非洲猪瘟病毒检测方法
阅读：169发布：2020-05-11
专利汇可以提供非洲猪瘟病毒检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种检测非洲 猪瘟 病毒的方法。此外，本发明并涉及用于检测非洲 猪瘟病毒 的寡核苷酸对。，下面是非洲猪瘟病毒检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于侦测非洲猪瘟病毒的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:
11、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:19。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第1162至第1206个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
4.权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第454至第503个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
6.如权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:5，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第454至第583个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:8。
8.如权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第403至第442个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
9.如权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:12，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:
12，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第403至第453个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
10.如权利要求8或9所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:
14所示。
11.如权利要求1所述的寡核苷酸对，其中所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:19，且进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒的p72基因序列的第156至第189个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。
12.如权利要求11所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:20所示。
非洲猪瘟病毒检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 猪是全球最重要的经济动物之一。根据美国农业部统计，2018年全球主要养猪国的猪肉总产量达113,081千吨。猪肉的经济价值已超过千亿美金。然而，密集养殖加上管理不良可能造成猪只容易感染疾病且疫情迅速扩散。以2018年中国爆发的非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)为例，病猪死亡率几乎为100％，已经造成了巨大的经济损失。由此可见，在饲养场密集监控猪只疾病对管理而言是不可或缺的一环。本发明即提供了快速、方便的非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法以供产业利用。
发明内容
[0003] 在一方面，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法，包含提供一可能含有一非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；通过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(convective polymerase chain reaction,cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
[0004] 在某些实施方案中，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自包含以下的群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:
13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:
17与SEQ ID NO:19。
13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:
17与SEQ ID NO:19。
[0005] 在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述萤光抑制分子大体上抑制所述萤光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述萤光分子大体上未被抑制。
[0006] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第1162至第1206个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第454至第503个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0008] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第454至第583个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:8。
[0009] 在某些实施方案中，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自包含以下的群组：SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第403至第442个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:14所示。
[0010] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列选自包含以下的群组：SEQ ID NO:9以及SEQ ID NO:10，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:12所示。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第403至第453个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:14所示。
[0011] 在某些实施方案中，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自包含以下的群组：SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:19。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其序列为一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第156至第189个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:20所示。
[0012] 在一方面，本发明涉及一种用于侦测非洲猪瘟病毒(ASFV)的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物。
[0013] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第1162至第1206个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0014] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第454至第503个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第454至第583个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列选自由下列所组成的群组：SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:8。
[0016] 在某些实施方案中，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自包含以下的群组：SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，以及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:13。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第403至第442个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:14所示。
[0017] 在某些实施方案中，所述第一引物的序列选自包含以下的群组：SEQ ID NO:9以及SEQ ID NO:10，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:12所示。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第403至第453个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:14所示。
[0018] 在某些实施方案中，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自包含以下的群组：SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:19。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72完整基因序列(GenBank accession No.MH713612)的第156至第189个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子。在某些优选实施方案中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:20所示。
[0021] 图1所示为使用引物ASFV-F1与ASFV-R1以及探针ASFV-P1进行即时PCR(real-time PCR)检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的结果。
[0022] 图2所示为使用引物ASFV-F2与ASFV-R2以及探针ASFV-P2进行即时PCR(real-time PCR)检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的结果。
具体实施方式
[0023] 在一方面，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法。在某些实施方案中，所述方法为聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)。在某些实施方案中，所述方法为反转录聚合酶链锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。在某些实施方案中，所述方法为热对流聚合酶链锁反应(convective polymerase chain reaction,cPCR)。在某些实施方案中，所述方法为即时聚合酶链锁反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)。
[0024] 在一方面，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法，包含:
[0025] 提供一可能含有一非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列的样本；
[0026] 提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端；
[0027] 提供一聚合酶；
[0028] 在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
[0029] 通过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及
[0030] 侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
[0031] 在另一方面，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法，包含:
[0032] 提供一可能含有一非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列的样本；
[0033] 提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述非洲猪瘟病毒(ASFV)的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5'端；
