表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组猪痘病毒载体疫苗
阅读：298发布：2020-05-19
专利汇可以提供表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组猪痘病毒载体疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了以猪痘病毒为表达载体的猪 圆环病毒 2型重组 疫苗 ，该重组疫苗包含猪痘病毒载体和 猪圆环病毒 2型ORF2基因。本发明所述的重组疫苗是以猪痘病毒基因组SPV017～SPV020基因作为插入位点，将猪圆环病毒2型ORF2基因为外源基因克隆入载体pSWE11，得到转移载体pSWE11/P28C；将猪痘病毒和转移载体感染、 转染 PK15细胞，通过同源重组获得表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒。本发明重组猪痘病毒相对已报道的其他位点具有病毒滴度高，能更加高效、稳定表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白等优点，且免疫动物后能产生强烈的免疫应答，诱导免疫动物产生高效价的 抗体 ，并产生良好的免疫保护作用。，下面是表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组猪痘病毒载体疫苗专利的具体信息内容。
1.一种用于预防猪圆环病毒2型所致疾病的重组疫苗，包括重组猪痘病毒；该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和编码猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因，编码猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因以猪痘病毒SPV017～SPV020为缺失位点插入。
2.一种重组猪痘病毒，包含猪痘病毒载体和编码猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因，编码猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因在猪痘病毒载体上以SPV017～SPV020为缺失位点插入。
3.权利要求2所述的重组猪痘病毒，其中所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因序列如SEQ ID：1所示。
4.权利要求2所述的重组猪痘病毒，其中所述的重组猪痘病毒载体为pSWE11，该重组猪痘病毒载体是以猪痘病毒SPV017～SPV020为缺失位点插入外源表达目的基因。
5.权利要求2所述的重组猪痘病毒在制备用于预防和/或治疗猪圆环病毒2型引发疾病药物的用途。
6.根据要求5所述的用途，其中所述的猪圆环病毒2型引发疾病为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤和母猪繁殖障碍。
7.一种制备重组猪痘病毒的方法，该方法包括：
利用特异性的引物对扩增猪圆环病毒2型衣壳蛋白的编码基因ORF2基因；
将ORF2基因克隆入转移载体pSWE11中，然后通过PCR和双酶切鉴定，获得含ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C；
让含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C与猪痘病毒在感染细胞内进行同源重组，获得以SPV017～SPV020缺失的重组猪痘病毒rSWE11/P28C；
纯化重组猪痘病毒rSWE11/P28C。
8. 权利要求7所述的方法，其中所述的特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
9. 权利要求7所述的方法，其中所述的让含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C与猪痘病毒同源重组的具体操作为：用猪痘病毒（SWPV）感染PK15单层细胞，吸附2小时后用脂质体转染法加入转移载体pSWE11/P28C，二者发生同源重组；
PK15细胞在常规条件下培养4天后，反复冻融3次，获得原始重组猪痘病毒rSWE11/P28C；纯化重组猪痘病毒rSWE11/P28C的具体操作为：将所述重组猪痘病毒rSWE11/P28C进行10倍梯度稀释，接种PK15单层细胞后继续培养4天，在荧光显微镜下标记单个带绿色荧光蚀斑，挑取单独的病毒蚀斑，反复冻融后适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复8次纯化，直至获得能够稳定遗传的重组猪痘病毒。
表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组猪痘病毒载体疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可引起猪发生猪圆环病毒病（PCVD），猪圆环病毒病在临床上有多种表现形式，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤及母猪繁殖障碍等疾病。目前，PCVD在我国流行范围很广泛，给养猪业造成较大的经济损失。猪圆环病毒2型（PCV2）基因组大小为1767bp或1768bp。对其基因组分析得出有200bp以上大小的ORF有11个，编码蛋白分子量在2～36KDa之间；
