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一种抗 纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法

阅读：1043发布：2020-06-08

专利汇可以提供一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了属于生物组合物技术领域的一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法。本发明以响应面试验验数据作为4-8-1结构神经网络的训练样本，建立了大豆异黄酮不同浓度组合物与HSC-T6 细胞增殖抑制率的预测模型，并使用模拟退火算法对网络进行优化。训练好的神经网络具有较好的预测功能，预测值与实测值之间的平均相对误差优于响应面模型平均相对误差。优化大豆异黄酮组合物为：黄豆黄素4μM、染料木素1.993μM、大豆苷元 2.996μM、黄豆黄苷15.776μM，细胞增殖抑制率和相对误差分别是66.93%和1.57%，优于响应面设计优化出的最佳组合物的60.85%和2.26%；优选的组合物的凋亡率也大于响应曲面优化的最佳组合物，利用神经网络-模拟退火算法的预测模型是有效的优化方法，为高通量筛选提供参考。，下面是一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，其特征在于，首先建立响应面以及神经网络模型，以响应面试验数据作为神经网络的训练样本，建立大豆异黄酮不同浓度组合物与HSC-T6细胞增殖抑制率的预测模型，然后使用模拟退火算法对网络进行优化获得最优组合物，最后检测最优组合物对HSC-T6细胞凋亡的作用。
2.根据权利要求1所述一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，其特征在于，所述建立响应面方法为：采用Box-Behnken确定变量范围，选择黄豆黄素、染料木素、大豆苷元和黄豆黄苷四种不同浓度异黄酮为自变量，以HSC-T6细胞增殖抑制率为响应值；
所述建立神经网络模型的方法为：利用响应面实验数据，采用神经网络建模，将4个因素作为网络的输入，HSC-T6细胞增殖抑制率为网络的输出，节点数为8，构建4-8-1的神经网络。
3.根据权利要求1所述一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，其特征在于，所述HSC-T6细胞增殖抑制率的检测方法包括如下步骤：
1）HSC-T6细胞培养在37℃和5% CO2的培养箱中，培养液DMEM含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素；
2）以6×104个/孔的密度接种细胞于96孔培养板中，每孔接种量为100 μL，细胞贴壁后，继续培养6 h后，空白组只加培养基，对照组加入等体积培养基和细胞，实验组加入等体积不同浓度大豆异黄酮组合物、培养基和细胞，培养48 h 后更换为无血清培养液，且每孔加入20μL 浓度为5 mg/mL MTT 溶液，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO震荡10 min后，用酶标仪测定570 nm处各孔的OD值；
3）计算HSC-T6细胞增殖抑制率，采用如下公式：
抑制率/%= 。
4.根据权利要求1所述一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，其特征在于，所述响应面优化分析采用Design Expert8.06（Demo）软件，所述建立神经网络模型和模拟退火算法优化采用MATLAB2016a（Trial）软件。
5.根据权利要求1所述一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，其特征在于，所述HSC-T6细胞凋亡的检测方法为：收集不同处理24小时的细胞，用磷酸盐缓冲盐洗涤两次，轻轻地重悬于结合缓冲液中，并与Annexin V-FITC和PI在暗处温育10分钟，采用流式细胞仪Accuri C6检测和数据分析。
6.权利要求1所述抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法得到的优化大豆异黄酮组合物, 其特征在于，所述大豆异黄酮组合物为黄豆黄素4μM、染料木素1.993μM、大豆苷元
2.996μM、黄豆黄苷15.776μM。

说明书全文

一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物组合物技术领域，具体涉及一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法。

背景技术

[0002] 肝纤维化发病率和死亡率都很高，至今尚无疗效令人满意的药物。肝纤维化是肝组织中含胶原的ECM（extracellular matrix，ECM）的大量沉积所致，其核心是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）纤维化功能的过表达，在病理损伤刺激下，肝脏相关细胞分泌转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF），TGF-β1激活HSC，PDGF促进激活的HSC大量增殖，同时激活的HSC自分泌TGF-β1和PDGF，维持和放大HSC激活与增殖效应。因此，抑制HSC增殖和诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要手段。

