所属技术领域

本发明所涉及的猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及其生产方法，属兽用生物制 品领域。

本发明的技术背景

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus，CSFV) 引起的猪的高度致死性、接触性传染病，其特征是小血管壁的变性、导致内脏器官中的多 发性出血、坏死和梗死。目前CSF遍布全世界，根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》(2004) 中，CSF被列为必须报告的法定传染病之一，在我国属于四大动物疫病之一，经济损失严 重。目前临床上CSF在流行特点、临床表现和病理变化等方面表现出非典型性的特征，因 此对其诊断带来困难，必须依赖实验室诊断才能确诊。由于CSFV在细胞内繁殖滴度较低， 并且不产生肉眼可见的病变，对该病原的进一步研究尤其是诊断技术的研究带来了难度， 致使目前CSF的诊断技术研究依然存在许多问题，各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度 较低、非特异性反应较严重等诸多问题。

目前常见的CSF病原诊断技术分传统诊断方法和诊断新技术，传统诊断方法主要有猪 瘟免疫荧光技术(HCFA)、琼脂糖扩散法、兔体交互免疫试验和实验动物法等；诊断新技 术有RT-PCR技术和ELISA抗原捕获法等等。免疫荧光技术：又可分为直接免疫荧光和间 接免疫荧光，应用荧光标记的一抗或二抗对组织切片进行染色观察，以检测是否有CSFV 感染。免疫荧光法是目前检测CSF病原的法定方法，但该法需要较昂贵的显微镜和有经验 的试验人员，HCFA技术经验性较强，在制片特别是组织切片过程中难度大，耗时长；组织 抹片的制作也可能由于选定的样品为非病灶区而漏检；细胞飞片受多种因素影响如：细胞 状况好坏、花费时间长，且采用细胞HCFA技术通常会在边缘部分出现非特异性荧光而造 成错检。琼脂糖扩散试验：该法虽操作简单，但敏感性低。实验动物法：用敏感仔猪进行 接种试验或用兔体交互免疫试验进行病原的鉴定，此法可用来鉴别疫苗毒和野毒感染，但 该法需在有条件的实验室进行，而且费时。ELISA抗原捕获法：利用双抗夹心法或竞争法 捕获CSFV于酶标板上，然后利用辣根过氧化物酶标记的二抗进行显色，根据吸光值的高 低来判断有无CSFV，目前这种试剂盒主要靠进口，价格昂贵，而且敏感度较低，不利于普 及。RT-PCR技术：随着分子生物学的发展，越来越多的学者应用RT-PCR和nested-PCR对 CSFV进行了成功扩增。虽然该法具有操作简便，快速，特异性强等优点，但在病毒含量较 低或在RNA提取过程中造成RNA降解等情况下，会出现假阴性结果；此外需要经过反转录、 二次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，耗时太长而不利于实验室快速检测。

由于上述各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、非特异性反应较严重等诸多问 题。因此开发猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断技术对于猪瘟病原的定量检测具有十分重要 的意义。

本发明的目的是将荧光定量PCR技术与ABI定量检测系统相结合，建立CSFV实时 荧光RT-PCR快速检测技术，从而制备用于CSFV快速检测的试剂盒。

本发明的主要技术原理

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction， RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术是通过始 点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量 两种方式实现定量检测。

实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术包括探针类和染料类两种。探针类是利用与靶序列 特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqManTM技术为代表，常用的荧光基团是FAM， TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与 双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是 SYBR GreenI染料。

实时荧光PCR技术常用TaqManTM技术，由美国Perkin Elmer公司研制，它在一条20 多bp的寡核苷酸探针(Probe)的两端分别标记上荧光发射基团(R)和淬灭基团(Q)，在 PCR反应中设立标准模板系列对照反应管和阴性对照管，在PCR扩增的退火或延伸步骤中 检测荧光信号的变化，得出实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的动力学曲线图。探针完整时，发 射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的-5’外切酶活性将探针酶 切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离(见附图1)，从而荧光监测系统可接收到荧 光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。计算样品的Ct值，Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈 值的PCR反应循环数；阈值是由所选定作为基线的各个循环数的ΔRn值的平均数加上其标 准差所得的数值决定。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期， 此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间 不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。根据Ct值与初始模板浓度的对数呈线性关系，利 用标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线(见附图2)。利用各样品的Ct值，就可以确定样 品的起初模板量。

