ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用
阅读：5发布：2021-02-07
专利汇可以提供ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于病毒学和 生物 药学领域。具体而言，本发明提供了ORF7 缺陷 型 水 痘病毒、含有该病毒的 疫苗 及其应用，提供了用于 预防 水痘和/或带状疱疹的疫苗，其包含水痘病毒以及疫苗用赋形剂或载体，其中所述水痘病毒的如SEQ ID NO:1所示的ORF7全部或部分缺失，由此得到的病毒不能够感染人的 皮肤 或感觉神经节。，下面是ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用专利的具体信息内容。
1.用于预防水痘和/或带状疱疹的疫苗，其包含水痘病毒以及疫苗用赋形剂或载体，其中所述水痘病毒的如SEQ ID NO:1所示的ORF7全部或部分缺失，由此得到的病毒不能够感染人的皮肤或感觉神经节。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述ORF7全部或部分被抗生素抗性基因所取代。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述抗生素抗性基因选自：青霉素、链霉素、以及卡那霉素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述ORF7片段的序列如SEQ ID NO：13所示。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中水痘病毒是于2009年7月28日以保藏编号为CGMCC No.3207保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的水痘病毒。
6.水痘病毒在制备用于预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途，其中所述水痘病毒的如SEQ ID NO:1所示的ORF7全部或部分缺失，由此得到的病毒不能够感染人的皮肤或感觉神经节。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述ORF7全部或部分被抗生素抗性基因所取代。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述抗生素抗性基因选自：青霉素、链霉素、以及卡那霉素抗性基因。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述ORF7片段的序列如SEQ ID NO：13所示。
10.根据权利要求6所述的用途，其中水痘病毒是于2009年7月28日以保藏编号为CGMCC No.3207保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的水痘病毒。
ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用
技术领域
[0003] 水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus:VZV，简称“水痘病毒”或“VZV”)是严格种属特异性的病毒，是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。其中，P-Oka株是由Takahashi等于1971年在日本Oka姓氏的3岁男孩的水痘囊泡液中分离出来的，并经人胚肺细胞培养获得的，被认为具有引发水痘和带状疱疹功能(Takahashi M,Otsuka T,Okuno Y,et al.Live vaccine used to prevent the spread of varicella in children in hospital.Lancet 1974；2:1288–90.)。
[0004] 美国专利3985615中公开了P-Oka株通过豚鼠胚胎组织(GPEC)和人胚肺细胞多次传代，产生减毒的V-Oka病毒，制备预防水痘的V-Oka活疫苗。美国专利4000256中叙述了用人胚成纤维细胞WI-38株传代培养VZV病毒10-80次生产VZV减毒疫苗。但迄今为止，只有P-Oka株经细胞传代获得的“水痘病毒减毒冈株”(特公昭53-41202号公报；Lancet 2：1288-1290，1974)为WHO批准的唯一用于预防水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株，该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用[Requirement for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984:
WHO Technical Report Series,No.725,pp.102-104,1985]。但是，尽管水痘疫苗接种的人群比水痘自然感染人群的带状疱疹发生率低，且大多为免疫功能低下儿童，但是，带状疱疹发生是不争的事实，且从患者的疱疹中分离到V-Oka株(Schmid D.S，et al.Impact of Varicella Vaccine on Varicella-Zoster Virus Dynamics，CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS,Jan.2010,p.202–217)。
WHO Technical Report Series,No.725,pp.102-104,1985]。但是，尽管水痘疫苗接种的人群比水痘自然感染人群的带状疱疹发生率低，且大多为免疫功能低下儿童，但是，带状疱疹发生是不争的事实，且从患者的疱疹中分离到V-Oka株(Schmid D.S，et al.Impact of Varicella Vaccine on Varicella-Zoster Virus Dynamics，CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS,Jan.2010,p.202–217)。