[0003] 大豆异黄酮是豆粕、豆渣、黄浆水中的主要活性成分之一。大豆异黄酮对肝纤维化具有预防和改善作用。大豆异黄酮有效阻止对硫代乙酰胺（TAA）诱导的大鼠模型中肝纤维化，可能与抑制ECM合成和HSCs增殖相关。赵育芳等发现大豆异黄酮组明显减轻CCl4 和橄榄油造模的肝纤维化大鼠，同时降低α-SMA、TGF-β1蛋白表达。虽然大豆异黄酮有抗纤维化能力，但大豆异黄酮已知有9种单体，不同单体异黄酮相互作用研究较少。以大豆异黄酮单体组合物为基础，开发预防肝纤维化的保健食品，不仅对解决肝纤维化防治问题具有积极的推进作用，而且为大豆异黄酮再利用提供新途径。神经网络和模拟退火算法是重要的非线性建模优化方法，在生物活性物质提取分离工艺和活性筛选中有较多应用。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法。

[0005] 为达到上述目的，采用如下技术方案：一种抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法，首先建立响应面以及神经网络模型，以响应面试验数据作为神经网络的训练样本，建立大豆异黄酮不同浓度组合物与HSC-T6细胞增殖抑制率的预测模型，然后使用模拟退火算法对网络进行优化获得最优组合物，最后检测最优组合物对HSC-T6细胞凋亡的作用。

[0006] 建立响应面方法为：采用Box-Behnken确定变量范围，选择黄豆黄素、染料木素、大豆苷元和黄豆黄苷四种不同浓度异黄酮为自变量，以HSC-T6细胞增殖抑制率为响应值；建立神经网络模型的方法为：利用响应面实验数据，采用神经网络建模，将4个因素作为网络的输入，HSC-T6细胞增殖抑制率为网络的输出，节点数为8，构建4-8-1的神经网络。

[0007] HSC-T6细胞增殖抑制率的检测方法包括如下步骤：1）HSC-T6细胞培养在37℃和5% CO2的培养箱中，培养液DMEM含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素；
2）以6×104个/孔的密度接种细胞于96孔培养板中，每孔接种量为100 μL，细胞贴壁后，继续培养6 h后，空白组只加培养基，对照组加入等体积培养基和细胞，实验组加入等体积不同浓度大豆异黄酮组合物、培养基和细胞，培养48 h 后更换为无血清培养液，且每孔加入20μL 浓度为5 mg/mL MTT 溶液，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO震荡
10 min后，用酶标仪测定570 nm处各孔的OD值；
3）计算HSC-T6细胞增殖抑制率，采用如下公式：
抑制率/%=
本发明响应面优化分析采用Design Expert8.06（Demo）软件，所述建立神经网络模型和模拟退火算法优化采用MATLAB2016a（Trial）软件。

[0008] 确定最佳组合物后，检测最佳组合物对HSC-T6细胞凋亡的作用，检测方法为：收集不同处理24小时的细胞，用磷酸盐缓冲盐洗涤两次，轻轻地重悬于结合缓冲液中，并与Annexin V-FITC和PI在暗处温育10分钟，采用流式细胞仪Accuri C6检测和数据分析。

[0009] 上述抗纤维化的大豆异黄酮组合物优化方法得到的优化大豆异黄酮组合物为黄豆黄素4μM、染料木素1.993μM、大豆苷元2.996μM、黄豆黄苷15.776μM。

[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明训练好的神经网络具有较好的预测功能，预测值与实测值之间的平均相对误差0.62%，优于响应面模型的1.27%。优化大豆异黄酮组合物对细胞增殖抑制率和相对误差分别是66.93%和 1.57% ，优于响应面设计优化出的最佳组合物的60.85%和2.26%；优选的组合物的凋亡率也大于响应曲面优化的最佳组合物，这些结果说明利用神经网络-模拟退火算法的预测模型是有效的优化方法，在抗纤维化高通量筛选模型上有一定的参考意义。附图说明

