一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法
专利汇可以提供一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种大鼠 肺 微血管内皮细胞分离培养方法，采用ECM内皮细胞专用培养基培养大鼠肺微血管内皮细胞，其它类型细胞混杂少，内皮细胞专用培养基ECM培养的PMVECs纯度则高达99.28％，内皮细胞生长速度快平均2-3天可传一代，可以更好的满足后续实验研究，建立了一种取材方便、操作简单、繁殖速度快、纯度高的一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法。，下面是一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法专利的具体信息内容。
1.一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2％戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75％酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；
(2)取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次1min；
(3)除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，
100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3mm宽的肺外边缘组织块；
(4)将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10％FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到100mm培养皿中，于5％CO2培养箱中在37℃条件下培养。
(5)2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5％FBS、1％ECGS)，培养液以每隔48h更换1次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培 养基，继续培养；
(6)培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；
(7)原代细胞培养3-5天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；
(8)弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤1遍，加入1.5mL 0.125％的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；
(9)将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min；
(10)弃上清，用含5％胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2-3d换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
2.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：所用的大鼠为四周龄的SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10％FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到100mm培养皿中，于
5％CO2培养箱中在37℃条件下培养。
4.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5％FBS、1％ECGS)， ECM培养液为血管内皮细胞专用培养液，以每隔48h更换1次培养基继续培养，72-90h后移除组织块，更换培养基，继续培养。
5.一种采用如权利要求1获得的大鼠肺微血管内皮细胞纯度鉴定方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2X106个细胞，一管加APC标记抗人CD31抗体，另一管加同型阴性对照，4℃避光孵育30min；
(2)PBS洗涤，1000转/min，离心10min；
(3)弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；
(4)流式细胞仪检测细胞纯度。
一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min；弃上清，用含5％胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔
2换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人CD31抗体，另一管加同型阴性对照，4℃避光孵育30min；PBS洗涤，1000转/min，离心10min；弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，
200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，如图3所示，培养的PMVECs纯度高达99.28％。
将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min；弃上清，用含5％胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔
2换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人CD31抗体，另一管加同型阴性对照，4℃避光孵育30min；PBS洗涤，1000转/min，离心10min；弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，培养的PMVECs纯度高达99.22％。
将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min；弃上清，用含5％胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔
2换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人CD31抗体，另一管加同型阴性对照，4℃避光孵育30min；PBS洗涤，1000转/min，离心10min；弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，培养的PMVECs纯度高达99.11％。
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