[0005] 专利CN1163604C涉及水痘病毒减毒冈株的鉴定，并且从分子水平上揭示该毒株是由多个不同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中，源于V-Oka疫苗接种者产生V-Oka株的带状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的，但是，现在还没有其它预防VZV的疫苗株上市。该病毒具有严格种属特异性，人是其唯一的自然宿主，没有合适的动物模型研究VZV基因功能；再者该病毒对宿主细胞具有强结合性，游离的病毒极易失活，获得可供转化的VZV病毒DNA非常困难，故很长时间以来该病毒基因功能研究的进展极为缓慢。
[0006] 但是，随着细菌人工染色体(BAC)在研究中的应用，组织培养技术的进步，异种生物间器官移植屏障的突破(联合免疫缺陷型小鼠的开发)，拓宽了种属特异的VZV基因功能研究的空间，可以在体外或移植到动物体内进行VZV基因功能研究。2004年Kazuhiro N.等在“Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli”一文中揭示被克隆到BAC载体上的VZV Oka株全基因组，可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖，BAC可被一同转化到人胚肺细胞中的Cre酶精确切除，产生的重组VZV病毒具有p-Oka同样结构，完全具有亲本病毒的特性。BAC的应用为VZV的功能研究带来了极大便利，可以对VZV每个基因进行功能研究，加速了VZV基因功能研究的进程。
[0007] 水痘-带状疱疹病毒(VZV)的ORF7位于病毒基因组的8607-9386bp之间，编码一个29kDa的蛋白，可能位于皮层结构中，它的功能目前仍不清楚。
[0008] 本发明人经过不懈的研究，惊奇地发现，ORF7决定着VZV感染人皮肤和感觉神经节的功能。当ORF7缺陷即发生如下情况之一：全部或部分缺失、被插入终止密码子，以及被一个或多个碱基取代，特别是删除了ORF7或者ORF7产生翻转反向移码突变时，ORF7的功 能丧失，即VZV不感染皮肤和感觉神经节，故不存在产生水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害(我们在本发明中称之为ORF7缺陷引起的功能丧失，所述功能是指能够感染人的皮肤和感觉神经节)。ORF7删除的水痘病毒株(VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC)可以在大肠杆菌中进一步经抗生素筛选或半乳糖筛选(麦糠基氏培养机上产生亮红色斑)得到单一克隆株，不存于混合型V-Oka株的潜在危害，这为开发更加安全有效的疫苗带来了希望。
发明内容
[0009] 本发明的一个方面涉及一种水痘病毒(例如P-Oka株)，其基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入，并且所述的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。
[0010] ORF7(8607-9386bp)的序列如下：
[0011]ATGCAGACGGTGTGTGCCAGCTTATGTGGATATGCTCGAATACCAACTGAAGAGCCATCTTATGAAGAGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAACCGCTGTGAATGGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGTCGTTTGGTCCGCGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACAGCACCATTTTACTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAAC
AAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATGTTATGCTTGTATAA(SEQ ID NO:1)
AAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATGTTATGCTTGTATAA(SEQ ID NO:1)
[0012] 在本发明的一个实施方案中，ORF7全部或部分被抗生素抗性基因和/或者无功能的核酸序列所取代。所述无功能的核酸序列是指该核酸序列不使ORF7功能恢复，即水痘病毒仍不能感染皮肤和感觉神经节，该无功能的核酸序列可以是不编码融合蛋白的，也可以是编码蛋白的核酸序列，只要所编码的蛋白不会使ORF7功能的恢复。在本发明的一个实施方案中，所述无功能的核酸序列是翻转反向移码突变的ORF7片段。
[0013] 术语“ORF7片段”是指ORF7的全部或部分核酸序列。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，所述翻转反向移码突变的ORF7片段的序列如SEQ ID NO：13所示。
[0016] 在一个具体的实施方式中，发明人以来自斯坦福大学医学院Dr.Ann Arvin实验室的P-Oka临床分离株为材料，以VZV-BAC(P-Oka)为框架，应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长ORF7被Kanr基因取代而产生VZV-7D BAC株或被翻转反向移码突变的ORF7部分片段取代而产生VZV-7DRM BAC株。其中，Kanr基因的序列如下：
