黑。具有可定制性状的转基因动物
阅读：1033发布：2020-08-26
专利汇可以提供黑。具有可定制性状的转基因动物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于在动物中产生可定制性状的材料和方法。在本发明原理的展示中，使用了 角 蛋白-14特异性启动子以及loxp盒中的红色 荧光 蛋白、色素盒中的显性黑色(ΔG23)β防卫素103和SV40(具有内含子)聚腺苷 酸化 序列。当向动物的 皮肤 施用在载体基质(例如，脂双层)中的Cre重组酶(或HTNCre)时， 毛皮 将被永久地基因修饰从而在施用了所述Cre重组酶的形状中变，下面是黑。具有可定制性状的转基因动物专利的具体信息内容。
1.一种制备非人转基因动物的方法，所述非人转基因动物包含细胞，其中所述细胞的基因组包含：
外源核酸序列和诱导型表达系统，其中外源核酸序列与启动子有效地连接，并且其中所述外源核酸序列的表达是在所述诱导型表达系统的控制之下，所述诱导型表达系统需要诱导剂的存在以激活表达，使得在不存在所述诱导剂的情况下，所述外源核酸序列的表达被抑制；
其中所述外源核酸序列编码与生物色素的合成有关的蛋白质或与生物色素转运有关的蛋白质，
其中添加所述诱导剂诱导所述蛋白质的表达，并且其中所述蛋白质的所述表达导致所述非人转基因动物的皮肤或毛皮色素沉着的变化，其在所述非人转基因动物的毛皮或皮肤上或者毛皮和皮肤两者上形成预定的色素沉着图案，并且其中所形成的图案可用于鉴定动物或者所形成的图案指示了动物中的疾病。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱导型表达系统选自：Cre-LoxP重组系统、FLP-FRT重组系统、四环素(Tet)控制的转录激活系统、蜕皮激素诱导型系统、热休克开/关系统、lacO/IPTG系统、cumate阻抑蛋白CymR系统、硝基还原酶系统、库马霉素/新生霉素调控系统、RheoSwitch配体RSL1系统、嵌合二分核受体表达系统、GAL4系统、类固醇诱导/阻抑系统及其任意组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述诱导型表达系统包含Cre-LoxP重组系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Cre-LoxP重组系统包含lox-STOP-lox(LSL)序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述诱导剂是Cre重组酶蛋白。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述诱导型表达系统包含四环素(Tet)控制的转录激活系统。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述诱导剂是多西环素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子选自：巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β肌动蛋白启动子、泛素启动子、JeT启动子、SV40启动子、β珠蛋白启动子、延伸因子1α(EF1-α)启动子、RSV启动子、Ripply2启动子、Ticked启动子、Tabby启动子、Mo-MLV-LTR启动子、Rosa26启动子、角质形成细胞特异性启动子、黑色素细胞特异性启动子、基质细胞特异性启动子和真皮乳头特异性启动子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源核酸序列编码选自以下的蛋白质：与生物色素的合成有关的蛋白质和与生物色素的转运有关的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述外源核酸序列编码选自以下的蛋白质：黑皮质素受体(MC1R)、促黑素细胞激素(MSH)、β-防卫素103、野灰蛋白信号传递蛋白(ASP)、酪氨酸酶(TYR)、黑色素细胞特异性转运蛋白、Ras-相关蛋白Rab-7、rab蛋白香叶基香叶基转移酶组件A2、可能的E3泛素-蛋白质连接酶(HERC2)、双功能酶CarRP样酶、番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶样酶和八氢番茄红素脱氢酶样酶。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人转基因动物为牛。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人转基因动物为狗。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述类固醇诱导/阻抑系统是固醇诱导/阻抑系统。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述类固醇诱导/阻抑系统是合成类固醇诱导/阻抑系统。
具有可定制性状的转基因动物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年2月15日提交的美国临时申请序列No.61/598,987的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
[0005] 发明背景
[0006] 大部分动物物种中合成唯一的色素，并且唯一存在于所有哺乳动物物种中的色素是黑色素。有两类黑色素：产生金色和红色的褐黑素(pheomelanin)以及产生深褐色或黑色的真黑素(eumelanin)。这两类黑色素都由酪氨酸合成，但是其合成途径在多巴醌(dopaquinone)的产生后分叉。
[0008] 黑皮质素受体可被任何促黑素细胞激素(MSH)激活，最常见的是被α-MSH激活，但也被β-防卫素103激活。相反地，MC1R的激活可通过野灰蛋白信号传递蛋白(agouti signaling protein，ASP)的表达来抑制。β-防卫素103信号对ASP信号是显性，且ASP信号对MSH信号是显性。另外，在所有这些基因中都有提高或降低其活性的突变和多态性。皮毛颜色还受到黑色素产生和转运的多种调谐子的调节，包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶转运蛋白OCA2和泛素化基因HERC2等。
[0009] 植物产生多种另外的色素种类，包括叶绿素、类胡萝卜素、花色素(anthrocyanin)和甜菜色素(betalain)。在这些色素中，类胡萝卜素可能是最容易转移到动物中的，因为植物中产生类胡萝卜素染料所依赖的前体也可在动物中发现。香叶基香叶基焦磷酸是HMG-CoA还原酶途径中的中间体，并且被用作合成类固醇和固醇的前体。通过添加4到5种植物蛋白质，可使用香叶基香叶基焦磷酸替代作为前体来合成黄胡萝卜素和橙胡萝卜素或者红酵母烯(torulene red)。在自然中已发生植物色素向动物的转移：豌豆蚜(A.pisum)具有数个以某种方式转移自真菌的基因。已在属于动物界的基因工程酵母中生产类胡萝卜素。
[0010] 在多细胞动物中曾试图通过遗传干预对表面色素进行的唯一修饰是是将动物从浅色整体改变为深色或从深色整体改变为浅色。未曾产生更详细的图案。胡萝卜素染料从未在比蚜虫更复杂的动物中被天然发现过，也未曾改造到任何多细胞动物中。在本发明之前，尚未在动物物种的皮肤或毛皮中产生可定制的颜色或图案。
发明内容
[0011] 本发明提供了用于在动物中产生可定制性状的材料和方法。例如，本发明提供了用于在动物的皮肤和/或毛皮中产生可定制图案的材料和方法。在另一些实施方案中，所述可定制性状可包括动物皮肤或毛皮的长度和/或质地。或者，本发明可用于实现动物甲/嘴甲/指甲/趾甲(nail)、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度的控制变化。
[0012] 在一个具体实施方案中，本发明方法包括向动物细胞中引入基因构建体，所述基因构建体包含角蛋白-14特异性启动子、loxp盒中的红色荧光蛋白、色素盒中的显性黑色(ΔG23)β防卫素103以及SV40(具有内含子)聚腺苷酸化序列。然后，当向具有所述基因构建体的动物之皮肤施用包含Cre重组酶(或HTNCre)的组合物时，所述动物的毛皮将在施用了所述组合物的地方变黑。以这种方式，将毛皮永久地基因修饰从而以期望的形状变色。
[0013] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了在动物的皮肤和/或毛皮中产生可定制的永久性图案的方法。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在动物物种的皮肤和/或毛皮中产生多色图案的方法。
[0015] 在又一个实施方案中，本发明提供了在动物物种的皮肤和/或毛皮中产生可定制图案以使得所述动物将在其整个生存期中继续生长保持这些颜色的毛皮的方法。
[0016] 本发明还提供了在那种动物中产生可遗传、可定制的预定条状图案的方法。
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了在本发明的转基因动物中透皮施用一种或更多种活化因子以驱动重组和永久的转基因表达。在某些具体的实施方案中，根据本发明可使用的活化因子包括但不限于：重组酶蛋白质、能够诱导重组酶表达的小分子(例如，多西环素、cumate、蜕皮激素等)、能够诱导重组酶表达的病毒和驱动重组酶表达的核酸(例如DNA)构建体。