ORF1为PCV2最大的阅读框，共有945个碱基，位于病毒的正股DNA上，编码病毒复制相关蛋白（Rep蛋白）和截短的Rep′蛋白：Rep蛋白有312aa，分子量约为35.8KDa，与病毒基因组的滚环复制有关；Rep′蛋白有168aa，分子量约为19KDa。Rep蛋白与Rep′蛋白的正常表达，病毒才能启动正常复制。ORF2为PCV2病毒第二大阅读框，共有702或705个碱基，编码病毒的核衣壳蛋白。衣壳蛋白分子量约为27.8KDa，是PCV2的主要免疫原性蛋白，所以在疾病诊断和疫苗研究起着重要作用，目前针对PCV2疫苗的研究主要集中在衣壳蛋白。目前，已有多种利用PCV2的衣壳蛋白编码基因构建用于预防猪圆环病毒的疫苗，如杆状病毒、原核表达质粒、乳酸链球菌等。
ORF1为PCV2最大的阅读框，共有945个碱基，位于病毒的正股DNA上，编码病毒复制相关蛋白（Rep蛋白）和截短的Rep′蛋白：Rep蛋白有312aa，分子量约为35.8KDa，与病毒基因组的滚环复制有关；Rep′蛋白有168aa，分子量约为19KDa。Rep蛋白与Rep′蛋白的正常表达，病毒才能启动正常复制。ORF2为PCV2病毒第二大阅读框，共有702或705个碱基，编码病毒的核衣壳蛋白。衣壳蛋白分子量约为27.8KDa，是PCV2的主要免疫原性蛋白，所以在疾病诊断和疫苗研究起着重要作用，目前针对PCV2疫苗的研究主要集中在衣壳蛋白。目前，已有多种利用PCV2的衣壳蛋白编码基因构建用于预防猪圆环病毒的疫苗，如杆状病毒、原核表达质粒、乳酸链球菌等。
[0003] 痘病毒载体作为基因工程中的重要工具，其应用极其广泛，已成功地表达了来源于植物、动物，乃至人类的很多基因。作为病毒疫苗载体，痘病毒具有以下优点：（1）便于操作和使用；（2）痘病毒的基因组大，容易组装，可以容纳超过25 kb的外源DNA；（3）痘病毒载体的外源基因表达产物能诱导抗外来抗原的抗体和细胞毒性T细胞反应，接种一次就能获得长期的免疫效果；（4）痘病毒具有严格的宿主特异性，病毒本身不会对免疫接种的动物造成疾病；（5）能够正确的表达目的蛋白，保证蛋白的真实性。因此痘病毒具有潜力成为安全有效的疫苗载体。目前，常用的重组痘病毒表达载体主要有：痘苗病毒（VV）、禽痘病毒、山羊痘病毒等。迄今未见以猪痘病毒SPV017～SPV020为缺失位点构建表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组猪痘病毒的报道。
[0004] 目前已报道关于猪痘病毒作为表达载体表达外源基因的插入位点有3个，分别是SPV063（TK基因）、SPV043和SPV020～SPV021间非编码区。例如以猪痘病毒（SWPV）为载体，以SPV063（TK基因）作为外源基因插入和缺失位点，表达猪瘟病毒E2蛋白；以猪痘病毒SPV043作为插入位点表达猫白血病病毒Gag和Env基因；以猪痘病毒SPV020～SPV021间非编码区为插入位点表达圆环病毒2型ORF2基因。但以猪痘病毒SPV017～SPV020作为缺失位点构建的重组猪痘病毒载体疫苗乃本发明人独创。
[0005] 本发明人经过大量实验成功构建了以猪痘病毒SPV017～SPV020为缺失位点表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗。在实验过程中发现，由于SPV017～SPV020缺失不影响病毒增殖，产生的重组病毒滴度比其他缺失位点（比如SPV020～SPV021间非编码区、SPV043、SPV063）显著要高，能在免疫动物体内进行有效的增殖，免疫后产生的抗体效价明显高于其他缺失位点。因而以其作为载体构建的疫苗相对于其他载体或其他缺失位点取得了更好的免疫效果。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种能够有效预防猪圆环病毒病的重组猪痘病毒载体疫苗及其制备方法。
[0007] 本发明提供了一种重组猪痘病毒（rSWE11/P28C），该重组猪痘病毒是在猪痘病毒载体SPV017～SPV020缺失位点插入本发明所述的ORF2基因重组制备而成。
[0008] 在本发明的技术方案中，本发明所述的ORF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009] 本发明通过动物免疫试验发现：本发明提供的重组猪痘病毒能够在免疫动物体内表达目的蛋白（PCV2衣壳蛋白），能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用。
[0010] 本发明提供了一个表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组疫苗，该重组疫苗包含猪痘病毒载体和本发明提供的ORF2基因。
[0011] 在本发明的技术方案中，所述的猪痘病毒载体为pSWE11，该载体是以猪痘病毒SPV017～SPV020作为缺失位点插入外源基因。
[0012] 本发明还涉及所述的重组疫苗在制备预防和/或治疗猪圆环病毒引发的疾病药物的用途，优选用于制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型引发的疾病药物的用途。所述的猪圆环病毒2型引发疾病为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征和仔猪先天性震颤等。
[0013] 本发明所述免疫的接种途径包括但不限于肌肉注射等。
[0014] 本发明提供了一种制备重组猪痘病毒的技术方案，该方案是这样实现：（1）利用基因工程方法构建转移载体pSWE11；
（2）利用特异性引物对扩增猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白的编码基因ORF2；
