抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法
专利汇可以提供抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种抗脂环酸芽孢杆菌单克隆 抗体 的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴制备免疫接种的小鼠；⑵骨髓瘤细胞培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶将脂环酸芽孢杆菌向免疫接种的小鼠 腹腔 接种免疫，并且获得脾细胞，经分散脾细胞得到脾细胞沉淀物；⑷培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物并混合，经离心得到沉淀物；⑹沉淀物离心、悬浮，即得融合细胞；⑺将融合细胞进行培养、测定，确定杂交瘤细胞；该杂交瘤细胞进行克隆、筛选得到杂交瘤细胞系；⑻制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞系按常规方法进行单克隆抗体生产即得。本发明快速、特异性高。，下面是抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法专利的具体信息内容。
1.抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小
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鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×10，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
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⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×10的脂环酸芽孢杆菌向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置
1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加
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入100 μL浓度为1~2×10个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液
100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞；
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑻制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
2.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法。
3.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
4.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。
5.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹和所述步骤⑺中的HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、
1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液和1mL 的100倍A母液混合而成的含有HAT以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
6.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑺中HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、
1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT，20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
7.如权利要求3、5或6所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
所述双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小
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鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×10，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
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⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×10的脂环酸芽孢杆菌向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置
1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加
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入100 μL浓度为1~2×10个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液
100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞；
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑻制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
具体实施方式
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小
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鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×10，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍。
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