结核(TB)是全球健康的主要威胁，保守估计每分钟四人死于TB，相当于每年两百万。 估计世界人口的三分之一被结核分枝杆菌潜伏感染。大多数活性TB病例来自于这一巨 大的潜在结核病病源库，这是实现TB控制的主要障碍。
为什么潜伏结核分枝杆菌感染使消灭TB的努力难以实现有多种原因。首先，对潜 伏感染的接触追踪和治疗仅在绝大多数人的结核菌素皮肤试验呈阴性的地方才能实现， 这种情况出现在TB发病率已经很低的工业化国家。即使在这些地方，目前可用的治疗 潜伏结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的方案的有效性也是有限的。除了低治疗效果 和抗生素抗性株的流行这些明显问题外，可能与发现休眠结核分枝杆菌有机体对常用药 物例如仅对复制的杆菌具有杀菌能力的利福平和异烟肼适度地高度耐药有关，正如已经 被体外所证实的(1，2)。结核分枝杆菌的基因型在潜伏期的许多年中几乎不改变而DNA 模式的变化程度在疾病活动期较高这一发现支持了结核分枝杆菌在潜伏期期间一直不 进行复制的观点(3，4)。其次，当前唯一对TB有效的疫苗牛分枝杆菌卡介苗(BCG)不能 阻止潜伏期结核分枝杆菌感染的建立。BCG防止TB再活化的保护作用有很大不同，在 地理区域之间是不同的，并且这可能取决于暴露在环境中的分枝杆菌的水平(5)。近来对 发展改良疫苗的努力主要集中在预计在结核分枝杆菌感染发生前施用的预防疫苗，并且 已经进行了急性初次感染的动物模型的评价。当使用动物模型模拟慢性或潜伏感染而在 暴露后的情况下使用时(6-8)，这些预防疫苗候选者是无效的或甚至是有害的。相反，能 够安全给药于已潜伏感染个体的和预防TB复活的暴露后疫苗将具有能应用于人群中的 多数出现结核分枝杆菌潜伏感染的高病区的直接优点。此疫苗中包括的抗原能在潜伏性 感染期间增强能识别和消灭结核分枝杆菌的保护免疫应答。
CD4 T细胞在控制和维持结核分枝杆菌感染中起重要作用，然而潜伏性TB期间有 关的精确机制和抗原识别的靶还大多未知(9)。直到最近，几乎没有关于潜伏期间差别基 因表达和结核分枝杆菌机制变化的研究。甚至更没有分析与潜伏期持续有关的特异性人 宿主免疫应答的研究。直到现在仅鉴定了一个具有良好特征的结核分枝杆菌蛋白质，该 蛋白质在潜伏期似乎是具有重要性(10)。这个蛋白质是HspX(Rv2031c或Acr)，它在 低氧下被强烈的正调节，低氧条件是可被作为替代与人肉芽肿的潜伏性感染有关的环境 应激的体外条件(11)。对此热休克蛋白的细胞免疫应答在潜伏期感染的个体中可见，因 此与保护状态有关，而此抗原的抗体发现于具有活跃TB疾病的人中(12，13)。
其它潜伏期相关抗原的鉴别有益于成功开发暴露后的疫苗。一些研究集中在结核分 枝杆菌感染的持续状态，使用设计为模拟潜伏期的天然状态的体外和体内模型。首先， 通过在逐渐减少氧压力下培养结核分枝杆菌，Wayne等人建立了潜伏期的体外模型，逐 渐减少氧压力会导致该杆菌的可逆的生长阻止，命名为非复制持续(NRP)(14)。其他人使 用恒定的含氧量低的培养条件来研究结核分枝杆菌的代谢变化(11，15，16)。此外，Voskuil 等人研究了在低剂量氧化氮条件下培养时结核分枝杆菌的表达图谱，低剂量氧化氮是杆 菌在潜伏期遇到的另一个体外条件和与Th1免疫一致(开始)(19)。使用全部基因组DNA 微阵列，Voskuil等人观察到结核分枝杆菌的一套48个基因始终正调节，在潜伏期的所 有三个体外模型即在NRP、恒定低氧和低剂量氧化氮暴露下都观察到这一事实(17)。当 M.tuberculosis在活化鼠巨噬细胞中体外生长时，所谓休眠调节子(DosR)的基因也发现是 正调节的(18)。此外在慢性感染的小鼠和TB病人的肺中，M.tuberculosis的转录模式显 示了NRP的特征(19，20)。这说明在TB疾病过程中很可能一杆菌亚群碰上低氧的条件 和低浓度氧化氮，并且适合于非复制状态。这显示在向潜伏期感染的转变过程中休眠相 关蛋白质被诱导且在潜伏期间很可能结核杆菌表达休眠相关蛋白质。大多数被此调节子 编码的假设蛋白质的功能还未知。在此专利说明书中，我们将由休眠调节子的基因编码 的蛋白质称为潜伏期抗原。
基于休眠(DosR)调节子基因的发现，将被编码的蛋白质作为用于检测目的和防护性 或治疗性免疫接种和/或接种疫苗目的的潜在抗原可见于GB 0116385.6/US2004/0241826。此外，WO 0179274和US2004/0057963提供了使用在分枝 杆菌感染潜伏阶段中被特异性诱导的多肽针对潜伏结核分枝杆菌感染诱导的免疫应答 的方法和组合物。其中的多肽选自在前述体外模型的潜伏期中是正调节的45个休眠调 节子基因的库。促进免疫接种目的的抗原之一是编码一个α晶体蛋白同源体的 HspX(Rv2031c或Acr)，US2004/0146933中描述了其对诊断和免疫接种目的用途。
目前还不清楚NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质是否确实在人的M.tuberculosis感 染潜伏期中表达非常高水平以诱导显著的免疫应答，因为现有技术使用潜伏期的体外模 型和小鼠模型。也不清楚来自于潜伏期或休眠调节子的假设抗原是否是足够免疫原性的 以及这些假设的潜伏期抗原和/或表位的免疫性是否确实与提供针对潜伏或新获得的哺 乳动物分枝杆菌感染的保护相关。尤其现在还不清楚48个休眠/潜伏期调节子编码的假 设蛋白质中的哪个在实际人结核分枝杆菌潜伏感染中可能是最相关的。
为了在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中引起免疫应答而组合所有48个假设潜伏期 抗原在例如一个药学组合物或疫苗之中既不可实行或预期也无效。许多鉴定出的假设潜 伏期抗原不能有效引起免疫应答，因为它们没有表达到足够水平或它们不含有足够的 (显性的)识别潜伏感染的哺乳动物的免疫系统的细胞毒性T细胞(CTL)或T辅助细胞 (Th)表位。
发明概述
本发明要解决的问题是从48个已知的假设潜伏期抗原中提供一种最佳选择以及仅 选择那些确实能够引起潜伏分枝杆菌感染的健康个体体内免疫应答的抗原。本发明通过 体内对分枝杆菌潜伏期相关抗原和/或表位的显性人免疫应答的离体鉴别解决了上述讨 论的问题从而提供了针对潜伏分枝杆菌感染的检测和免疫接种的新方法和组合物。这些 组合物仅包含那些确实能够在处于潜伏分枝杆菌感染的哺乳动物体内引起免疫应答的 潜伏期抗原，更优选仅包含那些被潜伏感染个体优选识别的抗原，并且这些抗原不被或 更较少程度的被具有活跃分枝杆菌感染的个体或具有分枝杆菌诱导的疾病或症状的个 体例如患有肺结核(TB)的病人识别。本发明通过从至少48个本领域公知的结核分枝杆 菌潜伏期抗原的组中鉴别出显性抗原和/或表位的狭窄亚群来实现此目标。
令人惊讶的是，本发明鉴别出的最优选抗原与那些到目前为止在现有技术中研究和 应用最多的假设潜伏期抗原不一致；主要是Rv2031c(HspX/acr)和Rv0569。本发明远离 现有技术出版物、专利和专利申请选择和应用的优选假设潜伏期抗原，说明本发明的狭 窄亚群与已知实例远远不同。根据本公开发明，该不同的小亚群的潜伏期抗原有目的地 选自假设潜伏期抗原的已知组。本发明的抗原和/或表位是广泛分析假设抗原组后选择 的。尽管现有技术中的假设抗原已在在实验室条件下进行了体外模型和小鼠模型的鉴 别，然而本发明公开了那些抗原中确实能够在潜伏分枝杆菌感染的正常环境下引起体内 不同免疫应答的抗原部分，并且它们在健康个体或患有TB疾病的病人中不引起或以更 少的程度引起体内免疫应答。
发明详述
本发明提供了在脊椎动物优选哺乳动物中对分枝杆菌感染尤其是潜伏分枝杆菌感 染诱导免疫应答的方法和组合物，该方法包含对脊椎动物施用组合物的步骤，该组合物 包含一种或多种多肽或其片段，所述的多肽或其片段选自包含能够引起具有分枝杆菌感 染的脊椎动物的体内免疫应答的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的 组。
如本文所用的术语分枝杆菌感染意为包含潜伏感染的哺乳动物，即新近感染还没有 显示症状的哺乳动物和患有分枝杆菌诱导疾病和症状例如活动性肺结核的脊椎动物。为 了防止肺结核疾病的发展，根据本发明治疗的分枝杆菌感染优选潜伏感染。根据本发明 的方法还可方便地作为辅助治疗在抗生素治疗之中或之后应用于有或没有(多重)耐药性 TB的TB病人；对于健康但是暴露于TB之中的人，优选但是不仅是TB流行国家已预 先接种过BCG的儿童。
本发明提供了可针对潜伏分枝杆菌感染的方法和组合物，还可容易地由技术人员将 其与包含表位的多肽或组合物例如针对分枝杆菌的预防疫苗和/或多相疫苗的组合，所述 的表位目的是引起非潜伏感染的免疫应答。
潜伏分枝杆菌感染在本文中理解为涉及感染中的阶段，其中杆菌保持活性但缓慢复 制或维持在非复制状态且可被器官或组织内的局部损害包围而不引起活性坏死性疾病， 正如通常在TB中观察到的一样。潜伏期可存在于宿主的剩余生命，或者感染可在例如 宿主免疫降低或应答其它应激物例如其它(分枝)杆菌或病毒像HIV-1感染或癌症治疗和 其它免疫抑制病症或治疗的时期内再活化。
本发明提供了适合用于以下情况的方法和组合物，1)预防性的(保护性的)，2) 暴露后/感染或3)针对潜伏分枝杆菌感染和相关疾病的治疗性/治愈性疫苗，例如但是 不限于(减毒活和/或重组)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆 菌(包括卡介苗(BCG))(M.bovis(including Bacillus Calmette-Guerin(BCG))、 非洲分枝杆菌(M.africanum)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻疯分枝杆菌(M. leprae)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、禽分 枝杆菌(包括类结核亚种)(M.avium(including subsp.paratuberculosis))、 M.canettii、麻疯分枝杆菌(M.leprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)和溃疡分枝杆 菌(M.ulcerans)。
结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(包括BCG株)、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌和 M.canettii(例如属于TB复合群的分枝杆菌属和株)是根据本发明所使用的潜伏期诱导 的多肽或其片段的最优选来源。
对于本发明的方法和组合物，待治疗或诊断的脊椎动物优选人，但也可包含所有 实验室和农场动物，例如但是不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、山羊、奶 牛、马、骆驼和家禽例如鸡、鸭、火鸡和鹅。
多肽的来源可以是蛋白质、蛋白质的消化物和/或其片段，它们可以是纯化形式或可 包含于粗制组合物中，优选生物来源，例如细菌溶菌产物、超声处理物或固定物。或者， (多)肽可以由化学合成或体外酶生成。多肽或其片段的来源还可以是由RNA或DNA 模板的核酸编码的多肽或其片段。此RNA或DNA分子可以是“裸露”DNA，优选包 含于小囊泡或脂质体中，或可以包含于载体中。载体可以是本领域公知的任何(重 组)DNA或RNA载体，优选其基因编码的潜伏期抗原可操作性的连接于使编码的信使 进行表达和翻译的调控序列的质粒。载体还可以是任何的DNA或RNA病毒，例如但是 不限于腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、改良安卡拉痘病毒(modified Vaccinia Ankara virus)(MVA)或禽痘病毒，或其它任何能够使包含宿主潜伏期表位的 多肽进行表达的病毒载体。DNA载体可以是不完整的，例如附加型复制载体或者可以 是在宿主基因组中随机整合或同源重组整合的载体。
根据本发明包含编码多肽或其片段的基因，任选植入载体例如病毒或质粒中，可以 整合入宿主基因组中。在本发明的一个优选实施方案中，这种宿主可以是微生物。这一 重组微生物优选分枝杆菌，例如结核分枝杆菌种或牛分枝杆菌种且最优选牛分枝杆菌卡 介苗(BCG)，根据本发明它们能够将多肽或其片段传递到宿主中。重组BCG和重组方 法是本领域公知的，例如WO2004094469。这一重组微生物可以制成重组活和/或减毒活 疫苗，例如Jacobs等人，1987，Nature，327(6122)：532-5。载体还可包含于细菌来源的宿 主中，例如但是不限于减毒活和/或重组志贺氏杆菌或沙门氏菌。
在一个实施方案中，本发明提供了诱导对哺乳动物分枝杆菌感染的免疫应答的方 法，该方法包含对哺乳动物施用一种或多种多肽或其片段源的步骤，所述的多肽或其片 段选自包含分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的组，所述蛋白质能够 引起人T细胞系的IFN-γ应答，由Rv079、Rv0569、Rv0572c、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、 Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα 晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2623、Rv2624c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、 Rv3127、Rv3129、Rv3130c、Rv3131、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv3134c、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同型物或同系物，并且任选一 种或多种佐剂。