（3）将ORF2基因克隆入转移载体pSWE11中，通过PCR和双酶切鉴定，获得含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C；
（4）让含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C与猪痘病毒亲本病毒同源重组，获得重组猪痘病毒rSWE11/P28C；
（5）纯化重组猪痘病毒rSWE11/P28C。
（2）利用特异性引物对扩增猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白的编码基因ORF2；
（3）将ORF2基因克隆入转移载体pSWE11中，通过PCR和双酶切鉴定，获得含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C；
（4）让含有ORF2基因的转移载体pSWE11/P28C与猪痘病毒亲本病毒同源重组，获得重组猪痘病毒rSWE11/P28C；
（5）纯化重组猪痘病毒rSWE11/P28C。
[0015] 所述的特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
[0016] 在本发明的一个优选技术方案中，所述让含有ORF2基因的转移载体pSWE11与猪痘病毒同源重组的具体操作为：用猪痘病毒亲本病毒（SWPV）感染PK15单层细胞，吸附2小时后用脂质体转染法加入转移载体pSWE11/P28C，二者发生同源重组。PK15细胞在常规条件下培养4天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪痘病毒rSWE11/P28C。
[0017] 在本发明的一个优选技术方案中，所述纯化重组猪痘病毒rSWE11/P28C的具体操作为：将所述重组猪痘病毒rSWE11/P28C进行10倍倍比稀释，接种PK15单层细胞后继续培养4天，在荧光显微镜下标记单个带绿色荧光蚀斑，无菌操作挑取单个的病毒蚀斑，反复冻融后适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复8次，直至最后获得能够稳定遗传的重组猪痘病毒。
[0018] 另一方面，本发明提供了一种将上述重组猪痘病毒制成疫苗的方法，该方法包括：（1）将纯化的重组猪痘病毒rSWE11/P28C在PK15细胞上连续传代35次，检测其ORF2
8.5
基因的表达情况，至ORF2基因稳定表达，且重组猪痘病毒的毒价稳定在10 PFU/mL。
8.5
基因的表达情况，至ORF2基因稳定表达，且重组猪痘病毒的毒价稳定在10 PFU/mL。
[0019] 扩大培养时，以重组猪痘病毒rSWE11/P28C按5MOI接种单层PK15细胞，培养3～4天，当细胞病变达到80％左右时收毒，反复冻融3次，即可获得表达ORF2基因的重组猪痘病毒载体疫苗。
[0020] 本发明有益效果1、本发明成功构建了表达圆环病毒2型ORF2基因的重组疫苗，由于该重组猪痘病毒更容易在猪体内进行复制，在猪体内不断表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白，刺激机体产生中和抗体，提供持续的保护力。因此，相对于其他类型猪圆环病毒2型疫苗（如其它载体构建的基因工程疫苗或猪圆环病毒2型全病毒灭活苗等）具有更强更持久的保护力。
[0021] 2、本发明构建的表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪痘病毒是以猪痘病毒SPV017～SPV020作为缺失位点插入ORF2基因，试验证明，以该缺失位点构建的重组猪痘病毒能对外源蛋白高效、稳定表达；种毒效价高，不影响病毒增殖，种毒的效价稳定8.5 7.8
在10 PFU/mL，相对其它插入位点：比如以SPV020～SPV021间非编码区（10 PFU/mL）、
7.0 7.2
SPV043（10 PFU/mL）、SPV063（TK基因）（10 PFU/mL）为缺失位点的种毒毒价要高。动物免疫试验证明，本发明所述重组猪痘病毒载体疫苗能够产生针对猪圆环病毒2型衣壳蛋白的高效价中和抗体，且抗体水平比其杆状病毒载体构建的基因工程疫苗、全病毒灭活苗或以SPV020～SPV021间非编码区、SPV043、SPV063（TK基因）作为缺失位点构建的重组猪痘病毒要高，因此，具有很好的免疫保护作用。
在10 PFU/mL，相对其它插入位点：比如以SPV020～SPV021间非编码区（10 PFU/mL）、
7.0 7.2
SPV043（10 PFU/mL）、SPV063（TK基因）（10 PFU/mL）为缺失位点的种毒毒价要高。动物免疫试验证明，本发明所述重组猪痘病毒载体疫苗能够产生针对猪圆环病毒2型衣壳蛋白的高效价中和抗体，且抗体水平比其杆状病毒载体构建的基因工程疫苗、全病毒灭活苗或以SPV020～SPV021间非编码区、SPV043、SPV063（TK基因）作为缺失位点构建的重组猪痘病毒要高，因此，具有很好的免疫保护作用。
[0022] 3、本发明构建的重组猪痘病毒载体疫苗相对于目前同类疫苗具有稳定性好、制备简单、成本低、免疫效果好等优点，适用于大规模生产。
[0024] 图1为转移载体pSWE11/P28C结构示意图。其中，SPV017～SPV020-L和SPV017～SPV020-R分别为猪痘病毒的左、右同源交换臂；P11和P28为痘病毒启动子，EGFP为标记基因；ORF2为目的蛋白基因；图2 为以SPV063（TK基因）（a）、SPV043（b）和SPV020～SPV021间非编码区（c）分别为缺失位点构建的重组转移载体；
图3为猪痘病毒的SPV017-SPV020左、右同源臂和P11-EGFP的PCR扩增结果；
图4为猪圆环病毒2型ORF2基因PCR扩增结果；
图5为转移载体pSWE11/P28C酶切产物电泳检测结果；
