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一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型感染的疫苗组合物及其制备方法和应用

阅读：861发布：2020-05-27

专利汇可以提供一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型感染的疫苗组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种预防和/或治疗猪圆环病毒混合感染的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的猪圆环病毒 3型抗原以及载体。本发明的疫苗组合物具有良好的、广谱的免疫原性，能对不同地域来源的猪圆环病毒3型毒株混合感染具有保护作用。，下面是一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型感染的疫苗组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的猪圆环病毒3型抗原以及药学上可以接受的载体；
其中，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒3型抗原为猪圆环病毒3型SG株或其培养物灭活全病毒抗原，SG株保藏号为CCTCC NO.V201712。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒3型SG株培养物为≥1代次的培养物；优选地，所述猪圆环病毒3型SG株的培养物为≥5代次的培养物；更优选地，所述猪圆环病毒3型SG株的培养物为5～55代次的培养物。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/ml；优选地，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml；更优选地，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原；或
优选地，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株减毒株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株减毒株、所述猪细小病毒灭活抗原为HN-2011株灭活全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株或5型ZJ株灭活全菌抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活全菌抗原。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒灭活抗原含量为灭活前
105.0～107.0TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为104.0～106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为106.0～107.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前
6.0 7.0 5.0 7.0
10 ～10 TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为10 ～10 TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前108.0～1010.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前108.0～
1010.0CCU/ml；
5.0 7.0
优选地，所述猪圆环病毒灭活抗原含量为灭活前10 ～10 TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为105.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为106.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前109.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前
109.0CCU/ml。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；
或MontanideTMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；优选地，所述佐剂为MontanideTMGel；
所述佐剂含量为5～20V/V％；更优选地，所述佐剂含量为10V/V％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用；优选地，所述猪圆环病毒3型相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
10.根据权利要求1～8任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染导致的疾病的药物中的应用。

说明书全文

一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型感染的疫苗组合物及其制

备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型感染的疫苗组合物、制备方法和应用，属于动物病毒学领域。

背景技术

[0002] 猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases， PCVAD)，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

[0003] 然而，在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb 的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒。其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

[0004] 当初早在1985年由PCV2导致的系统疾病就已经以零星状态爆发，由于未能重视，导致九十年代末大规模爆发该疾病，而新的猪圆环病毒PCV3在PNDS和繁殖障碍方面具有与PCV2相似病原学特性，且目前无疫苗产品可针对该PCV3感染进行预防或治疗，因此现阶段开发能有效预防PCV3感染或者与其他病原大规模混合感染的疫苗需求迫切，针对该新临床疫情制备新的疫苗组合物，对猪场疾病控制十分重要。

发明内容

[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供一种预防和/或治疗新型猪圆环病毒混合感染的疫苗组合物，该疫苗组合物能对新型猪圆环病毒混合感染提供有效的保护，显示出显著的免疫特性。

[0006] 为此，本发明的一个目的在于提供一种预防和/或治疗新型猪圆环病毒混合感染的疫苗组合物，其含有猪圆环病毒3型毒株抗原，能有效保护猪圆环病毒3型流行株和一种或多种其他病原的混合感染，且针对不同来源的猪圆环病毒3型的感染提供完全的保护。

[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染疾病的药物中的应用。

[0008] 发明优点：

[0009] (1)本发明毒株具有良好的免疫原性，免疫一次，即能刺激机体快速产生免疫效力，有效保护流行株的攻击，具有很好的保护作用，且能以较低的抗原含量达到良好的免疫保护作用，进一步降低生产成本；

[0010] (2)本发明首次采用目前新的猪圆环病毒3型流行的毒株制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染的疫苗组合物，疫苗组合物中各抗原成分之间不发生干扰，能共同施用；

[0011] (3)本发明的疫苗，能针对不同地域来源的猪圆环病毒3型毒株感染提供完全保护，具有广谱的保护能力。

具体实施方式

[0012] 以下，对本发明的实施方式进行说明。

[0013] 猪圆环病毒3型为基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

[0014] 本发明的猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，Strain SG)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学。

[0015] 本发明涉及一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型混合感染的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的猪圆环病毒3型抗原以及药学上可以接受的载体；其中，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原。

[0016] 本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，仅免疫一次，即能对猪产生完全保护，且抗原含量较低也能达到良好的免疫保护作用。