[0018] 在某些实施方案中，向动物皮肤表面施用单独的或在载体(carrier)溶液(例如，脂质体、溶剂、包含DMSO的混合物等)中的活化因子。在一个实施方案中，皮内(例如，借助于纹身针)或皮下施用活化因子。
[0019] 在一个实施方案中，所述转基因动物包含一种或更多种外源核酸分子，所述外源核酸分子包括但不限于色素沉着相关基因、皮毛(coat)/毛发(hair)质量基因(例如，用于控制动物毛发的长度和/或卷曲的基因)、指甲/趾甲/爪或角质量相关基因(例如，编码交联角蛋白的核酸分子)以及用于在动物细胞中合成和/或表达植物色素的基因。
[0020] 在某些实施方案中，根据本发明可使用的启动子包括但不限于：皮肤特异性启动子(例如，角蛋白特异性启动子)、黑色素细胞特异性启动子(例如，MCR启动子)、组成型启动子(例如，β-珠蛋白启动子、CMV启动子)和响应于循环因子如NF-kB、干扰素γ、雌激素和糖皮质激素的启动子。
[0021] 在某些实施方案中，本发明提供了使用多种类型的重组酶靶标以允许通过施用不同的重组酶选择不同基因的特异激活。在一个实施方案中，使用多种重组酶靶标以允许在动物出生后产生多种颜色。
[0022] 在一个实施方案中，在具有天然金色毛皮的转基因狗中，Cre重组酶激活黑色狗毛皮的产生，并且Flp重组酶激活红色狗毛皮的产生。
[0023] 在一个实施方案中，本发明提供了使用天然启动子来驱动皮毛色素沉着而不需要外部活化因子。在一个具体实施方案中，所述天然启动子涉及在动物发育中限定体节边界。
[0024] 在一个实施方案中，使用天然异源启动子在不同物种中产生皮毛图案，例如，使用在猫中发现的Tabby或Ticked启动子在狗中驱动皮毛着色。
[0025] 在某些实施方案中，本发明提供了经基因修饰的动物，其具有可在出生后定制的永久性皮毛图案。
[0026] 在某些实施方案中，本发明提供了具有在通常哺乳动物中未发现的皮毛颜色的转基因动物。
[0028] 在某些实施方案中，本发明提供了经基因修饰的在其皮毛中的具有“不可见”之标记的牛、绵羊或其他动物，所述标记可响应于健康或生理状态的变化而改变颜色。
[0029] 在一个实施方案中，转基因牛或绵羊或其他动物可在皮毛或毛皮上表达一种符号，其中如果所述动物具有NF-kB的慢性激活，则该符号可改变颜色，以及如果动物具有干扰素-γ的慢性激活时可改变颜色的另一种符号。
[0030] 在某些实施方案中，本发明提供了出生就具有在其天然物种中通常不出现的毛皮颜色和图案的基因修饰动物。
[0032] 图1是用于在动物中实现颜色改变的基因构建体的一个实施方案的示意图。
[0033] 图2是用于在动物皮肤或毛皮中产生可定制图案和颜色的基因构建体的实施方案的示意图。
[0034] 图3是用于在动物皮肤或毛皮中产生可定制图案和颜色的基因构建体的实施方案的示意图。
[0035] 图4是用于在小鼠的皮肤或毛皮中产生可定制图案和颜色的基因构建体的一个实施方案的示意图。所述构建体包含角蛋白14启动子，该启动子在所有皮肤成纤维细胞中表达以驱动信号分子β-Def103的显性黑色(dominant black)形成。β-Def103的表达被通过LoxP可切除的编码环指蛋白(ring finger protein，RFP)的核酸阻断，所述环指蛋白用作标记。编码RFP的核酸分子不是所述构建体需要的，可用STOP代替。
[0036] 图5(A)示出通过透皮施用重组酶激活的β-Def103表达在成年小鼠的皮毛或毛皮中产生永久的基因变化。(B)可实现对标记转变的精细控制：通过注射重组酶产生具有单一狭窄背线的小鼠。皮肤/毛皮图案的变化通过多周期皮毛再生长而持续，表明成功改变了定居的干细胞。
[0037] 图6示出可通过向小鼠皮肤施用的重组酶的量渐变(titrate)转基因小鼠的皮毛颜色。增加向小鼠施用的重组酶的量提高了转基因表达和真黑色素激活的水平。
[0038] 图7是用于敲入牛中的基因构建体的一个实施方案的示意图，所述构建体具有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的精子特异性表达和显性负性Rab7的重组酶介导的黑色素细胞特异性表达。将可通过PIGGYBACTM转座子切除的编码新霉素抗性生物标记蛋白的核酸序列放置在所述构建体的中央，所述构建体侧翼是短的同源臂。
[0039] 图8示出了对基因改造的黑安格斯(Black Angus)小母牛在皮肤中表达可定制标识图案的描述。
[0040] 序列简述
[0041] SEQ ID NO：1是双功能酶CarRP样酶同工型1[豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001943170)。
[0042] SEQ ID NO：2是双功能酶CarRP样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001950787)。
[0043] SEQ ID NO：3是番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001950868)。
[0044] SEQ ID NO：4是八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001943225)。
[0045] SEQ ID NO：5是八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001950764)。
[0046] SEQ ID NO：6是八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP001946689)。
[0047] SEQ ID NO：7是八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜]的氨基酸序列(Genbank登录号XP_001943938)。
[0048] SEQ ID NO：8黑皮质素1受体的氨基酸序列(GenBank登录号EDL11741)。
[0049] SEQ ID NO：9是α促黑素细胞激素(MSH)的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID NO：10是β促黑素细胞激素(MSH)的氨基酸序列。
[0051] SEQ ID NO：11是β促黑素细胞激素(MSH)的氨基酸序列。
[0052] SEQ ID NO：12是γ促黑素细胞激素(MSH)的氨基酸序列。
[0053] SEQ ID NO：13是β-防卫素蛋白质的氨基酸序列(GenBank登录号AAT67592)。
[0054] SEQ ID NO：14是野灰蛋白信号传递蛋白前体的氨基酸序列(GenBank登录号NP_056585)。
[0055] SEQ ID NO：15是酪氨酸酶(TYR)的氨基酸序列(Genbank登录号BAA00341)。
[0056] SEQ ID NO：16是黑色素细胞特异性转运蛋白的氨基酸序列(Genbank登录号Q62052)。
[0057] SEQ ID NO：17是rab蛋白香叶基香叶基转移酶组件A2的氨基酸序列(Genbank登录号NP_067325)。
[0058] SEQ ID NO：18是ras相关蛋白Rab-7a的氨基酸序列(Genbank登录号NP_033031)。
[0059] SEQ ID NO：19是可能的E3泛素-蛋白质连接酶(HERC2)的氨基酸序列(Genbank登录号NP_084390)。
[0060] 发明详述
[0061] 本发明提供了用于在动物中产生可定制性状的材料和方法。例如，本发明提供了用于在动物的皮肤和/或毛皮中产生可定制图案的材料和方法。在另一些实施方案中，所述可定制性状可包括动物皮肤或毛皮的长度和/或质地。或者，本发明可用于实现动物毛发、甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度的控制变化。
[0062] 在一个具体实施方案中，本发明的方法包括向动物细胞中引入基因构建体，所述基因构建体包含角蛋白-14特异性启动子、loxp盒中的红色荧光蛋白、色素盒中的显性黑色(ΔG23)β防卫素103以及SV40(具有内含子)聚腺苷酸化序列。然后，当向具有所述基因构建体的动物的皮肤上施用包含Cre重组酶(或HTNCre)的组合物时，所述动物毛皮将在施用了所述组合物的地方变黑。以这种方式，将毛皮永久地基因修饰以在期望的形状改变颜色。
[0063] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了在动物的皮肤和/或毛皮中产生可定制的永久性图案的方法。
[0064] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在动物物种的皮肤和/或毛皮中产生多色图案的方法。
[0065] 在另一个实施方案中，本发明提供了在动物物种的皮肤和/或毛皮中产生可定制图案以使得所述动物在其整个生存期中将继续生长保持这些颜色的毛皮的方法。
[0066] 本发明还提供了在那种动物中产生可遗传、可定制的预定条状图案的方法。
[0067] 在一个实施方案中，转基因动物具有可遗传的软爪或软毛发或毛皮。
[0068] 在另一个实施方案中，本发明提供了转基因动物的细胞、组织或部分(例如，皮肤、毛发、毛皮)及其用途。在一个实施方案中，转基因动物在皮肤和/或毛皮中具有可定制的颜色和/或图案，并且随后可从转基因动物移除所述皮肤或毛皮用于生产兽皮、毛皮、皮革等，可用于生产服装、地毯、鞋子、马匹装备(horse tack)、马具、室内装饰品(upholstery)、以及其他皮革制品。
[0069] 具有可定制性状的转基因动物