图6为western blot检测衣壳蛋白在重组猪痘病毒rSWE11/P28C中的表达情况，其中泳道M：预染蛋白Marker，泳道1：感染rSWE11/P28C的PK15细胞，泳道2：感染以SPV063（TK基因）缺失位点表达ORF2重组猪痘病毒的PK15细胞，泳道3：猪痘病毒亲本病毒感染PK15细胞，泳道4：正常无病毒感染PK15细胞；
图7图示的是荧光条件下检测重组猪痘病毒rSWE11/P28C在PK15细胞中的表达情况，其中（A）为转移载体pSWE11-28C与猪痘病毒亲本病毒转染PK15细胞，能够看到明显的单个绿色荧光斑；图（B）纯化的重组猪痘病毒rSWE11/P28C感染PK15细胞，可见绿色荧片；
图8图示的是免疫小鼠血清抗体效价测定结果；
图9图示的是免疫玉山黑猪后血清中抗体水平。
图3为猪痘病毒的SPV017-SPV020左、右同源臂和P11-EGFP的PCR扩增结果；
图4为猪圆环病毒2型ORF2基因PCR扩增结果；
图5为转移载体pSWE11/P28C酶切产物电泳检测结果；
图6为western blot检测衣壳蛋白在重组猪痘病毒rSWE11/P28C中的表达情况，其中泳道M：预染蛋白Marker，泳道1：感染rSWE11/P28C的PK15细胞，泳道2：感染以SPV063（TK基因）缺失位点表达ORF2重组猪痘病毒的PK15细胞，泳道3：猪痘病毒亲本病毒感染PK15细胞，泳道4：正常无病毒感染PK15细胞；
图7图示的是荧光条件下检测重组猪痘病毒rSWE11/P28C在PK15细胞中的表达情况，其中（A）为转移载体pSWE11-28C与猪痘病毒亲本病毒转染PK15细胞，能够看到明显的单个绿色荧光斑；图（B）纯化的重组猪痘病毒rSWE11/P28C感染PK15细胞，可见绿色荧片；
图8图示的是免疫小鼠血清抗体效价测定结果；
图9图示的是免疫玉山黑猪后血清中抗体水平。
具体实施方式
[0025] 下列实施例的给出是为了更好的理解和阐述本发明，而决不应理解为对本发明的任何限制。
[0026] 实施例1 通用转移载体pSWE11的构建根据NCBI唯一收录的猪痘病毒（GenBank：AF410153.1）基因序列设计两对特异性引物，分别扩增SPV017-SPV020左右同源臂：
SPV017-020-L11（基因组中的位置：11134bp-11158bp）
5ˊ-CGAGCTC（SacⅠ）ACTTCTGTTTAGATTCACAGCATTT-3ˊ
SPV017-020-L12（基因组中的位置：12280bp-12300bp）
5ˊ-CGGGATCC（BamHⅠ）ACGATAGCAGCGTTGGTGTT-3
SPV017-020-R11（基因组中的位置：13365bp-13384bp）
5ˊ-GCTCTAGA（XbaⅠ）CTCGAG（XhoⅠ）GTCGAC（SalⅠ）
GTGGGTGGTGTAGACTGTGT-3ˊ
SPV017-020-R12（基因组中的位置：14416bp-14436bp）
5ˊ-CCAAGCTT（HindIII）TTCGATTTTTCACAGGTGGCT-3ˊ
TM
用病毒核酸提取试剂盒（QIAGEN）提取猪痘病毒（ATCC：VR-363 ）的基因组作为模板，用上述引物通过PCR方法分别扩增得到转移载体的左右同源臂SPV017-020-L和SPV017-020-R（扩增结果见图3）。PCR扩增产物经胶回收纯化后，SPV017-020-R片段插入到pUC19质粒的HindIII和XbaⅠ酶切位点，同时将SPV017-020-L片段插入到pUC19质粒的BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点，构建出pSW-R-L。
SPV017-020-L11（基因组中的位置：11134bp-11158bp）
5ˊ-CGAGCTC（SacⅠ）ACTTCTGTTTAGATTCACAGCATTT-3ˊ
SPV017-020-L12（基因组中的位置：12280bp-12300bp）
5ˊ-CGGGATCC（BamHⅠ）ACGATAGCAGCGTTGGTGTT-3
SPV017-020-R11（基因组中的位置：13365bp-13384bp）
5ˊ-GCTCTAGA（XbaⅠ）CTCGAG（XhoⅠ）GTCGAC（SalⅠ）
GTGGGTGGTGTAGACTGTGT-3ˊ
SPV017-020-R12（基因组中的位置：14416bp-14436bp）
5ˊ-CCAAGCTT（HindIII）TTCGATTTTTCACAGGTGGCT-3ˊ
TM
用病毒核酸提取试剂盒（QIAGEN）提取猪痘病毒（ATCC：VR-363 ）的基因组作为模板，用上述引物通过PCR方法分别扩增得到转移载体的左右同源臂SPV017-020-L和SPV017-020-R（扩增结果见图3）。PCR扩增产物经胶回收纯化后，SPV017-020-R片段插入到pUC19质粒的HindIII和XbaⅠ酶切位点，同时将SPV017-020-L片段插入到pUC19质粒的BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点，构建出pSW-R-L。
[0027] 通用穿梭质粒pSWE11的构建以质粒EGFP-N1为模板，用引物：
P11-EGFP1:
5ˊ- GCTCTAGA（XbaⅠ）TAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATG
GTGAGCAAGGGCGAG－3ˊ
P11-EGFP2:
5ˊ－CGGGATCC（BamHⅠ）TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG－3ˊ
