本发明涉及培养骨髓基质细胞。

骨髓是由造血细胞，骨髓基质细胞和胞外基质组成的复杂的，动态的器 官系统。骨髓内的多能干细胞增殖并分化成包括红细胞和白细胞的多种细胞 类型。一段时间以来，已知干细胞和基质细胞之间的关系对于此过程而言是 至关重要的。对细胞培养的研究已表明：在造血干细胞能生长和分化之前必 需确立贴壁的基质细胞层。

骨髓基质细胞是由其形态学和功能确定的细胞不均一的群体。在细胞培 养中，它们具有特征性的纺锤形形态，并分泌生长因子和形成胞外基质的成 分。在响应于表皮生长因子(EGF；Kimura等人，1988,Br.J.Hematol, 69:9-12)，血小板衍生的生长因子(PDGF；Kimura等人，文献同上)，和 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Kimura等人，文献同上；Oliver等人， 1990，生长因子，3:231-236)的培养中，基质细胞显示出分裂。

成纤维细胞生长因子的发现基于多年前的观察结果，即脑的提取物可以 刺激成纤维细胞的分裂(见Thomas,1987，美国联邦实验生物学(学会)联合 会杂志(FASEBJ.),1:434-440)。从此分离出特殊的FGF，目前此家族至 少含有7个成员，包括酸性和碱性FGF(aFGF和bFGF)。这两种因子由不同 的单拷贝基因编码，在氨基酸水平上仅有55％相同(Thomas，文献同上)。

正如大多数生长因子，FGF通过与细胞表面受体结合而发挥它们的促 分裂活性。最近已鉴定出4个相关的FGF受体(FGFR1-FGFR4)，每种FGF 受体以多种形式存在，对于每种受体形式而言，aFGF和bFGF的相对亲合 力有所不同(参见Burgess等人，1989，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem), 58:575-606；Dionne等人，1991，美国国家科学院院刊 (Ann.N.Y.Acad.Sci),638:161-166；Johnson等人，1993，癌症研究进展 (Adv.CancerRes.),60:1-41)。碱性和酸性FGF对肝素的反应也有所不同， 在细胞培养中，肝素与两种FGF都络合，但实际上只增加aFGF的促分裂活 性(Thomas，文献同上)。

对于涉及造血细胞的很多疾病而言，骨髓移植或植入是有希望的疗法。 移植可用于取代被内在的疾病，如贫血症破坏的细胞，或者在造血细胞被化 学疗法或放射性疗法破坏的情况下。移植可以是自身移植，即病人可作为他 或她自己的供体。或者，病人可接受组织相容性供体的骨髓。然而，迄今为 止，培养能被移植和用于多种基因疗法的骨髓，尤其是骨髓基质细胞的条件 仍未最优化。基于基质细胞修饰的基因疗法的主要障碍是获得治疗上有用数 目的基质细胞。因此，尽管可成功地移植骨髓，但需要成功地移植骨髓基质 细胞的基因疗法仍无法实现。

发明概述

本发明是培养骨髓基质细胞的新方法，本发明基于以下的发现，即酸性 FGF(aFGF)，或aFGF和肝素的联合能显著增强骨髓基质细胞的确立和随后的 扩展。通过利用此方法，在培养中骨髓基质细胞可被扩展成前所未有的水平， 这对于治疗用途显然是有利的。因此，此培养方法使得骨髓基质细胞可用于 多种类型的基因疗法。

一般情况下，本发明的特征在于扩展骨髓基质细胞以得到总数至少为 107，优选为109以上的骨髓基质细胞的方法。此方法包括步骤：(a)例如从骨 髓抽吸液中得到骨髓基质细胞；(b)将基质细胞导入其内壁已被明胶(gelatin)， 如1.0％的明胶(gelatin)水溶液预包被的容器中，该容器中含有包括酸性成纤 维细胞生长因子(“aFGF”)多肽的培养基；和(c)在足以得到增加数目的骨髓基 质细胞的条件和时间下，在培养基中扩展基质细胞。在此方法中，培养基进 一步优选地包括至少0.05单位/ml的肝素多肽。在导入骨髓基质细胞之前， 容器内壁还可被胎牛血清预包被。