[0011] 图1为神经网络结构图。

[0012] 图2 为神经网络回归坐标图。

[0013] 图3为神经网络误差性能图。

[0014] 图4为模拟退火算法预测结果图。

[0015] 图5为大豆异黄酮及组合物的凋亡Annexin V/PI双染法检测图；其中 A：空白对照；B：响应面优化组合物；C：神经网络优化组合物；D：凋亡细胞数分析。

具体实施方式

[0016] 下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

[0017] 1.下述实施例所使用的材料及仪器如下：黄豆黄素、黄豆苷元、大豆苷元和染料木素：纯度98%，上海源叶生物技术有限公司；
四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜 (DMSO)：Sigma公司；
DMEM 和胎牛血清：Gibco公司；
Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒：Invitrogen公司；
抗生素（青霉素和链霉素）：Hyclone公司；
HSC-T6细胞鼠肝星状细胞：南京凯基生物科技公司；
CO2培养箱和Mutiskan Go酶标仪：美国热电公司；
Accuri C6流式细胞仪：美国BD公司；
真空干燥器：Eppendorf公司；
TDL-166RH高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。

[0018] 2.HSC-T6细胞增殖抑制率的检测方法为：1）HSC-T6细胞培养在37℃和5% CO2的培养箱中，培养液DMEM含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；
2）以6×104个/孔的密度接种细胞于96孔培养板中，每孔接种量为100 μL，细胞贴壁后，继续培养6 h后，空白组只加培养基，对照组加入等体积培养基和细胞，实验组加入等体积不同浓度大豆异黄酮组合物、培养基和细胞，培养48 h 后更换为无血清培养液，且每孔加入20μL 浓度为5 mg/mL MTT 溶液，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO震荡
10 min后，用酶标仪测定570 nm处各孔的OD值；
3）计算HSC-T6细胞增殖抑制率，采用如下公式：
抑制率/ %=
实施例1 响应面实验设计
响应面实验设计采用Box-Behnken确定变量范围，选择黄豆黄素（X1）、染料木素（X2）、大豆苷元（X3）和黄豆黄苷（X4）四种不同浓度异黄酮为自变量，以HSC-T6细胞增殖抑制率（Y）为响应值，试验因素和水平编码见表1。

[0019] 表1 因素水平编码表水平 X1浓度/μM X2浓度/μM X3浓度/μM X4浓度/μM
-1 1 2 3 4
0 2 4 6 8
1 4 8 12 16
根据表1因素水平编码表，响应面实验结果及方差分析表见表2-3。表3中R2 adj=
0.96081、R2=0.92162、回归模型P < 0.0001，失拟项P = 0.8284 > 0.05，这些参数说明建立的响应面二次多项式实际值与预测值拟合较好，可以用于预测。

[0020] 表2 响应面试验设计及结果该回归方程为：
Y=55.00+1.54*X1+2.16*X2-1.67*X3-1.95*X4-1.21*X1*X2+1.20*X1* X3+1.28*X1*X4+
0.27*X2*X3-3.98*X2*X4+0.16* X3* X4+2.47* X12-3.74* X22-1.04 * X32-2.38*X42 利用回归模型得到的最佳条件为：黄豆黄素（4μM）、染料木素（0.88μM）、大豆苷元（3μM）和黄豆黄苷（16μM），在此条件下细胞抑制率为62.26%。

