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用于病毒性疾病的广效型疫苗

阅读：187发布：2020-05-16

专利汇可以提供用于病毒性疾病的广效型疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于诱导一种或多种免疫反应和/或用于增强宿主中疫苗接种的有效性的药物组合，所述药物组合能够诱导针对口蹄疫病毒的多个毒株和/或血清型的交叉保护。，下面是用于病毒性疾病的广效型疫苗专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种能够诱导针对不同血清型或病毒株的交叉保护的疫苗制剂，其中该疫苗制剂包含全灭活病毒和至少一种以下成分：
a)编码该病毒的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；
b)该病毒的人工肽或多肽；
c)该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；
d)该病毒的病毒样颗粒；
e)衍生自其他病毒的病毒样颗粒，该病毒样颗粒展示该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；
或
f)肽、多肽或蛋白质作为载体或分子佐剂，其中该肽、多肽或蛋白质会或不会与任何(b)至(e)的成分融合。
2.如权利要求项1之疫苗制剂，其制剂能够针对该病毒特定血清型的所有毒株，或针对该病毒的所有血清型的所有毒株，诱导保护性免疫。
3.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒包含口蹄疫病毒。
4.如权利要求项3之疫苗制剂，其制剂能够针对该病毒的一种或多种血清型的所有毒株，诱导保护性免疫，该血清型包含O、A、C、Asia 1、SAT-1、SAT-2和SAT-3。
5.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该多核苷酸衍生自以下各选择中全部、部分或变异的序列：
a)编码一个或多个口蹄疫病毒衣壳蛋白基因VP1、VP2、VP3和VP4的多核苷酸序列；
b)编码一个或多个口蹄疫病毒非结构蛋白基因2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的多核苷酸序列；
c)编码一个或多个氨基酸序列SEQ ID NO.1-55的多核苷酸序列；或
d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能类似物的肽的多核苷酸序列。
6.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该重组或人工病毒肽、多肽或蛋白质编码选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：
a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；
b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；
c)一个或多个SEQ ID NO.1-55的氨基酸序列；或
d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。
7.如权利要求项6之疫苗制剂，其中该重组或人工病毒肽、多肽或蛋白质是线性或树状聚合物。
8.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该全灭活病毒包含任何血清型或毒株的口蹄疫病毒。
9.如权利要求项8之疫苗制剂，其中该全灭活口蹄疫病毒选自一种或多种血清型或毒株的口蹄疫病毒。
10.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该病毒样颗粒包括一种或多种天然或突变形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白质。
11.如权利要求项10之疫苗制剂，其中该突变形式的VP0、VP1和VP3蛋白质能形成完整的空衣壳蛋白。
12.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该衍生自其他病毒的病毒样颗粒与病毒肽、多肽或蛋白质融合，其中该病毒肽、多肽或蛋白质选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：
a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；
b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；
c)一个或多个SEQ ID NO.1-55的氨基酸序列；或
d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。
13.如权利要求项1之疫苗制剂，其中该病毒是口蹄疫病毒，其中该载体或分子佐剂与多肽融合，其中该多肽编码选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：
a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；
b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；
c)一个或多个SEQ ID NO.1-55的氨基酸序列；或
d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。
14.如权利要求项13之疫苗制剂，其中该载体或分子佐剂是线性或树状聚合物。
15.如权利要求项13之疫苗制剂，其中该载体或分子佐剂源自Brucella lumazine synthase(BLS)蛋白的天然氨基酸序列或其突变体、或与BLS蛋白或其片段的序列具有至少
85％同源性的氨基酸序列。
16.如权利要求项15之疫苗制剂，其中该载体或分子佐剂与来自相同口蹄疫病毒毒株或血清型的一种或多种口蹄疫病毒多肽融合。
17.如权利要求项15之疫苗制剂，其中该载体或分子佐剂与来自不同口蹄疫病毒毒株或血清型的一种或多种口蹄疫病毒多肽融合。
18.如权利要求项15之疫苗制剂，其中该载体或分子佐剂不与任何口蹄疫病毒衍生的多肽融合。
19.如权利要求项15之疫苗制剂，其中该BLS突变体是具有点突变的BLS蛋白以提高其稳定性。
20.一种对易受口蹄疫病毒感染的宿主接种疫苗的方法，包含向宿主施用一种或多种如权利要求项15之疫苗制剂以诱导免疫反应。
21.如权利要求项20之方法，其中该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置同时施用。
22.如权利要求项20之方法，其中该疫苗制剂的组分在宿主的相同位置于不同时间点施用。
23.如权利要求项20之方法，其中该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置于不同时间点施用。
24.如权利要求项20之方法，其中该宿主是牛、羊、山羊或猪。
25.如权利要求项20之方法，其中该宿主未感染口蹄疫病毒，其中该诱导的免疫反应是保护性免疫反应。
26.如权利要求项20之方法，其中该诱导的免疫反应是体液免疫反应或细胞免疫反应。
27.如权利要求项20之方法，其中该诱导的免疫反应包括针对一种或多种口蹄疫病毒各种血清型或毒株的交叉保护中和抗体。
28.如权利要求项20之方法，其中该诱导的免疫反应与一种或多种口蹄疫病毒的各种血清型或毒株交叉反应。

说明书全文

用于病毒性疾病的广效型疫苗

发明背景

[0001] 随着全球人口以目前的速度增长，确保安全和可持续的粮食供应至关重要。动物卫生行业的重要挑战，是力求为安全、可靠和可持续的食品供应而开发先进的解决方案。动物保健品有助于改善和维护动物在疾病预防、治疗和管控方面的健康和福利。

[0002] 动物生病的最重要原因之一是受病毒感染。其中一些病毒的传染性非常高，可以造成毁灭性的经济损失和对公共卫生造成影响。

[0003] 口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是一种严重且高度传染性的疾病，可影响可食用动物包括：牛、猪、绵羊和山羊等内偶蹄类动物。尽管死亡率非常低，但口蹄疫的传染性很强，所以生产力损失和经济影响方面成为畜牧业最严重的疾病之一。

[0004] 口蹄疫在全球多个地方流行。世界动物卫生组织(OIE)定期发布疾病分布和爆发图。由于世界动物卫生组织制定的市场限制，该组织所发布的卫生状况对肉类贸易依赖型经济的国家(特别是受口蹄疫影响的国家)产生了深远的经济影响。其他可对家畜生产力产生重大影响的病毒，包括但不限于，可导致新生牛犊腹泻的牛轮状病毒(Rotaviruses)；牛疱疹病毒-1型(Bovine Herpesviruses 1，BoHV-1或BHV-1，可导致传染性牛鼻气管炎)和牛疱疹病毒(Bovine Herpesviruses 5，BoHV-5或BHV-5，可导致牛疱疹性脑炎)；与牛呼吸道疾病综合症(Bovine respiratory disease complex，BRD)相关的牛副流感病毒-3型(Bovine Parainfluenza Virus 3，PI3或BPIV-3)及牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV)；牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhoea Virus，BVDV，可导致腹泻之外，可引起免疫抑制、流产、不孕和致命性并发症，称为粘膜病)；及可在动物和人类中引起致命的脑炎的狂犬病病毒(Rabies Virus)。

[0005] 口蹄疫病毒(Foot and Mouth disease virus,FMDV)是一种无脂质包膜的呈二十面体对称的病毒，直径大小为25-30nm，含有由约8500个核苷酸组成的单链核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分子。该核糖核酸分子包含编码结构蛋白和非结构蛋白的单个开放阅读框(open reading frame，ORF)。其蛋白质组分为结构蛋白和非结构蛋白。四种结构蛋白为：VP1，VP2，VP3和VP4。在这些蛋白质中，VP1是最广泛被研究的蛋白质，原因是其在病毒附着、保护性免疫和血清型特异性中的重要作用(Sabbir Alam,et al.Antigenic heterogeneity of capsid protein VP1 in foot-and-mouth disease virus(FMDV)serotype Asia.Advances and applications in Bioinformatics and Chemistry.2013,6:37-46)。此外，VP1是用于开发新型肽疫苗的主要蛋白质(WO1999066954A1and Peralta A.,et al.VP1 protein of Foot-and-mouth disease virus(FMDV)impairs baculovirus surface display.Virus Research.2013,175(1):87-90)。非结构蛋白质组包括的蛋白质为：2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D。这些蛋白质已被用于区分感染和接种疫苗的动物(Rodriguez A.,et al.Immunogenicity of non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus:differences between infected and vaccinated swine.Archives of
virology.1994,136(1):123-131)。

[0006] 不同血清型的FMDV已有描述，并且将每种血清型进一步分为多种毒株。这些血清型包括：O型、A型、C型、Asia型、和南非类型SAT-1型、2型和3型，其中最常见的是O型、A型及Asia型。

[0007] 尽管现正不断努力开发针对FMDV而不需要大规模扩散病原体的替代疫苗，目前的疫苗仍是基于灭活的全病毒，浓缩和纯化至临界质量的抗原以达到能够产生保护性免疫反应。制造这些疫苗的厂房需符合OIE的生物安全等级4的要求。估计每年全球生产的口蹄疫疫苗数量为25至30亿剂。

[0008] 与传统疫苗相比，肽疫苗是一种安全和经济的技术。该技术的缺点是其免疫原性差。这类型的疫苗已经进行了实验，以测试其保护动物的能力(Taboga O.,et al.A Large-Scale Evaluation of Peptide Vaccines against Foot-and-Mouth Disease:Lack of Solid Protection in Cattle and Isolation of Escape Mutants.Journal of Virology.1997,71(4):2606-2614)。实验结果显示，肽疫苗的保护率均低于50％。相反，灭活的病毒疫苗(阳性对照)通常达到90％至100％保护。因此，作为常规方案以根除和处理紧急情况的疫苗通常以灭活病毒为基础。

[0009] 肽疫苗的另一个实施例涉及使用树状聚合肽。这些肽包含：赖氨酸残基的核心、两个或更多个氨基酸分支及其N-和C-末端的T和B表位。这些树状大分子肽先被用作抗微生物肽(Tam J.,et al.Antimicrobial dendrimeric peptides.Eur.J.Biochem.2002,269:923-932)，但目前它们可用作动物疫苗接种的多抗原肽。在一个专利申请中
(EP2647390A1)，开发出比线性肽引发更高同源免疫反应的树状大分子肽。这些树状聚合肽的缺点是需要用大量的肽配制疫苗以赋予针对口蹄疫病毒的实际保护。这是使用该肽疫苗的难题，因为大规模制造该疫苗的成本很高。