[0017] 本发明的疫苗组合物，可以包含免疫量的猪圆环病毒3型或其培养物的灭活抗原、减毒全病毒抗原以及药学上可以接受的载体。

[0018] “培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。

[0019] “疫苗组合物”指含有猪圆环病毒3型免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪圆环病毒3型的免疫反应。

[0020] “灭活抗原”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。

[0021] “减毒全病毒抗原”指的是毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV 辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。或者是人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

[0022] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒3型抗原为猪圆环病毒3型SG株或其培养物灭活全病毒抗原，SG株保藏号为CCTCC NO. V201712。

[0023] 作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒3型抗原为猪圆环病毒3型病毒SG株或其培养物裂解型抗原。

[0024] 病毒的不同代次传代培养物基因序列仅可能会发生微小的变异，能保证同样的免疫原性，其制备的灭活疫苗能具有相似的免疫效力。

[0025] 作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒3型SG株培养物为≥1代次的培养物。

[0026] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒3型SG株的培养物为≥5代次的培养物。

[0027] 作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒3型SG株的培养物为5～55代次的培养物。

[0028] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据多种因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

[0029] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/ml。

[0030] 本发明的疫苗组合物中猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速地产生免疫力，当使用灭活前105.0TCID50/ml的含量时，也能达到良好的免疫保护作用，实现100％的保护率。

[0031] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml。

[0032] 作为本发明的一种更优选实施方式，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。

[0033] 本发明疫苗组合物中，所述猪圆环病毒3型SG株或其培养物的灭活全病毒抗原含量范围还可选自105.0～106.0TCID50/ml，或106.0～ 107.0TCID50/ml。

[0034] 本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合物使用以制备抵抗包括猪圆环病毒3型感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。

[0035] 术语“联合疫苗”指本发明的猪圆环病毒3型与至少一种不同病毒的病毒抗原混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的猪圆环病毒3 型和细菌抗原制备的疫苗。例如，本发明的猪圆环病毒3型可与以下病原的抗原：猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒和/或副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪波氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪肺炎支原体、猪鼻支原体混合或组合。

[0036] 本发明的猪圆环病毒3型抗原能与多种抗原成分组成疫苗组合物共同施用，各抗原相互之间不发生干扰，其中的抗原成分能针对各自的攻毒毒株产生完全保护。

[0037] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒减毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。

[0038] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物还包含由免疫量的以下抗原组成的组中的一种或多种：猪瘟病毒减毒抗原、猪伪狂犬病病毒灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原、猪细小病毒灭活抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原、猪肺炎支原体灭活抗原。

[0039] 作为本发明的一种更优选实施方式，所述猪瘟病毒减毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株、所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原为HN1201-R株减毒株、所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原为HN1201株灭活全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原为JXA1-R株减毒株、所述猪细小病毒灭活抗原为HN-2011株灭活全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌血清4型JS株或5型ZJ株灭活全菌抗原、所述猪肺炎支原体灭活抗原为HN0613株灭活全菌抗原。

[0040] 作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒灭活抗原5.0 7.0 4.0 6.0
含量为灭活前10 ～10 TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为10 ～10 TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为 106.0～107.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前 106.0～107.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为
105.0～107.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前106.0～ 108.0TCID50/ml，所
8.0 10.0
述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前10 ～ 10 CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前108.0～ 1010.0CCU/ml。

[0041] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒灭活抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml，所述猪瘟病毒减毒抗原含量为105.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒减毒抗原含量为 106.0TCID50/ml，所述猪伪狂犬病病毒灭活抗原含量为灭活前 106.0TCID50/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原含量为 106.0TCID50/ml，所述猪细小病毒灭活抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原含量为灭活前109.0CFU/ml，所述猪肺炎支原体灭活抗原含量为灭活前109.0CCU/ml。

[0042] 作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。

[0043] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂为MontanideTM Gel。

[0044] 作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂含量为5～20V/V％。

[0045] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂含量为10V/V％。

[0046] 本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如 QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTM Gel。

[0047] 尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/ 癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical Application ofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。

[0048] 特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。

[0049] 优选地，本发明选用的佐剂为MontanideTM Gel。

[0050] 适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据多种因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

[0051] 本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

[0052] 可以根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。

[0053] 优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

[0054] 本发明还涉及上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3 型相关疾病的药物中的应用。