[0070] 在一个实施方案中，本发明提供了具有可定制性状的转基因动物，其中所述转基因动物(例如在其基因组中)包含：
[0071] 编码目的蛋白质的外源核酸分子，其中所述核酸分子与启动子有效地连接并且处于诱导型基因表达系统的控制下，所述诱导型基因表达系统需要诱导剂的存在以激活基因表达；
[0072] 其中在不存在诱导剂的情况下所述外源核酸分子的表达被抑制。
[0073] 在某些实施方案中，所述外源核酸分子编码选自以下的蛋白质：色素蛋白质；与色素的合成和/或转运有关的蛋白质；发光(例如荧光)蛋白质；与皮肤或毛皮的长度和/或质地有关的蛋白质；以及与动物甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质。
[0074] 在一个具体实施方案中，本发明提供了具有可定制毛皮或皮肤色素沉着的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组包含：
[0075] 编码目的色素蛋白质或与目的色素的合成和/或转运有关的蛋白质的外源核酸分子，其中所述外源核酸分子与启动子有效地连接诱导型基因表达系统并且处于其控制下，所述诱导型基因表达系统是位点特异的重组系统；
[0076] 其中在不存在位点特异性重组的情况下，所述位点特异的重组系统抑制第一核酸分子的表达。
[0077] 在例如向所述转基因动物施加重组酶之后，可诱导外源核酸分子的表达。
[0078] 在一个实施方案中，外源核酸分子、启动子和/或位点特异的重组系统被包含在色素沉着构建体中。
[0079] 在一个实施方案中，转基因动物的基因组包含在Cre/LoxP重组系统的控制下表达的外源核酸分子，其中所述Cre/LoxP重组系统阻止所述外源核酸分子的表达。在一个具体实施方案中，所述Cre/LoxP重组系统包含lox-stop-lox(LSL)序列。
[0080] 在一个实施方案中，将所述色素沉着构建体转移到细胞(例如受精卵)中。可使用任何常规手段将所述色素沉着构建体转移到细胞例如受精卵中，所述手段包括但不限于：慢病毒(lentivirii)、前核注射和卵胞浆内单精子注射(ICSI，intracytoplasmic sperm injection)。
[0081] 在某些实施方案中，将一种或更多种色素沉着构建体引入到转基因动物的基因组中。所述色素沉着构建体可包含超过一种外源核酸分子，每一种核酸分子均编码目的蛋白质。
[0082] 在某些实施方案中，转基因动物的基因组包含超过一种诱导型基因表达系统以控制目的核酸分子的表达。
[0083] 在一个具体实施方案中，本发明提供了具有可定制性状(例如，毛皮或皮肤色素沉着)的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组包含：
[0084] 编码目的蛋白(例如色素沉着蛋白)的第一外源核酸分子，其与第一启动子有效地连接并处于loxP位点的控制下，其中在不存在Cre重组酶蛋白的情况下，所述loxP位点阻止所述第一外源核酸分子的表达；以及
[0085] 编码Cre重组酶蛋白的第二核酸分子，其与第二启动子有效地连接。
[0086] 在另一个具体实施方案中，本发明提供了具有可定制性状(例如，毛皮或皮肤色素沉着)的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组包含：
[0087] 编码目的蛋白(例如色素沉着蛋白)的第一外源核酸分子，其与第一启动子有效地连接并处于loxP位点的控制下，其中在不存在Cre重组酶蛋白的情况下，所述loxP位点阻止所述第一核酸分子的表达；
[0088] 编码反向tRA(rtTA)的第二核酸分子，其与第二启动子有效地连接；以及
[0089] 编码Cre重组酶蛋白的第三核酸分子，其与第三启动子有效地连接并处于TetO操纵子的控制下。
[0090] 图2和3示出了表达构建体的一个实施方案，其中目的外源核酸分子的表达(例如，色素蛋白质和与生物色素合成有关的蛋白质)处于Cre-LoxP重组系统和四环素(Tet)控制的转录激活系统的控制下。
[0091] 在一个具体实施方案中，向具有金色毛皮颜色的转基因动物施用与DMSO载体混合的多西环素(或蜕皮激素等)，从而使所述转基因动物的颜色变红；随后，向所述转基因动物施用与DMSO混合的Cre或HTNCre以产生黑色。
[0092] 在另一个具体实施方案中，转基因动物的基因组包含在四环素(Tet)控制的转录激活系统的控制下表达的外源核酸分子。
[0093] 在另一个实施方案中，本发明提供了具有可定制性状(例如，毛皮或皮肤色素沉着)的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组包含：编码目的蛋白(例如，色素沉着蛋白)的第一外源核酸分子，其与第一启动子有效地连接并处于诱导型基因表达系统(例如，四环素(Tet)控制的转录激活系统)的控制下，其中所述诱导型基因表达系统在其失活状态(缺少诱导)下阻止所述第一核酸分子的表达。
[0094] 转基因动物可以是任何物种，包括但不限于：哺乳动物物种，包括但不限于驯养动物和实验室动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊、鸭、鹅和鸡；灵长类动物，例如猿、黑猩猩、猩猩、人和猴；鱼；两栖动物，例如蛙和蝾螈；爬行动物，例如蛇和蜥蜴；以及其他动物，例如狐狸、鼬(weasel)、兔、水貂(mink)、河狸(beaver)、貂(ermine)、水獭(otter)、黑貂(sable)、海豹、郊狼(coyote)、毛丝鼠(chinchilla)、鹿、麝鼠(muskrat)和负鼠(possum)。在某些实施方案中，所述动物不是人。
[0095] 色素蛋白质
[0096] 本文使用的术语“色素蛋白质”是指包含色素的蛋白质。本文使用的术语“色素”是指不发光但是由于波长选择性吸收而改变反射光或透射光的颜色的物质，这一物理过程不同于其中物质发光的荧光、磷光及其他形式的发光。色素蛋白质包括但不限于色蛋白，例如细胞色素和黄素蛋白。
[0097] 发光蛋白
[0098] 本文使用的术语“发光蛋白”是指发光的蛋白质。可根据本发明使用的发光蛋白包括但不限于荧光蛋白(包括但不限于绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白和红色荧光蛋白)；以及磷光蛋白。荧光蛋白是一类蛋白质的成员，它们共同具有自己足以从其自身多肽序列内的三个氨基酸序列形成可见波长发生团的独特性质。多种发光蛋白(包括荧光蛋白)是公知的。可根据本发明使用的荧光蛋白包括但不限于在以下专利中公开的荧光蛋白：美国专利No.7,160,698，美国专利申请公开No.2009/0221799、2009/0092960、2007/0204355，2007/0122851、2006/0183133、2005/0048609、2012/0238726、2012/0034643、
2011/0269945、2011/0223636、2011/0152502、2011/0126305、2011/0099646、2010/
0286370、2010/0233726、2010/0184116、2010/0087006、2010/0035287、2007/0021598、
2005/0244921、2005/0221338、2004/0146972和2001/0003650，其全部通过引用整体并入本文。
2011/0269945、2011/0223636、2011/0152502、2011/0126305、2011/0099646、2010/
0286370、2010/0233726、2010/0184116、2010/0087006、2010/0035287、2007/0021598、
2005/0244921、2005/0221338、2004/0146972和2001/0003650，其全部通过引用整体并入本文。
[0099] 与生物色素的合成有关的蛋白质
[0100] 与生物色素合成有关的蛋白质包括但不限于野生型或突变形式的黑皮质素受体(MC1R)、促黑素细胞激素(MSH)(例如，α-MSH、β-MSH、γ-MSH)、β-防卫素103、野灰蛋白信号传递蛋白(ASP)、酪氨酸酶(TYR)、黑色素细胞特异性转运蛋白、Ras-相关蛋白Rab-7、rab蛋白香叶基香叶基转移酶组件A2和可能的E3泛素-蛋白质连接酶(HERC2)。
[0101] 在某些实施方案中，转基因动物的基因组包含编码与生物色素合成有关的蛋白质的外源核酸分子。
[0102] 编码与生物色素之合成和/或转运有关的蛋白质的核酸分子可来源于包括但不限于显性MC1R E92K和野灰蛋白基因的基因。在某些实施方案中，转基因动物的基因组包含编码与生物色素的合成和/或转运有关有关的蛋白质的核酸分子，所述生物色素包括但不限于：黑色素(例如，褐黑素、真黑素)；尿色素；叶绿素；胆红素；胆绿素；藻胆素；藻红素；粪胆素；尿胆素；血蓝蛋白；血红蛋白；肌红蛋白；荧光素；类胡萝卜素，包括血色素、胡萝卜素(例如，α和β胡萝卜素、番茄红素、视紫质)、叶黄素(例如，角黄素、玉米黄质、黄体素)；光敏素；藻胆蛋白(例如，R-藻红蛋白(R-PE)、B-藻红蛋白(B-PE)、C-藻蓝蛋白(CPC)、别藻蓝蛋白(APC))；多烯烯醇化物；和类黄酮。
[0103] 黄色、红色或橙色的类胡萝卜素色素可在表达八氢番茄红素合酶、去饱和酶和环化酶的动物中合成，如Moran(2010)和Verdoes(2003)中所述。在一个实施方案中，使用香叶基香叶基焦磷酸作为底物合成类胡萝卜素染料。