[0017]ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCA GTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA(SEQ ID NO:2)[0018] 具体地，本发明提供一种水痘病毒，其保藏编号为CGMCC No.3207，保藏日期2009年7月28日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0019] 体内外实验证实该病毒株不感染人皮肤和感觉神经节，故极可能不存在引发水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害；该毒株可在MRC-5、Mewo、或ARPE细胞上生长，且同P-Oka株生长特性一致，并且也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性；该毒株保留了P-Oka株的所有糖蛋白，其免疫原性理应同P-Oka株的免疫力相同；该毒株是通过Kanr筛选或半乳糖筛选单一克隆株，不存于混合型V-Oka株的潜在危害；由于整个ORF7删除，或以翻转反向移码突变，VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC株不可能产生回复突变，因而，以VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC株制备减毒活疫苗更为安全和有效。
[0020] 本发明的另一方面涉及上述的水痘病毒的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 1)将野生型水痘病毒的基因组克隆到BAC载体上，然后通过细菌内重组，使得水痘病毒的基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一 个或多个碱基取代或插入，导致得到的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节；
[0022] 2)分离1)中得到的水痘病毒的DNA，并与含Cre酶的重组质粒共转染Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞；
[0023] 3)通过Cre酶的作用在Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞中删除BAC。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，所述野生型水痘病毒是P-Oka株，并且步骤1)中所述的ORF7被Kanr取代，或者翻转反向移码突变的ORF7片段所取代。在一个具体的实施方式中，所述翻转反向移码突变的ORF7片段是SEQ ID NO：13。
[0025] 本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有上述的任一种水痘病毒。
[0026] 本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的疫苗，其含有上所述的任一种水痘病毒，以及疫苗用赋形剂或载体。
[0027] 在本发明中，术语“预防水痘和/或带状疱疹的疫苗”是指水痘疫苗、带状疱疹疫苗、以及预防水痘和带状疱疹的疫苗。
[0028] 本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒在制备预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途。
[0029] 本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒的DNA在制备表达载体中的用途。
[0030] 发明的还一方面涉及一种表达载体，其由BAC和插入到BAC中的上述的任一种水痘病毒的DNA组成。一种表达载体，其为上述的任一种水痘病毒的DNA。上述的表达载体至少可以插入10kb的外源基因而不影响其本身生长和增殖，可用于表达外源基因，并且所述表达载体由于ORF7功能缺失而变得安全。也可以将该表达载体用荧光素酶基因标记(Zhang et al.Journal of Virology,Sept,2007,p9024-9033)，用于体内外VZV-7DRM功能研究的监测。
[0031] 发明的还一方面涉及一种重组载体，其含有上述的表达载体以及 插入的外源基因。
[0032] 发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有上述的表达载体或重组载体。
[0033] 本发明的一个实施方案中，所述重组细胞所用的宿主细胞选自如下细胞：
[0034] MRC-5、Mewo、ARPE、2BS、WI-38、以及KMB17。
[0035] 本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的方法，包括给予患者接种有效量的上述疫苗的步骤。
[0037] 图1：p-Oka BAC(VZV BAC)载体构建。
[0038] 图2：ORF7缺失BAC株(VZV-7D BAC)的制备。
[0039] 图3：ORF7缺失的VZV病毒的电泳鉴定。
[0040] 图4：VZV-7D病毒的背根神经节培养。A.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在MeMo细胞中的生长曲线。B.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在背根神经节(DRG)中的生长曲线。
[0041] 图5：ORF-7回复突变(VZV-7R)水痘病毒的制备。
[0042] 图6：带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人体MeWo细胞中生长曲线。
[0043] 图7：带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人胸腺组织培养(TOC)物中的生长曲线。
[0044] 图8：带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人皮肤组织培养(SOC)物中的生长曲线。
[0045] 图9：A.用WT、VZV-7DRM和VZV-7R的DNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞中生长。B.背根神经节(DRG)从人胚胎的脊髓中分离所得。C.DRG被移植到重症联合免疫缺陷(SCID-hu)小鼠的肾囊里，WT或VZV-7DRM病毒感染DRG，用IVIS仪器测试病毒生长，VZV-7DRM不能在SCID-hu鼠(植入人组织的重症联合免疫缺陷鼠)中生长。D.感染后GFP强度增加显示，野生型(WT)VZV能够在DRG培养物中生长。