其中上游引物（P11-EGFP1）中带有P11启动子序列，扩增出绿色荧光蛋白EGFP的基因，通过酶切、连接等步骤，将其克隆到载体pSW-R-L中的XbaⅠ和 BamHⅠ位点，形成转移载体pSWE11。
P11-EGFP1:
5ˊ- GCTCTAGA（XbaⅠ）TAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATG
GTGAGCAAGGGCGAG－3ˊ
P11-EGFP2:
5ˊ－CGGGATCC（BamHⅠ）TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG－3ˊ
其中上游引物（P11-EGFP1）中带有P11启动子序列，扩增出绿色荧光蛋白EGFP的基因，通过酶切、连接等步骤，将其克隆到载体pSW-R-L中的XbaⅠ和 BamHⅠ位点，形成转移载体pSWE11。
[0028] 实施例2 猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析2.1 PCR引物设计及合成
根据NCBI公布的猪圆环病毒2型中国分离株参考基因序列（GenBank：HQ693093）设计了一对扩增ORF2基因的特异性引物，在上游引物的5'端加上P28启动子序列，同时含有限制性内切酶XhoⅠ和 SalⅠ的酶切位点。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
根据NCBI公布的猪圆环病毒2型中国分离株参考基因序列（GenBank：HQ693093）设计了一对扩增ORF2基因的特异性引物，在上游引物的5'端加上P28启动子序列，同时含有限制性内切酶XhoⅠ和 SalⅠ的酶切位点。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0029] P28-ORF2-1：5' – gc CTCGAG（XhoⅠ）TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGACGTATCCAAGGAGGCG - 3'
P28-ORF2-2：
5' – gc GTCGAC（SalⅠ）TTATCACTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGT - 3'
2.2 PCR扩增
10×EasyTaq Buffer 5μL，dNTPs（2.5mM/L）4μL，P28-ORF2-1（20μM/L）0.5μL，P28-ORF2-2（20μM/L）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，纯化的猪圆环病毒2型核酸模板
2μL，用灭菌的去离子水补至总体积50μL。PCR仪上进行扩增，反应条件为：95℃预变性
5min，95℃变性45s，54℃复性1min，72℃延伸1min,共30个循环；最后72℃延伸10mim，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
P28-ORF2-2：
5' – gc GTCGAC（SalⅠ）TTATCACTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGT - 3'
2.2 PCR扩增
10×EasyTaq Buffer 5μL，dNTPs（2.5mM/L）4μL，P28-ORF2-1（20μM/L）0.5μL，P28-ORF2-2（20μM/L）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，纯化的猪圆环病毒2型核酸模板
2μL，用灭菌的去离子水补至总体积50μL。PCR仪上进行扩增，反应条件为：95℃预变性
5min，95℃变性45s，54℃复性1min，72℃延伸1min,共30个循环；最后72℃延伸10mim，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
[0030] 2.3 PCR产物回收与纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下完整、单一的目的条带，用DNA胶回收纯化试剂盒回收目的片段。具体操作步骤按天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒说明书进行。图4为猪圆环病毒2型ORF2基因PCR扩增结果。
[0031] 2.4 PCR产物酶切与纯化酶切反应总体积为50μL：PCR回收片段30μL，10×buffer Tango 5μL，SalⅠ 2μL， XhoⅠ2μL，补足灭菌去离子水至50μL。37℃水浴2h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
[0032] 2.5目的片段ORF2与转移载体pSWE11的连接ORF2酶切回收产物6μL，载体pSWE11酶切回收产物2μL，10×ligation buffer1μL，T4 DNA连接酶1μL，混匀后4℃连接过夜。连接产物pSWE11/P28C转化大肠杆菌TOP10。
pSWE11/P28C具体结构见图1。图5为转移载体pSWE11/P28C酶切产物电泳检测结果。
pSWE11/P28C具体结构见图1。图5为转移载体pSWE11/P28C酶切产物电泳检测结果。
[0033] 2.6 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备和转化感受态细胞的制备及连接产物的转化步骤详见《分子克隆 实验指南》。
[0034] 2.7 重组质粒的提取和鉴定用质粒提取试剂盒提取重组质粒pSWE11/P28C（具体操作步骤按天根生化科技有限公司质粒提取试剂盒说明书进行），PCR和双酶切鉴定中都可以看到目的条带。
