光敏离子透过性分子
阅读：153发布：2020-05-11
专利汇可以提供光敏离子透过性分子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及光敏离子透过性分子。本发明提供多核苷酸和用于在动物细胞中表达光激活蛋白以及通过光刺激改变所述细胞的动作电位的方法。本发明还提供动物细胞和包含表达所述光激活蛋白的细胞的非人动物。，下面是光敏离子透过性分子专利的具体信息内容。
1.一种动物细胞，所述动物细胞包含在细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于蓝隐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。
2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:1中所示序列至少
95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
3.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于杜氏盐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的去极化电流。
4.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:2的残基25-365中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
5.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
6.一种用于制备根据权利要求5所述的细胞的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:3中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
7.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
8.一种用于制备根据权利要求7所述的细胞的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:4中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
9.一种方法，所述方法是：
一种识别动物或组织中的神经细胞之间的跨突触连接的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A中的神经细胞施用编码融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B中的神经细胞施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在；以及c)识别在区域B中表达所述光激活蛋白的神经细胞，其中在所述神经细胞中的光激活蛋白的表达指示所述细胞与区域A中的所述细胞跨突触连接，或
一种产生动物或组织中的靶标神经细胞的光控制的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，并且其中在区域A和区域B中的神经细胞跨突触连接；以及c)用激活所述蛋白的光控制区域B中的神经细胞的动作电位，或
一种控制动物中的神经元的动作电位的方法，所述方法包括用光激活所述神经元中的光激活蛋白以产生动作电位的改变，其中所述神经元中的光激活蛋白的表达通过以下步骤产生：a)对所述动物的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体，b)对含有所述神经元的动物的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，其中在区域A和区域B中的所述神经元跨突触连接。
10.一种动物细胞，所述动物细胞包含表达对蓝光响应的质子泵的整合外源分子，所述外源分子来源于蓝隐藻。
光敏离子透过性分子
[0003] 本专利文件根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2010年3月17日提交的标题为“Light-Sensitive Ion-Passing Molecules”的美国临时专利申请第61/314,969号的权益，此专利文献和基础临时申请中提交的附录均以引用的方式全部并入本文。
[0004] 总览和概述
[0005] 本公开的各个方面整体涉及用于刺激靶细胞的系统和方法，并且更具体地涉及使用光学装置刺激靶细胞。对身体各种细胞的刺激已被用于产生多种有益效果。一种刺激方法涉及使用电极将外部产生的信号引入细胞。基于电极的脑刺激技术面临的一个问题是负责既定精神过程的神经元的分布性质。相反地，不同类型的神经元彼此靠近驻留，使得在进行特定任务时只有在脑部给定区域中的某些细胞被激活。换句话说，不仅异种神经束通过紧密的空间范围平行移动，而且细胞体本身也可以混合、稀疏嵌入的构型存在。这种分配的处理方式似乎违背了要理解CNS内规范顺序的最大努力，并且使神经调节难以实现治疗目的。脑的这种构造为基于电极的刺激带来一个问题，因为电极在其所刺激的神经元的基本生理学方面是相对没有选择性的。相反，电极杆与神经元的物理接近度往往是哪些神经元将被刺激的唯一的最具有决定性的因素。因此，使用电极对单一种类的神经元进行绝对限制性的刺激通常是不可行的。
[0006] 使用电极进行刺激的另一个问题是因为电极布置决定哪些神经元将被刺激，并且机械稳定性经常不足，所以导致电极导线从目标区域迁移。此外，在体内一段时间以后，电极导线经常被胶质细胞包裹，使电极的有效电阻升高，进而使达到靶细胞所需的电功率输送增加。然而，对电压、频率或脉冲宽度的补偿性增加可使电流扩散并且增加对其它细胞的不希望的刺激。
[0007] 另一种刺激方法使用光敏生物分子结构来刺激响应于光的靶细胞。例如，可以使用光激活蛋白控制通过细胞膜的离子流动。通过促进或抑制通过细胞膜的正离子或负离子的流动，可以使细胞暂时去极化、去极化并保持该状态或超极化。神经元是一类使用由去极化产生的电流来产生通信信号(即神经脉冲)的细胞的实例。其它电激发细胞包括骨骼肌、心肌和内分泌细胞。神经元使用迅速去极化以在全身传输信号并且用于达到各种目的，如运动控制(例如肌肉收缩)、感觉响应(例如触觉、听觉和其它感觉)和计算功能(例如脑功能)。因此，细胞去极化的控制可有益于多种不同的目的，包括(但不限于)心理疗法、肌肉控制和感觉功能。
[0008] 本发明的各个方面针对能够抑制神经活动的蓝光感应视蛋白。所述视蛋白来自隐芽植物蓝隐藻(G.theta)。所研究的视蛋白是从蓝隐藻中分离的第三视蛋白，简写为GtR3。当用光照射时，GtR3能够调节超极化电流。对GtR3的作用光谱的表征显示最大吸收是约
490nm，并且GtR3不被黄光激活。
490nm，并且GtR3不被黄光激活。
[0009] 本发明的各个方面涉及能够激发神经活动的蓝光感应光敏感通道。所述光敏感通道来源于杜氏盐藻(Dunaliella salina)。所研究的光敏感通道简写为DChR。DChR可以在哺乳动物神经元中异源表达并且当用蓝光照射时可以调节强的去极化电流。DChR的作用最大值是约500nm。
[0010] 按照本公开的实施方案，通过工程化来源于蓝隐藻的蛋白产生抑制电流流动，所述蛋白通过产生抑制电流来阻止神经元的去极化而对光响应。将所述蛋白递送给目标神经元并且暴露在光下。
[0011] 按照本公开的另一个实施方案，对表达GtR3质子泵的细胞进行光刺激的方法包括对所述细胞提供一系列刺激，各刺激使得在所述细胞中发生去极化事件的可能性增加。对所述细胞提供光以激活GtR3质子泵的表达，从而降低在所述细胞中发生去极化事件的可能性。在某些特定实施方案中，提供的光在蓝光光谱中。
[0012] 按照本公开的另一个实施方案，公开了用于体内控制神经元或其它细胞的动作电位的系统。所述系统包括向所述神经元或细胞引入响应于蓝光的蛋白的递送装置。响应于蓝光的蛋白对蓝光响应而产生抑制电流。所述系统包括产生用于刺激蓝光响应蛋白的光的蓝光源和控制光源产生光的控制装置。
[0013] 按照本公开的另一个实施方案，公开了提供用于哺乳动物表达的光响应蛋白的方法。光响应蛋白从蓝隐藻中分离。所述分离的蛋白具有C末端和N末端。向所述分离的蛋白的C末端添加内质网(ER)输出信号以产生增强的光响应蛋白。将所述增强的蛋白放入空病毒载体中以向目标细胞递送。随后将携带所述增强的蛋白的病毒载体递送给目标细胞。
[0014] 按照本公开的实施方案，提供一种动物细胞。所述动物细胞包括响应蓝光表达质子泵的整合的外源分子。所述外源分子来源于蓝隐藻。在某些实施方案中，所述动物细胞是神经细胞。所述动物细胞还可以是例如肌细胞或细胞系。
[0015] 本公开涉及下述实施方案。
[0016] 1.一种动物细胞，所述动物细胞包含在细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于蓝隐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。
[0017] 2.根据实施方案1所述的动物细胞，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列。
[0018] 3.根据实施方案2所述的动物细胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的内质网(ER)输出信号。
[0019] 4.根据实施方案3所述的动物细胞，其中所述核心氨基酸序列通过接头与所述ER输出信号连接。
[0020] 5.根据实施方案3所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0021] 6.根据实施方案3所述的动物细胞，其中所述蛋白包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列。
[0022] 7.根据实施方案1所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
[0023] 8.根据实施方案1所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
[0024] 9.根据实施方案8所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
[0025] 10.根据实施方案9所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChR1、DChR、SFO和ChR2组成的组。
[0026] 11.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据实施方案1-10中任一项所述的细胞。
[0027] 12.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:1中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
[0028] 13.一种表达载体，所述表达载体包含编码含有与SEQ ID NO:1中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
[0029] 14.根据实施方案13所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
[0030] 15.根据实施方案14所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
[0031] 16.一种使用根据实施方案1-7中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
[0032] 17.一种使用根据实施方案8-10中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
[0033] 18.一种非人动物，所述非人动物包含根据实施方案1-10中任一项所述的细胞。
[0034] 19.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于杜氏盐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的去极化电流。
[0035] 20.根据实施方案19所述的动物细胞，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列。
[0036] 21.根据实施方案20所述的动物细胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的内质网(ER)输出信号。
[0037] 22.根据实施方案21所述的动物细胞，其中所述核心氨基酸序列通过接头与所述ER输出信号连接。
[0038] 23.根据实施方案22所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0039] 24.根据实施方案19所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
[0040] 25.根据实施方案19所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
[0041] 26.根据实施方案25所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的超极化电流的蛋白。
[0042] 27.根据实施方案25所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由NpHR、BR、AR和GtR3组成的组。
[0043] 28.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据实施方案19-27中任一项所述的细胞。
[0044] 29.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:2的残基25-365中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
[0045] 30.一种表达载体，所述表达载体包含编码含有与SEQ ID NO:2的残基25-365中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
[0046] 31.根据实施方案29所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
[0047] 32.根据实施方案30所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
[0048] 33.一种使用根据实施方案19-24中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
[0049] 34.一种使用根据实施方案24-27中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
[0050] 35.一种非人动物，所述非人动物包含根据实施方案19-27中任一项所述的细胞。
[0051] 36.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
[0052] 37.根据实施方案36所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER输出信号和所述膜运输信号。
[0053] 38.根据实施方案36所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜运输信号和所述ER输出信号。
[0054] 39.根据实施方案36所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0055] 40.根据实施方案36所述的动物细胞，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
[0056] 41.根据实施方案36所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
[0057] 42.根据实施方案36所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
[0058] 43.根据实施方案42所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
[0059] 44.根据实施方案42所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChRl、DChR、SFO和ChR2组成的组。
[0060] 45.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据实施方案36-44中任一项所述的细胞。
[0061] 46.一种用于制备根据实施方案36-44中任一项所述的细胞或根据实施方案45所述的细胞群体的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:3中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
[0062] 47.根据实施方案46所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在表达载体中。
[0063] 48.根据实施方案47所述的多核苷酸，其中所述表达载体是病毒载体。
[0064] 49.根据实施方案48所述的多核苷酸，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
[0065] 50.一种使用根据实施方案36-41中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用具有介于约580nm和约630nm之间的波长的光激活所述光激活蛋白。
[0066] 51.一种使用根据实施方案42-44中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
[0067] 52.一种非人动物，所述非人动物包含根据实施方案36-44中任一项所述的细胞。
[0068] 53.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
[0069] 54.根据实施方案53所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER输出信号和所述膜运输信号。
[0070] 55.根据实施方案53所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜运输信号和所述ER输出信号。
[0071] 56.根据实施方案53所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0072] 57.根据实施方案53所述的动物细胞，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
[0073] 58.根据实施方案53所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
[0074] 59.根据实施方案53所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
[0075] 60.根据实施方案59所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
[0076] 61.根据实施方案59所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChR1、DChR、SFO和ChR2组成的组。
[0077] 62.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据实施方案53-61中任一项所述的细胞。
[0078] 63.一种用于制备根据实施方案53-61中任一项所述的细胞或根据实施方案62所述的细胞群体的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO:4中所示序列至少95％相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
[0079] 64.根据实施方案63所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在表达载体中。
[0080] 65.根据实施方案64所述的多核苷酸，其中所述表达载体是病毒载体。
[0081] 66.根据实施方案65所述的多核苷酸，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
[0082] 67.一种使用根据实施方案53-58中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
[0083] 68.一种使用根据实施方案59-61中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
[0084] 69.一种非人动物，所述非人动物包含根据实施方案59-61中任一项所述的细胞。
[0085] 70.一种识别动物或组织中的神经细胞之间的跨突触连接的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A中的神经细胞施用编码融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B中的神经细胞施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在；以及c)识别在区域B中表达所述光激活蛋白的神经细胞，其中在所述神经细胞中的光激活蛋白的表达指示所述细胞与区域A中的所述细胞跨突触连接。
[0086] 71.一种产生动物或组织中的靶标神经细胞的光控制的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，并且其中在区域A和区域B中的神经细胞跨突触连接；以及c)用激活所述蛋白的光控制区域B中的神经细胞的动作电位。
[0087] 72.一种控制动物中的神经元的动作电位的方法，所述方法包括用光激活所述神经元中的光激活蛋白以产生动作电位的改变，其中所述神经元中的光激活蛋白的表达通过以下步骤产生：a)对所述动物的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体，b)对含有所述神经元的动物的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，其中在区域A和区域B中的所述神经元跨突触连接。
[0088] 73.根据实施方案70-72中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是选自由AAV、HSV和慢病毒组成的组的病毒载体。
[0090] 75.一种动物细胞，所述动物细胞包含表达对蓝光响应的质子泵的整合外源分子，所述外源分子来源于蓝隐藻。
[0091] 76.根据实施方案75所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或细胞系。
[0092] 77.根据实施方案75所述的动物细胞，其中所述外源分子含有表3中所示GtR3氨基酸序列。
[0094] 附图简述
[0095] 结合以下附图来考察随后本发明的各种实施方案的详细描述，可以更透彻地理解本发明：
[0096] 图1A展示细胞器膜中的离子泵；
[0097] 图1B展示细胞膜中的离子泵；
[0098] 图2A展示表达光响应蛋白组合的细胞群体；
[0099] 图2B展示用于某些实施方案的刺激模式，其中将两种或两种以上光响应蛋白引入相同的细胞群体；
[0100] 图3展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的系统的框图；
[0101] 图4展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的植入装置的框图；
[0102] 图5展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图；
[0103] 图6A展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图；
[0104] 图6B展示根据本发明的示例实施方案的对应于图6A的框图的电路图；
[0105] 图7A和图7B展示根据本发明的示例实施方案的用于容纳光敏生物分子的筛孔的图形；
[0106] 图8A和图8B展示根据本发明的示例实施方案的病毒基质的图形；
[0108] 图10A、10B和10C展示根据本发明的示例实施方案的用于产生响应于RF信号的光的框图和电路；
[0109] 图11A和图11B各自展示根据本发明的示例实施方案的光纤装置的图形；
[0110] 图12A、12B、12C和12D描绘根据本发明的示例实施方案的在产生光敏生物部分中的各个阶段；以及
[0111] 图13展示根据本发明的示例实施方案的植入装置；
[0112] 图14A和图14B展示根据本发明的示例实施方案的另一个植入装置的图形；
[0113] 图15描绘根据本发明的示例实施方案的具有多个光源的装置；
[0114] 图16展示根据本发明的示例实施方案的用于体内控制一种或多种细胞电性质的系统；
[0115] 图17展示根据本发明的示例实施方案的用于体内控制一种或多种细胞电性质的系统；
[0116] 图18A展示根据本发明的示例实施方案的用于光学药物筛选的系统的框图；
[0117] 图18B展示根据本发明的示例实施方案的用于根据本发明方法筛选药物的大型、准自动化系统的特定系统图；
