一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系
阅读：4发布：2020-06-01
专利汇可以提供一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种对JEV易感的猪扁桃 体细胞 系，该细胞系通过慢病毒颗粒感染原代猪扁桃体细胞系，并在添加嘌呤霉素的含血清的DMEM/F12培养液中进行细胞筛选，再将阳性细胞用不含嘌呤霉素的培养液扩大培养获得的；该慢病毒颗粒是通过以pHY-sv40-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助 包装 载体，共同 转染 进入293T细胞中获得的。本发明的细胞系具有无限传代的功能，对JEV敏感，可以用于相关研究。，下面是一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系专利的具体信息内容。
1.一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系，其特征在于，该细胞系是通过慢病毒颗粒感染原代猪扁桃体细胞系，并在添加嘌呤霉素的含血清的DMEM/F12培养液中进行细胞筛选，再将阳性细胞用不含嘌呤霉素的培养基扩大培养获得的；
其中，所述慢病毒颗粒是通过以pHY-sv40-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染进入293T细胞中获得的。
2.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系，其特征在于，所述原代猪扁桃体细胞系是在5％FBS的DMEM/F12培养基中进行培养过的，且在培养基中添加100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。
3.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系，其特征在于，所述慢病毒颗粒采用2％FBS的DMEM培养。
4.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系，其特征在于，所述扩大培养的培养基为不含嘌呤霉素的5％FBS的DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系，其特征在于，所述感染时加入5μg/mL的凝聚胺。
一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系
技术领域
[0001] 本发明涉及一种猪扁桃体细胞系，具体涉及一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系。
背景技术
[0002] 猪日本乙型脑炎(简称为乙脑)是由猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的常见病毒性脑炎，是一种人兽共患传染病，多种家畜、禽类以及人类都能够感染该病。该病主要经由蚊虫等吸血昆虫的叮咬以传播病毒，任何品种和性别的猪对该病均具有易感性。临床症状主要为妊娠母猪发生流产或是产死胎，初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡，公猪睾丸明显肿大，个别病猪可能出现神经症状，有些孕畜也会被感染流产。
[0003] PK-15细胞(猪肾上皮细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、PIEC细胞(猪髋动脉内皮细胞)等均是研究猪乙脑病毒感染常用的细胞系，但这些细胞的来源器官本身不感染或很少感染猪乙脑病毒，使用PK-15、ST、PIEC等细胞来研究猪乙脑病毒感染过程存在感染增殖不同于靶器官、先天性免疫应答不同于靶器官、获得性免疫应答不同于靶器官、病毒和细胞相互作用不同于靶器官等情况。这些病毒和基因的变化以及相互作用与靶器官的实际情况并不完全一致，甚至是完全不一样的，这种结果很可能会造成误导，导致实验结果和临床实际情况不一样，会影响临床的疫苗和药物开发。
[0004] 猪扁桃体是猪多种疾病的靶器官，也是发生体内感染的病灶。但是目前没有可用的猪扁桃体细胞系用于研究猪扁桃体对猪病感染和传播的作用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系，该方法解决了目前没有对猪病毒感染的猪扁桃体细胞系的问题，其具有无限传代的功能，且能维持猪扁桃体细胞的特性，在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化，且对JEV敏感，可以用于JEV的传代以及相关的研究。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供了一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系，该细胞系是通过慢病毒颗粒感染原代猪扁桃体细胞系，并在添加嘌呤霉素的含血清的DMEM/F12培养液中进行细胞筛选，再将阳性细胞用不含嘌呤霉素的培养基扩大培养获得的。
[0009] 优选地，所述慢病毒颗粒采用2％FBS的DMEM培养。
[0010] 优选地，所述扩大培养的培养基为不含嘌呤霉素的5％FBS的DMEM/F12培养基。
[0011] 优选地，所述感染时加入5μg/mL的凝聚胺。
[0012] 本发明的对JEV易感的猪扁桃体细胞系，解决了目前没有对猪病毒感染的猪扁桃体细胞系的问题，具有以下优点：
[0013] 本发明的细胞系首次以猪扁桃体细胞作为宿主细胞，转染带有SV40抗原基因的慢病毒表达质粒，经Puromycin筛选获得对JEV易感的猪扁桃体细胞系。该细胞系具有无限传代的功能，且能维持猪扁桃体细胞的特性，在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化；而且，该猪扁桃体细胞系对JEV敏感，JEV可以在此细胞内复制，以用于JEV的传代以及相关的研究，为JEV的培养提供了一个新的细胞系，扩大了JEV研究的宿主细胞的范围，对于JEV对免疫系统的致病机理研究有重要的意义。附图说明
[0014] 图1为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的培养生长情况图。
