猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法
专利汇可以提供猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 检测方法的改进与研发技术领域，特别是涉及一种 猪瘟 病毒E2蛋白定量的检测方法，该检测方法包括下述步骤：一、对 猪瘟病毒 E2蛋白单克隆 抗体 的制备及纯化步骤；二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。与常规方法相比，此方法的定量定性过程约2小时，在不影响定量结果的前提下，对人员和仪器设备要求不高，省时省 力 ，为猪瘟病毒E2蛋白定量提供了新的方法。，下面是猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法专利的具体信息内容。
1.猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，其特征在于，该检测方法包括下述步骤：
一、对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化步骤；
二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；
三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤一的具体方法：①将制备单克隆抗
6
体的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0×10/ml；②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用Melon Gel IgG Spin Purification Kit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤二的具体方法：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100µg/ml、50µg/ml、25µg/ml、12.5µg/ml、
6.25µg/ml、3.125µg/ml、1.56µg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔加入50µl上述稀o
释后的单克隆抗体；③将包被板置4C，在潮汐式振荡器上振荡16小时；④弃去板内的液体，每孔加300μl PBST，振荡洗涤5min，重复洗3次；⑤弃去PBST后每孔加入由PBS+1%BSAo
制备的100μl PBA置37C，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100µg/ml、75µg/ml、50µg/ml、25µg/ml、12.5µg/ml、6.25µg/ml、3.125µg/ml、1.56µg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔，加入上述制备好的包被板内，o o
50µl/孔，置37C反应1小时；⑦每孔加入200µl的BCA试剂盒中的显色液，置37C反应
30min；⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算P/N值；⑨当单克隆抗体浓度3.125µg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2蛋白标准品浓度在6.25～
2
100µg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R≥98%，最终确定检测的样本每孔加入
50µl即可保证样品检测结果的精确性。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤三的具体方法：随机抽取20份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白，按上述步骤二的方法检测，计算20份猪瘟病毒E2蛋白的平均OD值(x)和标准差SD，阴阳性临界值=x+3SD，当待检样本OD值≥x+3SD时，可在99.9%的水平上判定为阳性。
猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；
三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。步骤一的具体方法：①将制备单克隆抗体
6
的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0×10/ml；
②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用Melon Gel IgG Spin Purification Kit进一步纯化；
④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。步骤二的具体方法：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、
12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔加入50μl上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4℃，在潮汐式振荡器上振荡16小时；
④弃去板内的液体，每孔加300μl PBST，振荡洗涤5min，重复洗3次；⑤弃去PBST后每孔加入由PBS+1％BSA制备的100μl PBA置37℃，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔，加入上述制备好的包被板内，50μl/孔，置37℃反应1小时；⑦每孔加入200μl的BCA试剂盒中的显色液，置37℃反应30min；⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算P/N值；⑨当单克隆抗体浓度3.125μg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2
2
蛋白标准品浓度在6.25～100μg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R≥98％，最终确定检测的样本每孔加入50μl即可保证样品检测结果的精确性。步骤三的具体方法：随机抽取20份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白，按上述步骤二的方法检测，计算20份猪瘟病毒E2蛋白的平均OD值(x)和标准差SD，阴阳性临界值＝x+3SD，当待检样本OD值≥x+3SD时，可在99.9％的水平上判定为阳性。
附图说明
具体实施方式
的健康细胞离心并调整到1.0×10/ml；②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用Melon Gel IgG Spin Purification Kit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。
2
R≥98％，最终确定检测的样本每孔加入50μl即可保证样品检测结果的精确性结果详见表1～2。
标准品浓度(μg/ml) 6.25 12.5 25 50 100
吸光值 0.085 0.092 0.112 0133 0.188
表2 高效液相色谱法标准曲线数据
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 猪瘟病毒配体表位多肽SE241及其应用 | 2020-05-12 | 688 |
| 一种非洲猪瘟病毒巢式PCR检测方法 | 2020-05-13 | 483 |
| 一种猪瘟病毒纯化方法 | 2020-05-11 | 467 |
| 一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法 | 2020-05-15 | 645 |
| 猪瘟病毒疫苗和诊断 | 2020-05-11 | 109 |
| 一种非洲猪瘟病毒血清学诊断试剂盒 | 2020-05-15 | 908 |
| 一种猪瘟病毒E2次单位疫苗及其制备 | 2020-05-19 | 30 |
| 猪瘟病毒配体表位多肽SE241及其应用 | 2020-05-13 | 146 |
| 猪瘟病毒荧光定量RT－PCR诊断试剂盒 | 2020-05-15 | 594 |
| 猪瘟病毒抗体检测卡 | 2020-05-12 | 179 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
