小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用
阅读：1030发布：2020-07-12
专利汇可以提供小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。通过胎肝基质细胞获取及体外培养，骨髓LK细胞分离和细胞骨髓腔内移植的操作步骤完成。本发明制备的胎肝基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复，促进HSC的增殖和快速扩增，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。，下面是小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用专利的具体信息内容。
1.一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)胎肝基质细胞获取及体外培养
颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养，接种20-28h后初次换液，此后每
2-3天换液，当细胞汇聚程度达78-82％时按照1:2传代培养。
(2)骨髓LK细胞分离
将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin-c-Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用；
(3)细胞骨髓腔内移植
取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5-2mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用20-30μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞，注射骨髓LK细胞和胎肝基质细胞，培养6-12周。
2.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，所述培养皿中的培养液为高糖DMEM，15％胎牛血清(v/v)，1％青/链霉素(v/v)和0.1mMβ-巯基乙醇。
3.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(3)所述骨髓LK细胞的注射量为1.7*104个，胎肝基质细胞的注射量为2.3*105个。
4.根据权利要求1-3所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述滤网孔径大小为30μm。
5.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(3)所述注射器为1mL注射器，进样器为25μL进样器。
6.权利要求1制备的小鼠胎肝基质细胞在造血辅助中的应用。
小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于造血细胞构建技术领域，具体涉及小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。
背景技术
[0002] 基质细胞最早由Friedenstein A等从豚鼠BM中分离得到，与造血细胞不同，它们是一类可以在塑料材质器皿上贴壁生长的成纤维样细胞，后来这类细胞被发现能向成骨、软骨和脂肪细胞分化，因此基质细胞就慢慢被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)，但由于对小鼠MSC的认定缺乏统一的标准，国内外不同研究者建立的MSC差异很大，这些差异主要体现在表面标志表达上。一般认为MSC不表达血系标志CD45，但也有研究者分离到CD45+的小鼠BM MSC。CD34作为一种造血细胞的标志同样被认为在MSC中不表达，但Peister等人从B1/6小鼠BM中分离得到的MSC CD34阳性率超过75％。CD44为透明质酸的受体，普遍认为在MSC中高表达，但仍有研究者培养得到的两类基质细胞都不表达CD44。Sca-1是小鼠HSC的标志，其在MSC中的表达率也存在争议，不同研究差别较大，Post S等人得到的BM MSC Sca-1阳性率高达90％，而在张荣耀等人的研究中只有32％，Saeed等人分离得到的BM MSC，Sca-1阳性率则介于60％-90％之间。需要指出的是，MSC高表达整联蛋白CD29，不表达淋巴细胞标志CD11b，目前仍是公认的观点。表达不同表面标志的MSC常常具有不同的形态，惠大阳等人培养获得了近圆形、成纤维细胞形和纺锤多边形三种类型的BM MSC，其中近圆形细胞CD90表达率为16％，另两种类型的细胞则为90％左右；苑春慧等人分离得到的上皮形FL MSC CD105阳性率为97％，而成纤维形细胞仅为14％。
[0003] 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)作为目前临床应用最为广泛的成体干细胞，被用于治疗各类急慢性白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血、地中海贫血、重症联合免疫缺陷等血液和免疫系统疾病，但是由于来源于外周血(peripheral blood,PB)、骨髓(bone marrow，BM)和脐带血的HSC资源稀缺，导致了大量病人无法及时进行HSC移植，因此如何在体外获得大量的HSC成为了相关领域的研究热点。哺乳动物胎肝(fetal liver,FL)造血时期是HSC成熟和快速扩增的时期，FL中除了血系细胞外，还有各类能在体外贴壁生长的非血系细胞，他们被统称为基质细胞，由FL基质细胞构成的造血微环境对HSC的扩增起到了重要的辅助作用。目前国内外的研究集中于将FL基质细胞作为饲养层细胞，诱导其他类型的细胞分化为HSC并大量扩增，但在目前的研究中，鲜有科研人员探索FL基质细胞在体内发挥的造血辅助作用：其在体内环境下的造血辅助作用是否与体外有所差异，能否促进外源HSC在受体体内的归龛、增殖和分化等问题仍有待探索。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。