[0104] 与生物色素的合成和/或转运有关的蛋白质包括但不限于：双功能酶CarRP样酶同工型1[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001943170(SEQ ID NO：1))、双功能酶CarRP样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001950787(SEQ ID NO：2))、番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001950868(SEQ ID NO：3))、八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001943225(SEQ ID NO：4))、八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001950764(SEQ ID NO：5))、八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP001946689(SEQ ID NO：6))和八氢番茄红素脱氢酶样酶[豌豆蚜](例如，GenBank登录号XP_001943938(SEQ ID NO：7))。
[0105] 与生物色素合成和/或转运有关的蛋白质可以是任何动物来源(例如，小鼠、猪、人)，包括但不限于：黑皮质素1受体(例如，GenBank登录号EDL11741(SEQ ID NO：8))、α促黑素细胞激素(MSH)(例如，SEQ ID NO：9)、β促黑素细胞激素(MSH)(例如，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)、γ促黑素细胞激素(MSH)(例如，SEQ ID NO：12)、β-防卫素(例如，GenBank登录号AAT67592(SEQ ID NO：13))、野灰蛋白信号传递蛋白前体(例如，GenBank登录号NP_056585(SEQ ID NO：14))、酪氨酸酶(TYR)(例如，GenBank登录号BAA00341(SEQ ID NO：
15))、黑色素细胞特异性转运蛋白(例如，GenBank登录号Q62052(SEQ ID NO：16))、rab蛋白香叶基香叶基转移酶组件A2(例如，GenBank登录号NP_067325(SEQ ID NO：17))、ras相关蛋白Rab-7a(例如，GenBank登录号NP_033031(SEQ ID NO：18))和可能的E3泛素-蛋白质连接酶(HERC2)(例如，GenBank登录号NP_084390(SEQ ID NO：19))。
15))、黑色素细胞特异性转运蛋白(例如，GenBank登录号Q62052(SEQ ID NO：16))、rab蛋白香叶基香叶基转移酶组件A2(例如，GenBank登录号NP_067325(SEQ ID NO：17))、ras相关蛋白Rab-7a(例如，GenBank登录号NP_033031(SEQ ID NO：18))和可能的E3泛素-蛋白质连接酶(HERC2)(例如，GenBank登录号NP_084390(SEQ ID NO：19))。
[0106] 在某些实施方案中，与生物色素合成和/或转运有关的蛋白质可以是与SEQ ID NO：1至19中的任一具有至少80％同一性或具有任意同一性百分比大于80％(例如，至少85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的蛋白质。
[0107] 与毛发、甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质
[0108] 在某些实施方案中，转基因动物表达编码改变毛发质量(例如，直的或卷的毛发)或长度的蛋白质的核酸分子。在一个实施方案中，在外毛根鞘(outer root sheath)中条件性过表达WNT3或DVL2诱导动物的较短毛发。在某些实施方案中，转基因动物表达编码与动物毛发、指/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关之蛋白质的核酸分子。
[0109] 与控制动物毛发、甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质包括角蛋白，包括但不限于角蛋白1、角蛋白2、角蛋白2A、角蛋白HB6、角蛋白3、角蛋白4、角蛋白5、角蛋白6、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白9、角蛋白10、角蛋白11、角蛋白12、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20、角蛋白23、角蛋白24、角蛋白25、角蛋白26、角蛋白27、角蛋白28、角蛋白31、角蛋白32、角蛋白33、角蛋白34、角蛋白35、角蛋白36、角蛋白37、角蛋白38、角蛋白39、角蛋白40、角蛋白71、角蛋白
72、角蛋白73、角蛋白74、角蛋白75、角蛋白76、角蛋白77、角蛋白78、角蛋白79、角蛋白80、角蛋白81、角蛋白82、角蛋白83、角蛋白84、角蛋白85和角蛋白86。
72、角蛋白73、角蛋白74、角蛋白75、角蛋白76、角蛋白77、角蛋白78、角蛋白79、角蛋白80、角蛋白81、角蛋白82、角蛋白83、角蛋白84、角蛋白85和角蛋白86。
[0110] 氨基酸和/或多核苷酸序列的修饰
[0111] 多种以下蛋白质的氨基酸序列是公众可获得的，例如通过GenBank数据库获得：色素蛋白质；与色素的合成和/或转运有关的蛋白质；与动物皮肤或毛皮的长度和/或质地有关的蛋白质；以及与动物甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质。本发明涵盖这样的蛋白质的用途。
[0112] 本发明范围内的多核苷酸和多肽也可根据与本文特别示例的那些序列的同一性来限定。序列同一性通常大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，以及可大于95％。与本文示例的序列相比，序列同一性可以为60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％。
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％。
[0113] 除非另有说明，本文使用的两个序列的百分比序列同一性可使用Karlin和Altschul(1993)改进的Karlin和Altschul(1990)的算法来确定。这样的算法被并入了Altschul等(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可利用评分＝100、字长＝12的NBLAST程序进行BLAST搜索以获得具有期望百分比序列同一性的序列。出于比较目的获得缺口比对，可如Altschul等(1997)的描述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见NCBI/NIH网站。
[0114] 启动子元件
[0115] 在根据本发明的某些实施方案中，核酸分子与组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子有效地连接。
[0116] 本文使用的术语“组成型启动子”指其通常含义，即允许持续转录其相关联基因的未受调控的启动子。可根据本发明使用的组成型启动子包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β肌动蛋白启动子、泛素启动子、JeT启动子、SV40启动子、β珠蛋白启动子、延伸因子1α(EF1-α)启动子、RSV启动子和Mo-MLV-LTR启动子。
[0117] 可根据本发明使用的启动子包括但不限于：通用启动子(例如，Rosa26)；组织特异性启动子，例如角质形成细胞特异性启动子(例如，角蛋白14)；黑色素细胞特异性启动子(例如，黑皮质素1受体(MCR1)基因的启动子)；以及真皮乳头特异性启动子。可根据本发明使用的启动子包括黑色素细胞特异性启动子和基质细胞特异性启动子。
[0118] 角质形成细胞特异性启动子包括但不限于以下角蛋白基因的启动子：角蛋白1、角蛋白2、角蛋白2A、角蛋白HB6、角蛋白3、角蛋白4、角蛋白5、角蛋白6、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白9、角蛋白10、角蛋白11、角蛋白12、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20、角蛋白23、角蛋白24、角蛋白25、角蛋白26、角蛋白27、角蛋白28、角蛋白31、角蛋白32、角蛋白33、角蛋白34、角蛋白35、角蛋白36、角蛋白37、角蛋白38、角蛋白39、角蛋白40、角蛋白71、角蛋白72、角蛋白73、角蛋白74、角蛋白75、角蛋白76、角蛋白77、角蛋白78、角蛋白79、角蛋白80、角蛋白81、角蛋白82、角蛋白83、角蛋白84、角蛋白85和角蛋白86。
[0119] 在某些实施方案中，可根据本发明使用的启动子包括但不限于在内源目的生物因子(例如NF-KB、干扰素γ、雌激素和/或糖皮质激素)的存在下诱导基因表达的启动子。
[0120] 可根据本发明使用的启动子包括但不限于在目的感染因子(infectious agent)(例如病毒、细菌和/或原生动物)的存在下诱导基因表达的启动子。
