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一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用

阅读：24发布：2020-05-08

专利汇可以提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用。该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株LH3‑2，保藏号为CGMCC No.14744。实验表明，本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该贝莱斯芽孢杆菌制备的生物防治制剂能够高效的防治核桃溃疡病，是一种极具应用前景的生物防治制剂。，下面是一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1. 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株LH3-2，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.14744。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2在防治核桃溃疡病中的应用。
3.一种包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2的生物防治制剂。
4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）制备贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2的种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，27 30℃下恒温培养；
~
（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温27 30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养；
~
步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶
1.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=52∶30∶10∶8；所述无机盐按质量百分比计为，磷酸二氢钾12%，硫酸镁5%，硫酸铵10%，轻质碳酸钙73%；
步骤（3）中的大量发酵培养基同步骤（2）的固体培养基。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2的孢子移植到牛肉膏液体培养基，27 30℃摇床振荡~
培养2 3 d得到种子液；所述牛肉膏液体培养基为：牛肉浸膏3 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g，~
蒸馏水1000 mL，pH调至7.2 7.4；
~
（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，27 30℃下振荡~
培养3 5 d；
~
（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，在27 30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养~
8 9 d。
~
6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治核桃溃疡病中的应用。
7.一种核桃溃疡病的生物防治方法，其特征是，向具有溃疡病病的核桃施用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2或者权利要求3所述的生物防治制剂。

说明书全文

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用，以及采用该贝莱斯芽孢杆菌制备的生物防治制剂。

背景技术

[0002] 核桃是我国重要的“木本粮油”战略树种，其果实营养丰富，经济价值较高。近年来，我国的核桃产业发展迅猛，已成为全球最大的核桃生产国。核桃种植面积快速增加，集中栽培规模不断扩大，但在栽培管理上却仍然延续传统的粗放模式，使得以核桃溃疡病等为代表的树干部病虫害迅速蔓延发。核桃溃疡病，又称为腐烂病、黑水病，是核桃树干上的一种常见病害，早在上世纪的1915年，美国加利福尼亚州即已发现此病，在国内如陕西、河北、河南、山东、江苏、安徽等省均有其分布，其病原菌为聚生小穴壳菌(Dothiorella gregaria Sacc)，有性世代为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，主要危害核桃树主干及侧枝，严重时导致枝枯、结果能力下降，甚至整株死亡，造成的经济损失巨大。

[0003] 对于核桃溃疡病的防治，目前生产上主要依靠林业栽培管理措施和化学农药进行防治。但由于该病具有较长的潜伏期、较长的发病周期和多点危害的特点，在防治中需要一个生长周期多次处理、多次施用化学农药，才能较好的控制其危害。存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题。因此，寻求新的经济高效、绿色环保的防治技术与途径已成为当前核桃溃疡病防治中需迫切解决的问题。

[0004] 芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，其生理特征丰富多样，在自然界中广泛存在，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，其主要的生防机制是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株用于高效防治核桃溃疡病的新的微生物——贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2。本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株LH3-2，是从济南市小清河河水中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：
北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.14744。其具有以下生物学特性：在牛肉膏培养基上菌落呈乳白色、黏液性、皱褶状凸起，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

[0007] 本发明贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2的培养方法或繁殖方法包括：

[0008] (1)普通培养保存牛肉膏培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。

[0009] (2)实验室液体培养采用牛肉膏液体培养基，配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。

[0010] (3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶1.3；所述固料按质量比计，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝52∶30∶10∶8；所述无机盐按质量百分比计为，12％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，73％轻质碳酸钙。

[0011] (4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。

[0012] 本发明还提供一种用于防治核桃溃疡病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2。

[0013] 本发明还提供了一种用于防治核桃溃疡病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有溃疡病病的核桃施用上述贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2或者上述生物防治制剂。

[0014] 本发明也提供了上述贝莱斯芽孢杆菌或者上述生物防治制剂在防治核桃溃疡病中的应用。

[0015] 本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：

[0016] (1)制备贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2的种子液；

[0017] (2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，27～30℃下恒温培养；

[0018] (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温27～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。

