一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
阅读：907发布：2020-05-26
专利汇可以提供一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种猪 圆环病毒 2型新的基因亚型的毒株，该毒株具有良好的、广谱的免疫原性。其制备的 疫苗 组合物能 预防 和/或 治疗 猪圆环病毒 2型感染导致的相关 疾病 ，且能对不同地域来源的毒株均具有良好的免疫保护效 力 。，下面是一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.猪圆环病毒2型HH3株(Porcine Circovirus type 2，strain HH3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201726，保藏日期为2017年6月4日，保藏地址：中国武汉·武汉大学。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有免疫量的权利要求1所述的猪圆环病毒
2型HH3株抗原以及药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型HH3株抗原为猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的全病毒灭活抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为≥1代次的培养物；优选地，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为≥5代次的培养物；更优选地，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为5～48代次的培养物。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭
5.0
活全病毒抗原含量为灭活前≥10 TCID50/ml；优选地，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml；更优选地，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或MontanideTMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；优选地，所述佐剂为MontanideTMGel；
所述佐剂含量为5～20V/V％；更优选地，所述佐剂含量为10V/V％。
7.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原；
优选地，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原；
优选地，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原；
更优选地，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株减毒株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株减毒株、所述猪细小病毒灭活抗原为HN-
2011株灭活全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株或5型ZJ株灭活全菌抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活全菌抗原。
8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭
5.0 7.0 4.0
活全病毒抗原含量为灭活前10 ～10 TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10 ～
106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为106.0～107.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～107.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为105.0～107.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～
108.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前108.0～1010.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前108.0～1010.0CCU/ml；
优选地，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～
107.0TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为105.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为
7.0 9.0
灭活前10 TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10 CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前109.0CCU/ml。
9.根据权利要求2～8任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染导致的相关疾病的药物中的应用，其中，所述猪圆环病毒2型感染导致的相关疾病为由PCV2不同基因亚型单独感染或它们混合感染导致的相关疾病。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述猪圆环病毒2型相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种毒株、其制备的疫苗组合物、制备方法和应用，属于动物病毒学领域。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。
[0003] PCV2主要有两种基因亚型PCV2a和PCV2b，两者基因组长分别为1767和1768个核苷酸，还有一种PCV2c仅在丹麦有过报道。2003年之前PCV2a是主要流行株，之后PCV2b开始出现并迅速扩大范围，2009年又发现新的基因亚型PCV2d。临床上，随着PCV2疫苗的普遍应用，在免疫压力下，PCV2的变异速度加快。
[0004] 近年来，一类介于PCV2b与PCV2d之间的新的基因亚型的毒株开始流行，这类病毒特征是ORF2基因中存在突变或存在不同基因亚型基因之间的重组。由于该新的PCV2基因亚型毒株的流行，且其抗原与现有的基因亚型之间存在差异，而现有的商品化疫苗均以PCV2a或PCV2b为疫苗株来制备的，不能对最新流行的毒株进行完全的保护，因此针对该最新流行的毒株制备新的疫苗，对猪场疾病控制十分重要。
发明内容
[0006] 为此，本发明的一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型毒株，属于现在流行的新的基因亚型，其具有良好的、广谱性的免疫原性。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗新的猪圆环病毒2型感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的本发明所述的猪圆环病毒2型毒株的抗原以及药学上可接受的载体。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗猪圆环病毒2型各基因亚型感染以及它们混合感染的疫苗组合物。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗不同地域来源的猪圆环病毒2型各基因亚型感染以及它们混合感染的疫苗组合物。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种制备所述疫苗组合物的方法，包括：步骤(1)增殖所述的猪圆环病毒2型毒株；步骤(2)灭活所述步骤(2)增殖的猪圆环病毒2型毒株，加入佐剂，乳化。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型相关疾病的药物中的应用。