所述抗原被产自感染个体的短期T细胞系识别且使之与结核分枝杆菌超声处理物接 触。在如实施例1和2所描述的方法中T细胞系显示了优选至少＞50pg IFNγ/ml的干扰 素γ(IFN-γ)应答。分枝杆菌抗原的术语Rv和NRP/休眠(DosR)调节子的DNA和蛋白质 序列在本领域内众所周知且可以例如发现于http://genolist.pasteur.ff/TubercuList/或 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez(Accession number AL123456)。如本文所用的术语Rv 既可涉及抗原的氨基酸序列或编码抗原的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，诱导对脊椎动物分枝杆菌感染的免疫应答的方法 包含施用选自分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组的多肽或其片段来源，所述的 分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列含有能够在具有潜伏分枝杆菌感染的脊椎动物中 引起免疫应答的潜伏期抗原，包括Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、 Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα晶体蛋白同 系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、 Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同 型物或同系物。这些潜伏期抗原的特殊亚群能够在具有潜伏分枝杆菌感染的个体的外周 血单核细胞(PBMC’s)中诱导超过100＞pg IFNγ/ml的干扰素γ(IFN-γ)应答，并且至少是所 有分枝杆菌感染个体的5、10、20、30、40或50％。
在本发明的一个最优选实施方案中，提供了在脊椎动物优选患有或有危险获得潜伏 分枝杆菌感染的个体中诱导免疫应答的方法，包含施用选自分枝杆菌NRP/休眠(DosR) 调节子序列的组的多肽或其片段来源，所述分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列能够 在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中优选引起免疫应答，包括抗原Rv1733c、 Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。 所述八种抗原包含优选在潜伏感染个体中识别和不能或更较少在非感染个体或具有活 动性分枝杆菌感染导致的疾病症状的个体中诱导IFN-γ应答的显性表位。所述抗原在检 测的48个潜伏期抗原中在外周血单核细胞(PBMC’s)中诱导最高水平IFN-γ。此外，这八 个抗原能够在潜伏感染个体的PBMC’s中诱导IL-10的显著生成，但不在患有活动性结 核分枝杆菌感染相关症状的病人的PBMC’s中诱导生成。
根据本发明的方法中使用的三个最优选多肽是分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序 列Rv1733c和Rv2029c(PfkB)和Rv2627c。在检测的所有48个多肽中Rv1733c和 Rv2029c(PfkB)和Rv0080是最常在潜伏分枝杆菌感染的个体中检测到引起免疫应答的， 通过从这些个体获得的PBMC’s中的IFN-γ和/或IL-10的诱导来确定。
在本发明的另一方面，本发明提供了包含分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的多 肽或其片段来源的组合物，所述分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列能够在具有潜伏 分枝杆菌感染的个体中引起免疫应答。根据本发明针对分枝杆菌感染和诱导的疾病而免 疫接种的组合物优选选自包含分枝杆菌NRP/(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的组的一 种或多种多肽或其片段来源，其中所述分枝杆菌NRP/(DosR)调节子编码的蛋白质能够 在人T细胞系中引起IFNγ应答，包括Rv0079、Rv0569、Rv0572c、Rv1733c、Rv1738、 Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、 16-kDa α晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2623、Rv2624c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、 Rv3126c、Rv3127、Rv3129、Rv3130c、Rv3131、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv3134c、 Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同型物或同系物，并 且任选包含至少一种佐剂。
如本文所用的同系物或同型物理解为包含具有与上述天然结核分枝杆菌NRP/休眠 (DosR)调节子编码多肽至少70％、80、90、95、98或99％氨基酸序列相同的多肽且仍 能够引起至少来自结核分枝杆菌多肽的免疫应答。同系物或同型物可包含取代、插入、 缺失和添加N-或C-末端氨基酸或化学部分来增强稳定性、溶解性和免疫原性。
本发明的多肽抗原的片段理解为包含至少一个表位的片段。因此该片段至少包含多 肽抗原序列上的4、5、6、7或8个相邻氨基酸。该片段更优选包含至少一个T细胞表 位，例如至少8、9、10、11、12、13或14个多肽抗原序列上的相邻氨基酸。该片段还 更优选包含CTL和T辅助细胞表位。但是最优选的片段是需要由抗原递呈细胞加工的 肽，例如片段长度为至少大约18个氨基酸，而这18个氨基酸不必是所述多肽抗原的连 续序列。
本发明的组合物更优选包含选自包含能够在分枝杆菌潜伏感染的个体中引起免疫 应答的潜伏期抗原的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组的多肽或其片段，包括 Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、 Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDa α晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、 Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。所述抗原和组合物能够在具有分枝杆菌 感染的个体的外周血单核细胞(PBMC’s)中诱导IFNγ应答。
在一个更优选实施方案中，根据本发明，组合物包含能够在具有潜伏分枝杆菌感染 的个体中优选引起免疫应答的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列来源，其中抗原选 自下列的一种或多种：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。与检测的其它48个分枝杆菌NRP/休眠 (DosR)调节子多肽相比，Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)多肽能够在潜伏感染的个体中诱导出最强 的应答，以PBMC’s中生成IFNγ表示。所述抗原还能够在潜伏感染病人的PBMC’s中 刺激IL-10的生成。而IL-10诱导作用不能或较少在具有活动性分枝杆菌感染和/或TB 疾病症状的病人的PBMC’s中观察到。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少从分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子 序列Rv1733c和/或Rv2029c和/或Rv2627c中获得的多肽或其片段来源，它们是所有检 测的NRP/休眠(DosR)调节子编码的多肽中潜伏感染个体最常识别的抗原。
根据本发明用于免疫接种的包含NRP/休眠(DosR)调节子编码多肽或其片段的组合 物优选包含至少一种赋形剂。赋形剂是药学领域公知的且可以例如见于教科书例如 Remmington’s pharmaceutical sciences，Mack Publishing，1995。根据本发明用于免疫接种 的组合物可优选包含至少一种佐剂。佐剂可包含任何疫苗领域公知的佐剂且可选自教科 书例如Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，2004。
佐剂最有选选自以下佐剂列表：阳离子(抗菌)肽和Toll样受体(TLR)配体，例如但是 不限于：ploy(I：C)、CpG序列、LPS、脂质A、脂肽Pam3Cys和细菌鞭毛蛋白或其部分， 以及它们的具有化学修饰的衍生物。其它本方法中和本发明的组合物中使用的优选佐剂 是：活或灭活BCG的混合物、所述潜伏抗原或其部分的免疫球蛋白复合物、IC31(来自 WWW.intercell.com；见于W003047602)、QS21/MPL(US2003095974)、 DDA/MPL(WO2005004911)、DA/TDB(WO2005004911；Holten-Andersen等人，2004 Infect Immun.2004 Mar；72(3)：1608-17)和可溶性LAG3(CD223)(来自www.Immunotep.com； US2002192195)。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物还可包含CD40结合分子的使用和/或添加 以增强CTL应答从而增强本发明的方法和组合物的治疗效果。CD40结合分子的使用描 述于WO 99/61065中，引入本文作为参考。CD40结合分子优选是抗体或其片段或CD40 配体或其变异体，并且还可单独加入或可包含于根据本发明的组合物之中。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物还可包含竞争性抗-4-1BB抗体或其片段 或另一能够与4-1BB受体相互作用的分子的使用和/或添加。4-1BB受体竞争性抗体和 分子的使用描述于WO 03/084999中，引入本文作为参考。4-1BB竞争性抗体可在添加 或不添加CD40结合分子时使用，通过触发/激4-1BB和/或CD40受体来增强CTL免 疫性。4-1BB结合分子或抗体可单独加入或可包含于根据本发明的组合物之中。
根据本发明用于免疫接种目的的多肽可与蛋白质例如但是不限于破伤风毒素/类毒 素、白喉毒素/类毒素或其它载体分子融合。根据本发明的多肽还可方便地与热休克蛋白 融合，例如重组内源(鼠)gp96(GRP94)作为免疫显性的肽的载体，这描述在(参考文献： Rapp UK和Kaufmann SH，Int Immunol.2004 Apr；16(4)：597-605；Zugel U，Infect Immun. 2001 Jun；69(6)：4164-7)中或与Hsp70的融合蛋白(Triebel等人；WO9954464)。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物优选包含使用从本发明的多肽中获得的 多肽片段，它包含显性CTL或Th表位，并且所述肽的长度在18-45个氨基酸间。CTL 或Th表位序列的存在可由技术人员使用常用已知生物信息学工具例如HLA_BIND、 SYFPEITHI、NetMHC和TEPITOPE 2000(参考文献43、44、45、46、47和48)或实验 中使用标准实验法(Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience 2004)来确定。
根据本发明具有18-45个氨基酸之间长度的肽正如WO 02/070006中所描述的已观 察到提供了优秀的免疫原性质。肽可以方便地化学合成且可任选(部分)重叠和/或还可与 其它分子例如TLR配体、肽或蛋白质连接。肽还可以融合形成合成的蛋白质，见 PCT/NL03/00929和Welters等人(Vaccine.2004 Dec 2；23(3)：305-11)。还可以方便地加入 到肽化学分子的氨基或羧基末端或额外的(修饰或D-)氨基酸来增加该肽的稳定性和/或 降低其生物降解能力。为了提高免疫原性，可以连接免疫刺激分子例如脂化。为了增强 肽的溶解性，可以添加带电荷或极性氨基酸来增强溶解性和体内稳定性。