[0035] 2.8 目的基因ORF2基因序列分析测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司协助完成。测序结果如SEQ ID NO：1所示，克隆的目的基因ORF2为705bp，符合载体阅读框要求。
[0036] 实施例3 含有ORF2基因的重组猪痘病毒的制备及测定3.1 PK15细胞准备
PK-15细胞每隔20h左右传代一次，保持细胞对数生长期，转染前天取一瓶细胞，按一瓶细胞接六孔板六孔比例，每孔含2mL培养液，37℃，5%CO2培养20h左右。
PK-15细胞每隔20h左右传代一次，保持细胞对数生长期，转染前天取一瓶细胞，按一瓶细胞接六孔板六孔比例，每孔含2mL培养液，37℃，5%CO2培养20h左右。
[0037] 3.2 重组猪痘病毒rSWE 11/P28C的获取TM
取猪痘病毒株VR-363 病毒液，用5%DMEM稀释，按0.05MOI的猪痘病毒感染PK15单层细胞，吸附2h，期间每隔20min摇晃一次。病毒吸附最后半小时前开始稀释质粒及脂质体。
转染按Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen公司）操作说明书操作。37℃培养箱孵育
6h后（静止不动）弃掉上清，换上10%DMEM 2mL继续培养。细胞培养4d后有病变时收毒，反复冻融3次，收集重组病毒rSWE11/P28C原始液。
取猪痘病毒株VR-363 病毒液，用5%DMEM稀释，按0.05MOI的猪痘病毒感染PK15单层细胞，吸附2h，期间每隔20min摇晃一次。病毒吸附最后半小时前开始稀释质粒及脂质体。
转染按Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen公司）操作说明书操作。37℃培养箱孵育
6h后（静止不动）弃掉上清，换上10%DMEM 2mL继续培养。细胞培养4d后有病变时收毒，反复冻融3次，收集重组病毒rSWE11/P28C原始液。
[0038] 3.3 重组猪痘病毒的纯化将原始重组病毒液按50、500、5000倍稀释，每孔接毒900µL，病毒吸附时间3-4h，期间轻晃摇匀3次。病毒吸附完成后，弃掉感染液，加含10%小牛血清DMEM 0.5%低熔点琼脂糖
3mL，室温放置30min左右后37℃ 5％CO2继续培养4d后，在荧光显微镜下，标记发荧光的单个蚀斑。用高压灭菌的200µL去尖枪头挑取单个的斑溶于200µL维持液中，反复冻融2次作为下一轮纯化和增值。由PCR鉴定是否纯化到，一般需要纯化7～8轮。得本发明重组猪痘病毒。
3mL，室温放置30min左右后37℃ 5％CO2继续培养4d后，在荧光显微镜下，标记发荧光的单个蚀斑。用高压灭菌的200µL去尖枪头挑取单个的斑溶于200µL维持液中，反复冻融2次作为下一轮纯化和增值。由PCR鉴定是否纯化到，一般需要纯化7～8轮。得本发明重组猪痘病毒。
[0039] 3.4 重组猪痘病毒滴度的测定及其与SPV020～SPV021间非编码区、SPV063（TK基因）缺失位点病毒滴度比较取3.3所得的本发明重组猪痘病毒（即插入位点为猪痘病毒基因组12301-13364位置，具体见图1）。
[0040] 对照组1为：SPV063（TK基因）缺失的重组病毒（即插入位点为猪痘病毒基因组55894位置，具体见图2-a）。
[0041] 对照组2为：SPV020～SPV021间非编码区基因缺失的重组病毒（即插入位点为猪痘病毒基因组13268-13457位置，具体见图2-b）。
[0042] 左臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：LF1：5’-GAATTCTAAATCTACTTCTTCAACGG-3’（12121-12140）
LF2：5’-GGTACCTATAACTACTAGGTCCACAC-3’（13249-13268）
右臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：
RF1：5’-GTCGACAGGCGATTATTTATGTTATTA-3’（13457-13477）
RF2：5’-AAGCTTATTTTTATCCTATTGTTGTTC-3’（14811-14832）
对照组3为：SPV043基因缺失的重组病毒（即插入位点为猪痘病毒基因组39130-39319位置，具体见图2-c）。
LF2：5’-GGTACCTATAACTACTAGGTCCACAC-3’（13249-13268）
右臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：
RF1：5’-GTCGACAGGCGATTATTTATGTTATTA-3’（13457-13477）
RF2：5’-AAGCTTATTTTTATCCTATTGTTGTTC-3’（14811-14832）
对照组3为：SPV043基因缺失的重组病毒（即插入位点为猪痘病毒基因组39130-39319位置，具体见图2-c）。
[0043] 左臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：LF1：5’- CGACAGAGCTCCTGGTCTTTTATCACCTCCCTG-3’（38155-38180）
LF2：5’- TACGCGGCCGCATCACGTTATACTCTGCCTATGTGAGG-3’（39103-39129）
右臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：