具体地说，培养基中可包括1.0-50.0％(体积百分比)的胎牛血清，0.01 -100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100单位/ml的肝素多肽。在具体的实 施方案中，培养基中包括16.0％(体积百分比)的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF 多肽，和5.0单位/ml的肝素多肽。

在本发明优选的方面，扩展步骤(c)包括步骤：(ⅰ)从容器中除去培养基和 非贴壁的细胞；(ⅱ)在容器中加入一定量的新鲜培养基；(ⅲ)从容器中除去培 养基和非贴壁的细胞，离心培养基和非贴壁的细胞以形成非贴壁细胞的沉淀 物；(ⅳ)将非贴壁细胞的沉淀物重新悬浮于取自容器的一定量的培养基中以形 成非贴壁细胞的混合物；和(ⅴ)将非贴壁细胞的混合物返回容器中。在此方法 中，步骤(ⅱ)中的新鲜培养基的量和步骤(ⅳ)中取自容器以重新悬浮非贴壁细 胞沉淀物的培养基的量相等。具体地说，当基质细胞已贴附于容器的内壁之 后，即可进行步骤(ⅰ)，在步骤(ⅰ)之后约1周即可进行步骤(ⅱ)和步骤(ⅲ)。

在这些方法的每一种中，骨髓基质细胞可以是得自活的或死的脊椎动 物，如哺乳动物之骨髓原始抽吸液的新鲜的基质细胞，或者可得自取自脊椎 动物，如人，灵长类动物，奶牛，狗，猪，或其它动物的骨。骨髓基质细胞 也可得自骨髓基质细胞培养物或骨髓基质细胞的冷冻储液。

本发明的特征还在于完全的骨髓基质细胞培养基，它包括大于12.5％(体 积百分比)的胎牛血清，酸性成纤维细胞生长因子(“aFGF”)多肽，和肝素多 肽。具体地说，培养基可包括12.6-50％(体积百分比)的胎牛血清，0.01 -100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100单位/ml的肝素多肽。在具体的实 施方案中，培养基中包括16.0％(体积百分比)的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF 多肽，和5.0单位/ml的肝素。培养基中可进一步地包括杀真菌剂，如浓度为 25μg/ml两性霉素B，和一种或多种抗生素，如25μg/ml的庆大霉素，100 单位/ml的青霉素和100μg/ml的硫酸链霉素。

另一方面，本发明的特征在于选择和扩展骨髓基质细胞的试剂盒。此试 剂盒包括一种或多种其内壁被明胶，如1.0％的明胶水溶液包被的培养容器 多肽，和骨髓基质细胞的培养基，该培养基中包括aFGF多肽和肝素多肽。 培养基可以是液体或冻干的粉末，可以在容器内或分别地被提供。

本文所用的“aFGF多肽”是与天然产生的aFGF蛋白的全部或部分氨 基酸序列相同，或基本上相同的任何多肽，并且对于骨髓基质细胞而言，所 述多肽与天然的或如本文所述的全长重组aFGF具有基本上相同的功能。因 此，术语包括重组的aFGF(如由LifeTechnologies公司，纽约长岛，制备的 #13241-013)，“aFGF类似物”，即aFGF的突变形式，和全长aFGF蛋白及 类似物的天然或合成的多肽片断，条件是这些类似物和片断对于如本文所述 的骨髓基质细胞而言，与天然的或全长重组的aFGF具有基本上相同的功能。 通过使用下述的培养方法可容易地检测这些类似物和片断的功能。不能用这 些方法提供至少107个细胞的酸性FGF类似物和片断不在本发明的范围之 内。

类似地，“肝素多肽”是具有与天然产生的肝素蛋白全部或部分氨基酸 序列相同，或基本上相同的多肽，对于骨髓基质细胞而言，所述肝素与如本 文所述的天然的肝素具有基本上相同的功能。因此，术语包括天然的肝素或 经化学修饰的天然肝素，如肝素钠(ElkinsSinn公司，CherryHill,NJ)，重 组肝素，“肝素类似物”，即突变型肝素，和全长肝素蛋白及类似物的天然或 合成的多肽片断，条件是这些类似物和片断对于如本文所述的骨髓基质细胞 而言，与天然肝素具有基本上相同的功能。使用下述培养方法可检测肝素的 功能。