[0055] 本发明疫苗组合物中抗原在上述含量范围内能有效激发免疫反应，抵抗各自针对的病原的攻毒，疫苗组合物中各抗原成分之间不产生干扰，能够完全保护，保护率为100％。

[0056] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物的应用中。所述猪圆环病毒3型相关疾病包括猪的断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

[0057] 本发明还涉及上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3 型混合感染导致的疾病的药物中的应用。

[0058] 本发明所用术语“猪圆环病毒3型混合感染疾病”用于指由猪圆环病毒3型与一种或多种病原共同感染引起的疾病。非穷举性包括，断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。

[0059] 术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒3型混合感染时是指抑制包括猪圆环病毒3型的复制、抑制包括猪圆环病毒3型的传播或防止包括猪圆环病毒3型在其宿主体内定居，以及减轻包括猪圆环病毒3型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/ 或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

[0060] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0061] 本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

[0062] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0063] 实施例1猪圆环病毒3型的分离鉴定

[0064] 1、病料来源

[0065] 在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加 9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2 型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、 CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。

[0066] 2、病毒株的分离与培养

[0067] 将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤；滤液在PK15细胞上传代， 37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，培养液经2次冻融后，收获病毒。

[0068] 3、PCR及测序分析鉴定病毒种属

[0069] 取以上步骤收获的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示， PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。

[0070] 实施例2猪圆环病毒3型疫苗株的筛选

[0071] 根据上述分离到的猪圆环病毒3型设计特异性引物，通过定量PCR 分析从全国各地采集的235份疑似PCV3阳性样品，筛选分离出121株 PCV3病毒，这121株中，各株之间其基因组核苷酸序列同源性高达 98.9～99.6％，Cap蛋白氨基酸序列同源性高达97.7～99.5％。经本动物致病性试验及免疫原性测试，最终筛选出1株致病性强、免疫原性良好、广谱性强的PCV3病毒株。该猪圆环病毒3型病毒命名为猪圆环病毒3 型SG株，提交保藏。

[0072] 实施例3猪圆环病毒3型SG株致病性试验

[0073] 用28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成两组，5头/组，第1组用PCV3SG株(含 105.0TCID50/头)攻毒，肌肉注射，空白对照组接种DMEM培养基，各组仔猪隔离饲养。攻毒后连续观察各组仔猪，根据其临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表1。

[0074] 表1猪圆环病毒3型SG株对仔猪致病性试验结果

[0075]

[0076]

[0077] 结果显示，攻毒组所有猪只均出现3～5日持续性40.5℃以上高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型病毒，而空白对照组无异常，表明本发明猪圆环病毒3型SG株接种仔猪均可导致仔猪发病，临床表症为典型的猪圆环病毒感染症状。

[0078] 实施例4猪圆环病毒3型SG株抗原的制备

[0079] 将实施例2筛选到的猪圆环病毒3型SG株不同代次的培养物按照病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK15传代细胞中，置于 37℃吸附30分钟，然后加入细胞维持液，置于37℃培养。每日观察1～ 2次，细胞生长良好，于36～37℃培养4～7日后收获细胞培养物，收获的细胞培养物冻融2-3次后，收获病毒液，并测定病毒毒价。将病毒液用中空纤维(0.5μm～2μm)滤柱过滤，以除去细胞碎片，再加入0.1％～ 0.2％的甲醛溶液在37℃灭活
24h，灭活完全后的病毒抗原用以制备疫苗。

[0080] 实施例5猪瘟病毒抗原的制备

[0081] 将长成良好单层的对猪瘟病毒兔化弱毒株高敏感的ST细胞用含 0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液,进行消化分散，细胞计数后接种细胞培养瓶，加入3％犊牛血清的DMEM细胞培养液，同时按照M.O.I.＝0.1 接毒剂量加入猪瘟病毒种毒(购自中监所，保藏号AVCC NO.AV1412), 置于37℃温箱中进行培养。培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加含
1.5％犊牛血清的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，可连续收毒5 次。最后收毒后将各批收毒的抗原混合置于-20℃储藏。

[0082] 实施例6猪伪狂犬病病毒减毒抗原的制备

[0083] 将猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(公开于中国专利申请 CN105087506A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的 ST细胞培养物中，置于37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，细胞培养液经2次冻融后，收毒，测定毒价，置于低温保存。