具体实施方式
[0046] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0047] 实施例1：p-Oka BAC(VZV BAC)载体构建
[0048] 1)BAC载体(pUSF-6)，含有原核复制起始序列(Ori)、复制和分区基因(repE,parA and parB),氯霉素抗性基因(camR)、绿色荧光蛋白(gfp)，两个500bpVZV片段a和b(灰色)、两个loxP位点(白色)。pUSF-6用BamH1消化成线性结构，通过同源重组将pUSF-6插入含VZV的科斯质粒pvSpe23中；
[0049] 2)p-Oka基因结构模式图显示VZV由125kb核苷酸组成，包括一个长片段(UL)和一个短片段(US)。完整基因组被消化成4个含重叠区的VZV基因片段，克隆到科斯质粒中，产生4个重组克隆pvFsp73、pvSpe14、pvPme19和pvSpe23，pUSF-6通过同源重组插在VZV科斯质粒pvSpe23的ORF60和ORF61之间；
[0050] 3)含BAC载体(pUSF-6)的pvSpe23与其它三个VZV科斯质粒共转染MeWo细胞，重组病毒(VZVBAC)能在MeWo细胞中复制并产生绿色荧光斑。
[0051] 另外，操作过程也可以参见Fig.1。
[0052] 比较VZV BAC病毒和野生型pOka病毒的生长曲线。病毒感染后每天记录蚀斑形成单位数(PFU)。结果显示VZV BAC病毒(绿色)没有出现生长缺陷，与亲本病毒体外生长一致。
[0053] 实施例2：ORF7缺失的BAC株(VZV-7D BAC)的制备以及检验
[0054] ORF7删除的VZV突变体的构建可以参照luc VZV BAC(Zhang et al.Journal of Virology,Sept,2007,p9024-9033)。操作过程也可以参见Fig.2以及下面的步骤：
[0055] 1.设计的两条引物各包含20bp的卡那霉素抗性基因同源核苷酸序列和ORF7删除区起始或终止密码子相连的40bp同源序列。所用引物F1、R1如下：
[0056] F1：GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGT TGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO:3),
[0057] R1：AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAG TGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO:4)。
[0058] 卡那霉素抗性基因从质粒pGEM-oriV/kan1上扩增(Netterwald,Yang et al.2005)，PCR产物用DpnI酶进行消化，用Qiagen凝胶提取试剂盒进行回收。
[0059] 2.以1.6kv,250μF的BioRad Gene Pulser II电转仪将大约200ng的PCR产物转进载有VZVLuc BAC的DY380菌体中。
[0060] 3.采用大肠杆菌DY380株作为高效同源重组系统，所需同源序列短至40bp。利用重组酶42℃激活/32℃抑制的特性，完成Kanr基因与ORF7的同源重组，ORF7被Kanr基因取代，在32℃下从含有30μg/ml卡那霉素的琼脂板上选择单克隆的重组子，从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株(ORF7缺失)VZV-BAC的DNA。
[0061] 4.所得病毒基因组完整性由HindIII酶切检验，重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7缺失的BAC株(VZV-7D BAC)，其ORF7 被Kanr基因取代。
[0062] 实施例3：ORF7翻转反向移码突变BAC株(VZV-7DRM BAC)的制备以及检验[0063] 思路如下：用galk基因取代野生型病毒中的ORF7序列，含galk基因的VZV在以半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏琼脂培养物上产生亮红色斑，用这种方法筛选出单克隆；再用翻转反向移码突变序列取代galk，在完全培养基和基础培养基上筛选单克隆，获得VZV-7DRM BAC
[0064] 步骤如下：
[0065] 1.设计正反向引物5′端各含有60bp ORF7基因两端侧翼同源序列的galk基因表达框的扩增引物F2和R2。从pgalk上扩增galk基因序列(1-82bp为启动子，83-1231bp为galk的ORF)，序列如下(SEQ ID NO:5)：
[0066]CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGGCTACCCTGCCACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAACGACGGTTTCGTTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTAAAGTTCGCGTGATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCACATGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGTAACAACAGCTTCGGCGGCGTGGACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCG GCAAGAAAGATCATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTGTGGCTGTCGTCATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAACAGTGCGAAACCGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGCTGTTGCGCATGAACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCGTTGAAGCTGCCAGCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGGAGTCTCATGCCTCTATGCGCGATGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGATTGGCGACAAAGGTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAGAGCTGGTGCCTGCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTTTACGTTTGTAAACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA(SEQ ID NO:5)
[0067] F2和R2序列如下：
[0068] F2：ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:6)；
[0069] R2：TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTT CAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:7)；
[0070] 2.用此引物扩增galk基因表达框，用DpnI消化过夜后纯化；
[0071] 3.用VZV BAC转化大肠杆菌SW102；
[0072] 4.挑取单克隆接种到5ml LB-CM(含氯霉素LB)的培养基，在 32℃培养过夜；
[0073] 5.用过夜培养菌接种到250ml LB-CM培养液中，32℃振荡培养到OD值达到0.4-0.6；
[0074] 6.制备电转细胞(VZVBAC转化的大肠杆菌SW102)；
[0075] 7.取1-2μl(约200ng)步骤2纯化的PCR产物按实施例2中的电转参数电转到步骤6中制备的VZVBAC大肠杆菌SW102感受态细胞中；
[0076] 8.向转化细胞中加1ml LB并于32℃培养1小时；
[0077] 9.恢复后，用1×M9盐如下洗涤细菌3次：13200RPM离心沉淀培养物15秒，吸取离心上清，用1×M9盐重悬沉淀，如上离心，重复洗涤一次。经3次洗涤后，弃除上清液，沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物、10倍稀释物、100倍稀释物加到含半乳糖、亮氨酸、生物素和氯霉素的M63基础培养基上。
[0078] 10. 32℃培养3天；
[0079] 11.挑取几个克隆到含有半乳糖、氯霉素指示剂的麦糠基氏琼脂培养板上培养，获得单克隆。培养3天出现的克隆应该是Gal+，但是，为了排除Gal-污染，获得单一亮红色克隆对进行下一步试验是非常重要的；
[0080] 12.挑取单一亮红色(半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏培养基上培养，Gal+)克隆，接种到5ml LB-CM培养液中，32℃过夜培养；用过夜培养物制备BAC DNA，并用PCR确证含有galk基因，所用引物如下：
[0081] F3：CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:8)；
[0082] R3：TCA GCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:9)；
[0083] 13.以F4(SEQ ID NO:10)和R4(SEQ ID NO:11)为引物的ORF7近3′端457bp的PCR扩增(457bp读码框序列(SEQ ID NO:12))。由于F4、R4引物设计引入了1位碱基移码，故扩增产物产生移码突变。
[0084] F4和R4引物序列如下：
[0085] F4：CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG(SEQ ID NO:10)
[0086] R4：AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAAC(SEQ ID NO:11)
[0087] 457bp读码框序列如下：
[0088]GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG(SEQ ID NO:12)。
[0089] 然后参照本实施例的步骤4-10制备电转感受态SW102细胞。
[0090] 14.200ng含与步骤2galk基因侧翼同源的PCR产物经热激转化50μl步骤13的感受态细菌。转化产物加到含10mlLB培养液的50ml锥形瓶中，32℃水浴振荡培养4.5小时进行恢复。这种长时间恢复旨在获得只含目标序列的重组VZV BAC(舍弃含galk表达框的VZV BAC)。因为F4由60bp OFR7 5′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp反向序列组成，R4由60bp OFR7 3′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp正向序列组成，所以扩增产物与OFR7位点上的galk基因 同源重组时，3′端457bp序列产生翻转反向连接，产生翻转反向移码突变突变(SEQ ID NO:13)，不具表达功能。翻转反向移码突变序列如下：
[0091]CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCAACACGGGCTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATACTTCTATAAGTGGGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCACATTTTCCCCTTTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACGACCCCAAGAGTTTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTCATTCTCAGGGTTTGATCGACAATATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTAAACACATATCAGCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC(SEQID NO:13)。