[0121] 在一个实施方案中，使用真皮乳头特异性启动子在来源于体节的细胞中产生可定制色素沉着、颜色或图案；可使用的启动子包括但不限于：Ripply2启动子、Tabby启动子和Ticked启动子。可通过进行多物种比较和/或使用高度保守的启动子元件的保守程度确定启动子的选择。在某些实施方案中，启动子元件还包含编码报告蛋白的核酸分子，其响应于转基因动物中的药物施用和/或代谢状态或生物标记的循环水平而表达。在一个实施方案中，启动子响应于转基因动物中目的生理状态的存在而诱导目的蛋白(例如，色素蛋白质和/或与生物色素合成有关的蛋白质)的表达，所述生理状态例如心脏应激、循环细胞因子水平升高和/或类固醇的存在或活性升高。
[0122] 诱导型表达系统
[0123] 可根据本发明使用的诱导型基因表达系统包括但不限于：位点特异性重组系统，其包括但不限于Cre-LoxP重组系统、FLP-FRT重组系统；四环素(Tet)控制的转录激活系统；蜕皮激素诱导型系统；热休克开/关系统；lacO/IPTG系统；cumate阻抑蛋白CymR系统；硝基还原酶系统；库马霉素/新生霉素调控系统；RheoSwitch配体RSL1系统；嵌合二分核受体表达系统；GAL4系统；固醇或类固醇或合成类固醇诱导/阻抑系统；及其任意组合。
[0124] 在一个实施方案中，可根据本发明使用的诱导型系统是Cre-LoxP重组系统。转基因动物的基因组可包含在Cre/LoxP重组系统的控制下表达的外源核酸分子，其中Cre/LoxP重组系统阻止所述外源核酸分子的表达。在一个具体实施方案中，Cre/LoxP重组系统包含lox-stop-lox(LSL)序列。
[0125] Cre-LoxP重组系统是位点特异性重组技术，其可用于在转基因动物或细胞的DNA中进行位点特异的缺失、插入、易位和倒位。Cre重组酶蛋白质(由最初命名为“引起重组”的基因座编码)由4个亚基和2个结构域构成：较大的羧基(C端)结构域和较小的氨基(N端)结构域。loxP(P1上x的基因座)是噬菌体P1上的位点，由34bp构成。Cre重组酶介导的重组的结果依赖于loxP位点的位置和方向，其可顺式或反式定位。在顺式定位的情况下，loxP位点的方向可以是相同的或相反的。在反式定向的情况下，涉及的DNA链可以是线性或环形。在顺式loxP位点的情况下，Cre重组酶介导的重组的结果可以是间插序列的切除(在loxP位点方向相同时)或倒位(在loxP位点方向相反时)，或者在反式loxP位点的情况下，将一个DNA插入到另一个中或在两个分子(染色体)之间易位。Cre-LoxP重组系统在本领域中是已知的，参见，例如Andras Nagy，Cre recombinase：the universal reagent for genome tailoring，Genesis 26：99-109(2000)。
[0126] 在不存在Cre介导的重组的情况下，Lox-Stop-Lox(LSL)盒阻止转基因的表达。在Cre重组酶的存在下，LoxP位点重组，终止子盒缺失。Lox-终止-Lox(LSL)盒在本领域中是已知的。参见，Allen Institute for Brain Science，Mouse Brain Connectivity Altas，Technical White Paper：Transgenic Characterization Overview(2012)。
[0127] 在某些实施方案中，loxP位点还包含编码基因(例如lacz、GFP)的报告基因和/或编码第二色素沉着蛋白的核酸分子(例如，如果第一色素沉着包含显性活化的MC1R，则另一个野灰蛋白基因可以被loxP位点侧翼连接)。
[0128] 四环素(Tet)控制的转录激活是一种诱导型表达方法，其中转录被抗生素四环素或其衍生物之一种(例如，多西环素)的存在或不存在可逆地控制。由于Tet-off蛋白或Tet-on蛋白与位于诱导型启动子内的四环素响应元件(TRE)结合，基因的表达被激活。Tet-on蛋白和Tet-off蛋白二者均激活基因表达。Tet-off蛋白在不存在四环素衍生物-多西环素(Dox)的情况下激活基因表达，而Tet-on蛋白在Dox的存在下激活基因表达。
[0129] 在Tet-off系统中，将通过TetR(四环素阻抑蛋白)蛋白质(可获自大肠杆菌(Escherichia coli)细菌)与VP16蛋白(可获自单纯疱疹病毒)融合产生的四环素反式激活因子(tTA)蛋白与TetO操纵子上的DNA结合。一旦结合TetO操纵子，激活与TetO操纵子偶联的启动子，从而激活附近基因的转录。四环素衍生物与tTA结合，并使其无法与TRE序列结合，从而阻止靶基因的反式激活。
[0130] 在Tet-on系统中，当tTA蛋白被多西环素结合时，多西环素结合的tTA能够与TetO操纵子结合。因此，向系统中引入多西环素起始基因产物的转录。为了更快的响应性，有时优选Tet-on系统。
[0131] 反向tTA(rtTA)是互补基因模块，用于通过添加Dox(Tet-on)迅速激活基因。参见Kistner等，Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.第93卷，第10933-10938页(1996)。
[0132] 改进的Tet-on反式激活蛋白(也称为rtTA2S-M2)是Tet-On的替代版本，其表现出降低的基础表达，并在与Tet-on相比低10倍的Dox浓度相下发挥作用。另外，由于是人密码子优化的并使用三个最小转录激活结构域，其表达被认为在真核细胞中更稳定。Tet-on 3G(也称为rtTA-V10)与改进的Tet-on类似，是人密码子优化的并由三个最小的VP16活化结构域构成。与原始Tet-on相比，Tet-on 3G对低100倍的Dox敏感。
[0133] 在响应四环素的调控表达元件的一个实施方案中，四环素控制的反向反式激活蛋白(rtTA)包含：tetR(例如，来自大肠杆菌Tn10)；充当效应器的哺乳动物转录因子VP 16反式激活的结构域；和控制rtTA效应器转录的组织特异性启动子。在多西环素的存在下，rtTA与位于CMV启动子上游的(TeTO)7操纵子(7个串联的重复TetO序列)结合，所述CMV启动子驱动转基因的表达。因此，可通过施用和撤开多西环素来开启或关闭转基因的表达。
[0134] 表达构建体
[0135] 本发明还提供了可用于产生转基因动物的表达构建体、载体以及宿主细胞。
[0136] 本文使用的术语“表达构建体”是指提供用于有效地连接的核酸序列之转录的核酸序列的组合。本发明的表达构建体通常还包含在待表达所述表达构建体的预期宿主细胞中起作用的调控元件。因此，本领域一般技术人员可选择调控元件用于在例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞中使用。调控元件包含启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和聚腺苷酸化元件。
[0137] 在某些实施方案中，本发明提供了用于定制动物的颜色和/或图案的表达构建体，包括色素沉着构建体和图案构建体。
[0138] 图1示出了色素沉着构建体的一个实施方案，其包含：启动子、loxP盒、编码目的色素蛋白质或与目的色素之合成和/或转运有关的蛋白质的核酸分子以及聚腺苷酸化序列。在色素沉着构建体的一个实施方案中，通过施用Cre重组酶激活目的色素蛋白质或与目的色素之合成和/或转运有关的蛋白质的表达。
[0139] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种图案构建体。图2示出了图案构建体的一个实施方案。在一个实施方案中，图案构建体的启动子来源于对体节边界特化特异的基因。在一个实施方案中，所述启动子选自Ripply2启动子、Tabby启动子和Ticked启动子。在一个实施方案中，转基因动物包含色素沉着构建体和图案构建体。在一个实施方案中，转基因动物在背部皮肤上具有可定制的组成型垂直条纹。
[0140] 在一个实施方案中，转基因动物的基因组包含：
[0141] 1)图1中所示的色素沉着构建体，其中启动子是黑色素细胞特异性启动子，并且核酸分子编码与红色素合成有关的蛋白质(例如，ASIP或MC1R)；
[0142] 2)图1所示的色素沉着构建体，其中启动子是真皮乳头特异性启动子，并且核酸分子编码防卫素103；以及
[0143] 3)图3所示的一组构建体，其中启动子是黑色素细胞特异性启动子。
[0144] 本发明的表达构建体可包含与编码本发明之肽的多核苷酸序列有效地连接的启动子序列。可使用本领域中已知的标准技术将启动子并入多核苷酸。可在本发明的表达构建体中使用启动子的多个拷贝或多个启动子。在一个优选实施方案中，启动子可定位在距转录起始位点与在其天然基因环境中距转录起始位点大约相同距离的位置。允许该距离的一些变化而不大幅降低启动子活性。转录起始位点通常包含在表达构建体中。
[0145] 本文使用的术语“有效地连接”是指所述组件毗邻，其中组件处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系。通常，有效地连接的组件是相邻关系。与编码序列有效地连接的序列能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导该编码序列的转录时，编码序列与启动子有效地连接。
[0146] “编码序列”或“编码区”是被转录成mRNA和/或翻译成多肽的多核苷酸序列。例如，编码序列可编码目的多肽。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子确定。
[0147] 本文使用的术语“启动子”是指与待转录的核酸序列(例如编码期望分子的核酸序列)有效地连接的DNA序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游，并提供用于被RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。在一些具体实施方案中，启动子通常位于转录产生期望分子的核酸序列的上游，并提供用于被RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。