[0118] 图19展示根据本发明的示例实施方案的根据本发明方法操作的小型、全自动化药物筛选系统的系统图；
[0119] 图20A描绘根据本发明的示例实施方案的发射器/检测器单元的实例的运行；
[0120] 图20B描绘根据本发明的示例实施方案的发射器/检测器单元的另一个实施方案的运行；
[0121] 图21A和21B描绘根据本发明的示例实施方案的用于激活在发射器/检测器单元内使用的LED发射器的电子电路机构；
[0122] 图22展示根据本发明的示例实施方案的示例筛选过程的环境中的一系列事件的时间线；
[0123] 图23示出根据本发明的示例实施方案的在孔板的孔内的细胞和药物样品的布局的实例；以及
[0124] 图24示出根据本发明的示例实施方案的可以在促进高通量药物筛选的较大系统内使用的所公开发明的环境。
[0125] 图25小图D展示在用eNpHR3.0转导的细胞和用eNpHR2.0转导的细胞中显示的代表性光电流迹线及其汇总图线；
[0126] 图25小图E展示在用eNpHR3.0转导的细胞和用eNpHR2.0转导的细胞中显示的代表性超极化电压迹线及其汇总图线；
[0127] 图26小图B展示被WGA-Cre融合激活的跨突触基因的模型。所述该示意图描绘出两个注射位点(一个具有WGA-Cre融合基因，另一个具有Cre依赖性视蛋白病毒)和长范围的投射；Cre可以从转导的细胞中跨突触释放从而只在接收Cre依赖性病毒的突触连接神经元中激活远缘基因表达。
[0128] 图26小图C展示用哺乳动物密码子优化的WGA-Cre和Cre依赖性AAV载体的构建体设计；
[0129] 图27小图A展示630纳米的光在用eNpHR3.0转导的神经元中激起强光电流(代表性的电压钳迹线在左侧)。比较表达eNpHR2.0和eNpHR3.0的神经元的汇总图线(在右侧)；eNpHR2.0，42.7±4.5pA；eNpHR3.0，239.4±28.7pA；未配对的t检验，p＝0.00004；n＝10)。
[0130] 图27小图B展示630纳米光照激起强的超极化(代表性电压钳迹线在左侧)。比较表达eNpHR2.0和eNpHR3.0的神经元的汇总图线(右侧)；eNpHR2.0为15.6±3.2mV，eNpHR3.0为43.3±6.1mV；未配对的t检验，p＝0.00116；n＝10)。
[0131] 图27小图C展示由不同波长的红外线和远红外线边缘照射激起的外向光电流的汇总：630mn，239.4±28.7pA(左侧，n＝10)；660nm，120.5±16.7pA(中间，n＝4)；以及680nm:76.3±9.1pA(右侧，n＝4)。功率密度：3.5mW/mm2(630nm)和7mW/mm2(660nm、680nm)。
[0132] 图27小图D展示用红外线和远红外线边缘光照射抑制了由表达eNpHR3.0的神经元中的电流注入诱导的峰值。典型的电流钳迹线显示在630nm(左上)、660nm(右上)和680nm(下部)的光抑制。功率密度：3.5mW/mm2(630nm)和7mW/mm2(660nm、680nm)。
[0133] 图27小图G展示蓝光(445nm，5ms脉冲)在20Hz(左侧)和10Hz(右侧)激起脉冲，而同时施加黄光(590nm)抑制峰值。
[0134] 图27小图F展示eNPAC、ChR2(H134R)和eNpHR3.0单独的激发光谱；
[0135] 图28小图B展示560纳米的光诱导eBR细胞中的外向光电流，以及在电压钳中的相应样品迹线；
[0136] 图28小图C展示560纳米的光诱导eBR细胞中的超极化，以及在电流钳中的相应样品迹线；
[0137] 图29小图A展示用于使微生物视蛋白基因与后生动物完整系统生物学相匹配的一般的亚细胞靶向策略；
[0138] 图29小图B展示在组织和亚细胞水平的靶向的概括；
[0139] 图30小图A展示当暴露于间隔2.5秒、5秒、10秒和20秒的10秒时长的黄光脉冲对时，在表达eNpHR3.0的细胞中的有效光电流的稳定和恢复；
[0140] 图30小图B展示长期连续光暴露的eNpHR3.0标准化的光电流的时程；
[0141] 图30小图C展示超过10分钟以上的eNpHR3.0的外向电流的稳定；以及
[0142] 图31小图C展示在472nm光下的GtR3功能的样品电流钳和电压钳迹线及汇总图线数据。
[0143] 虽然本发明可具有多种改良和替代形式，但其实施例已在附图中通过举例来展示并且将对其进行详细描述。然而，应理解的是，不希望将本发明限制于所展示和/或描述的特定实施方案。相反，希望覆盖落入本发明的精神和范围之内的所有改良、等价和替代形式。
[0144] 详细描述
[0145] 本发明被认为可用于促进多种光敏生物分子结构的实际应用，并且已经发现本发明特别适于在处理细胞膜电压控制和刺激的装置和方法中使用。虽然本发明不一定局限于这些应用，但通过使用上下文论述各种实施例可以领会本发明的各个方面。
[0146] 如本文所用，靶细胞的刺激通常用于描述细胞性质的改变。例如，刺激靶细胞可引起细胞膜性质的变化，该变化可以导致靶细胞的去极化或极化。在一种特定情况下，所述靶细胞是神经元，并且所述刺激通过促进或抑制神经元产生脉冲来影响脉冲的传输。
[0147] 按照本发明的一个示例实施方案，在细胞中将光响应蛋白工程化。所述蛋白响应于光而影响穿过细胞膜的离子(阴离子、阳离子或质子)流动。离子流中的这种变化在所述细胞的电性质(包括例如流经所述细胞膜的电压和电流)中产生相应的变化。在一种情况下，所述蛋白使用内源性辅因子调节穿过所述细胞膜的离子流而在体内起作用。在另一种情况下，所述蛋白改变穿过所述细胞膜的电压从而阻止或促进所述细胞中的动作电位的触发。在又一种情况下，所述蛋白在引入光的几毫秒内就能够改变所述细胞的电性质。
[0148] 抑制蛋白通过使所述细胞的电位远离细胞的动作电位出发水平来阻止动作电位的触发。在许多神经元中，这意味着所述蛋白增加穿过所述细胞膜所观察到的负电压。在一种特定情况下，所述蛋白作为主动将质子转移出细胞的质子泵。以这种方式，所述蛋白产生穿过所述细胞膜的抑制电流。更具体地讲，所述蛋白通过降低穿过所述细胞的电压对光响应，从而降低发生动作电位或去极化的概率。
[0149] 本发明的某些方面基于起质子泵作用的分子/蛋白的识别和开发。该质子泵来源于隐芽植物蓝隐藻并且已经被开发用于在靶细胞中表达。在某些更特定的实施方案中，所述细胞是神经元。工程化的蛋白(GtR3)通过产生抑制电流来阻止细胞的去极化而对蓝光响应。当在神经细胞中表达时，所述质子泵(GtR3)可以响应蓝光刺激而用于抑制神经活动。GtR3泵通过产生穿过所述神经膜的抑制电流对光刺激响应。当修饰的细胞暴露于(蓝)光时，该电流就抑制动作电位。
[0150] 本公开还提供在细胞中表达的光激活蛋白的修饰，所述修饰通过添加一个或多个增强向哺乳动物细胞质膜转运的氨基酸序列基序来实现。来源于进化上更简单的有机体的光激活蛋白可能不被哺乳动物细胞表达或耐受，或在哺乳动物细胞中以高水平表达时可能显示受损的亚细胞部位。因此，在一些实施方案中，将在细胞中表达的光激活蛋白与选自由信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和N末端高尔基输出信号组成的组的一个或多个氨基酸序列基序融合。可以将一个或多个增强向哺乳动物细胞质膜的光激活蛋白转运的氨基酸序列基序与所述光激活蛋白的N末端、C末端或N末端和C末端两者融合。所述光激活蛋白和一个或多个氨基酸序列基序可以任选由接头间隔。可以增强向细胞质膜的光激活蛋白转运的其它蛋白质基序在美国专利申请第12/041,628号中描述，所述申请全部并入本文。
[0151] 本公开还提供在天然光激活蛋白(例如但不限于天然GtR3、NpHR、DChR和BR)的氨基酸序列中含有氨基酸置换、缺失和插入的光激活蛋白。光激活蛋白包括那些其中一个或多个氨基酸残基已进行氨基酸置换而仍保留对光响应的能力以及控制质膜极化状态的能力的蛋白。例如，可以通过将一种或多种氨基酸置换到所述蛋白的天然或野生型氨基酸序列中来制备光激活蛋白。在一些实施方案中，本发明包括含有与天然氨基酸序列相比氨基酸序列改变的蛋白，其中所述改变的光激活蛋白仍保留特有的光激活性质和/或调节穿过前体蛋白质膜的离子流的能力，但是在一些特定方面可能具有改变的性质(例如，与天然蛋白质相比，对光敏感性的增加或降低、对特定波长的光的敏感性增加或降低和/或调节哺乳动物细胞质膜极化状态的能力增加或降低)。天然蛋白序列中的氨基酸置换可以是保守性或非保守性置换，并且这些置换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码统一编码的。根据其侧链的化学性质，将标准的二十种氨基酸“字母”分成化学家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳基的侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守性氨基酸置换”是其中的氨基酸残基被化学上相似的侧链置换的氨基酸置换(即，用具有碱性侧链的另一种氨基酸置换具有碱性侧链的氨基酸)。“非保守性氨基酸置换”是其中的氨基酸残基被化学上不同的侧链置换的氨基酸置换(即，用具有芳族侧链的氨基酸置换具有碱性侧链的氨基酸)。
[0152] 本发明的某些方面涉及表达GtR3分子的动物细胞。以这种方式，所述动物细胞包括表达响应蓝光的质子泵的整合外源分子。在某些非限制性实施方案中，所述动物细胞可以是神经细胞、肌细胞、杆状或锥状细胞或细胞系。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。
[0153] 本文中提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光敏感并且来源于蓝隐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约450nm和495nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约490nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。
[0154] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、
10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0155] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和信号肽(例如，增强向质膜转运的信号肽)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。
[0156] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。
[0157] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、
175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
[0158] 本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的分离的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。本文中还提供包含编码本文中描述的任何蛋白的表达载体(如本文中描述的病毒载体)，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。
[0159] 本文中提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于杜氏盐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约450nm和495nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约490nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-
365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-
365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-
365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-
365或1-365中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留去极化响应于光的神经细胞质膜的能力。
365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-
365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-
365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-
365或1-365中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留去极化响应于光的神经细胞质膜的能力。
[0160] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可融合到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、
275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可融合到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、
275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0161] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和信号肽(例如，增强向质膜转运的信号肽)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、
275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和信号肽(例如，增强向质膜转运的信号肽)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、
275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。
[0162] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、
250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、
250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。
[0163] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、
20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。
在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、
20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。
在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
[0164] 本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的分离的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-
365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。
365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。
[0165] 本文中还提供包含编码本文中描述的任何蛋白的表达载体(如本文中描述的病毒载体)，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。
365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或1-365中所示序列至少90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。
[0166] 本文中提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对黄光以及红光响应并且来源于法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约580nm和630nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约589nm的波长。在一些实施方案中，所述光具有大于约630nm(例如小于740nm)的波长。在一些实施方案中，所述光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。
[0167] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、
10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0168] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。
[0169] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、
20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。
在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。
在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
[0170] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3的N末端信号肽缺失或被置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:3的残基40-291、39-
291、38-291、37-291、36-291、35-291、34-291、33-291、32-291、31-291、30-291、29-291、28-
291、27-291、26-291、25-291、24-291、23-291、22-291、21-291、20-291、19-291、18-291、17-
291、16-291、15-291、14-291、13-291、13-291、12-291、10-291、10-291、9-291、8-291、7-
291、6-291、5-291、4-291、3-291、2-291或1-291中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和膜运输信号。
291、38-291、37-291、36-291、35-291、34-291、33-291、32-291、31-291、30-291、29-291、28-
291、27-291、26-291、25-291、24-291、23-291、22-291、21-291、20-291、19-291、18-291、17-
291、16-291、15-291、14-291、13-291、13-291、12-291、10-291、10-291、9-291、8-291、7-
291、6-291、5-291、4-291、3-291、2-291或1-291中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和膜运输信号。
[0171] 本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。所述多核苷酸可以在表达载体(如本文中描述的病毒载体)中。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。
[0172] 本文中提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对绿光敏感并且来源于极端嗜盐古菌(Halobacterium salinarum)，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约520nm和570nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约560nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。
[0173] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可以到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有
5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。
[0174] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N Y。
[0175] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、
50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。
[0176] 本文中还提供一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4的N末端信号肽缺失或被置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO:4的残基40-262、39-
262、38-262、37-262、36-262、35-262、34-262、33-262、32-262、31-262、30-262、29-262、28-
262、27-262、26-262、25-262、24-262、23-262、22-262、21-262、20-262、19-262、18-262、17-
262、16-262、15-262、14-262、13-262、13-262、12-262、10-262、10-262、9-262、8-262、7-
262、6-262、5-262、4-262、3-262、2-262或1-262中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和/或膜运输信号。
262、38-262、37-262、36-262、35-262、34-262、33-262、32-262、31-262、30-262、29-262、28-
262、27-262、26-262、25-262、24-262、23-262、22-262、21-262、20-262、19-262、18-262、17-
262、16-262、15-262、14-262、13-262、13-262、12-262、10-262、10-262、9-262、8-262、7-
262、6-262、5-262、4-262、3-262、2-262或1-262中所示序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和/或膜运输信号。
[0177] 本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。所述多核苷酸可以在表达载体(如本文中描述的病毒载体)中。所述多核苷酸可以用于在动物细胞中表达光激活蛋白。
[0178] 在某些更特定的实施方案中，提供一种提供用于哺乳动物表达的光响应蛋白的方法。光响应蛋白是从蓝隐藻(GtR3)中分离的。GtR3具有C末端和N末端。GtR3的C末端加入了启动子。在某些实施方案中，所述启动子是内质网(ER)输出信号。关于优化在哺乳动物细胞中表达的GtR3的更多说明，参见在所述基础临时申请且标题为“Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics”中提交的附录A。
[0179] 激发蛋白通过使细胞的电位向所述细胞的动作电位触发水平移动来促进动作电位的触发。在许多神经元中，这意味着所述蛋白降低穿过所述细胞膜所观察到的负电压。在一种特定的情况下，所述蛋白作用于将阳离子转移到细胞中的另外的离子通道。以这种方式，所述蛋白产生穿过所述细胞膜的激发电流。更具体地讲，所述蛋白通过升高穿过所述细胞的电压对光响应，从而增加发生动作电位或去极化的可能性。在某些情况下，可以将穿过细胞膜的电压增加到动作电位出发水平或更高，从而引起所述细胞的去极化。
[0180] 本发明的某些方面基于来源于杜氏盐藻的通道(DChR)的识别和开发。当用蓝光照射时，光敏感通道DChR调节强的去极化电流。所述去极化电流可能使细胞响应于蓝光照射而激发。在某些实施方案中，DChR在目标细胞中被表达为外源蛋白。对于神经细胞，当递送给目标细胞时，DChR可以起利用内源性辅因子的激发蛋白的作用。
[0181] 向光遗传学领域引入GtR3和DChR为多种应用提供了可能。例如，GtR3和DChR可以与其它光遗传学离子透过性分子如ChR2(从莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中开发)组合使用。GtR3和DChR相对于其它光响应分子具有不同的操作参数。这促进了对不同波长的光具有精确调整的响应的细胞或细胞群体的发展。可以调整的参数包括但不限于电流密度、超极化水平、膜电导、刺激频率、静息电位、光波长和/或光强度。
[0182] 在另一个示例实施方案中，用于控制神经元的动作电位的方法包括以下步骤：在所述神经元中工程化第一光响应蛋白；在所述神经元中且从第一光响应蛋白响应于光产生抑制电流；在所述神经元中工程化第二光响应蛋白；以及在所述神经元中从第二光响应蛋白响应于光产生激发电流。第一光响应蛋白和第二光响应蛋白可以对不同波长的光响应。在某些情况下，使用DChR或GtR3可以促进该激发或抑制电流的特定的电流密度和/或产生该电流的光波长。
