对2型猪环状构象病毒(PCV2)感染高度容许的均质细胞系的产生
专利汇可以提供对2型猪环状构象病毒(PCV2)感染高度容许的均质细胞系的产生专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及对2型猪环状构象病毒(“PCV2”)感染高度容许的连续细胞系。PCV2是猪的 断奶仔猪多系统衰竭综合征 (“PMWS”)的致病因子。PMWS作为主要的 疾病 出现，对全球的养猪工业经济产生极大威胁。本发明的高容许细胞系提供重组且可靠的PCV2来源以用于开发PMWS的 疫苗 ， 治疗 和 诊断剂 。，下面是对2型猪环状构象病毒(PCV2)感染高度容许的均质细胞系的产生专利的具体信息内容。
1.连续产生2型猪环状构象病毒(“PCV2”)的方法，包括用所述病毒感 染猪肾细胞系PK15-C1，在适合细胞生长的条件下培养所述细胞系；以及 回收所述细胞系产生的所述病毒。
2.产生基本均质的对2型猪环状构象病毒(“PCV2”)感染高度容许的细 胞系的方法，包括(1)培养含有对PCV2感染具有不同易感性的细胞的均质 细胞群；(2)稀释所述细胞培养物并将稀释的细胞的等份试样置于分离的容 器内使得每个容器含有大约一个细胞；(3)将PCV2加入每个容器；(4)培养 所述细胞并鉴定含有对PCV2感染易感的细胞的容器；和(5)培养并维持来 自这种细胞的细胞系。
3.权利要求2的方法，其中所述均质细胞群是PK15细胞群。
4.权利要求2的方法，其中步骤2-5重复至少一次。
5.连续产生2型猪环状构象病毒(“PCV2”)的方法，包括用PCV2感染 权利要求2，3或4的方法产生的细胞系，在适合细胞生长的条件下培养所 述细胞系，以及回收所述细胞系产生的所述病毒。
6.权利要求2，3或4的方法产生的连续产生2型猪环状构象病毒 (“PCV2”)的细胞系。
7.细胞系PK15-C1，其于2007年3月20日以PTA-8244保藏在美国 典型培养物保藏中心。
背景技术
本发明涉及产生2型猪环状构象病毒(PCV2)。更具体地，本发明涉及 对PCV2感染高度易感的连续细胞系以及利用所述细胞系产生PCV2的方 法。
猪环状构象病毒(PCV)是小的无包膜环状单链DNA病毒，其属于环状 构象病毒科。Murphy，F A.，Fauquet，C M.，Bishop，D H L.，Ghabrial，S A.， Jarvis，A W.，Martelli，G P.；Mayo，M A.，Summers，M D.Virus taxonomy.Sixth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.New York，N.Y： Springer-Verlag；1995.pp.166-168。其最开始被鉴定并描述为猪肾细胞系的 污染物。Tischer，L，Gelderblom，H.，Vettermann，W.，Koch，M.A.A very small porcine virus with circular single-stranded DNA.Nature.1982：295：64-66。最 近，PCV与猪的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相联系，该疾病首先在 以下文献中涉及：Western Canada.Ellis，J.，Hassard，L.，Clark，E.，Harding，J.， Allan，G.，Willson，P.，Strokappe，J.，Martin，K.，McNeilly，F.，Meehan，F.，Todd， D.，Haines，D.Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome.Can.Vet.J.，1998；39：44-51；Harding，J.C.S.， Clark，E.G. Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS).Swine Health Prod.1997；5：201-203；Jue Liu，Isabelle Chen，and Jimmy Kwang，J.Virol 2005：7P(13)；8262-74。PWMS作为一种主 要的疾病出现，其对全球的猪工业经济造成极大威胁。其首次出现于加拿 大之后，PMWS目前已经播散到美国、欧洲和亚洲。该综合征主要影响6-14 周的幼仔。在患病猪中呈缓慢渐进性进展，死亡率高。见 http://www.aphis.usda.gov/vs/ceah/cei/taf/emergingdiseasenotice files/pmws 0301 htm。
PMWS高度可变。患病猪显示慢性消耗，呼吸窘迫，腹泻，动作失调， 麻痹，皮肤苍白以及蓝耳的表现。猪通常会显示生长速度减慢，以及有时 会出现黄疸。
PMWS的诊断基于患病猪的年龄，典型的消耗表现以及尸检病变。显 微镜和免疫组织化学组织检测显示独特的肺和淋巴样组织病变，其中存在 PCV2。Id.