[0148] 除启动子之外，可包含一个或更多个增强子序列，例如，但不限于：巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和SV40增强子元件。另外包含的序列为：内含子序列，例如β珠蛋白内含子或通用内含子；转录终止序列和mRNA聚腺苷酸化(pA)序列，例如但不限于SV40-pA、β-珠蛋白-pA、人生长激素(hGH)pA和SCF-pA。
[0149] 在一个实施方案中，表达构建体包含聚腺苷酸序列，例如来源于牛生长激素(BGH)和SV40的聚腺苷酸序列。
[0150] 术语“聚腺苷酸”或“p(A)”或“pA”是指作为转录终止和mRNA聚腺苷酸化的信号的核酸序列。聚腺苷酸序列以六核苷酸基序AAUAAA为特征。通常使用的聚腺苷酸化信号是SV40pA、人生长激素(hGH)pA、β-肌动蛋白pA和β-珠蛋白pA。序列的长度范围可以为32bp至450bp。可使用多个pA信号。
[0151] 在一个实施方案中，基因构建体包含编码选择标记(例如新霉素抗性生物标记蛋白)的核酸分子，其可通过PIGGYBACTM转座子切除。在一个实施方案中，构建体侧翼连接短的同源臂。
[0152] 术语“载体”用来指用于向宿主细胞转移编码信息(例如，本发明多核苷酸)的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。
[0153] 术语“表达载体”和“转录载体”可互换使用，是指适于在宿主细胞(例如，对象的细胞)中使用并且包含指导和/或控制外源核酸序列之表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于过程例如转录、翻译和RNA剪接(若存在内含子)。可根据本发明使用的载体包括质粒、病毒、BAC、YAC等。说明性的特定病毒载体包括来源于腺病毒、腺相关病毒和慢病毒的那些。
[0154] 本文使用的术语“分离的”分子(例如，分离的核酸分子)是指在通过重组技术产生时基本不含其它细胞物质或培养基的分子，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质的分子。
[0155] 术语“重组体”用于指核酸构建体，其中两个或更多个在自然中未发现连接的核酸被连接。
[0156] 本文使用的术语“核酸”是指具有超过一个核苷酸的任何形式(包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸)的RNA或DNA分子。
[0157] 术语“核苷酸序列”用于指单链形式的核酸中寡核苷酸或多核苷酸的核苷酸顺序。
[0158] 术语“表达”是指转录核酸序列以产生相应的mRNA和/或翻译mRNA以产生相应的蛋白质。可使用公知方法重组或合成或通过DNA合成产生表达构建体。
[0159] 本文使用的术语“调控元件”是指控制有效地连接的核酸序列之表达的一些方面的核苷酸序列。用作说明的示例性调控元件包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、聚腺苷酸化信号(pA)、启动子、转录终止序列和上游调控结构域，其有助于核酸序列的复制、转录、转录后加工。本领域一般技术人员能够不超过常规实验来选择和使用表达构建体中的这些和其他的调控元件。
[0160] 在一个实施方案中，本发明的构建体包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，表达构建体包含kozak共有序列。
[0161] 任选地，转基因构建体中包含报告基因。本文使用的术语“报告基因”是指在表达时容易检测的基因，例如，通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标记、配体结合测定等。示例性报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白。通过基因工程生产重组体核酸、载体、转化的宿主细胞、蛋白质和蛋白质片段是公知的。
[0162] 若需要，载体可任选地包含指导位点特异性同源重组的侧翼核酸序列。使用侧翼DNA序列以允许同源重组到期望的基因座位中是本领域中已知的。目前，优选在载体中在编码序列(或待通过同源重组插入到染色体位置中的本发明任何其他序列)两侧上都存在对应于染色体插入位点的多至数千或更多碱基的侧翼DNA以确保利用外源DNA精确替换染色体序列。参见，例如Deng等，1993，Mol.Cell.Biol13(4)：2134-40；Deng等，1992，Mol Cell Biol12(8)：3365-71；和Thomas等，1992，Mol Cell Biol12(7)：2919-23。还应注意的是，本发明细胞可包含目的基因的多个拷贝。
[0163] 转化的宿主细胞是已经用包含本发明之核酸构建体的载体转化或转染的细胞，其可以或可以不转录或翻译有效地关联的目的核酸。
[0164] 用于定制动物性状的RNA干扰盒
[0165] 在另一个实施方案中，本发明提供了具有可定制性状的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组包含：
[0166] 目的外源抑制性RNA编码序列，其与启动子有效地连接并处于诱导型基因表达系统的控制下，所述诱导型基因表达系统需要诱导剂的存在以激活基因表达；
[0167] 其中在不存在诱导剂的情况下，所述目的外源抑制性RNA编码序列的表达被抑制。
[0168] 在某些实施方案中，目的外源抑制性RNA编码序列干扰编码以下蛋白质之核酸序列的表达：色素蛋白质；与色素的合成和/或转运有关的蛋白质；与动物皮肤或毛皮的长度和/或质地有关的蛋白质；发光(例如荧光)蛋白质；和与动物甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质。
[0169] 在一个实施方案中，外源抑制性RNA编码序列编码干扰甲/嘴甲/指甲/趾甲中的交联肌动蛋白之表达的siRNA，从而产生具有软甲/嘴甲/指甲/趾甲而不是硬甲/嘴甲/指甲/趾甲的转基因动物(例如，猫)。
[0170] 在一个实施方案中，RNAi构建体包含干扰编码交联角蛋白的核酸分子之表达的siRNA，其与对交联角蛋白特异性的启动子有效地连接，并处于两侧连接loxP位点的报告基因的控制下。
[0171] 与动物毛发、甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质包括但不限于：角蛋白1、角蛋白2、角蛋白2A、角蛋白HB6、角蛋白3、角蛋白4、角蛋白5、角蛋白6、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白9、角蛋白10、角蛋白11、角蛋白12、角蛋白13、角蛋白
14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20、角蛋白23、角蛋白24、角蛋白25、角蛋白26、角蛋白27、角蛋白28、角蛋白31、角蛋白32、角蛋白33、角蛋白34、角蛋白
35、角蛋白36、角蛋白37、角蛋白38、角蛋白39、角蛋白40、角蛋白71、角蛋白72、角蛋白73、角蛋白74、角蛋白75、角蛋白76、角蛋白77、角蛋白78、角蛋白79、角蛋白80、角蛋白81、角蛋白
82、角蛋白83、角蛋白84、角蛋白85和角蛋白86。
14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20、角蛋白23、角蛋白24、角蛋白25、角蛋白26、角蛋白27、角蛋白28、角蛋白31、角蛋白32、角蛋白33、角蛋白34、角蛋白
35、角蛋白36、角蛋白37、角蛋白38、角蛋白39、角蛋白40、角蛋白71、角蛋白72、角蛋白73、角蛋白74、角蛋白75、角蛋白76、角蛋白77、角蛋白78、角蛋白79、角蛋白80、角蛋白81、角蛋白
82、角蛋白83、角蛋白84、角蛋白85和角蛋白86。
[0172] 在一个实施方案中，本发明提供了包含siRNA编码序列和3’UTR序列的微RNA盒。
[0173] 本文使用的术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性细胞内降解。RNAi在细胞中自然发生以除去外源RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA切割的片段进行，其指导对其他类似RNA序列的降解机制。或者，可人为启动RNAi以例如沉默外源靶基因(例如PKC-ι)的表达。
[0174] 本文使用的术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本领域中也被称为“短干扰RNA”)指包含约10至50个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA(或RNA类似物)，其能够指导或介导RNA干扰。
[0175] 如本文使用的，siRNA具有“与靶mRNA序列充分互补的序列以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)”意指siRNA具有足以触发通过RNAi机器或过程破坏靶mRNA(例如PKC-ιmRNA)的序列。“mRNA”或“信使RNA”或“转录物”是单链RNA，其确定一个或更多个多肽的氨基酸序列。在蛋白质合成过程中，当核糖体与mRNA结合时，该信息被翻译。