[0010] 还有其他基于肽的策略用于诱导针对不同疾病的实际免疫保护。其中一个策略是使用Brucella Lumazine Synthase(BLS)技术(见EP1776456B1)，其特征在于来自布鲁杆菌属(Brucella spp.)的一种蛋白质，能够形成十聚体并具有分子辅助性质：可以将有需要的抗原(例如肽)与其N-氨基末端融合，以促进针对靶抗原的免疫应答。因此，重组BLS蛋白的十聚体能够同时融合十个肽。该技术与其它肽疫苗具有相同的缺点，即获得免疫原性保护所需的抗原剂量较高。此外，大尺寸的BLS蛋白，含有表位的相对数量非常低。因此，为了克服上述问题，有需要配制大量BLS表位的疫苗以达到必需的表位质量以获得实际保护。

[0011] 不同血清型的口蹄疫病毒分布在世界各地。一些地区有不止一种血清型和毒株会使卫生状况复杂并阻碍根除该疾病(Paton D.,et al.Options for control of foot-and-mouth disease:knowledge,capability and policy.Philosophical Transactions of the Royal Society B.2009,364:2657-2667)。由于口蹄疫在经济损失方面的重要影响，至关重要的是需要有一种疫苗可以为多种口蹄疫病毒血清型和/或毒株提供交叉保护。因此，特定地区的动物可以通过较少的疫苗接种来进行广泛的保护

[0012] 制定口蹄疫病毒疫苗的重大困难是该病毒呈现出显著的抗原多样性，特别是显示高度遗传变异的VP1蛋白(Haydon D.,et al.Characterizing sequence variation in the VP1capsid proteins of foot and mouth disease virus(serotype 0)with respect to virion structure.Journal of Molecular Evolution.1998,46(4):465-475)。高度的遗传变异导致血清型之间缺乏交叉保护。当动物接种疫苗或从一种血清型病毒中康复，仍然易受其他六种血清型病毒的感染。此外，一种血清型高度的抗原变异可能引起对一种毒株具保护性的疫苗对同一血清型中的另一毒株无效。

[0013] 有大量研究显示，使用仅基于一种特异性毒株的疫苗，当针对另一种毒株时可引致缺乏保护性反应(Mattion N.,et al.Reintroduction of foot-and-mouth disease in Argentina:Characterization of the isolates and development of tools for the control and eradication of the disease.Vaccine.2004,22:4149-4162and Maradei E.,et al.Characterization of foot-and-mouth disease virus from outbreaks in Ecuador during 2009–2010and cross-protection studies with the vaccine strain in use in the region.Vaccine.2011,29:8230-8240)。Mattion N.等人于2004年比较了毒株A/Argentina/79和A/Argentina/87之间的交叉反应性结果显示，一毒株与另一株的单克隆抗体没有反应。Maradei E.等人的保护数据显示，接种一剂单价O1/Campos疫苗的牛对厄瓜多尔46-2010病毒O型的挑战仅诱导6％的保护(一只动物受保护，15只动物未受保护)，以及对再次接种的动物诱导18％的保护(3只动物受保护，13只动物未受保护)。此外，有实验显示，使用O1Manisa接种疫苗并受O1 Campos感染的动物，只有接种高载荷的O1Manisa疫苗才能实现对O1 Campos的保护(Nagendrakumar SB,et al.Evaluation of cross-protection between O1Manisa and O1 Campos in cattle vaccinated with foot-and-mouth disease virus vaccine incorporating different payloads of inactivated O1Manisa antigen.Vaccine.2011,29(10):1906-1912)。

[0014] 为了克服缺乏交叉保护问题并考虑到目前存在的各种不同的肽，定制的肽疫苗可以帮助解决这个问题，因为定制的肽能够易于改变疫苗靶向目标。虽然肽疫苗似乎是获得交叉保护的好策略，该疫苗的免疫原性弱并在经济上不可行。此外，肽疫苗不能引起强大的细胞介导的免疫应答，这是实现完全免疫原性保护的基石(Becker Y.,et al.Need for cellular and humoral immune responses in bovines to ensure protection from foot-and-mouth disease virus(FMDV)-a point of view.Virus Genes.1994,8:199-214)。口蹄疫病毒特异性细胞介导的免疫应答取决于病毒衣壳抗原的完整性和稳定性，因此，肽疫苗不能触发实际的细胞介导的反应。此外，细胞介导的免疫应答对于针对异源毒株的交叉反应性保护是至关重要的(Bucafusco D.,et al.Foot-and-mouth disease vaccination induces cross-reactive IFN-γresponses in cattle that are dependent on the integrity of the 140S particles.Virology.2015,476:11-18)。因此，强烈建议将灭活的FMDV添加到疫苗制剂中，以引发更强的体液和细胞介导的免疫应答。

[0015] 基于上述原因，建议把灭活的口蹄疫全病毒抗原与其他疫苗技术组合，以利用灭活的抗原诱导强的细胞免疫应答的能力，并且使用新颖的疫苗技术，通过引发强而广泛的抗体反应来实现广泛的交叉保护和特异性。这种针对口蹄疫的新型及广效型的疫苗可有效在全球范围内应付口蹄疫病毒大流行并作为有用的工具，为所有血清型和不同品种的口蹄疫病毒提供全面的保护，并为未满足的市场和技术需求提供解决方案。在新技术中，基于肽疫苗的多靶标能力，肽抗原可与灭活抗原组合使用。

[0016] 如今，制备药物和生物制药产品的过程必须严格遵守生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice,GMP)的标准。符合该要求可确保高标准的产品质量和可靠性。

[0017] 本发明首次开发一个可符合GMP要求以制备各种疫苗的平台。在一个实施例中，提供了灭活病毒与至少一种以下成分的组合，包括：在不同类型质粒内编码病毒肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重组肽、多肽或蛋白质；病毒样颗粒；蛋白质作为载体或分子佐剂，与衍生自一种或多种病毒的肽、多肽或蛋白质融合；佐剂；乳化剂，分子佐剂和载体体系。本发明可开发用于保护动物免受一种或多种病毒性疾病的广效型疫苗。发明概述

[0018] 在一个实施例中，本发明提供制备广效型疫苗制剂的详细程序，能够诱导针对广泛的血清型或病毒株的交叉保护(包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒)。

[0019] 在一个实施例中，本发明提供一种或多种包含一种或多种灭活病毒的制剂，包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒，并含有不同剂量的不同组分。该制剂由全灭活的病毒及以下一种或多种成分组成：在不同类型质粒内编码病毒肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重组肽、多肽或蛋白质；病毒样颗粒；蛋白质作为载体或分子佐剂，与衍生自一种或多种病毒的肽、多肽或蛋白质融合；佐剂；乳化剂，分子佐剂和载体体系。

[0020] 在一个实施例中，本发明公开披露一种能够诱导针对不同血清型或病毒株的交叉保护的疫苗制剂，其中该疫苗制剂包含全灭活病毒和至少一种以下成分：(a)编码该病毒的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；(b)该病毒的人工肽或多肽；(c)该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；(d)该病毒的病毒样颗粒；(e)粒衍生自其他病毒的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒展示该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；及(f)肽、多肽或蛋白质作为载体或分子佐剂，其中该肽、多肽或蛋白质会或不会与任何(b)至(e)的成分融合。在一个实施例中，该病毒包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒。

[0021] 在一个实施例中，本发明提供包含不同剂量的各种组分及具有全灭活口蹄疫病毒的不同制剂。其中该制剂包含全灭活口蹄疫病毒和至少一种以下成分：在不同类型质粒中编码口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；口蹄疫病毒的人工肽或多肽；口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；口蹄疫病毒样颗粒；衍生自其他病毒的病毒样颗粒，该病毒样颗粒展示口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；蛋白质作为载体或分子佐剂与衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白质融合；佐剂；乳化剂、分子佐剂和载体体系。

[0022] 本发明提供的药物组合，用于诱导针对宿主中的一种或多种病毒性疾病的一种或多种免疫反应和/或用于增强宿主中疫苗接种的有效性，该药物组合包含：(a)本发明所述的一种或多种能够在宿主中引发免疫应答的疫苗制剂；及(b)一种或多种增强宿主免疫应答的分子佐剂，可增强宿主的免疫反应，其中病毒疫苗和分子佐剂可以单独或同时施用。

[0023] 本发明提供一种对易受口蹄疫病毒感染的宿主接种疫苗的方法，包含向宿主施用一种或多种如本发明所述的之疫苗制剂以诱导免疫反应，其中该疫苗制剂及分子佐剂可以同时或不同时施用。

[0024] 在一个实施例中，包含本发明的一种或多种疫苗制剂的药物组合能够通过诱导细胞介导和体液成分的免疫反应确保对一种或多种病毒提高保护性，其中该病毒例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0025] 在一个实施例中，包含本发明的一种或多种疫苗制剂的药物组合能够通过诱导细胞介导和体液成分的免疫反应确保提高对口蹄疫病毒保护性。

[0026] 在一个实施例中，本发明的药物组合可以在偶蹄动物如牛、绵羊、山羊或猪诱导针对一种或多种病毒感染的免疫应答，该病毒例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0027] 在一个实施例中，本发明包含一种或多种疫苗制剂的药物组合可以使用较少疫苗接种活动产生免疫原性交叉保护作用。

[0028] 在一个实施例中，本发明提供一种包含广效型疫苗的药物组合并能符合GMP标准。附图说明

[0029] 图1及图2所示的是牛的临床试验中获得的血清学结果，基于与不同口蹄疫病毒肽表位融合的BLS载体蛋白比较不同药物组合的疫苗制剂。测试中的不同疫苗制剂是重组BLS蛋白与口蹄疫病毒肽表位或编码不同BLS-FMDV表位的裸质粒DNA融合。实验疫苗在研究的第0天和第30天使用初次/加强方案进行。在接种疫苗后不同时间检测血清反应(DPV：Day Post Vaccination，接种疫苗后天数)：30DPV、60DPV、90DPV和105DPV。序列BLS-I(DNA)(SEQ ID NO.56)、BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)、and BLS-I(SEQ ID NO.57)如表2所示。BLS-I(DNA)/BLS-I：含多核苷酸“BLS-I(DNA)”(SEQ ID NO.56)及融合蛋白BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗制剂的药物组合；BLS-I(DNA)/BLS-D+BLS-A1+BLS-I：含多核苷酸BLS-I(DNA)(SEQ ID NO.56)及融合蛋白BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)及BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗制剂的药物组合；BLS-I/BLS-I：只含融合蛋白BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗制剂的药物组合；BLS-D+BLS-A1+BLS-I/BLS-D+BLS-A1+BLS-I：含融合蛋白BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)及BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗制剂的药物组合。疫苗制剂D、E、F及G如表3所示，动物的疫苗接种方案如表4所示。灭活的四价病毒疫苗(O1 Campos,A2001,C3 Indaial and A24 Cruzeiro)作阳性对照(+)。进行竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量所获得的血清学反应中存在的O1 Campos抗体滴度。抗体滴度表示为血清稀释度的倒数log10，给予对照(没有血清的病毒)孔中记录的吸光度的50％。

