一种马精液冷冻保存液及其配制方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种马精液冷冻保存液及其配制方法，属于动物精液冷冻保存技术领域。
背景技术
[0002] 精液冷冻保存是马人工辅助繁殖技术手段之一。1950年，Smith和Polge最早将甘油作为抗冻剂应用到马精液冷冻保存。1957年，Barker和Gandier最早利用马附睾冷冻精液进行配种受孕。中国早在20世纪50年代末就开始进行有关马精液冷冻保存的研究，并取得了较好的成绩。20世纪80年代，随着阿拉伯马、夸特马、美国花马等品种登记组织允许使用冷冻精液配种出生的幼驹登记，使得马精液冷冻保存技术得到快速发展。马精液冷冻可扩大种公马配种范围，减少马生殖道
疾病的传播，保护优良遗传资源，能够跨越种族间进行交配，对完善马的精液冷冻和人工授精配套技术，对于马业的发展、地方优良马品种保存、加快马品种改良等方面都具有重要的意义。
[0003] 冷冻保存液是精子的保护剂，对精液冷冻的效果有决定性的影响。目前，国内马精液的冷冻技术还处于试验阶段，主要原因在于：(1)马精液冷冻过程中冷冻一解冻机理、精子损伤机理、外部环境变化对精子的影响、精子内部组成物质的变化规律及分子机制等诸多方面尚不完全清楚；(2)实际操作中的冷冻一解冻程序、稀释液和解冻液的组成不一致，配制成分、方法复杂，不便于生产中现场配制使用；(3)冷冻精液的活
力也难以达到人工授精要求。以上问题严重制约了马冷冻精液在马育种及商品化生产中的应用。因此，研究一种马精液冷冻保存液，能够有效提高马精子冻存过程中的存活率和活力，便于冷冻一解冻程序操作使用，显得尤为必要。
发明内容
[0004] 为解决
现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种马精液冷冻保存液，能够有效提高马精液在冻存过程中的存活率和精子活力，该马精液冷冻保存液的制备方法简单易实现。
[0005] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0006] 一种马精液冷冻保存液，是由
葡萄糖2.00g～2.40g、乳糖3.40g～4.00g、海藻糖0.60g～1.00g、谷胱甘肽0.061～0.092g、
柠檬酸钠0.50g～0.70g、
脱脂奶30mL～50mL、卵黄液2.5～4.5mL、青霉素5万～10万IU、
链霉素5万～10万IU、甘油3.5～5.5mL和双蒸
水配制成
100mL马精液冷冻保存液。
[0007] 进一步地，前述马精液冷冻保存液，是由葡萄糖2.20g、乳糖3.70g、海藻糖0.80g、谷胱甘肽0.077g、柠檬酸钠0.60g、脱脂奶40mL、卵黄液3.5mL、青霉素10万IU、链霉素10万IU、甘油4.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。
[0008] 一种马精液冷冻保存液的配制方法，包括以下步骤：(1)配制脱脂奶；(2)配制
基础液I；(3)配制冷冻保存液。
[0009] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤：
[0010] (1)配制脱脂奶：取新鲜马奶过滤后，100℃水浴灭菌10min，缓慢降温至室温后，置于4℃冷藏(能够充分冷却，使脂质漂浮于上层即可)，随后离心去除上层脂质和下层沉淀，得到脱脂奶，其保存时间一般不超过三天；
[0011] (2)配制基础液I：按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加入双蒸水溶解，，定容至100mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌即得基础液I；
[0012] (3)配制冷冻保存液：取基础液I 96.5mL～94.5mL和甘油3.5～5.5mL，在基础液I中加入甘油搅拌20min～40min，即得冷冻保存液。
[0013] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤(1)中，离心为：以2000～3000r/min转速离心20～30min。
[0014] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤：
[0015] (1)配制脱脂奶：取脱脂奶粉加入双蒸水中，搅拌，配制成浓度为0.1g/mL溶液，得到脱脂奶；
[0016] (2)配制基础液I：按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加入双蒸水溶解，定容至100mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌即得基础液I；
[0017] (3)配制冷冻保存液：取基础液I 96.5mL～94.5mL和甘油3.5～5.5mL，在基础液I中加入甘油搅拌20min～40min，即得冷冻保存液。
[0018] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤(2)中，卵黄液通过以下步骤获取：取新鲜鸡蛋，去除蛋清后，将蛋黄转移到
滤纸片上滚动以便除去剩余蛋清和白色的黏着在蛋黄膜上的卵带，接着把蛋黄膜刺透，卵黄液收集到用