[0019] 在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

[0020] (1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株LH3-2的孢子移植到牛肉膏液体培养基，27～30℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；

[0021] (2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，27～30℃下振荡培养3～5d；

[0022] (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温27～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。

[0023] 其中，步骤(1)中的牛肉膏液体培养基，配方为牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。

[0024] 步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶1.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝52∶30∶10∶8；所述无机盐按质量百分比计为，12％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，73％轻质碳酸钙。

[0025] 步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。

[0026] 实验表明，本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在核桃表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该贝莱斯芽孢杆菌制备的生物防治制剂能够高效的防治核桃溃疡病，是一种极具应用前景的生物防治制剂。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。

[0028] 实施例一

[0029] 1、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LH3-2的分离与纯化

[0030] 本发明的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LH3-2是2013年5月从济南市小清河(117.09E,36.73N)河水中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

[0031] (1)芽孢杆菌的分离

[0032] 样品采集自济南市小清河，采用灭菌矿泉水瓶取样，分别采集河两岸距离河岸2m，样本为3*500mL，混匀，带回室内暂存于4℃温箱中。称取10g水样于90mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在28℃培养2d后挑取牛肉膏培养基上的不同形态的微生物菌落于牛肉膏培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。

[0033] (2)核桃溃疡病高效拮抗芽孢杆菌的筛选

[0034] ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA(Potato Dextrose Agar)平板，用打孔器在芽孢杆菌、核桃溃疡病边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，28℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。

[0035] ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。

[0036] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治核桃溃疡病的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LH3-2。实验证明，该贝莱斯芽孢杆菌原粉在防治核桃溃疡病中显示出非常高效的防治效果。因而，本发明的贝莱斯芽孢杆菌是具有广泛应用前景的贝莱斯芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治核桃溃疡病的生物防治制剂。

[0037] 2、菌株鉴定

[0038] (1)微生物学特性

[0039] 在牛肉膏培养基上菌落呈乳白色、黏液性、皱褶状凸起，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

[0040] (2)分子生物学特性

[0041] 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株LH3-2的16s rRNA基因序列测定结果如下：

[0042] CCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCC[0043] (3)细胞形态和理化实验结果

[0044] 表1贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LH3-2的细胞形态和理化实验结果[0045]实验项目结果实验项目结果
革兰氏染色阳性碳水化合物产酸 +
细胞形状杆状葡萄糖 +
细胞直径﹥1μm - 木糖 +
形成芽孢 + L-阿拉伯糖 +
芽孢膨大 - 甘露醇 -
芽孢圆形 - 乳糖 -
伴孢晶体 - 发酵葡萄糖产气 +
接触酶 + 利用柠檬酸盐 +
氧化酶 + 50℃生长 +
厌氧生长 - pH 5.7生长 +
VP试验 + 7％NaCl生长 +
VP﹤pH 6 + 淀粉水解 +
VP﹥pH 7 - 分解酪素 +
硝酸盐还原 + 水解明胶 +

[0046] 实施例二

[0047] 1、贝莱斯芽孢杆菌发酵过程

[0048] 牛肉膏液体培养基配方为：牛肉浸膏3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。

[0049] 固料为：按质量比计，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝52∶30∶10∶8；无机盐为按质量比计为：12％磷酸二氢钾，5％硫酸镁，10％硫酸铵，73％轻质碳酸钙；固料与无机盐质量比为98.7∶1.3。

[0050] 贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2大量固体发酵过程：

[0051] ①菌种种子液培养

[0052] 将贝莱斯芽孢杆菌菌株(B.velezensis)LH3-2从试管斜面中挑取少量细菌，移至牛肉膏液体培养基中，28℃摇床振荡培养2～3d，此为种子液。

[0053] ②固体生产菌种的培养

[0054] 将种子液按10％的质量比接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。

[0055] ③大量固体发酵

[0056] 将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，即可得到发酵液，发酵液活性菌可达到40亿/克。进一步制成原粉后，活性菌可达到200-300亿/克。

[0057] 为了明确贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2发酵液对核桃溃疡病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年3～6月份在山东省临沂市进行了大田试验，现将试验结果报告如下：