[0176] 术语“核苷酸”是指具有一个或更多个磷酸基团以酯键连接糖部分的核苷。示例性核苷酸包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换地使用，是指通过5′碳原子和3′碳原子之间的磷酸二酯键连接在一起的核苷酸的聚合物。术语“核酸”或“核酸序列”涵盖：寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或任意这些的片段；基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链，并且可表现为有义链或反义链；肽核酸(PNA)或者任何天然或合成来源的DNA样或RNA样物质。如本领域技术人员将理解的，当核酸是RNA时，脱氧核苷酸A、G、C和T分别被核糖核苷酸A、G、C和U代替。
[0177] 本文使用的术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”通常指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”通常指脱氧核苷酸的聚合物。DNA和RNA分子可以是天然合成的(例如，分别通过DNA的复制或DNA的转录)。RNA分子可以是转录后修饰的。DNA和RNA分子也可以是化学合成的。DNA和RNA分子可以是单链(即，分别为ssRNA和ssDNA)或多链(例如，双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。然而，基于本发明的性质，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”也可以是指主要包含(即，大于80％，或优选大于90％)核糖核苷酸但是任选地包含至少一个非核糖核苷酸分子(例如至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个核苷酸类似物)的聚合物。
[0178] 本文使用的术语“核苷酸类似物”在本文中也称为“经改变的核苷酸”或“经修饰的核苷酸”，是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的核苷酸类似物是在任意位置进行修饰以改变核苷酸的某些化学性质而仍保留所述核苷酸类似物发挥其预期功能的能力。
[0179] 本文使用的术语“RNA类似物”是指与相应的未经改变或未经修饰的RNA相比具有至少一个经改变或经修饰的核苷酸并保留与相应的未经改变或未经修饰RNA相同或相似的性质或功能的多核苷酸(例如，化学合成的多核苷酸)。如上文讨论的，寡核苷酸可通过导致RNA类似物的水解速率比具有磷酸二酯键的RNA分子低的键连接。示例性RNA类似物包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。这样的改变或修饰还可包括例如向RNA的末端或内部(在RNA的一个或更多个核苷酸处)添加非核苷酸物质。RNA类似物仅需要与天然RNA充分类似，使得其能够介导RNA干扰或以其他方式降低靶基因表达。
[0180] 制造转基因非人动物的方法
[0181] 可使用多种方法中的任意一种向非人动物中引入转基因以产生转基因动物。这样的技术是本领域中公知的，并且包括但不限于：前核显微注射、病毒感染以及胚胎干细胞和iPS细胞的转化。可使用的用于产生转基因动物的方法包括但不限于以下文献中描述的那些：J.P.Sundberg和T.Ichiki编辑，Genetically Engineered Mice Handbook，CRC Press；2006；M.H.Hofker和I.van Deursen编辑，Transgenic Mouse Methods and Protocols，Humana Press，2002；A.L.Joyner，Gene Targeting：A Practical Approach，Oxford University Press，2000；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002，ISBN-10：0879695919；K.Turksen(编辑)，Embryonic stem cells：methods and protocols in Methods Mol.Biol.2002；185，Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology，ISBN：978047015180；Meyer等.PNAS USA，卷107(34)，15022-15026。
[0182] 在某些实施方案中，可使用精原干细胞(SSC)、使用转座元件的piggyBacTM移动DNA技术、黄单胞菌(Xanthamonas)转录活化剂(TAL)样核酸酶(XTN)[又名TAL-效应器核酸酶(TALEN)]及其组合产生具有位点特异的敲入的基因工程动物。
[0183] 定制动物性状的方法
[0184] 在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的转基因动物定制动物性状的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
[0185] a)提供转基因动物，其基因组包含：
[0186] 编码目的蛋白质的外源核酸分子，其中所述核酸分子与启动子有效地连接并处于诱导型基因表达系统的控制下，所述诱导型基因表达系统需要诱导剂的存在以激活基因表达；
[0187] 其中，在不存在诱导剂的情况下，所述外源核酸分子的表达被抑制；
[0188] b)向所述转基因动物施用诱导剂，从而诱导所述外源核酸分子的表达。
[0189] 在某些实施方案中，外源核酸分子编码目的蛋白质，其中所述目的蛋白质选自：色素蛋白质；与色素的合成和/或转运有关的蛋白质；发光(例如荧光)蛋白质；与皮肤或毛皮的长度和/或质地有关的蛋白质；以及与动物甲/嘴甲/指甲/趾甲、爪和/或角的质地、结构强度和/或长度有关的蛋白质。
[0190] 在某些实施方案中，可根据本发明使用的诱导型基因表达系统包括但不限于：位点特异性重组系统，其包括但不限于Cre-LoxP重组系统、FLP-FRT重组系统；四环素(Tet)控制的转录激活系统；蜕皮激素诱导型系统；热休克开/关系统；lacO/IPTG系统；cumate阻抑蛋白CymR系统；硝基还原酶系统；库马霉素/新生霉素调控系统；RheoSwitch配体RSL1系统；嵌合二分核受体表达系统；GAL4系统；固醇或类固醇或合成类固醇诱导/阻抑系统；及其任意组合。
[0191] 在某些实施方案中，可根据本发明使用的用于基因表达的诱导剂包括但不限于：cre重组酶HTCre；FLP重组酶；四环素或其衍生物例如多西环素；蜕皮激素；cumate；硝基还原酶类固醇；及其任意组合。
[0192] 在一个实施方案中，转基因动物包含处于位点特异性重组系统的控制之下的外源核酸分子，且在向转基因动物物施用(例如，通过局部施用)重组酶蛋白质后或施用(例如通过注射)编码重组酶蛋白质的核酸分子后，诱导所述外源核酸(nucleic)分子的表达。
[0193] 在一个实施方案中，转基因动物的基因组包含在Cre/LoxP重组系统的控制下表达的外源核酸分子，其中Cre/LoxP重组系统阻止所述外源核酸分子的表达，其中向转基因动物施用(例如，通过局部施用)Cre重组酶和/或HTCre或者施用(例如通过注射)编码Cre重组酶和/或HTCre的核酸分子诱导所述外源核酸分子的表达，从而定制目的动物性状。
[0194] 在另一个具体实施方案中，定制动物性状的方法包括：
[0195] a)提供转基因动物，其基因组包含：
[0196] 编码目的蛋白质(例如，色素沉着蛋白质)的第一外源核酸分子，其与第一启动子有效地连接并处于loxP位点的控制下，其中在不存Cre重组酶蛋白质的情况下，所述loxP位点阻止所述第一外源核酸分子的表达；
[0197] 编码反向tTA(rtTA)的第二核酸，其与第二启动子有效地连接；以及
[0198] 编码Cre重组酶蛋白质的第三核酸分子，其与第三启动子有效地连接并处于TetO操纵子的控制下；
[0199] b)向所述转基因动物施用多西环素，从而诱导所述外源核酸分子的表达。
[0200] 用于向转基因动物施用的诱导剂可以是可与载体组合的形式。术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂(vehicle)。这样的药物载剂可以是无菌液体，例如水和油，包括：石油例如矿物油，植物油例如花生油、大豆油和芝麻油，动物油或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是对于注射溶液。
[0201] 可通过标准途径向转基因动物施用诱导剂和组合物，所述标准途径包括经口、吸入或肠胃外施用(其包括静脉内、皮下、局部、透皮、皮内、透黏膜、腹膜内、肌内、囊内、眼眶内、心脏内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔)，以及作为任何待插入(暂时或永久性)到转基因动物中的医疗设备或物体的组件共施用。实施例
[0202] 以下是说明用于实施本发明的步骤和实施方案的实施例。所述实施例不应被解释为限制性的。
[0203] 实施例1.动物中皮肤或毛皮色素沉着的定制
[0204] 本实施例提供了用于定制动物中的皮肤和毛皮色素沉着的基因构建体的实施方案。
[0205] 在皮肤或毛皮中具有定制的色素沉着和图案的动物