在另一个实施方案中，根据本发明引起免疫应答或免疫接种的组合物还包含不特异 针对潜伏期阶段的分枝杆菌抗原。这些抗原可能对感染过程的其它阶段具有高度特异 性。提供不仅只对潜伏分枝杆菌感染引起免疫应答还能够对在感染的哺乳动物中引起疾 病症状的活动性分枝杆菌感染引起免疫应答的组合物可能对免疫接种的目的是有益的。 在这些方法中和用该组合物将在感染过程中多个时期的针对分枝杆菌的保护性免疫组 合起来从而提供更好的全面保护是有效的。因此根据本发明包含能够引起免疫应答的潜 伏期特异性抗原的组合物可与已知在活动性感染中引起免疫应答的分枝杆菌抗原组合 使用，所述活动性感染例如但是不限于：结核分枝杆菌抗原ESAT-6(Rv3875)、 Ag85A(FbpA/MPT59、Rv3804c)、Ag85B(Rv1886c)、Ag85C(Rv3803c)、CFP10(Rv3874)、 TB10.3(Rv3019c)、TB10.4(Rv0288)、MPT64(Rv1980c)、MPT32(Rv1860)和 MPT57(Rv3418c)。
在另一个实施方案中，根据本发明的潜伏期特异性抗原和组合物用于提供诊断潜伏 分枝杆菌感染的方法和试剂。根据本发明一种诊断受试者潜伏或持续分枝杆菌感染特别 是潜伏感染的方法包含以下步骤：
a)任选分离的受试者的体液和/或细胞(特别是白细胞)样品与一个或多个多肽或其片 段接触，所述肽选自由Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、 Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα晶体蛋白同 系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、 Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)组成的分枝杆 菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组；和
b)通过测量指示分枝杆菌感染的增殖或细胞因子生成来检测对所述多肽的免疫应 答。
诊断方法最优选包含多肽Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)中的至少一个或多个。在另一个优选实施 方案中诊断方法包含检测针对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv0080多肽或其 片段的免疫应答，它们是如本文检测的潜伏分枝杆菌感染的所有潜伏期抗原中最常检测 到的抗原。
如本文所用的体液意为包含尿、唾液、精液、眼泪、淋巴液和最优选的血包括血细 胞。PBMC’s可使用已知常规技术自血样中获得和培养。为了增加诊断方法的灵敏性和 特异性，高度优选组合检测数个潜伏期特异性抗原，在一个特别优选的实施方案中方法 包含检测针对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、和Rv0080抗原的免疫应答。该方 法还可与本领域公知的非特异于分枝杆菌感染的潜伏期例如那些特异于感染过程中活 动期的其它抗原的检测组合。这些关于结核分枝杆菌的抗原可包含但是不限于： ESAT-6(Rv3875)、Ag85A(FbpA/MPT59、Rv3804c)、Ag85B(Rv1886c)、Ag85C(Rv3803c)、 CFP10(Rv3874)、TB10.3(Rv3019c)、TB10.4(Rv0288)、MPT64(Rv1980c)、MPT32(Rv1860) 和MPT57(Rv3418c)。
本发明还提供了实施前述诊断方法的诊断试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的一个 或多个多肽或其片段且任选包含检测和定量结合于所述多肽的抗体或测量细胞免疫应 答的试剂。这些试剂可优选包含检测抗原结合例如但是不限于ELISA或多重CBA检测 所需的试剂，或检测IFN-γ和/或IL-10应答的试剂，例如那些用于本文提供的实施例中 的试剂。检测分枝杆菌感染的多肽或其片段可方便地与固相载体例如蛋白质/肽(微)芯片 或微滴/孔板连接。
本发明还包含来自潜伏期特异性抗原和/或表位的优选片段，包含多肽Rv1733c、 Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。 这些肽优选用于根据本发明引起免疫应答和诊断目的的方法和组合物并且优选长度为 18-45个氨基酸且包含以下序列或由以下序列组成：VEDPAPPARAIADAALAALG(SEQ ID No.1)或图13、14、15和16中本发明鉴定和描述的B和T细胞表位中的一种。
定义
氨基酸序列相同表示两个(多)肽序列被例如GAP或BESTFIT程序使用默认参数最 佳排比时如本文其它部分定义的那样具有至少一定百分比的相同序列。GAP使用 Needleman和Wunsch全序列排比算法来排比两个序列全长，最大化匹配的数量且最小 化裂隙(gaps)的数量。一般而言，使用GAP默认参数，1个裂隙插入扣分＝8和1个 gap延伸扣分＝2。对于蛋白质默认打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。百分比序列相同的序列排比和打分可使用计算机软件例如GCG Wisconsin Package，Version 10.3，可购于Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752，USA来确定。或者百分比相似或相同可通过在例如FASTA、BLAST等等数 据库中搜索来确定。
调节子是真核生物中的遗传单位，由单个调节基因控制的基因非连续的组组成。在 细菌中，调节子是涉及多效调节域的相互作用的整体调节系统且可由一个或数个操纵子 组成。结核分枝杆菌的NRP/休眠(DosR)调节子是由DosR转录调节子-(Rv3133c)控制的 且包含至少48个表2中所列的Voskuil等人(J.Exp.Med.2003，198(5)：705-13)描述的序 列。
如本文所用的术语受试者涉及活的多细胞脊椎生物体，范畴包括人和非人哺乳动 物。术语受试者包括人和兽医或实验室受试者。
本文的抗原是能够诱导哺乳动物免疫应答的大量分子或其片段。该术语包括对抗原 性或抗原决定簇或表位负责的免疫原和区域。抗原是一种化学或生物化学结构，其中起 决定性作用的抗原或其部分能够诱导细胞(T细胞)或体液(抗体)免疫应答的形成。
体内或体外免疫应答可通过本说明书提供的一种方法来确定和/或监测，还可通过许 多本领域技术人员公知的和显而易见的其它方法例如见于Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience 2004的方法来进行。细胞免疫应答能够通过诱导取自当 前或之前感染(有毒地)分枝杆菌的或用不限于多肽免疫的哺乳动物的淋巴细胞中的相关 细胞因子例如IFN-γ或IL-10的释放(或诱导细胞增殖)来确定。为了检测细胞增殖，细 胞可用放射性标记的胸苷脉冲或(流式)细胞计数仪或显微镜下计数。细胞因子的诱导可 通过多种免疫化学方法例如但是不限于ELISA或Elispot检测法来检测。体外细胞应答 还可通过来自健康个体或分枝杆菌感染的哺乳动物的T细胞系的使用来确定，其中T细 胞系取自活和/或灭活、减毒或重组分枝杆菌、潜伏分枝杆菌或由其衍生或从中获得的选 择抗原。
术语疫苗或免疫原性组合物本文用于描述对刺激哺乳动物特异性免疫应答有效的 组合物，任选包含佐剂或其它活性成分来增强或直接引起特殊类型的免疫应答，优选 CTL或Th应答。
分枝杆菌在其休眠期或静止期表达的潜伏期特异性多肽或抗原比在其活动或对数 生长期水平更高(或唯一)，因为结核分枝杆菌可由NRP/休眠(DosR)调节子编码(Voskuil 等人，2003)。
应将TST阳性个体理解为包含显示阳性曼塔斯试验(＞5mm硬结)的哺乳动物或其纯 蛋白衍生物PPD(＝结核菌素)诱导阳性体外响应应答的个体，应答通过IFN-γ的释放来确 定，并且因此可能具有潜伏分枝杆菌感染，例如已被(有毒力的)分枝杆菌例如结核分枝 杆菌感染的个体没有显示(活动性)疾病例如肺结核(TB)的信号。TB患者是培养或显微镜 证明(有毒力的)分枝杆菌感染的个体和/或临床诊断TB和对抗TB化学疗法有效的个体。 TB的培养、显微镜检查和临床诊断是任何本领域医生公知的。
当第一个核酸序列与第二个核酸序列功能相关时，核酸序列可操作性的选连接于第 二个核酸序列上。例如如果启动子影响了编码序列的转录和表达，可将启动子操作性的 选连接于编码序列上。一般而言，可操作链接的DNA序列是连续的且必要时在同样的 阅读框中连接两个蛋白质编码区域。
如本文所用的载体涉及引入宿主细胞从而生成转化宿主细胞的核酸分子。载体可包 括允许在宿主细胞中复制的核酸序列例如复制起点。载体可以例如是质粒、噬菌粒、噬 菌体、粘粒、病毒、逆转录病毒、游离基因或转座因子。载体还可包括一种或多种可选 (抗生素抗性)或外观可见(例如GFP、免疫标记)标记基因和其它本领域公知的遗传元件。 蛋白质、肽和多肽是氨基酸(通常是L-氨基酸)的线性聚合链，其中α碳是通过一个氨 基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接的。链 的一个末端的末端氨基酸(例如氨基末端)具有游离氨基，而链的另一个末端的末端氨基 酸(例如羧基末端)具有游离羧基。因此，术语氨基末端(N-末端)涉及肽的氨基末端的氨 基酸的游离α-氨基或肽的其它任何位置的氨基酸的α氨基(当参与另一个肽键时为亚氨 基)。术语羧基末端(C-末端)涉及肽的羧基末端的氨基酸的游离羧基或肽任何其它位置的 氨基酸的羧基。
合成多肽涉及用有机化学工具形成肽键通过特定顺序连接氨基酸在体外形成的多 肽。通常形成肽的氨基酸依次计数，开始于肽的氨基末端且朝向羧基末端增加。
附图说明
图1.应答结核分枝杆菌潜伏期抗原、低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物和培养滤液 (CF)的长期T细胞系的数量(n＝12)。≥50pg/ml的IFN-γ应答认为是阳性。用在低含氧量 条件下生长的结核分枝杆菌培养液的溶菌产物(n＝4)□或CF(n＝4)■或用在标准含氧条 件下生长的结核分枝杆菌培养液的溶菌产物(n＝4)■刺激从TST+个体(n＝2)或TB病人 (n＝4)的得到的PBMC获得细胞系。条带指示了对每个潜伏期抗原的应答的细胞系的数 量且每个条带顶部的数字说明了这些应答细胞系生成IFN-γ的平均值。
图2.TST阳性个体(TST+)和TB病人识别的潜伏期抗原的数量。来自23个TST+ 个体和20个TB病人的PBMC’s用25个结核分枝杆菌潜伏期抗原刺激。当潜伏期抗原 诱导≥50 pg/ml的IFN-γ应答时认为其被识别。计算每个个体识别潜伏期抗原的数量。条 带显示了识别特定数目的潜伏期抗原的个体的数量。(a)TST+个体。白色条带指示了新 近TST转化者的数量(总数n＝12)而黑色条带指示了遥远TST转化者(总数n＝11)的数量。 (a)TB病人。白色条带指示了活动性TB病人的数量(总数n＝11)而黑色条带指示了治愈 TB病人的数量(总数n＝9)。
图3.对四个最佳识别的结核分枝杆菌潜伏期抗原的应答曲线。来自健康对照(HC)、 TB病人(TB)和TST阳性个体(TST+)的应答四个结核分枝杆菌潜伏期抗原即Rv1733c(a)、 Rv2029c(b)、Rv2627c(c)、Rv2628(d)的PBMC’s的IFN-γ生成。还评价了PBMC对低含 氧量条件下生长的结核分枝杆菌的溶菌产物(e)或培养滤液(f)的应答性。受试组的平均值 用水平线表示。*，P＜.05；**，P＜.01；***，P＜.001。
图4.对结核分枝杆菌潜伏期抗原的健康对照(HC)的应答。(a)健康非结核分枝杆菌 感染对照基于其对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的应答分为两组。具有＜100pg/ml的 IFN-γ应答的HC分类为HClow(n＝11)(○)，而具有＞100pg/ml的IFN-γ水平的HC分类 为HChigh(n＝10)(●)。平均值显示为水平线。(b)对25个潜伏期抗原的IFN-γ应答平均 值计算为HChigh组(黑色条带)和HClow组(白色条带)。正如显示的那样，对潜伏期抗原的 IFN-γ应答几乎只在HChigh组(黑色条带)中观察到(b)。这组中的个体大多可能暴露于环 境中的分枝杆菌中，正如它们对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的强烈应答所显示的那 样。
图5.被结核分枝杆菌Rv1733c的肽池刺激后的CFSE标记的CD4淋巴细胞的增殖。 已知对Rv1733c重组蛋白质进行应答的TST+个体的PBMC用羧基醋酸荧光素琥珀酰亚 氨酯(CFSE)标记且用培养基(a)、PPD(b)、Rv1733c重组蛋白质(c)或Rv1733c肽池(d-f) 刺激。CD4细胞染色，随后通过使用流式细胞仪测量CFSE的稀释液来评价CD4阳性 细胞的增殖。
图6.应答潜伏期抗原的细胞因子曲线。TB病人(n＝10)和TST阳性个体(n＝10)的 PBMC用显示的潜伏期抗原和低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物刺激。六天后收集上清液 且使用FACSCalibur流式细胞仪根据微量样本多指标流式蛋白定量技术(BD)来确定细胞 因子曲线。评价以下细胞因子：TNFα(红色)、IL-10(橙色)、IL-5(黄色)、IL-4(绿色)和IL-2(蓝 色)；每组中显示的是每个抗原的细胞因子水平平均值。与TB病人相比，TST阳性中观 察到显著的IL-10应答，特别是对于Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628和 Rv3129中。
