塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用
阅读：1021发布：2020-09-27
专利汇可以提供塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用。本发明从猪组织中分离，并经传代和噬斑纯化获得一株塞尼卡谷病毒，该分离株能够在传代细胞上稳定增殖，形成典型的细胞病变，且病毒滴度高达108.5～1010.5TCID50/mL。该分离株对仔猪无明显致病 力 。本发明塞尼卡谷病毒分离株具有较好的增殖性能，优异的免疫原性，采用该分离株制备的 疫苗 能够诱导仔猪产生高 水 平的中和 抗体 ，为塞尼卡谷病毒病的有效防控提供强有力的技术支持。，下面是塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用专利的具体信息内容。
1.塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.16396。
2.含有权利要求1所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801的细胞，原始细胞选自BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞，优选BHK-21细胞或PK-15细胞。
3.以权利要求1所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801为免疫原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
4.权利要求3所述特异性抗体的以下任一应用：
1)在制备用于预防和/或控制塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物及组合物中的应用；
2)在制备塞尼卡谷病毒检测试剂及试剂盒中的应用。
5.塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，有效成分为权利要求1所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-
201801。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为活疫苗或灭活苗。
7.根据权利要求5或6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中含有适量保护剂，所述保护剂是由明胶、脱脂乳或水解酪蛋白中的至少一种与适宜浓度蔗糖混合而成；和/或所述疫苗中含有一种或多种非塞尼卡谷病毒或非塞尼卡谷病毒的抗原性物质，且与所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801之间无免疫抑制；所述非塞尼卡谷病毒选自猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒中的至少一种；所述非塞尼卡谷病毒的抗原性物质是指非塞尼卡谷病毒中能够刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。
8.一种分离的塞尼卡谷病毒核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
9.含有权利要求8所述核酸的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或细胞系。
10.权利要求1所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801、权利要求2所述细胞、权利要求8所述核酸或权利要求9所述生物材料在制备塞尼卡谷病毒疫苗中的应用。
塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus,SVV),也被称为A型塞尼卡病毒(Senecavirus A)，属于小RNA病毒科塞尼卡谷病毒属，是一种无囊膜的单股正链RNA病毒。病毒基因组全长约7.2kb，自5’端到3’端依次为5’UTR、一个大的开放阅读框(ORF)、3’UTR以及一段poly(A)。SVV感染猪可引起猪只鼻镜、蹄冠部出现水疱、溃烂甚至死亡，临床症状与口蹄疫、猪水泡病及水泡性口炎极其相似。
[0003] 2002年，塞尼卡谷病毒首次从PER.C6细胞培养物中分离到(SVV-001)，随后，美国、加拿大等国猪场陆续报道有塞尼卡谷病的发生，2014年以后，巴西、美国、中国等几个国家出现塞尼卡谷的爆发，造成了严重的经济损失。近几年，我国多个省份存在塞尼卡谷的流行，然而市场上并没有有效的疫苗，使得该病成为困扰生猪养殖业的重要疾病之一。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801及其应用。
[0005] 为了实现本发明目的，发明人于2018年从某猪场猪组织中分离并经传代和噬斑纯化，获得一株塞尼卡谷病毒，命名为SVV-ZM-201801。该分离株能够在传代细胞(如PK-15或BHK-21等细胞)上稳定增殖，形成典型的细胞病变，且病毒滴度高达108.5～1010.5TCID50/mL。该毒株致病性低，且免疫原性优异，能够诱导仔猪产生高水平中和抗体。该毒株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.16396，保藏日期2018年10月10日。
[0006] 第一方面，本发明提供所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801。
[0007] 第二方面，本发明提供含有所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801的细胞。
