新型免疫刺激大环内酯
阅读：239发布：2020-05-12
专利汇可以提供新型免疫刺激大环内酯专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供(I)的免疫刺激大环内酯。大环内酯类可用于 治疗 细胞内细菌、 真菌 和 原生动物 感染。，下面是新型免疫刺激大环内酯专利的具体信息内容。
1.式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐。
2.药物组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
3.权利要求1所述的化合物在医药中的用途。
4.权利要求1所述的化合物在治疗细胞内感染中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中细胞内感染选自细菌感染、原生动物感染和真菌感染。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述细胞内感染选自由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causing atypical disease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，Mycobacterium avium-intracellulare complex，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)引起的细菌感染。
7.用于权利要求5所定义的化合物，其中所述细胞内感染选自由弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和利什曼原虫(Leishmania)引起的原生动物感染。
8.根据权利要求5所述的用途，其中所述细胞内感染选自由荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)引起的真菌感染。
9.一种治疗或预防由病毒感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的权利要求1的化合物。
10.制备权利要求1所定义的化合物的方法，所述方法包括将式(II)的糖苷配基添加到使3-羟基位置糖基化的生物转化菌株的培养物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物转化菌株表达与SEQ ID NO:1(AngMII)或SEQ ID NO:2(AngMIII)具有70％以上同源性的糖基转移酶。
新型免疫刺激大环内酯
技术领域
[0001] 本发明提供了能够刺激免疫系统的新型大环内酯化合物。本发明涉及新型化合物在医药中的用途，尤其是当免疫系统的刺激有用时在治疗细胞内细菌感染、真菌感染和原生动物感染中的用途以及在联合治疗病毒性疾病、慢性炎性病症和癌症的用途。该化合物也可用作疫苗接种中的免疫调节佐剂。新型大环内酯类可最大化免疫系统的调节作用，同时最小化治疗上不需要的直接抗菌作用。本发明还提供了制备本发明化合物的方法以及该化合物在医药中的用途。
背景技术
[0002] 细胞内细菌、真菌和原生动物感染通常不会在健康个体中被诊断出来，因为它们似乎无症状，或者因为症状很轻微以至于受感染的个体往往不会寻求医疗帮助。因此，细胞内感染可能持续潜伏或可能发展为疾病状态。妨碍正常T细胞功能的病症通常导致疾病从潜伏感染进一步发展，并且诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)的细胞内感染是HIV感染已经发展为AIDS的情况下常见的患者死亡原因。因此，本领域迫切需要治疗细胞内感染的方法和手段。
[0003] 细胞内病原体(例如Mtb)具有隐藏在单核细胞和巨噬细胞的细胞内结构的能力，从而引起持续感染。尽管在肺中CD4+ T辅助细胞可识别Mtb并且产生适当的反应，但该系统不能产生灭菌免疫力(MacMicking 2012)。为了逃避宿主的免疫识别，Mtb开发了一系列机制，抑制在CD4+ T辅助细胞的MHC II类口袋中呈递的Mtb肽的识别。已经证明Toll样受体2被Mtb抑制，而这又抑制了IFN-γ诱导的MHC II类表达(Noss 2001)。此外，数据表明Mtb具有抑制吞噬体加工和成熟的能力，可能是通过恒定链相关机制(Ramachandra 2001)。因此，由于Mtb产生的免疫逃逸因子，源自Mtb的MHC II类肽的正常抗原加工、加载和呈递受损。
[0004] 设计内吞体溶酶体途径以摄取病原体，将它们加工成12-15aa的长肽，在通过HLA-DM去除恒定链肽CLIP后加载到MHC II类口袋中的肽。在抗原加载之后，将MHC II类肽复合物转运至细胞表面，以呈递CD4+ T辅助细胞的特异性T细胞受体(Roche 2015)。最近据报道，Mtb表达的蛋白EsxH直接抑制内吞体分选转运复合体(ESCRT)机制(Portal-Celhay 2016)。EsxH抑制抗原呈递单核细胞和巨噬细胞激活CD4+ T辅助细胞的能力。由于完整的ESCRT机制似乎是抗原加工、呈递和T细胞活化所必需的，因此EsxH是通过干预MHC II类途径解释Mtb诱导的免疫逃逸的关联。
[0005] MHC II类呈递的重要性也已在原发性免疫缺陷(PID)患者中得到证实。在IFN-γ回路(包括IFNGR和IL-12)中存在缺陷的PID患者具有增加的获得TBC和非典型分枝杆菌感染的风险。由于MHC II类表达取决于IFN-γ表达并受其调节，因此IFN-γ回路中的表达缺陷将导致额外降低的MHC II类表达和CD4+ T辅助细胞的活性差。
[0006] 原生动物如弓形虫(Toxoplasma gondii)作为绝对细胞内寄生虫，已经开发出一种通过细胞内隐藏来避免免疫识别的机制。该机制涉及干扰MHC II类表达，因此减少了针对特异性CD4+ T辅助细胞呈递的弓形虫的量。详细的机制取决于弓形虫表达的可溶性蛋白，即抑制IFN-γ诱导的MHC II类表达(Leroux 2015)。Cryptococos neoformans[0007] 此外，已经证明不同的真菌感染取决于MHC II类表达。新型隐球菌(Cryptococos neoformans)可能会导致包括艾滋病在内的免疫缺陷患者的危及生命的脑部感染。在新型隐球菌感染的小鼠模型中的工作已经证明，以IFN-γ依赖性方式激活小胶质细胞及其对MHC II类的上调对于存活是至关重要的(Zhou 2007)。
[0008] 因此，为了克服由Mtb和其他细胞内细菌、诸如弓形虫的原生动物或以隐球菌(Cryptococus)为例的真菌诱导的免疫逃逸机制，在单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞或其他感染细胞的细胞表面的MHC II类和MHC I类表达可能的增加有益于免疫识别和消除病原体。
[0009] 大环内酯类例如红霉素和阿奇霉素已经常年用于治疗细菌感染。红霉素是通过放线菌糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)的发酵产生的聚酮化合物天然产物大环内酯。阿奇霉素是红霉素的半合成氮杂内酯衍生物。许多参考文献描述了大环内酯类例如红霉素的抗菌活性。这种抗菌机制是通过分子与细菌50S细菌核糖体上的P位点结合来实现的，从而干扰tRNA结合。