[0030] 图3所示的是针对不同疫苗和免疫策略中获得的攻毒测试的结果。感染结果分析在7DPI(Day Post Infection、DPI、感染后天数)进行。疫苗制剂和免疫策略的不同药物组合与图1所述的相同。灭活的四价病毒疫苗(O1 Campos,A2001,C3 Indaial and A24 Cruzeiro)作阳性对照(+)。T：舌；RFM：右前方位置；LFM：左前方位置；RHM：右后方位置；LHM：左后方位置。符号“+”是指动物的该位置受FMDV感染后出现症状。符号“–”是指动物的该位置受FMDV感染后没有出现症状。因为舌头是接种部位，所以不考虑对该部位进行分析。当该位置(RFM、LFM、RHM和LHM)没有显示任何症状时，动物被定义为“受保护”。

[0031] 图4及图5所示的是O1 Campos毒株特异性血清学检测结果，在交叉保护的临床检测中使用不同疫苗制剂的药物组合进行比较。实验疫苗均在第0天施用。测试中使用的疫苗制剂的不同药物组合是：(1)BLS-I(SEQ ID NO.57)应用于动物的左侧和应用于动物的右侧的灭活的口蹄疫病毒血清型A2001型全病毒(疫苗制剂A和B)；(2)灭活的FMDV血清型A2001型全病毒：阴性对照(–)(疫苗制剂B)；(3)灭活的口蹄疫病毒血清型O1 Campos型全病毒：阳性对照(+)(疫苗制剂C)；(4)动物未接种疫苗。进行竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量所获得的血清学反应中存在的O1 Campos抗体滴度。y轴上的抗体滴度表示为在对照孔(无血清病毒)中记录的50％吸光度的血清稀释度的倒数log10。在接种后29和58天测量血清学反应。

[0032] 图6及图7所示的是在牛的临床试验中获得的A2001毒株特异性血清学检测结果，对疫苗制剂的不同药物组合进行比较。在不同时间测定血清学反应：63DPV和98DPV。O1 Campos灭活病毒疫苗：O1 Campos全灭活病毒颗粒(阴性对照)。A2001灭活病毒疫苗：A2001全灭活病毒颗粒(阳性对照)。BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)的序列如表2所示。第1组：(BLS-I_A2001+O1 Campos灭活病毒疫苗):包含两种不同的疫苗配方，第一种含有融合蛋白BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)及第二种含有O1 Campos全灭活病毒颗粒，应用于动物两侧。疫苗制剂H、I和J如表7所示。阴性对照(–)：O1 Campos全灭活病毒颗粒。阳性对照(+)：A2001全灭活病毒颗粒。抗体滴度表示为血清稀释度的倒数log10，给予对照(没有血清的病毒)孔中记录的吸光度的50％。

[0033] 图8及图9所示的是接种不同药物组合的疫苗制剂后使用高病原性A2001口蹄疫病毒攻毒检测的测试结果。感染结果分析在7DPI进行。阴性对照(–)：O1 Campos全灭活病毒颗粒。阳性对照(+)：A2001全灭活病毒颗粒。T：舌；RFM：右前方位置；LFM：左前方位置；RHM：右后方位置；LHM：左后方位置。符号“+”是指动物的该位置受口蹄疫病毒感染后出现症状。符号“–”是指动物的该位置受口蹄疫病毒感染后没有出现症状。因为舌头是接种部位，所以不考虑对该部位进行分析。当该位置(RFM、LFM、RHM和LHM)没有显示任何症状时，动物被定义为“受保护”。在y轴上的值表示为在针对口蹄疫病毒O1 Campos型攻毒的总动物数量中受保护动物数量的百分比。

[0034] 图10及图11所示的是A2001毒株特异性血清学在牛临床试验中获得的结果，并比较不同药物组合的疫苗制剂和免疫方案。实验疫苗均在第0天施用。在疫苗接种后不同时间测定血清学反应：31DPV和63DPV。O1 Campos灭活病毒疫苗：O1 Campos全灭活病毒颗粒(阴性对照)。A2001灭活病毒疫苗：A2001全灭活病毒颗粒(阳性对照)。序列BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)如表2所示。BLS-I_A2001+O1 Campos灭活病毒疫苗:含O1 Campos全灭活病毒颗粒及融合蛋白BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)的疫苗制剂。疫苗制剂K、L和M如表10所示。阴性对照(–)：O1 Campos全灭活病毒颗粒。阳性对照(+)：A2001全灭活病毒颗粒。抗体滴度表示为血清稀释度的倒数log10，给予对照(没有血清的病毒)孔中记录的吸光度的50％。

发明内容

[0035] 本发明的方法涉及制备一种或多种高质量的病毒疫苗的过程，该病毒例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及狂犬病病毒等。

[0036] 在一个实施例中，本发明的方法制定针对一种或多种病毒的血清型和/或毒株的广效型疫苗，例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等，以仅一次疫苗接种获得交叉保护。

[0037] 在一个实施例中，本发明提供了免疫原性组分以配制不同的疫苗，以确保针对所有或不同的病毒血清型或毒株的交叉保护，例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0038] 在一个实施例中，本发明提供了免疫原性组分以配制不同的疫苗，以确保针对不同口蹄疫病毒血清型和/或毒株的总体或交叉保护。结合使用全灭活的口蹄疫病毒与一种或多种免疫原性组分可以确保了细胞和体液成分的免疫应答的高度保护。

[0039] 在一个实施例中，本发明的广效型疫苗可以特异性诱导针对存在于特定地区的病毒的全部或不同血清型和/或毒株的一种或多种靶向免疫应答(该病毒如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等)。

[0040] 在一个实施例中，本发明的制剂由灭活的病毒及以下一种或多种成分组成：在不同类型质粒中编码病毒肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重组肽、多肽或蛋白质；病毒样颗粒；衍生自其他病毒的病毒样颗粒；蛋白质作为载体或分子佐剂，与衍生自一种或多种病毒的肽、多肽或蛋白质融合；佐剂；乳化剂、分子佐剂和载体体系。该病毒包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒。

[0041] 在一个实施例中，本发明的制剂包含全灭活口蹄疫病毒和至少一种以下成分：在不同类型质粒中编码一个或多个口蹄疫病毒的多核苷酸序列；口蹄疫病毒的人工肽或多肽；口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；口蹄疫病毒样颗粒；衍生自其他病毒的病毒样颗粒展示口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；蛋白质作为载体或分子佐剂，与衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质融合；佐剂；乳化剂、分子佐剂和载体体系。在不同类型质粒中编码病毒肽、多肽或蛋白质的多核苷酸

[0042] 本领域普通技术人员将容易理解到，本发明可以使用来自各种病毒(例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等)的多核苷酸的组合。

[0043] 本发明也可以组合使用口蹄疫病毒不同的多核苷酸。在一个实施例中，广效型疫苗包含一个或多个多核苷酸，用以编码全部、部分或变异的口蹄疫病毒蛋白质，例如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；或非结构蛋白例如2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或编码一个或多个氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)的多核苷酸序列，或其部分、变异、同源或功能类似物的肽的多核苷酸序列。上述多核苷酸序列可以克隆在本领域已知的能够在真核细胞环境中表达上述序列的任何表达载体中。合适的表达载体也可以通过本领域通常已知的重组技术的技术构建。具有编码口蹄疫病毒表位的序列的表达载体的实例包括但不限于：pcDNA3.1/P1–2A3C3D、含编码病毒结构蛋白前体序列的质粒P1-2A(VP0、VP1或VP3)及非结构蛋白3C和3D(Cedillo-Barron L.,et al.Induction of a protective response in swine vaccinated with DNA encoding foot-and-mouth disease virus empty capsid proteins and the 3D polymerase.Journal of General Virology.2001,82:1713-
1724)；和由于在小鼠和猪克隆VP1的DNA序列而赋予口蹄疫病毒保护作用的质粒pCEIM和pCEIS(Wong HT.,et al.Plasmids Encoding Foot-and-Mouth Disease Virus
VP1Epitopes Elicited Immune Responses in Mice and Swine and Protected Swine against Viral Infection.Virology.2000,278:27-35)。
病毒的肽、多肽或蛋白质(重组或人工)

[0044] 本领域普通技术人员将容易理解到，本发明可以组合使用衍生自病毒(例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等)不同的重组或合成肽、多肽和/或蛋白质。

[0045] 在一个实施例中，本发明的组合物包含不同的衍生自口蹄疫病毒的氨基酸序列的组合。例如，一个或多个衍生自口蹄疫病毒的氨基酸序列，可以编码全部、部分或变异的口蹄疫病毒衣壳蛋白序列例如VP1、VP2、VP3和VP4；或非结构蛋白例如2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D。在另一个实施例中，氨基酸序列可以选自SEQ ID NO.1-55(表1)的肽，或其部分、变异、同源或功能类似物的肽。衍生自口蹄疫病毒的合适多肽的实例包括但不限于，一种或多种构建自口蹄疫病毒VP1的GH环和来自麻疹病毒(UBITh1)并混杂人造Th位点的全部、部分或变异的天然、合成或重组的肽、多肽或蛋白质，可以于保护猪只不受O1台湾型口蹄疫病毒感染。(Wang CY.,et al.Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine.Vaccine.2002,20:2603-2610)；天然、合成或重组的肽、多肽和蛋白质衍生自全部、部分或变异的口蹄疫病毒毒株A/HuBWH/CHA/2009的免疫原性表位VP1(129-169)、3A(21-35)和3D(346-370)蛋白质，可有效地在牛和豚鼠中引发产生针对血清型A的病毒中和抗体(Zhang Z.,et al.Efficacy of synthetic peptide candidate vaccines against serotype-A foot-and-mouth disease virus in cattle.Applied
Microbiology and Biotechnology.2015,99(3):1389-1398)。在一个实施例中，多肽选自天然、合成或重组的肽或多肽衍生自全部、部分或变异的GH环的高可变区域，其长度可以根据毒株变化，但通常包含口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的氨基酸135至160。VP1蛋白的GH环的高可变区域包含主要表位，并且是口蹄疫病毒毒株之间的系统多样性的主要位点之一，因为其代表了在免疫系统的压力下口蹄疫病毒分歧毒株的逃避机制。事实上，由宿主针对一个毒株的高可变区域产生的抗体是针对该特异毒株的中和抗体，但不会中和另一种口蹄疫病毒分歧毒株。因此，不同序列的同源性百分比是高度可变的。因此，本领域技术人员可以容易地理解，衍生自GH环并且被认为可用于本发明的肽和多肽是功能类似物，并且与GH环肽的氨基酸序列SEQ ID NO.9-18(表1)的同源性可低至10％。在另一个实施例中，多肽包含(i)衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的GH环高可变区域(氨基酸135-
160)的天然、合成或重组肽或多肽，和(ii)包含RGD基序(3个氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列(Berinstein A.,et al.Antibodies to the vitronectin receptor(integrin alpha V beta 3)inhibit binding and infection of foot-and-mouth disease virus to cultured cells..Journal of Virology.1995,69(4):2664-2666)。
病毒样颗粒