“多肽”是指任何链型氨基酸，不论其长度或翻译后的修饰如何，所述 修饰如糖基化，磷酸化或化学修饰，因此多肽包括天然和合成的肽和蛋白 质。

aFGF或肝素的“突变形式”是指与天然产生的蛋白质相比，其氨基酸 序列中包含任何变化的多肽，条件是突变形式对于骨髓基质细胞而言，与天 然的或如本文所述的全长重组的蛋白质具有基本上相同的功能。通过例如化 学能量，如X-射线可自发产生这些变化，或者通过其它形式的诱变，基因 工程，或作为编码aFGF多肽的遗传信息交配或其它形式的交换结果也可产 生这些变化。突变可包括例如取代，缺失，插入，倒位，易位或重复。优选 突变是保守的取代，如在下列组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮 氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸， 赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。

本文所用的与多肽相关的术语“相同的”是指两个多肽之间氨基酸序列 的相似性。当两个多肽的氨基酸位置被相同的氨基酸所占据时，则它们在所 述位置上是相同的。因此，“基本上相同”是指与参照的氨基酸序列有至少 80％，优选85％，更优选90％，最优选95％相同的氨基酸序列，并且该 序列保留了与参照序列相同的功能活性。典型地，可使用序列分析软件(如序 列分析软件程序包，GeneticsComputerGroup，威斯康星大学生物技术中心， 1710UniversityAvenue,Madison,Wi53705)检测氨基酸序列的同一性。

本文所用的细胞的“扩展”是指在使细胞不仅能生长和兴旺，还能增殖 以使在扩展结束时比扩展开始时得到更多数目的细胞。

本文所用的“传代”是指这样的过程，在此过程中从组织培养容器上脱 附达到一定数目，或一定密度，直到，包括并超过铺满状态的细胞，收集于 聚集体，如通过离心形成的沉淀物中，并重新悬浮于组织培养基中。然后将 悬浮液分布于组织培养容器，如培养板或培养瓶中，采取的方式应使细胞生 长和分裂所能利用的总的表面积比它们先前能利用的要大。通过增加容器的 数目可以做到这一点。例如，在一个容器中生长的细胞可被脱附，收集，重 新悬浮，并分布到两个或更多个容器中。此过程也包括给细胞提供支持细胞 生长和分裂的一定量的组织培养基。

除非另有定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属技术领域 的技术人员通常理解的意义相同。尽管可以在本发明的实践或试验中使用与 本文所述相似或相当的方法和材料，但下文中将要描述优选的方法和材料。 另外，材料，方法和实施例只是为了阐明而不是限制本发明。

从下文详细的描述和权利要求书看，本发明的其它特征和优点将是显而 易见的。

图的简述

图1是显示在存在或缺乏aFGF和肝素时培养的骨髓基质细胞的生长曲 线。根据每次传代细胞数目百分比变化测量生长。

图2是显示在存在或缺乏aFGF和肝素时培养的骨髓基质细胞的总生长 曲线。

图3是显示通过被转染的犬骨髓基质细胞体外表达和分泌人生长激素 (hGH)的图。

详细的说明

为了产生能用于移植的骨髓基质细胞培养物，从人或狗体内得到骨髓， 并在特殊制备的组织培养瓶中培养之。另外，用酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)和肝素修饰培养基，并根据特殊的制度更新培养基。使用此新方法， 可在培养中确立大量骨髓基质细胞，这些细胞可被扩展以产生前所未有的大 量的细胞，这对于使用基质细胞的有效的基因疗法是必要的。

接下去将描述培养骨髓基质细胞的方法，并描述通过转染的犬骨髓基质 细胞体外分泌人生长激素(hGH)。 培养犬骨髓基质细胞的方法

将犬全身麻醉，从髂嵴处无菌抽取全部的骨髓，抽取用的注射器中含有 肝素以防止凝血。将骨髓从注射器中转移到含有15ml预冷的组织培养基，如 RPMI或DMEM的50ml的锥形管中，所述培养基中含有抗真菌剂和抗生素 (50μg/ml两性霉素B；50μg/ml的庆大霉素；100单位/ml的青霉素； 100μg/ml的硫酸链霉素)。在每管培养基中加入大约10-15ml骨髓抽取液， 将混合物置于冰上。