[0010] 许多参考文献描述了通过半合成和生物合成工程产生红霉素的类似物。特别是，已经描述了用于半合成去除红霉素、去氧糖胺(desosamine)和碳霉糖(mycarose)/红霉支糖(cladinose)上的糖基的方法。已经描述了用于生物转化以向红霉素糖苷配基添加替代糖基的其他方法(例如参见Gaisser et al.,2000、Schell et al.,2008和WO2001079520)。然而，本文公开的工作的主要焦点是产生抗菌红霉素类似物。
发明内容
[0011] 以前没有报道过缺乏直接抗菌活性的大环内酯类的免疫刺激活性。令人惊讶的是，我们发现本发明的化合物(化合物1，图1)对免疫系统的几种细胞类型具有有效的免疫刺激作用。在用1μM化合物1(图1)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)24-48小时后，CD4 T细胞和B细胞上的激活标记物CD69被上调(图2)。我们还观察到T细胞和B细胞上MHC I类分子(HLA-ABC)的上调(图3)，表明对源自细胞内感染的抗原的抗原呈递的影响。用化合物1刺激PBMC群体中的单核细胞导致共刺激分子CD80以及抗原呈递分子MHC II类(HLA-DR)的上调(图4)。分化成巨噬细胞的单核细胞也响应于化合物1的刺激而上调CD80(图5)。此外，用化合物1刺激的PBMC表达改变的细胞因子谱，其中免疫抑制细胞因子IL-10的产生增加，表明在某些条件下具有免疫抑制作用(图6)。化合物1的免疫学作用的进一步分析显示，用流式细胞术测量，刺激6天后T细胞的细胞因子驱动的增殖谱的改变(图7)。此外，病毒特异性T细胞增殖受化合物1的影响。在CMV抗原和化合物1存在下培养的巨细胞病毒(CMV)感染的供体的PBMC显示出活化的CMV特异性CD8+ T细胞的表型改变，以及IL-7受体α(CD127)表达增加(图8)。CD127对于T细胞稳态、分化和功能至关重要，并且表达降低与HIV和其他慢性病毒性疾病中的疾病严重性相关(Crawley et al Sem Imm 2012)。总之，化合物1具有通过影响抗原呈递、共刺激和T细胞活化和增殖来特异性激活和修饰免疫应答的惊人能力。在许多这些研究中，包括化合物2(先前在Schell et al.2008中作为化合物20公开的另一种相关的具有改变的糖基化的大环内酯红霉素类似物)，因为它在试验中显示很少活性或没有活性。
[0012] 因此，在本发明的一个方面，提供了一种式(I)的免疫刺激大环内酯(也称为化合物1)，其没有如本文所定义的实质抗菌活性：
[0013]
[0015] 在本发明的另一个方面，提供了制备式(I)的化合物的方法，该方法包括将式II的糖苷配基添加到使3-羟基位置糖基化的生物转化菌株的培养物中。
[0016]
[0017] 在本发明的一个优选实施方案中，生物转化菌株表达与AngMII(SEQ ID NO.1)或AngMIII(SEQ ID NO.2)具有70％以上同源性的糖基转移酶，例如具有75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的同源性，例如100％同源性。
[0018] 两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源性由参数“同一性”描述。序列的比对和同源性评分的计算可以使用例如完整的Smith-Waterman比对(可用于蛋白质和DNA比对)完成。分别使用默认评分矩阵BLOSUM50和单位矩阵用于蛋白质和DNA比对。空位中第一个残基的罚分对于蛋白质为-12，对于DNA为-16，而空位中其他残基的罚分对于蛋白质为-2，对于DNA为-4。可以使用FASTA包版本v20u6进行比对。可以使用“ClustalW”进行蛋白质序列的多重比对。可以使用蛋白质比对(protein alignment)作为模板，用来自DNA序列的相应密码子替换氨基酸来进行DNA序列的多重比对。或者，可以使用不同的软件来比对氨基酸序列和DNA序列。两个氨基酸序列的比对通过例如，使用EMBOSS包(http://emboss.org)版本2.8.0中的Needle程序来确定。使用的取代矩阵为BLOSUM62，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5。
[0019] 一般化学方法
[0020] 技术人员将认识到，可以以已知方法以多种方式制备本发明化合物。以下路线仅说明可用于合成式(I)的化合物的一些方法。
[0021] 在一种通用途径中，将红霉素A进行半合成操作以生成阿奇霉素。用于该转化的方法是已知的(US 3 478 014、US 4 328 334、US 4 474 768,Glansdorp et al.,2008)，尽管这些途径的变体或其他途径可用于相同目的。通过进一步的化学方法(例如糖苷切割)去除碳霉糖/红霉支糖和/或去氧糖胺。简而言之，在一种方法中，可以通过用酸处理来去除糖。为了便于去除氨基糖，首先必须氧化二甲胺以形成N-氧化物，然后通过热解将其去除。然后可以通过酸性降解将所得的5-O糖和3-O糖去除。LeMahieu(1974)和Djokic,S.,et al.,(1988)教导了一种合适的方法。最后，使用添加氨基糖的细菌菌株对该化合物进行生物转化。
[0022] 本发明化合物的一般用途
[0023] 本文所述的化合物可用于医药、医学研究或用于此类用途的组合物的制备中。当在下文中术语“本发明化合物”与医学用途或药物组合物一起使用时，该术语还旨在包括式(I)的化合物，条件是这些化合物还不为这种用途所知。
[0024] 设计本发明化合物是为了使直接抗菌作用最小化，但还关注免疫激活特性。当将化合物加入到细菌大肠杆菌(E.coli)、唾液链球菌(S.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、长双歧杆菌(B.longum)或藤黄微球菌(M.luteus)的培养物中时，没有发现抗菌作用或发现最小化的抗菌作用。具有影响宿主细胞的单独的免疫刺激性质的化合物的优点是避免了细菌抗性的发展。此外，避免了大环内酯类药物公知的影响肠道微生物群的副作用，其具有使导致腹泻和假性结肠炎(pseudomebraneous colitis)的梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)过度生长的风险。许多细胞内病原体，例如Mtb以及病毒和癌症已经开发出避免免疫识别的机制，即通过下调HLA表达以避免被T细胞检测。干预化合物的机制依赖于感染细胞上HLA分子的激活和增加的表达。HLA分子加载并呈递源自细胞内感染因子的肽，以呈现T细胞的识别信号，以允许消除受感染的细胞。
[0025] 本文公开的本发明化合物可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染，例如由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causing atypical disease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌
(Mycobacterium avium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)引起的细菌感染；例如由弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和利什曼原虫(Leishmania)引起的原生动物感染；以及由荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)引起的真菌感染。
(Mycobacterium avium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)引起的细菌感染；例如由弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和利什曼原虫(Leishmania)引起的原生动物感染；以及由荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)引起的真菌感染。
[0026] 当这些感染单独发生或与病毒剂或病毒性疾病相关或与原发性或继发性免疫缺陷的其他原因相关时，本发明化合物可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染。原发性免疫缺陷的原因包括遗传性遗传缺陷和体细胞突变，而继发性免疫缺陷可能由例如上述病毒感染引起，或由遗传性或非遗传性疾病如糖尿病或营养不良引起，或由诸如免疫抑制剂的药剂、药物滥用或其他环境因素引起。
[0027] 此外，本文公开的本发明化合物可用于治疗或共同治疗其中免疫应答刺激是有用的疾病、病症、状况和症状，例如治疗感染病毒的患者或患有病毒性疾病的患者，病毒性疾病例如HIV、腺病毒、甲病毒、虫媒病毒、博尔纳病、布尼亚病毒、杯状病毒、尖锐湿疣、冠状病毒、柯萨奇病毒(、巨细胞病毒、登革热病毒、羊传染性脓疱、爱泼斯坦-巴尔病毒、传染性红斑、汉坦病毒、病毒性出血热、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、传染性单核细胞增多症、流感、拉沙热病毒、麻疹、流行性腮腺炎、接触传染性软疣、副粘病毒、白蛉热、多瘤病毒、裂谷热、风疹、慢病病毒、天花、亚急性硬化性全脑炎、肿瘤病毒感染、西尼罗河病毒、黄热病病毒、狂犬病病毒和呼吸道合胞体病毒。
[0028] 此外，预期本发明化合物适用于癌症的联合治疗，尤其是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱、骨癌、脑/中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、巨大淋巴结增生症(Castleman Disease)、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumors)、胃肠道间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、肾癌、喉癌和下咽癌(Laryngeal and Hypopharyngeal Cancer)、急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)、慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia)、慢性粒单核细胞白血病(Chronic Myelomonocytic Leukemia)、肝癌(Liver Cancer)、非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、肺类癌(Lung Carcinoid Tumor)、淋巴瘤(Lymphoma)、恶性间皮细胞瘤(Malignant Mesothelioma)、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、骨髓增生异常综合征
(Myelodysplastic Syndrome)、鼻腔和副鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、神经母细胞瘤(Neuroblastoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、口腔和口咽癌(Oral Cavity and Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、胰腺癌(Pancreatic Cancer)、阴茎癌(Penile Cancer)、垂体瘤(Pituitary Tumors)、前列腺癌(Prostate Cancer)、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(Salivary Gland Cancer)、基底细胞和鳞状细胞皮肤癌(Basal and Squamous Cell Skin Cancer)、黑色素瘤(Melanoma)、梅克尔细胞皮肤癌(Merkel Cell Skin Cancer)、小肠癌(Small Intestine Cancer)、胃癌(Stomach Cancer)、睾丸癌(Testicular Cancer)、胸腺癌(Thymus Cancer)、甲状腺癌(Thyroid Cancer)、子宫肉瘤(Uterine Sarcoma)、阴道癌(Vaginal Cancer)、外阴癌(Vulvar Cancer)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms Tumor)。
(Myelodysplastic Syndrome)、鼻腔和副鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、神经母细胞瘤(Neuroblastoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、口腔和口咽癌(Oral Cavity and Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、胰腺癌(Pancreatic Cancer)、阴茎癌(Penile Cancer)、垂体瘤(Pituitary Tumors)、前列腺癌(Prostate Cancer)、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(Salivary Gland Cancer)、基底细胞和鳞状细胞皮肤癌(Basal and Squamous Cell Skin Cancer)、黑色素瘤(Melanoma)、梅克尔细胞皮肤癌(Merkel Cell Skin Cancer)、小肠癌(Small Intestine Cancer)、胃癌(Stomach Cancer)、睾丸癌(Testicular Cancer)、胸腺癌(Thymus Cancer)、甲状腺癌(Thyroid Cancer)、子宫肉瘤(Uterine Sarcoma)、阴道癌(Vaginal Cancer)、外阴癌(Vulvar Cancer)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms Tumor)。
[0029] 因此，本发明化合物相对于现有技术大环内酯类的有利性质可包括以下一种或多种：
[0030] -降低的直接抗菌活性
[0031] -改善的MHC I类刺激
[0032] -改善的免疫调节
