口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒专利检索-蹄叉角动物学专利检索查询-专利查询网

口 蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测 试剂盒

阅读：844发布：2020-05-15

专利汇可以提供口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本发明是以口蹄疫病毒2B基因设计口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三个血清型的共用反转录引物；再以口蹄疫病毒VP1基因作为扩增靶区域，设计3对口蹄疫病毒型特异性引物和TaqMan MGB探针，采用实时荧光定量RT-PCR技术，实现对口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三个血清型的鉴别检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似口蹄疫病毒(FMDV)感染家畜的水疱皮、扁桃体、淋巴结等组织样品及水疱液、食道-咽部分泌液(O-P液)的病毒核酸检测，灵敏度可达1.0×101拷贝/μL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病原体例如VSV、PRV、CSFV、PRRSV、SS2、GPV、BVDV之间无交叉反应。，下面是口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
O型FMDV检测引物和探针：
P1：5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'
P2：5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'
Probe-P7：5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3'；
A型FMDV检测引物和探针：
P3：5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'
P4：5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'
Probe-P8：5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3'；
AsiaⅠ型FMDV检测引物和探针：
P5：5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'
P6：5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'
Probe-P9：5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3'；以及
共用反转录引物P0：5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3'；
其中，S为G，C；R为A，G；B为C，G，T；N为A，C，G，T；K为G，T；Y为C，T；W为A，T；V为A，C，G；M为A，C。
2.含有权利要求1所述引物和探针的用于检测O、A和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量RT-PCR 试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、
2+
Taq DNA聚合酶、Mg 、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，用于所述试剂盒的反转录体系为：
5×M-MLV缓冲液4μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，20μmol/L共用反转录引物P01μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNase抑制剂0.5μL，样品RNA 10μL；反转录条件为：37℃，1h。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，用于荧光定量RT-PCR扩增反应的反应体系以25μl计为：引物P1、P2、P3、P4、P5、P6终浓度各为0.4μmol/L，Probe-P7终浓度为0.4μmol/L，Probe-P8终浓度为0.6μmol/L，Probe-P9终浓度为0.6μmol/L，
2.5mmol/L dNTPs2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA模板4μL，去离子水补足至总体积25μL；
扩增反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

说明书全文

口 蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检

测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及口蹄疫病毒的分子生物学检测技术，具体地说，涉及口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测试剂盒。

背景技术

[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，对偶蹄兽有重大危害。口蹄疫病毒共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia Ⅰ(亚洲Ⅰ型)7个血清型，我国主要是O、A和Asia Ⅰ型，各个血清型的病毒之间不能产生交叉免疫。因此，口蹄疫病毒快速准确的分型是口蹄疫诊断的重要内容，可为疫苗的选择和流行病学研究提供有价值的信息。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供用于口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测的引物和探针。

[0004] 本发明的另一目的是提供口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR检测试剂盒。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的用于口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR检测的引物和探针，包括：

[0006] O型FMDV检测引物和探针：

[0007] P1：5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'

[0008] P2：5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'

[0009] Probe-P7：5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3'；

[0010] A型FMDV检测引物和探针：

[0011] P3：5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'

[0012] P4：5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'

[0013] Probe-P8：5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3'；

[0014] Asia Ⅰ型FMDV检测引物和探针：

[0015] P5：5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'

[0016] P6：5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'

[0017] Probe-P9：5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3'；以及

[0018] 共用反转录引物P0：5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3'；

[0019] 其中，S为G，C；R为A，G；B为C，G，T；N为A，C，G，T；K为G，T；Y为C，T；W为A，T；V为A，C，G；M为A，C。

[0020] 本发明还提供含有所述引物和探针的用于检测O、A和Asia Ⅰ型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

[0021] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。

[0022] 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中，所述阳性对照为经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物；所述阴性对照为正常细胞培养液。分别设置O型、A型和Asia Ⅰ型检测体系为FAM、VIC和NED荧光通道。

[0023] 用于所述试剂盒的反转录体系为：5×M-MLV缓冲液4μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，20μmol/L共用反转录引物P0 1μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNase抑制剂0.5μL，样品RNA 10μL；反转录条件为：37℃，1h。

[0024] 用于荧光定量RT-PCR扩增反应的反应体系以25μl计为：引物P1、P2、P3、P4、P5、P6终浓度各为0.4μmol/L，Probe-P7终浓度为0.4μmol/L，Probe-P8终浓度为0.6μmol/L，Probe-P9终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA模板4μL，去离子水补足至总体积25μL。

[0025] 扩增反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 15秒，60℃ 30秒，共40个循环。