[0012] 发明优点：
[0014] (2)本发明首次采用猪圆环病毒2型新的基因亚型的毒株制备的疫苗组合物，其不仅能针对猪圆环病毒2型新的基因亚型的毒株提供保护，还能对猪圆环病毒2型不同基因亚型的毒株单独感染或混合感染提供预防和/或治疗；
[0015] (3)本发明的疫苗，能针对不同地域来源的猪圆环病毒2型毒株提供完全保护，具有广谱的保护能力。
具体实施方式
[0016] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0017] “猪圆环病毒2型new基因亚型”是指一种新的PCV2基因亚型，其在ORF2基因中存在突变或存在不同基因亚型之间的重组，具有PCV2b的标签序列，但在遗传进化分析中组成一个独立分支，猪只感染该基因亚型的毒株后出现的临床表征有：持续性高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点。
[0018] 本发明涉及猪圆环病毒2型HH3株(Porcine Circovirus type 2，strain HH3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201726，保藏日期为2017年6月4日，保藏地址：中国武汉·武汉大学。
[0019] 本发明的猪圆环病毒2型HH3株属于猪圆环病毒2型new基因亚型，其免疫原性与现有技术中的PCV2基因亚型均存在差异。该毒株具有良好的免疫原性，制备的疫苗能够有效激发免疫保护作用。
[0020] 本发明提供的新的猪圆环病毒2型基因组长为1768个核苷酸，具有PCV2b的标签序列，但在遗传进化分析中却组成一个独立分支，ORF2基因中存在突变或存在不同基因亚型之间的重组，是一种新PCV2基因亚型。
[0021] 本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有所述免疫量的所述猪圆环病毒2型HH3株抗原以及药学上可接受的载体。
[0022] 本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，免疫一次，即能刺激机体快速地产生免疫效力，有效保护毒株的攻击，实现完全保护。
[0023] 所述猪圆环病毒2型HH3株抗原可以是猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活抗原、减毒全病毒抗原。
[0024] “培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
[0025] “疫苗组合物”指含有猪圆环病毒2型免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪圆环病毒2型的免疫反应。
[0026] “灭活抗原”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
[0027] “减毒全病毒抗原”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。或者是人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。
[0028] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株抗原为猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的全病毒灭活抗原。
[0029] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株抗原为猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的裂解型抗原。
[0030] 病毒的不同代次传代培养物基因序列仅可能会发生微小的变异，能保证同样的免疫原性，其制备的灭活疫苗能具有相似的免疫效力。
[0031] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为≥1代次的培养物。
[0032] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为≥5代次的培养物。
[0033] 作为本发明的一种更优选实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株培养物为5～48代次的培养物。
[0034] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据多种因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0035] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/ml。
[0036] 本发明的疫苗组合物中猪圆环病毒2型HH3株灭活全病毒抗原具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速地产生免疫力，当使用灭活前105.0TCID50/ml的含量时，也能达到良好的免疫保护作用，实现100％的保护率。
[0037] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全5.0 7.0
病毒抗原含量为灭活前10 ～10 TCID50/ml。
病毒抗原含量为灭活前10 ～10 TCID50/ml。
[0038] 作为本发明的一种更优选实施方式，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。
[0039] 本发明疫苗组合物中，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含5.0 6.0 6.0 7.0
量范围还可选自10 ～10 TCID50/ml，或10 ～10 TCID50/ml。
量范围还可选自10 ～10 TCID50/ml，或10 ～10 TCID50/ml。
[0040] 作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或MontanideTMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
[0041] 作为本发明的一种优选实施方式，所述佐剂为MontanideTMGel。
[0042] 作为本发明的一种实施方式，所述佐剂含量为5～20V/V％。
[0043] 作为本发明的一种优选实施方式，所述佐剂含量为10V/V％。
[0044] 本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。
[0045] 术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTMGel。
[0046] 尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical Application ofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
[0047] 特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
[0048] 优选地，本发明选用的佐剂为MontanideTMGel。