图7.所有48个DosR潜伏期抗原的免疫原性检查。
图8.优选TB潜伏期抗原的识别频数。
图9.显示了参与的对TB潜伏期抗原应答的欧拉图。
图10.图D.人接种BCG后的免疫应答。BCG接种的个体对TB潜伏期抗原的单独 (i)IFNγ应答和平均值(ii)。不暴露在任何结核分枝杆菌下的BCG接种的个体显示了对 TB潜伏期抗原的弱IFNγ生成(左)，而有证据暴露于TB(例如对TB特异性抗原ESAT6 或CFP10的体外应答阳性)的BCG接种的个体对TB潜伏期抗原具有显著的IFNγ生成 (右)。
图11.(上层条带I)BCG接种的HLA-DR3转基因小鼠对TB潜伏期抗原HspX及其 HLA-DR3限制性T细胞表位诱导弱免疫应答，而对Hsp65和Ag85重组蛋白质及其 HLA-DR3限制性肽观察到显著应答(如Geluk等人，PNAS 95：10797-802所描述)。
(下层条带ii)BALB/c小鼠对潜伏期TB潜伏期抗原的IFNγ应答。体外用TB潜伏期 抗原刺激的BCG接种鼠脾细胞生成低水平IFNγ。相反，分泌抗原Ag85A刺激的细胞 生成显著数量的IFNγ(A)。然而，小鼠能够对检测的TB潜伏期抗原产生免疫应答：在 用质粒DNA编码单独TB潜伏期抗原3×免疫接种后，脾细胞产生显著数量的IFNγ(B)。
图12.TB抗原的TMHMM(跨膜)后概率分析。
实施例
材料和方法
研究对象
研究包括20个TB病人、23个健康结核菌素皮肤试验(TST)阳性个体和21个健康未 感染对照。因为我们的主要目标是检查对新潜伏期抗原的T细胞应答而没有做关于结核 分枝杆菌感染哪个时期中最易发生识别的假设。因此选择了复杂背景的TB病人和TST 转化者作为研究对象。
20个TB病人中11个病人患有治疗了2周-6个月(平均2.5个月)的活动性TB疾病 而9人患有在取血样前治疗了4-63年(平均间隔29年)的已治愈TB。11个病人患有肺而 9人患有肺外TB。取血样时的平均年龄为46岁(范围是17-75)，14人是男性。9个病人 来自荷兰、3人北非、6人非洲和3人是亚洲血统。这些病人都没有HIV的危险因素。
23名TST阳性者全部健康、他们都没有经过BCG接种且TST结果证实他们都有 ≥10mm的硬结，绝大多数在接触肺TB涂布呈阳性的案例后(n＝14)。平均年龄是37岁(范 围是21-63)，14人是男性。所有均为荷兰人。12人在TST转化后6个月内取血，其中 只有5人用异烟肼治疗了潜伏TB感染。剩下的11个TST阳性者，转化和取血间的平 均间隔是6年(范围是2-12年)。这些遥远TST转化者中仅有2人曾接受过异烟肼。直到 撰写本发明时，没有TST阳性者在TST转化后平均4.9年的时期后患有活动性TB疾病。 此组中的大多数个体可认为是潜伏感染个体，显示了对活动性TB疾病发生的一定程度 的天然保护。
作为对照组，21个健康、未经BCG接种的个体接受研究。在这些健康对照中没有 人曾暴露于TB中。他们是TST阴性(n＝18；其他人没有进行TST)和或用ELISPOT进 行的对结核分枝杆菌特异性蛋白质、ESAT-6和CFP-10检测IFN-γ的试验呈阴性(21)。 所有对照者是平均年龄30岁(范围是22-44岁)的荷兰人，7人是男性。
血样通过使用肝素化导管标准静脉穿刺获得自所有的写有知情同意书的研究对象。 随后如前描述的使用Ficoll密度梯度法分离PBMC且储存于液氮中(22)。研究计划 (P207/99)由Leiden University Medical Center的机构审查委员会批准。
结核分枝杆菌抗原和肽
为此研究，结核分枝杆菌H37Rv在螺旋瓶盖盖紧的试管中生长24小时，如前述收 集并裂解(16)。该裂解液还被称为低含氧量裂解液，将其用丙酮沉淀和PBS透析。此低 氧培养的培养滤液用centriprep离心超滤器浓缩。获得制品的蛋白质浓度用BCA试验确 定(Pierce，Rockford，Ilinois)。低含氧量裂解液和低含氧量培养滤液由Statens Serum Institute(Copenhagen，Denmark)惠赠。标准充氧实验室条件下培养结核分枝杆菌的溶菌产 物由Natinoal Institute of Public Health and Environment(Bilt ho ven，the Netherlands)提供。
重组蛋白质由来自结核分枝杆菌休眠调节子的25个最正调节的基因组成(表1)。用 PCR扩增基因和在含有N-末端组氨酸标签的细菌表达载体中用Gateway技术克隆 (Invitrogen，San Diego，CA)。蛋白质在大肠杆菌B株BL21(DE3)中过表达且如前述纯化 (23)。为了证实表达了正确的序列，测序所有嵌入物。通过凝胶电泳和抗-His抗体的免 疫印迹法检查大小和纯度。通过鲎变形细胞溶解物试验评价残余内毒素的浓度低于 50I.U./mg蛋白质(BioWhittaker，Walkersville，MD)。
来自潜伏期抗原Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628的20个合成肽每个是带 有10个氨基酸重叠的20个氨基酸(aa)长且跨越所述潜伏期抗原的全部氨基酸序列(22)。 所有肽的序列在C-末端用两个赖氨酸残基延长以提高溶解性。为了最佳使用PBMC’s， 我们选择生成9个肽池，每个具有4-5个肽且每个单独的肽存在于两个不同的池中。此 方法能够鉴定被抗原特异性T细胞识别的一个池中的特异性肽。
T细胞系
针对生长于低氧条件下的结核分枝杆菌的裂解液(n＝4)或培养滤液(n＝4)使用获得自 两个TB病人和两个已知应答HspX的TST阳性个体的PBMC生成八个长期T细胞系。 为了比较，用在标准充氧实验室条件下培养的结核分枝杆菌的裂解液刺激来自三个TB 病人和一个TST阳性个体的PBMC制备了另外4个结核分枝杆菌特异性T细胞系。T 细胞系如前述制备(24)。简言之，PBMC在24孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中以1×106 细胞/孔浓度在5μg/ml上述详细说明的抗原的存在下培养。6天后，加入25U/ml白细胞 介素-2(Cetus，Amsterdam，The Netherlands)且继续培养2-3周。T细胞冻存于液氮中直至 使用。
T细胞增殖检测
将单独的T细胞(5×104/孔)或将T细胞(5×104/孔)与作为抗原递呈细胞(1.5×104/孔)的 HLA-DR匹配的辐射PBMC三份在抗原存在或不存在下于96孔平底微量滴定板(NUNC) 中培养。补充10％混合人血清、40U/ml青霉素和40μg/ml链霉素的Iscoves改良 DMEM(Gibco，Paisley，Scotland)用做标准培养基。如表1所示的所有25个重组潜伏期抗 原在终浓度0.33μm下及标准结核分枝杆菌裂解液、低含氧量-裂解液和-培养滤液在 1μg/ml浓度下检测。有丝分裂原PHA(2μg/ml)用作阳性对照。37℃和5％CO2培养三天 后，收集上清液(50μl/孔，每三份混合)进行IFN-γ检测且T细胞增殖通过[3H]胸苷掺入 如前述测定(22)。增殖表示为刺激指数，计算为刺激孔中每分钟计数除以未刺激孔中每 分钟计数。刺激指数＞4预先定义为阳性应答。
淋巴细胞刺激测定
三份PBMC(1.5×105/孔)在标准培养基中于96孔平底微量滴定板37℃、5％CO2在潜伏 期抗原存在或不存在下培养。相同抗原和相同量在所有实验室中使用。由于Rv1737c量 的不足，对此抗原的研究对象的数量限制为17个健康对照、18个TST+者和16个TB 病人。在第六天，收集上清液(75μl/孔，每三份混合)进行IFN-γ检测且如前述测定T细 胞增殖(22)。
IFN-γ检测
上清液中IFN-γ浓度通过ELISA(U-CyTech，Utrecht，The Netherlands)测定。此方法的 检出限是20pg IFN-γ/ml。ELISA样品重复两次检测。刺激培养基的平均值减去未刺激 培养基的平均值。阳性应答预先定义为在刺激T细胞系的上清液中IFN-γ浓度＞50pg/ml 和PBMC培养基中＞100pg/ml。
多重细胞因子检测
IFNγ、TNFα、IL-10、IL-5、IL-4和IL-2在培养基上清液中的浓度用人Th1/Th2细 胞因子(BD Biosciences)微量样本多指标流式蛋白定量(CBA)试剂盒来确定，允许在一个 样品中同时检测多重细胞因子。检测根据厂家说明书进行。
CFSE标记的PBMC’s的增殖
将PBMC融化并以10×106细胞/ml重悬于PBS/0.5％BSA(37℃)中。CFSE以终浓度 5μM加入且37℃黑暗培养10分钟。培养后，加入FCS(10％)且用PBS/0.5％BSA洗细胞 两次。标记的PBMC(1×106细胞/孔)在标准培养基中在PPD(5μg/ml)、Rv1733c重组蛋白 质(20μg/ml)、Rv1733c肽池(每个肽10μg/ml)、PHA(2μg/ml)或单独培养基存在下于24 孔板中培养。6天后，细胞用PBS/0.1％BSA清洗且对CD4染色，随后通过使用流式细 胞仪测量CFSE的稀释液来评价CD4阳性细胞的增殖。
统计分析
为了比较每个研究组中应答者的比例，使用卡方检验。IFN-γ应答平均值用克-瓦二 氏检验非参数计算以比较所有三个研究组而曼-惠特尼U检验用作两组对比时的事后检 定。由于此研究的主要目的是初步筛选有潜力的免疫原性潜伏期抗原，所以不适用 Bonferroni校正。非参数弗里德曼检验(等级方差)用于检测TST阳性个体一般识别25 个潜伏期抗原好于TB病人的假说。P值＜0.05认为在统计学上是显著的。用于Windows 的SPSS10.0用于统计分析。
实施例1
免疫原性的潜伏期抗原的选择
抗原选自最近鉴定的结核分枝杆菌的休眠调节子，它由48个基因(表2)组成，发现 这48个基因在NRP、氧限制和暴露在低剂量氧化氮的条件下能被诱导(17)。由于这些 基因中的大多数是具有未知功能的假设开放阅读框，因此对此后基因组抗原发现计划的 基因选择不能基于蛋白质功能。因此我们根据其诱导的浓度选择基因。为此目的，计算 每个单独基因的平均诱导倍数，基于Voskuil等人在三个不同体外潜伏期模型中观察到 的诱导倍数(17)。在48个候选基因的数据中，选择25个诱导最强的基因进行克隆和表 达为重组蛋白质(表1；图7i和8i)。这些假设蛋白质随后在相同摩尔浓度下检测以能够 进行大小上非常不同(9-74kDa)的潜伏期抗原之间的直接比较。这25个抗原全部被结核 分枝杆菌超声处理物生成的短期T细胞系识别。
对于这些假设潜伏期抗原的免疫原性的最初评价，在低氧条件下或在标准充氧条件 下(n＝4)培养的的结核分枝杆菌的裂解液(n＝4)或培养滤液(n＝4)中制备长期T细胞系且 特异性通过T细胞增殖检测证实。重要的是，所有25个潜伏期抗原都被12个T细胞系 中的至少1个识别(IFN-γ＞50pg/ml)而20个抗原被至少4个T细胞系识别(图1)。潜伏期 抗原HspX(Rv2031c)和Rv2032是最常被识别的，被检测的T细胞系的75％识别，IFN-γ 在应答系中的浓度平均值分别是507和129pg/ml。大多数潜伏期抗原被低含氧量溶菌产 物和低含氧量培养滤液培养的T细胞系识别，说明潜伏期抗原还能在培养滤液细胞外中 发现。这证实了之前显示Rv0569、Rv2623和Rv2626c蛋白质存在于生长在低含氧量条 件下的结核分枝杆菌的培养滤液中的研究(16)。标准溶菌产物特异性T细胞系对潜伏期 抗原的应答与低含氧量溶菌产物特异性T细胞系一样好(图1)。这一发现支持了最近的 观察结果，即在静止生长期收获细菌时潜伏期抗原还被标准充氧培养的结核分枝杆菌表 达，虽然其表达的程度比在所定义的低含氧量条件下培养的结核分枝杆菌(25)更低。我 们用于生成T细胞系的标准充氧的结核分枝杆菌溶菌产物的免疫印迹分析证实了潜伏 期抗原HspX在此制品中的存在(数据没有显示)。增殖数据(数据没有显示)的类似结果证 实了T细胞系对潜伏期抗原的应答性。这一首次探索筛选说明所有25个新分枝杆菌潜 伏期抗原具有能引起细胞免疫应答的可能。
实施例2
应答结核分枝杆菌潜伏期抗原的PBMC中干扰素γ的生成
随后，用20个TB病人、23个TST阳性健康个体和21个未感染对照对象的PBMC 研究了25个潜伏期抗原诱导IFN-γ的生成。对每个单独潜伏期抗原，计算每组研究对 象的应答(IFN-γ≥100pg/ml)比例(表1)。我们还计算了所有43个结核分枝杆菌感染个体 中应答者的比例，其中共20个TB病人和23个TST阳性个体。后一个分析显示19个 潜伏期抗原被结核分枝杆菌感染个体的至少5％识别，Rv1733c被大部分(56％)感染个体 识别。剩余6个检测的抗原，Rv0572c、Rv2623、Rv2624c、Rv3127、Rv3131、Rv3134c 不或很少被结核分枝杆菌感染个体识别。当分析增殖数据时(未显示)发现类似识别曲线。
表1.潜伏期抗原的免疫原性a