[0046] 本领域普通技术人员将容易理解到，本发明使用的一种或多种病毒样颗粒源自病毒，例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0047] 在一个实施例中，本发明使用口蹄疫病毒样颗粒。构建、克隆和表达口蹄疫病毒样颗粒可以通过本领域通常已知的重组技术完成。在一个实施例中，病毒样颗粒完全由口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP1和VP3组成，其通过重组技术表达并自发组装成不掺入病毒基因组的颗粒。在另一个实施例中，口蹄疫病毒衣壳蛋白是变异的。上述病毒样颗粒是非复制型和非传染性疫苗，能够模拟天然病毒的表位呈现。病毒样颗粒技术作为口蹄疫病毒疫苗已进行测试，在豚鼠、猪和牛中获得了有效的保护性免疫应答。(Guo HC.,et al.Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs,swine and cattle.Veterinary Research.2013,44:48；and Terhuja M.,et al.Comparative efficacy of virus like particle(VLP)vaccine of foot-and-mouth-disease virus(FMDV)type O adjuvanted with poly I:C or CpG in guinea
pigs.Biologicals.2015,43(6):437-443)。此外，通过将突变的3C蛋白酶和多肽(P1-2A)拼接在一起，可提高结构蛋白的产量，而所获得的病毒样颗粒能够引发体液和细胞介导的免疫应答(Bhat S.,et al.Novel immunogenic baculovirus expressed virus-like particles of foot-and-mouth disease(FMD)virus protect guinea pigs against challenge.Research in Veterinary Science.2013,95(3):1217-1223)。

[0048] 在另一个实施例中，本发明包括使用具有非口蹄疫病毒骨架的病毒样颗粒，但能够在其表面上呈现口蹄疫病毒重组抗原。这项技术的一个例子是“Metavax”技术，被描述为重组免疫原性肽或大型蛋白质的载体(US 7678374)。由于其形成融合蛋白的病毒样颗粒的工程具有灵活性和多功能性，Metavax技术是表达口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白质的合适方案。肽、多肽或蛋白质作为载体与具有病毒表位的肽、多肽或蛋白质融合

[0049] 在一个实施例中，本发明的肽、多肽或蛋白质可以作为载体与具有病毒表位的肽、多肽或蛋白质融合，该病毒如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0050] 在一个实施例中，本发明的肽、多肽或蛋白质可以作为载体与具有口蹄疫病毒表位的肽、多肽或蛋白质融合。现有的技术公开了口蹄疫病毒表位可以是VP1蛋白的全部、部分或变异的序列：血清型O1Kaufbeuren(O1K)的氨基酸残基144-159(Pfaff E.,et al.Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus.The EMBO Journal.1982,1(7):869-874)；血清型O1K的氨基酸残基25-41和200-213(Bittle J.,et al.Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence.Nature.1982,298:30-33)；O/UKG/35/2001的氨基酸残基66-80(Gerner W.,et al.Identification of a novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitope with immunodominant characteristics in cattle with MHC serotype A31.2007.Vet.Res.38:565-572)；血清型Asia-1的氨基酸残基1-12、17-29及194-211(Zhang ZW.,et al.Screening and identification of B cell epitopes of structural proteins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1.Veterinary Microbiology.2010,140(1-2):25-33)；毒株AF/72的氨基酸残基106-115和4-13(Liu X-S.,et al.Identification of H-2d Restricted T Cell Epitope of Foot-and-mouth Disease Virus Structural Protein VP1.Virology Journal.2011,8:426)。在一个实施例中，该肽或多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的天然、合成或重组的肽或多肽。例如，该肽是表1所示的SEQ ID NO.1-21序列衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白，及其变异或功能类似物。VP1蛋白的高可变区域(氨基酸135-160)是口蹄疫病毒毒株间产生多样性的主要位点之一。VP1蛋白的G-H环高可变区域的同源性百分比高度可变。在另一个实施例中，该多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的GH环高可变区域(氨基酸135-
160)的天然、合成或重组肽或多肽和包含RGD基序(3个氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。
此外，源自口蹄疫病毒表位的肽可以是其它衣壳蛋白的全部、部分或变异的序列，例如血清型Asia-1的VP2(氨基酸残基40-50)、VP3(氨基酸残基26-39)和VP4(氨基酸残基30-41)(Zhang ZW.,et al.Screening and identification of B cell epitopes of structural proteins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1.Veterinary Microbiology.2010,140(1-2):25-33)。此外，源自口蹄疫病毒表位的肽可以是非结构蛋白的全部、部分或变异的序列，例如来自血清型O1K的2B(PFFFSDVRSNSFKLV(SEQ ID NO.28)、FFRSTPEDLERAEK(SEQ ID NO.29))、2C(LKARDINDIFAILKN(SEQ ID NO.30)、SEEKFVTMTDLVPG(SEQ ID NO.31))、3B(ERTLPGQKACDDVN(SEQ ID NO.35)、GPYAGPLETQKPLK(SEQ ID NO.36)、PLERQKPLKVRAKL(SEQ ID NO.37)、GPYAGPMERQKPLK(SEQ ID NO.38)、PMERQKPLKVKAKA(SEQ ID NO.39)、QKPLKVKAKAPVVK(SEQ ID NO.40))( BJ.,et al.Identification of Foot-and-Mouth Disease Virus-Specific Linear B-Cell Epitopes To Differentiate between Infected and Vaccinated Cattle.Journal of Virology.2003,Aug.:8633-
8639)；毒株O1K的蛋白3A(氨基酸残基11-25和21-35)、3C(氨基酸残基121-135和166-180)(Blanco E.et al.Identification of T-Cell Epitopes in Nonstructural Proteins of Foot-and-Mouth Disease Virus.Journal of Virology.2001.April:3164-3174)；及毒株C-S8的蛋白3D(氨基酸残基301-315、326-340、346-360、351-365、356-370和406-420)(Gerner W.,et al.Identification of novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine.Virus Research.2006,121(2):223-228)。

[0051] 在另一个实施例中，具有口蹄疫病毒表位的肽的实例如表1所示(SEQ ID NO.1-55)。本发明还包括表1的肽的同源序列或功能类似物的肽。在另一个实施例中，该口蹄疫病毒表位的肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的GH环高可变区域(氨基酸135-160)的天然、合成或重组肽或多肽，和包含RGD基序(3个氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。

[0052] 本发明的肽、多肽或蛋白载体能够呈现口蹄疫病毒的免疫原性表位。在一个实施例中，该载体可以增强免疫原性应答。在一个实施例中，该载体可以是猪免疫球蛋白G重链恒定区，与重复多表位基因融合，其包含三个部分对应于口蹄疫病毒毒株O/China/99的VP1蛋白氨基酸残基141-160和200-213的免疫原中(Shao J-J.,et al.Promising Multiple-Epitope Recombinant Vaccine against Foot-and-Mouth Disease Virus Type O in Swine.Clinical and Vaccine Immunology.2011,18(1):143-149)。另一个实例中，可以使用VP1和牛IFN-γ的序列设计的融合蛋白，被证明是体液和细胞介导反应的诱导物(Shi X-J.,et al.Expressions of Bovine IFN-γand Foot-and-Mouth Disease VP1 antigen in P.pastoris and their effects on mouse immune response to FMD antigens.Vaccine.2006,82-89)。本领域普通技术人员将容易理解和/或构建适用于本发明的肽或多肽载体。
灭活病毒

[0053] 本发明可以使用灭活病毒的任何毒株和/或血清型，该病毒例如口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。

[0054] 本发明可以使用任何类型的灭活口蹄疫病毒，包括但不仅限于，毒株O1 Campos、C3 Indaial、A24 Cruzeiro和A2001，或口蹄疫病毒的血清型如O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3或ASIA1。本发明的疫苗可以包括一种或多种不同毒株和/或不同血清型的病毒。可用于本发明制剂中的毒株将取决于预期疫苗接种区域中的主要毒株。在一个实施例中，在疫苗中配制的毒株可以是PanAisa毒株血清型O型，其与亚洲爆发性的流行病有关，并从1998年至2001年延伸至非洲和欧洲地区(Knowles N.,et al.Pandemic Strain of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O.Emerging Infectious Diseases.2005,11(12):
1887-1893)。其它毒株包括但不限于，O–Manisa、O-PanAsia-2(或等同物)、O-BFS或Campos、A24 Cruzeiro、Asia 1Shamir、A Iran-05(或A TUR 06)、A22Iraq、SAT 2Saudi Arabia(或等同物，即SAT 2Eritrea)、A Eritrea、SAT 2Zimbabwe、SAT 1South Africa、A Malaysia
97(或等同物，即A/NPT/TAI/86)、A Argentina 2001(A2001)、O Taiwan 97(猪适应毒株或菲律宾等同物)、A Iran'96、A Iran'99、A Iran 87或A Saudi Arabia 23/86(或等同物)、A15Bangkok related strain、A87Argentina相关毒株、C Noville、SAT 2Kenya、SAT
1Kenya、SAT3Zimbabwe以及将来根据粮农组织世界口蹄疫参考实验室可能出现的其他毒株。灭活过程可以使用本领域中已知的技术，例如加入氯仿和二元乙烯亚胺(BEI)两次。此外，可以使用溶剂和/或洗涤剂和/或其它蛋白质变性剂灭活病毒颗粒。在另一个实施例中，可以通过其基因组中的遗传变化灭活病毒颗粒或减毒。(Rieder E.,et al.Vaccines Prepared from Chimeras of Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)Induce
Neutralizing Antibodies and Protective Immunity to Multiple Serotypes of FMDV.Journal of Virology.1994,68(11):7092-7098)。
佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体体系