冰冷却的容器中。
[0019] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤(2)中，室温搅拌20min～45min得到基础液I。
[0020] 一种马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用。
[0021] 前述马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用中，马精液冷冻保存方法包括以下步骤：取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:1～2，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600×g
离心力离心8～12min，弃去上清液，再用冷冻保存液稀释至精子
密度为5×107～1×108个/mL，混合均匀后，装入0.5mL细管中，缓慢降温至4℃平衡90～120min，可以使甘油渗入精子体内，产生抗冻保护作用；再在距离液氮面上4～6cm处熏蒸8～10min后(优选距离液氮层面4cm高处)，投入液氮中保存。本发明中通过调整熏蒸高度和时间来控制细管精液的降温速率，熏蒸距离过高或过低、时间过长或过短，都会使精子受冷打击，造成不可逆转的精子死亡后果。
[0022] 本发明中，精液采用假
阴道法采精后，用4层灭菌纱布过滤附性腺等胶状物，采精后进行常规检查，最后取精子活力在0.60以上，密度“中”的精液用于冷冻保存。解冻过程为：从液氮中取出精液细管，迅速浸入水浴解冻，轻轻摇动至融化。解冻
温度为：37℃、30s。
[0023] 精子在冷冻过程中易发生
氧化损伤，氧化损伤是
活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)产生和清除活动
不平衡的结果：正常情况下，射出精液精浆(SP)中的抗氧化物质具有清除ROS的潜力，但精液在冷冻保存过程中，精液离心去除了精浆，使精子失去了精浆抗
氧化剂的保护作用，导致精子易受氧化攻击；另外冷冻过程又能诱导精子产生ROS。其中有
缺陷精子和死精子是冷冻期间ROS的主要来源。ROS能通过氧化不饱和
脂肪酸，破坏质膜脂质双分子结构，引起精子细胞膜功能障碍及内部结构损伤。
[0024] 糖类是精液冷冻保存液的基本组成部分,既可以为精子代谢提供
能量,又是重要的
冷冻保护剂。海藻糖，是由两个葡萄糖分子构成的非还原性糖，性质非常稳定。海藻糖能够有效地遏制Ca2+的流动，减缓细胞内
外渗透压的瞬间变化，保护细胞膜不被破坏。它还可以与精子膜上的氢结合，形成一种保护层，在精子膜破裂的情况下能有效地阻止精子内部有效成分的外流。另外，海藻糖可调控细胞内和溶液之间水分的变化，在冷冻-解冻过程中保护细胞免受损伤。海藻糖的保护机制与其
晶体结构、溶液的物理构象和化学特性密切相关。在精子冷冻时,海藻糖可以强有力的束缚水分子,与膜脂质共同拥有
结合水或者本身起到代替膜结合水的功用,保持细胞内湿润,防止细胞因失水而造成养分的损失和细胞的损伤,具有稳定细胞膜和
蛋白质结构的特性。
[0025] 甘油通透精子膜的能力很强，可浓缩或结合胞内水分，降低溶液中盐浓度和冷冻液的渗透压。但甘油对精子有一定的毒害作用。为达到保护作用同时将危害降为最低，本发明的冷冻保存液配方中降低了甘油浓度。100mL冷冻保存液中含有甘油3.5～5.5mL时，经
过冷冻一解冻过程后精子活力最高。
[0026] 海藻糖在
哺乳动物精子深低温保存时，只有与甘油联合使用才能有效保护精子。因此,冷冻保存液中的海藻糖与甘油共同作用时,更适合于保护马精子的细胞形态与细胞功能等，阻碍细胞内冰晶的形成,有效抵消甘油对精子的毒害作用。此外，海藻糖的双重作用非常有利于保护马精子细胞膜的完整性,可以经受与精子活力和受精能力有关的成熟变化。海藻糖与甘油两者结合共同作用，最终对马精子起到最佳的保护作用。
[0027] 谷胱甘肽(GSH)是哺乳动物细胞中重要的非蛋白硫氢化合物，它作为过氧化－还原酶系统的作用物，能及时保护精子免遭氧化及过氧化反应终结产物的伤害，使精子脂膜结构保持稳定，最终提高了精液
质量。
[0028]
试剂：甘油(日本)，注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂)，注射用
硫酸链霉素(大连美罗大药厂)，脱脂奶粉(英国)，葡萄糖(Sigma)，乳糖(Sigma)，海藻糖(Sigma)。
[0029] 仪器：TDZ5-WS型离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，400×实体
显微镜(Olympus)，高温高压灭菌器(上海博迅实业有限公司)。
[0030] 分别检测了不同配方马精液冷冻保存液进行冷冻保存，对冻融后精子品质的影响。具体实验过程如下：
[0031] 选取5-15岁纯血马2匹，蒙古马2匹，每周采集精液3次，活力0.6以上进行冷冻保存。2周共24组样本。分别用4个不同配方冷冻保存，其中，自配液1组和2组均为采用本发明的马精液冷冻保存液，INRA82和INRA96为市售产品(法国IMV(卡苏)公司)。解冻温度为37℃,30s。冷冻保存方法为：取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:1，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600×g离心力离心10min，弃去上清液，再用冷冻保存液稀释至精子密度为1×108个/mL，混合均匀后，装入0.5mL细管中，缓慢降温至4℃平衡100min，再在距离液氮面上4cm处熏蒸8min后，投入液氮中保存。