抗细菌药物通常对于PWMS无效并且目前没有可用的疫苗。症状的预 防基于生物安全防护和良好的畜牧习惯。
PCV2已经被发现与其他疾病相关，包括猪皮炎肾病综合征(″PDNS″)， 先天性震颤(CT-AIl)，繁殖疾病，产前心肌炎(prenatal myocarditis)和增生性 坏死性肺炎。
利用PCV抗原的疫苗已经显示了在预防PMWS中的初步成功。Fenaux， M.，et al.，A chimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2(PCV2)cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCVl induces protective immunity against PCV2 infection in pigs.J.Virol，2004.75(12)：p.6297-303；Blanchard，P. et al.，Protection contre la maladie d′amaigrissement du porcelet(MAP)par vaccins a ADNet proteines recombinantes.Journees de Ia Recherche Porcine en France，2004.36： p.345-352；Blanchard，P.，et al.，Protection of swine against porcine multisystemic wasting syndrome(PMWS)by porcine circovirus type 2(PCV2) proteins.Vaccine，2003.21：p.4565-4575；Pogranichniy，R.et al.Efficacy of inactivated PC V2 vaccines for preventing PMWS in CDCD pigs.American Association of Swine Veterinarians.2004.Des Moines，Iowa。但是，目前没有 可用的有效疫苗。
PMWS以及其他PCV2病毒感染相关疾病的疫苗、诊断剂和治疗的开 发需要有效且可靠的大量制造所述病毒的手段。PCV2病毒母液常规地通过 在猪肾细胞系PK15上培养所述病毒来产生。从PK15细胞培养物产生的病 毒效价表达为50％组织培养感染剂量(″TCID50″)每毫升，通常为104-105并 且不超过105。感染的PK15细胞培养物的免疫荧光染色显示仅仅大约40％ 的细胞群对PCV2感染易感。
需要对PCV2感染高度容许并可靠地在延长的时间中以高效价产生病 毒的连续细胞系。
附图简述
图1显示免疫荧光测定的结果，显示感染后3天被PCV2感染的非克 隆的和克隆的PK15细胞单层的感染百分比。A，B，C和D分别代表模拟感 染的PK15单层(阴性对照)，感染的PK15单层，低容许和高容许(克隆C1) 亚克隆的单层。
图2显示37℃吸附1小时后，PCV2附着于PK15细胞系低和高容许 细胞克隆的表面膜。
图3显示PK15和克隆C1细胞群在48小时中的生长曲线。
图4显示在亲代PK15和克隆的C1细胞系在4代中产生的PCV2病毒。
图5显示亲代PK15和克隆的C1细胞系中PCV2病毒基因组合成。
发明简述
本发明提供了对PCV2感染高度容许的连续细胞系。另一实施方案中， 本发明提供了产生对PCV2感染高度容许的基本均质的细胞系的方法，其 包括(1)培养含有对PCV2感染具有不同易感性的细胞的均质细胞群；(2) 稀释所述细胞培养物并将稀释的细胞的等份试样置于分离的容器内使得每 个容器含有大约一个细胞；(3)将PCV2加入每个容器；(4)培养所述细胞并 鉴定含有对PCV2感染易感的细胞的容器；和(5)培养并维持来自这种细胞 的细胞系。具体实施方案中，本发明提供了名为PK15-C1的连续细胞系。 其他实施方案中，本发明提供了产生PCV2的方法，所述方法通过在本发 明的细胞系中在适合细胞生长的条件下培养病毒并回收所述细胞系产生的 病毒来进行。
发明内容
本发明的均质细胞系可通过克隆单个细胞并鉴定对PCV2感染高度易 感的所得培养物来产生。虽然PK15细胞系是用于本发明方法中的优选细 胞系，其他对PCV2感染易感的细胞系也可用于产生产生均质病毒的细胞 系。
均质细胞群的培养物首先稀释成包含单个细胞的等份试样。所述单细 胞等分试样置于独立的容器中，诸如微量滴定板的孔中，并悬浮在含有细 胞复制所需营养成分、生长因子和缓冲液的营养培养基中。它们随后在诱 导细胞生长的温度和大气条件下保温。细胞生长之后，例如生长到连续单 层之后，将感染量的病毒加入每个等分试样并培养细胞直到达到适宜的病 毒产生阶段。
测定每个等分试样的病毒效价，例如通过免疫荧光测试，所述的测定 根据以下方案：感染后(pi)72小时感染的细胞用4％多聚甲醛固定15分钟， 与PCV2 ORF-1抗体以及随后与抗豚鼠异硫氰酸荧光素(FITC)保温，每次 在37℃保温1小时，每个步骤之间用磷酸缓冲盐水洗涤细胞一次。染色结 果在奥林巴斯荧光显微镜下观察并对细胞产生高病毒效价的能力进行评 分。高病毒产生细胞系随后有利地再克隆并选出高度容许细胞。
本发明产生的优选的细胞系来自细胞系PK15(ATCC CCL-33)并称为克 隆C1。在本发明中优选称为PK15-C1。本发明的结果显示克隆的C1细胞 群比PK15细胞对PCV2感染更易感。因此，PK15-C1与亲本PK15细胞系 相比是更有效产生高PCV2病毒产量的细胞系。