[0049] 适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据多种因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0050] 本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)增殖培养所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物；以及步骤(2)灭活所述步骤(1)增殖培养的猪圆环病毒2型HH3株或其培养物，步骤(3)在所述灭活后的猪圆环病毒2型HH3株或其培养物中加入佐剂，乳化。
[0051] 本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合物使用以制备抵抗包括猪圆环病毒2型感染的疾病的联合疫苗或复合疫苗。
[0052] 术语“联合疫苗”指本发明的猪圆环病毒2型与至少一种不同病毒的病毒抗原混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的猪圆环病毒2型和细菌抗原制备的疫苗。例如，本发明的猪圆环病毒2型可与以下病原的抗原：猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒和/或副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪波氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪肺炎支原体、猪鼻支原体混合或组合。
[0053] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原。
[0054] 本发明的猪圆环病毒2型抗原能与多种抗原成分组成疫苗组合物共同施用，各抗原相互之间不发生干扰，其中的抗原成分能针对各自的攻毒毒株产生完全保护。
[0055] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。
[0056] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还含有由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。
[0057] 作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株减毒株、所述猪细小病毒灭活抗原为HN-2011株灭活全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株或5型ZJ株灭活全菌抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活全菌抗原。
[0058] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为104.0～106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为106.0～107.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～107.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为105.0～107.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前108.0～1010.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前108.0～1010.0CCU/ml。
[0059] 本发明疫苗组合物中抗原在上述含量范围内能有效激发免疫反应，抵抗各自针对的病原的攻毒，疫苗组合物中各抗原成分之间不产生干扰，能够完全保护，保护率为100％。
[0060] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述猪圆环病毒2型HH3株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml，所述猪瘟病毒减5.0 6.0
毒抗原含量为10 TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10 TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前109.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前
9.0
10 CCU/ml。
毒抗原含量为10 TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为10 TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前109.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前
9.0
10 CCU/ml。
[0061] 本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
[0062] 可以根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。
[0063] 优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
[0064] 本发明还涉及上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染导致的相关疾病的药物中的应用，其中，所述猪圆环病毒2型感染导致的相关疾病为由PCV2不同基因亚型单独感染或它们混合感染导致的相关疾病。
[0065] 本发明的疫苗组合物的猪圆环病毒2型new基因亚型抗原不仅能针对猪圆环病毒2型new基因亚型毒株进行免疫保护，还能针对PCV2其他的基因亚型毒株进行免疫保护，也能有效保护不同PCV2基因亚型之间的混合感染。
[0066] 本发明的疫苗组合物的猪圆环病毒2型抗原具有抗原广谱性，其能针对不同地域来源的猪圆环病毒2型毒株提供完全保护。
[0067] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型感染导致的相关疾病为由PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2new基因亚型单独感染或它们混合感染导致的相关疾病。
[0068] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒2型相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
[0069] 本发明所用术语“猪圆环病毒2型相关疾病”用于指由猪圆环病毒2型感染引起的疾病。非穷举性包括，断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。
[0070] 术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒2型感染时是指抑制猪圆环病毒2型的复制、抑制猪圆环病毒2型的传播或防止猪圆环病毒2型在其宿主体内定居，以及减轻猪圆环病毒2型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
[0071] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0072] 本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0073] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0074] 实施例1猪圆环病毒2型的分离鉴定
[0075] 1、病料来源