  Rv编号   基因   产品   应答者(％)b     HC    (n＝21)     TB     (n＝20)     TST+     (n＝23)   Rv0079   Rv0569   Rv0572c   Rv1733c   Rv1738   Rv1813c   Rv1996   Rv2007c   Rv2029c   Rv2030c   Rv2031c   Rv2032   Rv2623   Rv2624c   Rv2626c   Rv2627c   Rv2628   Rv3126c   Rv3127   Rv3129   Rv3130c   Rv3131   Rv3132c   Rv3133c   Rv3134c                 fdxA   pfkB   hspX   acg   TB31.7   devS   dosR     HP   CHP   HP   可能是跨膜蛋白   CHP   CHP   CHP   可能是铁氧环蛋白A   可能是磷酸果糖激酶   B   CHP   热休克蛋白HspX   CHPAcg   CHP TB31.7   CHP   CHP   CHP   HP   HP   CHP   CHP   CHP   CHP   传感组氨酸激酶   转录调节蛋白   CHP     14     -     10     41     -     14     14     -     29     14     5     14     -     -     14     38     10     19      -     19     -     -     24     14     -     10     5     5     50     11     15     11     -     25     15     20     20     -     -     10     30     16     10      -     21     -     -     15     32     -     16     22     -     61     13     17     4     9     61*     26     -*     30     -     -     30     52     35     30     4     35     13     4     17     30     4
a缩写：HC，健康对照；TB，TB病人；TST+，结核菌素皮肤试验阳性个体；HP， 假设蛋白质；CHP，转化假设蛋白质。
注释来自http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/
bIFN-γ应答≥100pg/ml认为阳性。-，受试者都没有应答。
*P＜.05，比较TB病人与TST+个体的卡方检测。
除了25个最强诱导的DosR基因，再次检测了48个DosR基因整组的INFγ生成， 包括剩余的23个未检测的TB潜伏期抗原。所有DosR基因在如前述的类似形式下检测， 结果在图7ii和8ii中显示。从下条带中清楚地看出除了Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c 和Rv2628外，另外4个抗原Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)获 得了强INFγ生成，能选择为潜在疫苗候选者。
实施例3
TB病人和TST阳性个体对潜伏期抗原的不同应答
检测TB病人和TST转化者的组中对每个潜伏期抗原的IFN-γ应答平均值。将25 个潜伏期抗原作为一组，IFN-γ应答平均值在被认为是结核分枝杆菌潜伏感染的TST阳 性个体中始终和显著地高于TB病人(P＜0.01；弗里德曼检验)。为了深入分析此抗原识别 的不同，我们计算了对每个潜伏期抗原的IFN-γ应答和相同个体中对低含氧量结核分枝 杆菌溶菌产物的全部应答间的比率。此分析校正了T细胞的一般应答性中可能的个体间 变异。当重复上述弗里德曼分析时，比较这些比率的平均值，证实了潜伏期抗原优选被 TST阳性个体所识别(P＜0.01)。
当比较TST阳性个体组和TB病人组中对每个单独潜伏期抗原的应答者的比率时， 发现几乎所有潜伏期抗原相比TB病人被TST阳性个体组较大比率识别(表I)。但是这 种倾向仅对Rv2029c显著(P＝0.02)，其被61％TST阳性个体和25％TB病人识别。
个体间的应答曲线不同，这潜伏期抗原的数量和被识别的特异性抗原有关(图2)。 TST阳性者平均识别检测的25个潜伏期抗原中的4个，而相反TB病人平均识别仅1 个潜伏期抗原。
图8中概括了Mantoux阳性个体识别TB潜伏期抗原的频数。对第一系列25个TB 潜伏期抗原来说，显然不是所有抗原都相同地被识别(Cochran’s Q检验，P＜.001)。基于 此想法，我们选择了第一系列中至少50％识别的潜伏期抗原：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、 Rv2627c和Rv2628且选择了第二系列23个TB潜伏期抗原中具有相同特点的：Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)。这8个抗原提供了最适于诊断和免疫接 种目的的TB潜伏期抗原的特异性亚群，作为单独抗原或其片段，但是最优选使用选自 由Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和 Rv1736c(Nark)组成的组中的1、2、3、4、5、6、7或所有8个DosR基因产物的组合。
实施例4
常被识别的潜伏期抗原的干扰素-γ应答
4个潜伏期抗原即Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628被大部分潜伏感染个体 广泛识别且如IFN-γ生成所测量的那样诱导最强的Th1应答。每个研究组对这4个抗原 的IFN-γ应答显示于图3。TST阳性者的组对Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628 应答而生成IFN-γ的平均值分别是213、281、107和51pg/ml。相反，TB病人对这4个 抗原的IFN-γ应答则低得多，平均值分别是98、16、＜10和＜10pg/ml。抗原Rv2029c的 IFN-γ应答的区别在统计学上呈显著性(P＝0.03)(图3)。
令人惊奇的是，潜伏期抗原Rv2031c相比TST转化者更常被TB病人显著识别 (IFN-g＞100pg/ml)(P＝0.02)(表I)。但是当进行定量分析时，直接比较两组间的IFN-γ生 成未发现统计学上显著的区别。有趣的是，对Rv2031c至少显示了一些应答(IFN-γ浓度 在20-100pg/ml间)的TST转化者全部是最近TST转化者(＜6个月)，因此仅在最近暴露 于结核分枝杆菌中。
我们研究的另一个有趣的潜伏期抗原是Rv3133c/dosR，显示其充当了介导结核分枝 杆菌的低含氧量应答的转录因子。最近研究了Rv3133c/dosR的一个突变株；在豚鼠显 示它的病理变化和细菌负载减少但是没有改变体外结核分枝杆菌在人单核细胞中的进 入、存活和繁殖(28)。在我们的研究中，Rv3133c被大约三分之一TST阳性个体和TB 病人识别，应答者中的IFN-γ应答平均值分别是227和145pg/ml。
在图9(欧拉图)中IFN-γ应答的重叠代表了第一系列受试者中最好的4个TB潜伏期 抗原，其中，评价了所有单独抗原：82.4％Mantoux阳性个体对一个或多个以下潜伏期 抗原有应答：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628。Rv1733c和Rv2627c的组 合是最常被识别的，且只对此现象负责；没有Rv2029c(PfkB)和/或Rv2628的附加值。 Rv2029c(PfkB)是Mantoux阳性者中最常识别(70.6％)的TB潜伏期抗原。这些抗原的组 合，优选与Rv0080、Rv1735c、Rv1736c和/或Rv1737c组合将高度适合且优选用于诊断 试验和潜伏期和/或多级疫苗的组合物。
图12中显示了TB潜伏期抗原Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)的跨膜螺旋的预测。用TMHMM 2.0 Server 进行预测.Krogh A，Larsson B，von Heijne G，Sonnhammer EL.Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model：application to complete genomes.2001.J Mol Biol.305(3)：567-80(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。表3和4中MHC I类和II 类表位与预测数据组合而表5中与体外数据组合，此分析表明能检测到CD8 T细胞对 TB抗原的应答，这与这些抗原是分泌的或膜结合的事实无关(Klein MR等人， HLA-B*35-restricted CD8 T cell epitope in Mycobacterium tuberculosis Rv2903c.2002 Infect Immun.70(2)：981-4)。
实施例5
健康对照对潜伏期抗原的识别
多少出乎意料的是，25个潜伏期抗原中的16个被少数健康个体的T细胞识别(表I)， 虽然免疫应答强度通常低于结核分枝杆菌感染个体。因为所有健康未接种BCG的对照 是TST阴性的且此组对结核分枝杆菌特异性免疫显性抗原ESAT6和CFP10的体外应答 也是阴性的(数据未显示)，我们推断观察到的潜伏期抗原应答不是由结核分枝杆菌复合 种感染引起的。但是，21个健康对照中的10个(48％)确实对低含氧量结核分枝杆菌溶菌 产物有显著应答，应答者的IFN-γ应答平均值是563pg/ml(图3和4)。此发现与对获得 自先前暴露于环境分枝杆菌的分支杆菌抗原的T细胞交叉反应性是一致的。由于对潜伏 期抗原的应答大多在强烈应答低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的健康对照组中观察到 (图4)，这些应答很可能还在反应先前暴露于交叉反应性环境分枝杆菌。只有Rv1733c 有时还被不强烈应答低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的健康对照识别，IFN-γ平均值 41pg/ml，说明了对除了分枝杆菌抗原的其他抗原的可能的交叉反应性。
实施例6
对Rv1733c的肽应答的CFSE标记的PBMC的增殖
为了证实潜伏期抗原的蛋白质特异性激活作用，我们检测了作为最常被识别的抗原 Rv1733c的肽特异性增殖。来自已知对Rv1733c有应答的TST阳性个体和健康对照的 PBMC用CFSE标记且用Rv1733c的重组蛋白质或肽池刺激。6天后细胞进行CD4染色 且用流式细胞仪评价CD4 T细胞的增殖。PPD和Rv1733c重组蛋白质的刺激都诱导 CD4+T细胞的强烈增殖。Rv1733c的数个肽池，特别是含有肽16的肽池也能够诱导 CD4+T细胞的增殖。图5中显示了来自TST阳性个体的PBMC。计算机预测对此供体 (DRB1*15)的HLA类型的Rv1733c表位导致发现了数个可能的表位，其中两个位于肽 16(VDEPAPPARPIADAALAALG和VDEPAPPARAIADAALAALG)，这与观察到的应答 肽16的CD4 T细胞的增殖一致。使用来自健康对照的PBMCRv1733c的肽还诱导CD4 细胞的增殖，这些健康对照对Rv1733c的重组蛋白质进行诱导，这说明此应答是抗原特 异性的。
除了原始申请中提到的含有T细胞表位序列的来自Rv1733c的肽16，现已确定在选 择的TB潜伏期抗原中还有以下其它T和B细胞表位和肽：在表3和表4中所有预测的 HLAI类和II类限制性T细胞表位分别代表了第一系列(例如Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、 Rv2627c和Rv2628)和第二系列(例如Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和 Rv1736c(Nark))中最好的4个TB潜伏期抗原。
表4中列出了9个氨基酸构成的序列，代表被所有已知HLA I类超型：A1、A2、 A3、A24、B7、B8、B27、B44、B58和B62限制的预测的CD8 T细胞表位。
使用NetCTL 1.0 Server进行预测，预测了蛋白质序列中的CD8 T表位。此方法将肽 MHC结合、蛋白酶体C末端断裂和TAP转运效率的预测结合起来。该软件允许预测限 制于10个HLA超型的CTL表位。MHC结合和蛋白酶体断裂使用人工神经网络来进行。 TAP转运效率使用重量矩阵来预测。参考文献：Larsen MV等人，2005.Eur J Immunol 35(8)：2295-303(www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)。
(表4)列出了由20个氨基酸构成的序列，它们代表预测的被25个HLA II类等位基 因限制的CD4 T细胞表位：DR1(DRB1*0101、*0102)、DR3(DRB1*0301)、DR4、 (DRB1*0401、*0402、*0404、*0405、*0410、*0421)、DR7(DRB1*0701)、DR8(DRB1*0801、 *0802、*0804、*0806)、DR11(5)(DRB1*1101、*1104、*1106、*1107)、DR13(6)(DRB1*1305、 *1307、*1321)、DR15(2)(DRB1*1501、*1502)和DRB5*0101。使用TEPITOPE 2000(Vaccinome)进行预测。TEPITOPE是基于HLA II类肽结合的T细胞表位预测模型 且允许从大量蛋白质序列中快速鉴别混那杂的HLA II类配体和表位。参考文献：Bian H， Hammer J.Discovery of promiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes with TEPITOPE. 2004.Methods.34(4)：468-75。