[0055] 本发明可以使用不同类型的佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体体系。在一个实施例中，本发明的制剂包括但不限于，铝盐、氢氧化铝凝胶、皂苷或衍生物如QS21、淋巴细胞因子、CpG、聚肌胞(poly I:C)、Toll样受体激动剂、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质体、不完全弗氏佐剂、脂质体、硬脂酸酪氨酸酯、角鲨烯、L121、Emulsigen、单磷醯酰脂质A、Montanide ISA佐剂(ISA 15VG、ISA 25VG、ISA 28 VG、ISA 35VG、ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 207VG、ISA 50V2、ISA 50V4、ISA 61VG、ISA 70、ISA 71VG、ISA 71R VG、ISA 720、ISA 760、ISA 761VG、ISA 763A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐剂(IMS 251C、IMS 1312VG、IMS
1313VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、轻质矿物油、代谢油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯
85、聚山梨醇酯120、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯和其他有效的佐剂和乳化剂。在另一个实施例中，疫苗制剂是乳液，如油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液或水包油包水(W/O/W)乳液或油包水包油(O/W/O)乳液。在另一个实施例中，疫苗制剂包含乳液和一种或多种其他佐剂的混合物。可用于该疫苗制剂中的载体体系的其它实例，例如本领域中已知的可导致TH1或TH2应答的脂质体(Badiee A.,et al.The role of liposome size on the type of immune response induced in BALB/c mice against leishmaniasis:rgp63as a model antigen.Experimental Parasitology.2011,132(4):
403-409)、微/纳米球、纳米颗粒如聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和多糖(Akagi T.,et al.Biodegradable Nanoparticles as Vaccine Adjuvants and Delivery Systems:
Regulation of Immune Responses by Nanoparticle-Based
Vaccine.Adv.Polym.Sci.2012,247:31–64)、树状聚合物(Sheng KC.,et al.Delivery of antigen using a novel mannosylated dendrimer potentiates immunogenicity in vitro and in vivo.European Journal of Immunology.2008,38(2):424-436)、胶束体系、金纳米粒子(Dykman L.,et al.Use of a synthetic foot-and-mouth disease virus peptide conjugated to gold nanoparticles for enhancing immunological response.Gold Bull.2015,48:93-101)和免疫刺激复合物(ISCOMs)。

[0056] 在一个实施例中，本发明的广效型疫苗可以通过注射器注射、无针注射、微针补片和递送来施用。药物组合可以通过不同途径施用，例如口服、肌内、皮下、皮内、鼻内喷雾。

[0057] 在一个实施例中，本发明的药物组合含有衍生自口蹄疫病毒衣壳蛋白的抗原表位。该抗原表位可以衍生自，例如，A型、O型和C型的血清型；African SAT1、SAT2和SAT3血清型；和Asia-1血清型。在一个实施例中，抗原表位衍生自口蹄疫病毒的VP1蛋白。载体系统-蛋白质或树枝状聚合肽作为载体或分子佐剂

[0058] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂可以使用蛋白质或树状聚合肽作为外来肽、多肽和/或蛋白质的载体。在一个实施例中，可以使用BLS蛋白作载体或分子佐剂，把免疫应答重定向至特定毒株或血清型。在另一个实施例中，BLS蛋白的N-氨基末端与外来肽、多肽和/或蛋白质融合。

[0059] 在一个实施例中，外来肽、多肽和/或蛋白质包含病毒的表位，该病毒包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒。在一个实施例中，该BLS蛋白与来自衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，或病毒的非结构蛋白质的全部、部分或变异的病毒肽、多肽或蛋白质融合，包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒等。在一个实施例中，该融合蛋白可诱导宿主中一种或多种病毒的免疫应答。

[0060] 在另一个实施例中，外来肽、多肽和/或蛋白质包含口蹄疫病毒表位。在一个实施例中，外源肽、多肽和/或蛋白质与蛋白质载体和BLS佐剂融合以引发更强的免疫应答。在一个实施例中，BLS或其变异的BLS与来自衣壳蛋白的VP1、VP2、VP3和VP4，或非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的全部、部分或变异的口蹄疫病毒肽，多肽或蛋白质融合。在一个实施例中，BLS或其变异的BLS与一种或多种口蹄疫病毒肽或其变异或同源物如表1所示的序列(SEQ ID NO.1-55)融合。在另一个实施例中，BLS或其变异的BLS与一种或多种如表1所示的肽的同源或功能类似物的肽序列融合。在一个实施例中，BLS或其变异的BLS与衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的GH环高可变区域(氨基酸135-160)的天然、合成或重组肽或多肽，和包含RGD基序(3个氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列融合。在另一个实施例中，BLS或其变异的蛋白质与蛋白质、多肽和肽融合，并以肽或多肽作为接头。在一个实施例中，本发明的融合蛋白可诱导宿主中口蹄疫病毒的免疫反应。在一个实施例中，本发明的疫苗制剂还包含一种或多种灭活的口蹄疫病毒。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂还包含一种或多种质粒DNA。在一个实施例中，本发明的质粒DNA可以编码BLS与源自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白质融合的蛋白。在一个实施例中，BLS或其变异的BLS可以用作分子佐剂而没有与任何口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白质融合。

[0061] 在一个实施例中，本发明的广效型疫苗可以使用线性肽表位串联配制。在另一个实施例中，可以结合使用T表位和B表位的组合(Blanco E.et al.Identification of T-Cell Epitopes in Nonstructural Proteins of Foot-and-Mouth Disease Virus.Journal of Virology.2001.April:3164-3174)。

[0062] 在一个实施例中，在广效型疫苗的制剂中，用于呈现免疫原性抗原的多肽可以采用不同配置的树状聚合肽。例如，树状聚合肽可以配置成含有一种或多种衍生自口蹄疫病毒表位的肽(Blanco E.,et al.B Epitope Multiplicity and B/T Epitope Orientation Influence Immunogenicity of Foot-and-Mouth Disease Peptide Vaccines.Clinical and Developmental Inmunology.2013,Article ID 475960and Cubillos C.Enhanced Mucosal Immunoglobulin A Response and Solid Protection against Foot-and-Mouth Disease Virus Challenge Induced by a Novel Dendrimeric Peptide.Journal of Virology.2008,July:7223-7230)。有其他实例描述了树状聚合肽(MonsóM.,et al.Influence of configuration chemistry and B Epitope Orientation on the Immune Response of Branched Peptide Antigens.Bioconjugate Chemistry:24(4),578-585,2013)。呈现在树状聚合肽上的口蹄疫病毒表位可以是相同表位或不同表位，以针对口蹄疫病毒的不同毒株和/或血清型提供保护。

[0063] 在另一个实施例中，可以通过仅融合口蹄疫病毒免疫原性肽来构建树状聚合肽。

[0064] 在一个实施例中，广效型疫苗制剂包含一种或多种BLS嵌合蛋白，携带来自不同类型的口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白质，以便对不同类型的口蹄疫病毒提供保护。

[0065] 在另一个实施例中，源自口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白质可以与BLS蛋白质融合，以便对不同类型的口蹄疫病毒提供保护。

[0066] 在一个实施例中，与BLS蛋白质融合的一种或多种源自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白质可以衍生自口蹄疫病毒的B表位和/或T表位。

[0067] 在一个实施例中，选择与BLS蛋白质融合的源自口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白质的标准取决于需要保护的口蹄疫病毒的类型。本发明能够针对一种特定毒株、针对相同血清型的不同毒株或针对不同的血清型设计疫苗。为了针对一种特定的毒株提供保护，建议可以组合使用衍生自该毒株的B表位和T表位的肽，以提高保护效果(Blanco E.,et al.B Epitope Multiplicity and B/T Epitope Orientation Influence Immunogenicity of Foot-and-Mouth Disease Peptide Vaccines.Clinical and Developmental Inmunology:Article ID 475960,2013)。为了对多于一种毒株提供保护，建议可以组合使用衍生自不同毒株的表位的肽(Cao Y.,et al.Evaluation of cross-protection against three topotypes of serotype O foot-and-mouth disease virus in pigs vaccinated with multi-epitope protein vaccine incorporated with poly(I:C).Veterinary Microbiology.2014,168(2-4):294-301)，并建议同时选择衍生自口蹄疫病毒的B表位和T表位的肽。为了对多于一种血清型提供保护，建议可以组合使用衍生自不同血清型的表位的肽，并建议同时选择衍生自口蹄疫病毒的B表位和T表位的肽。

[0068] 在一个实施例中，具有口蹄疫病毒表位的肽的实施例，包括但不限于，表1所示的肽。本领域普通技术人员将容易理解到，本发明不限于表1所述的肽；本发明包括表1所述的肽以及其变异、同源序列和/或功能类似物。表1、来自不同口蹄疫病毒毒株的肽序列
表2.多核苷酸和载体系统的序列

[0069] 在一个实施例中，本发明的广效型疫苗可以在没有多核苷酸序列的情况下使用。

[0070] 在一个实施例中，本发明的方法根据GMP标准开发，以确保疫苗的质量和纯度。在许多情况下，符合GMP标准是输出产品的必要条件。

[0071] 在一个实施例中，本发明适用于OIE协议紧急疫苗方案，以对抗口蹄疫病毒的新毒株的爆发。实现上述方案的准则是该疫苗需在单次给药后能够为动物提供足够的保护，以防止动物受口蹄疫病毒感染。

[0072] 在一个实施例中，本发明适用于产生抗原库，可以在紧急情况下使用，以制备FMDV口蹄疫病毒的广效型疫苗。

[0073] 在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂可以多次给药。

[0074] 在一个实施例中，本发明提供一种能够诱导针对口蹄疫病毒不同血清型或病毒株的交叉保护的疫苗制剂，其中该疫苗制剂包含全灭活口蹄疫病毒和至少一种以下成分：(a)在不同类型质粒中编码口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；(b)口蹄疫病毒的人工肽或多肽；(c)口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；(d)口蹄疫病毒样颗粒；(e)衍生自其他病毒的病毒样颗粒，该病毒样颗粒展示口蹄疫病毒的重组肽、多肽或蛋白质；(f)蛋白质作为载体或分子佐剂与衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白质融合；(g)佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体体系。

[0075] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂能够针对口蹄疫病毒特定血清型的所有毒株。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂能够针对该病毒的一种或多种血清型的所有毒株，诱导保护性免疫，该血清型包含O、A、C、Asia 1、SAT-1、SAT-2和SAT-3。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂能够针对口蹄疫病毒的所有血清型的所有毒株，诱导保护性免疫。

[0076] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含一种或多种编码口蹄疫病毒蛋白质的全部、部分或变异氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列衍生自口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)及其变异序列。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含编码表1同源的肽的多核苷酸序列。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含编码表1功能类似物的肽的多核苷酸序列。

[0077] 在一个实施例中，本发明含有口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质的疫苗制剂包含一种或多种口蹄疫病毒蛋白质的全部、部分或变异的序列，例如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55。在另一个实施例中，该肽或多肽包含表1的肽的同源或功能类似物的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的口蹄疫病毒多肽是人工或重组肽或多肽衍生自(i)口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的GH环高可变区域(氨基酸135-160)的天然、合成或重组肽或多肽，和(ii)包含RGD基序(3个氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。在一个实施例中，口蹄疫病毒多肽是线性肽。在另一个实施例中，本发明的口蹄疫病毒多肽是具有不同构型的树状聚合肽，包括但不限于任意超分枝型、接枝型、树枝状聚合物、树枝状高分子。在一个实施例中，通过仅融合口蹄疫病毒免疫原性肽构建树状聚合肽。