[0033] -改善的抗原呈递细胞的活化
[0034] -改善的T细胞应答
[0035] -改善的抗病毒活性
[0036] -改善的MHC II类抗原呈递
[0037] 包含本发明化合物的药物组合物
[0038] 本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。类似地，本发明还提供了药物试剂盒，其包含至少一种药物组合物，该药物组合物包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。本发明还涉及化妆品或兽医用组合物，其包含本发明化合物和一种或多种化妆品或兽医学上可接受的赋形剂。
[0039] 本发明化合物或包含本发明化合物的药物、化妆品或兽医组合物可以通过任何常规途径给药，例如但不限于肠胃外、口服、局部或通过粘膜(包括口腔、舌下、透皮、阴道、直肠、鼻、眼等)、通过医疗设备(例如支架)、通过吸入给药。在一段时间内治疗可以由单次施用或多次施用组成。
[0040] 本发明化合物和本发明的药物组合物的给药方案可以根据所述化合物或组合物的药物性质而变化。给药方案可以在一个或多个时间段内由单次施用或多次施用组成。根据具体用途、待治疗的疾病和待治疗患者的身体状况和特征(如性别、体重和年龄)，可以每日一次、每日两次、每日三次、每日四次、不太频繁或更频繁地进行施用。也可以通过连续给药(例如通过滴剂或通过贮库的静脉内给药或缓释制剂)来进行治疗。
[0041] 虽然本发明化合物可以像这样给药，但优选将其与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起作为药物组合物提供。在与本发明化合物相容并且对其接受者无害的意义上，赋形剂必须是“可接受的”。合适的赋形剂的实例在下面更详细地描述。
[0042] 药物组合物可以方便地以合适的包括单位剂型在内剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这些方法包括使本发明化合物与一种或多种赋形剂结合的步骤。通常，药物组合物通过将本发明化合物与赋形剂均匀且紧密地结合在一起来制备，然后，如果需要，将所得组合物成型为例如片剂。
[0043] 本发明化合物通常通过任何常规的给药途径给药，例如口服或任何肠胃外途径，以包含本发明化合物的药物组合物的形式给药，任选以药学上可接受的盐的形式，并以药学上可接受的剂型给药。取决于病症和待治疗的患者、以及给药途径，药物组合物可以以不同的剂量和/或频率给药。
[0044] 药物组合物在制造和储存条件下必须是稳定的；因此，如果必要的话，应该保护它们免受微生物如细菌和真菌的污染作用。在液体制剂如溶液、分散液、乳液和悬浮液的情况下，赋形剂可以为溶剂或分散介质，例如但不限于：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油、及其合适的混合物，以及包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和植物油的溶剂或分散介质。
[0046] 适合于口服给药的本发明药物组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的本发明化合物；作为多个单元存在，例如片剂或胶囊形式；作为粉末或颗粒存在；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液存在。药物组合物也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂形式存在。
[0047] 适于口服给药的本发明化合物的溶液或悬浮液还可含有一种或多种溶剂，包括水、醇、多元醇等，以及一种或多种赋形剂，如pH调节剂、稳定剂、表面活性剂、增溶剂、分散剂、防腐剂、香料等。具体实例包括N,N-二甲基乙酰胺、聚山梨醇酯80、聚乙二醇和Phosal 50 PG(由磷脂酰胆碱、大豆脂肪酸、乙醇、甘油单酯/甘油二酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成)。根据本发明的药物组合物还可以为乳液形式，其中根据式(I)的化合物可以存在于乳液中，例如水包油乳液或油包水乳液。油可以为天然或合成油或任何类似油的物质，例如大豆油或红花油或其组合。
[0048] 片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖(例如乳糖一水合物或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、丁基化羟基甲苯(E321)、交联聚维酮、羟丙甲纤维素、崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐、和造粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
[0049] 片剂可以通过压制或模塑本发明化合物以及任选地一种或多种赋形剂来制得。压制片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(如粉末或颗粒)的本发明化合物，任选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂和/或分散剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的本发明粉末化合物的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以进一步加工处理，以使其中的本发明化合物缓慢或受控释放，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线。
[0050] 类似类型的固体药物组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖和高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂，本发明化合物可与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂(例如水、乙醇、丙二醇和甘油)、以及它们的组合混合。
[0051] 适于在口腔中局部给药的本发明药物组合物包括：含有调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)的本发明化合物的锭剂；润喉糖(pastille)，其包括在惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的本发明化合物；和漱口水，其包含在适合的液体载体中的本发明化合物。
[0052] 适于局部给药的本发明药物组合物可以制成膏剂、霜剂、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、浸渍敷料剂、喷雾剂、气雾剂或油剂、透皮装置、扑粉(dusting powder)等。这些组合物可通过含有本发明化合物的常规方法制备。因此，它们还可以包含相容的赋形剂，例如防腐剂、有助于药物渗透的溶剂、霜剂或膏剂中的润肤剂和洗剂中的乙醇或油醇。
赋形剂可以占组合物的约1重量％至约98重量％。优选地，赋形剂可占组合物的约80重量％。仅作为说明，通过将足量的含有约5-10重量％的化合物的亲水性材料和水以足够的量混合，来制备霜剂或膏剂，以产生具有所需稠度的霜剂或膏剂。