[0008] 原始细胞可选自BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞等易感细胞，优选BHK-21细胞或PK-15细胞。
[0009] 第三方面，本发明提供以所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801为免疫原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
[0010] 第四方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：
[0011] 1)在制备用于预防和/或控制塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的药物及组合物中的应用；
[0013] 第五方面，本发明提供一种塞尼卡谷病毒疫苗，有效成分为所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801。
[0014] 本发明所述塞尼卡谷病毒疫苗可以是活疫苗或灭活苗。
[0016] 可选地，所述疫苗中含有一种或多种非塞尼卡谷病毒或非塞尼卡谷病毒的抗原性物质，且与所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801之间无免疫抑制。
[0018] 所述非塞尼卡谷病毒的抗原性物质是指非塞尼卡谷病毒中能够刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。本领域技术人员可以通过本领域熟知的方法获得某种病毒的抗原性物质，例如，可以通过稀释、浓缩或提取等方法获得该病毒的抗原性物质。
[0019] 本发明中，“无免疫抑制”是指所述塞尼卡谷病毒株和非塞尼卡谷病毒株或非塞尼卡谷病毒株的抗原性物质在免疫动物以后不会显著削弱对方的免疫效果。
[0020] 可选地，本发明所述塞尼卡谷病毒疫苗还包含药学上可接受的佐剂。
[0021] 第六方面，本发明提供制备所述塞尼卡谷病毒疫苗的方法。所述方法包括将所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801接种至易感细胞进行培养，收获病毒液并测定毒价。
[0022] 在本发明的一个具体实施方式中，所述疫苗的制备方法如下：将塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801接种PK-15细胞或BHK-21细胞进行传代，收获病毒液，测定毒价，然后按体积比为1:1的比例加入含10％蔗糖和3％明胶的保护剂混匀，经冻干制成。所述活疫苗抗原含量为每头份不低于106.0TCID50。
[0023] 第七方面，本发明提供一种预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒引起的相关疾病的方法，所述方法包括使用本发明所述的塞尼卡谷病毒疫苗。
[0024] 免疫途径为肌肉注射或鼻腔接种，优选地，肌肉注射途径。
[0025] 本发明所述动物为偶蹄类动物，包括但不限于猪、牛或羊。
[0026] 第八方面，本发明提供一种分离的塞尼卡谷病毒核酸，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。即，塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801的全基因组序列。
[0027] 本发明中，“分离的”是指一种物质(例如，多肽或者核酸)与它在自然界中正常存在的环境相分离或存在于与它在自然界中正常存在的环境不同的环境中。
[0029] 第十方面，本发明提供所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801、含有该毒株的细胞、塞尼卡谷病毒核酸或含有所述核酸的生物材料在制备塞尼卡谷病毒疫苗中的应用。
[0030] 在此基础上，利用本发明所述塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801制备的用于防控、诊断塞尼卡谷病毒病的其他生物制品也属于本发明的保护范围。
[0031] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0032] 本发明提供的塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801在易感细胞上增殖快，病毒滴度高，且8.5
该毒株致病力低，用10 TCID50病毒液对断奶仔猪进行鼻腔攻毒，连续观察10天，攻毒仔猪无体温升高和水泡等临床症状，全部存活。以本发明毒株制备的活疫苗，免疫原性好，能够诱导仔猪产生高水平的中和抗体，为塞尼卡谷病毒病的有效防控提供强有力的技术支持。
附图说明
该毒株致病力低，用10 TCID50病毒液对断奶仔猪进行鼻腔攻毒，连续观察10天，攻毒仔猪无体温升高和水泡等临床症状，全部存活。以本发明毒株制备的活疫苗，免疫原性好，能够诱导仔猪产生高水平的中和抗体，为塞尼卡谷病毒病的有效防控提供强有力的技术支持。
附图说明
[0033] 图1为本发明实施例1中塞尼卡谷分离株在PK-15细胞上培养的情况。其中，A为塞尼卡谷在PK-15细胞上的病变(CPE)，B为正常PK-15细胞对照。
[0034] 图2为本发明实施例1中塞尼卡谷分离株在BHK-21细胞上培养。其中，A为塞尼卡谷病毒在BHK-21细胞上的病变(CPE)，B为正常BHK-21细胞对照。
[0035] 图3为本发明实施例1中塞尼卡谷病毒的RT-PCR鉴定结果。其中，1.Trans 2K Plus DNA Marker；2.第3代细胞培养物；3.第5代细胞培养物；4.塞尼卡谷阳性对照；5.阴性对照。