[0078] 在一个实施例中，本发明含有灭活口蹄疫病毒的疫苗制剂包含源自任何血清型或毒株的口蹄疫病毒。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含一种或多种源自不同血清型或毒株的口蹄疫病毒。

[0079] 在一个实施例中，本发明含有口蹄疫病毒样颗粒的疫苗制剂包含一种或多种天然或突变形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白质。在一个实施例中，该突变形式的VP0、VP1和VP3蛋白质能形成完整的空衣壳蛋白。

[0080] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含衍生自其他病毒的病毒样颗粒与一种或多种衍生自全部、部分或变异的口蹄疫病毒的氨基酸序列融合，例如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55；或表1所示的肽的同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。

[0081] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含肽、多肽或蛋白质作为载体或分子佐剂，并与一种或多种口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白质的全部、部分或变异的序列融合，例如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55；或表1所示的肽的同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的口蹄疫病毒多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的G-H环高可变区域(氨基酸135-160)的天然、合成或重组肽或多肽。

[0082] 在一个实施例中，本发明的蛋白质、多肽或肽载体可以使用任何接头与目标序列融合。

[0083] 在一个实施例中，用作载体和/或分子佐剂的蛋白质来自BLS蛋白的天然氨基酸序列或其变异的序列。在一个实施例中，可以使用任何肽或多肽接头融合BLS蛋白与口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白质。在一个实施例中，BLS蛋白作为载体或分子佐剂，并与一种或多种口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白质的全部、部分或变异的序列融合，该序列衍生自衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)或非结构蛋白(2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D)。在一个实施例中，BLS蛋白作为载体或分子佐剂，并与表1所示具有口蹄疫病毒表位的肽(SEQ ID NO.1-55)融合，或与表1所示的肽(SEQ ID NO.1-55)的突变序列融合，或其同源或功能类似物的肽融合。在另一个实施例中，本发明的口蹄疫病毒多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的全部、部分或变异的GH环高可变区域(氨基酸135-160)的天然、合成或重组肽或多肽。在另一个实施例中，可以使用任何肽或多肽接头融合BLS蛋白与任何肽、多肽和蛋白质。在一个实施例中，BLS蛋白与来自相同口蹄疫病毒毒株或血清型的一种或多种口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白质融合。在另一个实施例中，BLS蛋白与来自不同口蹄疫病毒毒株或血清型的一种或多种口蹄疫病毒肽、多肽和/或蛋白质融合。在另一个实施例中，BLS蛋白或其突变体不与任何口蹄疫病毒肽、多肽和蛋白质融合。在另一个实施例中，BLS的突变体是具有点突变的BLS蛋白以提高稳定性。

[0084] 在一个实施例中，本发明的佐剂和乳化剂可以选自铝盐、氢氧化铝凝胶、皂苷或衍生物如QS21、淋巴细胞因子、CpG、聚肌胞(poly I:C)、Toll样受体激动剂、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质体、不完全弗氏佐剂、脂质体、硬脂酸酪氨酸酯、角鲨烯、L121、Emulsigen、单磷酰脂质A、Montanide ISA佐剂(ISA 15VG、ISA 25VG、ISA 28VG、ISA 35VG、ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 207VG、ISA 50V2、ISA 50V4、ISA 61VG、ISA 70、ISA 71VG、ISA 71R VG、ISA
720、ISA 760、ISA 761VG、ISA 763A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐剂(IMS
251C、IMS 1312VG、IMS 1313VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、轻质矿物油、代谢油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯和其他有效的佐剂和乳化剂。

[0085] 在一个实施例中，疫苗制剂是乳液，如油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液或水包油包水(W/O/W)乳液或油包水包油(O/W/O)乳液。在另一个实施例中，疫苗制剂包含乳液和一种或多种其他佐剂的混合物。

[0086] 在一个实施例中，载体系统可以是脂质体、微米球、纳米颗粒、树枝状大分子、胶束系统或免疫刺激复合物(ISCOM)。

[0087] 本发明提供一种对易受口蹄疫病毒感染的宿主接种疫苗的方法，包含向宿主施用一种或多种本发明所述之疫苗制剂以诱导免疫反应。在一个实施例中，该疫苗制剂的组分于不同时间点施用在宿主上。在另一个实施例中，其中该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置于相同时间点施用。在另一个实施例中，该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置于不同时间点施用。在一个实施例中，该宿主是牛、羊、山羊或猪。

[0088] 在一个实施例中，该宿主未感染口蹄疫病毒，该诱导的免疫反应是保护性免疫反应。在另一个实施例中，该宿主已被口蹄疫病毒感染，该诱导的免疫应答是治疗性免疫反应。在一个实施例中，该诱导的免疫反应是体液免疫反应。在另一个实施例中，该诱导的免疫反应是细胞免疫反应。在另一个实施例中，该诱导的免疫反应包括针对一种或多种口蹄疫病毒血清型或毒株的交叉保护中和抗体。在另一个实施例中，诱导的免疫应答与口蹄疫病毒的各种血清型和/或毒株交叉反应。

[0089] 在一个实施例中，本发明提供一种能够诱导针对不同血清型或病毒株的交叉保护的疫苗制剂，其中该疫苗制剂包含全灭活病毒和至少一种以下成分：(a)编码该病毒的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；(b)该病毒的人工肽或多肽；(c)该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；(d)该病毒的病毒样颗粒；(e)衍生自其他病毒的病毒样颗粒，该病毒样颗粒展示该病毒的重组肽、多肽或蛋白质；或(f)肽、多肽或蛋白质作为载体或分子佐剂，其中该肽、多肽或蛋白质会或不会与任何上述的成分融合。所述病毒包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及狂犬病病毒等。

[0090] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂能够针对该病毒特定血清型的所有毒株，或针对该病毒的所有血清型的所有毒株，诱导保护性免疫。

[0091] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含口蹄疫病毒，其中该多核苷酸衍生自以下各选择中全部、部分或变异的序列：(a)编码一个或多个口蹄疫病毒衣壳蛋白基因VP1、VP2、VP3和VP4的多核苷酸序列；(b)编码一个或多个口蹄疫病毒非结构蛋白基因2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的多核苷酸序列；(c)编码一个或多个氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)的多核苷酸序列；或(d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)同源或功能类似物的肽的多核苷酸序列。在一个实施例中，其中该同源肽与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95％的同源性。在一个实施例中，其中该多核苷酸序列可以编码表1所示的肽的功能类似物的肽。在另一个实施例中，该功能性类似物的肽与SEQ ID NO.1-55中任一个氨基酸序列具有低至10％的同源性。

[0092] 在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含口蹄疫病毒，其中该重组或人工病毒肽、多肽或蛋白质编码选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：(a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)一个或多个SEQ ID NO.1-55(表1)的氨基酸序列；或(d)编码一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。在一个实施例中，其中该同源肽与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95％的同源性。在另一个实施例中，该功能性类似物的肽与SEQ ID NO.1-55中任一个氨基酸序列具有低至10％的同源性。在一个实施例中，该重组或人工的病毒肽或多肽是线性或树状聚合肽。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含的灭活口蹄疫病毒衍生自口蹄疫病毒的任何血清型或毒株。在一个实施例中，该灭活口蹄疫病毒包含一种或多种口蹄疫病毒的血清型或毒株。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂含有的口蹄疫病毒样颗粒包括一种或多种天然或突变形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白质，或其突变形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白质能形成完整的空衣壳蛋白。

[0093] 在一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含口蹄疫病毒，其中该衍生自其他病毒的病毒样颗粒与病毒肽、多肽或蛋白质融合，其中该病毒肽、多肽或蛋白质选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：(a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)与表1所示的氨基酸序列同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。在一个实施例中其中该同源肽与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95％的同源性。在另一个实施例中，该功能性类似物的肽可以与SEQ ID NO.1-55中任一个氨基酸序列具有低至10％的同源性。

[0094] 在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含口蹄疫病毒，其中该载体或分子佐剂与多肽融合，其中该多肽编码选自以下各选择中全部、部分或变异的序列：(a)口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非结构蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)一个或多个SEQ ID NO.1-55的氨基酸序列；或(d)一个或多个与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能类似物的肽的氨基酸序列。在一个实施例中，其中该同源肽与氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95％的同源性。在另一个实施例中，该功能性类似物的肽可以与SEQ ID NO.1-55中任一个氨基酸序列具有低至10％的同源性。在一个实施例中，其中该载体或分子佐剂是线性或树状聚合物。

[0095] 在另一个实施例中，该载体或分子佐剂衍生自天然的BLS蛋白或其突变的氨基酸序列。在一个实施例中，BLS蛋白与一个或多个衍生自相同口蹄疫病毒毒株或血清型的口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质融合。在另一个实施例中，BLS蛋白与一个或多个衍生自不同口蹄疫病毒毒株或血清型的口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质融合。在一个实施例中，BLS蛋白或突变的BLS蛋白没有与任何口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白质融合。在另一个实施例中，BLS的突变体是具有点突变的BLS蛋白以提高稳定性。

[0096] 本发明提供了一种对易受口蹄疫病毒感染的宿主接种疫苗的方法，包含向宿主施用本发明所述的疫苗制剂以诱导免疫反应。在一个实施例中，该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置同时施用。在一个实施例中，该疫苗制剂的组分在宿主的相同位置于不同时间点施用。在一个实施例中，该疫苗制剂的组分在宿主的不同位置于不同时间点施用。在一个实施例中，该宿主是牛、羊、山羊或猪。

[0097] 在一个实施例中，该宿主未感染口蹄疫病毒，其中该诱导的免疫反应是保护性免疫反应。在另一个实施例中，该诱导的免疫反应是体液免疫反应或细胞免疫反应。

[0098] 在一个实施例中，该诱导的免疫反应包括针对一种或多种口蹄疫病毒血清型或毒株的交叉保护中和抗体。在另一个实施例中，该诱导的免疫反应与一种或多种口蹄疫病毒的血清型或毒株交叉反应。

[0099] 本发明还提供了一种药物组合，用于诱导针对宿主中的一种或多种病毒性疾病的一种或多种免疫反应和/或用于增强宿主接种疫苗的有效性，包含：(a)本发明所述能够在宿主中引发免疫应答的疫苗制剂；和(b)一种或多种增强宿主免疫应答的分子佐剂，其中该疫苗制剂和分子佐剂可以单独或一起施用。引发病毒性疾病的病毒包括但不限于，口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒。在一个实施例中，本发明的药物组合是本发明所述的疫苗制剂包含一个或多个多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、病毒样颗粒、灭活病毒、佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体系统。在另一个实施例中，本发明的药物组合含有一种或多种本发明所述的疫苗制剂，包含一个或多个多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、病毒样颗粒、灭活病毒、佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体系统。

