一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
阅读：701发布：2020-05-28
专利汇可以提供一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种猪 圆环病毒 II型病毒样颗粒 疫苗 及其制备方法和应用，属于 生物 制药技术领域。本发明所述的病毒样颗粒疫苗包括可溶性蛋白，该可溶性蛋白为大肠杆菌表达 猪圆环病毒 II型完整衣壳蛋白基因得到的蛋白。其中该衣壳蛋白基因是筛选自目前国内猪圆环病毒II型流行毒株的衣壳蛋白基因，并且经过密码子优化，不仅能在大肠杆菌中大量表达，而且表达的可溶性蛋白还能形成病毒样颗粒。应用本发明的方法制备的猪圆环病毒II型 亚单位疫苗 具有 抗原 纯度高、免疫原性强等特点，此外该疫苗制备过程简单，生产成本低廉，有很好的应用前景。，下面是一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)合成目的基因：合成两端加入酶切位点的如SEQ ID NO：2的基因序列，基因命名为rORF2；
(2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET-43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-
43.1a-rORF2；
(3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43.1a-rORF2菌株，即为重组表达菌株；
(4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET-
43.1a-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；
(5)疫苗的制备：将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的两端加入酶切位点为BamHI和HindIII两个酶切位点。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的佐剂为法国赛比克公司提供的201佐剂。
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例为体积比1:1。
5.一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由权利要求1～4任一项所述的制备方法获得。
6.权利要求1～4任一项所述的制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制备防治断奶仔猪多系统衰竭综合征的药物中应用。
一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，其主要感染6-15周龄的仔猪，临床表现为进行性消瘦、发热、淋巴结肿大、黄疸、呼吸困难等症状。此外，PCV2与猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、A2型先天性震颤、猪增生性和坏死性肺炎、繁殖障碍等疾病密切相关。PCV2的危害还在于能够使感染的猪只免疫功能受到损伤，从而导致机体抵抗力下降，使机体容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病表现为世界流行，已经给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失，但对PCV2的致病机制研究仍不透彻，目前仅能通过加强饲养管理、疫苗接种等方法控制该病毒在猪群中的爆发。因此，研发一种廉价且有效地猪圆环疫苗显得尤为迫切。
[0003] 研究表明PCV2含有两个主要的开放阅读框，分别为ORF1和ORF2，其中ORF1与病毒的复制相关，免疫原性较弱；ORF2为编码该病毒的主要结构蛋白Cap的基因，Cap是病毒的衣壳蛋白，该蛋白含有可中和病毒的抗原表位，还可自我装配成病毒样粒子，因此ORF2是研制新型疫苗的主要候选基因。
[0004] 此外，有文献报道，Cap蛋白的N端富含碱性氨基酸(如精氨酸)，序列高度保守，其中前41个氨基酸是Cap蛋白的核内化信号肽序列，而位于第12～18与34～41位的氨基酸对Cap蛋白的核定位起着决定性作用。还有研究表明，核定位信号肽区域含有潜在的抗原表位，因此，要想获得更好的保护效果，最好能表达完整的Cap蛋白。但由于Cap蛋白的N端大量精氨酸的存在，严重影响了完整Cap蛋白的大量表达，因此，大多研究人员选择了截短或是部分表达Cap蛋白，大量表达完整的Cap蛋白目前仍是亟待解决的难题。通过本发明提供的方法不仅可以大量表达完整的Cap蛋白，而且表达的蛋白还是可溶的，活性高，易于大规模生产。
[0005] 病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLP)是含有病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含遗传物质，其形态、大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒粒子相同或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫应答，具有良好的免疫原性，且没有毒副作用。目前，已有部分VLPs疫苗上市，如流感VLPs疫苗、乙肝VLPs疫苗、乳头瘤VLPs疫苗等，说明该类疫苗有巨大的潜力。