[0015] 图2为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的免疫荧光鉴定图。
[0016] 图3为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的生长条件的优化。
[0017] 图4为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的细胞增殖图。
[0018] 图5为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞和猪肾细胞感染JEV。
[0019] 图6为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞感染效率图。
[0020] 图7为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞转染表达绿色荧光蛋白。
具体实施方式
[0021] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系，该细胞系是通过慢病毒颗粒感染原代猪扁桃体细胞系，并在添加嘌呤霉素的含血清的DMEM/F12培养液中进行细胞筛选，再将阳性细胞用不含嘌呤霉素的培养基扩大培养获得的。
[0023] 其中，慢病毒颗粒是通过以pHY-sv40-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染进入293T细胞中获得的。
[0024] 上述原代猪扁桃体细胞系是在5％FBS的DMEM/F12培养基中进行培养过的，且在培养基中添加100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。
[0025] 上述慢病毒颗粒采用2％FBS的DMEM培养。
[0026] 上述扩大培养的培养基为不含嘌呤霉素的5％FBS的DMEM/F12培养基。
[0027] 在感染时加入5μg/mL的凝聚胺。
[0028] 实验例对JEV易感的猪扁桃体细胞系的特征验证
[0029] 采用免疫荧光对JEV易感的猪扁桃体细胞系的特征验证，具体步骤如下：
[0030] (1)细胞爬片
[0031] 取玻璃片于24孔板中，每孔加入DMEM/F12培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
[0032] (2)细胞接种5MOI JEV病毒，两小时后更换2％FBS的DMEM培养基，不同的时间点收获细胞样品。
[0033] (3)固定
[0035] (4)破膜封闭
[0036] 将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS 1:1混合(TritonX-100的最终浓度为0.25％)，再加10％血清(破膜封闭时血清来源需和二抗相同，若二抗用羊，则用羊血清)，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
[0037] (5)一抗孵育
[0038] 一抗配置：抗体与PBS 1:100(200)稀释。破膜后，取50μL一抗(2H4)于防水膜上(湿盒中)，将玻片有细胞的一面盖上置于4℃(最多可放置一周)，阴性对照组可用PBS代替一抗。
[0039] (6)二抗孵育
[0040] PBS洗3×5min/次，二抗混合液配置为：二抗(Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG)：PBS＝1:500，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)：PBS＝1：1000。防水膜上滴50μL二抗混合液，盖上玻片，避光，室温放置2h。
[0041] (7)包埋
[0042] PBS洗3×5min/次，玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
[0043] 如图1所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的培养生长情况图：图中A为PT细胞24小时的生长情况，图中B为PT细胞48小时的生长情况，图中C为PT细胞12小时的形态，图中D为PT细胞24小时的形态，图中E为PT细胞48小时的形态，图中F为PT细胞72小时的形态，从图中可以看出细胞形态为椭圆长梭形，直径约为15～20μm，形态与大部分上皮细胞类似。
[0044] 如图2所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的免疫荧光鉴定图(A：DAPI染色的细胞核，B：CK-19染色的角蛋白)，从图中可以看出并没有别的细胞种类，均为上皮细胞。
[0045] 如图3所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的生长条件的优化，图中A为PT细胞在不同胎牛血清(FBS)浓度下的生长情况，图中B为PT细胞在不同培养基(MEM，minimum Eagle’s medium；DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's medium；1640培养基)下的生长情况，从图中可以看出细胞的最佳生长条件为5％胎牛血清浓度的MEM培养基。
[0046] 如图4所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞的细胞增殖图，从图中可以看出细胞在12～24h之间进入对数生长期，24h后进入稳定生长期。
[0047] 如图5所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞和猪肾细胞感染JEV(MOCK为空白对照组，JEV为接毒实验组；A：接种5MOI JEV的生长曲线；B：接种0.5MOI JEV的生长曲线；C：接种5MOI JEV病毒在PT细胞中的复制情况；D：接种5MOI JEV病毒在PK细胞中的复制情况)，从图中可以看出JEV病毒在PT细胞中可以正常扩增。