[0100] 在另一个实施例中，本发明的药物组合中使用的疫苗制剂可以诱导针对目标病毒的不同血清型和/或毒株的交叉保护，该目标病毒包括但不限于口蹄疫病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒和狂犬病病毒。在另一个实施例中，本发明的疫苗制剂包含一种或多种有效量的组分，例如佐剂、乳化剂、分子佐剂和载体，以触发免疫应答，疫苗制剂中用于触发免疫应答的组分包括但不限于：全灭活病毒；病毒样颗粒；衍生自其他病毒的病毒样颗粒并展示目标病毒的重组肽、多肽或蛋白质；编码病毒肽、多肽或蛋白质的多核苷酸；目标病毒的合成肽或多肽；目标病毒的重组肽、多肽或蛋白质；目标病毒的病毒样颗粒；衍生自其他病毒的病毒样颗粒。

[0101] 在一个实施例中，药物组合的分子佐剂选自：铝盐、氢氧化铝凝胶、皂苷或衍生物如QS21、淋巴细胞因子、CpG、聚肌胞(poly I:C)、Toll样受体激动剂、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质体、不完全弗氏佐剂、脂质体、硬脂酸酪氨酸酯、角鲨烯、L121、Emulsigen、单磷酰脂质A、Montanide ISA佐剂(ISA 15VG、ISA 25VG、ISA28VG、ISA 35VG、ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 207VG、ISA 50V2、ISA 50V4、ISA 61VG、ISA 70、ISA 71VG、ISA 71R VG、ISA
720、ISA 760、ISA 761VG、ISA 763A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐剂(IMS
251C、IMS 1312VG、IMS 1313VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、轻质矿物油、代谢油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)乳液、油包水包油(O/W/O)乳液、聚乳酸-乙醇酸、多糖、树状聚合物、金纳米粒子、衍生自病毒衣壳蛋白的抗原表位、BLS蛋白、BLS蛋白与能够引发免疫应答的成分融合或突变的BLS蛋白与能够引发免疫应答的成分融合。

[0102] 在一个实施例中，BLS蛋白与能够引发免疫应答的成分融合，并以肽或多肽作为接头。

[0103] 本发明提供了一种对易受口蹄疫病毒感染的宿主接种疫苗的方法，包括对宿主施用本发明的药物组合以诱导免疫应答，其中疫苗和分子佐剂分别或一起施用。

[0104] 在一个实施例中，本发明的药物组合通过口服、肌内、皮下、皮内、鼻内喷雾施用。

[0105] 在一个实施例中，本发明的药物组合在宿主的相同位置同时施用。在另一个实施例中，本发明的药物组合在宿主的相同位置于不同时间点施用。在另一个实施例中，本发明的药物组合在宿主的不同位置同时施用。在另一个实施例中，本发明的药物组合在宿主的不同位置于不同时间点施用。

[0106] 通过引用以下的实验细节，可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应理解所提供的实施例仅作为说明作用，而非限制本发明的范围。本发明的范围将由随后的申请专利范围所界定。

[0107] 在本申请中的引用了不同的参考文献或出版物。这些参考或出版物的全文和公开都结合到本申请中，从而更全面地描述本发明的情况。过渡语“包含”与“包括”﹑“含有”或“以......为特征”是同义的，是包括性或开放式的，当中并不排除有另外未列举的元素或方法步骤。实例1
制备疫苗制剂

[0108] 本实例说明了制备针对不同类型的口蹄疫病毒的疫苗制剂和步骤。

[0109] 在一个实施例中，具有重组蛋白或灭活全口蹄疫病毒抗原的疫苗制剂包含以下化学物质和溶液：-水相(抗原相)溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH＝8。
-油相溶液：Montanide ISA 50V2。

[0110] 在另一个实施例中，具有质粒DNA的疫苗制剂包含以下化学物质和溶液：-磷酸盐缓冲盐水10X(PBS)：80g/L NaCl，2g/L KCl，11.5g/L Na2HPO4，2g/L KH2PO4.pH＝7.2。

[0111] 表3显示了四种用于测试的不同疫苗制剂(D、E、F和G)。表3、三个基于重组BLS的口蹄疫病毒疫苗制剂和一个灭活病毒抗原疫苗制剂

[0112] 在一个实施例中，按照以下步骤配制基于重组BLS蛋白的口蹄疫病毒疫苗制剂：1)在50mL的锥形瓶中制备水相，其体积如表3所示。
2)把油相的体积加入100mL烧杯中。
3)把Ultra-Turrax(T10、T18、T25或T50)的小茎(S10N-10G、S10N-10G-ST、S18N-10G、S18N-19G、S25N-10G、S25N-10G-ST、S25N-18G、S25N-18G-ST、S25N-25G、S25N-25G-ST和其他类似物)置于具有油相的管内。当该油相以6500rpm搅拌时，以5mL/min的流速加入适当体积的水相。
4)加入所有水相后，混合物在21500rpm下乳化30秒。
5)为了测量颗粒尺寸的分布，每种制剂各取500μl等分于Eppendorf管中。如果d(0.9)(第90个百分位数，这表明90％的水相体积已经形成了具有小于指定尺寸(μm)的直径的颗粒)的值小于3微米，然后，进行填装和完成的过程。否则，将其再均化30秒，并重新测量d(0.9)以获得指定值。
6)将制剂无菌分装在25mL小瓶中，随后将其封闭并用橡胶塞盖住并使用无菌镊子翻转。
7)不同的制剂储存于4℃。

[0113] 在另一个实施例中，按照以下步骤配制基于BLS的质粒DNA的口蹄疫病毒疫苗制剂：1)含有BLS-I(DNA)的质粒pVAX1通过QIAGEN's EndoFree Plasmid Giga Kit从大肠杆菌(E.coli DH5α)的培养物在50μg/ml卡那霉素的LB无菌培养液中于37℃下纯化。
2)通过琼脂糖凝胶电泳证实质粒pVAX1-BLS-I(DNA)的存在。
3)使用10X PBS缓冲液把纯化的pVAX1-BLS-I(DNA)稀释至最终浓度1mg/mL。

[0114] 在另一个实施例中，按照以下步骤配制灭活全口蹄疫病毒抗原的疫苗：1)使用磁力搅拌器在第一个5升无菌玻璃瓶中把油相混合。
2)在第二个5升无菌玻璃瓶中制备包含从生产过程中获得的灭活全口蹄疫病毒抗原的水相，然后使用蠕动泵和无菌矽胶管，逐渐转移水相至包含油相的第一个5升无菌玻璃瓶中，在13.5-15℃下以均速混合。
3)温度降至2-8℃，用磁力搅拌器进行高速搅拌约15-16小时。
4)然后把混合物从第一个5升瓶通过试点规模的SilversonL4RT高速剪切混合机转移至第三个无菌5升玻璃瓶中，以产生最终乳液。高速剪切混合机的转速为4000rpm。
5)乳化完成后再搅拌30-35分钟。
6)停止搅拌，在2-8℃下静置乳液直至填装和完成的过程。
实例2
使用基于BLS的口蹄疫病毒重组肽(O1Campos)疫苗

[0115] 本实例说明了使用不同疫苗制剂，包括基于BLS的口蹄疫病毒重组疫苗，接种动物的方法。(a)动物模型：

[0116] 本实例使用了22只18至24个月大及没有施用口蹄疫疫苗的赫里福德小牛。对所有动物进行了针对口蹄疫病毒的血清学检测，由此证实不存在初乳抗体和/或疫苗相关抗体。整个临床试验中，动物留于同一场地。
(b)实验组：

[0117] 把动物随机分为6个实验组：第1组(n＝4)于不同时间施用1mL疫苗制剂D(表3,SEQ ID NO.56:编码融合蛋白BLS-I的BLS-I(DNA)质粒DNA(pVAX1))及5mL疫苗制剂E(表3,SEQ ID NO.57:BLS-I)；第2组(n＝4)于不同时间施用1mL疫苗制剂D(表3,SEQ ID NO.56:编码融合蛋白BLS-I的BLS-I(DNA)质粒DNA(pVAX1))及5mL疫苗制剂F(表3所示的融合蛋白组合SEQ ID NO.57(BLS-I)、SEQ ID NO.58(BLS-D)和SEQ ID NO.59(BLS-A1))；第3组(n＝4)于不同时间施用两次5mL疫苗制剂E(表3，SEQ ID NO.57:BLS-I)；第4组(n＝4)于不同时间施用5mL疫苗制剂F(融合蛋白组合SEQ ID NO.57(BLS-I)、SEQ ID NO.58(BLS-D)和SEQ ID NO.59(BLS-A1))；第5组(n＝2)为对照组对应于未接种疫苗的动物。最后，第6组(n＝4)施用2mL疫苗制剂G(如表3所示包含四种灭活的口蹄疫病毒抗原的四价疫苗作为阳性对照)。表4、不同的疫苗接种方案
(c)疫苗接种方案

[0118] 实验疫苗在研究的第0天和第30天使用首剂/加强方案施用：第0天的第一次注射启动免疫，第30天的第二次注射加强免疫。(d)抽血：

[0119] 在接种疫苗后30，60，90和105天(DPV)进行抽血。表4列出不同的接种方案。(e)口蹄疫病毒血清学检测：

[0120] 进行ELISA测定以测量包含DNA(BLS-I)及BLS-肽(BLS-D、BLS-I及BLS-A1)(图1及图2，第1及第2组)的疫苗制剂和包含BLS-肽混合物(BLS-D、BLS-I和BLS-A1的不同组合)(图1及图2，第3及第4组)的疫苗制剂应用于牛只(剂量为每疫苗制剂2或5mL)中产生的O1 Campos毒株特异性总抗体。结果显示，两种类型的疫苗只能诱导非常低的抗体产生，并明显低于阳性对照(图1及图2，第6组)。
实例3
接种疫苗后的免疫保护

[0121] 本实例说明实例2的动物接种疫苗后，获得针对口蹄疫病毒毒株O1 Campos的免疫保护。

[0122] 在第一次接种后112天(DPV)，来自实施例2的动物，在生物安全水平4的OIE设施中以10,000半数致死剂量(LD 50)(在乳鼠中测定的致死剂量)口内注射强毒口蹄疫病毒O1 Campos毒株。在感染后7天(DPI)从广泛性口蹄疫病毒疫苗对足部感染的试验(Podal Generalization)获得的保护结果。当动物的位置(RFM、LFM、RHM和LHM)没有显示任何症状时，会被定义为“受保护”。因为舌头是接种部位，所以不考虑对该部位进行分析。

[0123] 结果：为了检测这些疫苗是否能够赋予保护性免疫力，进行了感染攻毒。结果显示，这些疫苗不能保护动物免受病毒感染，因为结果坍均呈现典型的与口蹄疫病毒相关的病变。只有使用灭活的全口蹄疫病毒疫苗作为阳性对照能够提供完全的保护(图3)。这些实验的结果显示，当肽疫苗用作唯一抗原时，不能为接种疫苗的动物针对自体口蹄疫病毒提供任何保护。实例4
结合使用BLS-口蹄疫病毒(O1 Campos)重组肽疫苗和灭活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗进行接种