[0021] 表3回归模型方差分析来源平方和自由度均方 F 值 P值显著性
模型 439.1322 14 31.36659 24.51674 < 0.0001 ***
X1 28.61341 1 28.61341 22.3648 0.0003 ***
X2 55.77141 1 55.77141 43.59202 < 0.0001 ***
X3 33.63401 1 33.63401 26.28899 0.0002 ***
X4 45.59101 1 45.59101 35.63482 < 0.0001 ***
X1X2 5.880625 1 5.880625 4.596411 0.0501
X1X3 5.76 1 5.76 4.502128 0.0522
X1X4 6.5536 1 6.5536 5.122421 0.0400 *
X2X3 0.297025 1 0.297025 0.232161 0.6374
X2X4 63.28203 1 63.28203 49.46246 < 0.0001 ***
X3X4 0.1089 1 0.1089 0.085118 0.7748
X12 39.63217 1 39.63217 30.97728 < 0.0001 ***
X22 90.88409 1 90.88409 71.03677 < 0.0001 ***
X32 7.024781 1 7.024781 5.490706 0.0344 *
2
X4 36.68547 1 36.68547 28.67408 0.0001 ***
残差 17.91153 14 1.279395
失拟项 9.96525 10 0.996525 0.501631 0.8284
绝对误差 7.94628 4 1.98657
总和 457.0438 28
***表示差异极显著（P< 0.001），**表示差异高度显著（P< 0.01），*表示差异显著（P<
0.05）；R2 adj=0.96081，R2=0.92162。

[0022] 实施例2 神经网络建模利用响应面实验数据，采用神经网络建模，将4个因素作为网络的输入，HSC-T6细胞增殖抑制率为网络的输出，节点数为8，构建4-8-1的神经网络，结构见图1。

[0023] 神经网络模型建立后，采用响应面实验数据来确定人工神经网络优化需要的训练数据，29个样本中随机分成23个（80%）训练组（Training），3个（10%）验证组（Validation），3个（10%）检测组（Test），选择Levenberg-Marquardt 算法训练。由图2可知，训练后的神经网络的预测值与实测值具有较好的相关性，三类样本数据回归直线的相关系数分别为0.98924，1，0.80998，所有组训练样本回归直线的相关系数为0.98551。在经过7次迭代训练后网络的验证误差为0.406，达到了训练要求，表明该神经网络具有很好的收敛性和预测性，如图3所示。

[0024] 实施例3 响应面和神经网络预测及验证试验训练成熟的神经网络建立的4种异黄酮不同浓度组合物与细胞增殖抑制率的非线性的映射关系，以仿真函数为模拟退火算法的寻优函数。由于模拟退火算法的初值(X0)不同搜索路径也不同，可能产生不同的结果。为减少初值选择所带来的误差，选择4个不同的初值，结果为平均值。表4和图4显示了4 个不同初值的搜索结果及最优参数。

[0025] 表4 模拟退火算法预测结果 X0/μM 迭代次数 X1/μM X2/μM X3/μM X4/μM 预测值/%
A [2,4,6,8 ] 2832 4.000 1.990 3.000 16.000 68.0796
B [4,8,12,16] 2296 4.000 1.982 2.985 15.984 68.0443
C [1,2,3,4 ] 2533 4.000 2.000 2.997 15.120 67.8693
D [2, 3, 12, 4] 3127 4.000 1.998 3.000 16.000 68.0074
平均 4.000 1.993 2.996 15.776 68.0002
由两种模型验证试验（见表5）可知，响应面回归分析的预测值与实测值的相对误差为
2.26%，而人工神经网络的预测值与实测值相对误差仅为1.57%，说明人工神经网络预测能力优于响应面。

[0026] 表5 两种方法优化结果比较实施例4 凋亡检测
收集不同处理24小时的细胞，用磷酸盐缓冲盐洗涤两次，轻轻地重悬于结合缓冲液中，并与Annexin V-FITC和PI在暗处温育10分钟，采用流式细胞仪Accuri C6检测和数据分析。

[0027] 使用空白无处理（A）、响应面优化组合物（B）和神经网络优化组合物（C）处理细胞，Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况。图5结果显示，空白对照早期凋亡率为1.0％和晚期凋亡率为2.2％，响应面优化组合物（B）分别为5.8％和16.0％，而神经网络优化组合物（C）为10.0％和29.8％。这些结果表明了神经网络优化大豆异黄酮组合物中诱导细胞凋亡的能力更强。这些结果一致于细胞增殖抑制实验。

[0028] 以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

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