猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途
专利汇可以提供猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 猪瘟 病毒单克隆 抗体 HK24及医用用途，可用于制备诊断或检测 猪瘟病毒 试剂 ；也可用于制备 预防 治疗 猪瘟 生物 制剂；对于减少猪瘟病毒给养猪业造成的经济损失具有重要意义。，下面是猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途专利的具体信息内容。
1.一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24，包括轻链和重链，其特征在于：
所述单克隆抗体的重链全长氨基酸序列为SEQ ID 2，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID 4；
所述单克隆抗体的轻链全长氨基酸序列为SEQ ID 6，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID 8。
2.一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24，其特征在于：
能够编码抗体重链全长核酸序列为SEQ ID 1；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 3；
能够编码抗体轻链全长核酸序列为SEQ ID 5；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 7。
3.根据权利要求1、2中任一项所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24，其特征在于：
所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F (ab’)2、Fd、Fv、Fc、dAb、互补决定区片段、单链抗体。
4.根据权利要求1、2中任一项所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24，其特征在于：所述的单克隆抗体包括非CDR区，且所述非CDR区来自不是猪类的物种。
5.如权利要求1或2所述的一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24的制备方法，包括以下步骤：
在猪21-30日龄和65日龄时分别注射1次猪瘟疫苗，间隔一周后加强免疫一次，共免疫三次；
用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测免疫后猪血清中抗体阻断率，选择高阻断率的猪全血分离淋巴细胞，并利用流式细胞技术分选单个表位特异性抗体分泌细胞，放入0.2-ml 含有
2μl裂解液（1 μl RNase抑制剂和19 μl 0.2% (vol/vol) Triton X-100）1 μl oligo-dT 和 1 μl dNTP的 PCR 管中，立即混匀；
利用SuperScript II 反转录酶获取单细胞全长cDNA，并以其为模版使用巢式PCR扩增得到抗体重链、轻链基因全长序列，通过表达及鉴定获得一对能够特异性结合并中和猪瘟病毒的单克隆抗体。
6.根据权利要求1、2中任一项所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在制备诊断或检测猪瘟病毒试剂中的用途。
7.根据权利要求1、2中任一项所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在制备预防治疗猪瘟生物制剂中的用途。
猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途
技术领域
发明内容
所述单克隆抗体的轻链全长氨基酸序列为SEQ ID 5，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID 7；
所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24，其特征在于：
能够编码抗体重链全长核酸序列为SEQ ID 2；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 4；
能够编码抗体轻链全长核酸序列为SEQ ID 6；所述抗体的轻链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 8。
所得淋巴细胞使用FITC标记的抗猪IgG 和5-tamra标记的特异性表位
CTAVSPTTLRTEVVK同时标记，利用流式细胞术筛选出抗体分泌细胞群，并使用显微操作技术将所得细胞群分离为单个状态，即为单个抗体分泌细胞。
利用SuperScript II 反转录酶获取单个抗体分泌细胞全长cDNA，并使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix进行预扩增，之后使用特定引物，以预扩增产物为模版进行巢式PCR，扩增得到抗体重链、轻链基因全长序列，通过表达及鉴定获得了一对能够特异性结合并中和猪瘟病毒的单克隆抗体，命名为HK24。
附图说明
图3：单克隆抗体HK24中和活性检测。
具体实施方式
具体实施过程如发明内容所述，大致流程为：流式分选后的单个细胞中加入TritonX-
100和RNA酶抑制剂裂解细胞，获取mRNA。按照Invitrogen SuperScript II反转录酶说明书合成cDNA，并进行巢式PCR扩增，。PCR扩增产物进行pLB载体连接，具体操作参考pLB 零背景快速连接试剂盒（VT205）说明书。挑取单克隆菌落测序，并对抗体序列中的可变区进行预测鉴别，结果如下：
抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；重链全长氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示；
抗体重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；重链可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO. 3所示；
轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所
示；
抗体轻链可变区核酸序列如SEQ ID NO. 8所示；抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
将HK24的重链全长序列（SEQ ID NO：2）和轻链全长序列（SEQ ID NO：6）分别克隆到含有启动子EF1α的表达载体中（酶切位点：NdeI和XhoI），共转染293FT细胞。细胞培养4天后，将培养液1000rpm/min离心5min收集上清，0.45µm滤膜过滤后利用ProteinA磁珠纯化获得重组抗体，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，目标蛋白大约在55kD和24kD处与预期相符。
1、猪瘟病毒感染PK-15细胞72h后收集胞内蛋白，以未感染病毒的PK-15细胞做阴性对照；
2、吸取等量的病毒组及非病毒组蛋白，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1×）补齐至相同体积，100℃水浴5-10 分钟，充分变性蛋白。依照试剂盒配制12%的 SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩胶。按照一定顺序上样到SDS-PAGE 胶加样孔中，浓缩胶以 90mV,分离胶以 120mV 恒压电泳约 1 个小时，待蓝色染料到达胶的底端处附近停止电泳；
3、电泳后按说明书操作将样品转至NC膜，并用5%脱脂奶粉封闭2h；
4、加入HK24抗体（1：100稀释在封闭液中）4℃孵育过夜；
5、次日，用TBST震荡洗涤 3次，每次10分钟，随后加入辣根过氧化酶标记兔抗猪IgG的二抗（PBST 1：2000稀释），室温摇床中放置1小时，再次充分洗涤；
6、显色；
7、结果如图2所示，病毒组检测到目标蛋白大约在55kD，无病毒组未检测到目标蛋白。
1、HK24抗体两倍连续稀释在DMEM中，与等体积的TCID50/ml CSFV 37℃混合，孵育1小时；
2、100ul的抗体-病毒混合物加入到含有PK15细胞的96孔板中，37℃孵育2小时；
弃去培养液，并用PBS清洗三次，加入新鲜含有5%FBS 的完全培养基，37℃孵育72小时；
3、弃去培养液，用PBS清洗3次，每次10分钟，逐孔加入100µl预冷的80%丙酮，-20℃固定过夜；
4、吸出个各培养孔中的固定液，各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2~
3次；
5、用抗体稀释液按1:100的比例稀释一抗，加入到各细胞培养孔中，37℃，孵育1 2小~
时；
6、各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2 3次；
~
7、用抗体稀释液按1:100的比例稀释荧光二抗，加入到各细胞培养孔中，37℃孵育30分钟；
8、各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2 3次；
~
9、各孔加入100µlPBST，在倒置荧光显微镜显微镜下进行分析；
10、结果如图3所示。
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