[0005] 一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，按照如下步骤进行：
[0006] (1)胎肝基质细胞获取及体外培养
[0007] 颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养，接种20-28h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达78-82％时按照1:2传代培养；
[0008] (2)骨髓LK细胞分离
[0009] 将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin-c-Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用；
[0010] (3)细胞骨髓腔内移植
[0011] 取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5-2mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用20-30μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞，注射骨髓LK细胞和胎肝基质细胞，培养6-12周。
[0013] 优选的，步骤(3)所述骨髓LK细胞的注射量为1.7*104个，胎肝基质细胞的注射量为2.3*105个。
[0014] 优选的，步骤(1)和步骤(2)所述滤网孔径大小为30μm。
[0015] 优选的，步骤(3)所述注射器为1mL注射器，进样器为25μL进样器。
[0016] 上述制备的小鼠胎肝基质细胞在造血辅助中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：本发明制备的胎肝基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复，促进HSC的增殖和快速扩增，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。附图说明
[0018] 图1为基质细胞形态及表面标志表达；
[0019] 图中，A：FL基质细胞；B:BM基质细胞；bar：100μm。
[0020] 图2为受体生存率及各项血液指标变化；
[0021] 图中，A：生存率；B：PB各项血液指标；C：移植后前两周PLT、RBC和HGB含量；p<0.05表示有统计学意义。
[0022] 图3为受体外周血和骨髓外源血系细胞嵌合率及染色(800X)；
[0023] 图中，A：受体嵌合率；B：瑞氏-吉姆萨染色。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0025] 下述实施例采用的实验动物及主要试剂如下：
[0026] FL基质细胞来源于C57BL/6CD45.2/CD45.2雌鼠与雄鼠交配后怀孕13.5天(E13.5)的胎鼠，BM基质细胞来源及细胞移植受体小鼠为C57BL/6CD45.2/CD45.2雌鼠；BM LK细胞来源于C57BL/6CD45.1/CD45.2雌鼠。小鼠购置于上海灵畅生物科技有限公司[生产许可：SCXK(沪)2013-0018]和上海南方模式生物科技股份有限公司[生产许可：SCXK(沪)2017-0010]。淋巴细胞分离液(Stemcell)；Lin-c-Kit+细胞磁珠分选试剂盒(Miltenyi)；CD44、CD29、CD45.1、CD45.2及Sca-1抗体均购置于BD Phamingen公司。
[0027] 实施例1基质细胞获取及体外培养，表面标志表达检测
[0028] 颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出FL并吹打为细胞悬液，过30μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离FL单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿上，培养液为高糖DMEM+15％胎牛血清(v/v)+1％青/链霉素(v/v)+0.1mMβ-巯基乙醇，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养。接种24h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达80％左右时按照1:2传代培养。BM基质细胞取自小鼠胫骨及股骨，除了培养液为低糖DMEM外，其余培养方式同FL基质细胞。
[0029] 取培养1-4代的FL及BM基质细胞，用0.25％的胰酶溶液消化细胞，然后用磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗一次，加入CD44、CD29及Sca-1抗体4℃避光孵育25min，PBS洗两次后用流式细胞仪(Beckman,CytoFlex)分析。
[0030] 原代细胞接种24h后，在显微镜下即可看见有贴壁的基质细胞出现，原代培养的基质细胞形态多为近圆形，短梭形和成纤维细胞形，另有一些不规则的有突起的细胞，在以后的培养过程中会向短梭形细胞过渡(图1)。
[0031] 实施例2FL基质细胞骨髓腔内移植
[0032] BM LK细胞分离将两只C57BL/6CD45.1/CD45.2雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出BM细胞，过30μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到BM单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin-c-Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用。