[0092] 15.如步骤9操作，沉淀1ml培养物，用1×M9盐洗涤细菌3次，沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物和10倍稀释物各100μl加到含甘油、亮氨酸、生物素、2-脱氧-半乳糖和氯霉素的M63培养板上。
[0093] 16. 32℃培养3-4天；
[0094] 17.挑选并移种单克隆转到LB-CM和Galk-M63CM基础培养基的平板上。在LB-CM生长而在基础培养板上不生长的单克隆，提取病毒基因组用HindIII酶切检验完整性，重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7翻转反向移码突变的BAC株(VZV-7DRM BAC)。
[0095] 上述步骤所用试剂的配制如下面的表1所示：
[0096] 表1：本实施例所用试剂及其配制
[0097]
[0098]
[0099] 实施例4：VZV-7D和VZV-7DRM病毒的制备
[0100] 1.从实施例2制得的VZV-7D BAC中提取DNA，转入DY380菌中培养、增殖、提取、纯化。
[0101] 2.将提取纯化的DNA单独电转染至(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞，(BAC上带的GFP可以用于病毒在细胞中生长增殖研究)或与Cre表达载体一同电转染至(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞，BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除，产生VZV-7D病毒。
[0102] 类似地，可以得到翻转反向移码突变取代ORF7的VZV-7DRM病毒，由于VZV-7DRM的ORF7只有部分且为翻转反向序列，所以，此片段不能表达，更无ORF7功能。因此，VZV-7DRM与VZV-7D具有相同的功能。
[0103] 实施例5：VZV-7D病毒的鉴定
[0104] 用实施例4中制得的VZV-7D病毒感染长成单层的MRC-5细胞， 用含2％牛血清的MEM培养基培养，约80％细胞病变发生时，弃培养基，收获病变细胞，提取DNA，以P-Oka为对照进行试验。PCR扩增ORF-10和ORF-7基因，用HindIII消化VZV-7D和P-Oka株的DNA。PCR产物和HindIII消化产物用0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物见Fig.3。VZV-7D在ORF-10的PCR产物同P-Oka的一致，但在ORF-7上没有条带，证实ORF-7缺失。HindIII对病毒的酶切图谱上，VZV-7D和P-Oka之间看不出差别。
[0105] 实施例6：VZV-7D病毒的背根神经节培养
[0106] 用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠20周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节(DRG)，分离的背根神经节用含1％青霉素/链霉素的冰浴1ΧPBS瞬时洗涤，然后转到冰浴的培养基(DEM,含15％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素)，将每个背根神经节单独放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上，加0.5ml培养基，培养5天，其间换培养基一次。六孔细胞板中制备50％Mewo细胞培养物，用于滴度检测和生长曲线分析(Fig.4A)。第6天收获P-Oka，VZV-7D和VZV-7R新近感染的Mewo细胞，于培养基悬浮至1ml。每个背根神经节单独饲养在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl悬液用于病毒滴度检测，2μl用于Mewo细胞感染的生长曲线。其余细胞悬液用力通过27号针20次，细胞碎片通过4000rpm离心10min沉淀。上清均分，用于感染背根神经节，约120μl/样品，另外，2滴(20μl)细胞悬液用于感染另一个背根神经节，37℃5％CO2下培养3小时后，背根神经节用1×PBS洗涤，再补加新鲜培养基。每24小时检测一次荧光素酶活性。样品用含150μg/ml的D-luciferin 37℃培养10分钟后，用IVIS仪器和软件分析光子数。检测结果见Fig.4B。
[0107] 结果表明，VZV-7D在Mewo上生长正常，而在背根神经节中几乎不生长。VZV-7D不感染背根神经节细胞，这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。
[0108] 实施例7：VZV-7D病毒的回复突变体(VZV-7R)制备以及验证
[0109] ORF7缺失正确与否不仅可以用HindIII酶切鉴定，而且可以通过基因的同源重组获得完整的VZV加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的VZV，见Fig.5。可以利用Invitrogen的高保真Taq DNA聚合酶试剂盒PCR扩增ORF7片段，并将其克隆到质粒pGEM-lox-zeo的NotI和BglII位点之间，从而形成pGEM-zeo-ORF7质粒。该克隆片段通过测序分析鉴定正确，且通过PCR扩增没有错误密码子被引入ORF7编码框中。之后以pGEM-zeo-ORF7质粒为模板用下述引物PCR扩增zeoR-ORF7编码框。
[0110] F5：GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO：14)；