[0183] 在另一个示例实施方案中，用于控制神经元的动作电位的方法包括以下步骤：在所述神经元中工程化第一光响应蛋白；在所述神经元中且从第一光响应蛋白响应于光产生抑制电流；在所述神经元中工程化第二光响应蛋白；以及从第二光响应蛋白响应于光产生第二抑制电流，所述两个电流的组合比单个光响应蛋白更强地抑制所述神经元。例如，第一光响应蛋白可以是NpHR且第二光响应蛋白可以是GtR3。
[0184] 用于控制穿过细胞的细胞膜的电压水平的另一种方法包括测量所述细胞膜的电压水平。工程化光响应蛋白且将所述光响应蛋白引入所述细胞中，并且在其中表达。提供特定波长的光，所述光通过所述光响应蛋白在所述细胞中产生反应。所述光响应蛋白的响应产生穿过所述细胞膜的电流。所述电流对测量的电压水平响应。
[0185] 本发明的另一个方面涉及用于在体内控制神经元的动作电位的系统。所述系统包括递送装置、光源和控制装置。所述递送装置将光响应蛋白引入所述神经元中，所述光响应蛋白产生抑制电流。光源产生刺激光响应蛋白的光，控制装置控制光源产生的光。在其他实施方案中，被引入神经元的光响应蛋白产生激发电流。
[0186] 在更详细地实施方案中，将所述系统进一步修改以使得递送装置通过转染、转导和显微注射之一引入光响应蛋白，和/或从而使光源通过植入光发生器和光纤之一将光引入神经元。关于基因递送和表达方法的其它细节，参见PCT公布第WO2010/019619A1号(PCT/US2009/053474)，标题为“Method and Composition for Controlling Gene Expression”，将其以引用的方式全部并入本文。
[0187] 本公开的另一个方面涉及用于治疗病症的方法。所述方法靶向与所述病症相关的一组神经元；并且在该组中，所述方法包括工程化抑制蛋白以响应于光，通过产生抑制电流阻止神经元的去极化，并且将所述神经元暴露于光下，从而阻止所述神经元的去极化。
[0188] 本公开的又一个方面针对用于治疗病症的又一种方法。所述方法靶向与所述病症相关的一组神经元；并且在该组中，所述方法包括工程化激发蛋白以响应于光，通过产生激发电流促进神经元的去极化，并且将所述神经元暴露于光下，从而促进所述神经元的去极化。在本发明的其它方面中，将抑制蛋白和激发蛋白(响应于不同波长的光)两者引入目标神经元组。所述神经元被交替地暴露于不同波长的光进行激发，并且抑制所述神经元的去极化。
[0189] 更详细的实施方案详细地说明这些技术。例如，本发明的另一个方面在物种(例如小鼠和秀丽隐杆线虫(C.elegans))中共表达具有其它已知视蛋白的GtR3和DChR，如NpHR和VChRl。此外，产生反极化电流并且具有不同颜色敏感性的视蛋白在灵敏的哺乳动物大脑切片中与钙成像整合以用于双向光调制和神经活动的读取。同样地，可以将耦合的视蛋白靶向秀丽隐杆线虫肌肉和胆碱能运动神经元以双向控制移动。可以将共同耦合的视蛋白用作带电神经回路的多模式、高速、基因靶向、全光探查(all-optical interrogation)的完全和互补的光遗传学系统。此外，可以用不同的视蛋白耦合靶向一组以上细胞，允许精确控制多组相互独立的细胞。
[0190] 除了GtR3和DChR之外，还有可以工程化以光学调节离子流或在细胞内的第二信使的若干光敏感通道、氯视紫红质蛋白和微生物视蛋白。本发明的各种实施方案包括优化、突变、截短的密码子、融合蛋白、靶向型或此外这些离子光学调节剂的改进型。例如，GtR3和DChR(例如在所述基础临时申请中提交的附录B和C)。提到的视蛋白作为若干不同实施方案的代表使用。除非规定，否则不希望特定地识别GtR3和DChR的论述将本发明限制于光学调节剂的这些特定的实例。关于上述序列的更多细节，可以参考Feng Zhang等Nature(2007年4月5日)446卷：633-639的“Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry”，将其以引用的方式全部并入本文。
[0191] 表1展示用于横跨可见光谱抑制细胞活动的识别的视蛋白：
[0192]
[0193] 表2展示用于横跨可见光谱激发和调节的识别的视蛋白：
[0194]
[0195]
[0196] 视蛋白描述于美国专利申请第12/988,567号和第12/996,753号，美国专利申请公开号：2007/0054319、2010/0234273、2007/0261127、2007/0053996、2010/0145418、2009/0093403、2008/0085265、2010/0190229、2009/0099038和PCT公布第PCT/US09/64355号均以引用的方式整体并入本文。
[0197] 在本发明的某些实施方案中，将列举的视蛋白的各种组合例如递送给细胞群体。可以对不同细胞群体递送第二组合。例如，使用各种视蛋白的确定的作用和波长敏感性信息，可以选择视蛋白的组合来激发某些细胞群体而同时抑制其它细胞群体。
[0198] 按照本发明的一个示例实施方案，使用植入装置刺激靶细胞。所述植入装置包括促进响应于光接收的靶细胞的刺激的生物部分。所述植入装置还包括用于产生光以激发靶细胞刺激的光发生器。在某些实施方案中，所述植入装置包括微控制器和反馈环路。由光发生器产生的光的颜色取决于细胞的电压。靶细胞可以包括响应于不同波长的光的多种光敏蛋白以抑制或促进靶细胞的去极化。
[0199] 按照本发明的另一个示例实施方案，使用能够诱导光敏离子通道生长(例如DChR离子通道)或光敏离子泵(例如GtR3质子泵)进行体内刺激靶细胞的方法。将所述载体连同所述装置的电子组件一起植入体内。在靠近靶细胞处植入产生光的装置。响应于光产生装置产生的光而刺激靶细胞。在某些更特定的实施方案中，基因转移载体能够诱导多于一个离子通道或离子泵的生长。
[0200] 按照本发明的一个特定实施方案，将蛋白引入一个或多个靶细胞。当被引入细胞时，所述蛋白改变响应于具有一定频率的光的细胞的电位。这可引起可以用于控制(阻止)动作电位触发的静息电位的改变。在一个特定的实例中，所述蛋白是GtR3，它作为用于转移穿过响应于光的细胞膜的电荷的膜泵。膜泵是使用用于转移穿过所述膜的离子的电磁或化学键能的能量转换器。在其它特定的实例中，所述蛋白是作为膜泵起作用的氯视紫红质蛋白。所述氯视紫红质蛋白膜泵移动穿过所述膜的特定离子。关于氯视紫红质蛋白膜泵的其它信息，可以参考Brigitte Schobert等的“Halorhodopsin Is a Light-driven Chloride Pump”，The Journal of Biological Chemistry，第257卷，第17期，1982年9月10日，第10306-10313页，将其以引用的方式全部并入本文。
[0201] 在特定的实施方案中，可以将GtR3和NpHR分别引入不同靶细胞群体。所述两种抑制剂对不同波长的光响应，允许使用所述两种蛋白独立地抑制不同靶细胞群体。还可以将GtR3和NpHR引入相同的细胞群体，以梯度地控制细胞群体的抑制。例如，可以相对彼此独立地激活在相同细胞内的GtR3和NpHR分子。因此，第一水平的抑制可以通过激活为所述细胞条件提供最低的电流水平的分子类型(GtR3或NpHR)进行。下一个水平可以通过减活该第一分子类型和激活其它分子类型进行。第三水平可以通过同时激活两种分子进行。例如，其它梯度控制可以通过改变光的波长实现，或通过改变处于或接近各蛋白的最大值的光强度实现。
[0202] 多种抑制剂的组合还可以导致分流抑制，这与超极化抑制组合比使用单个抑制剂蛋白可以在所述组合方法中导致更强的超极化。在细胞膜中，离子的逆转电位(也称为能斯特电位)是没有从膜的一侧向另一侧的净(总)离子流时的膜电位。各种类型离子通道均具有特定的逆转电位。在能斯特电位时，离子向外和向内的运动速率是相同的(对于所述离子类型来说离子流处于平衡)。在所述能斯特电位的任何一侧的膜电位的变化均使离子流的总方向逆转。如果离子通道的逆转电位低于细胞膜的静息电位(或瞬间电位，在光响应蛋白离子通道被刺激并且改变了“静息”电位的情况下)，离子通道将通过细胞的超极化促进抑制。相反，如果离子通道的逆转电位介于静息电位和动作电位产生的阈值之间，那么离子通- +道将具有分流效应。任何给定离子(例如C1 )的浓度梯度部分地由另一种离子(例如Na 和K+)的活动之间的差额决定。分流抑制之所以称为“分流”是因为在相邻的激发通道产生的通道电导短路电流。因此，增加具有抑制特性的光响应蛋白通道可以将膜电位降低至现有离子通道逆转方向并且“分流”电流的点，产生阻止膜电位达到动作电位的其它路径。
[0203] 本文中提供细胞群体、组织和非人动物，它们在细胞膜上包含表达本文中描述的一种或多种光激活蛋白的细胞。还提供使用所述细胞、细胞群体、组织和非人动物的方法。
[0204] 图案1A展示细胞膜160中的光响应离子透过性分子(泵或通道)150。一般来讲，离子通道允许朝向所述通道的逆转电位(或通道的平衡电位)的流动；所述方向基于膜电位是否高于或低于通道的逆转电位。离子通道不需要额外的能量来转运离子。离子泵逆平衡流动转运离子并且需要引入某种形式的能量(如ATP)来转运离子穿过膜。离子162可以是阴离子或阳离子。氢离子是质子(也是阳离子)。离子沿着离子极化流动的方向将决定离子透过性分子是否对细胞具有超极化作用或去极化作用。在某些实施方案中，离子透过性分子150将质子转运出细胞，引起细胞的超极化和细胞触发的抑制。除非存在适当频率的光，否则光响应离子通道/泵150不会开放/激活。
[0205] 图案1B展示本发明的替代实施方案，其中光响应离子透过性分子150在细胞内的膜内表达。细胞的许多内部组成部分具有类似包围细胞的细胞膜的膜。在引入光响应蛋白之前，细胞器152的膜含有天然离子泵/通道。取决于连同外源光响应蛋白一起引入的启动子，光响应蛋白可以在各种不同细胞器的膜中、在细胞膜中或不同细胞器和/或细胞膜的组合中表达为离子泵/通道。在某些实施方案中，光响应离子透过性分子150是质子泵。在其他实施方案中，所述泵可以是对于特定的阳离子或特定的阴离子的泵/通道。离子泵/通道150位于细胞器的膜156。
[0206] 将质子转移穿过离子透过性分子在其中表达的膜可以用于改变膜156和膜160之一或两者的膜电位。将质子转运出细胞质可能引起细胞超极化，从而产生细胞的抑制。
[0207] 在某些情况下，可以使用泵/通道150来改变细胞器152和细胞质154周围的pH。此外，可以改变和/或控制细胞器(其中表达蛋白)的pH。因为细胞内的大多数酶对pH敏感，所以各种细胞器的pH重要地决定沿内吞和分泌途径发生的协调的生物化学反应。正常细胞器pH稳态的异常可能导致显著的功能变化。取决于光响应蛋白表达的水平和位置(即何种细胞器)，细胞的各种功能可能增强或阻滞。在足够高的表达水平细胞可能被杀死。这在不希望有的(即癌症)细胞中可能是希望的。例如，可以在癌肿瘤位置局部地转染细胞并且随后可以使用小心引导的光脉冲缩小或消除肿瘤。
[0208] 图案2A展示使用光响应蛋白的两个实例，每个实例包括三种细胞群体，A、B和C。如以上简要论述的，可以将两种或两种以上光响应蛋白引入相同的细胞群体。当被激活时，引入的光响应蛋白可以引起相同或不同的响应。不同蛋白还可以具有不同反应时间或反应强度。可以同时激活相同极化的两种蛋白，引起加合效应。例如，可以交替地刺激两种去极化蛋白。这可以允许触发频率的增加。在实施例1中，细胞群体A和B表达相同抑制蛋白，而不同的激发蛋白。细胞群体C具有对与细胞群体A和B的抑制蛋白约相同波长的光有反应。细胞群体C的抑制剂对类似于细胞群体A的激发蛋白的波长有反应。这种结构允许各种细胞群体组合对提供刺激细胞群体的光反应。当建立实施例1时，可以激发细胞群体B而不激发或抑制其它两个群体的任何一个。然而，细胞群体A和C以几乎相反的方式对提供的光反应。
[0209] 实施例2包括具有三种光响应蛋白的细胞群体A和具有两种光响应蛋白的细胞群体B和C。细胞群体A包括对不同波长的光有反应的两种激发蛋白和一种抑制蛋白。细胞群体B和C各具有细胞群体A的激发蛋白之一和抑制蛋白，所述抑制蛋白对与存在于其它细胞群体(B或C)中的激发蛋白相同光谱中的波长响应。这种结构允许细胞群体A和B的组合被激发，或细胞群体B和C被激发，而第三细胞群体被抑制。它允许细胞群体A被抑制而不影响细胞群体B或C的任何一个，并且允许细胞群体A被激发而同时抑制细胞群体B和C两者。图2A的示例组合不旨在进行限制，而是举例说明在两个单细胞群体中的光响应蛋白的许多组合中的一些和穿过细胞群体的组合。
[0210] 按照本发明另一个示例实施方案，靶细胞是位于哺乳动物脑部的神经元。靶细胞被基因修饰以表达光敏生物分子结构，例如DChR离子通道。随后可以使用光刺激神经元。取决于若干因素，如在脑部内的位置和刺激的频率和长度，可以实现不同的目的。例如，深度脑部刺激(DBS)的当前技术使用电极直接对脑部的目标区域施加电流。电刺激的频率有时称为低频率DBS或高频率DBS。研究表明，高频率DBS抑制脉冲从被刺激的细胞的产生，而低频率DBS促进脉冲从被刺激的细胞的产生。还显示产生低频率DBS的高频率的作用的频率取决于被刺激的脑部特定面积而变化。根据高频率DBS的一个实例，使用以约100Hz或更高频率提供电流脉冲的电极刺激神经元。已经证明该频率在某些应用中是有效的，如本文中进一步论述。
[0211] 在各种细胞群体(类似于图2A中说明的那些)中，可能存在两种或两种以上光响应蛋白。所述两种或两种以上光响应蛋白的一些(或全部)可以在细胞群体内针对相同的作用(即激发或抑制)。例如实施例2的细胞群体A包括两种激发光响应蛋白，DChR和VChR1。图2B展示与某些实施方案使用的刺激模式，在这些实施方案中可以将两种或两种以上类型的光响应蛋白(例如DChR和VChR1)引入相同的细胞群体。各种离子透过性分子具有相应的刺激频率限制，这可能部分上响应于环境因素如pH。该限制反映了分子在激活和非激活状态之间转变所需的恢复时间。使用两种类型的光响应蛋白(各响应于不同光波长)可以允许分别地控制各种类型的蛋白。可以交替地激活相应的离子通道，允许脑部刺激的频率增加。
[0212] 例如，实施例3展示第一波长的光脉冲(实竖线)并且在频率F提供。选择该波长激活第一类型的分子(三角形)。还可以频率F提供第二波长的第二套光脉冲(虚竖线)。可以使用该第二套光脉冲激活第二类型的分子(正方形)。因此所得的对于两种细胞的激活频率是各单个离子透过性分子的激活频率的两倍。当然，两种类型的分子之间的频率没有必要相同并且可以随时间变化。
[0213] 在另一个方案(在实施例4中展示)中，可以将第一类型的离子透过性分子激活一段时间，随后激活第二类型的离子透过性分子。这对于允许各种所述离子透过性分子在其它离子透过性分子正在被激活期间的时间段被去活化可能是特别有用的。在某些情况下，这可以促进离子透过性分子的恢复和持续的使用。此外，当决定产生希望的响应的特定的刺激模式时，可以考虑不同的电流类型、密度和离子透过能力。
[0214] DBS的一个特定实例是用于治疗帕金森氏病(Parkinson’s disease)。在该应用中，经常对在患者脑部内的苍白球内侧部或丘脑底核施加DBS。通过植入修饰细胞对光响应的生物结构，可以使用闪光灯(light flashing light)代替电极。因此，靶标神经元细胞和外部电信号没有必要对靶细胞直接施加。此外，光与电比往往从其起点传播得更远，从而增加相对于刺激源的有效面积并且只有光敏感化神经元被刺激。
[0215] 如同基于电极的DBS方法一样，本发明的一个实施方案可以使用高频率DBS进行以抑制神经元产生的脉冲。虽然已经在约100Hz的频率实现高频率DBS，但是使用本发明的各种实施方案的高频率DBS可能不一定需要相同的频率。例如，当使用光激活技术时，可在较低频率(例如50Hz)再现高频率DBS的抑制作用。例如，GtR3泵的激活本质上有利于超极化和对动作电位产生的反抗。取决于特定的应用(例如，脑部的目标部分和希望的作用)和施加的刺激形式，并且可以施加各种频率。
[0216] 按照本发明的另一个示例实施方案，使用诱导光敏生物分子表达的基因转移载体靶向特定类型的细胞。例如，可以产生基于病毒的蛋白(例如慢病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒)以靶向特定类型的细胞，取决于它们独特地表达的蛋白。随后用基于病毒的基因转移蛋白感染靶细胞，并且开始产生新类型的离子通道(例如DChR)，从而变成光敏的。这对于刺激靶细胞而不刺激接近靶细胞的其它细胞是特别有用的。例如，不同长度、直径、时值、其它膜性质、电绝缘性、神经递质输出和总体功能的神经元彼此紧密安置，因此当使用电极提供神经元的刺激时，可能对其产生无意的刺激。关于病毒载体的产生和神经细胞的体内修饰和刺激的更多细节，可参考2006年7月24日提交的美国专利申请第11/459,636号，Alexander M.Aravanis等“An optical neural interface:in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiber optic and optogenetic technology”，Journal Neural Engineering 4(2007)S143-S156,Antoine R.Adamantidis等“Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons”，Nature(2007年11月15日)第450卷：420-424,Viviana Gradinaru等“Targeting and Readout Strategies for Fast Optical Neural Control In Vitro and In Vivo”，The Journal of Neuroscience,(2007年12月26日)27(52):14231-1423 8,Feng Zhang等“Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry”，Nature(2007年4月5日)第446卷：633-639,Feng Zhang等“Circuit-breakers:optical technologies for probing neural signals and systems”，Nature Reviews Neuroscience(2007年8月)，第8卷：577-581，所述文献各以引用的方式全部并入本文。
[0217] 本发明的一个特定实施方案采用供体内使用的植入结构。其包括用于产生光的发光二极管、激光或类似的光源(例如，如图3中的光发生器104所示)。生物部分修饰靶细胞使其包括促进响应于由光源产生的光的靶细胞的刺激光响应分子。
[0218] 本发明的另一个实施方案采用一种布置来刺激靶细胞，所述布置使用允许靶细胞响应于光受刺激的光敏蛋白。使用生物递送装置(如结合图4的生物部分204讨论的那些)来植入修饰靶细胞以包括光敏蛋白的载体。使用植入组件(如结合生物部分204、图7A-7B的筛孔或图8A-8B的病毒基质)来在靶细胞附近植入光产生装置。使用控制装置(如在连接控制电路208中讨论的)来激活光产生装置以产生由靶细胞接收的光，从而刺激响应于产生的光的靶细胞。
[0219] 现在回到附图，图3展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的系统的框图。区块102表示有机体(例如哺乳动物)内的位置，如体内标识所示。光发生器104是体内产生光的植入装置。光敏生物部分106影响靶细胞，从而使产生的光照射引起靶标的刺激。在一种情况下，光发生器104是尺寸为大约几毫米数量级的小电子装置。小尺寸对于使装置的侵入和相关的植入操作最小化是特别有用的。在另一种情况下，光发生器104可以包括能用于从外部来源向靶细胞传输光的光纤装置。
[0220] 在本发明的一个实施方案中，靶细胞被修饰以含有光激活质子泵/通道蛋白。该蛋白的特定实例是GtR3，它是基于隐芽植物蓝隐藻的产物。对于GtR3的作用光谱的表征显示最大吸收是约490nm。另一个特定实例是来自杜氏盐藻的DChR。DChR的作用最大值是约500nm。
[0221] 这些光敏蛋白可以使用若干不同方法植入，示例方法包括但不限于使用各种递送装置如明胶胶囊、液体注射等。这些方法还包括使用立体定向手术技术如框架或计算机手术导航系统植入或此外进入身体的部位。关于递送这些蛋白的更多细节，可参考2006年7月24日提交并且标题为“Light-Activated Cation Channel and Uses Thereof”的美国专利申请第11/459,636号，将其以引用的方式全部并入本文。
[0222] 图4展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的植入装置的框图。所述附图包括控制电路208、光源206、生物部分204和靶细胞202。生物部分204影响靶细胞202从而使靶细胞响应于光受刺激。
[0223] 在本发明的一个实施方案中，生物部分204可以由已经被修饰为光敏的靶细胞202组成。在本发明的另一个实施方案中，生物部分204可以含有生物元素如基因转移载体，它使靶细胞202变得对光敏感。一个实例是携带用于DChR表达的基因的慢病毒。以这种方式，靶细胞202的刺激可以通过植入装置控制。例如，可以调整控制电路208以通过激活或减活光源206或通过向为光源206提供电力的电池充电对外部信号响应。在一种情况下，外部信号是由控制电路208接收的电磁辐射。例如，辐射频率(RF)信号可以由外部RF发射器传输并且由控制电路208接收。在另一个实例中，可以使用磁场激活和/或驱动控制电路。
[0224] 控制电路208可以使用不同的复杂程度来实施。在一种情况下，所述电路是暴露于磁场时产生电流的简单线圈。随后使用所述电流驱动光源206。该方案对于限制尺寸和复杂性以及增加装置的寿命是特别有用的。在另一种情况下，控制电路208可以包括RF天线。控制电路208可以任选使用电池或类似的电源如电容元件。充电时，所述电源允许电路继续操作而不需要来自体外的并行能量。这对于为光源206发射的光提供精确的控制以及对于增加发射光的强度是特别有用的。在本发明的一个实施方案中，光源206使用发光二极管(LED)实现。已经证明LED对低功率应用是有用的并且还对电信号具有相对快的响应。
[0225] 在本发明的另一个实施方案中，生物部分204包括含有基因转移载体的明胶或类似物质，所述基因转移载体基因编码靶细胞以获得光敏性。在一种情况下，一旦被植入体内所述载体就被释放出来。这可以例如通过使用允许载体被释放到水溶液中的容纳材料来实现(例如使用脱水或水溶性材料如明胶)。载体的释放导致靶细胞被修饰，从而使它们模拟响应于来自光源206的光。
[0226] 在本发明的另一个实施方案中，生物部分204包括含有光敏细胞的合成筛孔。在一种情况下，所述细胞是已经被修饰为光敏的神经元。可以将所述合成筛孔构造成允许所述树突和轴突通过筛孔而不允许整个神经元(例如细胞体)通过。该筛孔的一个实例具有直径的数量级为3-7微米的小孔并且由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。在另一个示例实施方案中，生物部分204包括如本文中进一步详细讨论的注射机械装置。
[0227] 图5展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图。图3的植入装置对磁场响应。更具体地讲，由线圈302和核304构造的电感器产生响应于磁场的电流/电压。所述电流被经由导电路径306通过控制电路310。在响应中，控制电路310使用导电路径308激活光源312。为了刺激靶细胞，光源312照射生物部分314。在一种情况下，生物部分314包括明胶、合成筛孔或注射机械装置，如在本文中进一步详细讨论的。
[0228] 在本发明的一个实施方案中，控制部分可以是简单的电连接、电阻元件或可以被完全地去除。在该实施方案中，产生的光的强度、持续时间和频率将直接由从磁场产生的电流控制。这对于产生廉价、耐用和小的装置是特别有用的。该实施方案的一个实例结合图6A和图6B进一步讨论。
[0229] 在本发明的另一个实施方案中，控制部分可以作为更复杂的电路实现。例如，所述控制电路可以包括并且另外补充不同的整流电路、电池、脉冲计时、比较器电路等。在一个特定实例中，控制电路包括使用CMOS或其它方法生产的集成电路(IC)。集成电路技术允许在非常小的区域中使用大量的电路元件，并且因此对于一些应用可以实现相对复杂的控制电路。
[0230] 在本发明的一个特定实施方案中，电感器(图5的302和304)是表面固定电感器，如Gowanda Electronics Corp提供的100uH电感器部件号CF1008-103K。产生光的部分是蓝色LED，如0603或0805包装尺寸的LED。一个特定实例是部件号为SML0805的蓝色表面贴装LED，自LEDtronics,Inc(Torrance,CA)购得。连接路径306和308可以使用各种电导体实现，如导电环氧化物、胶带、焊料或其它粘合剂材料。在黄色光谱(适用于NpHR通道)和其它光谱中发射光的LED可通过商业来源获得，包括该相同的制造商。
[0231] 图6A展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图。图6A展示包含线圈402和核404的电感器，它被使用406展示的导电路径连接到LED 408上。图6B展示对应于图6A的框图的电路图。电感器412与LED 410并联连接。因此，通过改变在电感器412观察到的磁场产生的电流和电压使LED 410产生光。可以改变变化磁场的频率和强度以从LED 410产生希望的量和周期性的光。
[0232] 图7A和图7B展示根据本发明的示例实施方案的用于含有光敏生物分子的筛孔的图形。筛孔502被构造成具有孔504，孔504具有允许光照通过但是小到足够防止细胞506通过的尺寸。这允许细胞506被植入而仍然接收来自光发生器的光。
[0233] 在本发明的一个实施方案中，细胞506是被修饰为光敏细胞的干细胞。所述干细胞允许如图7B所示成熟。在一种特定情况下，所述干细胞成熟为具有细胞体512、轴突/树突508和510的神经元。所述神经元被基因修饰为光敏的。孔504的直径为大约3-7微米。该尺寸允许一些轴突和树突通过孔504，而防止细胞体512通过。
[0234] 图8A和图8B展示根据本发明的示例实施方案的病毒基质的图形。所述病毒基质包括结构602，其含有病毒载体604。在一种情况下，结构602包括含有病毒载体604的凝胶或流体物质，直到它们被植入哺乳动物606。一旦病毒载体604被释放，它们就如图8B所示在植入的病毒基质附近感染靶细胞608。感染的靶细胞610变成光敏的，并且因此可以使用光来控制靶细胞610的刺激。