[0076] 在国内一免疫商品化PCV2疫苗的猪场,零星出现母猪流产、木乃伊胎增加的现象。受影响的母猪表现出厌食症状，在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。通过免疫组化和定量PCR检测，PCV2阳性。在免疫PCV2商品化疫苗后依然从发病猪组织中检测到PCV2，原因值得深究，为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
[0077] 2、病毒株的分离与培养
[0078] 将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤；滤液在PK15细胞上传代，于37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，培养液经2次冻融后，收获病毒。
[0079] 3、PCR及测序分析鉴定病毒
[0080] 取以上步骤收获的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用PCV2特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出1.7kb目的条带。
[0081] PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列同已经报道过的其他PCV2的同源性都少于96％，氨基酸序列少于94％，进一步分析该毒株介于PCV2b与PCV2d之间，ORF2基因中存在突变或存在不同基因亚型的重组，在遗传进化分析中属于一个新的PCV2基因亚型。
[0082] 实施例2猪圆环病毒2型疫苗株的筛选
[0083] 根据上述分离到的猪圆环病毒2型设计特异性引物，通过定量PCR分析从全国各地免疫商品化PCV2疫苗后零星发病的猪场采集的42份疑似PCV2阳性样品，筛选分离出16株PCV2病毒，在这16株之间，其基因组核苷酸序列同源性高达99.6～100％，Cap蛋白氨基酸序列同源性高达99.5～100％，进一步分析属于同一个基因亚型。经本动物致病性试验及免疫原性测试，最终筛选出1株致病性强、免疫原性良好、广谱性强的PCV2病毒株。该猪圆环病毒2型病毒命名为猪圆环病毒2型HH3株，提交保藏。
[0084] 实施例3猪圆环病毒2型HH3株致病性试验
[0085] 用28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成两组，5头/组，第1组用PCV2HH3株(含105.0TCID50/头)攻毒，肌肉注射，空白对照组接种DMEM培养基，各组仔猪隔离饲养。攻毒后连续观察各组仔猪，根据其临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表1。
[0086] 表1猪圆环病毒2型HH3株对仔猪致病性试验结果
[0087]
[0088]
[0089] 结果显示，攻毒组所有猪只均出现3～5日持续性40.5℃以上高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型病毒，而空白对照组无异常，表明本发明猪圆环病毒2型HH3株接种仔猪可导致仔猪发病，临床表症为典型的猪圆环病毒感染症状。
[0090] 实施例4猪圆环病毒2型HH3株抗原的制备
[0091] 将实施例2筛选到的猪圆环病毒2型HH3株不同代次的培养物按照病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK15传代细胞中，置于37℃吸附30分钟，然后加入细胞维持液，置于37℃培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，于36～37℃培养4～7日后收获细胞培养物，收获的细胞培养物冻融2-3次后，收获病毒液，测定病毒液中病毒毒价。将病毒液用中空纤维(0.5μm～2μm)滤柱过滤，以除去细胞碎片，再加入0.1％～0.2％的甲醛溶液在37℃灭活
24h，灭活完全后的病毒抗原用以制备疫苗。
24h，灭活完全后的病毒抗原用以制备疫苗。
[0092] 实施例5猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗的制备
[0093] 用实施例4制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活抗原缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。疫苗具体配方见表2。
[0094] 表2猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗配方及含量
[0095]
[0096] 实施例6猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗免疫原性试验
[0097] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪25头随机分成5组，5头/组，免疫实施例5制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗。第3～6组分别免疫疫苗1～4，第7组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为HH3株猪圆环病毒105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表3。
[0098] 表3猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗免疫原性试验结果
[0099]
[0100] 结果显示，猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗具有很好的保护效力。
[0101] 实施例7猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗免疫原性比较试验
[0102] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪130头随机分成13组，10头/组，第8～10组免疫实施例5制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗1，第11～13组免疫商品化疫苗D1(PCV2a株，含量为灭活前≥105.0TCID50/ml)，第14～16组免疫商品化疫苗D2(PCV2b株，含量为灭活前≥105.0TCID50/ml)，第17～19组不免疫作为攻毒对照组，第20组不免疫作为空白对照组。第8～10组免疫组注射疫苗2ml/头，1次免疫；第11～16组免疫组注射疫苗2ml/头，2次免疫；第17组对照组接种DMEM培养基2ml/头，1次接种；第18～20组对照组接种DMEM培养基2ml/头，2次接种。免疫后28日进行攻毒，第8组、第11组、第14组、第17组用猪圆环病毒2型HH3株攻毒；第9组、第12组、第15组、第18组用从中国江西分离的猪圆环病毒2a型JX02株强毒株攻毒；第10组、第13组、第16组、第19组用从中国上海分离的猪圆环病
5.0
毒2b型SH03株强毒株攻毒；攻毒剂量为10 TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表4。
5.0
毒2b型SH03株强毒株攻毒；攻毒剂量为10 TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表4。
[0103] 表4猪圆环病毒2型HH3灭活疫苗免疫原性比较试验结果
[0104]
[0105]
[0106] 结果显示，第17～19组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型；
[0107] 第8～10组、12～13组、15～16组各免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV2阴性；第11组4头、第14组3头不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型病毒；