赋形剂可以占组合物的约1重量％至约98重量％。优选地，赋形剂可占组合物的约80重量％。仅作为说明，通过将足量的含有约5-10重量％的化合物的亲水性材料和水以足够的量混合，来制备霜剂或膏剂，以产生具有所需稠度的霜剂或膏剂。
[0055] 或者，可以将本发明化合物配制成具有水包油乳膏基质或油包水基质的霜剂。
[0056] 对于肠胃外给药，制备包括本发明化合物和无菌载体的流体单位剂型，该无菌载体例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，优选水。取决于使用的载体和浓度，本发明化合物可以是胶状的、悬浮的或溶解在载体中。在制备溶液时，可将本发明化合物溶解在注射用水中并过滤灭菌，然后装入合适的小瓶或安瓿中并密封。
[0057] 对于肠胃外给药，制备包含本发明化合物和无菌载体的流体单位剂型，所述无菌载体例如但不限于水，醇，多元醇，甘油和植物油，优选水。取决于所用的载体和浓度，本发明的化合物可以是胶体的，悬浮的或溶解在载体中。在制备溶液时，可以将本发明化合物溶解在注射用水中并过滤灭菌，然后装入合适的小瓶或安瓿中并密封。
[0058] 有利地，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的试剂可以溶解在载体中。为了增强稳定性，可以在填充到小瓶中之后冷冻药物组合物，然后可以在真空下去除水。然后将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且可以提供附带的注射用水小瓶，以在使用前重新配制液体。
[0059] 适用于注射用途的本发明药物组合物包括无菌水溶液或分散液。此外，该药物组合物可以是无菌粉末的形式，用于临时制备这种无菌可注射溶液或分散体。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以便于注射。
[0060] 胃肠外悬浮液以与溶液基本相同的方式制备，不同之处在于本发明化合物悬浮在载体中而不是溶解，并且不能通过过滤完成灭菌。本发明化合物可以在悬浮于无菌载体中之前通过暴露于环氧乙烷来灭菌。有利地，药物组合物中包含表面活性剂或润湿剂以促进本发明化合物的均匀分布。
[0061] 应当理解，除了上面特别提到的成分之外，本发明的药物组合物可以包括本领域中常规的与所讨论的制剂类型有关的其他试剂，例如适合口服给药的药物组合物可包括调味剂。本领域技术人员将知道如何选择合适的制剂以及如何制备它(参见在Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,Mack Publishing Company,1990或更新版本的指导下)。本领域技术人员还将知道如何选择合适的给药途径和剂量。
[0062] 本领域技术人员将认识到，本发明化合物的单个剂量的最佳量和间隔将取决于所治疗病症的性质和程度、给药的形式、途径和部位、以及所治疗的特定个体的年龄和状况。并且医生将最终确定要使用的适当剂量。该剂量可以适当地重复进行。如果产生副作用，则可以根据正常的临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。
[0063] 除非上下文另有要求，否则本文提及的所有％值均为重量％。
[0064] 定义
[0065] 本文使用的“一种”、“一个”和“该”是指一(种)或多于一个(种)(即至少一个(种))语法对象。举例来说，“一种类似物”表示一种类似物或多于一种类似物。
[0066] 如本文所用，术语“本发明化合物”是指式(I)的化合物。
[0067] 如本文所用，术语“直接抗菌作用”是指通过与细菌rRNA复合物结合而发生的红霉素和类似物的抗菌活性。该效果不需要任何宿主免疫系统组分的存在，因此在标准抗菌测定中是显而易见的，例如体外最小抑菌浓度(MIC)测定和圆纸片抑制测定。
[0068] 如本文所用，术语“没有实质的抗菌活性”意指当与本文实施例2一起测试其对大肠杆菌、唾液链球菌、干酪乳杆菌和长双歧杆菌的抗菌活性时，本发明化合物的MIC值>64μg/mL。
[0069] 本发明化合物的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机酸或碱形成的常规盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸(steroic)、单宁酸等。其它酸(例如草酸)虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备可用作获得本发明化合物及其药学上可接受的盐的中间体的盐。合适的碱性盐的更具体实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲葡糖胺和普鲁卡因盐。附图说明
[0070] 图1.大环内酯类红霉素A、化合物1、化合物2、化合物3和EM703的结构。
[0071] 图2.T-细胞和B-细胞上的CD69上调。PBMC用化合物1、化合物2和活化对照LPS和IFN-γ处理24小时。用流式细胞术在CD4+ T细胞群(左)和CD19+B细胞群(右)上测量早期活化标记物CD69的表达。值表示一式三份样品中的平均荧光强度、MFI和误差棒标准偏差。
[0072] 图3.T-细胞和B-细胞上的HLA-A,B,C上调。PBMC用化合物1或化合物2以及活化对照LPS和IFN-γ处理24小时。用流式细胞术在CD4+ T细胞群(左)和CD19+B细胞群(右)上测量HLA-A,B,C的表达。值表示一式三份样品中的平均荧光强度、MFI和误差棒标准偏差。
[0073] 图4.血液单核细胞上的CD80和HLA-DR上调。PBMC用化合物1或化合物2以及活化对照LPS和IFN-γ处理24小时。用流式细胞术在单核细胞群上测量CD80和HLA-DR的表达。值表示一式三份样品中的平均荧光强度、MFI和误差棒标准偏差。
[0074] 图5.血液单核细胞上的CD80上调。PBMC用化合物1或化合物2以及活化对照IFN-γ处理24小时。用流式细胞术在单核细胞群上测量CD80的表达。值表示一式三份样品中的平均荧光强度、MFI和误差棒标准偏差。
[0075] 图6.用化合物1刺激48小时或1周后的从PBMC产生IL-10，其用ELISA测量。
[0076] 图7.用化合物1(cpd 1)刺激6天后的CD4T细胞增殖，其用增殖染料Celltrace violet(Invitrogen)和流式细胞术测量。未处理的细胞(UNT)或化合物2(cpd 2)用作对照。
[0077] 图8.用化合物1孵育后的CMV特异性CD8T细胞上IL-7受体α(CD127)的上调，其用流式细胞术测量。
[0078] 图9：在存在或不存在化合物1或化合物2的情况下，用CMV肽生长的PBMC(来自CMV+供体)的干扰素-γ分泌(通过流式微球分析技术(cytometric bead assay)测定)5天。
[0080] 图11：用指定化合物刺激48小时的PBMC或巨噬细胞的趋化因子RANTES分泌(通过流式微球分析技术测定)。
[0081] 图12：用指定化合物刺激48小时的PBMC或巨噬细胞的IL12p70分泌(通过流式微球分析技术测定)。
[0082] 图13：用指定化合物刺激48小时的PBMC、巨噬细胞或CD4T细胞的IL1b分泌(通过流式微球分析技术测量)。