[0026] 本发明进一步提供所述试剂盒在检测口蹄疫病毒和鉴别O、A和Asia Ⅰ型病毒中的应用。具体地，所述应用包括以下步骤：

[0027] 1)提取待测病毒样品的总RNA，进行反转录获得cDNA；其中，反转录体系为：5×M-MLV缓冲液4μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，共用反转录引物P0 1μL(20μmol/L)，M-MLV反转录酶0.5μL，RNase抑制剂0.5μL，RNA 10μL；反转录条件为：37℃，1h。

[0028] 2)进行荧光定量RT-PCR扩增反应；其中，反应体系以25μl计为：引物P1、P2、P3、P4、P5、P6终浓度各为0.4μmol/L，Probe-P7终浓度为0.4μmol/L，Probe-P8终浓度为0.6μmol/L，Probe-P9终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA模板4μL，去离子水补足至总体积25μL；

[0029] 扩增反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 15秒，60℃ 30秒，共40个循环。

[0030] 在本发明中，检测结果的判定方式可以为：阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，可根据不同仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞30.0或无Ct；阳性对照的Ct值应≤25.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。

[0031] 在检测结果成立的前提下：

[0032] 1)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且Ct值≤32.0，则可判定为样品中存在FMDV。

[0033] 2)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无Ct，则判定为FMDV阴性。

[0034] 3)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且32.0＜Ct值≤35.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。

[0035] 4)若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-O型；若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-A型；若在“NED/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-Asia Ⅰ型。

[0036] 本发明提供的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，以及基于所述引物和探针建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法可实现在一个反应中同时对O、A、Asia Ⅰ3个血清型口蹄疫病毒进行快速鉴别检测，可在1-2h内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测O、A、Asia Ⅰ3个血清型口蹄疫病毒的要求。

[0037] 本发明是以口蹄疫病毒2B基因设计口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三个血清型的共用反转录引物；再以口蹄疫病毒VP1基因作为扩增靶区域，设计3对口蹄疫病毒型特异性引物和TaqMan MGB探针，采用实时荧光定量RT-PCR技术，实现对口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三个血清型的检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似口蹄疫病毒(FMD)感染家畜的水疱皮、扁桃体、淋巴结等组织样品及水疱液、食道-咽部分泌液(O-P液)的病1
毒核酸检测，灵敏度可达1.0×10拷贝/μL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病原体，例如猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪链球菌2型(SS2)、羊痘病毒(GPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)之间无交叉反应。
附图说明

[0038] 图1为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR 方法建立扩增曲线；其中，1为FMDV-O灭活细胞毒扩增曲线；2为FMDV-A型灭活细胞毒扩增曲线；3为FMDV-Aisa Ⅰ型灭活细胞毒扩增曲线；4～10为猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪链球菌2型(SS2)、羊痘病毒(GPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)扩增曲线，11为阴性对照扩增曲线。

[0039] 图2为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测O型口蹄疫病毒0 1 2 3
敏感性扩增曲线；1～6分别对应的质粒浓度为1.0×10,1.0×10,1.0×10,1.0×10,1.
4 5
0×10,1.0×10拷贝/μL；7为阴性对照。

[0040] 图3为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测O型口蹄疫病毒标准曲线。

[0041] 图4为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测A型口蹄疫病毒0 1 2 3
敏感性扩增曲线；1～6分别对应的质粒浓度为1.0×10,1.0×10,1.0×10,1.0×10,1.
4 5
0×10,1.0×10拷贝/μL；7为阴性对照。

[0042] 图5为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测A型口蹄疫病毒标准曲线。

[0043] 图6为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测Asia Ⅰ型口蹄0 1 2
疫病毒敏感性扩增曲线；1～6分别对应的质粒浓度为1.0×10,1.0×10,1.0×10,1.0×
3 4 5
10,1.0×10,1.0×10拷贝/μL；7为阴性对照。

[0044] 图7为口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测Asia Ⅰ型口蹄疫病毒标准曲线。

具体实施方式

[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0046] 实施例1 用于口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物和探针以及检测方法的建立

[0047] 1.1材料

[0048] 1.1.1毒株

[0049] 经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物，来自国内某单位生产的口蹄疫检测试剂盒；其他对照病毒、细菌或阳性重组质粒由河南省动物疫病预防控制中心提供。

[0050] 1.1.2仪器和试剂

[0051] 荧光PCR仪，美国ABI公司产品，型号ABI7000；PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等均购自宝生物工程(大连)有限公司，M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体等购自Promega公司。