本发明的详细描述

1.对照品

阳性对照：采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆片段体外逆转录获得，浓度为 (0.126～0.368μg)。

阳性参照品毒株：猪瘟病毒GDGZ1/95株、HeBHH1/95、BJCY1/96株和JL1/94株病毒 由本实验室鉴定和保存，在PK15细胞上传代，灭活后备用。

阴性对照：采用无特异性病原(SPF)猪各组织，按1∶5倍体积加入PBS液，于研钵 或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中备用。

2.试剂

Trizol(200ml/瓶)购自Invitrogen公司；StrataScript(每支10000U，50U/μl)反转 录酶购自Merck公司。

Taq DNA聚合酶(2U/μl，每支1000U)、dNTP Mix(10mM each)和RNase Inhibitor 购自北京鼎国生物技术有限责任公司和Promega公司。

3.荧光探针和引物的设计和筛选

根据GenBank上下载的29条国内外已测得的CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病 病毒-I(BVDV-I)和6条牛病毒性腹泻病病毒-II(BVDV-II)基因组全序列进行综合排列、 比较，同时为保证CSFV荧光探针的特异性，避开与牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)同源部分， 找出了5个CSFV保守的区域，在这5个保守区设计了5组TaqManTM探针和引物，分别记作 T1(J1、J2)；T2(J3、J4)；T3(5、J6)；T4(J7、J8)；T5(J9、J10)，并由上海基康生 物技术有限公司合成。所有荧光RT-PCR反应中都以SPF猪组织和去离子水作为阴性对照。

分别提取CSFV SM株、猪瘟兔化弱毒疫苗细胞毒(HCLV)和经鉴定的分离株GDZ1/95 株、HeBHH1/95、BJCY1/96株、JL1/94株的血毒样品总RNA进行RQ-PCR，除T1(J1、J2) 无论在高浓度和低浓度的模板中Ct值均较低外，其它4对引物和探针的灵敏度均会受到模 板量影响；对于同种样品相同RNA模板浓度的重复反应，T1(J1、J2)的反应Ct值也最为 稳定；而对于不同类型的RNA模板，T1(J1、J2)的反应Ct值也都为最低。即T1(J1、J2) 在不同的模板环境中的灵敏度最高，所以选用T1(J1、J2)作为本试验的探针和引物。

                         表1  5对探针和引物在不同样品中荧光RT-PCR的CT值   CT值                                     CSFV模板   HCLV   SM   GDZ1/95   HeBHH1/95   BJCY1/96   JL1/94   T1(J1、J2)   T2(J3、J4)   T3(J5、J6)   T4(J7、J8)   T5(J9、J10)   17.30   28.21   21.17   22.45   27.89   11.41   27.15   18.43   22.14   25.38   7.56   17.32   11.26   13.46   14.76   23.65   --   29.80   29.86   --   6.68   17.92   7.86   15.21   17.80   7.37   19.56   9.92   15.14   18.22

经筛选的引物和探针序列：

J1：5’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’

J2：5’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’

T1：5’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，探针由5’-FAM和3’-TAMRA修饰。

4.荧光RT-PCR反应体系的建立

以CSFV SM株和HCLV株作为模板进行荧光RT-PCR，经过对StrataScript反转录酶、上下游 引物、探针和反应体系的逐步优化。最终选用的反应体系为StrataScript反转录酶0.3μl、 10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1(10μm)2.5μl、J2(10μm)2.5μl、T1(5μm)1.5μl、 Taq DNA聚合酶1μl、RNase Inhibitor 1μl、加入0.02～0.06μg CSFV SM株RNA模板，补 ddH2O到50μl。反应条件42℃20min；92℃ 3min；92℃ 15s，60℃ 1min，40cycles。