[0108] 第20组空白对照组无异常。表明本发明提供的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗免疫一次，即可对猪只针对PCV2a、PCV2b也能提供有效的、完全的免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV2株；而商品化的无论是PCV2a疫苗，还是PCV2b疫苗均只能提供针对现有基因亚型PCV2a、PCV2b病毒株的完全保护，不能提供针对本发明新的猪圆环病毒2型流行株的完全保护。
[0109] 本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，对于不同基因亚型的PCV2均能提供完全保护。
[0110] 实施例8猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗广谱性保护试验
[0111] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪50头随机分成10组，5头/组，第21～25组免疫实施例5制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗1，第26～30组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第21组、第26组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒2a基因亚型HN06株强毒株攻毒；第22组、第27组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒2b基因亚型JS04株强毒株攻毒；第23组、第28组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒2d基因亚型JL13株强毒株攻毒；第24组、第29组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒2new基因亚型CQ14株强毒株攻毒；第25组、第30组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒2new基因亚型GD15株强毒株攻毒；攻毒剂量为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表5。
[0112] 表5猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗广谱性保护试验结果
[0113]
[0114]
[0115] 结果显示，第26～30组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型病毒；而第21～25组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV2阴性。
[0116] 表明本发明提供的猪圆环病毒2型HH3株灭活疫苗可对猪只针对不同地域来源不同基因亚型的猪圆环病毒2型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV2。本发明的疫苗组合物具有广谱的免疫原性，对于不同地域来源不同基因亚型的猪圆环病毒2型均能提供完全保护。
[0117] 实施例9猪瘟病毒抗原的制备
[0118] 将长成良好单层的对猪瘟病毒兔化弱毒株高敏感的ST细胞用含0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液，进行消化分散，分散后进行细胞计数，接种细胞培养瓶，加入3％犊牛血清的DMEM细胞培养液，同时按照M.O.I.＝0.1接毒剂量加入猪瘟病毒种毒(购自中监所，保藏号AVCC NO.AV1412)，置于37℃温箱中进行培养。培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加含1.5％犊牛血清的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，可连续收毒5次。最后收毒后将各批收毒的抗原混合置于-20℃储藏。
[0119] 实施例10猪伪狂犬病病毒减毒抗原的制备
[0120] 将猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(公开于中国专利申请CN105087506A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的ST细胞培养物中，置于37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，细胞培养液经2次冻融后，收毒，测定毒价，置低温保存。
[0121] 实施例11猪伪狂犬病病毒灭活抗原的制备
[0122] 将猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株(公开于中国专利申请CN103923884A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的ST细胞培养物中，置于
37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，收获的细胞培养液经2次冻融后，收毒，测定毒价。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(v/v)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，收获的细胞培养液经2次冻融后，收毒，测定毒价。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(v/v)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
[0123] 实施例12猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原的制备
[0124] 选取所需数量的Marc-145细胞(已长成单层的细胞转瓶)，弃去生长液，按1％(V/V)接种生产用毒种JXA1-R株(公开于中国专利申请CN101307305A)，加入含2％胎牛血清的DMEM细胞培养液，于37℃旋转(9～12转/小时)培养，在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，当CPE达到70％以上时收获细胞培养物，细胞培养物冻融1次，并经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。
[0125] 实施例13猪细小病毒灭活抗原的制备
[0126] 将猪细小病毒HN-2011株(公开于中国专利申请CN102886043A)培养物按M.O.I.＝0.01接毒剂量接入形成单层的ST细胞培养物中，置于37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，收获的细胞培养液经2次冻融后，收获病毒，测定毒价。向病毒液中加入
10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
[0127] 实施例14副猪嗜血杆菌灭活抗原的制备
[0128] 一级种子的繁殖：副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株(公开于中国专利申请CN102908615A)冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD(TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)平板上，置于37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD(TSB为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)液体培养基中，于37℃培养12～16小时，作为一级种子；