[0111] R5：AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCA TAA CTT CGT(SEQ IDNO：15)，
[0112] 得到的PCR产物是两端各含一段40bp的VZV基因序列，与kanR编码框序列相连的，位于删除的ORF7位点上。将得到的这段嵌合PCR产物按上文提到的方法电转化到携带有ORF7D BAC的DY380菌体中。重组体要通过含有50μg/ml的zeocin(Invitrogen)和12.5μg/ml的氯霉素的琼脂平板32℃培养筛选。正确的VZV克隆通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、潮霉素抗性、zeocin抗性、卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性的。这些克隆进一步被酶切消化和PCR分析确证正确。
[0113] 将鉴定正确的克隆(即携带有ORF7缺失或者luc VZV BAC拯救子的大肠杆菌DY380)接种于含12.5μg/ml的氯霉素的500mlLB培养基中32℃培养20小时。VZVBAC的DNA通过BAC DNA大量提取试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA)分离得到，并且利用转染试剂FuGene6(Roche,Indianapolis,IN)按照使用说明转染到MRC-5细胞。6孔板中的一孔(35-mm)在转染时DNA与转染试剂的使用比例为1.5μg:6μl。一般情况转染后3天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除BAC载体(两侧有loxP酶切位点)，可将Cre表达 载体与VZV BAC DNA一起共转染(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞，利用Cre酶的特性而精确切除BAC，产生完整的VZV。
[0114] 水痘ORF-7回复突变的病毒具有同P-Oka病毒相同的生长和增殖特性。说明ORF-7的功能可以通过回复突变手段得到恢复。
[0115] 实施例8：VZV-7DRM病毒的Mewo细胞培养
[0116] 六孔板中长成单层的Mewo细胞分别用含Luc的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染，以未感染的Mewo细胞作对照，Mewo细胞在37℃下用含2％牛血清的MEM培养基培养。感染24小时后，D-luciferin加到培养的细胞孔中，终浓度为150μg/ml，37℃培养10分钟，不同孔的生物荧光用体内成像系统IVIS(50Series；Xenogen Corporation,Alameda,CA)同时测量光子数，每天测量3孔感染细胞，测量后，细胞用病毒培养液取代D-luciferin物质继续培养。病毒荧光量每24小时测量一次，连续测量7天。用3孔测量的数据均值对时间绘制生长曲线。
结果见Fig.6。
结果见Fig.6。
[0117] 人MeWo细胞不被感染或者被水痘-带状疱疹病毒野生株(lucVZV)或者VZV-7DRM突变株或者VZV-7D回复株(luc7R)感染、培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数，用3孔测量的均值对时间绘制生长曲线，图中标出3孔测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM病毒和VZV-7R病毒和野生株一样都可以在MeWo细胞中正常生长。同时，试验结果表明将BAC插入VZV-7DRM中，7DRM能正常增殖，BAC上的基因也能正常表达，即VZV-7DRM可以用作外源基因表达的载体。
[0118] 实施例9：VZV-7DRM病毒在人胸腺组织的培养
[0119] 人胸腺-肝脏联合移植体异体移植到雄性的CB-17SCID/beige鼠内。人胸腺-肝脏联合移植体构建和使用按Jennifer F.M(Journal of Virology,Sept.1995,p.5236–5242)描述的方法进行。移植3月后，人胸腺-肝脏移植体经外科手术暴露后，直接注射2×103至4×103PFU 的Mewo培养的含有荧光素酶的VZV-7DRM和P-Oka，10-20μl细胞悬液，每种病毒感染3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物，即D-luciferin10分钟后，用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量，每种病毒测量3只小鼠。结果见Fig.7。
[0120] 培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受VZV野生株或者VZV-7DRM株感染，培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数。用3只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲线。图中显示3只测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM缺陷株像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。
[0121] 类似的实验证明，VZV-7D缺陷株也像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。
[0122] 实施例10：VZV-7DRM病毒的皮肤培养
[0123] 人胚胎皮肤完整结构按Jennifer F.M(Journal of Virology,Sept.1995,p.5236–5242)描述的方法，异体移植到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。移植4周后，三种含荧光素酶的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染皮肤，每种病毒感染3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物，即D-luciferin10分钟后，用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量，每种病毒测量3只小鼠。结果见Fig.8。