[0124] 本实例说明了结合使用BLS-口蹄疫病毒(O1 Campos)重组疫苗和灭活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗接种动物所实现的效果。(a)制备疫苗制剂：

[0125] 在一个实施例中，疫苗制剂包含以下化学物质和溶液：-水相溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH＝8。
-油相溶液：Montanide ISA 61VG

[0126] 使用与实施例1中包含BLS肽的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂A。

[0127] 使用与实施例1中包含全灭活病毒抗原的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂B和C。

[0128] 表5显示了测试的三种不同制剂(A、B和C)表5、疫苗的配方
(b)动物模型：

[0129] 使用了25头6至10个月大及没有施用口蹄疫疫苗的黑色阿伯丁安格斯小牛(公牛及母牛)。对所有动物进行了针对口蹄疫病毒的血清学检测，由此证实不存在初乳抗体和/或疫苗相关抗体。整个临床试验中，动物留于同一场地。(c)实验组：

[0130] 把动物随机分为4个实验组：第1组(n＝6)同时在右侧施用2mL疫苗制剂B(A Argentina 2001毒株)和在左侧施用2mL疫苗制剂A(表5，BLS-I)；第2组(n＝6)施用2mL疫苗制剂B(表5，A Argentina 2001毒株)；第3组(n＝9)施用2mL疫苗制剂C(表5，O1 Campos毒株)。第4组(n＝2)为对照组对应于未接种疫苗的动物。(d)疫苗接种方案：

[0131] 实验疫苗在研究的第0天施用。表6显示了不同的接种方案。表6.疫苗接种方案
(e)抽血：

[0132] 在接种疫苗后29和58天(DPV)如表6所示进行抽血。(f)口蹄疫病毒血清学检测

[0133] 使用特异性O1 Campos抗体的液相ELISA测定进行分析。在接种后的两个时间点，第29和58天，使用单价病毒疫苗免疫的组别中获得的抗体滴度在预期值内，在同源O1 Campos疫苗的情况下获得最大数值，而在使用毒株A2001接种的动物中获得最少针对O1 Campos的交叉反应性抗体。结合使用两种不同疫苗的免疫方案，在一侧施用重组BLS-I疫苗和在另一侧施用全灭活A2001病毒抗原，能够产生明显良好的抗O1 Campos抗体水平(图4和图5)。

[0134] 本实例的BLS蛋白用作载体和分子佐剂，以将免疫应答重定向到特定毒株或血清型。实验中使用BLS-I(SEQ ID NO.57)，蛋白质载体BLS与具有口蹄疫病毒表位的肽融合，结果显示，当使用两种不同疫苗组合的疫苗接种方案时，灭活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗和融合肽BLS-I(SEQ ID NO.57)疫苗同时接种在动物的不同部位，可有效诱导针对O1 Campos毒株的强烈免疫应答。另一方面，单独使用灭活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗，但没有使用融合肽BLS-I，未能产生良好水平的O1 Campos抗体。此外，如实例2所示，通过单独使用BLS-1免疫原获得的非常低的O1 Campos特异性抗体水平，而结合免疫方案所获得的血清学结果特别高。实例5
结合使用BLS-口蹄疫病毒(A2001O1 Campos)重组肽疫苗和灭活全口蹄疫病毒(O1 Campos)疫苗进行接种

[0135] 本实例在牛测试了三种疫苗制剂，以分析结合使用2种疫苗的免疫方案，口蹄疫病毒(A2001)重组肽与BLS蛋白融合的疫苗和灭活全口蹄疫病毒(O1 Campos)颗粒疫苗，在动物中产生对A2001的免疫应答的效果。测试的疫苗制剂和组合是：I(A2001全灭活病毒颗粒为阳性对照)，J(O1 Campos全灭活病毒颗粒为阴性对照)，H+J(结合使用2种疫苗：含有BLS-I_A2001融合蛋白SEQ ID NO.60的疫苗(H)和O1 Campos全灭活病毒颗粒疫苗(J)(表7))。(a)制备疫苗制剂：

[0136] 在一个实施例中，疫苗制剂包含以下化学物质和溶液：-水相溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH＝8。
-油相溶液：Montanide ISA 61VG

[0137] 使用与实施例1中包含BLS肽的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂H。

[0138] 使用与实施例1中包含全灭活病毒抗原的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂I和J。(b)动物模型：

[0139] 本实例使用了38头18至24个月大及没有施用口蹄疫疫苗的赫里福德小牛小牛。对所有动物进行了针对口蹄疫病毒的血清学检测，由此证实不存在初乳抗体和/或疫苗相关抗体。整个临床试验中，动物留于同一场地。表9显示了感染攻毒的方案。(c)疫苗接种方案：

[0140] 实验疫苗在研究的第0天或第0天和第28天施用。表8列出不同的接种方案。表7、疫苗制剂
(d)抽血：
在接种疫苗后28,63,和98天(DPV)如表8所示进行抽血。
表8.疫苗接种方案
表9.动物随机分为4组实验组

[0141] 口蹄疫病毒血清学检测：

[0142] 进行ELISA测定以测量三种疫苗制剂产生的A2001毒株的总抗体。结果显示，结合使用灭活全口蹄疫病毒(O1 Campos)颗粒和BLS-I_A2001的组合可以诱导产生与阳性对照(A2001全病毒疫苗)相同水平的抗体，然而单独使用O1 Campos疫苗接种则产生非常低的抗A2001血清学结果(图6和7)。上述结果与实例4所获得的结果一致，并且在实例4中显示的方案证明令人惊奇的协同效应，可用于靶向其它任何口蹄疫病毒毒株：本实例通过改变整个灭活病毒(O1 Campos)和融合肽(BLS-I_A2001)的毒株而成功实现。因此，实例4和5的结果表明，本发明所述的方案和方法可有效获得广效型口蹄疫疫苗。实例6
接种疫苗后的免疫保护

[0143] 本实例说明了实例5的动物接种疫苗后，获得针对口蹄疫病毒毒株A2001的免疫保护。

[0144] 在第一次接种(DPV)后112天，来自实施例5的动物，在生物安全水平4的OIE设施中以10,000半数致死剂量(LD 50)(在乳鼠中测定的致死剂量)口内注射强毒口蹄疫病毒A2001毒株。在感染后7天(DPI)从广泛性口蹄疫病毒疫苗对足部感染的试验(Podal Generalization)获得的保护结果。当动物的位置(RFM、LFM、RHM和LHM)没有显示任何症状时，会被定义为“受保护”。因为舌头是接种部位，所以不考虑对该部位进行分析。

[0145] 结果：为了检测这些疫苗是否能够赋予保护性免疫力，进行了感染攻毒。结果显示结合使用全灭活病毒颗粒(疫苗制剂J)和BLS-I_A2001融合蛋白肽(疫苗制剂H)能够保护实例5第1组中的12只动物中的7只，为这些动物提供完全的保护。因此，与单独使用O1 Campos全灭活病毒颗粒疫苗的结果比较(实例5，第3组，疫苗制剂J，阴性对照，6只动物中0只受保护)，显然BLS-I_A2001肽能够重定向针对A2001毒株的免疫应答，并与基于全病毒O1 Campos毒株的疫苗产生协同效应，以保护动物免受病毒毒株A2001感染。因此，这些实验的结果表明，这些肽疫苗与灭活的全口蹄疫病毒疫苗组合对免疫系统引起了非常惊人和不可预期的效果，并且能够在接种疫苗的动物中针对异源毒株产生适当的交叉保护。实例7
在同一疫苗制剂结合使用BLS-口蹄疫病毒(A2001)重组肽疫苗和灭活全口蹄疫病毒(O1 Campos)疫苗

[0146] 本实例说明了在同一疫苗制剂结合使用BLS-口蹄疫病毒(A2001)重组肽疫苗和灭活全口蹄疫病毒(O1 Campos)疫苗进行接种所实现的效果，与实例5分别使用BLS-口蹄疫病毒抗原和灭活全口蹄疫病毒的效果相近。(a)制备疫苗制剂：

[0147] 在一个实施例中，疫苗制剂包含以下化学物质和溶液：-水相溶液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH＝8。
-油相溶液：Montanide ISA 61VG

[0148] 配制和试验了表10所示的三种疫苗制剂(K、L和M)。

[0149] 使用与实例1中包含BLS肽的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂K。该疫苗的唯一区别是该制剂同时含有BLS肽和全灭活的抗原。

[0150] 使用与实例1中包含全灭活病毒抗原的疫苗相同的步骤配制疫苗制剂L和M。(b)动物模型：

[0151] 使用了23头6至10个月大及没有施用口蹄疫疫苗的黑色阿伯丁安格斯小牛(公牛及母牛)。对所有动物进行了针对口蹄疫病毒的血清学检测，由此证实不存在初乳抗体和/或疫苗相关抗体。整个临床试验中，动物留于同一场地。表10.疫苗的配方
(c)实验组：

[0152] 把动物随机分为4个实验组：第1组(n＝10)施用2mL疫苗制剂K(表7,BLS-I_A2001+全灭活病毒抗原毒株O1 Campos)；第2组(n＝5)施用2mL疫苗制剂L(表7,BLS-I_A2001+全灭活病毒抗原毒株Argentina 2001)；第3组(n＝5)施用2mL疫苗制剂M(全灭活病毒抗原毒株O1 Campos)；第4组(n＝5)为对照组对应于未接种疫苗的动物。(d)疫苗接种方案：

[0153] 实验疫苗在研究的第0天施用。表11显示了不同的接种方案。(e)抽血：

[0154] 在接种疫苗后31和63天(DPV)如表11所示进行抽血。表11.疫苗接种方案
(f)口蹄疫病毒血清学检测

[0155] 使用特异性A2001抗体的液相ELISA测定进行分析。在接种后的第31和63天，使用单价病毒疫苗免疫的组别中获得的抗体滴度在预期值内，在同源A2001疫苗的情况下获得最大数值，而在使用毒株O1 Campos接种的动物中获得最少针对A2001的交叉反应性抗体。另一方面，疫苗制剂K(BLS-I_A2001+O1 Campos)能够产生明显良好的抗A2001抗体水平，高达阳性对照的数量。这些实验结果表明，重组BLS肽A2001抗原与全病毒O1 Campos抗原疫苗组合引起了非常惊人和不可预期的效果(图10和11)。

[0156] 总结而言，实例5和7已经证明不同的免疫方案结合使用重组口蹄疫抗原和全灭活的口蹄疫病毒能够引发高抗体滴度，该免疫方案包括在同一疫苗中同时施用或者分别施用。

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