[0083] 图14：先前用指定剂量的化合物1注射24小时的C57bl/6小鼠血液中的％CD25高细胞。通过流式细胞术测量CD25表达。
[0084] 图15：先前用制定化合物注射24小时的3只C57bl/6小鼠脾脏中的％MHC I类高CD11b+细胞。通过流式细胞术测量MHC I类和CD11b表达。
具体实施方式
[0085] 材料
[0086] 除非另有说明，否则以下实施例中使用的所有试剂均来自商业来源。
[0087] 抗体
[0088] 抗CD80V450、抗CD69PE、抗HLA-DR APC-R700、抗CD127-APC和抗-HLA-A,B,C FITC购自BD Biosciences。用于T细胞增殖测定的Celltrace violet购自Invitrogen。ELISA抗体购自BD Biosciences。
[0089] 培养基
[0091] 一般生物学方法
[0092] 可以使用下述一种或多种方法测试本发明化合物对免疫刺激的作用：
[0093] 一般化合物方法
[0094] 化合物分析-溶液中的溶解度和稳定性
[0095] 发酵液和化合物的分析
[0096] 将如下所述得到的等分试样的发酵液与等体积的乙酸乙酯剧烈摇动30分钟，然后离心分离，或将已经分离的化合物溶于甲醇:水(9:1，0.1mg/ml)中，然后离心分离。通过LC-MS和LC-MS/MS分析上清液，并使用在40℃加热的Luna HPLC柱(250×4.6mm；Phenomenex(Macclesfield,英国)，在碱性去活的Luna C18反相二氧化硅(5微米粒径)上实现色谱法。包括四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器的Agilent 1100 HPLC系统与Bruker Esquire离子阱MS连接。
[0097] 流动相A＝0.1％甲酸水溶液
[0098] 流动相B＝0.1％甲酸乙腈溶液
[0099] 梯度：T＝0分钟，B＝50％；T＝4.5分钟，B＝50％；T＝7分钟，B＝100％；T＝10.5分钟，B＝100％；T＝10.75分钟，B＝50％；T＝13分钟，B＝50％。
[0100] 通过LC-MS和LC-MS/MS鉴定化合物，并通过LC-MS/MS对内标物进行定量。
[0101] 通过流式细胞术的标志物表达的分析
[0102] 用Ficoll-Paque密度离心纯化来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)。将细胞在37℃、5％CO2的条件下在补充有25mM HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠(Sigma)、10％胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Hyclone)的完全RPMI-1640培养基(Invitrogen)中培养24-72小时，并用浓度增加的化合物1和化合物2刺激。然后在PBS中洗涤细胞并用对细胞表面标志物(BD Pharmingen)特异的单克隆抗体染色，并使用BD FACS Canto II流式细胞仪，用流式细胞术进行分析。所有样品一式两份进行测试。
[0103] 巨细胞病毒(CMV)培养物
[0104] 用Ficoll-Paque密度离心纯化来自健康CMV阳性供体的人外周血单核细胞(PBMC)。PBMC用5μM celltrace violet(Invitrogen)在PBS中标记15分钟，然后用完全细胞培养基洗涤。标记的PBMC在涵盖(spanning)CMV pp65蛋白(1μg肽/ml，JPT)的肽文库的存在下在37℃、5％CO2的条件下在补充有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠(Sigma)、10％胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Hyclone)的AIM-V培养基(Invitro-gen)中培养6-8天。使用BD FACS Canto II流式细胞仪，用流式细胞术评估细胞增殖。
[0105] ELISA
[0106] 在37℃、5％CO2的条件下在完全RPMI培养基中与2.5μM化合物1和100U/mL IL-2(Miltenyi Biotechnologies)孵育48小时和7天后，用标准夹心ELISA(所有抗体来自BD Biosciences)测量上清液IL-10。
[0107] TLR2测定
[0108] 在Invivogen使用细胞报告试验并使用其标准测定条件，在重组HEK-293-TLR细胞系上一式两份测试样品和对照。这些细胞系在功能上过表达人TLR2蛋白以及作为分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因。该报告基因的产生由NFkB诱导型启动子驱动。。与阴性对照相比，TLR报告细胞系活化结果以光密度值(OD)给出。
[0109] 使用20μL的每种测试物在200μL最终反应体积中刺激hTLR2报告细胞系。使用至少两种测试浓度-20μM和10μM一式两份测试样品。
[0110] 细胞渗透性评估(双向)
[0111] 将10μM测试物添加至Caco-2细胞单层的顶端(A)表面(在37℃下的具有0.3％DMSO和5μM LY的HBSS缓冲液中)，并在孵育90分钟后测量化合物渗透到基底外侧(B)室中。这也是在相反方向(基底到顶端)进行，以研究有效输送。LC-MS/MS用于量化测试化合物和标准对照化合物的水平。通过将B至A的渗透率除以B至A的渗透率来计算流出率。
[0112] 药物渗透性：Papp＝(VA/(面积×时间))×([药物]受体/(([药物]初始，供体)×稀释因子)
[0113] 代谢稳定性评估(微粒体稳定性测定)
[0114] 微粒体中的代谢速率按如下测试：
[0115] 用缓冲液C(0.1M磷酸钾缓冲液，1.0mM EDTA，pH7.4)稀释人肝微粒体至2.5mg/ml的浓度。通过向孔中加入30μL的1.5μM化合物加标(spiking)溶液(将1.5μL的500μM加标溶液(10μL的10mM DMSO原液加入190μL CAN以最终产生1μM的最终测试浓度)和18.75μL的20mg/mL肝微粒体加入479.75μL缓冲液C)进行微粒体稳定性研究。将所有样品在37℃下预孵育约15分钟。此后，通过在温和混合下加入15μL NADPH溶液(6mM)引发反应。在0、5、15、30和45分钟取出等分试样(40μL)并用含有内标(135μL)的ACN淬灭。通过离心(4000rpm，15分钟)去除蛋白，并通过LC-MS/MS分析样品板的化合物浓度。然后通过标准方法计算半衰期，比较分析物的浓度与初始存在的量。
[0116] 实施例
[0117] 实施例1-化合物1的产生
[0118] 生成az-AG
[0119] 使用文献(Djokic,S.,et al.,1988)中描述的方法产生阿奇霉素糖苷配基。简而言之，通过酸性去除3-O和5-O糖将阿奇霉素转化为阿奇霉素糖苷配基。首先将5-O氨基糖氧化并热解以促进裂解。
[0120] 能够糖基化红霉素糖苷配基(红霉内酯)的生物转化菌株的生成：
[0121] 糖多孢红霉菌18A1(pAES52)的产生