[0052] 1.2方法

[0053] 1.2.1引物设计与合成

[0054] 经大量比对GenBank中FMDV 7个血清型的基因，选取FMDV的O、A、Asia Ⅰ3个血清型基因高度保守2B基因序列设计3个血清型的共用反转录引物FMDV-R(P0)以及基于O、A、Asia Ⅰ3个血清型具有型特异性的VP1基因设计特异性引物对和TaqMan MGB探针，分别命名为FMD-O-P1(P1)、FMD-O-P2(P2)、FMD-A-P3(P3)、FMD-A-P4(P4)、FMD-Asia Ⅰ-P5(P5)、FMD-Asia Ⅰ-P6(P6)、FMD-O-MGB-FAM(Probe-P7)、FMD-A-MGB-VIC(Probe-P8)、FMD-Asia Ⅰ-MGB-NED(Probe-P9)。

[0055] 所设计的引物和探针序列如下：

[0056] O型FMDV检测引物和探针：

[0057] P1：5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'

[0058] P2：5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'

[0059] Probe-P7：5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3'；

[0060] A型FMDV检测引物和探针：

[0061] P3：5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'

[0062] P4：5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'

[0063] Probe-P8：5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3'；

[0064] Asia Ⅰ型FMDV检测引物和探针：

[0065] P5：5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'

[0066] P6：5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'

[0067] Probe-P9：5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3'；以及

[0068] 共用反转录引物P0：5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3'；

[0069] 其中，S为G，C；R为A，G；B为C，G，T；N为A，C，G，T；K为G，T；Y为C，T；W为A，T；V为A，C，G；M为A，C。

[0070] 1.2.2总RNA的制备

[0071] 模板RNA的制备：以经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物为阳性对照，以正常细胞培养液为阴性对照，采用Trizol法提取总RNA。

[0072] 具体操作如下：分别取阳性对照、阴性对照及待测样品各200μL于1.5ml离心管中，再加入600μL的Trizol于涡旋器震荡2-3min，加入200μL氯仿，离心后，取上清转入另一1.5ml离心管中，加200μL异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20μL DEPC(焦磷酸二乙酯)水溶解沉淀，取10μL用于反转录，余量于-20℃保存。

[0073] 1.2.3反转录

[0074] 每管FMDV反转录反应体系含如下成份：5×M-MLV缓冲液4μL；2.5mmol/L dNTPs4μL；M-MLV反转录酶0.5μL；RNase抑制剂0.5μL；共用反转录引物P0 1μL(20μmol/L)；总体积10μL。向每管反转录反应体系中加入步骤1.2.2中制得的RNA 10μL，37℃水浴1h，或置于PCR仪中37℃反应1h，反应结束后，70℃，15min灭活反转录酶，直接用于后续PCR扩增或-20℃冻存备用。

[0075] 1.2.4pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ标准品的制备[0076] 将含有口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型VP1基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的O型、A型和Asia Ⅰ阳性重组质粒(分别命名为pGEM-FMDV-O，pGEM-FMDV–A，pGEM-FMDV–Asia Ⅰ)应用分光光度计测定其OD260和OD280值及OD260/OD280值，共重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-FMDV-O、pGEM-FMDV–A、10 10
pGEM-FMDV–Asia Ⅰ质粒DNA溶液的浓度分别为8.32×10 拷贝/μL、8.81×10 拷贝/
10 0 10
μL和8.54×10 拷贝/μL，并分别定量稀释至1.0×10 ～1.0×10 拷贝/μL，－20℃保存备用。

[0077] 1.2.5FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR反应条件的优化

[0078] (1)将步骤1.2.4中获得的pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ重5
组质粒分别稀释至终浓度1.0×10拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4、P5/P6引物对分别稀释至终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0μmol/L，Probe-P7、Probe-P8、Probe-P9探针分别稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0μmol/L，应用荧光PCR仪(美国ABI公司，型号：ABI7000)采用矩阵法筛选不同浓度的pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ引物和探针组合，筛选针对FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

[0079] (2)优化的25μL PCR反应体系中，FMDV O型、A型和Asia Ⅰ 型上、下游引物P1/P2、P3/P4、P5/P6终浓度各0.4μmol/L，Probe-P7终浓度为0.4μmol/L，Probe-P8终浓度为0.6μmol/L，Probe-P9终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L，dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓5
冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，1.0×10拷贝/μL的质粒模板各2μL，去离子水补足至总体积25μL。优化的PCR反应程序为：94℃，5min；94℃ 15s，60℃ 30s，
40个循环(图1)。