通过标准的Ficoll垫层技术(Ficoll cushion technique)由骨髓样品制备成核 细胞。简单地说，将15ml的FICOLL-PAQLUETM(PharmaciaBiotech)置于50ml 的锥形管中，每份骨髓-培养基样品中的一半在Ficoll的顶端小心成层，在 18℃下，以400×g将样品离心30分钟，离心时关掉制动器以使离心时间 过后，离心用的转头能缓慢地减速。移出并弃去所得制品的上层，上层中含 有无细胞的培养基。小心收集含有成核细胞的中层，并将中层置于含有20ml 如上所述的组织培养基的新用的50ml管中。加入另外的培养基以使终体积为 50ml。

成核细胞包括骨髓基质细胞，然而，基质细胞仅占得自骨髓抽取液的成 核骨髓细胞总数的一小部分，即约千分之一。

通过在100×g下离心10分钟将成核细胞收集到沉淀物中，用组织培 养基(含有25μg/ml两性霉素B,25μg/ml庆大霉素，100单位/ml青霉素和 100μg/ml硫酸链霉素的RPMI或DMEM)洗涤细胞沉淀物，并重新悬浮于5 -10ml“完全的骨髓基质细胞培养基”(complete bone marrow stromal cell medium)(“完全培养基”)中，重新悬浮后计数细胞。

一般情况下，完全的骨髓基质细胞培养基含有下列量或浓度范围内的下 列成分，含有1-50％，优选大于12.5％的胎牛血清(FBS)；0.01-100ng/ml 的aFGF多肽，如重组的aFGF；0.05-100单位/ml的肝素，如肝素钠；0.25 -250μg/ml两性霉素B；0.25-250μg/ml的庆大霉素；1-1000单位/ml 的青霉素；和1-1000μg/ml的硫酸链霉素的DMEM。在下述实验中所用的 完全培养基为含有16％(体积百分比)热灭活的FBS,aFGF(1ng/ml)，肝素(5 单位/ml)，两性霉素B(25μg/ml)，庆大霉素(25μg/ml)，青霉素(100单位/ml)和 硫酸链霉素(100μg/ml)的DMEM。

优选首先用明胶和FBS包被组织培养瓶(T150cm2)。具体地说，在每个 瓶中加入明胶溶液(Sigma；1％的水溶液)直至瓶的底部刚好被覆盖。除去 过量的溶液，在室温下将培养瓶底朝下(bottom side down)静置至少30分钟。 此时冷藏培养瓶以供下一步使用。然后在明胶化的培养瓶中加入热灭活的 FBS，如前所述，除去过量的溶液，在室温下将培养瓶底朝下静置至少30 分钟。此时可使用该培养瓶，也可冷藏。

以大约1×108个细胞/T150培养瓶的密度将如上制备的骨髓成核细胞加 入制备好的培养瓶中。在33℃,5％的CO2存在下，在15ml骨髓完全培养 基中温育细胞。3-4天后，或者当基质细胞已贴附至组织培养容器的内壁 时，在培养物中滴加15ml新鲜的完全培养基，因此细胞未受干扰。1周后， 在培养基中重要的成分耗尽之前，除去所谓的“条件培养基”，即培养瓶中含 有非贴壁细胞的培养基，在培养瓶中加入15ml新鲜的完全培养基。通过在 500×g下离心5分钟沉淀非贴壁的细胞，重新悬浮于15ml条件培养基中， 并返回到最初的培养瓶中。因此，非贴壁的细胞被返回到培养瓶中，培养基 以含有一部分新鲜培养基，一部分条件培养基的方式被改变。

一般情况下，细胞培养制度的关键在于：(1)用明胶溶液包被组织培养容 器的内壁，(2)当交换培养基时，一直将非贴壁的细胞返回培养物中，(3)加入 含有足够营养成分的培养基以维持生长，无需取出由骨髓细胞分泌的能增强 其生长的所有物质，(4)补充含有aFGF的组织培养基，和(5)补充含有肝素的 组织培养基。