RF1：5’- GTGAGATCTGTCATTTATATAAATTAATTCTAAATAATATAGG-3’（39320-39353）RF2：5’- CCAAGCTTTTCTATAGACGATATTGCAAAATCCTGG-3’（40312-40339）
按病毒学操作手册方法，分别用含双抗（青霉素和链霉素）的DHanks 缓冲液将病毒作
10 倍梯度稀释。
LF2：5’- TACGCGGCCGCATCACGTTATACTCTGCCTATGTGAGG-3’（39103-39129）
右臂引物在猪痘病毒基因组中的位置：
RF1：5’- GTGAGATCTGTCATTTATATAAATTAATTCTAAATAATATAGG-3’（39320-39353）RF2：5’- CCAAGCTTTTCTATAGACGATATTGCAAAATCCTGG-3’（40312-40339）
按病毒学操作手册方法，分别用含双抗（青霉素和链霉素）的DHanks 缓冲液将病毒作
10 倍梯度稀释。
[0044] 然后分别接种于长满单层PK15细胞的96 孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔接种100 μL。同时设定阴、阳性对照。37 ℃ 5% CO2 温箱培养2.5h后，换5％DMEM继8.5
续培养。每天观察细胞病变，并按Reed-Muench法计算病毒滴度。本重组病毒滴度为10
7.2
PFU/mL，而SPV063（TK基因）缺失的重组病毒滴度为10 PFU/mL，SPV020～SPV021间非
7.8 7.0
编码区重组病毒滴度为10 PFU/mL，SPV043缺失的重组病毒滴度为10 PFU/mL，表明本重组猪痘病毒种毒滴度显著高于对照组1、对照组2和对照组3的重组病毒。
续培养。每天观察细胞病变，并按Reed-Muench法计算病毒滴度。本重组病毒滴度为10
7.2
PFU/mL，而SPV063（TK基因）缺失的重组病毒滴度为10 PFU/mL，SPV020～SPV021间非
7.8 7.0
编码区重组病毒滴度为10 PFU/mL，SPV043缺失的重组病毒滴度为10 PFU/mL，表明本重组猪痘病毒种毒滴度显著高于对照组1、对照组2和对照组3的重组病毒。
[0045] 3.5 重组猪痘病毒的PCR检测取分别接种重组猪痘病毒rSWE11/P28C和亲本猪痘病毒的PK15细胞各一瓶，用病毒核酸提取试剂盒（QIAGEN）提取病毒DNA后分别用引物对P28-ORF2-1/ P28-ORF2-2进行PCR扩增。扩增产物电泳检测结果表明重组猪痘病毒中含有ORF2基因片段，而对照组的亲本猪痘病毒中扩增不出ORF2基因。
[0046] 3.6 绿色荧光蛋白检测在荧光显微镜下可以发现：接种重组猪痘病毒rSWE11/P28C的PK15细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光斑，而接种亲本猪痘病毒的PK15细胞则未见荧光斑。图7图示的是荧光条件下检测重组猪痘病毒rSWE11/P28C在PK15细胞中的表达情况，其中（A）为转移载体pSWE11-28C与猪痘病毒亲本病毒转染PK15细胞，能够看到明显的单个绿色荧光斑；图（B）纯化的重组猪痘病毒rSWE11/P28C感染PK15细胞，可见绿色荧片。
[0047] 3.7 检测目的蛋白（ORF2）的表达及与其他缺失位点表达量比较取重组猪痘病毒rSWE11/P28C纯化后第4代病毒液，感染PK15细胞，培养72h待细胞出现病变后，收集上清液，用细胞刮刀将细胞刮下并收集细胞。用不完全DMEM 3500r/min离心10min洗涤细胞3次后，最后加入300µL不完全DMEM悬浮细胞，反复冻融2次。加入4×上样缓冲液75µL，沸水煮沸10min后用于SDS-PAGE电泳，同时设以SPV063（TK基因）缺失位点构建表达ORF2的重组猪痘病毒、猪痘病毒亲本病毒和PK15正常细胞空白对照；SDS-PAGE电泳结束后，取出蛋白电泳胶，将PVDF膜盖于胶上，60V电转2h；转完后将膜置于脱色摇床上用PBST洗涤2次；将PVDF膜移置另一平皿中，加入5%脱脂奶室温下置脱色摇床上封闭
2h；将用His-ORF2免疫后小鼠血清用PBST稀释至500倍，将封闭后的PVDF膜置于一抗中孵育2h后，在脱色摇床洗涤3次，每次10min；同上方法准备羊抗鼠二抗，按1∶3000倍稀释后与膜接触，室温下孵育1.5h，在脱色摇床中用PBST洗涤3次，每次10min；最后将洗涤后的PVDF膜浸入配置好的DAB显色液中避光显色，直至出现明显的条带，用ddH2O终止反应，拍照。结果（图6）表明目的蛋白在重组猪痘病毒中均有表达，但SPV017-SPV020缺失位点构建的重组猪痘病毒的表达量比SPV063（TK基因）缺失位点构建的重组猪痘病毒表达量要高，而在猪痘病毒亲本病毒和正常PK15细胞中则没有目的蛋白出现。
2h；将用His-ORF2免疫后小鼠血清用PBST稀释至500倍，将封闭后的PVDF膜置于一抗中孵育2h后，在脱色摇床洗涤3次，每次10min；同上方法准备羊抗鼠二抗，按1∶3000倍稀释后与膜接触，室温下孵育1.5h，在脱色摇床中用PBST洗涤3次，每次10min；最后将洗涤后的PVDF膜浸入配置好的DAB显色液中避光显色，直至出现明显的条带，用ddH2O终止反应，拍照。结果（图6）表明目的蛋白在重组猪痘病毒中均有表达，但SPV017-SPV020缺失位点构建的重组猪痘病毒的表达量比SPV063（TK基因）缺失位点构建的重组猪痘病毒表达量要高，而在猪痘病毒亲本病毒和正常PK15细胞中则没有目的蛋白出现。
[0048] 实施例4 重组疫苗的免疫保护实验4.1 重组猪痘病毒免疫小鼠及免疫效果比较试验
7.5
取40只4周龄的SPF级ICR小鼠随机分成8组，每组5只小鼠；第一组用2*10 PFU
7.5
的本发明构建的重组猪痘病毒rSWE11/P28C肌肉注射免疫；第二组用2*10 PFU以SPV063