[0084] 实施例7猪伪狂犬病病毒灭活抗原的制备

[0085] 将猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株(公开于中国专利申请CN103923884A)培养物按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的ST细胞培养物中，置于
37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收获病毒液，测定毒价。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，于37℃灭活 18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。

[0086] 实施例8猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原的制备

[0087] 选取所需数量的Marc-145细胞(已长成单层的细胞转瓶)，弃去生长液，按1％(V/V)接种生产用毒种JXA1-R株(公开于中国专利申请CN101307305A)，加入含2％胎牛血清的DMEM细胞培养液，于 37℃旋转(9～12转/小时)培养，在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，当CPE达到70％以上时收获细胞培养物，细胞培养物冻融1次，并经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40℃以下。

[0088] 实施例9猪细小病毒灭活抗原的制备

[0089] 将猪细小病毒HN-2011株(公开于中国专利申请CN102886043A) 培养物按M.O.I.＝0.01接毒剂量接入形成单层的ST细胞培养物中，置于 37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，细胞培养液经2次冻融后，收获病毒，测定毒价。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，于37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。

[0090] 实施例10副猪嗜血杆菌灭活抗原的制备

[0091] 一级种子的繁殖：副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株(公开于中国专利申请CN102908615A)冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD (TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)平板上，置于37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD(TSB为BD 公司生产，NAD为Roche公司生产)液体培养基中，于37℃培养12～16 小时，作为一级种子；

[0092] 二级种子的繁殖：取上述制备的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5 型ZJ株一级种子的培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，于37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为二级种子；

[0093] 在TSB培养基中，加入0.01～0.05％NAD、5～10％的小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、0.1～5％的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4 型JS株、5型ZJ株二级种子菌液按1％的量加进培养基中分别培养，混匀后置于37℃培养16～18小时，当菌液的浓度OD600达到2.5以上、 DO值开始上升、pH值降低到6.5以下时停止培养。

[0094] 培养物活菌计数后，按总量的0.2％(V/V)加入37％的甲醛溶液(烟台市双双化工有限公司)，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次，灭活完全后备用。

[0095] 实施例11猪肺炎支原体灭活抗原的制备

[0096] 一级种子的繁殖：冻干菌种HN0613株(公开于中国专利申请 CN103031258A)启封后，按10％接种量接种液体培养基，置于37℃振荡培养3～7d，待pH值由7.5降至6.8时收获培养物，经纯粹检验，作为一级种子；

[0097] 二级种子的繁殖：取上述制备的一级种子按5％接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7d，待pH值由7.5降至6.8时收获培养物，经纯粹检验，作为二级种子；

[0098] 液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH2O(二次蒸馏水)360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)(10倍浓缩)40ml，0.25％酚红10ml，马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml， 10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25m1；

[0099] 将二级种子液以5％(v/v)接种于液体培养基中，置于37℃下培养 3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获菌液。

[0100] 取检验合格的上述制备的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔3～4h 搅拌一次，24h后取出，灭活完全后备用。

[0101] 实施例12含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物的制备

[0102] 分别将实施例5制备的猪瘟病毒减毒抗原、实施例6制备的猪伪狂犬病病毒减毒抗原、实施例8制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒抗原加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为猪瘟病毒活疫苗部分、猪伪狂犬病病毒活疫苗部分、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗部分。

[0103] 用实施例4制备的猪圆环病毒3型SG株灭活抗原缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm 乳化机搅拌12min，混匀，即为猪圆环病毒3型灭活疫苗部分。使用时用灭活疫苗部分稀释活疫苗部分，两种抗原比例如表2中所示。

[0104] 表2含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物成分配比(活苗部分)

[0105]

[0106] 分别取实施例4制备的猪圆环病毒3型SG株灭活抗原、实施例7 制备的猪伪狂犬病病毒灭活抗原、实施例9制备的猪细小病毒灭活抗原、实施例10制备的副猪嗜血杆菌灭活抗原、实施例11制备的猪肺炎支原体灭活抗原，将五种抗原根据组合物最终的抗原含量配制，加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为 800rpm乳化机搅拌12min，混匀。疫苗组合物的具体配方及含量见表3。

[0107] 表3含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物成分配比(灭活苗部分)

[0108]

[0109]

[0110] 实施例13含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物免疫原性试验

[0111] 1、猪圆环病毒3型部分免疫原性试验

[0112] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪45头随机分成9组，5头/组，免疫实施例12制备的疫苗组合物。第3～10组分别免疫疫苗1～8，第11组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后 28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表4。