[0036] 图4为本发明实施例2塞尼卡谷分离株SVV-ZM-201801攻毒试验仔猪存活曲线。
具体实施方式
[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0038] 实施例1塞尼卡谷病毒的分离
[0039] 1.组织的采集与处理
[0040] 从某猪场采集猪肺、肝、扁桃体等组织，剪碎，加入10倍体积含青霉素(400U/ml)与链霉素(400μg/ml)的DMEM培养基研磨，4℃，10000rpm离心10min，取研磨液上清，冻于-80℃备用。
[0041] 2.组织病原检测
[0042] 取200μl上述研磨液，用北京全式金生物公司DNA/RNA提取试剂盒，按说明书步骤提取DNA及RNA，然后用全式金反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以提取的DNA和反转录cDNA为模板，分别用口蹄疫(FMDV)猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型/3型(PCV2/PCV3)、流行性腹泻病毒(PEDV)、塞尼卡谷病毒(SVV)、水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病病毒(SVDV)共9对检测引物及全式金2×EasyTaq PCR SuperMix进行PCR检测，同时设置阳性和阴性对照。
[0043] 检测结果显示，病料研磨液为塞尼卡谷病原阳性，其他病原阴性。
[0044] 3.塞尼卡谷病毒分离及噬斑纯化
[0045] 用含8％胎牛血清(FBS)的DMEM将PK-15细胞制成悬液接种于6孔细胞培养板，待细胞长至单层，吸弃培养液，按1：10比例加入上述研磨液，500μl/孔，同时设置正常细胞对照，37℃孵育1小时，吸弃研磨液，加入含2％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，2ml/孔，置于37℃，
5％CO2培养箱培养。2-3天接种细胞出现聚集、圆缩、脱落的病变(图1)，而正常细胞无病变，此时收取细胞培养物。反复冻融3次后，离心取上清，按上述步骤继续盲传5代。对第3代和第
5代盲传产物进行RT-PCR鉴定，按北京全式金DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核酸，按全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录，PCR所用检测引物为：
5％CO2培养箱培养。2-3天接种细胞出现聚集、圆缩、脱落的病变(图1)，而正常细胞无病变，此时收取细胞培养物。反复冻融3次后，离心取上清，按上述步骤继续盲传5代。对第3代和第
5代盲传产物进行RT-PCR鉴定，按北京全式金DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核酸，按全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录，PCR所用检测引物为：
[0046]
[0047] 产物经1％琼脂糖凝胶电泳，出现大小为300bp左右的阳性条带(图3)。结果表明成功分离到塞尼卡谷病毒。
[0048] 对分离到的病毒进行噬斑纯化，将病毒液依次进行10倍梯度稀释，选10-4-10-9稀释度病毒液接种单层BHK-21细胞，37℃孵育1小时，弃掉上清液，加入含2％FBS的MEM与低熔点琼脂混合的培养基中，2ml/孔，待培养基凝固后，倒置放于37℃，5％CO2培养箱，2-3天后出现肉眼可见的白色噬斑，挑取单个噬斑于DMEM培养基中，反复冻融3次后，进行第二次噬斑纯化，最后挑取1号噬斑进行扩大培养得到一株塞尼卡谷病毒，命名为SVV-ZM-201801。
[0049] 将纯化塞尼卡谷病毒接种PK-15细胞及BHK-21细胞进行培养，24-36小时出现典型的细胞病变，如图1和图2所示。待细胞病变达到80％，收获培养物，反复冻融3次，依据Reed&Muench方法测定病毒毒价为108.5～1010.5TCID50/mL。
[0050] 4.塞尼卡谷病毒全基因组序列测定
[0051] (1)塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801基因组RNA提取与cDNA合成
[0052] 取200μl塞尼卡谷第五代病毒液，用全式金EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取病毒基因组，具体操作如下：
[0053] 先加入20μl蛋白酶K于1.5mL无菌离心管；在离心管中加入200μl病毒液；再加入200μl BB5(含5.6μg Carrier RNA),涡旋混合15s，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋混合15s，室温放置5分钟；将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000rpm离心1min，弃掉流出液；加入500μl WB5，12000rpm离心1min，弃掉流出液；重复加入500μl WB5步骤洗涤一次；
室温12000rpm离心1min，彻底去除残留的乙醇；将离心柱转入一个新1.5mL无RNA酶的离心管中，并向离心柱中央加20-50μl无RNA酶水，室温静置1min；室温12000rpm离心1min，洗脱RNA，冻于-80℃备用。
室温12000rpm离心1min，彻底去除残留的乙醇；将离心柱转入一个新1.5mL无RNA酶的离心管中，并向离心柱中央加20-50μl无RNA酶水，室温静置1min；室温12000rpm离心1min，洗脱RNA，冻于-80℃备用。