非贴壁细胞被取出，沉淀，并返回到含有等量新鲜和条件培养基的培养 物中的此过程被1周重复1次，达2-3周，或直至形成单层贴壁细胞。一 旦形成骨髓基质细胞单层，可通过将它们以1∶2或1∶3分开至新用的培养瓶中 以使细胞传代。此时，和从此时开始，用明胶，而不是FBS包被用于进一步 传代的培养瓶。也不再需要用条件培养基饲养确立的基质细胞，或者将非贴 壁的细胞返回到培养物中。可以以此方式将细胞至少传代8次或更多次。

使用此方法可从犬或人(或其它脊椎动物)的个体受试者的骨髓抽取液中 体外选择和扩展骨髓基质细胞，以使总细胞数超过108，甚至超过3×109。 也可使用得到骨髓的其它技术。通过此方法得自狗的骨髓基质细胞显示出成 纤维细胞-样骨髓基质细胞的特征性表现。假定基因疗法的成功取决于足够 水平的转基因产物的细胞生产，该水平可能很低，在培养中将基质细胞扩展 为108-109或更多的能力即可代表实质上的改善。

尽管不论存在aFGF和肝素与否，得自原始的犬骨髓抽取液的基质细胞 在P0(第0代)都可确立其自身，但只有在这两种因子存在时培养的细胞在第 一次或第二次传代后才能继续生长良好。另外，与不用这两种因子培养的细 胞相比，用aFGF和肝素培养的细胞能将成纤维细胞-样基质细胞的形态维 持更长的时间。

实施例

如上所述，从被称为ALG-5的狗体内制备髂嵴骨髓抽取液，将所述 抽取液分成两份，以使一半细胞可以用aFGF和肝素培养，另一半细胞可以 不用aFGF和肝素培养。用2.75×107个原代骨髓细胞接种组织培养瓶并通 过上述方法培养，其中在第一次传代时将基质细胞-条件培养基和非贴壁细 胞返回到培养瓶中。当所有的培养瓶中含有基质细胞的铺满层时，用胰蛋白 酶消化细胞，用得自各个P0培养瓶的2.5×106个细胞接种T75培养瓶(第1 代，P1)。1周后收集这些细胞，仍在存在或缺乏aFGF和肝素时下将每个培 养瓶中的2×106个细胞传代(P2)。

类似地，接种后8天收获P2细胞，将1×106个细胞传代至P3培养瓶 中。此时由于在缺乏aFGF和肝素时，经培养的细胞数目受到限制，故被传 代的细胞数目有所减少；只有1×106个细胞可用于再接种。用此数目的细 胞再接种所有的培养瓶以使每个培养瓶能继续维持差不多大小的群体。

接种后8天收获第3代(P3)细胞，将1×106个细胞接种至P4培养瓶中。 继续使细胞传代，并在每次收获和再接种时仔细计数细胞。第4次传代之后， 在存在aFGF和肝素时培养的细胞(7天)比缺乏这两种因子时培养的细胞(14 天)能更快地达到铺满状态。

通过将每次传代结束时收获的细胞数目与每次传代开始时接种到培养 瓶中的细胞数目相比较，测定出细胞数目的百分比变化，正数表示细胞数目 的增加，负数表示细胞数目的减少，零值表示细胞数目没有变化。在所有原 代培养(P0)的培养瓶中都确立了贴壁的基质细胞，当P0结束时，在缺乏aFGF 和肝素的培养瓶中细胞数较多(图1)。尽管两组细胞在P1的过程中都扩展， 但在存在aFGF和肝素时培养的细胞的生长比缺乏aFGF和肝素时培养的细 胞要高2.5倍。也许更重要的是，用aFGF和肝素培养的细胞在第2,3,4 和5代仍能在数目上有所增加，而不用aFGF和肝素培养的细胞在这些代中 生长得很差，或者根本就不生长。

图1中在P0时对所有培养瓶而言的负数反映了这样一个事实，即在原 始的骨髓抽取液中，骨髓基质细胞仅是成核细胞总群的一小部分，并进一步 阐明了aFGF和肝素对体外犬骨髓基质细胞的生长具有显著的促进作用。