表5中列出了从Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628获得的所有由20个 氨基酸构成的肽，已测定在20个PPD阳性供体中对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c 和Rv2628识别。细胞用CFSE标记，用肽、重组蛋白质或对照抗原刺激。CD4和CD8 T细胞的增殖用流式细胞仪测定且收集上清液用多重细胞因子检测法分析。
红色显示了引起多种供体中的CD4或CD8 T细胞的强烈增殖(＞75％)的肽，绿色肽 ＞50-75％增殖，而浅绿色肽＞20-50％增殖(表5)。其它TB潜伏期抗原(例如Rv0080、 Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark))期望得到类似数据。
表6中列出了Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、 Rv1735c和Rv1736c(Nark)的氨基酸序列且粗体和下划线分别显示了线性和构象的预测 的B细胞表位。使用BepiPred 1.0 Server进行预测，它使用隐马尔可夫模型(hidden Markovmodel)和倾向标度法的组合预测了线性B细胞表位的位置。仅预测了与其它可 获得结构和功能数据的已知蛋白质具有序列同源性的TB潜伏期抗原的B细胞表位构象 (例如Rv2029c(PfkB)、Rv1736c(Nark)和Rv1737c(NarK2))。(参考文献：Larsen，JEP，Lund O，Nielsen M.2006，Improved method for predicting linear B-cell epitopes(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred))。
实施例7
应答潜伏期抗原的其它细胞因子的生成
除了ELISA的IFNγ(实施例1-6)，在用重组抗原刺激PBMC第6天的上清液中测量 了一系列的其它细胞因子。TB病人(n＝10)和Mantoux阳性个体(n＝10)的PBMC用重组 蛋白质Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、HspX(Rv2031c)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、 Rv3129、ESAT-6和CFP10刺激，且结核分枝杆菌的低含氧量溶菌产物作为阳性对照(图 6)。IFNγ的CBA数据证实了ELISA的观察结果。TNFα和IL-5应答在两组中均发现没 有明显偏移。IL-2和IL-4检测到非常弱的应答；且如果有任何可检测到的应答，在TB 病人中也观察到这些应答。有趣的是，我们在Mantoux阳性者而不是TB病人中观察到 大量潜伏期抗原显著的IL-10应答(图6)。
表2：
    结核分枝杆菌DosR调节子(AL123456)     H37Rv   基因     大小(aa.)    说明     Rv0079     273    假设蛋白质     Rv0080     152    转化假设蛋白质     Rv0081     114    可能的转录调节蛋白质     Rv0569     88    转化假设蛋白质     Rv0570   nrdZ     692    可能的核糖核苷二磷酸还原酶     Rv0571c     443    转化假设蛋白质     Rv0572c     113    假设蛋白质     Rv0573c     463    转化假设蛋白质     Rv574c     380    转化假设蛋白质     Rv1733c     210    可能的转化跨膜蛋白质     Rv1734c     80    转化假设蛋白质     Rv1735c     165    假设膜蛋白     Rv1736c   narX     652    可能的硝酸盐还原酶     Rv1737c   NarK2     395    可能的硝酸/亚硝酸盐转运蛋白     Rv1738     94    转化假设蛋白质     Rv1812c     400    可能的脱氢酶     Rv1813c     143    转化假设蛋白质     Rv1996     317    转化假设蛋白质-USPA     Rv1997   ctpF     905    可能的金属阳离子转运蛋白P型三磷酸腺苷    酶A     Rv1998     258    转化假设蛋白质
    Rv2003c     285     转化假设蛋白质     Rv2004c     498     转化假设蛋白质     Rv2005c     295     转化假设蛋白质-USPA     Rv2006     otsB1     1327     可能的海藻糖-6-磷酸酯磷酸酯酶     Rv2007c     fdxA     114     可能的铁还蛋白     Rv2028c     279     转化假设蛋白质-USPA     Rv2029c     pfkB     339     可能的磷酸己糖激酶     Rv2030c     681     转化假设蛋白质     Rv2031c     acr     144     热休克蛋白质X(α-晶体蛋白同系物)     Rv2032     acg     331     转化假设蛋白质     Rv2623     TB31.7     297     转化假设蛋白质-USPA     Rv2624c     272     转化假设蛋白质-USPA     Rv2625c     393     可能的转化跨膜蛋白     Rv2626c     143     转化假设蛋白质     Rv2627c     413     转化假设蛋白质     Rv2628     120     假设蛋白质     Rv2629     374     转化假设蛋白质     Rv2630     179     假设蛋白质     Rv2631     432     转化假设蛋白质     Rv3126c     104     假设蛋白质     Rv3127     344     转化假设蛋白质     Rv3128c     337     转化假设蛋白质     Rv3129     110     转化假设蛋白质     Rv3130c     463     转化假设蛋白质     Rv3131     332     转化假设蛋白质     Rv3132c     578     两个组分传感组氨酸激酶
    Rv3133c   dosR   217   两个组分转录调节蛋白质     Rv3134c   267   转化假设蛋白质-USPA
实施例8
对暴露前(例如预防性)TB疫苗来说，它普遍应用于TB领域中，临床前的TB疫苗 研究应当包括在相关小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型中逐步筛选和检测(Brandt等人， Infect.Immun.2000；68(2)：791-795；Olsen等人，Infect.Immun.2004；72(10)：6148-50； Langermans等人，Vaccine 2005；23(21)：2740-50)，包括低剂量气溶胶感染激发模型 (Williams等人，2005，Tuberculosis(Edinb).2005；85(1-2)：29-38)。对于暴露后(例如治疗 性)TB疫苗来说，现有动物模型仅部分模拟人TB疾病(McMurray，Clin.Infect.Dis.2000； 30 Suppl 3：S210-2)且外推至人还不清楚。TB疫苗发展领域的当前想法是增强新TB疫苗 BCG诱导的免疫应答(例如McShane等人，Nat Med.2004；10(11)：1240-4；Orme Tuberculosis(Edinb).2005；85(1-2)：13-7)。但是增强免疫应答仅能在BCG首先开始应答时 奏效。
当前应用的TB疫苗是牛分枝杆菌BCG。BCG针对散布和严重形式的TB疾病保护 幼儿，但是不能保护成人中最流行和传染形式的肺TB。许多假说对BCG的这种失效进 行了解释，特别是BCG的免疫应答被暴露于环境的分枝杆菌所影响(Fine PE，1995 Lancet.346：1339-45)。本发明提供了一种更好的选择。免疫接种时BCG接触皮肤的情况 不同于结核杆菌存活时接触免疫能力活性的宿主的情况，主要在肺的免疫肉芽肿中。随 后抗原表达曲线也不同，包括相应的免疫识别曲线。我们发现BCG接种不能诱导对TB 潜伏期抗原的免疫应答：当接种BCG至健康受试者的血样(PBMC)体外检测时，与已暴 露于TB的个体(体外应答ESAT-6和CFP10呈阳性)相比观察到非常弱的对TB潜伏期抗 原的免疫应答(图10)。这种横向比较的观察结果在(HLA-A2和-DR3转基因)小鼠中的 HspX和在普通同系繁殖的BCG接种小鼠中的其它TB潜伏期抗原得到确证(图11)。
由于免疫显性的TB潜伏期抗原以人TB的部分天然免疫性为靶，且不是现有BCG 接种过程的靶，因此它们代表了治疗性TB疫苗的最有希望的候选者(注意：TB潜伏性 抗原都不在BCG中缺乏的RD抗原中)(Behr等人，1999)。BCG的体外表达曲线显示其 能够表达所有TB潜伏期抗原，除了NarX/K2。因此，尽管BCG大体上能够体外表达 TB潜伏期抗原，显然它不能遇到表达DosR调节子编码的抗原的合适的条件。本发明 提供了在体内更有效的DosR潜伏期抗原，选自由Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、 Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)组成的组，更优选选自 Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv0080，用于组合物和/或疫苗或者在重组体(BCG)分 枝杆菌中表达和/或显示。本发明还提供了这些DosR抗原中对T和B细胞的表位。
表3-1.Rv1733c中预测的超型HLA I类表位


表3-2.Rv2029c中预测的超型HLA I类表位


表3-3.Rv2627c中预测的超型HLA I类表位




表3-4.Rv2628中预测的超型HLA I类表位

表3-5.Rv0080c中预测的超型HLA I类表位


表3-6.Rv1735c中预测的超型HLA I类表位


3-7.Rv1736c(NarX)中预测的超型HLA I类表位






3-8.Rv1737c(NarK2)中预测的超型HLA I类表位




表4-1.免疫显性的TB潜伏期抗原中预测的HLA II类限制性T细胞表位


注：结果用TEPITOPE 2000生成，Vaccinome(Bian H，Hammer J.2004，Discovery ofpromiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes with  TEPITOPE.Methods，34(4)：468-75)。
表4-2.免疫显性的TB潜伏期抗原中预测的HLA II类限制性T细胞表位


注：结果用TEPITOPE 2000生成，Vaccinome(Bian H，Hammer J.2004，Discovery ofpromiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes with  TEPITOPE.Methods，34(4)：468-75)。
表5.TB潜伏期抗原的20个氨基酸肽的识别




表6.TB潜伏期抗原中预测的线性和构象B细胞表位
Rv1733c
  1  -MTATTFEFFG  ATMITFFIFI  FCFTTIFVF9  FNFIVFGTIF  IFAVVMIIAV  TVSIITTFFA
 61  -AAAGTAVQES  FSEVYAEQAQ  TFEFATATVT  IHEGVTESNT  TATSAFFFTF  ITVFAFWVVN
121  -GTEFSGEVNA  REGTFSGEFV  GTWVISAGQI  VEFFAFFAFA  TAIAAIAAIG  IWISVAAVAG
181  -AIIAITFAII  IFVFNASWQF  IIISIFCTQF
Rv2029c   (EfkE)
  1  -MTFFAAWIEG  FFFIITITMN  FAIITTTSVI  VVFFTFFMFG  GAFFYIFGGG  GINVAFIVHV
 61  -IGGCSTAIFE  AGGSTGSIIM  AIIGIAGVFF  FVIFIAASTF  ESFTVNFSFT  AFQYFFVIFG
121  -FSITVAFQFQ  CIEFIFGAAA  SAAFVVASGS  IFFGVAAIYY  QFVAIIGFFS  STFIIIITSG
181  -GGIQIISSGV  FIIFASVFEI  FFCVGSEIIT  FFFQIAAAEF  IIIFGFAFVV  VVSIGSQGAI
241  -IAIFHASFFF  SSIFMTAVSG  VGAGIAMVAA  ITVGISFGWS  IIFSVFIGNA  AGAAMIITFG