PK15-C1已经在美国典型培养物保藏中心保藏，保藏号PTA-8244。
本发明还通过以下实施例说明，其目的并非限制本发明。
实施例1
产生PK15-C1
PK15亲本细胞系维持在Eagle′s极限必需培养基(MEM)中，所述培养 基中补充有5％胎牛血清(FBS)，2.2g/L碳酸氢钠，2mM L-谷氨酸，1.0mM] 丙酮酸钠和抗生素。PK15细胞的克隆通过有限稀释法进行。细胞用胰蛋白 酶消化，以平均浓度1细胞/孔在MEM/20％FBS/60％调节的培养基中稀 释，并分配在96孔组织培养板中。立即筛选所述的板的单个细胞并进行标 记，在37℃和5％CO2大气下保温该板。鉴定来自最初的孔的细胞单层之 后，对这些亚克隆进行另一轮进一步的克隆。
PK15亲本和克隆的细胞群通过免疫荧光测定(IFA)筛选高和低容许细 胞。所述细胞在96孔板中接种到70％汇合并在接种后6小时用PCV2感染， 效价为大约105TCID50/ml。将葡糖胺(300mM)加入感染24小时内的感染细 胞中，所述细胞维持在MEM/5％FBS中、37℃/5％CO2下。该实验中所用 阳性和阴性对照分别为105TCID50/ml的PCV2病毒上清(s/n)和MEM/5％ FBS。所述细胞用4％多聚甲醛固定，IFA在感染后(pi)72小时进行。IFA结 果显示与PK15亲代细胞中的40％PCV2感染以及保持低容许性的细胞克隆 中的低于20％感染相比，在高容许克隆C1细胞中出现最高的90％PCV2感 染(图1)。此外，进行病毒附着测定来观察PCV2与每个细胞克隆的细胞表 面膜的亲和力。每个细胞克隆接种于细胞培养玻片上并如上所述保温过夜 以获得70％汇合。将107TCID50/ml的PCV2加入细胞在37℃吸附1小时 并用4％多聚甲醛固定。IFA如上所述继续进行，但是利用PCV2 ORF-2抗 体作为一级抗体。最后的洗涤之后，染色的细胞用荧光包埋介质包埋并在 Zeiss Meta倒置共聚焦显微镜下观察。共聚焦显微镜下的结果显示在37℃ 吸附1小时之后PCV2附着于克隆的和非克隆的PK15细胞的细胞表面膜， 如图2所示。A，B，C和D分别代表模拟感染的PK15单层(阴性对照)， 感染的低容许、高容许(克隆C1)亚克隆单层以及感染的PK15单层。1)FITC 荧光染色图像。2)光相(light phase)和绿色荧光图像的重合。荧光的扩散和 强度，表示PCV2附着于细胞表面膜，在高容许性细胞克隆C1上最强，然 后是未克隆的PK15细胞和低容许细胞克隆。这些结果提示克隆C1对PCV2 感染最易感，由此被选择用于PCV2病毒的增殖。
实施例2
PK15-C1的表征
PK15亲代细胞和克隆C1细胞通过它们以小时为单位的平均代长表 征。大约1x105个细胞接种到6孔板，在MEM/10％FBS中培养。细胞经 胰蛋白酶消化，计数，经DNA提取并在接种后0，4，8，16，24，32和48小时 定量。根据细胞计数和DNA定量数据，PK15亲代和克隆C1细胞群的平 均代长分别为12.1和14.6小时。结果显示于图3，表1提示PK15亲代细 胞比克隆C1细胞倍增得更快。
然后，在PK15亲代和克隆C1细胞的病毒产物之间比较培养物上清中 释放的病毒的效价。所述细胞在150cm2组织培养瓶中接种到70％汇合， 并在接种后6小时用PCV2(104TCID50/ml)感染。感染的培养物用D-葡 糖胺并如前所述维持在培养基中。最后，病毒感染的培养物在感染后4天 (DPI)冻干3次，细胞碎片在3500rpm、4℃沉淀5分钟，获得包含PCV2 病毒的上清。PCV2病毒在PK15亲代和克隆C1细胞系中连续传代，收获 并保存在-80℃直到利用C1克隆通过IFA测定感染力。IFA结果显示与从 亲代PK15细胞系产生的较低效价105TCID50/mL相比，C1细胞克隆在5 次连续传代之后产生最大的病毒效价108TCID50/mL(图4)。
表1
细胞系 平均代长(小时) PK15 12.1 克隆C1 14.6
亲代PK15和C1细胞克隆中PCV2的DNA复制速度也利用实时PCR 法评估。感染后4天(DPI)收获200微升的每种PCV2感染的PK15和C1 细胞裂解物，利用QiaAmp DNA Mini试剂盒(QIAGEN，Inc.，Valencia， California USA)进行DNA提取。纯化的DNA随后在200微升无菌蒸馏水 中洗脱。实时PCR利用Roche LightCycler system(Roche Applied Science， Indianapolis，Indiana USA)进行。1微升每种DNA提取物用作PCR模板， 并使用PCV2特异性引物对进行扩增(正向引物：5′cacctggttgtggtaaaagc 3′， 反向引物：5′ggtctgattgctggtaatcg 3′)。含有PCV2基因组插入物的PBluescript 质粒(Stratagene，La Jolla，California USA)用作标准参照。实时PCR定量显 示1mL PK15和C1细胞裂解物中PCV2的基因组DNA拷贝数分别为107 和1010(图5)。
尽管本发明通过举例说明，应理解本领域技术人员可进行变化而不偏 离本发明的精神和权利要求限定的范围。
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