一种诱导性多能干细胞的制备方法
专利汇可以提供一种诱导性多能干细胞的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法构建了含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，并使用这两种慢 病毒感染 人外周血单核细胞来获得诱导性多能干细胞(iPSCs)，具体包括下列步骤：(1)人外周血单核细胞的分离与培养；(2)质粒的构建和扩增；(3)慢病毒的构建；(4)慢病毒感染人外周血单核细胞以及iPSCs的获得。本发明将小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子整合到一个质粒上，进而构建了同时含有这四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，利用这两种病毒可使得人外周血单核细胞成为iPSCs。与使用多个含有单个基因病毒的常规iPSCs制备方法相比，本方法减少了所需要病毒的数量，大大简化了慢病毒的制备步骤，并降低了污染的 风 险。，下面是一种诱导性多能干细胞的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，具体包括下列步骤：
(1)人外周血单核细胞的分离与培养
利用Ficoll淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，使用含有生长因子的外周血单核细胞培养液培养4-7天；
(2)质粒的构建和扩增
构建Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号四种质粒，将所构建好的质粒分别取上清液做转化，用5-alpha大肠杆菌感受态或NEB感受态或C2987H感受态进行转化，均使用氨苄青霉素抗性的固体培养基；
次日挑取克隆置于氨苄青霉素的液体培养基中扩增，用质粒提取试剂盒提取质粒；
所述Ⅰ号质粒为psPAX2s质粒，此质粒是第二代慢病毒包装质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；
所述Ⅱ号质粒为pMD2.G质粒，此质粒是水泡性口炎病毒包膜质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；
所述Ⅲ号质粒为TetO-FUW-OSKM质粒，此质粒是在TetO-FUW质粒中插入了Oct4、Sox2、Klf4与c-Myc(OSKM)四种小鼠基因，是一种能被反向四环素反式激活因子诱导表达小鼠Oct4、Sox2、Klf4与c-Myc蛋白的病毒质粒，此质粒在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；
所述Ⅳ号质粒为FUW-M2rtTA质粒，此质粒是在FUW质粒上插入反向四环素反式激活因子的基因形成的病毒质粒，此质粒在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；
(3)慢病毒的构建
使用HEK-293T细胞构建A、B两种病毒，每种病毒由三种质粒构成，分别是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号质粒和Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ号质粒；
(4)慢病毒感染人外周血单核细胞以及诱导性多能干细胞(iPSCs)的获得
取培养4-7天的人外周血单核细胞，加入A、B两种病毒，之后采用离心法进行病毒感染；
第二天将细胞转移至iMatrix-511(购自nippi公司)包被的培养板上，使用含有Doxycycline(购自STEMCELL公司)及生长因子的外周血单核细胞培养液进行培养，每天采用新鲜培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液；第七天使用iPSCs培养液(mTeSRTM1 Complete Kit，购自STEMCELL公司)对培养体系进行1/2体积的半量换液，之后每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，直到形成直径1cm的克隆，即获得iPSCs；将克隆转移到新的iMatrix-511包被的培养板上，每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，每4-7天进行iPSCs的传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是所述步骤(1)中的所述含有生长因子的外周血单核细胞培养液为添加下列生长因子的StemPro-34(购自Therom Fisher公司)无血清培养液：
IL-3 20ng/ml
IL-6 20ng/ml
SCF 100ng/ml
FL-3 100ng/ml；每5×105-1×106细胞添加1.5ml培养液。
3.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是所述步骤(3)中的所述的构建A、B两种病毒的步骤包括：
第一天：将1×106-2×106个HEK-293T细胞分别种在二个10cm培养皿中，使用7ml终体积含量5-15％胎牛血清的无抗生素的DMEM培养基进行培养，置于37℃，5％CO2(通入含体积浓度5％CO2的空气)培养箱中培养；
第二天：在HEK-293T细胞长至培养皿面积的60％时，使用15μllipofectamine 2000/皿做细胞转染，对应A、B分别使用7.5μg Ⅰ号质粒、2.5μg Ⅱ号质粒，以及10μg Ⅲ号质粒或Ⅳ号质粒；置于37℃，5％CO2(通入含体积浓度5％CO2的空气)培养箱中转染6-8小时；之后，将培养基更换为7ml终体积含量5-15％胎牛血清及终体积含量1％青霉素和链霉素(体积比1:
1)的DMEM培养基；
第三天：分别将培养皿中含有病毒的7ml培养基收集在无菌EP管内，培养皿再添加7ml同样的新培养基培养24小时；
第四天：分别收集第三天新加入的培养基，再与第三天收集的含有病毒的7ml培养基分别用1500rpm离心5分钟，分别收集上清、混合，得A、B两种病毒；于4℃可进行短期(1周内)保存，-80℃可长期(超过1周)保存。
4.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是所述步骤(4)中的所述加入的A、B两种病毒的体积比例为1:1，每3×105细胞加10μl总病毒。
5.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是所述步骤(4)中的所述的采用离心法进行病毒感染是指将细胞和病毒混合均匀，放入离心管，2250rmp离心
30分钟，之后感染结束，细胞继续培养。
6.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是所述步骤(4)中的所述含有Doxycycline及生长因子的外周血单核细胞培养液为添加下述Doxycycline和生长因子的StemPro-34(购自Therom Fisher公司)无血清培养液：
Doxycycline 10μg/ml
IL-3 20ng/ml
IL-6 20ng/ml
SCF 100ng/ml
FL-3 100ng/ml；每5×105-1×106细胞添加1ml培养液。
7.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征是该方法构建了含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，并使用这两种慢病毒感染人外周血单核细胞来获得iPSCs。
一种诱导性多能干细胞的制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
10min。弃上清，再使用PBS离心洗涤一遍。弃上清，再加入10ml Buffer EL Erythrocyte lysis buffer(购自QIAGEN公司)，260g离心5min，弃上清。使用PBS离心洗涤一遍，弃上清，再使用含有生长因子的外周血单核细胞培养液(购自Therom Fisher公司的StemPro-34无血清培养液补充20ng/ml的IL-3和IL-6及100ng/ml的SCF和FL-3)在37℃，5％CO2(通入含体积浓度5％CO2的空气)的培养箱中培养5天，每7×105细胞添加1.5ml培养液。
34无血清培养液补充20ng/ml的IL-3和IL-6及100ng/ml的SCF和FL-3)重悬，37℃，5％CO2(通入含体积浓度5％CO2的空气)孵箱培养。第二天，将细胞转移至iMatrix-511(购自nippi公司)包被的培养板上，使用含有Doxycycline及生长因子的外周血单核细胞培养液(购自Therom Fisher公司的StemPro-34无血清培养液补充10μg/ml Doxycycline，20ng/ml的IL-
3和IL-6及100ng/ml的SCF和FL-3)进行培养，每1×106细胞添加1ml培养液，每天采用新鲜培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液。第七天使用iPSCs培养液(mTeSRTM1Complete Kit，购自STEMCELL公司)对培养体系进行1/2体积的半量换液，之后每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，直到形成直径1cm的克隆，即获得iPSCs。将克隆转移到新的iMatrix-511包被的培养板上，每天采用新鲜iPSCs培养液对培养体系进行1/2体积的半量换液，每6天进行iPSCs的传代培养。
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