[0122] 按如下产生pAES52，其为含有angAI、angAII、angCVI、ang-orf14、angMIII、angB、angMI和angMII以及actII-ORF4 pactI/III表达系统的表达质粒(Rowe et al.,1998)。
[0123] 从由美国标准菌库(American Type Culture Collection)(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)中获得的菌株泛温链霉菌(S.eurythermus)ATCC23956的粘粒文库扩增安哥拉霉素(angolamycin)糖生物合成基因。生物合成基因簇序列保藏为EU038272、EU220288和EU232693(Schell et al.2008)。
[0124] 如先前所述(Schell et al.2008,ESI)将生物合成基因盒组装在载体pSG144中，连续添加基因直至获得糖生物合成所需的8，产生质粒pAES52。
[0125] 将pAES52转化到菌株18A1中(WO2005054265)。
[0126] 将pAES52转化为糖多孢红霉菌18A1
[0127] 使用标准方法通过原生质体将pAES52转化到糖多孢红霉菌18A1中(Kieser et al.2000和Gaisser et al.1997)。所得菌株命名为ISOM-4522，其于2017年1月24日保藏于NCIMB，保藏号为：NCIMB 42718。
[0128] 糖多孢红霉菌SGT2(pAES54)的产生
[0129] 按如下产生pAES54，其为含有angAI、angAII、angCVI、ang-orf14、angMIII、angB、angMI和angMII以及actII-ORF4 pactI/III表达系统的表达质粒(Rowe et al.1998)。
[0130] 从由美国标准菌库(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)中获得的菌株泛温链霉菌(S.eurythermus)ATCC23956的粘粒文库扩增安哥拉霉素糖生物合成基因。生物合成基因簇序列保藏为EU038272、EU220288和EU232693(Schell et al.2008)。
[0131] 如先前所述(Schell et al.2008,ESI)将生物合成基因盒组装在载体pSG144中，连续添加基因直至获得糖生物合成所需的8，产生质粒pAES52。
[0132] 通过连接含有actII-ORF4 pactI/III启动子系统的11,541bp SpeI-NheI片段制备质粒pAES54，用来自pGP9的5,087bp XbaI-SpeI片段从pAES52切下8个ang基因，其含有阿泊拉霉素(apramycin)抗性基因、oriC、用于转移链霉菌的oriT和具有用于整合转化的attP位点的phiBT1整合酶。(在连接期间，兼容的NheI和XbaI位点被去除)。
[0133] 然后将pAES54转化到糖多孢红霉菌SGT2(Gaisser et al.2000,WO2005054265)。
[0134] 将pAES54转化为糖多孢红霉菌SGT2
[0135] 使用标准方法通过缀合将pAES54转化到糖多孢红霉菌SGT2中。简而言之，通过标准程序用pAES54转化大肠杆菌ET12567 pUZ8002，并与阿泊拉霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(33μg/mL)选择物涂布到2TY上。将该板在37℃下孵育过夜。将来自其的菌落用于建立新鲜液体2TY培养物，将其在37℃孵育直至达到后期对数生长期。收获细胞，洗涤，与糖多孢红霉菌SGT2的孢子混合，涂布在R6板上并在28℃孵育。24小时后，将这些板用1mL含有3mg阿泊拉霉素和2.5mg萘啶酸的无菌水覆盖，并在28℃下再孵育5-7天。将该板上的结合后体转移到含有阿泊拉霉素(100μg/mL)的新鲜R6板上。
[0136] 替代生物转化菌株
[0137] 或者，BIOT-2945(Schell et al.2008)可以用作生物转化菌株，因为该菌株也将安哥拉糖胺加入到红霉内酯中。
[0138] 阿奇霉素糖苷配基的生物转化
[0139] 将含有SV2培养基(40mL)和8uL硫链丝菌素(25mg/ml)的锥形烧瓶(250mL)用0.2mL菌株ISOM-4522的孢子原液接种，并在30℃下孵育并以2.5cm幅度(throw)以300rpm振荡48小时。
[0140]
[0141] 制备含有EryPP培养基(7mL)的无菌盖塞离心管(50mL)，并用不含抗生素的种子烧瓶(每个离心管0.5mL)接种培养物。将离心管在30℃下孵育并以2.5cm幅度以300rpm振荡24小时。
[0142] ERYPP介质：
[0143]
[0144]
[0145] 24小时后，将阿奇霉素糖苷配基(在DMSO中的0.5mM，50μL)加入至每个离心管中，并以2.5cm幅度在300rpm下继续培养6天。
[0146] 分离化合物1
[0147] 将全培养液调节至pH 9.5并用一体积当量的乙酸乙酯(EtOAc)萃取两次。离心(3,500rpm，25分钟)后通过抽吸收集有机层。合并有机层并真空浓缩，以得到含有化合物1的棕色胶状物。将该提取物在乙酸乙酯(200ml)和氯化铵水溶液(20ml 50％浓缩溶液)之间分配。分离后，用另外体积(200ml)的氯化铵水溶液萃取有机层。然后用氢氧化钠水溶液将合并的水层调节至pH 9.0，然后用一体积当量的乙酸乙酯萃取两次。合并有机层，并真空浓缩，以得到棕色固体。然后将该提取物加载于二氧化硅柱并用如下物质逐步洗脱(500ml份额)：
[0148]
[0149] 化合物1主要在F和G中。将这些溶剂合并，并真空蒸发，以得到含有化合物1的棕色固体。然后通过制备型HPLC(C18 Gemini NX柱，Phenomenex，使用20mM乙酸铵和乙腈作为溶剂)纯化该物质。合并含有目标化合物的馏分并干燥，然后在C18 SPE柱(cartridge)上脱盐。
[0150] 实施例2-直接抗菌活性的评估
[0151] 使用最小抑菌浓度(MIC)测定评估大环内酯类化合物对4种常见肠道细菌(大肠杆菌(Escherichia coli)、唾液链球菌唾液亚种(Streptococcus salivarius subsp.salivarius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis))和常见的哺乳动物皮肤分离物滕黄微球菌(Micrococcus luteus)的生物活性。除了藤黄微球菌(M.luteus)(其由NCIMB获得，并在-80℃下储存在20％甘油中)外，细菌菌株购自DSMZ(Brunswick,Germany)。
[0152] 将阳性对照(阿奇霉素和红霉素)和测试化合物1和2的原液(100％DMSO)在发酵液中稀释至工作储备浓度为256μg/mL(最终试验测定浓度范围128μg/mL至0.00391μg/mL)。将所有其他化合物的原液在发酵液中稀释至工作储备浓度为128μg/mL(最终试验测定浓度范围为64μg/mL至0.00195μg/mL)。
[0153] 除了在37℃需氧培养的藤黄微球菌外，将细菌菌株在37℃的厌氧室中的适当培养液中培养。将18小时培养物在发酵液中稀释至OD595为0.1，然后以1:10进一步稀释。在96孔板中，一式两份地将200μL试验化合物的工作原液转移到孔1中并在发酵液中连续稀释(1:2)。将100μL细菌悬浮液等分到每个孔中并充分混合。包括适当的无菌对照，并将板在厌氧培养室中在37℃下孵育18小时、或在有氧条件下(藤黄微球菌)在37℃下孵育18小时。MIC被确定为没有可见生长的第一个孔中测试化合物的浓度。