[0033] FL基质细胞和MEF细胞悬液制备选用培养第4代(P4)的E13.5FL基质细胞和P4MEF，胰酶消化后离心，用PBS重悬细胞后计数，置于4℃备用。
[0034] 细胞骨髓腔内移植：将20只C57BL/6CD45.2/CD45.2小鼠(前一天均接受9.0Gy60COγ射线辐射)分为4组，每组5只，分别命名为“PBS”组、“LK”组、“LK+FL”组、“LK+MEF”组，1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用1mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用25μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞。PBS组注射20μL PBS；LK组注射1.7*104BM LK细胞；LK+FL组注射1.7*104LK细胞加2.3*105FL基质细胞；LK+MEF组注射1.7*104LK细胞加2.3*105MEF。
[0035] 在细胞移植后的第1、2、3、4、6、8周通过尾尖采血获得受体小鼠PB，并通过血液分析仪(Sysmex,XT-2000i)检测并记录各项血常规数据。
[0036] 在细胞移植后第9周经眼球放血处死受体小鼠，获取PB和BM单个核细胞，加入CD45.1及CD45.2抗体，4℃避光孵育25min，PBS洗两次后进行流式细胞术检测。受体嵌合率计算方法为：CD45.1+CD45.2+细胞量/(CD CD45.1+CD45.2+细胞量+CD45.1-CD45.2+细胞量)*100％。
[0037] 细胞移植后第9周制作受体PB及胸骨BM涂片。PB涂片用瑞氏-姬姆萨染色，A液染色1min后加B液染3min；BM涂片：A液染色3min后加B液染7min。染色结束后用自来水冲洗，干燥后置于光学显微镜下观察。
[0039] 为了探讨FL基质细胞在体内的造血辅助作用，发明人将E13.5P4FL基质细胞和BM LK细胞混合后移植到了前一天接受9.0Gy 60COγ射线(致死剂量)辐射的受体小鼠的胫骨骨髓腔内。结果显示PBS组受体在移植后8-10天全部死亡，LK及LK+MEF组分别在移植后第10天和第8天发生了受体死亡的现象，而LK+FL组受体在两个月内存活率为100％(图2中的A)，表明FL基质细胞可能在造血重建过程中发挥了重要的造血辅助作用。
[0040] 为了进一步探明FL基质细胞发挥的具体作用，发明人记录了在移植前后各组受体PB中血小板(PLT)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和网织红细胞(RET)的含量(图2中的B)，其中第0周为辐射前一天数据。受体小鼠经辐射后PB中PLT数量急剧降低，在第1周各组数值均为不足正常水平的1/10，而RBC和HGB的含量在移植后一个月时间内都围绕正常值的75％上下波动，此后逐渐恢复，在移植后一个半月左右恢复正常。虽然整体看来三个移植组PLT、RBC和HGB的恢复情况基本一致，但是在移植后前两周，LK+FL组PLT含量均高于其余两组；在移植后第2周，其RBC和HGB含量也显著高于LK组(图2中的C)，这表明FL基质细胞可能在造血重建的早期促进了PLT和RBC的生成。移植后第1周到第2周这一时间段的特殊性可通过RET的变化进行阐释，RET是未成熟的RBC，在PB中的含量反应了BM中RBC的生成状况，移植后第1周各组受体RET数量都显著降低，为正常水平的10％左右，表明受体自身的BM RBC生成能力严重受损；但是在移植后第2周，各组RET数量急剧上升，达到正常值的3倍左右。RET在移植后1到2周的异常增多表明此时外源造血细胞已经开始迅速增殖分化，但尚未生成大量成熟血细胞，而只是产生了未成熟的各类血细胞，不能有效发挥相应的生物学功能，因此受体小鼠在这个阶段容易死于造血衰竭。发明人的研究表明在造血重建的早期阶段(移植后1-2周)，宿主自身的各类血细胞基本耗竭，而外源造血细胞尚未生成大量成熟血细胞，因此受体容易死于造血衰竭，而FL基质细胞在这一阶段发挥了重要的造血辅助作用——促进了PLT和RBC的快速恢复，从而避免了受体的死亡。
[0041] 移植9周后LK、LK+FL及LK+MEF组PB中外源血系细胞嵌合率分别为78.8％、80.8％和70.0％；在BM中分别为89.9％、90.0％和88.5％(图3中的A)。此结果表明9.0Gy的60COγ射线辐射几乎完全破坏了受体本身的造血功能，而BM LK细胞能在宿主骨髓腔内扩增并分化成为各类成熟的血细胞，具有优秀的造血重建能力，同时也表明骨髓腔可能是一个高效的HSC移植位点。
[0042] 血涂片显示各组PB中均存在大量典型的两面凹的圆盘状的RBC，以及有分叶核的中性粒细胞、单个核的淋巴细胞和单核细胞等血细胞；BM中的细胞都为有核细胞，各类细胞的细胞核普遍较大但数目不一，有大量多核的细胞存在(图3中的B)。三个移植组PB与BM中细胞类型和比例与Control组无明显差别，表明外源造血细胞在宿主体内重建了健康的血液系统，没有引起血液类疾病，证明了骨髓腔内移植HSC及基质细胞的可靠性和安全性。
[0043] 在本发明中，发明人初步证实了FL基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复。虽然从取材和伦理角度来说，用BM或脐带作为细胞来源比FL更加容易，但从促进HSC的增殖和快速扩增的角度来说，FL基质细胞具有很大的优势，因而在后续的研究中，发明人将进一步探索体内真正具有造血辅助作用的FL基质细胞类群，并找出关键的细胞因子及基因，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。
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