[0058] 1供试材料及方法

[0059] 1.1供试药剂

[0060] 按本发明实施例二发酵方法生产的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2发酵液(菌活40亿/克)；80％乙蒜素乳油(江苏新农化工有限公司生产，市售)。

[0061] 1.2供试材料与防治对象

[0062] 供试材料为核桃；防治对象为核桃溃疡病。

[0063] 1.3试验地情况

[0064] 试验地设在临沂市费县芍药山核桃产区。在该地区，溃疡病发病率为15.3％，病情指数为6.8。试验土壤类型为褐土，有机质含量为0.75％，pH值为6.8，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时核桃溃疡病处于发病初期。

[0065] 1.4试验设计及安排

[0066] 本试验共3个处理，分别为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2发酵液10倍、80％乙蒜素乳油300倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于2016年3月15日、4月11日、5月16日和6月15日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。

[0067] 1.5试验调查及计算方法

[0068] 1.5.1气象条件

[0069] 第1次施药(3月15日)当日多云，风力3级，最高气温为13℃，最低气温为2℃，相对湿度为56％。第2次施药(4月11日)，当日多云，风力3级，最高气温为21℃，最低气温为9℃，相对湿度为55％；第3次施药(5月16日)当日晴，风力3级，最高气温为26℃，最低气温为13℃，相对湿度为60％；第4次施药(6月15日)当日晴，风力3级，最高气温为32℃，最低气温为20℃，相对湿度为67％。

[0070] 1.5.2药效及安全性调查

[0071] 药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查50株，调查主干下部树皮，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。

[0072] 安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察核桃的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。

[0073] 分级方法(以单株为单位)：

[0074] 0级：无病班

[0075] 1级：病斑面积占整个树干面积的1/4以下。

[0076] 2级：病斑面积占整个树干面积的1/4～2/4。

[0077] 3级：病斑面积占整个树干面积的2/4～3/4。

[0078] 4级：病斑面积占整个树干面积的3/4以上。

[0079] 1.5.3药效计算方法

[0080] 药效按式(1)、(2)计算：

[0081]

[0082]

[0083] 式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；

[0084] CK1——空白对照区施药后病情指数；

[0085] PT0————药剂处理施药前病情指数；

[0086] PT1————药剂处理施药后病情指数。

[0087] 1.5.4对国槐生长的影响

[0088] 观察药剂对核桃有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对核桃的其他有益影响(例如刺激生长等)。

[0089] 用下列方式记录药害：

[0090] (a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。

[0091] (b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：

[0092] ①按照药害分级方法记录核桃的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

[0093] 药害分级方法：

[0094] —：无药害；

[0095] +：轻度药害，不影响林木生长；

[0096] ++：中度药害，可复原，不会造成林木减产；

[0097] +++：中度药害，影响林木正常生长，对林木产量和质量造成一定程度的损失；

[0098] ++++：严重药害，林木生长受阻，产量和质量损失严重。

[0099] ②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。

[0100] 2结果

[0101] 2.1供试药剂对核桃溃疡病的防治效果

[0102] 三种药剂处理前核桃溃疡病病害情况如表2所示，三种药剂处理对核桃溃疡病的防治效果如表3所示。表3结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2发酵液和80％乙蒜素乳油对核桃溃疡病均有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到70％以上。
从核桃溃疡病田间试验的病情指数来看(表3)，最后一次施药后14d，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LH3-2防治效果为75.37％，明显高于80％乙蒜素乳油57.25％的防治效果。

[0103] 表2三种药剂处理前核桃溃疡病病害情况

[0104]

[0105] 表3三种药剂处理对核桃溃疡病的防治效果

[0106]

[0107] 2.2核桃安全性调查

[0108] 经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，核桃生长正常，无药害产生，说明贝莱斯芽孢杆菌发酵液供试浓度对核桃安全。

[0109] 3小结

[0110] 3.1从病情指数和防治效果来看，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2(保藏号CGMCC No.14744)对核桃溃疡病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d的防治效果达70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。

[0111] 3.2从核桃长势看，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株LH3-2对核桃具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。

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一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治核桃溃疡病中的应用

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