[0006] 目前市场上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种，其中关于全病毒灭活苗，由于病毒自身特点和生产工艺的问题，经常出现病毒滴度难以提高等问题，有时需要浓缩才能达到要求。国内使用的亚单位疫苗主要是勃林格公司生产的，该公司生产的PCV2亚单位疫苗是使用杆状病毒表达目的蛋白，生产成本很高，造成很多养殖场难以在生产中使用该疫苗。因此本发明使用的大肠杆菌表达系统因其操作简单、表达量高、成本低廉等一系列优点而具有很好的前景。
发明内容
[0007] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)合成目的基因：以PCV2 119-GD01株(PCV2b基因亚型，由本实验分离保存)的Cap蛋白的氨基酸序列为基础，在保证此株Cap蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托华大基因公司合成，基因合成时两端加入酶切位点，氨基酸序列见SEQ ID NO：1，合成后的基因命名为rORF2，基因序列见SEQ ID NO：2；
[0012] (2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET-43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2；
[0013] (3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43.1a-rORF2菌株，即为重组表达菌株；
[0014] (4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET-43.1a-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；
[0015] (5)疫苗的制备：将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。
[0016] 步骤(1)中所述的两端加入酶切位点，优选为BamHI和HindIII两个酶切位点。
[0017] 步骤(5)中所述的佐剂优选为法国赛比克公司提供的201佐剂。
[0018] 步骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例优选为体积比1:1。
[0019] 一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由上述制备方法获得。
[0020] 上述获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制备防治断奶仔猪多系统衰竭综合征的药物中应用。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] 首先，本发明的基因是在保证氨基酸不变的情况下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，然后获得基因，使被普遍认为的全长Cap蛋白在原核表达系统中表达量低，容易形成包涵体等局限性得到解决，获得了表达量高，且目的蛋白可溶的重组表达菌株，其中上清中目的蛋白约占总蛋白的43.1％。
[0023] 其次，本发明表达的为Cap蛋白全长，它包含了Cap蛋白氨基端41aa里面含有的潜在抗原表位，因此本发明表达的Cap蛋白相比截短表达的蛋白拥有更齐全的抗原表位，更接近天然病毒衣壳蛋白，更易形成病毒样颗粒，免疫原性更强。
[0024] 一方面，使用本发明提供的纯化与去标签联合处理的方法制备蛋白，不仅操作简便，纯度很高，适于大规模生产，而且获得的蛋白不带有任何的标签(目前很多亚单位疫苗都含有标签，如6xHis标签、分泌性信号肽等，这些都不利于病毒样颗粒的形成)，这样也会减少表达的蛋白与天然衣壳蛋白的差异，以至于获得更接近天然病毒的颗粒[0025] 又一方面，应用上述方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗对实验动物没有致病性，且使用该疫苗免疫后，短时间内能在动物体内产生高水平的猪圆环病毒抗体。附图说明
[0027] 图1为大肠杆菌表达的目的蛋白的可溶性的检测结果图；其中，M泳道是蛋白marker；1:pET-43.1a-rORF2诱导表达破碎后上清；2:pET-43.1a-rORF2诱导表达破碎后沉淀；3:pET-43.1a-rORF2诱导表达后全菌；4：空载体诱导表达后全菌；图中箭头所指为融合蛋白。
[0028] 图2为电镜观察目的蛋白的结果图，图中病毒样颗粒得直径20nm左右。
[0029] 图3为免疫仔猪后不同时间血清的抗体水平；其中：横坐标代表不同组别；纵坐标代表以450nm/630nm双波长检测的样品吸光度；2W、4W、6W、8W分别代表一免后2、4、6、8周。
具体实施方式
[0030] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0031] 实施例1Cap蛋白表达载体的构建
[0032] Cap蛋白基因的获得
[0033] 以PCV2 119-GD01株(PCV2b基因亚型，由本实验分离保存)的Cap蛋白的氨基酸序列为基础，在保证此株Cap蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托华大基因公司合成，基因合成时两端加入酶切位点，氨基酸序列见SEQ ID NO：1，合成后的基因命名为rORF2，基因序列见SEQ ID NO：2。
[0034] 重组表达载体质粒的构建