[0032] 具体检测方法为：将解冻后的精子进行各项指标的测定，比较各实验组冷冻前后精子的运动参数、畸形率、细菌数。不同配方冻融后用CASA(Computer-aided sperm analysis)计算机辅助精子分析仪进行检测，每个样品检测3个重复。
[0033] (1)CASA检测精子浓度，每次检测至少达到5个
视野和200条以上的精子；
[0034] (2)一份标本检测3次，总共要观察15个以上的视野，600条以上的精子。
[0035] 用姬姆萨
染色法测精子畸形率。即抹片—晾干—固定—水洗—晾干—染色—水洗—晾干—镜检。400倍显微镜下至少观察200个精子，重复2次。细菌数用普通琼脂培养法。置37℃恒温箱内培养48小时后取出，计数平皿内菌落数。每组样品取二支作两个平皿,取平均值。
[0036] 通过SAS9.0
软件，所有数据均采用单因素方差分析方法进行处理，其中，TM＝总活力；PM＝前进运动精子百分率；VCL＝平均曲线速度(μm/s)；VSL＝平均直线速度；VAP＝平均路径速度；ALH＝精子头侧摆幅度；LIN＝直线性，曲线轨迹的直线性，VSL/VCL；STR＝前向性，空间平均路径的直线性，VSL/VAP；BCF＝鞭打
频率(Hz)。实验结果如表1所示。
[0037] 由表1可知，在同一批鲜精的样品中，通过不同的稀释液处理后，冷冻解冻后精液指标评定结果有差异，4个试验组中，自配液1组和2组总活力平均为68.75和64.14，高于INRA组2个组，差异显著(P＜0.05)。根据解冻后精液的各项检测，本发明的精液冷冻保存液(自配液)对精液畸形率、细菌数的控制上与商品化冷冻保存液无明显差异的基础上，有效提高了精液的总活力、前进运动精子百分率，
稳定性最好。
[0038] 本发明中还对谷胱甘肽进行了筛选实验。具体实验过程如下：选取5-15岁蒙古马4匹，每周采集精液3次，活力0.6以上进行冷冻保存。1周共12组样本。每组设计3个试验梯度组(配制100mL冷冻保存液，谷胱甘肽原料加入量分别为0.077g、0.154g、0.230g)和1个对照组(不添加谷胱甘肽)。解冻温度为37℃,30s。具体冷冻保存方法和检测方法与不同配方马精液冷冻保存液对冻融后精子品质的影响实验相同。测试结果如表2所示。
[0039] 由表2可知，在谷胱甘肽原料加入量为0.077g时得到的100mL冷冻保存液，用于保存马精液，冻精解冻后精子的总活力、前进运动精子百分率均优于其它浓度的还
原型谷胱甘肽，说明谷胱甘肽原料加入量为0.077g时得到的100mL冷冻保存液，能够有效提高冷冻精液的精子活力。
[0040] 此外，采用本发明的马精液冷冻保存液和冷冻保存方法冷冻后的马精液用于人工授精，一个情期内配种32匹母马，其中怀孕15匹，受胎率为46.88％。
[0041] 表1不同配方马精液冷冻保存液对冻融后精子品质的影响
[0042]
[0043]
[0044] 表2添加不同浓度谷胱甘肽对马精液冷冻保存效果的影响
[0045]
[0046] 注：表1和表2中同一行中具有不同上标字母者表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)。
[0047] 本发明的有益之处在于：本发明提供的一种马精液冷冻保存液，能够有效提高马精液在冻存过程中的存活率和精子活力。解冻后精子生理指标高,有效提高了精液的总活力、前进运动精子百分率，现场应用受胎效果稳定可靠,可用于生产。该马精液冷冻保存液的原料易得，成本低，制备方法步骤少、简单易操作，制备条件温和易控制。采用本发明马精液冷冻保存液的冷冻保存方法，条件易于控制，容易实现，冷冻保存效果好。将采用本发明的马精液冷冻保存液和冷冻保存方法冷冻后的马精液用于人工授精，一个情期内配种32匹母马，其中怀孕15匹，受胎率为46.88％。
具体实施方式
[0048] 以下结合具体
实施例对本发明作进一步的介绍。
[0049] 实施例1
[0050] 一种马精液冷冻保存液，由葡萄糖2.00g、乳糖3.40g、海藻糖0.60g、谷胱甘肽0.061g、柠檬酸钠0.50g、脱脂奶30mL、卵黄液2.5mL、青霉素5万IU、链霉素5万IU、甘油3.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。
[0051] 具体配制方法包括以下步骤：
[0052] (1)配制脱脂奶：取新鲜马奶过滤后，100℃水浴灭菌10min，缓慢降温至室温后，置于4℃冷藏，随后以2000r/min转速离心30min，去除上层脂质和下层沉淀，得到脱脂奶；
[0053] (2)配制基础液I：按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加入双蒸水溶解，定容至100mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌20min即得基础液I；