也在存在或缺乏aFGF和肝素时计算了得自狗ALG-5的骨髓基质细胞 的总的生长。通过将确立期结束时每个培养瓶中基质细胞的总数(+/-aFGF 和肝素)乘以第一次传代时细胞数目的平均百分比变化测定出此图(总生长)。 对于随后的每次传代，按类似方法计算出总生长(图2)，如图2所示，不用 aFGF和肝素的培养基本上未显示生长。另一方面，到P6为止，添加了aFGF 和肝素的培养显示出显著的经计算的生长，直至超过60×107个细胞。

在每次传代结束时，就在它们被胰蛋白酶消化和收获前，也可以肉眼观 察到得自狗ALG-5的细胞。用aFGF和肝素培养的细胞将其成纤维细胞- 样的形态维持了很多代，而不用aFGF和肝素培养的细胞在第一或第二代之 后即变成平扁的形态。

总之，这些结果表明aFGF和肝素能明显地增强犬骨髓基质细胞的生 长，并能在培养中维持这些细胞的特征性的成纤维细胞-样形态。

培养人骨髓基质细胞的方法

从髋部复位(hip replacement)手术过程中丢弃的股骨头中抽取人骨髓，也 可使用其它得到骨髓的技术。将骨髓置于含有组织培养基的管中，所述培养 基如含有50μg/ml两性霉素B和50μg/ml庆大霉素的RPMI或DMEM。使用 无菌剪刀将悬浮在培养基中的骨和组织细细地切碎，在500×g下离心10 分钟，并通过缓慢地倒转试管使沉淀物重新悬浮于含有16％热灭活的FBS 的组织培养基中。然后放置约1分钟以使较大的骨和组织片段沉至试管的底 部。小心移出含有悬浮细胞的上清液，并在500×g下离心10分钟。通过在 完全的骨髓基质细胞培养基中离心将细胞沉淀物洗涤1次，并重新悬浮于新 鲜的完全培养基中，对细胞进行计数。与上文对狗的骨髓基质细胞培养所描 述的相同，最初在被明胶和FBS预处理的培养瓶中，以1×108个细胞/T150 培养瓶培养这些原代骨髓细胞。

使用相同的技术和上述的完全培养基体外选择和扩展人骨髓基质细 胞。另外，将人股骨的小片段导入含有完全培养基的制备好的组织培养瓶 中。骨髓基质细胞从这些片段中长出，贴附在培养瓶中，随后按与其它骨髓 基质细胞相同的方法对所述细胞进行处理。从得自几个个体的原始骨髓中选 择和扩展人骨髓基质细胞，将细胞扩展至至少2×108个细胞。

通过被转染的犬骨髓基质细胞体外表达和分泌人生长激素

为了测定根据上述方法培养的骨髓基质细胞是否能被转染，使用标准技 术制备质粒表达载体pETKhGH，并用该质粒转染犬基质细胞。狗模型是人 骨髓系统可以接受的动物模型，对狗研究的结果可合理地预测对人患者的效 力。

由质粒pTKGH(Selden等人，1986，分子细胞生物学，6:3173-3179) 构建载体，该质粒中含有在HSV胸苷激酶(TK)启动子序列转录控制下的包 括内含子的人生长激素(hGH)基因，(NicholsInstituteDiagnostics′, SanJuanCapistrano,CA)。另外，通过使用pSV(E)-MLP质粒的衍生物 (Hurwitz等人，1987，核酸研究，15:7137-7153)作为模板的PCR使得自 SV40增强子的179个碱基对的FokI-PvuⅡ限制性酶切片段的尾部接上 HindⅢ位点，并将此片段克隆到紧接TK启动子上游的pTKGH的HindⅢ 位点。pETKhGH质粒缺乏真核生物的复制起点，不能整合到宿主细胞的基 因组中，因此，此载体只是瞬时表达hGH。