5.特异性和敏感性研究

采用上述优化的荧光RT-PCR反应体系对牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)OregonC24V株、 NADL株和牦牛株、猪伪狂犬病毒(PRV)Fa株、猪细小病毒(PPV)和猪繁殖和呼吸综合征 病毒(PRRSV)BJ株进行特异性试验，上述6种其它病毒的检出率重复3次均为零，采用上 述优化的荧光RT-PCR反应体系对野外分离的扁桃体CSF阳性样品(HCFA)10份，阴性样品 15份进行符合率试验，同时用水为空白对照，结果HCFA与荧光RT-PCR两者的符合率为83％， 荧光RT-PCR较HCFA方法敏感。

将提取的HCLV RNA模板2μl(约2.25×109拷贝/2μl)进行100～109倍梯度稀释，每个 稀释度设立3个重复，同时进行荧光RT-PCR和常规Nest-PCR检测。

             表2  各稀释度模板的荧光RT-PCR CT值和常规Nest-PCR阳性检出情况   CT值                                                      模板稀释度   100   10-1   10-2   10-3   10-4   10i-5   10-6   10-7   10-8   10-9   荧光RT-PCR       Nest-PCR   6.1   6     +   9.47       +   12.8   7     +   15.9   0     +   18.6   3     +   21.9   8     +   25.1   9     -   28.7   6     -   29.9   5     -   29.8   6     -

由CT值可知100～10-7间的CT值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间 的CT值相差约3.3，与理论上计算的模板浓度相差10倍Ct值相差3.3相符，且10-7后模板拷 贝数对数与CT值已不成线性关系，可见荧光RT-PCR可以检测出109倍稀释模板量即102的拷 贝数；而由电泳结果显示常规Nest-PCR能检测出105倍稀释模板量，即104的拷贝数，由此 荧光RT-PCR比常规Nest-PCR的灵敏度高出100倍。

试剂盒生产组装及应用

1.试剂盒生产组装

1.1对照品及水

阳性和弱阳性对照：采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆片段体外逆转录获得特异 RNA，强阳性对照含量为(0.126～0.368μg/10μl)和弱阳性对照含量为(0.013～0.037μg /10μl)，300μl/管分装，各2管，-20℃冻存备用。

阴性对照：采用SPF猪各组织，按1∶5倍体积加入0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)水，于 研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中，分 装成1200μl/管，共10管，-20℃冻存备用。

0.1％DEPC水(以下简称DEPC水)：在去离子水中加入0.1％DEPC，37℃1小时处理， 或室温过夜处理。15磅高压20分钟，20ml/瓶。

1.2试剂

Trizol裂解液：25ml/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用。 RT-PCR反应液：按本发明设计的引物J1：5’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’和 J2：5’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’，由上海基康生物技术有限公司合成。每个反 应包括10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1 2.5μl、J2 2.5μl，共11.0μl。50个反应共 计550μl，分装成2管(275μl/管)。

反应酶：每个反应包括StrataScript反转录酶0.3μl、Taq DNA聚合酶1.0μl，共1.3μl。 50个反应共计65μl，分装成1管。

探针溶液：按本发明所设计的探针

T1：5’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，探针由5’-FAM和3’-TAMRA修饰， 是上海基康生物技术有限公司合成，用0.1％DEPC水稀释成5μM，每个反应需1.5μl。50个 反应共计75μl，分装成1管，-20℃冻存备用。

2.试剂盒组装(以50头份计)

取上述阳性对照和弱阳性对照各2管，阴性对照10管，RT-PCR反应液2管、反应酶1管、 探针溶液1管、Trizol 1瓶，DEPC水1瓶，正放于试剂盒中；8联PCR反应管及管盖7排。

3.试剂盒的应用

3.1样品制备

3.1.1血液样品

每个反应取200μl全血提取RNA。

3.1.2组织脏器

取待检样品50～100mg于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加1ml DEPC水混匀， 4℃，3000r/min离心15min，取200μl上清液(/反应)转入无菌的1.5ml Eppendorf管中， 编号备用。