[0235] 根据本发明的一个实施方案，结构602是已经被浸渍或被包含在所述明胶内的病毒载体604密封。当结构602被植入时，明胶被水化和/或溶解，从而释放病毒载体604。除了化合物如Becton Dickenson and Company(Franklin Lakes,NJ)的BD Biosciences分公司的Matrigel之外，可以使用标准的市售明胶混合物。
[0236] 图9展示根据本发明的示例实施方案的产生响应于磁场的光的电路的电路图。图9包括输入电路720和输出电路730。电感器704产生响应于磁场702的电流。由于磁场的性质，电感器704产生的电流是交变电流(AC)信号。全波桥式整流器706整流AC信号并且连同RC电路一起从所述AC信号产生相对稳定的电压。该产生的电压对磁场702和输出电路730响应，当产生的电压处于足够的水平时输出电路730产生光。更具体地讲，来自电池708的电力被用于驱动响应于磁场702的LED 710。这对于电感器704经受的磁场702功率较小(例如由于电感器704的体内位置)的应用特别有用。
[0237] 图10A展示根据本发明的示例实施方案的产生响应于RF信号801的光的电路的电路图。天线802用于接收RF传输801并且将所述信号转化成电。接收的传输被二极管803整流并且进一步通过电容器805过滤。在一种情况下，二极管803可以使用具有低正偏和快速转换能力的二极管(如肖特基(Schottky)二极管)实现。
[0238] 在本发明的一个特定实施方案中，RF传输801含有用于为电池815充电的电力组件和用于控制LED 825的信号组件。可以选择电容器805来分离这些组件以供所述电路使用。例如，电力组件可以是相对低频率、大振幅信号的，而所述信号组件是相对高频率、小振幅信号的。可以选择电容器805来过滤电力组件的信号以产生相应的电压。所述RF传输的剩余的高频率成分被加到该电压中。随后可以使用所述传输的电力组件为电池815充电，并且使用所述传输的信号组件启动LED 825。LED 825产生的光激发靶细胞827的刺激。
[0239] 附图10B示出替代实施方案射频蓄能器，它为电池充电，而电池又为数字脉冲发生器供电，数字脉冲发生器为LED供电。环形天线852接收电磁信号850，产生相应的电信号。由环形天线852产生的电压受二极管855和856的反向偏压限制并且储存在电容器854中。在一种特定情况下，这些二极管具有相对精确的低反向偏压，如齐纳(Zener)二极管。电磁信号850经由二极管整流器桥858整流并且被电压调节器859过滤以产生DC电压。所述DC可以用于为电源860充电。
[0240] 电池860通过电容器862与施密特(Schmidt)触发器865的输入端耦合。来自施密特触发器的输出端的反馈通过电阻器864相对于在电容器863上的电荷提供。因此，施密特触发器865的方波输出的频率由包括电容器863和电阻器864的阻容网络的值决定。电阻器864和电容器863可以是固定的或可变的。施密特触发器865的输出信号进入数字逆变器867，数字逆变器867为LED 866供电。来自LED 866的光被传输到光敏神经元868，相对于施密特触发器865的方波输出的频率。
[0241] 图10C示出电磁场(EMF)蓄能器和脉冲发生方法的框图，其中所述接收的EMF 897(例如射频能量)不仅包括用于储存的能量，而且还包括关于微控制器895的指令的编码信号。在步骤885(能量和参数控制信号：编码和传输)中，编码控制指令信号以通过本领域已知方法(例如通过频率调制)控制能量组件。能量接收器区块890使用EMF信号的一部分以向区块893提供电力。控制信号接收器区块891使用EMF信号的一部分以向微控制器区块895提供控制指令。
[0242] 所述控制指令可以用于传输和产生的光的各种参数(如频率、强度、持续时间、颜色等)有关的信息。这些指令可以使用如区块895所示的微控制器或逻辑电路解码和处理。区块895可以产生响应于解码的指令的控制信号。因此，对于给定的植入装置而言，由LED
896速率产生的光的频率(和其它参数)没有必要固定。天线889将输入信号输送给能量接收器890(向电压调节器和电池电路893提供电力)。同时，天线889向控制信号接收器891输送编码的数据，控制信号接收器891向驱动LED 896的微控制器895提供控制输入。随后向电激活细胞898输送选择波长的光897。在电压调节器和电池电路893中的电池向微控制器895和控制信号接收器891提供电力。
896速率产生的光的频率(和其它参数)没有必要固定。天线889将输入信号输送给能量接收器890(向电压调节器和电池电路893提供电力)。同时，天线889向控制信号接收器891输送编码的数据，控制信号接收器891向驱动LED 896的微控制器895提供控制输入。随后向电激活细胞898输送选择波长的光897。在电压调节器和电池电路893中的电池向微控制器895和控制信号接收器891提供电力。
[0243] 图9和图10A、10B和10C的电路图仅说明本发明一些特定实施方案，可设想到各种其它方案。例如，特定的实施方案使用蓝色LED作为光源；然而，可以取决于特定的应用使用其它颜色和光源。在其它特定实施方案中，光源包括一个以上彩色光源。所述电路不仅控制何时提供光，而且控制何种颜色，这取决于是否指令需要抑制或激发细胞。例如，在一个特定实例中，靶细胞同时表达响应于不同波长的光的抑制剂(例如GtR3)和兴奋剂(例如VChR1)。所述系统还可以控制细胞被激发或抑制的水平。这可以通过在激发(或抑制)的靶细胞中包括多种光响应蛋白以及编程指令以在单次提供一种以上波长的光来实现。
[0244] 图11A和图11B各自展示根据本发明的示例实施方案的光纤装置的图形。所述光纤装置包括控制部分908、光发生器906和光纤电缆902。
[0245] 光纤电缆902可以放置在光敏生物部分(如本文中讨论的病毒基质或合成筛孔)附近。这允许控制部分908和光发生器906与靶细胞910相距一定距离(例如，对应于光纤光缆902的长度的距离)设置。这对于使靠近靶细胞(例如靶细胞位于或靠近在脑内的敏感位置)的植入装置的部分的尺寸最小化是特别有用的。在一些情况下，部分908和906的远端设置还有利于所述装置的改进，包括但不限于更换各种组件(例如电池)、改变刺激频率和长度。
[0246] 控制部分908可以被配置成对外部信号如磁场或RF信号响应。或者，控制部分908可以被配置成根据编程的程序或外部信号和编程的响应的组合启动光发生器906。
[0247] 图12A-12D描绘根据本发明的示例实施方案的光敏生物部分的产生的各个阶段。更具体地讲，图12A展示具有若干模具1002的模制结构1004。模具1002根据特定的应用被构造成各种尺寸。在一种此类应用中，模具的直径为几毫米或更小。
[0248] 图12B展示涂覆明胶或类似物质的层(如1006和1008所示的)之后的图12A的模具1002。此外，病毒载体(由“V”表示)在以上两个模具中。这些病毒可以被悬浮在培养基1012内，培养基1012可以是液体或凝胶培养基。该液体包括生理盐水、HEPES-缓冲盐水和其它已知的病毒物质和转移培养基。合适的凝胶培养基包括Matrigel(BD Biosciences,San Jose CA)。这些病毒载体被设计成在植入之后向靶细胞膜转移光敏化基因。
[0249] 图12C展示模具1006的侧视图。1016代表形成明胶层1014的形状的模制结构。明胶层1014截留包含在培养基1012内的病毒载体。施加顶部明胶层1010以完全包含病毒载体。
[0250] 图12D展示所得的病毒载体胶囊。病毒载体1018被罩壳1020容纳在区域1022内。罩壳1020可以被设计成一旦植入就溶解或以其它方式允许病毒载体1018向靶细胞散布。在一种情况下，胶囊由水溶性材料(例如明胶)构成，从而植入时就允许病毒载体逃逸进入体内。水溶性胶囊材料在制药行业中是众所周知的。
[0251] 图13展示根据本发明的示例实施方案的植入装置。使用植入装置将生物部分1102和光产生装置1108植入。例如，将装置1114的轴放置在靶细胞附近。接下来，装置的使用者按压部分1116，部分1116使部分1112将生物部分1102和光产生装置1108放在靶细胞附近。随后可以将植入装置去除。
[0252] 图14A和图14B展示根据本发明的示例实施方案的另一个植入装置的图形。可植入的光产生装置1204由流体通道1202围绕并且穿过。流体通道1202允许含有生物分子材料(例如光敏病毒载体)的溶液1210被紧靠近光产生装置1204和靶细胞注射。所述流体通道可以位于装置1204外和/或装置1204内，分别如1212和1214所示。以这种方式，可以大量地或经过一段时间注射病毒载体。例如，经过一段时间以后，被病毒载体感染的细胞可以恢复到其感染前状态。使用图12A的装置，病毒载体可以被周期性地再导入靶细胞。或者，可以通过流体通道导入不同的病毒载体，允许在植入位点靶向不同的细胞。这对于通过刺激不同类型的细胞的阶段处理是特别有用的。
[0253] 本发明的一个特定实施方案涉及用于将神经元基因修饰为表达光敏离子通道DChR的方法。在该方法中，蓝光的脉冲使DChR神经元触发对应于各种脉冲的动作电位。在毫秒时间跨度上发生的去极化和复极化使该方法符合正常网络神经生理学。
[0254] 特定的靶标神经元使用用于基因转移的病毒载体来修饰。关于病毒载体产生的更多细节，可以参考Boyden等2005，Zhang等2006标题为“Channelrhodopsin-2and Optical Control of Excitable Cells”，Nature Methods第3卷，第10期，将其以引用的方式全部并入本文。该转染导致对于单一蛋白(细胞膜离子通道，被称为“DChR”)的基因的引入。在自然界中，DChR存在于杜氏盐藻的细胞膜上。当吸收蓝/绿光(500nm)时，该离子通道暂时地开放，允许阳离子流入。当转染到哺乳动物神经细胞中时，被感染的神经变成光敏的，产生光触发的动作电位。
[0256] 在一种特定情况下，使用DChR用于光刺激。可以使用包含来自杜氏盐藻的DChR光敏感通道的氨基酸残基来对哺乳动物神经细胞提供快速光敏性，通过使用病毒载体将用于DChR的基因插入靶标神经细胞中，所述神经细胞随后可以表达该基因。当用大约500nm的蓝/绿光照射时，ATR异构化并且引起构象变化从而打开通道小孔。因为DChR是光敏离子通道，所以它允许激起向内的电流。
[0257] 在另一种情况下，施加GtR3(来源于蓝隐藻)用于光刺激。通过使用病毒载体将用于GtR3的基因插入到靶标神经细胞中，可以将该质子泵施加给哺乳动物神经细胞。当用大约472nm的蓝光照射时，从神经元细胞质主动泵出质子引起细胞的超极化。
[0258] 因为经由DChR或GtR3对蓝光的敏感性在病毒载体将相应的基因插入先前正常的细胞中被诱导，所以可以将所述插入基因靶向由特定的细胞亚型表达的产物。例如，只引起多巴胺能神经元而非胆碱能神经元对蓝光有反应可能是有利的。
[0259] 如上所述，本发明的某些实施方案涉及在细胞中表达的光响应离子泵或离子通道的用途。在一种特定情况下，所述细胞是神经细胞或干细胞。一个特定实施方案中涉及表达离子泵的体内动物细胞。本发明的某些方面基于质子泵(来源于蓝隐藻)的识别和开发，例如用于神经活动的暂时精确的光抑制。所述泵同时允许在迅速的脉冲串内的单个动作电位的破坏和经若干分钟的脉冲的阻断。
[0260] 根据本发明的示例实施方案，在一种或多种干细胞、祖细胞或干细胞或祖细胞的子代中表达光响应离子泵和/或通道。使用光刺激激活表达的泵/通道。可以使用所述激活来控制所述细胞中的质子浓度。它还可以用于控制特定的亚细胞器的pH。这对于感染存活、增殖、分化、去分化或在细胞中缺少分化是特别有用的。因此，进行光刺激以提供对干细胞或祖细胞的(成熟)的控制。
[0261] 根据本发明的其它示例实施方案，用于产生抑制神经元电流流动的方法涉及(在神经元中)工程化蛋白，所述蛋白通过产生阻止神经元去极化的抑制电流对光响应。在一种该方法中，所述蛋白(GtR3)是在所述神经元中的外源分子，在另一种方法中所述蛋白是使用内源性辅因子的抑制蛋白。
[0262] 在另一个示例实施方案中，用于控制神经元的动作电位的方法包括以下步骤：在所述神经元中工程化第一光响应蛋白；在所述神经元中且从第一光响应蛋白响应于光而产生抑制电流；在所述神经元中工程化第二光响应蛋白；以及在所述神经元中从第二光响应蛋白响应于光而产生激发电流。光响应蛋白的组合可能取决于所述蛋白的光敏感性、所述蛋白的反应时间和所述蛋白的确定的作用，例如。在相同细胞群体中可以使用相同类型(抑制对激发)的多个光响应蛋白，从而允许(例如)动作电位的长时间阻断或单个动作电位抑制，这取决于使用的光的波长。
[0263] 在用于控制穿过细胞的细胞膜的电压水平的另一种方法中，所述方法包括：在所述细胞中工程化第一光响应蛋白；测量穿过所述细胞膜的电压水平；以及响应于第一波长的光并且使用所述第一光响应蛋白产生穿过响应于测量的电压水平的细胞膜的电流。
[0264] 本发明的另一个方面针对用于控制体内神经元的动作电位的系统。所述系统包括递送装置、光源和控制装置。所述递送装置将光响应蛋白引入所述神经元中，所述光响应蛋白产生抑制电流。光源产生刺激光响应蛋白的光，控制装置控制光源产生的光。在一个特定实施方案中，所述光源是蓝光光源并且所述光响应蛋白对蓝光响应。
[0265] 在更详细地实施方案中，该系统被进一步修改从而使递送装置通过转染、转导和显微注射之一引入光响应蛋白，和/或从而使光源通过植入光发生器和光纤之一将光引入神经元。
[0266] 本发明的另一个方面针对用于治疗病症的方法。所述方法靶向与所述病症相关的一组神经元；并且在该组中，所述方法包括工程化使用内源性辅因子的抑制蛋白以响应于光，通过产生抑制电流阻止神经元的去极化，并且将所述神经元暴露于光下，从而阻止所述神经元的去极化。
[0267] 在本发明的另一方面，将GtR3优化以用于哺乳动物表达。从蓝隐藻中分离光响应蛋白。所述分离的蛋白具有C末端和N末端。向所述分离的蛋白的C末端加入内质网(ER)输出信号，产生增强光响应蛋白。在多种实施方案中，加入所述分离的GtR3的启动子取决于希望的表达位置而变化。
[0268] 图15描绘根据本发明的示例实施方案的具有多个光源的装置。图15展示照射蛋白1610和1614的光源1602和1604。将蛋白1610和1614在细胞1612内工程化以响应于分别来自光源1602和1604的光而控制穿过细胞膜的电流。在一种情况下，第一蛋白1610起阻止动作电位触发的作用，而第二蛋白1614起促进动作电位触发的作用。蛋白1610和1614各自对光响应。在一种特定情况下，第一蛋白对来自光源1602并具有波长A的光响应，第二蛋白对来自光源1604并具有波长B的光响应。因此，可以使用所述光源独立地控制各种蛋白。这可以用于同时促进和阻止所述细胞中的动作电位。在另一种情况下，具有允许同时对细胞膜电压的正控制和负控制的两种类型的蛋白。因此，可以使用不同的光源和蛋白来控制细胞膜的电压或电流水平(例如钳电压或电流水平)。
[0269] 一种测定响应性的方法涉及根据产生给定响应需要的光强度来定量响应性。在一些情况下，虽然所述蛋白的响应性可能小于主要波长的响应性，但是所述第一或第二蛋白仍然可以对替代波长的光响应。因此，第一类型的蛋白可以对对应于其它类型蛋白的波长有一些响应性而仍然保持充分的操作独立性。在一种此类情况下，细胞的控制可以通过改变光的波长或光的强度来实现。例如，波长可以在A与B之间改变以诱导膜电压电位的相应的升高或降低。或者，可以将具有类似的作用而不同的激活波长的多种蛋白引入相同的细胞中。响应可能随着波长的改变而变化，在一些地方，所述两种响应的组合比来自单个蛋白产生更大的响应。
[0270] 根据本发明的一个实施方案，泵1614可以任选实现除阻止动作电位触发以外的目的，如控制细胞1612的电压水平。更具体地讲，可以使用传感器向光源1602提供反馈。例如，该反馈可以是穿过细胞膜的电压或电流的测量值。因此，可以将光源配置成保持穿过细胞的恒定电流或电压(例如钳电流或钳电压)。此外，响应性的量可以通过调整光强度和光波长的一种或多种来控制。
[0271] 图16展示根据本发明的示例实施方案的用于控制一种或多种细胞体内电性质的系统。控制/接口单元1702启动/中止光源1704照射靶细胞1708。输送装置如光纤电缆1706限定或以其它方式将光引导至靶细胞1708。光纤电缆1706可以包括一束光缆，各光缆能够独立地传送和引导光。因此，可以将光纤电缆1706配置成向多个位置输送具有一种或多种波长的光。可以将传感器1710提供为例如光学装置(如光学镜)或电压计以向控制单元1702提供反馈。在一种特定情况下，所述反馈包括靶细胞或其它相关细胞的光学成象。在另一种情况下，所述反馈可以监测靶细胞的电压响应，包括动作电位触发的量。
[0272] 图17展示根据本发明的示例实施方案的用于控制一种或多种细胞体内电性质的系统。控制/接口单元1802启动/中止可植入光源1804，光源1804又照射靶细胞1806。展示的光源1804具有两个光源：抑制电流光源1808和激发电流光源1810。光源1808产生抑制蛋白有响应的波长和强度的光，而光源1810产生激发蛋白有响应的波长和强度的光。本领域技术人员将认识到，可能有各种形态的光源1810，包括单个抑制光源或具有一种或多种波长的光源阵列。控制/接口单元1802通过任何合适的通讯装置(如有线通讯或使用射频信号、磁信号等的无线通讯)与光源1804通讯。如上结合图16所述，传感器1812可以任选用于向控制单元1802提供反馈。
[0273] 本发明的某些实施方案可以用于药物筛选。所述各种光敏蛋白用于采用离子开关调节膜电压，所述离子开关在响应于光而被激活(或减活)时起通道或泵的作用，并且在下文称为光响应离子开关或光激活膜电位开关(LAMPS)。
[0274] 按照本发明的一个示例实施方案，一种系统筛选影响离子通道和离子泵的化合物。为了筛选候选药物，所述系统导入可以阻滞或增强离子通道或离子泵对细胞的活性的一种或多种候选药物，所述细胞通过添加上述蛋白(ChR2、DChR和NpHR等)的组合变成对光响应的。光激发在所述细胞中的光响应离子通道，导致穿过细胞膜的观察到的电压的变化。所述电压改变刺激在所述细胞中的电压门控离子通道，这随后将引起可以作为光输出读取的离子浓度的改变。这些光信号被检测并用于测定候选药物对电压门控离子通道具有何种作用(如果有的话)。在一个更特定的实施方案中，将表达质子泵的蛋白引入细胞。
[0275] 在一种情况下，所述系统允许筛选不同的候选药物而在筛选之间不需要大量的装置。例如，可以使用同时刺激光响应细胞和检测药物有效性的光学装置进行试验。使用光学装置而不是手动接触(例如，使用全细胞膜片钳)对于提高试验筛选过程的通量可能是特别有用的。例如，筛选之间的时间可以通过减少或消除对于刺激或检测靶细胞中的离子流不必要的物理操作来降低。还可以在筛选过程之前制备细胞，因为检测设备只需要与制备的细胞光耦合。在另一种情况下，可以通过使用例如光检测器阵列和暴露于不同药物的修饰的细胞的相应阵列同时筛选若干不同药物来提高通量。
[0276] 基于细胞系的方法不限于特定的离子通道。例如，可以对于电压门控钠(例如Nav1.1至Nav1.9)、钾(例如Kv，如hERG、TASK1、Shaker或KvLQT1)或氯离子传导通道/泵(例如，氯离子通道CLC家族的成员)。将这些基因引入细胞系的方法在本领域是已知的并且可以包括例如脂质体转染或病毒基因转移。对于与此相关的其它信息，可以参考以下参考文献中的一种或多种：
[0277] ■Warren Pear,Transient Transfection Methods for Preparation of High-Titer Retroviral Supernatants,增刊68,Current Protocols in Molecular Biology,9.11.1-9.11.18,John Wiley&Sons,Inc.(1996)。
[0278] ■R.E.Kingston,C.A.Chen,H.Okayama和J.K.Rose,Transfection of DNA into Eukarotic Cells.增刊63,Current Protocols in Molecular Biology,9.1.1-9.1.11,John Wiley&Sons,Inc.(1996)。
[0279] ■R.Mortensen,J.D.Chesnut,J.P.Hoeffler和R.E.Kingston,Selection of Transfected Mammalian Cells,增刊62,Current Protocols in Molecular Biology,9.5.1-09.5.19,John Wiley&Sons,Inc.(1997)。
[0280] ■H.Potter,Transfection by Electroporation,增刊62,Current Protocols in Molecular Biology,9.3.1-9.3.6,John Wiley&Sons,Inc.(1996)。
[0281] ■T.Gulick,Transfection using DEAE-Dextran,增刊40,Current Protocols in Molecular Biology,9.2.1-9.2.10,John Wiley&Sons,Inc.(1997)。
[0282] ■R.E.Kingston,C.A.Chen,H.Okayama,Transfection and Expression of Cloned DNA,增刊31,Current Protocols in Immunology(CPI),10.13.1-10.13.9,John Wiley&Sons,Inc。
[0283] 以上参考文献各自以引用的方式全部并入本文。
[0284] 这些和其它转移载体可以使用各种基因工程技术产生。例如，所述转移载体可以来源于逆转录病毒如免疫缺陷病毒(例如HIV-1或HIV-2或SIV)的原病毒克隆。关于293T细胞和其转染的使用的更多细节，可以参考美国专利第6,790,657号(标题为Lentivirus Vector System，授予Arya)，将其以引用的方式全部并入本文。
[0285] 在本发明的一个实施方案中，可以改变修饰的细胞的光刺激以测定引入的候选药物的特定性质。例如，可以将光刺激的强度调整至改变去极化的相应水平。可以调整希望的去极化的水平以进一步表征药物在检测下的有效性。在另一个实例中，所述光刺激可以包括所述光的迅速的脉冲发生。通过关联光刺激和所得的检测的荧光之间的瞬间关系，可以根据动力学响应进一步表征所述药物。因此，可以对于各种不同的方面表征所述药物，这些方面包括但不限于对离子浓度的稳定状态作用、激发电压门控离子通道需要的去极化水平的改变和对重复的去极化的作用。
[0286] 在一个实施方案中，所述系统允许所述光刺激和/或检测的简单的校准。可以在引入候选药物之前用光刺激修饰的细胞。检测并记录离子通道响应性。可以使用记录值作为比较相同的修饰的细胞在引入药物之后在检测下的离子通道响应性的基准。还可以使用所述记录值来调整光刺激或光检测器的敏感性。这些改进可以应用于单个试样或试样的阵列。对于该试样阵列，可以通过调整相应的光刺激单独地校准各个试样。类似地，可以单独调整各个相应的光检测器。
[0287] 图18A展示根据本发明的实施方案的用于筛选影响离子通道的药物的系统的基本框图。光控制1904与数据库1902、光源1906和光检测器1909通讯。光源1906向试样1908提供光刺激。试样1908包括在检测下的药物、具有光响应离子通道的细胞和电压/离子指示器。在一种情况下，所述指示器响应于来自光源1906的光发荧光。光控制1904还可以包括可重构的数字显示装置，从而使用不同LAMPS和不同LEIA时，可以使相同的控制系统容易地适合于各种模式。光检测器1909产生响应于该荧光的信号，光控制1904接收产生的信号。光控制
1904储存自数据库1902中的信号获得的数据。储存的信息可以包括因素如检测的光的强度、持续时间和波长。在一种特定情况下，可以将存储的数据与基准数据比较，其中基准数据表示在向试样1908引入药物之前的基准数据。在另一种情况下，光源1906可以改变与光源1906的控制相关的强度、持续时间或其它参数。可以将这些和其它参数储存在数据库
1902中。
1904储存自数据库1902中的信号获得的数据。储存的信息可以包括因素如检测的光的强度、持续时间和波长。在一种特定情况下，可以将存储的数据与基准数据比较，其中基准数据表示在向试样1908引入药物之前的基准数据。在另一种情况下，光源1906可以改变与光源1906的控制相关的强度、持续时间或其它参数。可以将这些和其它参数储存在数据库
1902中。
[0288] 显然光源1906可以使用单个光源如发光二极管(LED)或使用若干光源来实现。类似地，光检测器1909可以使用一个或多个检测器，数据库1902可以使用任何数目的合适的存储装置来实现。
[0289] 图18B展示根据本发明的特定实施方案的用于药物筛选的大型、准自动化系统的系统图。控制装置1901(例如计算机或控制逻辑)控制各种过程，并且作为系统输入/输出功能的中心点。在环境控制室1905内，可以借助于一个或多个传感器1914(例如恒温器、二氧化碳传感器和湿度传感器)、二氧化碳和调湿器装置1912和加热器1910将环境保持在适当的温度、湿度、二氧化碳水平和环境光水平。多孔盘1941含有用于容纳培养细胞、药物和用于各种检测需要的其它成分的检测孔1940。盘1941停放在X-Y-Z台1925上，台1925的移动在计算机1901的控制下通过台传动器1920进行。氙气灯1955发射高强度白光1956，白光1956通过滤色器1960。在使用DChR刺激孔1940内的细胞的情况下，滤色器1960是蓝色的，使蓝光1961从滤色器出来并且触及分色镜1970。蓝光1961随后向上通过显微镜物镜镜片装置
1930，并且通过透明盘1941的下部。用这种方式，照射孔1940的内容物与其透明的下侧。当需要单独的波长的光来刺激细胞活动的荧光发射指示器时，可以用适当规格的过滤器来替换上述过滤器160，使对于后者的适当的波长的光输送至孔1940。如果在孔1940内的细胞已经光敏化，并且如果在各种这些孔中检测的药物不抑制所述过程，那么细胞活动的发光指示器(LEIA)将根据由所述光的作用引起的电压变化发光，细胞活动的发光指示器还被加入各个孔中或经由基因修饰由细胞表达。通过显微镜转台1935来收集光的该第二波长(其在数量上比刺激光小得多)，并且还将被通过分色镜1975，到(CCD)照相机1980的镜片上。