[0034] 提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加在所述寡核苷酸探针上的一第一位置的萤光分子，以及一附加在所述寡核苷酸探针上的一第二位置的萤光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述萤光抑制分子大体上抑制所述萤光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述萤光分子大体上未被抑制；
[0035] 提供一聚合酶；
[0036] 在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述寡核苷酸探针、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
[0037] 通过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及
[0038] 侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
[0039] 在又一方面，本发明涉及一种用于侦测非洲猪瘟病毒(ASFV)的寡核苷酸对。
[0040] 在再一方面，本发明涉及一种用于侦测非洲猪瘟病毒(ASFV)的寡核苷酸对与寡核苷酸探针
[0041] 应当进一步理解的是，在某些实施方案中，本文揭露的寡核苷酸对及/或寡核苷酸探针可用于各种基础PCR技术之变异，例如，但不限于，反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)、热对流聚合酶链锁反应(cPCR)、即时聚合酶链锁反应(real-time PCR)、巢式聚合酶链锁反应(nested PCR)，以及热不对称性交错聚合酶链锁反应(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)。
[0042] 如本文所用，术语「热对流聚合酶链锁反应(cPCR)」是指一种聚合酶链锁反应，其中，将一装有一PCR样品的管状容器底部嵌入一稳定热源中，并控制所述PCR的参数，包括所述PCR样品的总体积、黏度、表面温度，以及所述管状容器的内径，使得所述PCR样品的底部到顶部的温度梯度下降，诱导热对流并且使得PCR样品的变性、黏合、聚合在所述管状容器的不同区域中依序且重复发生。热对流聚合酶链锁反应(cPCR)的详细描述请参见如美国专利号8,187,813，其以引用的方式将其整体并入本文。
[0043] 如本文所用，术语「萤光分子」意指一物质或其一部份，其系能够在可侦测的范围内显示萤光。如本文所用，术语「萤光抑制分子」意指一物质或其一部份，其系能够抑制当由一光源激发时由所述萤光分子所发射的萤光。在某些实施方案中，术语「萤光分子」与「萤光抑制分子」为TaqManTM分析套组(Applied Biosystems Inc.，加州，美国)的萤光分子与萤光抑制分子。TaqManTM分析套组的详细描述请参见如，Holland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA(1991)88:7276-7280；美国专利号5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式将其整体并入本文。
[0044] 所述萤光分子的例子包括，但不限于，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine,CYA)、6-羧基萤光素(6-carboxyfluorescein,FAM)、5,6-羧基罗丹明-L LO(5,6-carboxyrhodamine-l lO,R110)、6羧基罗丹明-6G(6-carboxyrhodamine-6G,R6G)、N',N',N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(N',N',N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine,TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)、2',4',5',7'-四氯4-7-二氯萤光素(2',4',5',7'-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein,TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基罗丹明(2',7-dimethoxy-4',5'-6carboxyrhodamine,JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(6-carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorofluorescein,HEX)、ALEXA萤光、Cy3萤光与Cy5萤光。所述萤光抑制分子的例子包括，但不限于，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4'-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid,Dabcyl)、黑洞萤光抑制剂1(Black Hole Quencher 1,BHQ1)、黑洞萤光抑制剂2(Black Hole Quencher 2,BHQ2)、黑洞萤光抑制剂3(Black Hole Quencher 3,BHQ3)、二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(dihydro cyclo pyrrolo indole tripeptide minor groove binder,MGB)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,TAMRA)。在某些实施方案中，所述萤光分子为6-羧基萤光素(FAM)，且所述萤光抑制分子为二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(MGB)。在某些实施方案中，所述萤光分子为6-羧基萤光素(FAM)，且所述萤光抑制分子为黑洞萤光抑制剂1(BHQ1)或四甲基罗丹明(TAMRA)。
[0045] 除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述之用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。
[0046] 本发明进一步通过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此通过引用的方式明确地并入本案中。
[0047] 实施例
[0048] 实施例1以传统聚合酶链锁反应检测非洲猪瘟病毒(ASFV)
[0049] 非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因(GenBank accession No.MH713612)全长序列被插入一克隆载体中，所述克隆载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pASFV质粒。
[0050] 进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pASFV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,
1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
[0051] 传统PCR的结果如表1所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的存在。
[0052] 表1各引物对进行传统PCR的结果
[0053]
[0054]
[0055] 实施例2以热对流聚合酶链锁反应(cPCR)检测非洲猪瘟病毒(ASFV)
[0056] 进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)所用的50μl PCR混合物含有：带有非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因全长序列的质粒(pASFV质粒，同实施例1)(分别为102,103,104,105,106拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5'端接合一萤光分子6-羧基萤光素(FAM)，且各探针序列的3'端接合一萤光抑制分子黑洞萤光抑制剂1(BHQ1)或四甲基罗丹明(TAMRA))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置在一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM萤光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
[0057] 敏感度测试的结果如表2所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数的pASFV质粒，其敏感度可达102拷贝数。
[0058] 表2各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
[0059]
[0060]
[0061]
[0062] 此外，以不同的猪病原菌基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表3所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有非洲猪瘟病毒(ASFV)的样品，而侦测不到含有典型猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、猪繁殖与呼吸道症候群病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、A型猪流感病毒(Swine influenza A virus,SIV)、猪流行性下痢病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪环状病毒第二型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
[0063] 表3各引物对与探针组合的专一性测试结果
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] “+”表示在所述样本中侦测到萤光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到萤光讯号。
[0068] 实施例3以实时定量聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)检测非洲猪瘟病毒(ASFV)
[0069] 以稀释的pASFV质粒(分别为100,101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)在一实时定量PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时定量PCR分析。以含有2μl pASFV质粒、0.01-2μM正向引物ASFV-F1(SEQ ID NO:1)、0.01-2μM反向引物ASFV-R1(SEQ ID NO:2)、0.01-2μM探针ASFV-P1(5'FAM-CACAAGCCGCACCAAAGCAAACCT-BHQ1 3',SEQ ID NO:3)总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时定量PCR分析。实时定量PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录萤光测量的结果。
[0070] 如图1所示，计算连续稀释(10倍)的pASFV质粒的实时定量PCR分析的标准曲线。1个拷贝数的pASFV质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.99812，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时定量PCR，并产生可信的结果。
[0071] 此外，以另一组引物对及探针进行实时定量PCR分析。以含有2μl pASFV质粒(分别为100,101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)、0.01-2μM正向引物ASFV-F2(SEQ ID NO:4)、0.01-2μM反向引物ASFV-R2(SEQ ID NO:5)、0.01-2μM探针ASFV-P2(5'FAM-TCCTCATCAACACCGAGATTGGCACA-BHQ1 3',SEQ ID NO:6)总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时定量PCR分析。实时定量PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及
60℃30分钟。在60℃的步骤中记录萤光测量的结果。
60℃30分钟。在60℃的步骤中记录萤光测量的结果。
[0072] 如图2所示，计算连续稀释(10倍)的pASFV质粒的实时定量PCR分析的标准曲线。至少10个拷贝数的pASFV质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.9998，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时定量PCR，并产生可信的结果。
[0073] 由实施例1-3结果表明，本发明的引物对与探针可用于不同的聚合酶链锁反应，包括传统PCR、cPCR、qPCR等，以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
[0074] 上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
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