3.1.3细胞培养物

每个反应取200μl细胞培养物提取RNA。

3.2样本存放

制备的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应 避免反复冻融(冻融不超过3次)。

3.3样本的处理

在样本制备区进行。

1)取n个灭菌的1.5ml Eppendorf管，其中n为被检样品数×重复数与阴性对照的和(阳 性对照、弱阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)。

2)每管加入500μl Trizol，分别加入被检样品、阴性对照各200μl，一份样品换一个吸 头，充分混匀，静置5min；再加入200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈， 以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。

3)取与步骤1)相同数量灭菌的1.5ml Eppendorf管，加入500μl异丙醇(4℃预冷)， 做标记。取上清约400μl(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，4℃静置 20min。

4)于4℃、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)， 小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600μl 75％乙醇，颠倒洗涤。

5)4℃、12000g离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去 上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。

5)6)4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁 上的残余液体甩到管底部，用微量加样器小心地将其吸干，一种样品换用一个吸头，吸头 不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。

6)7)加入3μl DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA须 在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。

3.4扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。

从试剂盒中取出猪瘟病毒荧光RT-PCR反应液、反应酶和探针溶液，在室温下融化后， 2000r/min离心5s。设PCR反应数为n，其中n为待检样品数×重复数+强阳性管数+弱阳 性管数+阴性管数，每个样本测试反应体系配制见下表。

     表1  每个样品反应体系配制表   试剂   用量   RT-PCR反应液   11.0μl   反应酶   1.3μl   探针溶液   1.5μl

3.5加样

在样本处理区进行。

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤3.3中制备的36.2μl RNA溶 液，盖紧管盖。

阳性对照和弱阳性对照管中分别加入10μl阳性对照和弱阳性对照，补水至50μl。

3.6荧光RT-PCR检测

在检测区进行。

将上述PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

循环条件设置：

第一阶段，反转录42℃/20min；

第二阶段，预变性92℃/3min；

第三阶段，92℃/15s，60℃/1min，40个循环。

试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

3.7结果判定

3.7.1结果分析条件设定

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正 常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

3.7.2质控标准

1)阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

2)阳性对照的Ct值应在15.0左右、弱阳性对照Ct值应在25.0左右并出现典型的扩 增曲线。否则，此次实验视为无效。

3.7.3结果描述及判定

1)阴性：无Ct值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟病毒。

2)阳性：Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟病毒。

3)有效原则：Ct＞35且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现Ct值和典 型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

五、附图说明

图1实时荧光定量技术的原理

图2标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线

图3本发明的技术路线

图4各模板稀释度Nest-PCR反应产物电泳图

图5经筛选的引物(J1、J2)和探针(T1)序列

六、本发明的优点

根据由GenBank下载的29条CSFV全长序列、牛病毒性腹泻病毒-I(BVDV-I)和 牛病毒性腹泻病毒-II(BVDV-II)全序列进行综合排列、比较，同时为保证猪瘟荧光探针 的特异性，避开与BVDV同源部分，设计了5组CSFV的特异性探针和引物。通过对5组 探针和引物的筛选，反转录酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了实 时荧光RT-PCR检测CSFV的试验方法。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术(HCFA) 方法符合率为83％，且比HCFA方法更敏感，较常规Nest-PCR方法敏感100倍；在其它病 原体的特异性试验中，其它病原的检出率均为零，说明该方法具有很强的CSFV特异性； 与常规Nest-PCR相比，从反应时间和试验成本等方面都体现了荧光RT-PCR检测CSFV的 优越性，建立了特异、灵敏、快速的CSFV实验室诊断方法。

本发明的优点，可以归纳为：1)特异性好：Taqman定量技术通过杂交对定量分子进行 甄别，具有很高的准确性，同时靶序列由特异引物和探针双重控制，特异性好，假阳性低； 2)灵敏度高：反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很灵敏的 检测能力；3)线性关系好：由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过 荧光信号的检测可以直接对样品初始模板浓度进行定量；4)操作简单：自动化程度高， Taqman技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，对环境污染 机会少；5)没有后处理过程：不用杂交、电泳、拍照等过程。