[0048] 如图6所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞感染效率图(A：接毒24h后JEV E蛋白的表达；B：细胞核；C：E蛋白和细胞核的共定位；D：接毒48h后JEV E蛋白的表达；E：细胞核；F：E蛋白和细胞核的共定位)从图中可以看出在48h，PT细胞已经全部感染JEV。
[0049] 如图7所示，为本发明对JEV易感的猪扁桃体细胞转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的荧光图(A：PT细胞转染GFP 24h后GFP的表达情况；B：细胞核；C：GFP与细胞核的共定位；D：PT细胞转染GFP 48h后GFP的表达情；E：细胞核；F：GFP与细胞核的共定位)，从图中可以看出PT细胞转染GFP质粒的效率较高。
[0050] 以下对本发明的JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法进行详细的说明，具体为：
[0051] 1、猪扁桃体细胞的培养
[0052] 将猪新鲜扁桃体于超净台放入无菌平皿内，剥离除掉包膜等结缔组织，用Hank's液洗涤3～5次，至洗出的Hanks液体透明澄清为止，然后将扁桃体组织剪碎至糊状，组织碎块直径约为1～2mm，加入少量Hank's液，移入无菌带玻璃珠的三角烧瓶内，用力振摇使细胞分散，然后静止片刻，使组织碎块下降，收集上层细胞悬液，接种至细胞培养皿，并添加青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL(防止细菌的污染)，隔天换液一次。
[0053] 2、猪扁桃体上皮细胞中Puromycin的最小致死浓度的测定
[0054] 以Puromycin(嘌呤霉素)作为筛选药物，由于表达载体pHY-SV40-Puro上有Puromycin抗性基因Puro，外源基因得到表达的猪扁桃体上皮细胞能够在含有一定浓度Puromycin的培养液DMEM/F12(购自gibco)中存活，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞Puromycin的最小致死浓度来作为筛选浓度。
[0055] Puromycin的最小致死浓度测定，具体如下：
[0056] 在猪扁桃体上皮细胞的培养中加入浓度梯度的Puromycin筛选一周，测定正常细胞Puromycin的最小致死浓度。当培养液中Puromycin的浓度达到2μg/mL时，显微镜下可见细胞全部死亡，所以Puromycin的最小致死浓度为2μg/mL。
[0057] 3、获得含有慢病毒载体pHY-SV40-Puro的慢病毒颗粒
[0058] 将psPAX2(6μg，购自addgene，#12260)，pCMV-VSV-G(6μg，购自addgene，#8454)，pHY-SV40-Puro(7.5μg)(购自addgene，HH-LV-005)共同转染进入293T细胞中。其中，pHY-SV40-Puro为慢病毒表达质粒(即作为慢病毒载体)，psPAX2(表达慢病毒外壳的质粒)和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，该表达载体pHY-SV40-Puro上有Puromycin抗性基因Puro。
[0059] 混合物加入细胞，继续培养48h，收集细胞上清样品；换新培养基，72h时收集细胞上清样品；
[0060] 上清3500rpm离心10min，去除细胞碎片。用0.45μM滤器过滤后，分装(1ml/管)，-80℃保存。
[0061] 在转染48h后，荧光显微镜下观察标记基因EGFP(增强绿色荧光蛋白，pHY-SV40-Puro携带的)表达产生的荧光，同时收获上清液。在转染72h后，收获上清液和细胞，与前述上清液混合。
[0062] 反复冻融三次，使细胞破裂，然后用0.45μm一次性滤器过滤，收集上清液，将该上清液与5×PEG 8000混合，4℃沉降过夜，4000g离心10分钟，去除上清，将沉淀用DMEM培养液溶解，-80℃储存待用。
[0063] 4、慢病毒颗粒感染猪扁桃体上皮细胞
[0064] 当原代猪扁桃体上皮细胞生长到第7天时，进行慢病毒感染，同时加入polybrene(5μg/mL，凝聚胺)提高病毒感染能力。
[0065] 在感染24h后，更换新鲜培养液。在感染72h后，加入Puromycin至终浓度2μg/mL。
[0066] 5、pHY-SV40-Puro载体阳性表达的筛选
[0067] pHY-SV40-Puro慢病毒颗粒感染猪扁桃体上皮细胞后，在含血清的DMEM/F12培养液中添加终浓度为2μg/mL的Puromycin进行细胞筛选。
[0068] 慢病毒感染细胞72h后，表达载体被表达并且在荧光显微镜下可以看到绿色荧光。当感染慢病毒的猪扁桃体上皮细胞能够发出绿色荧光，说明pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T已经进入细胞并且阳性表达。此时，将Puromycin浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见阳性细胞呈岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然呈绿色。然后，消化细胞，用含Puromycin的DMEM/F12培养液扩大培养。
[0069] 所筛选的阳性细胞都是稳定转染pHY-SV40-Puro的细胞，目的基因SV40T整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外。在稳定转染过程中，质粒pHY-SV40-Puro上携带的基因会整合到宿主的基因组上，通过Puromycin筛选14天再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转染的阳性细胞中持续表达，因此筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现Puromycin抗性。
[0070] 将筛选的阳性细胞用不含Puromycin的培养液至少扩大培养50代，即构建得到猪扁桃体上皮细胞系。
[0071] 本发明的JEV易感的猪扁桃体细胞系中转入的绿色荧光蛋白(EGFP)标签的启动子已经被甲基化，在荧光显微镜下无荧光，有利于细胞系进行后续的荧光实验不受干扰。
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