[0080] (3)反应参数设置

[0081] 1)探针检测模式设置为：荧光模式FMDV-O型设为FAM/NONE双标记模式，FMDV-A型设为VIC/NONE双标记模式，FMDV-Asia Ⅰ型设为NED/NONE双标记模式。

[0082] 2)反应条件设置为：第一阶段，预变性94℃ 5min，1个循环；第二阶段，94℃ 15s，60℃ 1min，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

[0083] 3)质量控制：

[0084] 阴性对照：在“FAM/NONE”、“VIC/NONE”和“NED/NONE”标记模式下的检测结果应为扩增曲线无对数增长期，且Ct值＞35.0或无Ct。

[0085] 阳性对照：在“FAM/NONE”、“VIC/NONE”和“NED/NONE”标记模式下出现3条有明显对数增长期的扩增曲线，且Ct值应≤25.0。

[0086] 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

[0087] 4)结果判定：

[0088] ①如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且Ct值≤32.0，则可判定为样品中存在FMDV。

[0089] ②如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无Ct，则判定为FMDV阴性。

[0090] ③如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且32.0＜Ct值≤35.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。

[0091] ④若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-O型；若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-A型；若在“NED/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-Asia Ⅰ型。

[0092] 1.2.6敏感性试验和标准曲线的建立

[0093] 将步骤1.2.4中获得的pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ阳性重组质粒分别进行10倍系列稀释，3种质粒按1:1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为7 0
1.0×10～1.0×10 拷贝/μL，共8个稀释度，以纯水为阴性对照，按步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ阳性重组质粒起始模板浓度为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立三重FQ-PCR方法的标准曲线。三重FQ-PCR检测pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–Asia Ⅰ阳性重组质粒的最低检出限均为
1
1.0×10拷贝/μL。

[0094] 由敏感性检测结果建立FMDV-O型标准曲线，相关系数R2为0.9984，斜率为-3.2509，截距为36.481，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.2509log X+36.481

[0095] 由敏感性检测结果建立FMDV-A型标准曲线，相关系数R2为0.9949，斜率为-3.2086，截距为37.147，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.2086log X+37.147

[0096] 由敏感性检测结果建立FMDV-Asia Ⅰ型标准曲线，相关系数R2为0.9947，斜率为-3.3106，截距为37.512，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.3106log X+37.512

[0097] 根据仪器读取的Ct值代入表达式就可算出FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型的初始拷贝数(图2～图7)。

[0098] 1.2.7特异性试验

[0099] 按步骤1.2.2所述方法对猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)等提取RNA并按步骤1.2.2进行反转录，猪伪狂犬病毒(PRV)、猪链球菌2型(SS2)、羊痘病毒(GPV)等则直接提取DNA，同时将经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物为阳性对照，以正常细胞培养液为阴性对照，按步骤1.2.2进行反转录、步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行三重FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。结果表明灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物阳性对照FQ-PCR扩增Ct值分别为17.56、17.84和18.76，且出现特定的扩增曲线；但猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪链球菌2型(SS2)、羊痘病毒(GPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、正常细胞培养液等均未出现特定的扩增曲线。实验结果见图1。

[0100] 1.2.8稳定性和重复性试验

[0101] 分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-FMDV-O/pGEM-FMDV–A/pGEM-FMDV–5 2
Asia Ⅰ阳性重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1.0×10～1.0×10 )按照步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定4个重复，分成3个批次进行验证该方法的稳定性和重复性。结果表明，批内重复试验变异系数(CV)为1.16％，批间重复试验CV为
1.51％，两者CV值均在3％以下，表明建立的FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性。试验结果见表1。

[0102] 表1 稳定性和重复性试验结果

[0103]

[0104] 实施例2 口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测试剂盒

[0105] 本发明的三重FQ-PCR检测试剂盒中包括O型FMDV检测引物对和探针、A型FMDV检测引物对和探针、Asia Ⅰ型FMDV检测引物对和探针以及1条共用反转录引物。

[0106] O型FMDV检测引物和探针：

[0107] P1：5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'

[0108] P2：5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'

[0109] Probe-P7：5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3'

[0110] A型FMDV检测引物和探针：

[0111] P3：5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'

[0112] P4：5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'

[0113] Probe-P8：5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3'

[0114] Asia Ⅰ型FMDV检测引物和探针：

[0115] P5：5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'

[0116] P6：5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'

[0117] Probe-P9：5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3'

[0118] 共用反转录引物P0：5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3'

[0119] 其中，S为G，C；R为A，G；B为C，G，T；N为A，C，G，T；K为G，T；Y为C，T；W为A，T；V为A，C，G；M为A，C。

[0120] 所述检测试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。

[0121] 所述检测试剂盒的具体应用如下：

[0122] (一)样本要求：

[0123] 1、应用正确技术收集样本。

[0124] 2、样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去。

[0125] 3、样本处理、收集后在室温放置不可超过6小时；如果不在6小时内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中；若需24小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