[0129] 二级种子的繁殖：取上述制备的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株一级种子培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，于37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为二级种子；
[0130] 在TSB培养基中，加入0.01～0.05％NAD、5～10％的小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、0.1～5％的葡萄糖，将上述制备的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株二级种子菌液按1％的量加进培养基中分别培养，混匀后置于37℃培养16～18小时，当菌液的浓度OD600达到2.5以上、DO值开始上升、pH值降低到6.5以下时停止培养。
[0131] 培养物进行活菌计数后，按总量的0.2％(V/V)加入37％的甲醛溶液(烟台市双双化工有限公司)，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次，灭活完全后备用。
[0132] 实施例15猪肺炎支原体灭活抗原的制备
[0133] 一级种子的繁殖：冻干菌种HN0613株(公开于中国专利申请CN103031258A)启封后，按10％接种量接种液体培养基，于37℃振荡培养3～7d，待pH值由7.5降至6.8时收获培养物，经纯粹检验，作为一级种子；
[0134] 二级种子的繁殖：取上述制备的一级种子按5％接种量接种于液体培养基，置于37℃振荡培养3～7d，待pH值由7.5降至6.8时收获培养物，经纯粹检验，作为二级种子；
[0135] 液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH2O(二次蒸馏水)360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)(10倍浓缩)40ml，0.25％酚红10ml，马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25m1；
[0136] 将二级种子液以5％(v/v)接种于液体培养基中，置于37℃下振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获菌液。
[0137] 取检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔3～4h搅拌一次，24h后取出，灭活完全后备用。
[0138] 实施例16含猪圆环病毒2型HH3株疫苗组合物的制备
[0139] 分别将实施例9制备的猪瘟病毒减毒抗原、实施例10制备的猪伪狂犬病病毒减毒抗原、实施例12制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为猪瘟病毒活疫苗部分、猪伪狂犬病病毒活疫苗部分、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗部分。
[0140] 用实施例4制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活抗原缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，即为猪圆环病毒2型灭活疫苗部分。使用时用灭活疫苗部分稀释活疫苗部分，两种抗原比例如表6中所示。
[0141] 表6含猪圆环病毒2型HH3株疫苗组合物成分配比(活苗部分)
[0142]
[0143] 分别取实施例4制备的猪圆环病毒2型HH3株灭活抗原、实施例11制备的猪伪狂犬病病毒灭活抗原、实施例13制备的猪细小病毒灭活抗原、实施例14制备的副猪嗜血杆菌灭活抗原、实施例15制备的猪肺炎支原体灭活抗原，将五种抗原根据表7中组合物最终的抗原含量配制，加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。疫苗组合物的具体配方及含量见表7。
[0144] 表7含猪圆环病毒2型HH3株疫苗组合物成分配比(灭活苗部分)
[0145]
[0146]
[0147] 实施例17含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫原性试验
[0148] 1、猪圆环病毒2型部分免疫原性试验
[0149] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪45头随机分成9组，5头/组，免疫实施例16制备的疫苗组合物。第31～38组分别免疫疫苗5～12，第39组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为HH3株猪圆环病毒105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表8。
[0150] 表8含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物PCV2部分免疫原性试验结果[0151]
[0152]
[0153] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫一次仔猪后，能针对猪圆环病毒2型感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株疫苗组合物中猪圆环病毒2型抗原部分具有很好的保护效力，能对猪提供100％的保护，且病毒检测均为阴性。本发明的猪圆环病毒2型HH3株与多种病毒抗原、细菌抗原之间不干扰，能共同组成疫苗组合物后施用。
[0154] 2、猪瘟部分免疫原性试验
[0155] 将20日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、CSFV抗原、抗体阴性的健康仔猪8头随机分成2组，4头/组。第40组免疫实施例16制备的疫苗5，第41组不免疫作为攻毒对照组。将每头份2ml疫苗5稀释3000倍，肌肉注射，每头1ml，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。10～14日后，连同条件相同的攻毒对照组4头，注射猪瘟石门系血毒1.0ml/头(105MLD)，观察16日。结果见表9。
[0156] 表9含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物CSFV部分免疫原性试验结果[0157]组别 免疫头份 保护率 临床症状
40 1/3000 100％(4/4) 无体温反应
41 DMEM培养基1ml 0％(0/4) 4头均死亡
40 1/3000 100％(4/4) 无体温反应
41 DMEM培养基1ml 0％(0/4) 4头均死亡
[0158] 根据中国兽药典标准，检测猪瘟病毒疫苗免疫效力，需将疫苗稀释300倍以上免疫后，再进行检测，而本实施例的结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物1/3000头份(稀释3000倍)免疫仔猪后，能针对猪瘟病毒感染为仔猪提供100％(4/4)保护，且没有体温反应，而攻毒对照仔猪攻毒后全部发病死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的猪瘟病毒抗原部分具有很好的保护效力及安全性。
[0159] 3、猪伪狂犬病病毒部分免疫原性试验
[0160] 将9日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第42组免疫实施例16制备的疫苗6，第43组免疫实施例16制备的疫苗8，第44组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后21日进行攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表10。