1930，并且通过透明盘1941的下部。用这种方式，照射孔1940的内容物与其透明的下侧。当需要单独的波长的光来刺激细胞活动的荧光发射指示器时，可以用适当规格的过滤器来替换上述过滤器160，使对于后者的适当的波长的光输送至孔1940。如果在孔1940内的细胞已经光敏化，并且如果在各种这些孔中检测的药物不抑制所述过程，那么细胞活动的发光指示器(LEIA)将根据由所述光的作用引起的电压变化发光，细胞活动的发光指示器还被加入各个孔中或经由基因修饰由细胞表达。通过显微镜转台1935来收集光的该第二波长(其在数量上比刺激光小得多)，并且还将被通过分色镜1975，到(CCD)照相机1980的镜片上。
[0290] 分色镜1970允许刺激膜的光门控需要的波长(例如对于DChR是蓝绿色)和使用的任何LEIA需要的波长(例如，对于FURA-2是紫外光)两者向上反射。可以调整该分色镜以允许LEIA(例如，对于FURA-2是蓝绿色)的输出光谱以极小的反射或吸收通过。
[0291] 图19是根据本发明的示例实施方案的自动化药物筛选系统的系统图。发射器/检测器单元2050组成发射器/检测器阵列2051。发射器/检测器阵列2051与盘2040上的孔的数目、尺寸和布局相匹配。一旦给定盘的检测已经完成，盘夹持装置2025就允许盘交换装置2020迅速地将新盘移动到位。整个过程可以是自动化的，并且在装置2001的控制之下。装置
2001可以使用计算机、控制逻辑、可编程逻辑阵列、discreet逻辑等来实现。检测下的候选药物的引入还可以使用机器实现自动化，所述机器提供用于储存药物的储存器和用于将药物注射到盘中的分配喷嘴。以类似于图18A-18B展示的方式，可以借助于恒温器、二氧化碳传感器和湿度传感器2014、二氧化碳和调湿器装置2012和加热器2010将在环境控制室2005的壁内的环境保持在适当的温度、湿度、二氧化碳水平和环境光水平。同时和并联使用多个刺激器/检测器元件对于提高全过程的速度可能是特别有用的。可以使用低成本元件来制造多个平行检测器(例如在以下图20A和20B的说明中详细描述的组件)；所述多个平行发射器/检测器单元还可以是非常经济可行的。
2001可以使用计算机、控制逻辑、可编程逻辑阵列、discreet逻辑等来实现。检测下的候选药物的引入还可以使用机器实现自动化，所述机器提供用于储存药物的储存器和用于将药物注射到盘中的分配喷嘴。以类似于图18A-18B展示的方式，可以借助于恒温器、二氧化碳传感器和湿度传感器2014、二氧化碳和调湿器装置2012和加热器2010将在环境控制室2005的壁内的环境保持在适当的温度、湿度、二氧化碳水平和环境光水平。同时和并联使用多个刺激器/检测器元件对于提高全过程的速度可能是特别有用的。可以使用低成本元件来制造多个平行检测器(例如在以下图20A和20B的说明中详细描述的组件)；所述多个平行发射器/检测器单元还可以是非常经济可行的。
[0292] 图20A描绘根据本发明的示例实施方案的发射器/检测器单元(如图19中所示那些)的运行。LED刺激位于孔内的细胞的光敏离子通道，光电二极管检测LEIA的响应。在该实施方案中，装置2101包括LED 2110，LED 2110产生光脉冲2111，光脉冲2111处在适当的波长、脉冲频率和强度，以便刺激在孔2106内的培养物中的光敏转基因细胞2105。由于LEIA(例如，压敏染料或钙染料)的存在，光2116从细胞2105返回，并且由光电二极管2115检测。在使用RH1691的情况下，发射红光荧光并且由光电二极管2115检测。在没有细胞去极化的情况下，光电二极管2115不能检测到荧光。还可以取代光电二极管使用其它光检测技术，包括光电晶体管和CCD元件。
[0293] 出于若干种不同的原因，光刺激与LEIA的光学成象技术的组合可能是有用的。例如，光刺激可以通过减少使用机械电极进行刺激的需要来简化激发细胞的研究。若干市售LEIA适于光测(photogrammetrically)指示电激发细胞的激活。一种此类LEIA是钙染料Fura-2，它可以用约340nm的紫光/紫外光刺激，并且其荧光输出可作为约535nm的蓝绿色光被检测。另一个实例是压敏染料RH1691，它可以用约550nm的绿光刺激，并且其荧光输出可作为在约70nm的红光检测。另一个实例是压敏染料di-4-ANEPPS，它可受在约560nm的蓝光刺激，并且其荧光输出可作为在约640nm的红光检测。
[0294] 图20B描绘图19中展示的发射器/检测器单元的另一个实施方案的运行，其中在单孔的环境内检测多种作用。例如，孔2156中的细胞2155可以同时表达GtR3和VChR1，并且因此对蓝光的超极化作用和黄光的去极化作用都敏感。装置2151包括LED 2160，其用于刺激光敏转基因细胞2155的靶标质子泵(例如GtR3)。可以使用其它LED 2175刺激第二靶标离子通道或泵(例如VChR1)。可以使用另一个LED 2180刺激压敏染料(例如，RH1691或钙染料，如Fura-2)。可以调整各个LED以输出用于刺激相应的靶标化合物的特定波长和强度。在一种情况下，LED可能影响一个以上的靶标，这取决于使用的各种化合物的特定的敏感性。光电二极管2165检测选择的电压染料的荧光，而光电二极管2170对选择的钙染料发出的荧光光谱敏感。对于相同细胞使用多种LED允许在不同波长刺激LEIA。还可以使用多种LED检测由LEIA发射的不同波长的光。
[0295] 图21A描绘根据本发明的示例实施方案的用于激活在发射器/检测器单元内使用的LED发射器的电子电路机构。控制装置2201对晶体管基极2205产生“开灯信号”2202。该开灯信号2202将保持希望的闪光持续时间，或者为了以规定的频率产生有节律的闪光可以开启和关闭。开灯信号2202允许(常规)电流从电源2210流动通过电阻器2211，并且通过晶体管集电极2207和晶体管发射极2212，到达接地2213。从而还允许电流通过电阻器2215，并且到LED 2220。LED 2220发射光2221，光2221落到孔2225上。在一种特定情况下，晶体管起信号2202的跨导放大器的作用。以这种方式，将适当的波长、强度和频率的光输送至孔2225内的细胞，以便使其刺激特定的通道(例如DChR)或泵(例如GtR3)，或使用其它光激活膜结构来调节电激发细胞的活动。各种其它电路也是可能的。例如，可以代替电路2206控制LED 2220的其它电路包括但不限于用运算放大器、场效应晶体管、电阻分压器网络、晶体管-晶体管逻辑、推挽式驱动器电路和开关代替晶体管。
[0296] 图21B描绘根据本发明的实施方案的用于通过发射器/检测器单元检测光的示例电子电路机构。控制装置2250可以(任选地，取决于具体的方案)向光电二极管2255提供电力。光电二极管2255接收来自孔2257内的细胞上的LEIA的荧光(发射)光2256。接收的光产生输出信号。该输出通过电阻器2260，并且输入施密特触发的六反相器2270(其调节所述信号)，提供要被输入计算机2250的整齐的“高”或“低值”。
[0297] 光检测器的操作以光电模式展示，但是所述元件也可以以光导操作模式使用。当然，还可以使用许多其它光检测装置和方法，包括光电晶体管、光闸流管和电荷耦合装置(CCD)元件或元件阵列。
[0298] 或者，可以无需密特触发的六反相器2270使用图21B的电路，以允许信号强度的连续流被直接传输至计算机2250的模拟输入或模拟-数字转换器。各种其它信号调节电路也是可能的。
[0299] 图22展示在计划的高通量处理时程2300的环境中并且根据本发明的一个实施方案使用图19、20A-20B和21A-21B中所示实施方案的步骤顺序。在步骤2305中，反射用于靶标离子通道的适当的波长和强度的光-在这种情况下为大约三秒。同时，取决于使用的特定的电压或钙染料等，可以任选激发LEIA刺激闪光2310。该LEIA化合物可以在之前已加入孔中，或可以被(人工)基因引到细胞上，从而由细胞产生/表达所述化合物。在步骤2315中，通过光检测器元件(例如光电二极管)检测由LEIA产生的光信号。例如，RH1691，在约70nm发射红色荧光。
[0300] 在步骤2320中，由光在光检测器元件上照射产生的信号被送回至计算机。这可以是二进制的(例如，“高”对“低”信号强度)，或可以被分级以反映激活水平的连续流。在使用多个光检测器测定在不同波长的能量的情况下，可以平行或依次记录这些光检测器的单个读数，用于自动化处理的稍后阶段中的合理的解释。在步骤2330中，所述系统请求所述自动化系统放置下一个盘。下一个盘在步骤2335中被移动到位，可以重复所述过程直到一个批次中的所有盘均已经被处理。
[0301] 为光输送分配的时间值可以变化，并且取决于包括光门控质子或离子通道/泵表达的水平和该细胞群体的其它质子/离子通道特性的密度和特性的因素。为光接收分配的时间值可以变化，并且取决于包括筛选期间所需的精度的因素。为孔板(盘)置换分配的时间值可以变化，并且取决于包括自动化装置的机械转速的因素。如果使用快速神经元作为被检测的细胞，细胞刺激和LEIA检测过程可以以毫秒实现。
[0302] 以上过程可以在不同的条件下重复。例如，可以在不存在药物下检测一套给定的细胞，并且随后在一种或多种药物存在下检测。从而可以记录、比较和研究在那些条件下的电激发细胞的响应。如果本发明用针对在盘上的各个孔的至少一个发射器/检测器和至少两个并行地操作装置来实现，那么可以保持延长的时间的连续操作。
[0303] 图23说明在孔板的孔内的细胞和药物样品的布局的实例，所述孔板适于在本发明的实施方案内使用。在该附图中，孔板2401(本文中还称为“盘”)含有孔2405(实例)，孔2405被组织成列2425(标记数字1-12)和行2420(标记字母A-H)。更具体地讲，示例列和行分别由2410和2415界定。
[0304] 作为引入这些孔的内容物的功能性布局的实例，可以使用单个板的行A-H来检测两种不同药物。为了提供基准条件，列1可以含有光门控细胞、内源或外源LEIA，但是没有药物。列2-6可以用于五种不同浓度的药物X，每列一种浓度水平。同样，列7-11可以用于五种不同浓度的药物Y，每列一种浓度。列12虽然完全可用，但在该特定实例中处于闲置状态。
[0305] 各种孔中的变量包括被检测的细胞类型、被检测的离子通道类型、放入细胞中的药物类型、放入孔中的药物的浓度、使用的特定LEIA和应用于孔中的细胞的光门控刺激参数(例如波长、强度、频率、持续时间)。
[0306] 图24示出可以在便于高通量药物筛选的较大系统内使用的公开发明的环境。孔板2506含有孔2505。这些孔被传送器2520向前传送，传送器2520可以是装置如传送带、机器人输送器或其它输送装置。吸管2510被机器人元件2515夹持成阵列，并且用来向孔2505中注射适当数目的培养细胞和培养基。随后，孔板2506被移动到传送器2520下，机器人元件2525(与机器人元件2515相似并且也含有吸管)在此向孔2505中注射适当的量的LEIA。随后传送器2520将孔板2505带到筛选室2530中。在室2530内放置发射器/检测器装置，如结合图17、图18A、图18B、图19小图A和小图B描述的那些。此外，在图20A和图20B中描述的部分过程可以在该室内发生。随后，孔板2535被传送带2540移动出筛选室2530，并被废弃在2545。在一个替代实施方案中，一种或多种机器人装置可以将吸管2510、筛选室2530等移动至孔板
2506的位置，而非相反。
2506的位置，而非相反。
[0307] 按照以上论述，示例筛选方法可以包括收集多个数据点而无需变换样品。因为仅仅通过用快速遮光器将激发光开启和关闭，在相同样品制备中的样品的控制是可逆的，所以可以再使用相同的样品。此外，可以向相同细胞样品提供一定范围的刺激模式，从而可以针对药物的作用进行检测而不涉及跨越不同样品制备的差异。通过调节激发的水平(例如通过线性改变从没有光至高或最大强度的光的水平)，可以检测跨范围的膜电位的药物作用。这允许识别在超极化、自然或去极化膜电位期间有效的药物。
[0308] 本文中描述的细胞系对于以高通量的方式详细表征候选药物可能是特别有用的。光控制是相对快速的，从而允许在激活的更生理学的形式下检测所述药物的活性。例如，可以使用不同频率的去极化和/或超极化来在神经活动的生理学形式下测定药物如何与通道相互作用。在一些情况下，可以不对细胞系应用昂贵的化学染料而实现所述过程。
[0309] 结合本文中讨论的各种性质，本发明的各种实施方案的使用对于通过消除对繁重的机械操作和液体操作的需要来改善筛选通量可能是特别有用的。各种实施方案还可能对使用相同样品重复筛选试验是有用的，通过消除对基于化学的荧光报告的需要来降低筛选成本，产生高瞬间精密度和低信号噪音(由于电压操作的光性质)，通过减弱用于刺激的光强度调节去极化的水平以及通过使用脉动光类型确定所述药物对离子通道调节的动力学。
[0310] 多种独立可控的激发蛋白和抑制蛋白的存在为各种应用提供了可能，包括但不限于应用于治疗各种病症，可以选择使用多种光响应蛋白以便对多种相应的光波长响应。虽然不总是明确地说明，但是在所述应用中抑制可以与激发组合使用，除了激发之外使用抑制或使用抑制代替激发。已经证明单组分蛋白系列对多种波长和强度的光响应。本发明的方面允许用于序列的其它突变和/或寻找，所述序列允许其它光波长和/或单独可控的蛋白通道。还可以使用关于光刺激的改变(例如，波长、强度或持续时间类型)。例如，刺激模式可以利用两种不同离子通道蛋白的激发波长的叠加以允许同时激发两种蛋白。在一种该情况下，所述蛋白可以具有不同的响应水平。因此，在神经应用中，一组离子通道可以以相对于第二组离子通道的不同成功百分数产生脉冲。类似地，在两种不同离子通道(或泵)的抑制波长中的叠加允许同时抑制两种蛋白。
[0311] 或者，可以使用多种光源，允许以希望的组合刺激光响应蛋白，而不刺激其它蛋白。
[0312] 本发明的许多用于人的应用在其使用之前需要政府批准。例如，人用基因治疗需要该批准。然而，在神经元(对肿瘤非敏感的非增殖细胞)中的类似的基因治疗进展迅速，涉及对人脑递送的病毒基因的活性、FDA批准的临床试验已经在进行中。这很可能有利于将本发明的各种实施方案用于大量的应用。以下是这些应用和实施方案的一些实例的非详尽清单。
[0313] 成瘾与各种脑功能有关，包括奖赏和期望。此外，成瘾的引发原因可能在个体之间有差异。根据一个实施方案，成瘾(例如尼古丁成瘾)可以用在脑岛上小区域的光遗传学稳定来治疗。任选地，可以使用功能性脑成象(例如cued-state PET或fMRI)来定位超代谢的病灶，以确定用于在脑岛表面上干预的精确靶点。
[0314] 伏隔核和隔的光遗传学激发可以向患者提供奖赏和愉快感，而不需要借助于使用物质，因此可以掌握成瘾治疗的关键。相反地，可以使用伏隔核和隔的光遗传学稳定来降低在成瘾环境中的药物渴望。在一个替代实施方案中，可以使用在前扣带(BA32)的膝部观察到的超代谢活性的光遗传学稳定来降低药物渴望。还可以使用在下丘脑内侧的弓状核内的细胞(其中含有促阿黑皮素原(POMC)和可卡因与安非他明调节转录(CART)的肽产物)的光遗传学稳定来减少药物成瘾行为。关于这方面的其它信息，可以参考：Naqvi NH,Rudrauf D,Damasio H,Bechara A.“Damage to the insula disrupts addiction to cigarette smoking.”Science，2007年1月26日；315(5811):531-534，将其以引用的方式全部并入本文。
[0315] 可以使用分泌促生长素抑制素的下丘脑室周核的神经内分泌神经元的光遗传学刺激来抑制生长激素从垂体前叶分泌，例如在肢端肥大症中。可以使用分泌促生长素抑制素或生长激素的神经内分泌神经元的光遗传学稳定来增进生长和身体发育。在伴随“正常”衰老的变化中，是在第4个和第5个十年之后的血清生长激素水平的急剧下降。因此，与衰老相关的身体衰退可以通过室周核的光遗传学稳定来减轻。
[0316] 可以使用下丘脑的腹内侧核(特别是弓状核的促阿黑皮素原(POMC)和可卡因与安非他明调节转录(CART))的光遗传学稳定来增进食欲，并且从而治疗神经性厌食。或者，可以使用下丘脑的外侧核的光遗传学刺激来增进食欲和进食行为。
[0317] 在受影响区(包括颞叶、NBM(Meynert的基底核)和扣带回后部(BA 31))的胆碱能细胞中的光遗传学激发向退化区域提供刺激，并且因此向退化区域提供神经营养动力。因为受影响的地区在脑内分布广泛，所以用植入电极的类似治疗可能比光遗传方法可行性更小。
[0319] 在正常的生理环境中，视网膜的光敏神经细胞(其响应于它们接收的光去极化)产生接收光图案的视觉图。在身体的许多部分中，可以使用光遗传学离子通道模拟该过程，眼睛也不例外。在由于视网膜损伤导致的视觉损伤或失明的情况下，可以生长功能上的新视网膜，这使用自然环境光而非来自植入装置的闪光类型。人工视网膜生长可以放在原始的视网膜位置(在此它可以利用视神经作为回到视觉皮质的通道)。或者，可以将人工视网膜放在另一个位置，如前额，条件是用于去极化信号的通道被传输到皮质组织，所述皮质组织能够解码来自光遗传学传感器矩阵的编码信息。皮质盲还可以通过模拟视觉皮质的视路下游来治疗。所述刺激将基于视觉皮质的上游或人工光传感器产生的视觉数据。
[0320] 心动过速的治疗可以用对副交感神经系统纤维(包括CN X或迷走神经)的光遗传学刺激来实现。这导致SA结速率的降低，从而降低心率和收缩压力。类似地，在脊神经T1至T4内的交感神经系纤维的光遗传学稳定用来减缓心脏。对于病理学心动过缓的治疗，迷走神经的光遗传学稳定或在T1至T4中的交感神经纤维的光遗传学刺激将用来增加心率。由超过窦房结的异常电集中(aberrant electrical foci)产生的心律失常(Cardiac disrhythmias)可以通过用适度的光遗传学稳定处理所述异常电集中来抑制。这降低了在所述处理的组织内的触发固有速率，并且允许窦房结复得其在整速心脏的电系统中的角色。同样地，可以治疗任何类型的心律不齐。在心肌病或充血性心力衰竭中发生的心脏组织退化还可以使用本发明来治疗；其余的组织可以使用本发明的各种实施方案来激发。
[0321] 包括额叶、顶叶和海马的脑部区域的光遗传学激发刺激可以提高处理速度、改善记忆和刺激神经元的生长和互连，包括刺激神经祖细胞的发育。举例来说，本发明的一种此类应用针对丘脑中的靶标神经元的光遗传学激发刺激，用于使患者脱离接近植物(仅有知觉)的状态。在靶标丘脑神经元的膜中的光门控离子通道或泵的生长被影响。随后将一束光引导到这些修饰的神经元上对其进行刺激(例如，经由还可以通过相同通道进入的光学装置)，从而调节靶标神经元和/或周围细胞的功能。对于与适当的调节技术(经由基于电极的治疗)有关的其它信息或与这些患者相关的脑部区域有关的其它信息，可以参考：Schiff ND、Giacino JT、Kalmar K、Victor JD、Baker K、Gerber M、Fritz B、Eisenberg B、O’Connor JO、Kobylarz EJ、Farris S、Machado A、McCagg C、Plum F、Fins JJ、Rezai AR“Behavioral improvements with thalamic stimulation after severe traumatic brain injury”，Nature,第448卷，2007年8月2日，第600-604页。
[0322] 在一个替代实施方案中，光遗传学激发可被用于治疗在病状如充血性心力衰竭中的心肌衰弱。由于心脏壁的细拉伸、脆弱的状态，以及在电极和肌肉之间提供均匀分布的电偶联的难度，中对CHF的衰弱心肌的电辅助通常是不实用的。因此，迄今为止用于提高心肌收缩力的优选方法涉及药理学方法如β激动剂和机械方法如心室辅助装置。在本发明的该实施方案中，经由在围绕心脏或此外靠近受影响的心脏壁的夹套内表面上的光发射元件对衰弱的心肌输送光遗传学激发。为了平滑地覆盖大面积的肌肉，用各个光脉冲引起收缩，可以通过本领域熟知的方法将光发散。
[0323] 在扣带回(Cg25)的膝下部分中进行光遗传学稳定，可以用植入装置施加黄光。目标是以类似于Mayberg HS等“Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression”,Neuron，第45卷，651-660，2005年3月3日，第651-660页教导的方式通过抑制靶标活性来治疗抑郁症，将该文献以引用的方式全部并入本文。在一个替代实施方案中，光遗传学激发刺激方法以类似于Schlaepfer等“Deep Brain stimulation to Reward Circuitry Alleviates Anhedonia in Refractory Major Depression”Neuropsychopharmacology 2007，第1-10页教导的方式提高在该区域中的活性，将该文献以引用的方式全部并入本文。
[0324] 在又一个实施方案中，用光遗传学激发刺激方法靶向左背外侧前额皮质(LDPFC)。将LDLPFC的频率定在5-20Hz以增强该结构的基本代谢水平，这经由连接电路，用来降低在Cg 25中的活性，改善进行中的抑郁症。抑制右背外侧前额皮质(RDLPFC)也是一种有效的抑郁症治疗策略。这可以通过在RDLPFC上的光遗传学稳定来实现，或还可以通过使用光遗传学激发刺激来实现，并且以缓慢的速率(例如1Hz或更小)产生脉冲，改善进行中的抑郁症。
可以使用光遗传学方法来改善迷走神经刺激(VNS)。为了只刺激到大脑的迷走神经传入神经(如结状神经节和颈静脉神经节)，可以使用光遗传学激发。来自大脑的传出神经不会接收该方法的刺激，因此消除一些VNS的副作用，包括咽喉不适、咳嗽、吞咽困难和声音嘶哑。
在一个替代实施方案中，可以对海马进行光遗传学激发，引起树突和轴突生长加快，以及海马的总体生长加快。可以使用本发明治疗的和抑郁症有牵连的其它脑部区域包括扁桃体、横核(accumbens)、眶额叶皮质和内侧眶额叶皮质(orbitomedial cortex)、海马、嗅觉皮质和多巴胺能投射、5-羟色胺能透射和去甲肾上腺素能投射。可以使用光遗传学方法来控制活性通过类似海马的结构扩散，从而控制抑郁症状。
可以使用光遗传学方法来改善迷走神经刺激(VNS)。为了只刺激到大脑的迷走神经传入神经(如结状神经节和颈静脉神经节)，可以使用光遗传学激发。来自大脑的传出神经不会接收该方法的刺激，因此消除一些VNS的副作用，包括咽喉不适、咳嗽、吞咽困难和声音嘶哑。
在一个替代实施方案中，可以对海马进行光遗传学激发，引起树突和轴突生长加快，以及海马的总体生长加快。可以使用本发明治疗的和抑郁症有牵连的其它脑部区域包括扁桃体、横核(accumbens)、眶额叶皮质和内侧眶额叶皮质(orbitomedial cortex)、海马、嗅觉皮质和多巴胺能投射、5-羟色胺能透射和去甲肾上腺素能投射。可以使用光遗传学方法来控制活性通过类似海马的结构扩散，从而控制抑郁症状。
[0325] 只要在郎格罕(Langerhans)胰岛中存在有活力的α和β细胞，就可以靶向胰岛来治疗糖尿病。例如，当血清葡萄糖高(人工测定或通过闭环葡萄糖检测系统测定)时，可以使用光遗传学激发来引起胰腺中的郎格罕岛的β细胞释放胰岛素，而使用光遗传学稳定来阻止胰腺中的郎格罕岛的α细胞释放胰高血糖素。相反地，当血糖过低(人工测定或通过闭环葡萄糖检测系统测定)时，可以使用光遗传学稳定来阻止β细胞分泌胰岛素，并且可以使用光遗传学激发来增强α细胞分泌胰高血糖素。
[0326] 对于癫痫的治疗，可使用光遗传学方法平息或阻滞致癫痫活性。大多数癫痫患者具有由致癫痫病灶产生的常规形式的活性扩散。可以使用光遗传学稳定在其扩散之前或抑制异常的活性或在其过程的早期就将其消除。或者，可以以一系列有意的不同步类型递送经由光遗传学激发刺激的可激发组织的激活，从而破坏出现的发作活性。另一个替代方案涉及在GABA能神经元中进行光遗传学激发刺激的激活，从而提供类似的结果。当检测到异常的EEG类型时，可以用光遗传学稳定靶向丘脑中继核。
[0327] 另一个实施方案涉及胃肠病症的治疗。消化系统具有它自己的包含感觉神经元、运动神经元和中间神经元的半自主神经系统。这些神经元控制胃肠道的运动，以及引起肠中特定的细胞释放酸、消化酶和激素(包括胃泌素、缩胆囊素和促胰液素)。包括任何这些细胞产物分泌不足的综合症可以用产生细胞类型的光遗传学刺激或增强其活动的神经元来治疗。相反地，光遗传学稳定化可以用于治疗产生过多内分泌和外分泌产物的综合症。肠动力低下病症，从便秘(尤其是在患有脊髓损伤的患者中)到巨结肠(megacolan)，可以用肠内运动神经元的光遗传学刺激来治疗。肠运动过度的病症，包括一些形式的肠易激综合症，可以用控制运动的神经元的光遗传学稳定来治疗。神经性胃出口阻塞可以用在幽门中的神经元和肌肉的光遗传学稳定来治疗。对于活动度不足综合症的一种替代治疗方法是对肠壁中的拉伸敏感神经元提供光遗传学刺激，增强肠充满和需要排空的信号。
[0328] 在这个相同的模型中，肠过度活动综合症的一种治疗方法是向下胃肠道中的拉伸受体神经元提供光遗传学稳定，从而提供了一个肠是空的而不需要排空的“假提示”。在显性大便失禁的情况下，获得对内部括约肌和外部括约肌改善的控制可能是减缓整个消化道的运动的首选。在患者需要控制排便期间，对肛门内括约肌的光遗传学刺激将阻止排便。向外括约肌提供光遗传学刺激可以用于提供额外的克制。当患者需要排便时，应该放松肛门内括约肌，并随后放松肛门外括约肌，这可通过中止光遗传学刺激或通过增加光遗传学稳定来实现。
[0329] 传导性听力丧失可以通过使用光学耳蜗植入体来治疗。一旦耳蜗为光遗传学刺激做好准备，就可以使用闪光的耳蜗植入体。感觉神经性听力丧失可以通过对在听觉通路下游目标的光学刺激来治疗。
[0330] 本发明的另一个实施方案针对血压病症(例如高血压)的治疗。在如主动脉(主动脉体和主动脉旁体)和颈动脉(“颈动脉体”)的区域中的压力感受器和化学感受器通过经由迷走神经(CN X)和其它的到髓质和脑桥的途径(特别是孤束与核)发送传入信号来参与血压和呼吸调节。对颈动脉体、主动脉体、主动脉旁体的光遗传学刺激可以用于向孤束与核发送“高血压”的假信息，使其报告应该降低血压。对脑干的适当部分直接进行光遗传学刺激或稳定也可用于降低血压。其相反的形式使光遗传学方法作为升高血压的物质。通过对迷走神经的光遗传学刺激或通过对脊神经T1-T4内的交感神经纤维的光遗传学稳定也可以获得类似的效果。在一个替代实施方案中，可以用心脏的光遗传学稳定来治疗高血压，引起心排血量的降低和血压下降。根据另一个实施方案，对肾上腺皮质内产生醛固酮的细胞的光遗传学稳定可以用于降低血压。在又一个替代实施方案中，高血压可以通过血管平滑肌的光遗传学稳定来治疗。激活光可经皮传递到外周血管床。
[0331] 另一个示例实施方案针对下丘脑-垂体-肾上腺轴障碍的治疗。在甲状腺机能减退的治疗中，对在旁室和下丘脑前核中的小细胞神经内分泌(parvocellular neuroendocrine)神经元的光遗传学刺激可以用于增加促甲状腺素释放激素(TRH)的分泌。