[0126] (二)检验方法：

[0127] 1、样本处理

[0128] 水疱液和食道-咽部分泌液(O-P液)样品离心后直接取100μL上清液为待测样本使用；水疱皮、扁桃体、淋巴结等组织样品取约0.5g进行充分研磨，加入0.3mL PBS(pH7.4)充分混匀后10000r/min离心8-10min，取上清液为待测样本；细胞培养物等液体样本可稀释或直接作为待测样本使用。

[0129] 2、核酸提取

[0130] 可采用商业化的RNA快速提取试剂盒(离心柱式)产品，按照试剂盒说明书进行操作；或者，可采用商业化的全自动核酸提取仪，按照各厂家仪器及配套试剂盒说明书进行操作。

[0131] 3、RNA的反转录

[0132] 取RNA 10μL加入10μL反转录反应体系中，37℃水浴1h后，获得的cDNA可直接用于荧光PCR反应或-20℃冻存备用。

[0133] 反转录体系制备：根据检测样本量按照单个反应10μl用量，计算各组分所需总量，混匀后分装10μl于单个PCR反应管中。考虑到分装过程中造成的损失，可配制多于实际检测样本量所需体系的用量。

[0134] 4、PCR扩增

[0135] 4.1将预混好的荧光PCR反应体系分装至荧光PCR反应管中，每管分装21μL。

[0136] 4.2于上述PCR反应管中分别加入阳性对照、阴性对照、待测样本cDNA各4μL，8000r/min离心数秒，放入PCR扩增仪。

[0137] 荧光PCR反应体系制备：根据检测样本量按照单个反应21μl用量，计算各组分所需总量，混匀后分装21μl于单个PCR反应管中。考虑到分装过程中造成的损失，可配制多于实际检测样本量所需体系的用量。

[0138] 5、反应参数设置

[0139] 5.1探针检测模式设置为：荧光模式FMDV-O型设为FAM/NONE双标记模式，FMDV-A型设为VIC/NONE双标记模式，FMDV-Asia Ⅰ型设为NED/NONE双标记模式。

[0140] 5.2反应条件设置为：第一阶段，预变性94℃5min，1个循环；第二阶段，94℃15s，60℃ 1min，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

[0141] (三)质量控制：

[0142] (i)阴性对照：在“FAM/NONE”、“VIC/NONE”和“NED/NONE”标记模式下的检测结果应为扩增曲线无对数增长期，且Ct值＞35.0或无。

[0143] (ii)阳性对照：在“FAM/NONE”、“VIC/NONE”和“NED/NONE”标记模式下出现3条有明显对数增长期的扩增曲线，且Ct值应≤25.0。

[0144] 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

[0145] (四)结果判定：

[0146] 1)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且Ct值≤32.0，则可判定为样品中存在FMDV。

[0147] 2)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，则判定为FMDV阴性。

[0148] 3)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且32.0＜Ct值≤35.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。

[0149] 4)若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-O型；若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-A型；若在“NED/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤32.0，表明样品中存在FMDV-Asia Ⅰ型。

[0150] 实施例3 口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测技术的应用

[0151] 依据本发明建立的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR和之前建立的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型三重RT-PCR检测方法，配制检测试剂，以经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物为阳性对照；以正常细胞培养液为阴性对照，由国内具有口蹄疫病毒分离培养研究资质的实验室对其保存的15份临床疑似FMDV感染样品(样品编号为：1～15)分别采用本发明提供的方法和ZL201110163932.4中公开的方法(普通RT-PCR检测)进行实验室检测，并对这两种方法的检测结果进行比较分析，并与测序结果比较，结果见表2。结果表明，采用本发明提供的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法检测，4份为FMDV-O阳性，2份为FMDV-A阳性，1份为FMDV-Asia Ⅰ阳性；采用普通RT-PCR检测3份为FMDV-O阳性，2份为FMDV-A阳性和1份为FMDV-Asia Ⅰ阳性。表明本发明建立的口蹄疫病毒O型、A型与Asia Ⅰ型三重FQ-PCR方法比普通RT-PCR方法的灵敏性高，该FQ-PCR方法检测结果与FMDV-O型/FMDV-A型/FMDV-Asia Ⅰ型基因测序结果符合率为100％。

[0152] 表2 本发明方法与普通RT-PCR及测序结果比较

[0153]

[0154]

[0155] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检

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