一种慢病毒载体系统及其制备方法
专利汇可以提供一种慢病毒载体系统及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种慢病毒载体系统及其制备方法，属于 生物 技术领域。一种慢病毒载体系统包括穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus， 包装 质粒pCAG-HIVgp和包膜 蛋白质 粒pVSV-G-RSV-Rev，将载体系统中的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev共同 转染 宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统。本 发明 与 现有技术 比较具有以下特点：1）成本低，以转染10皿10-cm的细胞为例，推荐使用的脂质体2000体积为600µl（60µl×10）价格约为1500元，而使用本方法的成本可降至0.62元，成本可大幅降低；2）转染效率高，转染率可达到80%以上；3）病毒效价高，可达到5.75×109。，下面是一种慢病毒载体系统及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种慢病毒载体系统，其特征在于包括穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，将载体系统中的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统。
2.如权利要求1所述的一种慢病毒载体系统，其特征在于所述的宿主细胞为293T细胞。
3.一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）宿主细胞培养：将293T宿主细胞接种至DMEM完全培养基中生长，培养环境为37℃，
5%的CO2培养箱，当转染质粒前2天时，调整培养箱中CO2浓度为10%；
2）质粒提取：分别提取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev作为慢病毒载体系统，提取后测定各质粒的含量；
3）宿主细胞接种：将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中，在培养环境为37℃，10%的CO2培养箱中培养18-24小时；
4）质粒转染：当宿主细胞的汇合率为65-75%时，取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，使用磷酸钙法进行质粒转染，质粒转染时，调整培养箱中CO2浓度至3%，培养12-16小时；
5）病毒收集：取步骤4）得到的培养液，加入预热的含有Forskolin的完全培养基，并在
37℃，10% CO2的培养箱中培养45-50小时，吸取含有包装出的病毒颗粒的培养液，用0.45 µm的滤器过滤后，收集病毒悬液，置于4℃保存；然后在步骤4）得到的细胞培养皿中再加入预热的含有Forskolin的完全培养基，继续培养45-50h，收集上清用0.45 µm的滤器过滤，收集病毒悬液，置于4℃保存；
6）病毒纯化：将上述收集的病毒悬液装入超速离心管中，20℃，50,000g离心2h，弃去上清液，沉淀用HBSS重悬，将重悬的病毒悬液加入超滤管中14,000g离心25min，弃去下层滤液，超滤管中加入HBSS洗涤两次，倒置超滤管，1,000g离心2min，收集病毒悬液， -80℃低温冰箱中保存备用，即得到慢病毒载体系统。
4.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中DMEM完全培养基中含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100µg/ml链霉素。
5.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中采用无内毒质粒提取试剂盒提取，使用紫外分光光度计测定质粒的含量，测定吸光值OD值时，OD260的光密度值应在0.1-1.0之间，OD260/OD280的光密度值应在1.8-2.0之间。
6.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中
5
将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释成5×10 个细胞/ml后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中。
7.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其所述的步骤4）磷酸钙法进行质粒转染时，先在质粒中加入2.5M的CaCl2，充分混匀后，逐滴加入2×BBS，
2×BBS 含有50mM BES、280 mM NaCl和1.5 mM Na2HPO4，pH6.95。
8.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其特征在于所述的步骤5）含有Forskolin的完全培养基中含有10µM的Forskolin试剂。
一种慢病毒载体系统及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
5%的CO2培养箱，当转染质粒前2天时，调整培养箱中CO2浓度为10%；
2）质粒提取：分别提取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev作为慢病毒载体系统，提取后测定各质粒的含量；
3）宿主细胞接种：将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中，在培养环境为37℃，5%的CO2培养箱中培养18-24小时；
4）质粒转染：当宿主细胞的汇合率为65-75%时，取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，进行磷酸钙法进行质粒转染，质粒转染时，调整培养箱中CO2浓度至3%，培养12-16小时；
5）病毒收集：取步骤4）得到的培养液，加入预热的含有Forskolin的完全培养基，并在
37℃，10% CO2的培养箱中培养45-50小时，吸取含有包装出的病毒颗粒的培养液，用0.45 µm的滤器过滤后，收集病毒悬液，置于4℃保存；然后在步骤4）得到的细胞培养皿中再加入预热的含有Forskolin的完全培养基，继续培养45-50h，收集上清用0.45 µm的滤器过滤，收集病毒悬液，置于4℃保存；
6）病毒纯化：将收集的病毒悬液装入超速离心管中，20℃，50,000g离心2h，弃去上清液，沉淀用HBSS重悬，将重悬的病毒悬液加入超滤管中14,000g离心25min，弃去下层滤液，超滤管中加入HBSS洗涤两次，倒置超滤管，1,000g离心2min，收集病毒悬液， -80℃低温冰箱中保存备用，即得到慢病毒载体系统。
培养的293T宿主细胞稀释成5×10 个细胞/ml后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中。
具体实施方式
1）以载体pDsRed1-N1中红色荧光蛋白基因设计引物，并在基因的两端引入NotⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列如下：
DsRed-F：GCGGCCGCCGCCACCATGGTGCGCTC
DsRed-R：GGATCCCTACAGGAACAGGTGGTGG
2）以质粒pDsRed1-N1为模板，PCR扩增红色荧光蛋白基因（DsRed），扩增产物连接入T载体，酶切及测序鉴定后， NotⅠ和BamHⅠ双酶切，凝胶回收试剂盒（天根生化）回收DsRed基因片段。
数为9.5×10/ml。
阳性细胞比例 0% 83%24.9% 2.5% 0.3% 0%
浓缩后病毒效价为={(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数) /接种病
5 5 9
毒体积} ×稀释倍数={（2.5%×9.5×10/1 ml）}×10=2.38×10。
其余实验步骤如实施例1，质粒转染细胞皿的数量为50皿，相应试剂按比例增加，效价
5
测定时，接种病毒前细胞的数量为6.7×10。
阳性细胞比例 0% 89%47.09% 8.58% 1.41% 0.19%
浓缩后病毒效价为={(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数) /接种病
9
毒体积} ×稀释倍数={（8.58%×6.7×105/1 ml）}×105=5.75×10。
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