[0161] 表10含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物PRV部分免疫原性试验结果[0162]
[0163] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能针对猪伪狂犬病病毒感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的猪伪狂犬病病毒灭活抗原或活病毒抗原部分均具有很好的保护效力。
[0164] 4、猪繁殖与呼吸综合征病毒部分免疫原性试验
[0165] 将4～6周龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRRSV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第45组免疫实施例16制备的疫苗7，第46组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株105.0TCID50/头，每日测温并观察临床症状和死亡情况。具体结果见表11。
[0166] 表11含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物PRRSV部分免疫原性试验结果[0167]
[0168] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病且死亡3头。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原部分具有很好的保护效力。
[0169] 5、猪细小病毒部分免疫原性试验
[0170] 将10～20kg经ELISA检测PCV2、PCV3、PPV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第47组免疫实施例16制备的疫苗9，第48组不免疫作为空白对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，空白对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日，连同空白对照组采血，测定抗体，空白对照组应为阴性(HI抗体效价≤1:8)，免疫组至少4头出现抗体反应，HI抗体效价≥1:64。具体结果见表12。
[0171] 表12含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物PPV部分免疫原性试验结果[0172]
[0173] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，PPV的HI抗体均大于1:64，能针对猪细小病毒感染为仔猪提供100％(5/5)保护。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的猪细小病毒抗原部分具有很好的保护效力。
[0174] 6、副猪嗜血杆菌部分免疫原性试验
[0175] 将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、HPs抗原、抗体阴性的健康仔猪30头随机分成6组，5头/组，第49组、第50组免疫实施例16制备的疫苗10，第51组、第52组免疫实施例16制备的疫苗12，第53组、第54组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35天，取免疫组第49组、第51组，攻毒对照组第53组，用4型JS株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为9.0×109CFU/头；取免疫组第50组、第52组，攻毒对照组第54组，用5型ZJ株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为6.0×
109CFU/头；攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。具体结果见表
13。
109CFU/头；攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。具体结果见表
13。
[0176] 表13含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物HPs部分免疫原性试验结果[0177]
[0178]
[0179] 注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。
[0180] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对副猪嗜血杆菌4型、5型菌感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的副猪嗜血杆菌抗原部分具有很好的保护效力。
[0181] 7、猪肺炎支原体部分免疫原性试验
[0182] 将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、Mhp抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第55组免疫实施例16制备的疫苗11，第56组免疫实施例16制备的疫苗12，第57组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基
2ml/头。免疫后35天，取免疫组第55组、第56组，攻毒对照组第57组，用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察28天，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。具体结果见表14。
2ml/头。免疫后35天，取免疫组第55组、第56组，攻毒对照组第57组，用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察28天，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。具体结果见表14。
[0183] 肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％
[0184] 表14含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物Mhp部分免疫原性试验结果[0185]组别 仔猪数 平均肺病变指数±标准差 肺炎病变减少率
55 5 1.8±1.14b 84.6％
56 5 2.0±0.76b 85.4％
57 5 11.7±3.94a /
55 5 1.8±1.14b 84.6％
56 5 2.0±0.76b 85.4％
57 5 11.7±3.94a /
[0186] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
[0187] 结果显示，含猪圆环病毒2型HH3株疫苗组合物免疫仔猪后，针对猪肺炎支原体感染，各免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与攻毒对照组平均肺病变存在显著差异。表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中的猪肺炎支原体抗原部分具有很好的保护效力。
[0188] 综上，从以上不同疫苗组合物针对PCV2、CSFV、PRV、PRRSV、PPV、HPs 4型菌、HPs 5型菌、Mhp的免疫原性试验结果来看，各疫苗组合物均能达到良好的保护效果，表明本发明提供的含猪圆环病毒2型HH3株抗原的疫苗组合物中不同的抗原成分具有很好的保护效力。本发明的猪圆环病毒2型HH3株抗原的灭活抗原能与不同病原抗原成分共同组成免疫组合物共同施用。
[0189] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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