[0054] 用全式金公司EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix将基因组RNA反转录成cDNA。所述反应体系(20μl)如下：
[0055]
[0056] 轻轻吹打混匀，42℃孵育1h，85℃加热5min，置于冰上或冻于-20℃备用。
[0057] (2)塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801全基因组序列
[0058] 从GenBank下载已公布的塞尼卡谷病毒基因组序列，经过比对分析，选择保守区设计覆盖基因组编码区全长的7对引物(SV1F/R～SV7F/R)及基因组两端非编码区的3条引物(5SV-R1、5SV-R2、3SV-F)，由北京三博远志生物技术有限公司合成。以上述cDNA为模板，用7个引物对(SV1F/R～SV7F/R)扩增基因组编码区,用Takara RACE5’/3’Kit及引物(5SV-R1、5SV-R2、3SV-F)分别扩增5’UTR和3’UTR。所述引物信息如下：
[0059]
[0060]
[0061] 所述PCR反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化目的条带，然后按全式金pEASY-T1Cloning Kit说明书进行TA克隆。
[0062] 反应体系如下：
[0063]
[0064] 轻轻混合，室温(20～25℃)反应5min，转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆送至北京铂尚生物技术有限公司测序。各片段经拼接得到塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801基因组全长序列，如SEQ ID NO:1所示。
[0065] 实施例2塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801致病性实验
[0066] 筛选塞尼卡谷病原及抗体阴性14日龄仔猪10头，随机分为2组，每组5头。试验组为鼻腔攻毒，每头猪分别接种108.5TCID50传代病毒液；对照组每头猪分别鼻腔接种等体积无菌PBS溶液。每日观察猪只状态，测量直肠温度并记录。
[0067] 连续观察10天，试验组和对照组体温均在正常范围内波动，临床症状观察发现，试验组和对照组猪只食欲正常，无水泡出现，且无猪只死亡，全部存活(图4)。以上数据表明，塞尼卡谷病毒分离株SVV-ZM-201801为低毒力毒株，对仔猪无明显致病性。
[0068] 实施例3分离株SVV-ZM-201801在制备塞尼卡谷病毒活疫苗中的应用[0069] 1.塞尼卡谷病毒活疫苗制备
[0070] 将SVV-ZM-201801分离株按MOI＝0.01接种于PK-15细胞或BHK-21细胞单层或悬浮细胞进行连续传代，收获病毒液，反复冻融3次后，离心取上清，测定病毒滴度。无菌及外源病毒检验合格后，与病毒液按体积比为1：1加入含10％蔗糖与3％明胶的保护剂，混匀，经冻干制备成疫苗，每头份病毒含量不低于106.0TCID50。
[0071] 2.疫苗安全性试验
[0072] 选取14日龄左右，塞尼卡谷抗原及抗体均阴性的健康仔猪12头，随机分为4组，每组3头。试验1组肌肉注射10头份疫苗，对照1组肌肉注射等体积无菌PBS溶液；试验2组滴鼻接种10头份疫苗，对照2组滴鼻接种等体积无菌PBS溶液。连续观察21天。结果显示，与对照组相比，试验1组和2组仔猪精神状态、体温及日增重无明显差异，未出现不良反应。
[0073] 3.疫苗有效性试验
[0074] 3.1疫苗免疫效力及攻毒保护试验
[0075] 筛选塞尼卡谷抗原及抗体均阴性的仔猪12头，随机分为4组，每组3头。试验1组肌注1头份活疫苗，对照1组肌注等体积无菌PBS溶液；试验2组滴鼻接种1头份活疫苗，对照2组滴鼻等体积无菌PBS溶液，连续观察28天，于7天、14天、28天采集血液，分离血清，于56℃灭活30min，测定SVV中和抗体。中和抗体检测结果显示(表1)，由本发明毒株SVV-ZM-201801经传代制备的活疫苗免疫后28天能产生高水平中和抗体，具有良好的免疫原性。其中，肌肉注射产生的中和抗体水平更高，是优选的免疫接种途径。
[0076] 表1活疫苗免疫后中和抗体检测结果
[0077]
[0078] 免疫28天后，用亲本组织毒进行攻毒试验，连续观察15天。结果表明，肌肉注射和滴鼻免疫猪只均无水泡等临床症状，达到100％抗体保护(表2)，而对照组3头猪在攻毒第2天口鼻及蹄部开始陆续出现水泡症状。
[0079] 表2免疫猪攻毒后临床症状与保护比例
[0080]
[0081] 3.2疫苗免疫交叉保护试验
[0082] 筛选塞尼卡谷抗原及抗体均阴性的仔猪10头，随机分为2组，分别为免疫组和对照组，免疫组每头猪分别接种1头份活疫苗，对照组接种等体积的无菌PBS溶液，于接种后28天用塞尼卡谷流行毒株CH-FJZZ-2017(Identification and genomic characterization of the emerging Senecavirus A in southeast China,2017,X.Zhang et al,Transbound Emerg Dis.)对免疫组和对照组分别进行攻毒，剂量为108.5TCID50，攻毒途径为肌肉注射。连续观察15日，根据口鼻或蹄部有无水泡判定动物发病情况，发病即为不保护。记录猪只发病情况(表3)。
[0083] 表3塞尼卡谷病毒活疫苗交叉保护效果
[0084]
[0085] 免疫保护试验表明，本发明分离株SVV-ZM-201801制备的疫苗免疫原性好，产生抗体效价高，且能够保护猪只免受异源毒株攻击，为塞尼卡谷病毒病的防控奠定了基础。
[0086] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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