[0035] 将rORF2用BamHI和HindIII两种限制性内切酶进行双酶切，然后回收纯化。pET-43.1a也进行与rORF2同样的处理。将处理好的pET-43.1a和rORF2在16℃连接12h，之后将连接产物转化到E.coli DH5ɑ感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16h。挑取平板上的单菌落，在含氨苄青霉素的液体LB培养基培养4h左右，然后进行菌液PCR鉴定和送金唯智测序。将测序正确的菌液1:1000加入到新鲜的含氨苄青霉素的LB中，培养过夜，之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2。
[0036] 重组表达菌株的构建
[0037] pET-43.1a-rORF2重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3),同样的，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16h，获得重组表达菌株pET-43.1a-rORF2。
[0038] 实施例2重组蛋白的表达、纯化
[0039] Cap蛋白的诱导表达
[0040] 取过夜培养的pET-43.1a-rORF2菌株1:100接种到新鲜的含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床上培养3h左右，使OD600的值达到0.6左右。然后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，16℃，150rpm进行诱导表达20h。样品处理过后进行SDS-PAGE分析(结果见图1)。
[0041] Cap蛋白的纯化和去标签
[0042] 将诱导完成的菌液按下述步骤处理
[0043] ⑴5000rpm离心5min，收集菌体，然后按照100ml菌液加入10ml PBS重悬菌体。
[0044] ⑵重悬后的菌体超声破碎法破碎，破碎条件：功率200W，工作时间/间歇时间＝4sec/6sec，超声次数根据菌液的多少决定。
[0045] ⑶将破碎完成的菌液离心，4℃、12000rpm、15min，收集上清待用。
[0046] ⑷Cap蛋白的纯化按以下步骤进行
[0047] ①Ni填料装柱。
[0048] ②Binding buffer平衡。
[0049] ③将收集的上清缓慢的通过处理后的含Ni填料的柱子。
[0050] ④Binding buffer洗去杂蛋白。
[0051] ⑤然后加入PBS稀释后的蛋白酶，16℃、100rpm、20h。
[0052] ⑥收集蛋白酶切下的蛋白，此蛋白即为去除标签的Cap蛋白。
[0053] ⑸SDS-PAGE电泳检测、western-blot。
[0054] 实施例3电镜观察表达的Cap蛋白
[0055] 取10倍稀释的纯化后的Cap蛋白样品20ul滴到200目铜网上，室温静置3min，用滤纸轻轻吸去多余的液体。然后用3％的磷钨酸染色3min，待完全干燥后在透射电镜下观察。电镜照片结果见图2。
[0056] 实施例4病毒样颗粒疫苗的制备
[0057] 首先使用BCA试剂盒测定上述纯化好的蛋白，将Cap蛋白浓度调至0.6mg/ml，然后按照1:1的体积比例将蛋白与法国赛比克公司提供的201佐剂混合，接着进行超声乳化。经检测粘度和稳定性合格后置于4℃保存。
[0058] 实施例5病毒样颗粒蛋白的仔猪免疫试验
[0059] 将15只3周龄经抗原抗体检测双阴性的仔猪随机分为3组，每组5头。各组均采用颈部肌肉注射的方式免疫，共免疫两次。
[0060] 第一组：每头仔猪每次免疫2ml灭菌后的PBS。
[0061] 第二组：每头仔猪每次免疫2ml某公司灭活疫苗。
[0062] 第三组：每头仔猪2ml由201佐剂乳化的Cap蛋白，终浓度为0.3mg/ml。
[0063] 一免后，每隔2周对每头仔猪进行采血，析出的血清使用猪圆环病毒ELISA检测试剂盒进行抗体检测。检测结果见图3。
[0064] 结果显示：病毒样颗粒疫苗免疫仔猪后能快速产生针对猪圆环病毒的抗体，且与商品化的灭活疫苗相比产生抗体更加迅速、水平更高。
[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用 | 2020-05-29 | 869 |
| 一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | 2020-05-26 | 907 |
| 一种预防和/或治疗猪圆环病毒感染的二联疫苗组合物及其制备方法和应用 | 2020-05-30 | 725 |
| 猪圆环病毒2型疫苗 | 2020-05-21 | 809 |
| 一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用 | 2020-06-03 | 1007 |
| 共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗 | 2020-05-25 | 914 |
| 一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | 2020-05-28 | 701 |
| 一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用 | 2020-06-02 | 239 |
| 针对PCV2高感染性的PK15细胞系及其制备方法和应用 | 2020-05-17 | 84 |
| 一种预防断奶仔猪多系统衰竭综合征的中草药饲料添加剂及其猪饲料 | 2020-05-13 | 169 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