[0154] 表1：
[0155]
[0156]
[0157] 从表1中的数据可以看出，化合物1对任何测试的细菌菌株都没有抗菌活性，而红霉素和阿奇霉素对多种细菌显示出强效活性。
[0158] 实施例3-免疫刺激活性的评估
[0159] 用Ficoll-Paque密度离心纯化来自健康供体人外周血单核细胞(PBMC)。将细胞在补充有25mM HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠(Sigma)、10％胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Hyclone)的完全RPMI-1640培养基(Invitrogen)中培养。将细胞在组织培养板中用浓度增加的化合物1和2在37℃、5％CO2下刺激24小时(研究1-4)或48小时至1周(研究5)。从板中取出细胞，在PBS中洗涤，并使用来自BD Pharmingen的单克隆抗体和FACS Canto II流式细胞仪，用流式细胞术分析细胞特异性表面标志物和MHC I类的表达。
[0160] 在用含有2.5μM化合物1和100U/mL IL-2(Miltenyi Biotechnologies)的完全RPMI培养基，在37℃、5％CO2下的孵育48小时和7天后，用标准夹心ELISA(所有抗体来自BD Biosciences)测量上清液IL-10。
[0161] 研究1：用1μM化合物1(图1)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)24小时后，激活标记物CD69在CD4+ T细胞和B细胞上被上调(图2)。
[0162] 研究2：我们还观察到分子MHC I类(HLA-ABC)在T细胞和B细胞上的上调(图3)，表明对病毒抗原的抗原呈递的影响。
[0163] 研究3：用化合物1刺激PBMC导致共刺激分子CD80以及单核细胞上的抗原呈递分子MHC II类(HLA-DR)的上调(图4)。
[0164] 研究4：分化成巨噬细胞的单核细胞也响应于化合物1的刺激而上调CD80(图5)。
[0165] 研究5：用化合物1刺激48小时和7天的PBMC表达改变的细胞因子谱，并且用夹心ELISA测得免疫抑制细胞因子IL-10的产生增加。这表明在某些条件下具有免疫抑制作用(图6)。
[0166] 研究6：用化合物1刺激PBMC，并在IL-2(Miltenyi Biotechnologies)和Cell Trace Violet Dye(Invi-trogen)的存在下在RPMI培养基中培养6天。用流式细胞术测量增殖。对化合物1的免疫学作用的分析揭示了改变的细胞因子驱动的T细胞增殖谱(图7)。
[0167] 研究7：CMV病毒特异性T细胞增殖也受化合物1的影响。在巨细胞病毒(CMV)抗原和化合物1存在下将来自CMV感染的供体的PBMC培养6天，该PBMC显示出活化的CMV特异性CD8+ T细胞的改变的表型，其中用流式细胞仪测得IL-7受体α(CD127)的表达增加(图8)。CD127对于T细胞稳态、分化和功能至关重要，并且表达降低与HIV和其他慢性病毒性疾病中的疾病严重程度相关(Crawley et al Sem Imm 2012)。
[0168] 可以看出，化合物1具有通过影响抗原呈递、共刺激和T细胞活化和增殖来特异性激活和修饰免疫应答的惊人能力。在许多这些研究中，化合物2是先前在Schell et al.2008中作为化合物20公开的另一种相关的具有改变的糖基化的大环内酯红霉素类似物，并且在测定中显示很少活性或没有活性。
[0169] 研究8：来自CMV感染的供体的PBMC在CMV抗原的存在下培养，其中未处理或暴露于化合物1或化合物2下3天。暴露于化合物1诱导分泌高水平的IFN-γ，而单独的抗原培养物或抗原与化合物2一起培养不诱导IFN-γ分泌(图9)。
[0170] 研究9：来自健康供体的巨噬细胞，其暴露于化合物1或2下48小时。只有暴露于化合物1的巨噬细胞分泌IFN-γ，而未处理的巨噬细胞和暴露于化合物2的巨噬细胞不分泌IFN-γ(图10)。因此，化合物1能够在来自健康供体的巨噬细胞中诱导IFN-γ分泌。
[0171] 研究10：暴露于化合物1或2下2天的PBMC和巨噬细胞(图11)。在PBMC中RANTES的基础表达不受化合物2的影响，而化合物1诱导表达的双重上调。RANTES的表达在巨噬细胞中微乎其微，而化合物1诱导高表达。
[0172] 研究11：暴露于化合物1和2下2天的PBMC和巨噬细胞。PBMC和巨噬细胞响应于化合物1分泌IL-12p70，而化合物2未能诱导超过未处理的细胞的分泌(图12)。
[0173] 研究12：暴露于化合物1和2下2天的PBMC、巨噬细胞和CD4+ T细胞。化合物1增加巨噬细胞中的IL-1β分泌，轻微增加PBMC中的IL-1β分泌，而在CD4+ T细胞中没有诱导IL-1β(图13)。
[0174] 研究13：化合物1以0.165mg/kg至5mg/kg静脉内施用于C57bl/6小鼠。在接受最高剂量5mg/kg的动物中CD25+细胞丰度增加(图14)，同一组中的体重也是如此(未显示)。
[0175] 研究14：化合物1或化合物2静脉内施用于C57bl/6小鼠。24小时后取出脾脏并评估CD11b+脾细胞上的MHC I类表达。化合物1诱导具有高MHC I表达的脾细胞增加，而注射有化合物2的小鼠的脾细胞未观察到任何效果。
[0176] 实施例4-针对TLR2的活性的评估
[0177] 使用测量TLR2受体刺激的TLR2报告分析(参见一般方法)测试化合物。由于分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的释放，测量到刺激效应，其表现为相对于阴性对照光密度(OD)增加，如表2所示：
[0178] 表2
[0179]
[0180] 可以看出，化合物1以低至5uM的浓度刺激TLR2，而红霉素A、阿奇霉素和化合物2和3(先前在Schell et al.2008中作为化合物17和20公开的相关的具有改变的糖基化的大环内酯红霉素类似物)在高达20uM的浓度下显示很少或没有刺激。
[0181] 实施例5-评估caco-2渗透性
[0182] 使用标准caco-2双向渗透性测定法测试化合物(参见一般方法)。生成的数据如表3所示。
[0183] 表3
[0184]
[0185] 从表3中的数据可以看出，化合物1具有更高的细胞渗透性，并且具有比阿奇霉素和EM703(例如参见EP1350510)更低的流出比率。
[0186] 实施例6-代谢稳定性的评估
[0187] 在标准人微粒体稳定性测定中评估本发明化合物的代谢稳定性(参见一般方法)。具有较长半衰期的化合物预计在给药后具有较长的半衰期，这对于允许较低频率的给药是有用的。具有较短半衰期的化合物可用作“软药(soft drugs)”，其中活性实体一旦进入患者体系就迅速降解。评估的化合物的半衰期如下表4所示：
[0188] 表4：
[0189] T1/2(分钟)
阿奇霉素 245
红霉素 31
化合物1 108
EM703 97
阿奇霉素 245
红霉素 31
化合物1 108
EM703 97
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