301  -TAACNFIIVF  FFFFIAAFFT  EVGQIQYVWF  FIVNFFASF
Rv2627c
  1  -MASSASEGTE  FFSAFFISFF  VISGAMGEFM  HTGIYVAQSW  FIYIGQQFIF  IFTAFFTIAI
 61  -AAQAFFIEIV  IIGIFAFFFV  SNEFVFEFIS  QEVAAGIEFY  GNFFWIEFES  GEFAQEEEIT
121  -EVAVFFVFIF  FFSFYFTFFE  SGFTFFFGEF  GSQFWISYTA  NNFFYAIIIF  HFFFFFWIVG
181  -VFGTFNGFAF  IIIAVFFAWF  IFIFIGINIV  MFVIFMFGFF  GQGIFFGAVF  FGFIVIEEVF
241  -GTAQAVWIIF  FIISWIFSQF  EESIIGINGI  SIGGYIASIV  ASIFFGIACA  IIGVFVAIII
301  -FIIGFFCGIF  EFIFFFFIVF  MAFFIGFMIS  FISITFIVFM  FGFFIYAGIA  IFIVFFFFQV
361  -TFIWFHWGFF  FTVWYFGGFT  GFFQSFFVFF  FVQAAIFQSG  IIEAFFTQFE  FSA
Rv2628
  1  -MSTQFFFFSG  IFAVGFYAWA  GFCGFIGFWG  VHQFAMMNIA  IWFFFFVQSA  IIYQVTEFSF
 61  -EGFTAFVFGE  FITSTVSGWI  SFIGTQSEIA  EFIAFAVFIG  IWFAAYAIGF  FISVETAVAV
Rv0080
  1  -MSFGSFFASF  QSAFFVVFII  FIFAMFIIAS  VEFGFVVFTF  AAIFAIFFVN  HIVVIGFV1G
 61  -FTFITAFVSV  AVFSSAEAGV  VVAYFAEEIE  FFFFTGWSVV  VTGIATFVSI  FEQVAFYQFI
121  -IFEWVNMAMI  TVVATFFFTV  TGTFIVAISF  TF
Rv1735c
  1  -MGATATTVIA  GAHIVEMAIA  FMATVTSGIV  AGASVVFWAF  GFWITFFIVA  ASTWFHVVFF
 61  -VFIFYFATIW  SVVFFIGMYG  VGAYFIGIAA  EIFIVFSTGF  FFGWVAIAVW  TTTFVAMIHH
121  -IAATTGFSGF  SSFAIGAAII  THAIICFFFF  SFIHQVFAFF  FNQFM
Rv1736c  (NarX)
  1  -VTVTFFTGSF  TFFIIAFSGF  FFTFGFTSAI  IFTVTFFGGF  EGEVFYFEFW  SFEFVVFSTE
 61  -GVNCTGSGSW  FTYVFEETTT  WFTQFTEYFS  VGFEFFEYFF  FGGFFGAAFS  WYTYSFTFVF
121  -FEYAFGVIVE  MYFFAFAFIG  EFVAAWAEIQ  AEFFFFFFYQ  FAFGKGGIVF  VSWAFATFMT
181  -AAAHVHTIST  YGFIFVAGFS  FIFAMSMVSF  AAGSFFVFII  GGVMISFYIW  YAIIFVASFQ
241  -VFGEQTEVEF  SGEWWEVVWQ  CASVIITYFN  SFQIGTAFFI  IAHIEGFAAI  IIGFTVSFIF
301  -FAEFITAATF  YVETFEIFGF  ATIYITYWTA  GITFNFGFFM  IAFAQTYFST  EVAFFFGETF
361  -EFIFVVIFFA  ATVEFEAGFF  IISGYFVFIA  AIQNAITFAA  IFYAFTVAAV  GFTGIMMGFI
421  -  FWIVVFYVIM  TTVAVGSWWF  YFYIFFGWTT  FSSGIYFSFI  IFTASFMFFF  GTIVVIVGFG
481  -  TGIVTFQSWT  QAAGISEGAY  HVQAVVIGST  AGTTTIAGVT  IITYFFFTFG  FVFMATTVNI
541  -  FVMYIVIVAA  TVAGIGATAI  GSGVVGFAYN  YFFTVSVWFF  SVWVIQFFGI  IMAFAFIYYQ
601  -  THVITGIAIF  AIWFFTFIVF  AFSAFIGYIF  FFYTIYFSFF  FIVITFFFFF  GW
Rv1737c    (NarX2)
  1  -  MFGQAANIVI  ATWTSVVNFW  AWNIIGFIST  SYAFIMSISS  AFASIIVATF  IIVGAIGFTV
 61  -  TGFITEFFGG  FAMIIAVTIA  SIIFVIAVGV  AAIMGSYAII  VFFGIFIGVA  GTTFAVGIFF
121  -  ANNWYQFAFF  GFSTGVFGMG  MVGTAISAFF  TFFFVFWFGI  FTTHATVAAA  IASTAVVAMV
181  -  VIFIAFYFFE  NAEEVIFFIB  AAAFIFVTWE  MSFIYATVFG  GFVAFSNYIF  TYTTTIYGFS
241  -  TVEAGAFTAG  FAIAAVIAFF  VGGWISIFIA  FFHVVIASIA  GTAIIAFAAA  IQEEEEVWSA
301  -  ATFTTIAVCI  GVGTGGVFAW  VAFFAFAASV  GSVTGTVAAA  GGIGGYFFFI  VMGATYEFVE
361  -  NEYTVGIIII  VATAIVAGTY  TAIHAFFFVS  EFASF
参考文献：
1.Wayne.L.G.and H.A.Sramek.1994.Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis(甲硝唑是结核分枝杆菌休眠细胞的 杀菌剂).Antimicrob.Agents Chemother.38：2054-2058.
2.Wayne.L.G.and K.Y.Lin.1982.Glyoxylate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions(在厌氧 条件下生存的结核分枝杆菌的乙醛酸代谢和适应).Infect.Immun.37：1042-1049.
3.Lillebaek，T.，A.Dirksen，E.Vynnycky，I.Baess，V.O.Thomsen，and A. B.Andersen.2003.Stability of DNA patterns and evidence of Mycobacterium tuberculosis reactivation occurring decades after the initial infection(在 感染起始后的数十年中存在的结核分枝杆菌复活的DNA图谱的稳定性和证据).
J.Infect.Dis.188：1032-1039.
4.Warren，R.M.，G.D.van der Spuy，M.Richardson，N.Beyers，M.W.Borgdorff， M.A.Behr，and P.D.van Helden.2002.Calculation of the stability of the IS6110 banding pattern in patients with persistent Mycobacterium tuberculosis disease (患有持续性结核分枝杆菌疾病的病人体内IS6110带型的计算).J.Clin.Microbiol. 40：1705-1708.
5.Fine，P.E.1995.Variation in protection by BCG：implications of and for heterologous immunity(异源免疫的启示).Lancet 346：1339-1345.
6.Turner，J.，E.R.Rhoades，M.Keen，J.T.Belisle，A.A.Frank，and I. M.Orme.2000.Effective preexposure tuberculosis vaccines fail to protect when they are given in an immunotherapeutic mode(当预暴露的结核疫苗以免疫疗法模 式给予时，有效的预暴露的结核疫苗没有保护).Infect.Immun.68：1706-1709.
7.Moreira，A.L.，L.Tsenova，M.H.Aman，L.G.Bekker，S.Freeman，B. Mangaliso，U.Schroder，J.Jagirdar，W.N.Rom，M.G.Tovey，V.H.Freedman， and G.Kaplan.2002.Mycobacterial antigens exacerbate disease manifestations in Mycobacterium tuberculosis-infected mice(结核分枝杆菌感染的小鼠体内分支 杆菌抗原使疾病表现更加恶化).Infect.Immun.70：2100-2107.
8.Repique，C.J.，A.Li，F.M.Collins，and S.L.Morris.2002.DNA immunization in a mouse model of latent tuberculosis：effect of DNA vaccination on reactivation of disease and on reinfection with a secondary challenge(在 潜伏期肺结核老鼠模型体内DNA免疫：在疾病的复发中和第二挑战的在感染中DNA疫苗 的作用).Infect.Immun.70：3318-3323.
9.Chan，J.and J.Flynn.2004.The immunological aspects of latency in tuberculosis(肺结核潜伏期的免疫特征).Clin.Immunol.110：2-12.
10.Cunningham.A.F.and C.L.Spreadbury.1998.Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension：cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog(低氧压诱导的分支杆菌静态阶段). J.Bacteriol.180：801-808.
11.Yuan，Y.，D.D.Crane，and C.E.Barry，III.1996.Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis：function of the mycobacterial alpha-crystallin homolog(结核分枝杆菌中静态阶段相关的蛋白 质的表达：分支杆菌α-晶体同源体的功能).J.Bacteriol.178：4484-4492.
12.Wilkinson，R.J.，K.A.Wilkinson，K.A.De Smet，K.Haslov，G.Pasvol， M.Singh，I.Svarcova，and J.Ivanyi.1998.Human T-and B cell reactivity to the 16kDa alpha-crystallin protein of Mycobacterium tuberculosis(人T和B细 胞对结核分枝杆菌16kDaa-晶体蛋白质的活性).Scand.J.Immunol.48：403-409.
13.Oftung，F.，E.Borka，and A.S.Mustafa.1998.Mycobacterium tuberculosis reactive T cell clones from naturally converted PPD-positive healthy subjects： recognition of the M.tuberculosis 16-kDa antigen(从天然转化的PPD-阳性健康 个体中得到的结核分枝杆菌活性的T细胞克隆：结核分枝杆菌16-kDa抗原的识别).
FEMS Immunol.Med.Microbiol.20：319-325.
14.Wayne，L.G.and L.G.Hayes.1996.An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence(通过持续的不复制的两个阶段连续研究结核分支杆菌的 变化的体外模型).Infect.Immun.64：2062-2069.
15.Sherman，D.R.，M.Voskuil，D.Schnappinger，R.Liao，M.I.Harrell， and G.K.Schoolnik.2001.Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding alpha-crystallin(结核分支杆菌低氧应答基因编码的α -晶体的调节).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98：7534-7539.