TRH进而刺激垂体前叶分泌TSH。相反地，甲状腺机能亢进可以用小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定来治疗。对于治疗肾上腺皮质功能不全或阿狄森氏病(Addison's disease)，对视上核和室旁核中的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学刺激可以用于增加加压素的分泌，这在促肾上腺皮质素释放激素(CRH)的帮助下进行，刺激垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)。库欣综合症(Cushing syndrome)通常由ACTH分泌过多引起，通过与上述相同的生理连锁效应，可以用视上核的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定来治疗。弓状核的神经内分泌神经元产生多巴胺，其抑制垂体前叶分泌催乳素。因此，可以通过光遗传学刺激治疗来高催乳激素血症，然而低催乳激素血症可以用弓状核的神经内分泌细胞的光遗传学稳定来治疗。
TRH进而刺激垂体前叶分泌TSH。相反地，甲状腺机能亢进可以用小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定来治疗。对于治疗肾上腺皮质功能不全或阿狄森氏病(Addison's disease)，对视上核和室旁核中的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学刺激可以用于增加加压素的分泌，这在促肾上腺皮质素释放激素(CRH)的帮助下进行，刺激垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)。库欣综合症(Cushing syndrome)通常由ACTH分泌过多引起，通过与上述相同的生理连锁效应，可以用视上核的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定来治疗。弓状核的神经内分泌神经元产生多巴胺，其抑制垂体前叶分泌催乳素。因此，可以通过光遗传学刺激治疗来高催乳激素血症，然而低催乳激素血症可以用弓状核的神经内分泌细胞的光遗传学稳定来治疗。
[0332] 在超自律状态(hyperautonomic states)(例如焦虑症)的治疗中，肾上腺髓质的光遗传学稳定可以用于减少去甲肾上腺素的输出。类似地，肾上腺髓质的光遗传学刺激可以用于需要肾上腺素升高的患者，例如患有严重哮喘或者表现为慢性嗜睡病症的患者。
[0333] 肾上腺皮质的光遗传学刺激会引起包括皮质醇、睾丸酮和醛固酮的化学物质的释放。与肾上腺髓质不同，肾上腺皮质从自垂体和下丘脑、肺和肾脏分泌的神经内分泌激素来接收其指令。无论如何，肾上腺皮质可接受光遗传学刺激的处理。肾上腺皮质的产生皮质醇细胞的光遗传学刺激可以用于治疗阿狄森氏病。肾上腺皮质的产生皮质醇细胞的光遗传学稳定可以用于治疗库欣病。产生睾丸酮的细胞的光遗传学刺激可以用于治疗女性性兴趣病症。那些相同细胞的光遗传学稳定可以用于减少女性中的面部毛发。肾上腺皮质内产生醛固酮的细胞的光遗传学稳定可以用于降低血压。肾上腺皮质内产生醛固酮的细胞的光遗传学刺激可以用于升高血压。
[0334] 可以使用特定的被影响的脑部区域的光遗传学激发刺激来提高处理速度，并且刺激神经元的生长和互连，包括刺激神经祖细胞的成熟。这些用途对于智力障碍的治疗是特别有用的。
[0335] 根据本发明的另一个实施方案，可以治疗各种肌肉疾病和损伤。与肌肉损伤、外周神经损伤和营养不良疾病相关的麻痹可以用光遗传学激发引起收缩以及光遗传学稳定引起松弛来治疗。后者经由光遗传学稳定方法产生的松弛还可以用于预防肌肉消瘦、保持弹性并且当对抗肌肉群收缩时允许运动协调。同样地，可以经由光遗传学稳定来治疗显性痉挛。
[0336] 在诸如外周神经缺损、中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤的领域中，有必要促进新的神经元的生长，并且帮助其整合到与其它神经元和与其目标组织的功能网络中。可以经由光遗传学激发促进新神经束的再生长，光遗传学激发用来向干细胞发出生长轴突和树突的信号，并且用来将自身与网络整合。光遗传学技术(与电极相对比)的使用防止完整的组织接收信号，并且凭借与发育的神经元建立的通讯用来保证新目标组织的生长，并且不使用类似从电极发出的人工信号。
[0337] 对下丘脑的腹内侧核(特别是促阿黑皮素原(POMC)和弓状核的可卡因与安非他明调节转录(CART))进行光遗传学激发可以治疗肥胖。在一个替代实施方案中，可以经由下丘脑的外侧核的光遗传学稳定来治疗肥胖。在另一个实施方案中，对产生瘦素的细胞或下丘脑内具有瘦素受体的细胞进行光遗传学刺激可以用于降低食欲并且从而治疗肥胖。
[0338] 对所述区域的前囊层和类似的DBS进行破坏性损伤是治疗严重的、难治性强迫症48(OCD48)的已确立的方法。这些方法可以使用对内囊的内边缘或对一些区域如BA32和Cg24(当OCD减轻时显示代谢降低)的光遗传学稳定来模拟。
[0339] 慢性疼痛可以使用本发明的另一个实施方案来治疗。电刺激方法包括局部外周神经刺激、局部脑神经刺激和“亚阈值”运动皮质刺激。合理的自生方法包括在局部疼痛位点进行光遗传学稳定。注意启动子的选择将保证其它感觉和运动纤维不被影响。在初级运动皮质进行中间神经元的选择性光遗传学激发还可以提供有效的疼痛减轻。此外，在感觉丘脑(特别是内侧丘脑核)、室周灰质和腹侧中缝核进行光遗传学稳定可以用于产生疼痛减轻。在一个替代实施方案中，对表达小清蛋白的细胞进行光遗传学稳定的目标策略可以通过减少P物质的产生而用于治疗疼痛。内源性阿片的释放可以通过使用光遗传学激发以提高在伏隔核中的活性来实现。在一个替代实施方案中，当内侧下丘脑的弓状核的POMC神经元被光遗传学激发时，β内啡肽升高，为抑郁症和慢性疼痛提供了可行的治疗方法。
[0340] 某些人格障碍，包括边缘性和反社会的类型，在包括“额叶功能过低”的脑部病症中显示局灶性缺损(focal deficits)。预期这些区域的直接或间接的光遗传学激发可产生改善的症状。还已知扁桃体中活动的异常爆发促使突然的、自发的感想(flights)变成愤怒：一种边缘性人格障碍以及其它病状的症状，这可以受益于扁桃体的光遗传学稳定。光遗传学方法可以改善脑部(包括扁桃体、纹状体和额皮质)的不同部分不同的通讯和同步，这可以促进降低冲动并且提高洞察力。
[0342] 精神分裂症的特征在于包括幻听的异常。这些可以通过使用光遗传学稳定抑制听觉皮层来治疗。与精神分裂症有关的额叶功能过低可以用受影响的额区的光遗传学激发来治疗。光遗传学方法可以改善脑部的不同部分之间的通讯和同步，这可有助于将自生刺激作为外来刺激的错误认定。
[0343] 在内侧下丘脑的弓状核内的细胞(其含有促阿黑皮素原(POMC)和可卡因与安非他明调节转录(CART)的肽产物)的光遗传学稳定可被用于减少强迫性行为。在内侧下丘脑的弓状核内的细胞(其含有促阿黑皮素原(POMC)和可卡因与安非他明调节转录(CART)的肽产物)的光遗传学激发可以在性欲的病例的治疗中用于提高性兴趣。在性欲减退病症的治疗中，可以通过脑垂体的光遗传学激发来增强睾丸和肾上腺产生睾丸酮。伏隔核的光遗传学激发可以用于治疗性快感缺失。
[0344] 视交叉上核分泌褪黑素，褪黑素用来调节睡眠/觉醒循环。对视交叉上核进行光遗传学激发可被用于增强褪黑素的产生，诱导睡眠，并且进而治疗失眠。为了促进觉醒，促食欲素(下视丘分泌素)神经元强烈地激发大量的脑核。产生促食欲素的细胞群体的光遗传学激发可被用于治疗发作性睡眠和慢性白天嗜睡。
[0345] 视上核的光遗传学刺激可用于诱导催产素的分泌，可用于促进在分娩期间的分娩，并且可用于治疗社会性依附病症。
[0346] 类似肌肉麻痹，由脊髓损伤阻滞传入神经的运动功能可以用光遗传学激发以引起收缩以及光遗传学稳定以引起松弛来治疗。后者经由光遗传学稳定方法产生的松弛还可以用于预防肌肉消瘦、保持弹性并且当对抗肌肉群收缩时允许运动协调。同样地，可以经由光遗传学稳定来治疗显性痉挛。可以经由光遗传学激发促进新脊神经束的再生长，光遗传学激发用来向干细胞发出生长轴突和树突的信号，并且用来将自身与网络整合。
[0347] 卒中障碍包括人格改变、运动障碍、感觉障碍、认知丧失和情绪不稳定。治疗卒中障碍的一种策略是向已经由激发连接阻滞传入神经的脑部和身体结构提供光遗传学刺激。类似地，可以对已经由抑制连接阻滞传入神经的脑部和身体结构带来光遗传学稳定能力。
[0348] 研究表明图雷特综合症(Tourette's syndrome)的基本病理学是皮质和皮质下区域、丘脑、基底神经节和额皮质中的多巴胺传输的阶段性功能紊乱。为了提供治疗，优选首先使用包括功能性脑成象和脑磁图(MEG)的技术来鉴别受影响的区域。无论是否被明确地鉴别，都可以使用候选束的光遗传学稳定来抑制动作型抽搐。装置参数的植入后经验性检测显示哪些光遗传学稳定位点，以及哪些不必要继续。
[0349] 为了治疗尿失禁或大便失禁，可以对括约肌使用光遗传学稳定，例如经由膀胱逼尿平滑肌或该肌肉的神经分布的光遗传学稳定。当需要排尿时，就将这些光遗传学过程关掉，或者可以用对(外部)尿括约肌的光遗传学稳定以及光遗传学激发膀胱逼尿肌或其神经分布将其反转。当已经阻滞膀胱的传入神经时，例如，当切断骶后根或被后根疾病(如人脊髓痨)破坏骶后根时，膀胱的所有反射性收缩消除，膀胱变得扩大。可以使用肌肉的直接光遗传学激发来修复逼尿肌的弹性，预防肾脏损伤，并且有助于排尿过程。随着膀胱变得“分散”并且对移动非常敏感，并且从而倾向于失禁，就可以使用对膀胱肌肉的光遗传学稳定来使器官的反应最小化。
[0350] 为了选择性地激发/抑制给定的神经元群体，例如涉及疾病病情的那些，可以使用若干策略将光遗传学蛋白/分子靶向至特定的群体。
[0351] 对于本发明的各种实施方案，可以使用遗传靶向来表达各种光遗传学蛋白或分子。该靶向涉及经由遗传控制元件的光遗传学蛋白/分子的靶向表达，这些遗传控制元件如启动子(例如小清蛋白、促生长素抑制素、缩胆囊素、GFAP)、增强子/沉默子(例如巨细胞病毒极早期基因增强子(Cytomaglovirus Immediate Early Enhancer))和其它转录或翻译调控元件(例如土拨鼠肝炎病毒后转录调控元件)。可以使用启动子+增强子+调控元件组合的变换来限制光遗传学探针对基因界定的群体的表达。
[0352] 本发明的各种实施方案可以使用空间/解剖学靶向来实现。该靶向利用的事实是携带遗传信息(DNA质粒、片段等)的神经元、病毒或其它试剂的投射图案可被集中地递送至计划的给定神经元群体的区域。所述遗传物质随后将被转运回到神经元体以调节光遗传学探针的表达。或者，如果希望在集中的区域中标记细胞，可以将病毒或遗传物质集中地递送至所述目标区域以调节局部的表达。
[0353] 使用各种基因递送系统来实现本发明的一种或多种实施方案。一种该递送系统是腺病毒相关病毒(AAV)。可以使用AAV来向特定的目标区域递送启动子+光遗传学探针盒。启动子的选择将促进特定群体的神经元的表达。例如，使用CaMKIIa启动子将促进光遗传学探针的激发神经元特定表达。AAV将调节至少一年或一年以上的光遗传学探针的长期表达。为了获得更多的特异性，可以用特定的血清型1、2、3、4、5、6、7和8将AAV假型化，各种血清型对于不同的细胞类型有不同的营养作用。例如，已知血清型2和5具有良好的神经元特定的营养作用。
[0354] 另一种基因递送机构使用逆转录病毒。可以使用HIV或其它基于慢病毒的逆转录病毒载体来向特定的目标区域递送启动子+光遗传学探针盒。还可以用狂犬病病毒被膜糖蛋白将逆转录病毒假型化，从而对于基于其轴突投射图案的标记细胞实现反向转运。将逆转录病毒合并到宿主细胞的基因组中，从而能够调节光遗传学探针的持久的表达。可以使用基于非慢病毒的逆转录病毒载体选择性地标记分裂细胞。
[0355] 无肠腺病毒和单纯疱疹病毒(HSV)是两种基于DNA的病毒，同样可以使用它们将启动子+光遗传学探针盒递送到脑部的特定区域中。HSV和腺病毒具有大得多的组装能力，并且因此可以容纳多得多的启动子元素并且还可以用于递送多种光遗传学探针或与光遗传学探针一起的其它治疗基因。
[0356] 还可以使用焦点电穿孔来瞬间转染神经元。可以将DNA质粒或片段集中地递送到脑部的特定区域中。通过施加轻微的电流，周围的局部细胞将接收所述DNA材料并且表达光遗传学探针。
[0357] 在另一种情况下，可以通过将遗传物质与脂质试剂混合并且随后注入脑部以调节局部细胞的转染来使用脂质转染。
[0358] 多种实施方案涉及各种控制元件的使用。除了遗传控制元件之外，可以使用其它控制元件(特别是活性对化学、磁刺激或红外辐射敏感的启动子和增强子)来调节光遗传学探针的暂时受控的表达。例如，转录活性经受红外辐射的启动子允许人们只在希望的时间使用集中的辐射来适度调整焦点区域中的光遗传学探针的表达。
[0359] 通过在丘脑底核(STN)或内侧苍白球(GPi)中的谷氨酸能神经元中使用激发特异性启动子(如CaMKIIα)表达光遗传学稳定并且施加光遗传学稳定，可以治疗帕金森氏病。不同于所有细胞类型都被影响的电调节，只有谷氨酸能STN神经元受到抑制。
[0360] 本发明的方面针对检测神经回路或疾病的模型。所述模型可以作为输入信号的函数来确定回路的输出响应。输出响应可以使用若干不同可测量特性来评价。例如，这些特性可以包括下游神经元的电反应和/或患者的行为响应。为了检测所述模型，在所述模型的输入位置表达光遗传学探针。刺激所述光遗传学探针并监测输出特性并且与所述模型预计的输出比较。
[0361] 在某些方案中，使用光遗传学探针允许使用电探针确定的模型的微调。因为电探针对刺激的引导只提供有限的能力并且因此不适于刺激某些区域而不直接刺激附近的区域。本文中公开的光遗传学探针提供用于更精确地选择刺激位置的装置。例如，可以使来自光遗传学探针的刺激针对回路/细胞的非常特异性的类型，如传入纤维。以下描述提供与该实施方案一致的示例方案，并且希望展示本发明的方面的可行性和广泛的适用性。
[0362] 根据本发明的一个实施方案，可以在DBS的动物模型(例如在帕金森大鼠中)中使用本发明以鉴别负责治疗作用的靶细胞类型(具有激烈的争论和巨大的临床重要性的区域)。该知识单独可导致用于治疗人类疾病的提高的药理学和手术策略的发展。
[0363] 一种此类应用涉及两个神经组之间的长期增强(LTP)和/或长期抑制(LTD)。通过将VChR1和ChR2的表达靶向不同的神经群体并且用不同频率的光刺激每一个，可以实现两组之间的LTP或LTD。可以使用相应的波长的光分别控制各组。这对一些应用可能是特别有用的，在这些应用中两个组的空间排列带来了使用相同波长的光的单独控制的问题。因此，所述光输送装置对激发错误神经组的敏感性更小并且对光刺激的精确空间位置的依赖性更小。
[0364] 可以使用若干不同的递送装置、方法和系统来实现对体内细胞递送蛋白。在该递送装置上有植入装置，植入装置递送用于体内修饰细胞的核苷酸序列，如病毒载体。所述植入装置还可以包括光输送装置。所述光输送可以使用例如发光二极管(LED)、光纤和/或激光来实现。
[0365] 本发明的另一个实施方案涉及在影响干细胞命运(包括存活/死亡、分化和复制)中使用VChR1。已经证明电性质的调节可以控制干细胞历程。可以使用各种技术来提供调节干细胞历程的刺激模式。一个特定的实例与Deisseroth,K.等“Excitation-neurogenesis coupling in adult neural stem/progenitor cells”Neuron 42,第535-552页(2004)中说明的技术一致，将该文献以引用的方式全部并入本文。
[0366] 本发明的另一个实施方案涉及使用DChR和/或GtR3评价治疗效能。这可以包括但不限于药物筛选、治疗方案或治疗/病症的模型。在一个特定实施方案中，DChR在这些评价中用作主要的光响应蛋白。在替代实施方案中，DChR与对不同波长响应的其它类型的光响应蛋白(例如VCHR1、GtR3、ChR2和/或NpHR)一起使用。
[0367] 本文中还提供识别动物或组织中的神经细胞之间的跨突触连接的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A中的神经细胞施用编码融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B中的神经细胞施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在；以及c)识别在区域B中表达所述光激活蛋白的神经细胞，其中在所述神经细胞中的光激活蛋白的表达指示这些细胞与区域A中的细胞跨突触连接。
[0368] 本文中还提供在动物或组织的靶标神经细胞中产生光控制的方法，所述方法包括：a)对所述动物或组织的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，并且其中在区域A和区域B中的神经细胞跨突触连接；以及c)用激活所述蛋白的光控制区域B中的神经细胞的动作电位。
[0369] 本文中还提供控制动物中的神经元的动作电位的方法，所述方法包括用光激活所述神经元中的光激活蛋白以产生动作电位变化，其中所述神经元中的光激活蛋白的表达通过以下步骤产生：a)对所述动物的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体，b)对含有所述神经元的动物的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，其中在区域A和区域B中的神经元跨突触连接。
[0370] 在一些实施方案中，所述病毒载体是选自由AAV、HSV和慢病毒组成的组的病毒载体。在一些实施方案中，所述跨细胞示踪蛋白是麦胚凝集素(WGA)或破伤风毒素片段C(TTC)。
[0371] 应理解本文中描述的各种实施方案的性质中的一种、一些或全部可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0372] 应理解本文中描述的本发明的方面和变化形式包括“包含”和/或“基本上包含”方面和变化形式。
[0374] “分离的”多核苷酸是已经被鉴别并且从其自然环境的成分中分离的多核苷酸。
[0375] 本文中包括对“约”某一个值或参数的提及包括(以及描述)针对所述值或参数本身的变量。例如，对“约X”的描述包括对“X”的描述。术语“约”具有其正常含义-大约。在一些实施方案中，“约”表示±10％或±5％。
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
[0383]
[0384] 本文中提供了动物细胞，所述动物细胞包括但不限于神经细胞、细胞系和肌细胞，所述动物细胞包含：表达响应于蓝光的质子泵的整合外源分子，所述外源分子来源于蓝隐藻。
[0385] 本文中还提供一种方法，所述方法包括：修饰来源于蓝隐藻的光响应蛋白以在所述光响应蛋白的C末端添加内质网(ER)输出信号。
[0386] 本文中还提供一种用于控制体内神经元的动作电位的系统，所述系统包括：将蛋白引入所述神经元的递送装置，所述蛋白对蓝光响应且产生抑制电流；产生用于刺激所述蓝光响应蛋白的光的蓝光源；和控制光源产生光的控制装置。
[0387] 本文中还提供针对表达GtR3质子泵的细胞的光刺激的系统、方法、装置或试剂盒。
[0388] 本文中还提供针对控制使用GtR3和/或DChR的亚细胞过程的系统、方法、装置或试剂盒。
[0389] 本文中还提供针对在常见的细胞网络的不同细胞群体中使用GtR3和DChR的系统、方法、装置或试剂盒。
[0390] 本文中还提供针对DChR的系统、方法、装置或试剂盒。
[0391] 本文中还提供与本文中描述的任何序列(例如表1中所示序列)一致的蛋白。
[0392] 本文中还提供针对DChR或GtR3与其它光响应视蛋白类型(这可以基于其反应类型)的组合的系统、方法、装置或试剂盒。
[0393] 本文中还提供针对三种或三种以上光响应视蛋白类型的组合的系统、方法、装置或试剂盒。
[0394] 本文中还提供用于提供使用在相同细胞中但是与不同的光反应的多种视蛋白类型的多种水平活性的方法。
[0395] 本文中还提供用于提供使用在相同细胞中的多种视蛋白类型的多种水平活性的方法，从而通过交替刺激各种视蛋白类型来提供频率增加的通道功能。
[0396] 本文中还提供针对肌肉控制的系统、方法、装置或试剂盒。
[0397] 本文中还提供针对若干不同细胞组的组合控制的系统、方法、装置或试剂盒，各组具有不同的视蛋白组合，从而各组独立于至少一种其它组而被控制。
[0398] 本文中还提供包含用于控制细胞(或细胞群体)的反馈环路的系统，所述细胞中表达多种光响应蛋白类型。
[0399] 本文中还提供治疗应用包括但不限于帕金森氏病的治疗。
[0400] 本文中还提供针对在视网膜细胞/再训练脑中植入以响应多种波长的强度的系统、方法、装置或试剂盒。
[0401] 本文中还提供针对药物检测的系统、方法、装置或试剂盒。
[0402] 本文中还提供针对用转基因动物使用GtR3和/或DChR的系统、方法、装置或试剂盒。
[0403] 本文中还提供针对细胞中的pH水平的控制的系统、方法、装置或试剂盒，包括但不限于细胞器中的pH水平的控制，可以实现此(不限于)以促进或抑制其功能或杀死或破坏所述细胞。实施例
[0404] 根据某些实施方案，亚细胞和跨细胞运输策略现在允许(1)在远红/红外边缘进行光调节和跨越整个可见光谱的光遗传学控制的扩充；(2)提高光抑制效能而不增加光功率需求(保持早先工具的光敏感性和可逆、阶梯形动力学稳定性的毫微安培级氯离子调节的光电流；以及(3)不仅基于遗传同一性，而且还基于形态和组织拓扑学的靶向细胞的可推广策略，从而当启动子未知或在遗传难治性有机体中时允许多样的靶向。这些结果说明使用细胞生物学原理来实现适于完整系统生物学和行为的多样快速光遗传学技术的扩展。
[0405] 本公开的特定方面涉及分子运输策略的应用，以获得一组数量和质量上都提高光遗传学效率的工具并且开辟独特的研究领域。具体来讲，开发允许仅凭借其在组织内的拓扑学关系就靶向细胞并且使光控制的范围延伸到红外边缘的工具，使效应子功能提高到超过其它已知工具的水平并且覆盖整个可见光谱。
[0406] 根据本公开，对表达eNpHR2.0的海马神经元的研究显示缺少球状ER累积与持久的胞内标记和差的膜定位，表明在ER输出步骤之后的其它修饰是重要的。对两种形式的具有不同膜定位的内向整流型钾通道(Kir2.1和Kir2.4)之间的一级序列差异的研究显示不仅C末端ER输出基序不同，而且N末端高尔基输出信号和C末端运输信号也不同(Hofherr等，2005)。令人惊讶的是，提供高尔基输出信号不显著地影响表面表达，但是在eNpHR和EYFP融合或在融合蛋白的C末端之间任何一个中添加来自Kir2.1的运输信号显著地减少胞内标记并且增加明显的表面膜表达，并且还改善细胞过程的标记。实际上，高分辨率共焦成像显示在过程中的标记的定位，跨越胞内区域的可识别的标记的膜显然缺少视蛋白-EYFP融合蛋白，先前用NpHR或其衍生物从未观察到这种图案。
[0407] 我们使用全细胞膜片钳记录研究了光电流，以定量氯视紫红质蛋白泵分子的真实功能性质膜定位。实际上光电流大大增加(达到比最初描述的NpHR电流大～20倍的水平；平均值±平均标准误差[SEM]，光电流747.2±93.9pA，在人突触蛋白I启动子下的慢病毒转导的海马锥体神经元中；n＝10)。图25小图D展示附图左侧部分的代表性迹线(traces)，以及附图右侧部分的汇总图线(summary plots)。图25小图D的代表性迹线和汇总图线展示表达eNPHR3.0(747.2±93.9pA，以黑色展示)和eNpHR2.0(214.1±24.7pA；未配对的t检验，p,0.0005；n＝10，以灰色展示)的细胞中的平均光电流水平。进行膜片的所有神经元的膜输入电阻相似(eNpHR:193.1±36.6MΩ；eNpHR3.0:151.6±28.5MΩ；未配对的t检验，p＝0.37)。
在以下描述的作用光谱峰，用3.5mW/mm2黄光容易地观察到毫微安培级的平均外向电流，比质子泵获得该光电流水平需要的强度的数量级低(保持低光强度只对体内试验是一个重要的问题，其中安全控制大的组织体积是最重要的)(Aravanis等，2007；Adamantidis等，
2007；Chow等，2010)。图25小图E展示eNpHR3.0(黑色)和eNpHR2.0(灰色)的代表性电压迹线(图的左侧部分)和汇总图线(右侧部分)。在病毒转导的神经元中，在相同的适当光功率水平下，通常可以获得>100mV的光诱导的超极化，如图25小图E所示(在表达eNpHR3.0的细胞中的平均超极化：101.0±24.7mV，n＝10；eNpHr2.0：57.2±6.8mV，未配对的t检验，p,
0.0005，n＝10)。这种新量值的膜电位变化在光遗传学抑制中提供功能上独特的进展，因此我们将这第三代NpHR表示为eNpHR3.0(盐碱单胞菌(Natronomonas)氯视紫红质蛋白在2005[Sato等，2005]中命名为NpHR，由Gradinaru等[2008]开发的第一代运输增强型现在称为eNpHR2.0)。先前研究(Zhang等，2007a)显示，NpHR光电流是阶梯形的并且经10min以上的连续照射很少显示失活(实际上，因此选择了NpHR，如Zhang等[2007a]描述)，正如所预期的，eNpHR3.0光电流也是阶梯形的，对抵抗失活，并且对多种光脉冲和长时间跨度(行为相关的)有高稳定性(Zhang等，2007a)。
在以下描述的作用光谱峰，用3.5mW/mm2黄光容易地观察到毫微安培级的平均外向电流，比质子泵获得该光电流水平需要的强度的数量级低(保持低光强度只对体内试验是一个重要的问题，其中安全控制大的组织体积是最重要的)(Aravanis等，2007；Adamantidis等，
2007；Chow等，2010)。图25小图E展示eNpHR3.0(黑色)和eNpHR2.0(灰色)的代表性电压迹线(图的左侧部分)和汇总图线(右侧部分)。在病毒转导的神经元中，在相同的适当光功率水平下，通常可以获得>100mV的光诱导的超极化，如图25小图E所示(在表达eNpHR3.0的细胞中的平均超极化：101.0±24.7mV，n＝10；eNpHr2.0：57.2±6.8mV，未配对的t检验，p,