[0206] 对具有褐色(“野灰色”着色)皮肤颜色的C3H/HeJ小鼠品系进行基因工程以表达以下三种构建体：1)包含角蛋白-14特异性启动子、含有编码红色荧光蛋白之核酸的loxp盒、含有编码显性黑色(ΔG23)β防卫素103蛋白质之核酸的色素盒以及SV40(具有内含子)聚腺苷酸化序列的构建体；2)包含与角蛋白-14特异性启动子有效地连接的编码反向四环素反式激活蛋白(rtTA)的核酸分子以及聚腺苷酸化序列的构建体，所述角蛋白-14特异性启动子启动编码rtTA的核酸的转录；以及3)包含与四环素敏感型启动子(TetO)7有效地连接的野灰蛋白信号传递蛋白(ASP)以及牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列的构建体，所述四环素敏感型启动子启动编码ASP的核酸分子的转录。
[0207] 当向基因修饰的小鼠喂食多西环素时，小鼠毛皮变为金色(这是首次证明出生后的毛发颜色的基因修饰)。通过载体基质(例如，蛋白质载体，如脂双层)向基因改造小鼠剃掉毛的皮肤施用Cre或HTNCre，在施用Cre和/或HTNCre的区域诱导毛皮的遗传上地永久性黑色着色。根据本发明，可将出生就具有棕色毛皮的小鼠改造成具有带有任意形状之黑色标记的金色毛皮。例如，可在具有金色背景的小鼠毛皮上产生黑色名字或黑色标志。
[0208] 为了在动物中定制皮肤色素沉着，所述动物可仅表达色素沉着构建体，而不需要表达图案构建体(如图2中所示)。通过施用Cre和/或HTNCre直接激活色素沉着和图案的定制。
[0209] 在一个实施方案中，可通过对动物进行基因改造以表达图案构建体来产生可遗传的图案。图2示出了图案构建体的一个实施方案。启动子可以是Ripply2启动子或来自对体节边界特化特异的任何基因。或者启动子可以是Tabby启动子或Ticked启动子。
[0210] 在一个实施方案中，基因组中包含色素沉着构建体和图案构建体的基因修饰动物在背部皮上具有组成型垂直条纹。
[0211] 复杂/多色图案
[0212] 图3描述了用于在动物皮肤或毛皮上产生复杂或多色图案的基因构建体的某些实施方案。在一个实施方案中，可借助于包含诱导型系统(如具有可诱导性机制的启动子)的构建体产生复杂图案。如图3所示，Cre仅在对rtTA启动子特异的组织中通过多西环素的存在激活。使用组织特异性启动子维持动物的体节边界；例如，转基因可仅在发育时期激活。还可使用诱导型系统产生多种颜色。
[0213] 可根据本发明使用的诱导型系统包括但不限于：四环素、蜕皮激素和他莫西芬诱导型系统；FLP-FRT重组系统；和Cre-LOX重组系统。
[0214] 实施例2.具有定制的毛皮颜色和图案的小鼠
[0215] 本实施例示出了通过透皮施用HTNCre可永久性改变其毛皮颜色的基因改造小鼠的产生，所述HTNCre是一种可容易穿过细胞膜的重组酶。
[0216] 图4示出了用于在小鼠皮肤或毛皮中产生定制的图案和颜色的一种基因构建体。所述构建体包含角蛋白14启动子(其在所有皮肤成纤维细胞中表达)以驱动信号分子βDef103的显性黑色形成；β-Def103的表达被编码环指蛋白(RFP)(所述RFP被用作标志)的Loxp可切除的核酸阻断。
[0217] 对野灰色小鼠进行基因工程以表达编码“显性黑色”信号分子βDef103的转基因，并且所述转基因的表达通过施用重组酶激活。
[0218] 图5A和B是示出了两个基因工程的小鼠的照片，其中通过皮或皮内施用在载体溶液中的HTNCre来激活显性黑色素蛋白的表达。在本发明之前，重组酶从未在活动物中施用过。
[0219] 图6表明向基因工程小鼠施用重组酶可导致毛皮颜色的剂量依赖性改变。野灰色小鼠毛发的尖端通常以包含黄褐黑素的细胞为特征(A)。如图6中所示，通过增加重组酶剂量来增加转基因的激活，小鼠毛皮色素可从褐黑素和黑色的真黑素的混合(B)转变为纯的真黑素(C)，转变成如此多的黑色素以致于划分的结构被破坏(D)。该实施例表明透皮施用重组酶可导致基因工程小鼠中毛发颜色的精细控制。
[0220] 实施例3.用于牛鉴定的定制的皮肤颜色和图案
[0222] 本实施例提供了具有可用作牛鉴定的代码(例如，条形码)的定制的皮肤颜色和图案的转基因牛。可使用实施例2中描述的方法产生转基因牛。如实施例2中所示，在出生后向基因组包含Cre-LoxP重组系统的转基因小鼠透皮或皮内施用重组酶诱导皮毛可定制的改变。
[0223] 图7示出了用于在牛中产生定制的图案或颜色鉴定的一种构建体。所述构建体包含编码显性负性Rab7的核酸分子，其与MC1R启动子有效地连接并处于loxP-STOP-loxP序列的控制下。可通过施用Cre重组酶诱导Rab7的表达。使用TAL核酸酶允许用短同源臂位点特异性敲入。构建体上的顶体蛋白启动子/EGFP臂允许流式分选(flow sorting)基因修饰的精子，从而确保F1代中100％是基因改造的后代。构建体的一个重要元件是MC1R(黑皮质素受体)启动子，其仅在使用重组酶激活时驱动显性负性Rab7基因的表达。构建体中多种元件的组合允许产生具有位点特异性敲入的经改造牛，所述位点特异性敲入允许在牛上产生永久的鉴定信息。
[0224] 图8示出了基因改造的黑安格斯小母牛在皮肤中表达可定制鉴定图案的图。
[0225] 在出生处理的过程中，可通过向基因组中包含图7所示构建体的牛施用Cre重组酶可容易地产生个体鉴定信息。另外，转基因仅在动物皮肤中表达，其可在食品加工的过程中除去，因此，在动物皮肤中产生牛标识应该不会增加政府机构(如USDA)的管理问题。
[0226] 在某些实施方案中，可使用常规技术产生位点特异性敲入动物，所述常规技术包括但不限于：精原干细胞(SSC)、使用转座元件的piggyBacTM移动DNA技术、黄单胞菌转录活化剂样(TAL)核酸酶(XTN)[又名TAL-效应器核酸酶(TALEN)]及其组合。
[0227] 在一个实施方案中，用使用黑色素细胞特异性显性负性Rab7的杂合敲入对黑安格斯皮毛颜色进行出生后改造，其需要关键的黑色素生成基因Tyrp1的细胞内转运。
[0228] 实施例4.用于牛疾病检测的定制的皮肤颜色和图案
[0229] 疾病是几乎每位牛肉和乳制品生产者的关注点，且许多常见疾病可能严重影响生产并且没有明显的临床征兆。猝死经常是梭菌疾病的首次和唯一的征兆。亚临床乳腺炎是乳制品生产中常见并且昂贵的问题。甚至传言很少具有明显临床征兆的牛海绵状脑病(BSE)也可对牛肉产业造成严重的经济损失。除感染性疾病之外，牛中的代谢性疾病也可造成经济损失：由于其饲料中存在螯合剂，1/3的肉牛具有亚临床的铜缺乏。根据本发明，毛皮或皮肤颜色的改变(例如，使用重组酶激活的皮毛颜色特异性标记)可用于鉴定牛中疾病的存在。
[0230] 在一个实施方案中，用于牛疾病检测的构建体与图7中所示构建体相同，不同之处在于使用替代的重组酶系统(例如，Flp-Frt重组系统)和/或疾病特异性启动子(如响应于NFkB、Ifnγ或铜缺乏靶标的启动子)代替了MC1R启动子。
[0231] 在一个实施方案中，在出生处理过程中，用重组酶涂抹牛以产生期望的符号。一旦牛发生炎症或代谢应激，涂抹区将变色(疾病特异性启动子调控的色素蛋白质的表达)。通过使用不同重组酶和重组酶靶标，可将牛疾病检测应用与牛鉴定应用组合使用。
[0232] 实施例5.具有可定制皮毛的狗
[0233] 不同品种的狗具有因色素基因的突变的不同组合所产生的皮毛颜色。哈巴狗具有完整的黑皮质素受体，但不具有“显性黑色”信号分子βDef103的内源表达。
[0234] 可使用实施例3和4中用于牛的所描述方法或通过实施例2中用于小鼠的所示流程产生具有定制的毛色和图案的狗。在一个实施方案中，基因组包含图7中所示构建体的基因工程的哈巴狗具有可定制颜色和图案的毛皮，所述图案包括老虎条纹、标志、书写内容和心形。
[0235] 由于犬科动物奇异的卵发育系统，狗通常难以进行基因工程。目前，无法通过体外受精(IVF)产生基因工程狗。可使用精原干细胞(SSC)、使用转座元件的piggyBacTM移动DNA技术、黄单胞菌转录活化剂样(TAiL)核酸酶(XTN)[又名TAL-效应器核酸酶(TALEN)]及其组合产生具有位点特异性敲入的基因工程狗。
[0236] 本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用并入本文，其程度等同于每一参考文献均被单独地并且明确地指出通过引用并入，并且以其整体在本文陈述。
[0237] 除非本文另有说明或同上下文明显抵触，否则在描述本发明的上下文中使用的没有量词限定的名词以及类似的指代被解释为包含单数和复数二者。
[0238] 本文引述的值的范围仅旨在用作个别地引用落在该范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另有说明，并且每个单独值都并入本说明书中，如同其在本文单独列出。除非另外说明，本文提供的所有精确值代表了相应的近似值(例如，在恰当时，对特定因子或测量值所提供的所有精确示例性值可被认为是也提供了用“约”修饰的相应近似测量值)。
[0239] 本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是为了限制本发明的范围，除非另有说明。本说明书中没有语言能够被解释为表明任何元件是实施本发明所必需的，除非同样地明确指明。
[0240] 本文对参照一个或多个元素使用术语例如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”的本发明的任何方面或实施方案的描述旨在为由特定的一个或更多个元素“组成”或“基本由其组成”或“基本包含”所述特定元素的本发明的类似方面或实施方案提供支持，除非另有说明或同上下文明显抵触(例如，本文描述为包含特定元素的组合物应被理解为也描述了由所述元素组成的组合物，除非另有说明或同上下文明显抵触)。
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