通过使用MBS哺乳动物转染试剂盒(Stratagene克隆系统，LaJolla, CA)的CaPO4-DNA共沉淀法，或者通过使用LIPOFECTAMINE试剂和 OPTI-MEMⅠ减少的-血清培养基(LifeTechnologies)的阳离子脂质-DNA 络合物法，根据厂商的说明用pETKhGH转染犬骨髓基质细胞。使用CaPO4法转染得自狗ALG-3的细胞，使用脂染法转染得自狗ALG-9的细胞。 在P2时，当细胞被接种到T150培养瓶之后的第2天，通过CaPO4法将DNA 转染给3.2×104个细胞。用150μgpETKhGH质粒转染细胞24小时，这些 细胞活跃地生长并表现出成纤维细胞-样的形态。

在P6时，当细胞被接种到T150培养瓶之后的第2天，通过脂染法将 DNA转染给1.2×106个细胞。与在较早的代中观察的结果相比，这些细胞 的生长速率有所降低，细胞形态已有所改变以使细胞显得更加平扁和分散。 在含有0.24mlLIPOFECTAMINE试剂的总体积为4.28ml的OPTI-MEM中 用40μgpETKhGH质粒转染这些细胞6小时。

通过使用hGH-TGES试剂盒(NicholsInstituteDiagnostics)的放射免疫测 定法(RIA)测定hGH的分泌水平。结果表示成重复试验测量结果的平均值。 被表达质粒pETKhGH转染之后，早(P2)和晚(P6)代的犬基质细胞都表达和分 泌高水平的hGH转基因产物(图3)。根据被检测的各个动物，细胞已被传代 的次数和转染的方法的不同，hGH表达的绝对水平也有所不同。

如图3所示，由狗ALG-3的细胞表达的hGH的绝对水平在大于1至 约2.5μg/24小时/106个细胞之间变化。从P6-P7，由狗ALG-9的细胞 表达的hGH的绝对水平在接近3至约5μg/24小时/106个细胞之间变化，然 后降低至约0.5，在P8和P9时，分别降低至接近于0。

其它实施方案

在本发明的其它实施方案中，可在于组织培养中扩展之前或之后深低温 保藏骨髓基质细胞。

为了深低温保藏骨髓的原始抽取液，使用上述的Ficoll梯度技术制备成 核细胞，并以例如2-5×107个细胞/ml的密度将所述细胞悬浮于50％的 培养基，50％的FBS中。将如900μl的悬浮液的量等分于含有100μlDMSO 的小管，如2ml无菌深低温管(Corning#25704)中。将小管在-80℃下储 存24小时，然后转移到-150℃的冰箱中或液氮罐中长期保存。

为了深低温保藏在培养中生长的基质细胞，从组织培养容器中抽取培养 基，用Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(Gibco14190-144)将细胞漂洗一次。然后用 胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶，0.53mMEDTA；Gibco25300- 062)使细胞从培养瓶或板的表面脱附。通过加入等体积的培养基终止胰蛋白 酶消化，在500×g下离心细胞悬浮液直至细胞被沉淀，将沉淀下来的细胞 重新悬浮于例如3ml的培养基中并计数。用含有10％二甲基亚砜(DMSO； SigmaD-8779)的培养基将细胞密度调节至1×106个细胞/ml。以1ml的体积 将细胞等分于无菌的深低温管(Corning#25704)中，立即在-80℃下储存 过夜，24小时后，将小管转移到液氮罐或-150℃的冰箱中长期保存。

也已使方法得以发展以深低温保藏大量经培养的基质细胞。例如，按上 述收获细胞之后，将200ml细胞悬浮液置于250ml的离心管中，在500×g 下离心以沉淀细胞，将沉淀下来的细胞重新悬浮于10-20ml的培养基中并 计数。然后用培养基将悬浮液的体积加至45ml，并将所得悬浮液用无菌注 射器加入转移包装容器(BaxterFenwal,4R2001)中，所述注射器上配备有18 号针头。然后加入5mlDMSO，将此包装在-80℃下储存过夜，24小时后， 将该包装转移到液氮罐或150℃的冰箱中长期保存。

应理解尽管结合其详细的说明书描述了本发明，前面的说明书只是为了 阐明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围确 定。本发明的其它方面，优点和变更在下列权利要求书的范围之内。

发明背景