0.0005，n＝10)。这种新量值的膜电位变化在光遗传学抑制中提供功能上独特的进展，因此我们将这第三代NpHR表示为eNpHR3.0(盐碱单胞菌(Natronomonas)氯视紫红质蛋白在2005[Sato等，2005]中命名为NpHR，由Gradinaru等[2008]开发的第一代运输增强型现在称为eNpHR2.0)。先前研究(Zhang等，2007a)显示，NpHR光电流是阶梯形的并且经10min以上的连续照射很少显示失活(实际上，因此选择了NpHR，如Zhang等[2007a]描述)，正如所预期的，eNpHR3.0光电流也是阶梯形的，对抵抗失活，并且对多种光脉冲和长时间跨度(行为相关的)有高稳定性(Zhang等，2007a)。
[0408] 图30小图A展示eNpHR3.0经短时间跨度的稳定性和恢复。图30小图A的左侧部分中的代表性迹线展示表达eNpHR3.0的细胞在暴露于间隔(从图30小图A自上到下)2.5秒、5秒、10秒和20秒的10秒长黄光脉冲对时的光电流。图30小图A的右上方部分展示在表达eNpHR3.0的细胞中显示标准化的平均光电流水平的相隔20秒脉冲的汇总图线(P1＝第一脉冲峰，1.00，S1＝第一脉冲稳定状态，0.74±0.01；P2＝第二脉冲峰，0.86±0.02；n＝11)。图
30小图A的右下方部分展示显示大约50％峰恢复的相隔20秒的脉冲的汇总图线(P2-S1)/(P1-S1)。20秒之后，峰恢复至(45.2±6.6)％。图30小图B展示长期连续光照的NpHR3.0标准化光电流的时程(n＝11；绘图的各为平均值±SEM)。图30小图C展示经10分钟的eNpHR3.0稳定性的外向电流(593nm的光输送由实心条表示；输出功率密度：2.5mW/mm2)。
30小图A的右下方部分展示显示大约50％峰恢复的相隔20秒的脉冲的汇总图线(P2-S1)/(P1-S1)。20秒之后，峰恢复至(45.2±6.6)％。图30小图B展示长期连续光照的NpHR3.0标准化光电流的时程(n＝11；绘图的各为平均值±SEM)。图30小图C展示经10分钟的eNpHR3.0稳定性的外向电流(593nm的光输送由实心条表示；输出功率密度：2.5mW/mm2)。
[0409] 为了阐明是否在哺乳动物脑部体内保持强的改善的表达，我们将递送在CaMKIIα启动子控制下的新颖视蛋白基因的慢病毒载体注射到成年小鼠海马结构的CA1区域中并且研究了表达的EYFP融合的分布。如同在培养细胞中，在体内树突中和体内轴突中都观察到eNpHR3.0和eNpHR3.1(具有相同功能但是去除N末端信号肽的eNpHR3.0的较短型)两者的强表达。对于系统神经生物学的主要体内契机是不仅控制自区域A至区域B的投射，而且控制具有自A至B的投射(在其连接中)的细胞类型本身。这种根本上不同的结果需要光控制与其它靶向方法的复用。这种控制将在系统神经生物学中具有巨大的价值；例如，皮质兴奋性锥体神经元构成遗传学和解剖学上定义的一类细胞，但是在这类细胞中是各自投射到脑部多种不同区域(例如丘脑、脊髓、纹状体和其它皮质区)的细胞，因此具有基本上不同的作用(Lein等，2007；Yoshimura等，2005)。遗传工具发展得足以区分所有这些不同细胞种类是不可能的，指出有必要抑制或激发由连接拓扑学定义的细胞(图26小图B)。实现该目标的一种方式是利用跨细胞运输：向局部细胞体位置引入有条件地表达选择的微生物视蛋白基因的Cre依赖性病毒(例如，Tsai等，2009)，而不是另外使用Cre-drive小鼠系，反而将表达融合到跨细胞示踪蛋白(例如麦胚凝集素(WGA)(图26小图B)或破伤风毒素片段C(TTC))的Cre重组酶的病毒引入一种远缘目标结构(选择通过解剖学连接来定义目标细胞)(Kissa等，2002；Maskos等，2002；Perreault等，2006；Sano等，2007；Sugita和Shiba，2005)。如果解剖学上连接并且激活由该连接定义的局部细胞的亚型中的视蛋白表达，那么融合蛋白中的Cre重组酶将与示踪物一起通过假定的内体运输装置转运至局部细胞体位置(图26小图B)(Gradinaru等，2007，2009；Petreanu等，2007，2009)。注意该方法不需要靶细胞的任何特定的启动子片段或遗传定义(对于在基因不易操控的物种如大鼠和灵长目中使用，这是一个明显的优点)；但如果需要的话，可以容易地添加这种额外的遗传改良(例如，在可用时均可以在细胞类型特异性启动子的控制下递送WGA-Cre和Cre依赖性视蛋白)，产生用于阐明在连接、位置和基因的交叉定义的细胞的多样性方法。
[0410] 该构思首先在大鼠中通过设计策略选择性地将eNpHR3.0引入涉及与主要感觉皮质(S1)的皮质-皮质连接的主要运动皮质(M1)微电路中验证(Colechio和Alloway，2009)。为此，我们注射了先前描述的Cre依赖性AAV，现在有条件地将eNpHR3.0表达到运动皮质中，并且将新颖的表达WGA-Cre的AAV(AAV2-EF1α-mCherry-IRES-WGA-Cre)远距离注射到主要躯体感觉皮质中。实际上，尽管远距离注射Cre重组酶AAV，注射5周之后，在运动皮质神经元的分布亚型中观察到强的eNpHR3.0-EYFP表达；在无Cre重组酶的对照动物中，没有观察到来自这些Cre-依赖性AAV的表达(Tsai等，2009；Sohal等，2009)。图26小图C展示WGA-Cre和Cre依赖性AAV载体的构建体设计，其中WGA和Cre基因都用哺乳动物密码子进行优化了。与Cre的跨突触或跨细胞转运的预期模式一致，在运动皮质中没有观察到mCherry阳性细胞体，在S1感觉皮质中没有观察到EYFP阳性细胞体。Cre可以从转导的细胞中跨突触释放，从而只在已接收Cre依赖性病毒的突触连接的神经元中(而不是在其它神经元中)激活远缘的基因表达。来自M1的预期EYFP-eNpHR3.0轴突末端存在于S1中。为了验证eNpHR3.0在WGA系统下的功能，进行同时的光极刺激/记录(Gradinaru等，2007)；实际上，在M1中容易地观察到强的抑制，如XFP-视蛋白融合蛋白的强烈荧光所预期的。这些数据表明涉及皮质-皮质连接的神经元实际上不仅可以作为投射来定位和靶向，还可以作为连接性定义的细胞类型来实现。
[0411] 为了在不同电路中并且用不同视蛋白独立地验证该靶向技术，我们接下来靶向涉及半球间投射的海马结构齿状回神经元。在齿状门内，唯一已知的单突触对侧投射来自门苔藓(hilar mossy)细胞，其在对侧齿状颗粒细胞上终止，在分子层的树突中(Freund和Buzsaki，1996；Ratzliff等，2004)。将WGA-Cre AAV单侧注入一个齿状回中，同时将Cre依赖性AAV注入相同动物的对侧齿状回。惊人的是，只在对侧门细胞中观察到视蛋白表达。实际上，在这种情况下并且在该时间点，Cre的累积在对侧门细胞的反向和单突触，因为在对侧颗粒细胞层中没有观察到EYFP标记；此外，针对用该AAV血清型缺少轴突末端的直接转导，在对侧齿状中没有观察到mCherry。在同侧齿状(ipsilateral dentate)中唯一表达EYFP的电路元件(提供光控制的精确时机)是观察到在颗粒细胞层的分子层中终止的轴突纤维，正如对于来自对侧齿状门的纤维所预期的一样。实际上，体内光极记录证实了WGA/Cre激活的ChR2在表达视蛋白的细胞体和表达ChR2的细胞的轴突投射神经元下游中，在对侧半球中的促进光触发的脉冲中的功能；与上述光遗传学研究(Zhang等，2007a、2007b)一致，通过光纤以30Hz输送的470nm光脉冲(5ms脉冲宽度)可靠地促进了体内神经元触发。
[0412] 在完整组织内工程化视蛋白的这些靶向策略的应用产生了是否在体内可调节的组织体积方面可以出现其它优点这一问题。虽然仅仅膜运输修饰不会改变作用光谱，但是能够在远红光中控制神经元是光遗传学长期追求的目标，因为这将允许使用向散射生物学组织穿透更深的光(如同最近对于荧光蛋白显示的远红外应用一样)(Shu等，2009)，因此将允许更大体积的恢复(Aravanis等，2007；Adamantidis等，2007；Gradinaru等，2009)。对于eNpHR3.0观察到的大的光电流(是最初对于NpHR报告的～20x，其本身能够阻滞响应于589nm黄光的脉冲)显示用远红光可以实现光遗传学控制。因此，我们用运输增强的eNpHR3.0研究了在远红光中的光控制。
[0413] 即使响应于只有3.5mW/mm2的真红光(630nm)，我们也在病毒转导的细胞中观察到有效的～250pA外向光电流—比用黄光首先观察到的NpHR电流还大6倍(图27小图A)，并且保持NpHR典型的特征性阶梯形、稳定动力学(表达eNpHR3.0和表达eNpHR2.0的神经元：eNpHR3.0：239.4±28.7pA；eNpHR2.0：42.7±4.5pA；未配对的t检验，p＝0.00004；n＝10)(Zhang等，2007a)。此外，我们发现由红光激起的这些光电流可以在海马锥体神经元中用于激发大的(>40mV)超极化(图27小图B)(表达eNpHR3.0和表达eNpHR2.0的神经元：eNpHR3.0：
43.3±6.1mV；eNpHR2.0：15.6±3.2mV；未配对的t检验，p＝0.00116；n＝10)。因此，我们研究了更远的红移光。我们在具有660nm的深红光和具有680nm的红光/红外光边缘中继续观察到强的光电流(图27小图C)。在680nm，光电流(～75pA)仍然比早先在7mW/mm2报告的峰(黄光)eNpHR2.0电流大。重要的是，在检测的所有红色和远红波长，eNpHR3.0光电流容易地阻滞由具有7mW/mm2或更小的电流注射诱导的动作电位，证实光遗传学控制通道扩充到了远红光。由不同波长的红色和远红/红外边缘照射激起的外向光电流是：239.4±28.7pA(n＝10)，在630nm；120.5±16.7pA(n＝4)，在660nm；以及76.3±8.1pA(n＝4)，在680nm。
43.3±6.1mV；eNpHR2.0：15.6±3.2mV；未配对的t检验，p＝0.00116；n＝10)。因此，我们研究了更远的红移光。我们在具有660nm的深红光和具有680nm的红光/红外光边缘中继续观察到强的光电流(图27小图C)。在680nm，光电流(～75pA)仍然比早先在7mW/mm2报告的峰(黄光)eNpHR2.0电流大。重要的是，在检测的所有红色和远红波长，eNpHR3.0光电流容易地阻滞由具有7mW/mm2或更小的电流注射诱导的动作电位，证实光遗传学控制通道扩充到了远红光。由不同波长的红色和远红/红外边缘照射激起的外向光电流是：239.4±28.7pA(n＝10)，在630nm；120.5±16.7pA(n＝4)，在660nm；以及76.3±8.1pA(n＝4)，在680nm。
[0414] NpHR的一个重要特征是其与ChR2的光谱相容性：这两种视蛋白具有在较大程度上能区分的作用光谱并且用类似的光功率密度需求来操作，尽管有小区域的光谱重叠，但是允许活体外或体内光学活性的双向控制(Zhang等，2007a)。为了检测(在给定的光谱重叠下)eNpHR3.0是否已经变得太有效以至于不能在相同细胞中与ChR2组合使用，我们建立了含有eNpHR3.0的双顺反子载体；类似的基于2A的组合载体(Ryan和Drew，1994)已经与较早的工具一起使用，并且使用该方法的光敏感通道电流在150至240pA范围内，氯视紫红质蛋白电流在11至40pA(Tang等，2009，Han等，2009b)。我们将eNpHR3.0-2A-ChR2构建体(简写为eNPAC)转染到海马锥体神经元中。用这些实验，观察到两种视蛋白基因产物向细胞过程的运输。为了验证尽管来自eNpHR3.0的电流增加独立的兴奋与抑制仍然是可能的，我们详细地的绘制了eNPAC以及ChR2(H134R)(Gradinaru等，2007)和eNpHR3.0单独的稳态光电流作用光谱。图27小图F展示eNPAC(图27小图F的左侧部分)以及ChR2(H124R)和eNpHR3.0(图27小图F的右侧部分)的激活光谱。在图27小图F的右侧部分中，ChR2的激活光谱以深灰色展示，eNpHR3.0的激活光谱以浅灰色展示。最大eNPAC稳态激发和抑制电流都是各个视蛋白单独表达时观察到的大约60％，在各个方向中产生>550pA的最大光电流(图27小图F-小图G)；适当重叠的作用光谱可以提供一个特征，即用该组合方法可能实现与超极化抑制组合的有效的分流抑制。更具体地讲，在427nm的最大eNPAC稳态激发是567±49pA(n＝9)，是ChR2(H134R)单独的值(916±185pA，n＝5)的62％。类似地，在590nm的最大eNPAC抑制是679±
109pA(n＝9)，是eNpHR3.0单独的值(1110±333pA；n＝4)的61％。峰电流值的输出功率密度是3.5-5mW/mm2(3.5mW/mm2，在590nm)。体内验证需要证明特定的P2A方法(或其它连接方法)在特定的电路或细胞类型(还有待于确定)中是有作用的；然而，在培养的海马神经元中的这些数据显示>500pA的有效的双向光电流各自可以在单细胞内实现，而不使运输增强的视蛋白的干扰能力丧失。
109pA(n＝9)，是eNpHR3.0单独的值(1110±333pA；n＝4)的61％。峰电流值的输出功率密度是3.5-5mW/mm2(3.5mW/mm2，在590nm)。体内验证需要证明特定的P2A方法(或其它连接方法)在特定的电路或细胞类型(还有待于确定)中是有作用的；然而，在培养的海马神经元中的这些数据显示>500pA的有效的双向光电流各自可以在单细胞内实现，而不使运输增强的视蛋白的干扰能力丧失。
[0415] 微生物视蛋白的已知的宽作用光谱在实现控制多种独立的通道方面带来了挑战；有意思的是，eNpHR3.0不仅成为一种有效的远红外光控制工具，而且还成为最有效的已知蓝光驱动基于视蛋白的抑制剂(在472nm下>400pA)。实际上，这里描述的膜运输策略可以构成用于使各种微生物视蛋白与实现光遗传学控制目的的独特性质相匹配的可普及的策略。
在一系列最终的实验中，我们研究了这些和其它增强的膜运输原理是否能够向光遗传学工具箱增加遗传和功能上独特的组件。
在一系列最终的实验中，我们研究了这些和其它增强的膜运输原理是否能够向光遗传学工具箱增加遗传和功能上独特的组件。
[0416] 虽然在自然界中存在大量的微生物视蛋白基因，但是我们和其他人到目前为止还没有发现在光电流大小、光需求或动力学方面胜过eNpHR3.0(如本文所述的)的基因(Zhang等，2007a；Han和Boyden，2007；Chow等，2010)。继续扩大光遗传学工具箱是重要的，但是我们发现大多数微生物视蛋白在哺乳动物细胞中运输较差。然而，在过去几年中，利用微生物视蛋白的巨大的自然多样性(Zhang等，2008；Chow等，2010)，应用这里列出的用于微生物视蛋白工程化的运输原理可以使光遗传学继续基因组发展(Zhang等，2008)。我们设法检测膜运输原理与表征最好的微生物视蛋白细菌视紫红质(BR)(Stoeckenius和Bogomolni，1982)的适应性，细菌视紫红质来自H.salinarum，是一种跨膜离子传导的绿光激活的调节剂(Marti等，1991)。
[0417] 我们发现观察到以未修饰的形式表达的显著的胞内累积，类似于当盐碱单胞菌氯视紫红质蛋白以高水平表达时观察到的那些，并且没有观察到光电流。然而，在BR和EYFP之间添加运输信号(TS，如eNpHR3.0使用的)大体上改善了膜和过程定位，有较小的持久的ER样累积，ER输出信号FCYENEV的进一步C末端添加就消除了这种累积。所得的构建体(eBR，为了最佳的膜运输加倍地工程化)在培养的神经元中被良好地耐受，具有标记的膜定位和过程靶向。功能性质膜靶向的验证显示eBR能够通常输送～50pA的外向光电流和～10mV超极化，当暴露于560nm的最佳波长的光时，这足以阻滞海马锥体神经元中的脉冲，从而提供用于光遗传学控制的另一个通道并且说明所述微生物视蛋白膜运输方法的潜在普及性。更具体地讲，如图28小图B所示，五百六十纳米的光在eBR细胞中诱导46.4±7.2pA的外向光电流(平均值±SEM绘图，n＝12)。对于进行膜片的所有神经元来说膜输入电阻是类似的(131.6±19.5mΩ)。在样品上的光功率密度是7mW/mm2。如图28小图C所示，光诱导的超极化是10.8±0mV(平均值±SEM绘图，n＝12)。
[0418] 我们还继续基因组策略，类似于允许我们识别来自团藻的红移激发视蛋白VChR1的那些(Zhang等，2008)；实际上，已经有人报告若干微生物显示对紫光至近红外光的敏感性。因此，我们在环境测序数据库、植物/微生物表达的序列标记物(EST)库和全基因组鸟枪(WGS)测序知识库中继续我们的广泛基因组开发方法，以寻找具有通道或泵性质和新颖的光敏感性的新视紫红质(Zhang等，2008)。我们使用ChR、HR和BR的初级氨基酸序列作为模板序列继续在进化上远缘的物种中寻找(Zhang等，2008；Chow等，2010)。在来自各种宿主(隐藻(Cryptomonas)、蓝隐藻、原始绿藻(Mesostigma)、杜氏藻(Dunaliella)、胶菌藻(Gloeobacter)等)的其它候选序列中，其中之一来自蓝隐藻，不同于早先报告的GtR1和GtR2(Sineshchekov等，2005)并且显示与ChR2有高的氨基酸同源性。我们将这种新的蛋白称为蓝隐藻视紫红质-3(GtR3)，为了哺乳动物表达优化了GtR3的密码子偏好，并且对海马锥体神经元递送GtR3-EYFP融合基因。在一个新兴课题中，GtR3显示胞内累积并且没有光电流。在GtR3和EYFP之间提供TS信号只适度地降低累积，但是，同时对C末端添加ER输出信号FCYENEV，累积消除了并且增加了表面并且观察到过程定位。
[0419] 所得的修饰的GtR3响应于472nm蓝光而超极化海马神经元，虽然比eBR的电流更小，然而也能够抑制脉冲。我们还用来自伞藻属蝶状藻(Acetabularia acetabulum)的工程化以改善运输的视蛋白(AR)实现了脉冲的蓝色抑制(Tsunoda等，2006；Chow等，2010)；AR独自产生很小的电流但是最初没有聚集并且只需要在AR和EYFP之间添加TS信号用于功能性2
膜定位和脉冲抑制。展示472nm光(18.5mW/mm )下的GtR3功能的样品电流钳和电压钳迹线和汇总图线数据分别在图31小图C的左侧和右侧部分中展示。光诱导的外向光电流汇总图线在图31小图C的左侧条形图中展示，蓝光峰的相应超极化汇总图线在右侧条形图中展示。
相应的光电流和超极化是：对于黄光(589nm；7.5mW/mm2)是0.5±0.4pA和0.12±0.09mV；对
2 2
于蓝光(472nm；18.5mW/mm )是20.0±6.7pA和5.6±1.2mV；对于紫光(406nm；3mW/mm )是1.7±0.9pA和0.6±0.3mV(平均值±SEM绘图；n＝10；输入电阻对于所有神经元是类似的：
113.5±24.2mΩ)。
膜定位和脉冲抑制。展示472nm光(18.5mW/mm )下的GtR3功能的样品电流钳和电压钳迹线和汇总图线数据分别在图31小图C的左侧和右侧部分中展示。光诱导的外向光电流汇总图线在图31小图C的左侧条形图中展示，蓝光峰的相应超极化汇总图线在右侧条形图中展示。
相应的光电流和超极化是：对于黄光(589nm；7.5mW/mm2)是0.5±0.4pA和0.12±0.09mV；对
2 2
于蓝光(472nm；18.5mW/mm )是20.0±6.7pA和5.6±1.2mV；对于紫光(406nm；3mW/mm )是1.7±0.9pA和0.6±0.3mV(平均值±SEM绘图；n＝10；输入电阻对于所有神经元是类似的：
113.5±24.2mΩ)。
[0420] 虽然这些和其它公开的微生物视蛋白衍生的抑制剂还不如eNpHR3.0那样有效(并且因此我们继续将eNpHR3.0用于光遗传学应用)，但是这里通过膜运输修饰实现的改善的功能表明该方法在揭示所有可能的生态多样性中的潜在多样性，以及表明将被指示不同微生物视蛋白基因的个性化的策略。图29小图A展示用于使微生物视蛋白基因与后生动物完整系统生物学相匹配的通用亚细胞靶向策略。图29小图B展示在组织和亚细胞水平的靶向的概括(亚细胞视蛋白靶向方法先前已经描述，参见Gradinaru等[2007]和Lewis等[2009]；组织/跨细胞视蛋白靶向方法在本文中描述)。
[0421] 光遗传学方法先前已经在自由活动的哺乳动物(Adamantidis等，2007；Airan等，2009；Gradinaru等，2009；Petreanu等，2007、2009；Sohal等，2009；Tsai等，2009)和其它动物(Douglass等，2008；Hwang等，2007；Lerchner等，2007；Zhang等，2007a)的生物过程和行为的控制中发现有价值的应用，具有对于完整系统生物学来说重要的高瞬间精密度。我们发现工程化微生物蛋白的特异性膜运输能力在产生用于完整系统生物学的各种光遗传学技术中是一个重要的步骤。不是所有的运输策略都适于所有的微生物视蛋白，在不同阶段遇到运输困难的视蛋白需要不同的基序；因此，仔细的亚细胞分析与适当修饰的合理选择共同构成可能适用于非哺乳动物来源的所有视蛋白的有针对性和有原则的策略，从而实现从基因组资源中产生一代系统的新颖光遗传学工具。
[0422] 我们早先就观察到用NpHR和NpHR2.0抑制虽然对许多应用来说有用(Gradinaru等，2009；Sohal等，2009；Tonnesen等，2009；Arrenberg等，2009)，但是在一些情况下可能被非常强的激发克服(Sohal等，2009)。用eNpHR3.0的大于100mV的超极化对光抑制效能有相当大的促进。现在用eNpHR3.0提供的抑制(比初始的NpHR强20倍以上)仍然可用光强度或占空比调节，如同任何光遗传学工具一样。在作用光谱峰，可用只有3.5mW/mm2的黄光得到毫微安培级平均外向电流(比用早先描述的质子泵获得类似电流需要的光功率小10倍)。同时，eNpHR3.0保留了NpHR的阶梯形的动力学、快速的恢复和经长时间跨度对失活的抗性(Zhang等，2007a)。
[0423] eNpHR3.0尤其适于体内应用，如同迄今为止大多数红移和有效的光遗传学抑制剂，但是必定会出现提高该工具和其它工具的效能的其它策略，并且这里描述的膜运输研究将来可能获得更有效的抑制剂。当使用eNpHR3.0时，如果需要，可以容易地通过使用较弱的启动子、较短的表达时间或降低的光水平减轻抑制，而仍然保持对来自上述报告(680nm对589nm)的新波长～100nm红移的可用性，从而实现在红外线边缘用穿透更深和更安全的光子操作。当然，不仅选择的视蛋白基因和光源，用于电路元件靶向的策略也都可以测定有效性；例如，对帕金森模型的光遗传学研究(Gradinaru等，2009)显示在丘脑底核(STN)中的治疗有效的深脑刺激(DBS)可能由对传入神经轴突的作用(这随后又调节下游和上游网络)而引发。虽然对STN中的局部细胞体的基于光纤的直接抑制不显示与用传入神经轴突的直接调节观察到的相当的行为作用，但是这些结果并非意味着STN的抑制不重要(实际上，如Gradinaru等[2009]指出，在STN中的光遗传学轴突调节引起STN脉冲的抑制)。更确切地，通过显示轴突调节构成控制患病的神经回路中的结构或网络的可能的点源如DBS电极(或光纤)的治疗机理和高效方法，这些结果表明了围绕DBS的机理和靶标的长期存在的临床重要的问题。除了这些电路元件靶向顾虑之外，光强度和波长、启动子选择、病毒效价、病毒嗜性、视蛋白表达时间、靶细胞生物物理学和内源活性和调节的局部模式都将影响光遗传学抑制效能并且应该针对各种实验系统仔细地考虑(Cardin等，2010)。
[0424] 为了实现对基于连接性质的细胞类型的控制，我们采取Cre重组酶的跨细胞递送。首先，在大鼠中，我们选择性地靶向涉及与S1的皮质-皮质连接的那些M1神经元，其次，我们靶向涉及半球间投射的海马结构齿状回神经元；在两种情况下，靶向仅由连接性定义的细胞，而不使用细胞类型特异性启动子片段或转基因动物。在各种系统中，必须验证该方法的Cre转运的方向性(前方或逆向)和程度，这可能取决于细胞特异性内体动力和实验的时间点；该策略可能还只对病毒有用而不是小鼠转基因，允许Cre进入附加体DNA。不直接转导轴突末端的载体可以很好地满足该方法，可能对于所有的AAV血清型不都是如此(我们和其他人在一些电路中观察到[Patema等，2004])。轴突末端的任何直接转导都可以用适当的XFP标记物来检测或排除，在一些情况下轴突末端的直接转导可能是希望的并且可以用HSV、某些AAV血清型和假型化慢病毒来实现；然而，这种方法(不同于本策略)不允许转导的末端的突触后的细胞类型的选择并且不如某些AAV那么有效，这些AAV是针对许多应用由于高效价、组织穿透、安全性和耐受性而选择的载体。
[0425] 由膜运输修饰实现的细胞过程靶向允许对拓扑学上定义(即，由其在组织内的连接的基本特性定义)的细胞的控制。目前，不能保证转运是突触或单突触的(如在海马电路实验中，这些性质需要在各种系统中验证)；因此，这里的术语“拓扑学上靶向”而不是突触靶向是用于强调连接的基本特性的变形独立性—轴突连接可以采取从A到B的任何路径，只要连接存在，拓扑学的靶向策略就仍然有效。该性质在不易基因操作的有机体中是重要的，但是即使在动物如小鼠(其中基因靶向工具在多数情况下是不适宜的)中也有相当大的价值。当然，基因靶向策略可以与拓扑学靶向复用；例如，来自Cre依赖性载体和Cre融合载体的表达可以各自由特定的基因靶向序列(如果可用)决定。此外，光控制的多通道的存在使组合拓扑学靶向策略成为可能。
[0426] 类似ChR2、NpHR和VChR1，我们注意到为了获得新种类的功能，大多数微生物视蛋白可以受益于大量的蛋白质工程。实际上，我们和其他人早先就提出了用于从微生物视蛋白得到增加的光敏感性(Bemdt等，2009)、增加的光电流数值(Gradinaru等，2007、2008；Zhao等，2008)、更快的动力学(Gunaydin等，2010；Lin等，2009)和双稳态开关行为(Bemdt等，2009)的分子策略。将来还可能实现其它可能性，如改变的作用光谱(Zhang等，2008；
Gunaydin等，2010)、增加的双光子反应性和改变的离子渗透性(例如，Ca2+)。
Gunaydin等，2010)、增加的双光子反应性和改变的离子渗透性(例如，Ca2+)。
[0427] 虽然离子电导调节视蛋白已经是用于现成的翻译(使用通用的电语言)的最多样的，但是在定义的细胞类型中使用光的生物化学控制也是可能的(但用一套不同的方法，假定微生物信号转导使用不同于后生动物信号传导的原理)。实际上，使用用于光控制特定G蛋白偶联受体信号传导的optoXR方法，最近在培养细胞和自由活动的哺乳动物中都实现了定义明确的生物化学信号传导途径的光遗传学控制。虽然具有限制体内应用的大量未知活性( 等，2007))，但是已经研究了来自裸藻的光可激活腺苷酸环化酶，并且如果这些方法可被用于在活动物中操作，对光敏PAS或LOV结构域的随后研究(Levskaya等，