7.5
（TK基因）为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第三组用2*10 PFU以SPV020～
7.5
SPV021间非编码区为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第四组用2*10 PFU以SPV043为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第五组用某进口猪圆环病毒2型疫苗（杆状病毒表达）肌肉注射免疫；第六组用某国产猪圆环病毒2型灭活疫苗肌肉注射免
7.5
疫；第七组用2*10 PFU的猪痘病毒亲本病毒肌肉注射免疫；第八组用灭菌生理盐水肌肉注射免疫作为空白对照组；每组小鼠免疫三次，初次免疫后的第14天和第35天按相同方法分别进行二免和三免；每天观察并记录免疫小鼠反应；在初次免疫前及免疫后第1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12周通过尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体效价。
7.5
取40只4周龄的SPF级ICR小鼠随机分成8组，每组5只小鼠；第一组用2*10 PFU
7.5
的本发明构建的重组猪痘病毒rSWE11/P28C肌肉注射免疫；第二组用2*10 PFU以SPV063
7.5
（TK基因）为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第三组用2*10 PFU以SPV020～
7.5
SPV021间非编码区为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第四组用2*10 PFU以SPV043为缺失位点构建的重组猪痘病毒肌肉注射免疫；第五组用某进口猪圆环病毒2型疫苗（杆状病毒表达）肌肉注射免疫；第六组用某国产猪圆环病毒2型灭活疫苗肌肉注射免
7.5
疫；第七组用2*10 PFU的猪痘病毒亲本病毒肌肉注射免疫；第八组用灭菌生理盐水肌肉注射免疫作为空白对照组；每组小鼠免疫三次，初次免疫后的第14天和第35天按相同方法分别进行二免和三免；每天观察并记录免疫小鼠反应；在初次免疫前及免疫后第1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12周通过尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体效价。
[0049] 结果表明（图8）：用本发明构建的重组猪痘病毒免疫小鼠血清抗体效价明显高于其他对照组和实验组。
[0050] 4.2 重组猪痘病毒rSWE11/P28C免疫玉山黑猪产生抗体试验取30头30日龄左右且猪圆环病毒2型血清抗体为阴性的玉山黑猪，随机分成六组，
7.5
每组5头。第一组用5*10 PFU的本发明重组猪痘病毒rSWE11/P28C通过颈部肌肉注射进
7.5
行免疫；第二组用5*10 PFU的SPV063（TK基因）缺失重组痘病毒颈部肌肉注射免疫；第
7.5
三组用5*10 PFU的SPV020～SPV021间非编码区基因缺失重组痘病毒颈部肌肉注射免
7.5
疫；第四组用5*10 PFU的SPV043的猪痘病毒亲本病毒以同样的方式进行免疫；第五组用
7.5
5*10 PFU的猪痘病毒亲本病毒以同样的方式进行免疫；第六组为阴性对照组，肌肉注射等量的灭菌生理盐水。初次免疫后间隔14天按相同方法进行二免，在初次免疫前及免疫后第
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周通过尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测圆环病毒抗体效价。
7.5
每组5头。第一组用5*10 PFU的本发明重组猪痘病毒rSWE11/P28C通过颈部肌肉注射进
7.5
行免疫；第二组用5*10 PFU的SPV063（TK基因）缺失重组痘病毒颈部肌肉注射免疫；第
7.5
三组用5*10 PFU的SPV020～SPV021间非编码区基因缺失重组痘病毒颈部肌肉注射免
7.5
疫；第四组用5*10 PFU的SPV043的猪痘病毒亲本病毒以同样的方式进行免疫；第五组用
7.5
5*10 PFU的猪痘病毒亲本病毒以同样的方式进行免疫；第六组为阴性对照组，肌肉注射等量的灭菌生理盐水。初次免疫后间隔14天按相同方法进行二免，在初次免疫前及免疫后第
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周通过尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测圆环病毒抗体效价。
[0051] 结果表明（图9）：免疫四组重组猪痘病毒均能诱导猪产生特异性抗体，但免疫本重组猪痘病毒产生的抗体效价较SPV063（TK基因）、SPV043、SPV020～SPV021间非编码区基因缺失位点显著要高。
[0052] 综上所述，本专利所涉及的以SPV017～SPV020为缺失位点构建的重组疫苗能诱导免疫动物产生针对圆环病毒2型ORF2的抗体，且相对SPV063（TK基因）、SPV043、PV020～SPV021间非编码区为缺失位点构建的重组病毒疫苗具有以下优点：（1）种毒效价高。不影响病毒的复制，能够在免疫动物体内大量增殖；（2）外源蛋白表达量高。能在免疫动物体内高效表达目的基因ORF2，并能够诱导免疫动物产生较高效价的抗体；（3）能对免疫动物产生良好的保护作用。因此本重组疫苗是一种理想的新型疫苗。
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