[0124] 培养的人皮肤组织被病毒野生株(P-Oka)或者ORF7缺失株(VZV-7DRM)或者ORF7回复突变株(VZV-7R)感染、以不被感染的鼠为对照，培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数，用3只测量的光子均值对时间绘制生长曲线。图中标出3只测量数据的误差线。实验证实VZV-7DRM在皮肤中有严重生长缺陷，这种功能缺陷在VZV-7DRM株回复突变后可以被恢复。
[0125] 类似的实验显示，VZV-7D在皮肤中也有严重生长缺陷，并且这种功能缺陷在VZV-7D株回复突变后可以被恢复。
[0126] 实施例11：ORF7对VZV感染神经细胞为必需的验证实验
[0127] 1.神经细胞瘤细胞感染实验
[0128] 用野生型(WT)、ORF7删除型(VZV-7DRM)和ORF7回复突变型(VZV-7R)的BAC DNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。研究发现，WT、VZV-7R在MeWo细胞和神经细胞瘤细胞上生长正常，但VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞上生长(Fig.9A)。研究结果显示ORF7很可能是VZV感染神经细胞所必需的。
[0129] 2.DRG移植体感染实验
[0130] 为了进一步验证本实施例中实验1的结果，使用植入人胎儿背根神经节(DRG)移植体的重症联合免疫缺陷鼠(SCID-hu)模型进行试验。结果发现，野生型在DRG移植体中经历一个短暂的复制循环(有荧光现象)后，很可能一直潜伏着。但是，VZV-7D不能在DRG移植体中复制。这些结果表明，ORF7很可能是VZV的嗜神经因子(Fig.9B－D)。
[0131] 以上两个实验证明，ORF7是VZV感染神经元所必需的。
[0132] 实施例12：疫苗的制备以及VZV-7DRM病毒的免疫原性检定
[0133] VZV-7DRM按MOI＝0.1感染长成单层的ARPE或MRC-5细胞，病毒在细胞上吸附40分钟后，向培养瓶中加病毒培养液后于35℃下培养。细胞病变达到80％左右(通常为3天)时，用0.1％EDTA消化收获，收获物经离心、加保护剂破碎和澄清后冻干制成疫苗。
[0134] 疫苗复溶后经皮下接种体重约250g豚鼠，5只/苗，5000PFU/0.5ml/剂，初免4周后，加强免疫1剂，以P-Oka和V-Oka为对照进行试验。
[0135] 加强免疫后2周经心脏采血，用gp-ELISA检测免疫血清抗体滴度。用免疫抑制法检测免疫血清对病毒的中和能力。免疫血清或免前血清10倍稀释后与病毒1:1混合，37℃培养60分钟，培养混合液感 染MRC-5细胞，于37℃5％二氧化碳培养箱中培养7天后，弃去培养液，用考马斯蓝染色，计蚀斑数再换算病毒滴度，用100×(被免前血清中和的病毒滴度-被免后血清中和的病毒滴度)/被免前血清中和的病毒滴度。检定结果见表2。
[0136] 表2：水痘病毒的豚鼠免疫血清抗体滴度和中和水平
[0137]
[0138] 实验结果表明VZV-7DRM有良好的免疫原性，抗体水平和V-Oka的相当，且VZV-7DRM免疫血清对三株病毒都有良好的中和作用，初步显示有疫苗开发前景。
[0139] 类似的实验显示，VZV-7D也具有良好的免疫原性，具有疫苗开发前景。
[0140] 实施例13：VZV-7DRM为载体的生物活性原料制备
[0141] 用含ORF7侧翼区同源序列的EV71-VP1引物从pT-VP1质粒上PCR扩增EV71-VP1阅读框。
[0142] 阅读框序列如下：
[0143]TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAGAGATAGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCGCAAATGCGTAGAAAGGTGG AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA(SEQ ID NO:16)[0144] PCR引物序列：
[0145] F6(ORF7 5′端侧翼区同源序列，起始密码子和EV71-VP1同源序列)：
[0146]CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAA(SEQ ID NO:17)
[0147] R6(ORF7 3′端侧翼区同源序列和EV71-VP1同源序列)：
[0148]AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTTAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA(SEQ ID NO:18)
[0149] PCR产物采用电转手段转入含VZV-7DRM BAC的SW102细菌中，按照实施例2筛选重组菌，经鉴定正确后，适量培养，提取VZV-7DRM-VP1BAC，与Cre表达载体一同电转染至ARPE细胞，BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除，产生VZV-7DRM-VP1重组病毒。重组病毒感染长成单层的ARPE细胞，35℃培养3-4天，细胞出现病变。收集的病毒培养上清、细胞悬液经 反复冻融或超声裂解后的离心上清原倍上样，采用EV71特异的双抗体夹心法检测VP1活性，用EV71和VZV-7DRM作对照。结果(见表3)在VZV-7DRM-VP1病毒感染的ARPE细胞中检测到VP1活性，表明VP1重组到VZV-7DRM中。此例表明VZV-7DRM能用作外源基因的表达载体表达目标蛋白。
[0150] 表3：VZV-7DRM-VP1重组病毒的VP1活性检测(双抗体夹心法)
[0151]
[0152] 类似的实验证明，VZV-7D也可以用于制备表达外源蛋白的载体。
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