2009；Wu等，2009)可能开辟控制蛋白-蛋白结合的新的方式。
2009；Wu等，2009)可能开辟控制蛋白-蛋白结合的新的方式。
[0428] 我们发现在神经系统中，光遗传学工具可以应用于探测信息传输、振荡、运动、觉醒和奖赏的神经回路基础，以及探测在包括帕金森氏病和癫痫的若干脑部疾病中重要的神经回路的活动(Adamantidis等，2007；Airan等，2009；Cardin等，2009；Gradinaru等，2009；Sohal等，2009；Tonnesen等，2009；Tsai等，2009)。此外，到目前为止结果表明光遗传学方法跨动物物种的有价值的多样性(Adamantidis等，2007；Airan等，2009；Aravanis等，2007；
Arenkiel等，2007；Bi等，2006；Boyden等，2005；Chow等，2010；Douglass等，2008；Gradinaru等，2008、2009；Hagglund等，2010；Han等，2009a；Huber等，2008；Hwang等，2007；Ishizuka等，2006；Li等，2005；Nagel等，2003、2005；Petreanu等，2007、2009；Tsai等，2009；Wang等，
2007；Zhang等，2006、2007a；Zhang和Oertner，2007；Zhao等，2008)。与光纤(Adamantidis等，2007；Aravanis等，2007)和合并的光纤-电极“光极”组件(Gradinaru等，2007)一起，甚至可以容易地在自由活动的哺乳动物中接近和研究(interrogated)位于大的、致密器官内的细胞。这里定义的其它资源源自应用分子、细胞和基因组策略来实现光控制能力的扩展，并且随着该工具箱迅速地成长，光遗传学可能在完整系统生物学中对于功能性组织内定义的细胞的快速控制发挥日益强大和多样的作用。
Arenkiel等，2007；Bi等，2006；Boyden等，2005；Chow等，2010；Douglass等，2008；Gradinaru等，2008、2009；Hagglund等，2010；Han等，2009a；Huber等，2008；Hwang等，2007；Ishizuka等，2006；Li等，2005；Nagel等，2003、2005；Petreanu等，2007、2009；Tsai等，2009；Wang等，
2007；Zhang等，2006、2007a；Zhang和Oertner，2007；Zhao等，2008)。与光纤(Adamantidis等，2007；Aravanis等，2007)和合并的光纤-电极“光极”组件(Gradinaru等，2007)一起，甚至可以容易地在自由活动的哺乳动物中接近和研究(interrogated)位于大的、致密器官内的细胞。这里定义的其它资源源自应用分子、细胞和基因组策略来实现光控制能力的扩展，并且随着该工具箱迅速地成长，光遗传学可能在完整系统生物学中对于功能性组织内定义的细胞的快速控制发挥日益强大和多样的作用。
[0429] 实验程序
[0430] 构建体
[0431] 所有NpHR变体均通过先前公开(Zhang等，2007b)的NpHR-EYFP构建体的PCR扩增来制备。为了哺乳动物表达，通过将各基因的密码子用法变为与人密码子用法分布一致，这里描述的所有视蛋白均已经进行优化。更新的图和载体可以从Deisseroth实验室(附属于斯坦福大学，Stanford,California)获得并免费地分发，并且在2010年12月的2010Scientific American,“Method of the Year”(http://www.optogenetics.org/)中描述，其内容以引用的方式全部并入本文。
[0432] 无信号肽序列的CtR3的氨基酸序列
[0433]
[0434] 具有来自ChR2的信号肽序列的CtR3的氨基酸序列
[0435]
[0436]
[0437] DChR的氨基酸序列
[0438]
[0439] NpHR的氨基酸序列
[0440]
[0441]
[0442] BR的氨基酸的序列
[0443]
[0444] 海马培养物
[0445] 从P0Spague-Dawley新生大鼠制备原代培养的海马神经元。用0.4mg/mL木瓜蛋白酶(Worthington,Lakewood,NJ)分离、分解CA1和CA3区域，并且以65,000/cm2的密度接种在预涂有1:30Matrigel(Beckton Dickinson Labware,Bedford,MA)的玻璃盖玻片上。对于所有构建体用效价匹配病毒体外(DIV)转染或转导在盖玻片上生长的海马培养物4天(最终稀释物在神经元生长培养基中的104感染单位(i.u.)/ml)。如先前描述(Zhang等，2007b)进行全细胞膜片钳记录。用效价匹配的病毒以4DIV感染原代海马培养物(最终稀释物在神经元生长培养基中的104i.u./ml)。在14DIV，用冰冷的4％多聚甲醛固定培养物并且随后用在2％正常驴血清(NDS)中的0.4％皂角苷渗透30min。在4℃下进行一级抗体孵育过夜；在室温下，在2％NDS中施加Cy3缀合的二级抗体(Jackson Laboratories,West Grove,PA)。在Leica共焦显微镜上使用63x/1.4NA油物镜获得图像。
[0446] 立体定向注射到啮齿动物脑部中和光极记录
[0447] 按照在斯坦福批准的方案饲养成年小鼠和Long-Evans大鼠。所有手术均在无菌条件下进行。用氯胺酮(80mg/kg)/赛拉嗪(15-20mg/kg)混合物(Sigma)的腹膜内注射使动物麻醉。经由10μl注射器和细34口径金属针头递送病毒；注射体积和流速(1μl，0.1μl/min)用来自World Precision Instruments(Sarasota,FL)的注射泵来控制。为了验证视蛋白功能，如先前描述(Gradinaru等，2007)用光极在活啮齿动物中同时进行光刺激和电记录，所述光极由与光纤(～200μm)连接的胞外钨电极(1MΩ，～125μm)组成，电极的顶端比光纤的顶端更深(～0.4mm)，以确保照射记录的神经元。将光纤耦合至来自CrystaLaser的473nm(对于ChR2)或560nm(对于eNpHR3.0)激光二极管(10mW纤维输出)。在用1.5％异氟烷麻醉的啮齿动物中进行光极记录，通过以上目标区产生的小开颅术放置光极。使用pClamp 10和Digidata 1322A板同时收集数据并产生通过纤维的光脉冲。记录的信号在300Hz低/5kHz高进行带通滤波(1800Microelectrode AC Amplifier)。
[0448] 组织切片制备
[0449] 为制备脑切片，注射病毒4至5周之后处死小鼠或大鼠。用20ml冰冷的PBS灌注啮齿动物，随后用20ml 4％多聚甲醛灌注。随后在4％多聚甲醛中固定脑部过夜并且转移到30％蔗糖溶液中经2天。冷冻脑部并且用Leica SM2000R恒冷切片机制备冠状切片(40μm)，并且在冷冻保护剂(在PBS中的25％甘油和30％乙二醇)中在4℃下保存。在显微镜载玻片上用PVA-DABCO固定切片(DAPI染色1:50,000)，在Leica共焦显微镜上使用10x空气和40x/1.4NA油物镜获得单个共焦光部分(例如，穿过背侧CA1区域，在前囟或背侧下托后～1-2.5mm，在前囟后2.7-3mm)。
[0450] 扩展的实验程序
[0451] 视蛋白来源
[0452] 这里描述的所有视蛋白已经通过将各基因密码子用法变为与人密码子用法分布一致来针对哺乳动物表达进行优化(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9606)。原始AR、BR和GtR3序列的Genbank登录号是DQ074124、M11720和EG722553。
[0453] DNA构建体
[0454] 所有NpHR变体均通过先前公开(Zhang等，2007b)的NpHR-EYFP构建体的PCR扩增来制备，并且按照标准分子生物学方案框架内克隆到携带CaMKIIα或Synapsin-1启动子的慢病毒的Agel和EcoRI限制酶切位点中。对于BR和AR使用类似的策略。GtR3通过搜索来鉴别。这里描述的所有视蛋白已经通过将各基因密码子用法变为与人密码子用法分布一致来针对哺乳动物表达进行优化(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9606)，并且定制合成了优化的序列(DNA2.0,Inc.,Menlo Park,CA)。原始AR、BR和GtR3序列的Genbank登录号是DQ074124、M11720和EG722553。pAAV-EF1a-mCherry-IRES-WGA-Cre载体使用标准分子生物学方案来构建。为了在哺乳动物细胞中表达，将WGA和Cre基因的密码子进行优化。所述基因由DNA2.0(Menlo Park,CA)合成。Cre被框架内融合到WGA的C末端，WGA的C末端又被融合到IRES。mCherry-IRES-WGA-Cre双顺反子表达盒使用EMCV IRES序列来设计。pAAV-EF1a质粒骨架与先前描述(Sohal等，2009；Tsai等，2009)的相同。
pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EFYP-P2A-ChR2H134R-mCherry用120单体引物(5’
caagttctgctacgagaacgaggtgggctccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcagg
agacgtggaagaaaaccccggtcccatggactatggcggcgctttgtctgccg3‘)来构建，所述引物在5'端含有具有ER输出序列的p2A区域并且在3’端含有hChR2的起点的20个碱基。首先，使用所述
120单体引物作为正向引物以及5'-atatc gaattctcattacttgtacagctcgt-3'作为反向引物扩增ChR2(H134R)-mCherry片段。其次，使用该扩增产物作为反向引物连同正向引物5‘-ccggatccccgggtaccggtaggccaccatgacagagaccctgcct-3‘一起将eNpHR3.0-EYFP与ChR2(H134R)-mCherry融合，插入p2A区域。随后纯化3.4Kb片段并且克隆到pAAV-hSyn载体的BamHI和EcoRI位点中。为了克隆的准确性，完全测定所有构建体的序列；更新的图可在http://www.optogenetics.org网站上在线获得，其内容以引用的方式全部并入本文。
pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EFYP-P2A-ChR2H134R-mCherry用120单体引物(5’
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agacgtggaagaaaaccccggtcccatggactatggcggcgctttgtctgccg3‘)来构建，所述引物在5'端含有具有ER输出序列的p2A区域并且在3’端含有hChR2的起点的20个碱基。首先，使用所述
120单体引物作为正向引物以及5'-atatc gaattctcattacttgtacagctcgt-3'作为反向引物扩增ChR2(H134R)-mCherry片段。其次，使用该扩增产物作为反向引物连同正向引物5‘-ccggatccccgggtaccggtaggccaccatgacagagaccctgcct-3‘一起将eNpHR3.0-EYFP与ChR2(H134R)-mCherry融合，插入p2A区域。随后纯化3.4Kb片段并且克隆到pAAV-hSyn载体的BamHI和EcoRI位点中。为了克隆的准确性，完全测定所有构建体的序列；更新的图可在http://www.optogenetics.org网站上在线获得，其内容以引用的方式全部并入本文。
[0455] 慢病毒制备和效价测定(Titering)
[0456] 如先前描述(Zhang等，2007b)制备用于培养神经元感染和用于体内注射的慢病毒。在于24孔板中生长的HEK293细胞中进行病毒效价测定并且在聚凝胺(8μg/ml)存在下用5倍连续稀释接种。4天之后，将培养物重悬在PBS中并且在FACScan流式细胞仪上针对EYFP荧光分选(每个样品收集20,000events)，随后使用FlowJo软件(Ashland,OR)分析。病毒的效价测定如下进行：[(受感染细胞％)×(孔中的总细胞数)×(稀释因子)]/(加入细胞的接
5
种物体积)＝感染单位/ml。培养物感染的病毒效价是10i.u./ml。用于体内注射的浓缩病毒的效价是1010i.u./ml。
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种物体积)＝感染单位/ml。培养物感染的病毒效价是10i.u./ml。用于体内注射的浓缩病毒的效价是1010i.u./ml。
[0457] 海马培养物
[0458] 从P0Spague-Dawley新生大鼠制备原代培养的海马神经元。用0.4mg/mL木瓜蛋白酶(Worthington,Lakewood,NJ)分离、分解CA1和CA3区域，并且以65,000/cm2的密度接种在预涂有1:30Matrigel(Beckton Dickinson Labware,Bedford,MA)的玻璃盖玻片上。用含有1.25％FBS(Hyclone,Logan,UT)、4％B-27添加剂(GIBCO,Grand Island,NY)、2mM Glutamax(GIBCO)和FUDR(2mg/ml,Sigma,St.Louis,MO)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen Carlsbad,CA)将培养物保持5％CO2潮湿恒温箱中。
[0459] 磷酸钙转染
[0460] 在24孔板中以65,000细胞/孔生长6-10div海马神经元。用于各孔的DNA/CaC CI2混合物：在15μl总H2O中的1.5-3μg DNA(QIAGEN无内毒素制剂)+1.875μl 2M CaC CI2(最终Ca2+浓度250mM)。向DNA/CaCI2中添加15μl 2X HEPES-缓冲盐水(pH 7.05)，并且通过用滴管吸取将最终体积混合均匀。在室温20min之后，将30μl DNA/CaCI22/HBS混合物滴到各孔中(孔中的生长培养基已经暂时去除并且用400μl热的MEM替换)并且在37C下转染45-60min。随后用3X 1mL热的MEM冲洗各孔并且替换生长培养基。通常在20-24hr内就观察到视蛋白表达。
[0461] 电生理学
[0462] 用对于所有构造的效价匹配的病毒以4div转导在盖玻片生长的海马培养物(在神经元生长培养基中的最终稀释物104i.u./ml)并且允许其表达一周。如先前描述进行全细胞膜片钳记录(胞内溶液：129mM葡萄糖酸钾，10mM HEPES、10mM KCI、4mM MgATP、0.3mM Na3GTP,滴定至pH 7.2；胞外Tyrode：125mM NaCl、2mM KCl、3mM CaCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES,滴定至pH 7.3)。为了进行电压钳记录将细胞保持在-70mV。从300W DG-4灯(Sutter Instruments,Novato,CA)中输送可见区中的光通过不同波长选择性的过滤器(Semrock,Rochester,NY)和Leica 40X/0.8NA水物镜。过滤器，除了功率谱，(这里给出以nm计的波长/以nm计的带宽/以mW/mm2计的输出功率)是：406/15/3；472/30/18.5；560/14/7；589/15/7.5；593/40/15.5；630/20/3.5。远红外光和近红外光输送：对于660nm抑制的光(7mW/mm2)使用发光二极管和40x/.8NA水物镜来输送。对于680nm抑制的光(7mW/mm2)使用X-Cite 120W卤素光源通过680±13nm过滤器和40x/0.8NA水物镜来输送。对于eNPAC、ChR2(H134R)和eNpHR3.0功率谱的光输送从配备具有不同波长的25mm过滤器的10位盘的Lambda
10-3滤光盘(Sutter Instruments)的300W DG-4灯和40X/0.8NA水物镜来输送。过滤器(这里给出以nm计的波长/以nm计的带宽/以mW/mm2计的输出功率)是：387/10/3.5；406/15/
3.5；427/10/4.0；445/20/4.0；470/22/4.0；494/20/4.5；520/15/4.5；542/27/5.0；560/20/
5.0；590/20/3.5；630/20/3.5。对于图1、3A-3D和4和图S2(参见以下表5)，共焦成像和全细胞膜片钳数据来自用基于慢病毒NpHR、BR、GtR3和AR的构造转染(共焦数据)或转导(膜片数据)培养的海马神经元并且允许其表达一周。表达由人突触蛋白I启动子驱动表达并且通过与EYFP融合可见。
10-3滤光盘(Sutter Instruments)的300W DG-4灯和40X/0.8NA水物镜来输送。过滤器(这里给出以nm计的波长/以nm计的带宽/以mW/mm2计的输出功率)是：387/10/3.5；406/15/
3.5；427/10/4.0；445/20/4.0；470/22/4.0；494/20/4.5；520/15/4.5；542/27/5.0；560/20/
5.0；590/20/3.5；630/20/3.5。对于图1、3A-3D和4和图S2(参见以下表5)，共焦成像和全细胞膜片钳数据来自用基于慢病毒NpHR、BR、GtR3和AR的构造转染(共焦数据)或转导(膜片数据)培养的海马神经元并且允许其表达一周。表达由人突触蛋白I启动子驱动表达并且通过与EYFP融合可见。
[0463] 表5展示用于蓝色抑制的其它运输增强的工具，和一种新的视蛋白序列：蓝隐藻视紫红质-3或GtR3。
[0464] 表5
[0465]
[0466] 新视蛋白序列：蓝隐藻视紫红质-3或GtR3。EST序列包括所有七种跨膜螺旋；5’氨基酸序列从ChR2提供(跨膜基序：条形；保守的残基：突出显示；肽的切断位点：*；从ChR2提供的信号肽：灰色。
[0467] 免疫组织化学
[0468] 用效价匹配的病毒以4div感染原代海马培养物(在神经元生长培养基中的最终稀释物104i.u./ml)。用冰冷的4％多聚甲醛固定14隔开培养物并且随后用在2％正常驴血清(NDS)中的0.4％皂角苷渗透30min。在4℃下使用识别含有KDEL驻留信号(KDEL 1:200,Abeam,Cambridge,MA)的内源性ER驻留蛋白的内质网的单克隆标记孵育一级抗体过夜。在室温下在2％NDS中施加Cy3缀合的二级抗体(Jackson Laboratories,West Grove,PA)1hr。在Leica共焦显微镜上使用63X/1.4NA油物镜获得图像。
[0469] 向啮齿动物脑部的立体定向注射
[0470] 按照在斯坦福批准的方案饲养成年小鼠和Long-Evans大鼠。所有手术均在无菌条件下进行。用氯胺酮(80mg/kg)/赛拉嗪(15-20mg/kg)混合物(Sigma)的腹膜内注射使动物麻醉。将头部放入立体定向装置(Kopf Instruments,Tujunga,CA；Olympus stereomicroscope)。涂布眼用软膏剂以预防眼睛干燥。进行中线头皮切口并且使用固定在立体定向装置上的钻头(Fine Science Tools,Foster City,CA)进行小的开颅术。使用10μl注射器和细34口径金属针头递送病毒；注射体积和流速(1μl，0.1CI2l/min)用来自World Precision Instruments(Sarasota,FL)的注射泵来控制。注射之后将针头再留在原处5分钟并且随后缓慢地拔出。用Vetbond组织粘合剂将皮肤粘合。将动物保持在加热板上直到其从麻醉中恢复。按照手术程序皮下注射丁丙诺啡(0.03mg/kg)以使不适最小化。对于图2A中的试验，为了覆盖背侧CA1的大面积，将在CaMKIIα启动子下的携带eNpHR3.1(具有N末端信号肽的eNpHR3.0的较短形式，原始NpHR的前17个氨基酸，去除)的1μl浓缩慢病毒(1010i.u./ml)微注射到各个海马的2个位点中(位点一：距前囟前后-1.5mm；侧部，±1mm；腹侧，1.5mm；
位点二：AP，距前囟2.5mm；侧部，±2mm；腹侧，1.5mm)。对于图2D和2E，在相同的手术期间用
0.15ul/min的注射速度立体定向注射两种不同的腺病毒相关病毒(AAV)(病毒效价2×
1012g.c./mL)。由UNC VectorCore制备高效价(2x1012g.c./mL)AAV。对于图2D，将携带eNpHR3.0-EYFP(AAV5-Ef1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP)的双敲除(double-floxed)的cre依赖性AAV5注入M1并且将AAV2-Ef1α-mCherry-IRESWGA-Cre注入成年Long-Evans大鼠的S1中。在由以下安排定义的五个不同位点递送1μl病毒：M1注射I：AP，距前囟+1mm；侧部，1.5mm；腹侧，2mm；M1注射II：AP，+2mm；侧部，1.5mm；腹侧，2mm；S1注射I：AP，-0.3mm；侧部，3.4mm；腹侧，2mm；S1注射II：AP，-1.3mm；侧部，3mm；腹侧，2mm；S1注射III：AP，-2.12mm；侧部，3mm；腹侧，2mm。对于图2E，将1μl病毒两侧注射到成年BL6小鼠的齿状回(DG)中。将AAV8-EF1a-DIO-ChR2-EYFP注射到右侧DG中并且将AAV2-EF1a-mCherry-IRES-WGA-Cre注射到左侧DG中，按以下安排进行：AP，距前囟-2.1；侧部，±1.05mm；腹侧，2.1mm。
位点二：AP，距前囟2.5mm；侧部，±2mm；腹侧，1.5mm)。对于图2D和2E，在相同的手术期间用
0.15ul/min的注射速度立体定向注射两种不同的腺病毒相关病毒(AAV)(病毒效价2×
1012g.c./mL)。由UNC VectorCore制备高效价(2x1012g.c./mL)AAV。对于图2D，将携带eNpHR3.0-EYFP(AAV5-Ef1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP)的双敲除(double-floxed)的cre依赖性AAV5注入M1并且将AAV2-Ef1α-mCherry-IRESWGA-Cre注入成年Long-Evans大鼠的S1中。在由以下安排定义的五个不同位点递送1μl病毒：M1注射I：AP，距前囟+1mm；侧部，1.5mm；腹侧，2mm；M1注射II：AP，+2mm；侧部，1.5mm；腹侧，2mm；S1注射I：AP，-0.3mm；侧部，3.4mm；腹侧，2mm；S1注射II：AP，-1.3mm；侧部，3mm；腹侧，2mm；S1注射III：AP，-2.12mm；侧部，3mm；腹侧，2mm。对于图2E，将1μl病毒两侧注射到成年BL6小鼠的齿状回(DG)中。将AAV8-EF1a-DIO-ChR2-EYFP注射到右侧DG中并且将AAV2-EF1a-mCherry-IRES-WGA-Cre注射到左侧DG中，按以下安排进行：AP，距前囟-2.1；侧部，±1.05mm；腹侧，2.1mm。
[0471] 体内光极记录
[0472] 为了验证视蛋白功能，如先前描述(Gradinaru等，2007)用光极在活啮齿动物中同时进行光刺激和电记录，所述光极由与光纤(～200μm)连接的胞外钨电极(1MΩ，～125μm)组成，电极的顶端比光纤的顶端更深(～0.4mm)，以确保照射记录的神经元。将光纤耦合至来自CrystaLaser的473nm(对于ChR2)或560nm(对于eNpHR3.0)激光二极管(10mW纤维输出)。在用1.5％异氟烷麻醉的啮齿动物中进行光极记录，通过以上目标区产生的小开颅术放置光极。使用pClamp 10和Digidata 1322A板同时收集数据并产生通过纤维的光脉冲。记录的信号在300Hz(低)/5kHz(高)进行带通滤波(1800Microelectrode AC Amplifier)。为了精确放置纤维/电极对，使用立体定向仪器。
[0473] 组织切片制备
[0474] 为制备脑切片，注射病毒4至5周之后处死小鼠或大鼠。用20ml冰冷的PBS灌注啮齿动物，随后用20ml 4％多聚甲醛灌注。随后在4％多聚甲醛中固定脑部过夜并且转移到30％蔗糖溶液中经2天。冷冻脑部并使用Leica SM2000R恒冷切片机制备冠状切片(40μm)，并且在冷冻保护剂(25％甘油，30％乙二醇，在PBS中)中保存在4℃下。在显微镜载玻片上用PVA-DABCO固定切片(DAPI染色1:50,000)，在Leica共焦显微镜上使用10X空气和40X/1.4NA油物镜获得单个共焦光部分(例如，穿过背侧CA1区域，在前囟或背侧下托后～1-3mm，在前囟后2.7-3mm)。
[0475] 关于上述实施方案的更多细节和论述，可以参考Viviana Gradinaru等“Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending
Optogenetics”,Cell 141,154-165,2010年4月2日，将其以引用的方式全部并入本文。
Optogenetics”,Cell 141,154-165,2010年4月2日，将其以引用的方式全部并入本文。
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[0548] 本文中公开的所有参考文献、出版物和专利申请均以引用的方式全部并入本文。
[0549] 上述各个实施方案只通过例证说明来提供，不应该理解为限制本发明。基于以上论述和说明，本领域技术人员将容易地认识到可以对本发明进行各种修改和改变而无需严格地遵循本文中说明和描述的示例性实施方案和应用。例如，这些改变可以包括使用数字逻辑或微处理器来控制发射的光。这些修改和改变不脱离在以下权利要求中阐述的本发明的真实精神和范围。如上所述，与本发明有关的特定应用和背景细节在上文、以下描述和本文中引用的全篇参考文献中讨论。附录中的实施方案可以结合一种或多种上述实施方案和方案以及在附图中展示和以下描述的那些方案来实现。可以参考附录(A、B和C)，这些附录在基础临时申请中提交并且以引用的方式并入本文。
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