[0054] (3)配制冷冻保存液：取基础液I 96.5mL和甘油3.5mL，在基础液I中加入甘油搅拌20min，即得冷冻保存液。
[0055] 其中，卵黄液通过以下步骤获取：取新鲜鸡蛋，去除蛋清后，接着把蛋黄膜刺透，卵黄液收集到用冰冷却的容器中。
[0056] 实施例2
[0057] 一种马精液冷冻保存液，由葡萄糖2.40g、乳糖4.00g、海藻糖1.00g、谷胱甘肽0.092g、柠檬酸钠0.70g、脱脂奶50mL、卵黄液4.5mL、青霉素6万IU、链霉素8万IU、甘油5.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。
[0058] 前述马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤：
[0059] (1)配制脱脂奶：取脱脂奶粉加入双蒸水中，搅拌，配制成浓度为0.1g/mL溶液，得到脱脂奶；
[0060] (2)配制基础液I：按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加入双蒸水溶解，定容至100mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌45min即得基础液I；
[0061] (3)配制冷冻保存液：取基础液I 94.5mL和甘油5.5mL，在基础液I中加入甘油搅拌40min，即得冷冻保存液。
[0062] 其中，卵黄液通过以下步骤获取：取新鲜鸡蛋，去除蛋清后，将蛋黄转移到滤纸片上滚动以便除去剩余蛋清和白色的黏着在蛋黄膜上的卵带，接着把蛋黄膜刺透，卵黄液收集到用冰冷却的容器中。
[0063] 实施例3
[0064] 马精液冷冻保存液，由葡萄糖2.20g、乳糖3.70g、海藻糖0.80g、谷胱甘肽0.077g、柠檬酸钠0.60g、脱脂奶40mL、卵黄液3.5mL、青霉素10万IU、链霉素10万IU、甘油4.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。
[0065] 马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤：
[0066] (1)配制脱脂奶：取新鲜马奶过滤后，100℃水浴灭菌10min，缓慢降温至室温后，置于4℃冷藏，随后以3000r/min转速离心20min，去除上层脂质和下层沉淀，得到脱脂奶；
[0067] (2)配制基础液I：按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加入双蒸水溶解，定容至100mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌30min即得基础液I；
[0068] (3)配制冷冻保存液：取基础液I 95.5mL和甘油4.5mL，在基础液I中加入甘油搅拌30min，即得冷冻保存液。
[0069] 其中，卵黄液通过以下步骤获取：取新鲜鸡蛋，去除蛋清后，将蛋黄转移到滤纸片上滚动以便除去剩余蛋清和白色的黏着在蛋黄膜上的卵带，接着把蛋黄膜刺透，卵黄液收集到用冰冷却的容器中。
[0070] 实施例4～6是将实施例1～3得到的马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的具体应用。
[0071] 实施例4
[0072] 实施例1～3的马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用，具体保存方法包括以下步骤：取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:1.5，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600×g离心力离心8min，弃去上清液，再用冷冻保存液稀释至精子密度为5×107个/mL，混合均匀后，装入0.5mL细管中，缓慢降温至4℃平衡90min；再在距离液氮面上5cm处熏蒸10min后，投入液氮中保存。
[0073] 实施例5
[0074] 实施例1～3的马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用，具体保存方法包括以下步骤：取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:2，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600×g离心力离心12min，弃去上清液，再用冷7
冻保存液稀释至精子密度为8×10 个/mL，混合均匀后，装入0.5mL细管中，缓慢降温至4℃平衡120min；再在距离液氮面上6cm处熏蒸9min后，投入液氮中保存。
[0075] 实施例6
[0076] 实施例1～3的马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用，具体保存方法包括以下步骤：取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:1，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600×g离心力离心10min，弃去上清液，再用冷