16.Rosenkrands，L，R.A.Slayden，J.Crawford，C.Aagaard，C.E.Barry， III.and P.Andersen.2002.Hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis studied by metabolic labeling and proteome analysis of cellular and extracellular proteins(通过代谢标记研究的结核分支杆菌的低氧应答和细胞内和细 胞外蛋白质的蛋白质组分析).J.Bacteriol.184：3485-3491.
17.Voskuil，M.L，D.Schnappinger，K.C.Visconti，M.I.Harrell，G.M. Dolganov，D.R.Sherman，and G.K.Schoolnik.2003.Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program(氧化 氮抑制呼吸诱导了结核分支杆菌休眠进程).J.Exp.Med.198：705-713.
18.Schnappinger，D.，S.Ehrt，M.I.Voskuil，Y.Liu，J.A.Mangan，I.M. Monahan，G.Dolganov，B.Efron，P.D.Butcher，C.Nathan，and G.K.Schoolnik. 2003.
Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages： Insights into the Phagosomal Environment(在巨噬细胞内结核分支杆菌的转录变化： 噬菌体环境的研究).J.Exp.Med.198：693-704.
19.Shi，L.，Y.J.Jung，S.Tyagi，M.L.Gennaro，and R.J.North.2003. Expression of ThI-mediated immunity in mouse lungs induces a Mycobacterium tuberculosis
transcription pattern characteristic of nonreplicating persistence(老鼠肺 中ThI-介导的免疫的表达诱导结核分支杆菌持续不复制的转录模式特征).
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100：241-246.
20.Timm，J.，F.A.Post，L.G.Bekker，G.B.Walther，H.C.Wainwright， R.Manganelli，W.T.Chan，L.Tsenova，B.Gold，I.Smith，G.Kaplan，and J.D. McKinney.2003.Differential expression of iron-，carbon-，and oxygen-responsive mycobacterial genes in the lungs of chronically infected mice and tuberculosis patients(在慢性感染的小鼠和肺结核病人的肺中铁-，碳-，和 氧应答的分支杆菌基因的不同表达).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100：14321-14326.
21.Arend，S.M.，P.Andersen，K.E.van Meijgaarden，R.L.Skjot，Y.W. Subronto，J.T.van Dissel，and T.H.Ottenhoff.2000.Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10(由对早期分泌的抗原目标6-kDa蛋 白质和培养基滤液蛋白质10有应答的T细胞检测活性肺结核感染).J.Infect.Dis. 18l：1850-1854.
22.Arend，S.M.，A.Geluk，K.E.van Meijgaarden，J.T.van Dissel，M.Theisen， P.Andersen，and T.H.Ottenhoff.2000.Antigenic equivalence of human T-cell responses to Mycobacterium tuberculosis-specific RDl-encoded protein antigens ESAT-6 and culture filtrate protein 10 and to mixtures of synthetic peptides (人T细胞对结核分支杆菌特异的RDl编码的蛋白质抗原ESAT-6和培养基滤液蛋白质 10的免疫应答和对合成肽的混合物的免疫应答的抗原等价).Infect.Immun.68：3314- 3321.
23.Franken，K.L.，H.S.Hiemstra，K.E.van Meijgaarden，Y.Subronto，J. den Hartigh，T.H.Ottenhoff，and J.W.Drijfhout.2000.Purification of his-tagged proteins by immobilized chelate affinity chromatography：the benefits from the use of organic solvent(由固定化螯合亲和层析纯化的组胺标记 的蛋白质).Protein Expr.Purif.18：95-99.
24.Ottenhoff，T.H.，D.G.Elfermk，J.Hermans，and R.R.de Vries.1985. HLA class II restriction repertoire of antigen-specific T cells.I.The main restriction determinants for antigen presentation are associated with HLA-D/DR and not with DP and DQ(抗原特异的T细胞的HLAII类限制抗体库。I抗原呈递所用 的主要限制决定物与HLA-D/DR有关而与DP和DQ无关).Humlmmunol.13：105-116.
25.Voskuil，M.L，K.C.Visconti，and G.K.Schoolnik.2004.Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy(在适应静态阶段和低氧休眠期间的结核分支杆菌基因的表达). Tuberculosis.(Edinb.)84：218-227.
26.Florczyk，M.A.，L.A.McCue，A.Purkayastha，E.Currenti，M.J.Wolin， and K.A.McDonough.2003.A family of acr-coregulated Mycobacterium tuberculosis genes shares a common DNA motif and requires Rv3133c(dosR or devR) for expression(acr-共调节的结核分支杆菌基因家族共享共同的DNA部分并且表达需 要Rv3133c(dosR or devR)).Infect.Immun.71：5332-5343.
27.Park，H.D.，K.M.Guinn，M.I.Harrell，R.Liao，M.I.Voskuil，M.Tompa， G.K.Schoolnik，and D.R.Sherman.2003.Rv3133c/dosR is a transcription factor that
mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis(Rv3133c/dosR 是介导结核分支杆菌低氧应答的转录因子).Mol.Microbiol.48：833-843.
28.Malhotra，V.，D.Sharma，V.D.Ramanathan，H.Shakila，D.K.Saini，S. Chakravorty，T.K.Das，Q.Li，R.F.Silver，P.R.Narayanan，and J.S.Tyagi. 2004.Disruption of response regulator gene，devR，leads to attenuation in virulence of Mycobacterium tuberculosis(破坏应答调节子基因，devR，导致结核 分支杆菌的毒性衰减).FEMS Microbiol.Lett.231：237-245.
29.Yuan，Y.，D.D.Crane，R.M.Simpson，Y.Q.Zhu，M.J.Hickey，D.R. Sherman，and C.E.Barry，III.1998.The 16-kDa alpha-crystallin(Acr)protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages(在巨噬 细胞中生长所需的结核分支杆菌的16-kDaα-晶体(Acr)蛋白质).
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：9578-9583.
30.Monahan，I.M.，J.Betts，D.K.Banerjee，and P.D.Butcher.2001. Differential expression of mycobacterial proteins following phagocytosis by macrophages.Microbiology 147：459-471.
31.Florczyk，M.A.，L.A.McCue，R.F.Stack，C.R.Hauer，and K.A.McDonough. 2001.Identification and characterization of mycobacterial proteins differentially expressed under standing and shaking culture conditions， including Rv2623 from a novel class of putative ATP-binding proteins(在静 止和振荡培养条件下不同表达的分支杆菌蛋白质的鉴定和鉴别，包括从新类别的假设 ATP-结合蛋白质中得到的Rv2623).Infect.Immun.69：5777-5785.
32.Boon，C，R.Li，R.Qi，and T.Dick.2001.Proteins of Mycobacterium bovis BCG induced in the Wayne dormancy model(在韦恩休眠模型中诱导的牛分支杆菌BCG 的蛋白质).J.Bacteriol.183：2672-2676.
33.Boon.C.and T.Dick.2002.Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy(低氧休眠所需的牛分支杆菌BCG应答调节子). J.Bacteriol.184：6760-6767.
34.Ottenhoff，T.H.，F.A.Verreck，E.G.Lichtenauer-Kaligis，M.A.Hoeve， O.
Sanal，and J.T.van Dissel.2002.Genetics，cytokines and human infectious disease：lessons from weakly pathogenic mycobacteria and salmonellae(遗传， 细胞因子和人感染疾病：由弱致病分支杆菌和沙门氏菌得到的经验).Nat.Genet. 32：97-105.35.Flynn，J.L.，J.Chan，K.J.Triebold，D.K.Dalton，T.A.Stewart， and B.R.
Bloom.1993.An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection(γ干扰素在抵御结核分支杆菌感染中的基本 作用).J.Exp.Med.178：2249-2254.
36.Mayuri，G.Bagchi，T.K.Das，and J.S.Tyagi.2002.Molecular analysis of the dormancy response in Mycobacterium smegmatis：expression analysis of genes encoding the DevR-DevS two-component system，Rv3134c and chaperone alpha- crystallin homologues(耻垢分枝杆菌中休眠应答的分子分析：编码DevR-DevS双组 分系统的基因的表达分析).FEMS Microbiol.Lett.211：231-237.
37.Behr，M.A.，M.A.Wilson，W.P.Gill，H.Salamon，G.K.Schoolnik，S. Rane.and P.M.Small.1999.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray(全基因组DNA的微排列的BCG疫苗的比较基因组学).Science 284：1520-1523.
38.Colditz，G.A.，T.F.Brewer，C.S.Berkey，M.E.Wilson，E.Burdick， H.V.Fineberg.and F.Mosteller.1994.Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis(BCG疫苗预防肺结核的效率).Meta-analysis of the published literature.JAMA 271：698-702.
39.Brandt，L.，C.J.Feino，O.A.Weinreich，B.Chilima，P.Hirsch，R. Appelberg.and P.Andersen.2002.Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine： some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis(牛分支杆菌BCG疫苗的失效： 环境中的分支杆菌中的一些种属阻碍BCG的增殖和对肺结核的保护性免疫的诱导). Infect.Immun.70：672-678.
40.Vekemans，J.，M.O.Ota，J.Sillah，K.Fielding，M.R.Alderson，Y.A. Skeiky，W.Dalemans，K.P.McAdam，C.Lienhardt，and A.Marchant.2004.Immune responses to mycobacterial antigens in the Gambian population：implications for vaccines and immunodiagnostic test design(冈比亚人群对分支杆菌抗原的免疫应 答).Infect.Immun.72：381-388.
41.Ravn，P.，H.Boesen，B.K.Pedersen，and P.Andersen.1997.Human T cell responses induced by vaccination with Mycobacterium boyis bacillus Calmette-Guerin(牛分支杆菌卡介苗接种诱导的人的T细胞应答).J.Immunol. 158：1949-1955.
42.Lim，A.，M.Eleuterio，B.Hutter，B.Murugasu-Oei，and T.Dick.1999. Oxygen depletion-induced dormancy in Mycobacterium bovis BCG(牛分支杆菌BCG 中氧消耗诱导的休眠).J.Bacteriol.181：2252-2256.
43.Parker，K.C，M.A.Bednarek，and J.E.Coligan.1994.Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains(基于每个肽的支链的独立结合对潜在的HLA-A2结合肽分级的 方案).J.Immunol.152：163.HLA BIND
(http://bimas.cit.nih.gov/mo lbio/hla_bind/)
44.Rammensee，Friede，Stevanovic，MHC ligands and peptide motifs：lst listing(MHC配体和肽部分：第1序列)，Immunogenetics 41，178-228，1995；SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/)and Rammensee，Bachmann，Stevanovic：MHC ligands and peptide motifs.Landes Bioscience 1997(International distributor-except North America：Springer Verlag GmbH&Co.KG，Tiergartenstr.17，D-6912l Heidelberg
45.Buus S，Lauemoller SL，Worning P，Kesmir C，Frimurer T，Corbet S，Fomsgaard A，Hilden J，Holm A，Brunak S.Sensitive quantitative predictions of peptide-MHC binding by a’Query by Committee’artificial neural network approach，in Tissue Antigens(由委员会选择算法人工中枢网络方法灵敏定量预测在组织抗原中肽-MHC 结合).，62：378-84，2003；NetMHC(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)
46.Nielsen M，Lundegaard C，Worning P，Lauemoller SL，Lamberth K，Buus S， Brunak S，Lund O.，Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations(使用新的序列法的中枢网络可靠预测T细胞 表位).Protein ScL，12：1007-17，2003.
47.Improved prediction of MHC class I and class II epitopes using a novel Gibbs sampling approach(使用新的Gibbs取样方法提高MHC I类和II类表位的预测)， Nielsen M，Lundegaard C，Worning P，Hvid CS，Lamberth K，Buus S，Brunak S，Lund O.，Bio informatics，20(9)：1388-97，2004.
48.Sturniolo，T.等，Nature Biotechnology 17，555-562，1999，Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA chips and virtual HLA class II matrices(使用DNA芯片和有效的HLA II类产生组织特异的和 混杂的HLA配体数据库)；TEPITOPE(http://www.vaccinome.com/pages/597444/)。