[0113] 表4含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物PCV3部分免疫原性试验结果[0114]

[0115]

[0116] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物一次免疫仔猪后，能针对猪圆环病毒3型感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型 SG株抗原的疫苗组合物中猪圆环病毒3型抗原部分具有很好的保护效力，能对猪提供100％的保护，且病毒检测均为阴性。

[0117] 本发明的猪圆环病毒3型SG株抗原与多种病毒抗原、细菌抗原之间不干扰，能共同组成疫苗组合物后施用。

[0118] 2、猪瘟部分免疫原性试验

[0119] 将20日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、CSFV抗原、抗体阴性的健康仔猪8头随机分成2组，4头/组。第12组免疫实施例12制备的疫苗1，第13组不免疫作为攻毒对照组。将每头份2ml疫苗1稀释3000 倍，肌肉注射，每头1ml，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。10～14 日后，连同条件相同的对照组4头，注射猪瘟石门系血毒1.0ml/头 (105MLD)，观察16日。结果见表5。

[0120] 表5含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物CSFV部分免疫原性试验结果[0121]组别免疫头份保护率临床症状
12 1/3000 100％(4/4) 无体温反应
13 DMEM培养基1ml 0％(0/4) 4头均死亡

[0122] 根据中国兽药典标准，检测猪瘟病毒疫苗免疫效力，需将疫苗稀释 300倍以上免疫后，再进行检测，而本实施例的结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物1/3000头份(稀释3000倍)免疫仔猪后，能针对猪瘟病毒感染为仔猪提供100％(4/4)保护，且没有体温反应，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物中的猪瘟病毒抗原部分具有很好的保护效力及安全性。

[0123] 3、猪伪狂犬病病毒部分免疫原性试验

[0124] 将9日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第14组免疫实施例12制备的疫苗2，第15组免疫实施例12制备的疫苗4，第16组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫7.0
后21日进行攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株 10 TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表6。

[0125] 表6含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物PRV部分免疫原性试验结果[0126]

[0127] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能针对猪伪狂犬病病毒感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物中的猪伪狂犬病病毒灭活抗原或活病毒抗原部分均具有很好的保护效力。

[0128] 4、猪繁殖与呼吸综合征病毒部分免疫原性试验

[0129] 将4～6周龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRRSV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第17组免疫实施例12制备的疫苗3，第18组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株105.0TCID50/头，每日测温并观察临床症状和死亡情况。具体结果见表7。

[0130] 表7含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物PRRSV部分免疫原性试验结果[0131]

[0132] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病且死亡3头。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原部分具有很好的保护效力。

[0133] 5、猪细小病毒部分免疫原性试验

[0134] 将10～20kg经ELISA检测PCV2、PCV3、PPV抗原、抗体阴性的健康仔猪10头随机分成2组，5头/组，第19组免疫实施例12制备的疫苗5，第20组不免疫作为空白对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，空白对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日，连同对照组采血，测定抗体，对照组应为阴性(HI抗体效价≤1:8)，免疫组至少4头出现抗体反应，HI抗体效价≥1:
64。具体结果见表8。

[0135] 表8含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物PPV部分免疫原性试验结果[0136]

[0137]

[0138] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后， PPV的HI抗体均大于1:64，能针对猪细小病毒感染为仔猪提供100％ (5/5)保护。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物中的猪细小病毒抗原部分具有很好的保护效力。

[0139] 6、副猪嗜血杆菌部分免疫原性试验

[0140] 将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、HPs抗原、抗体阴性的健康仔猪30头随机分成6组，5头/组，第21组、第22组免疫实施例12制备的疫苗6，第23组、第24组免疫实施例12制备的疫苗 8，第25组、第26组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35天，取免疫组第21 组、第23组，攻毒对照组第25组，用4型JS株进行攻毒，腹腔注射 3ml菌液，攻毒剂量为9.0×109CFU/头；取免疫组第22组、第
24组，攻毒对照组第26组，用5型ZJ株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为6.0×
109CFU/头；攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。具体结果见表
9。

[0141] 表9含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物HPs部分免疫原性试验结果[0142]组别仔猪数 4型JS株攻毒保护率 5型ZJ株攻毒保护率
21 5 5/5 —
22 5 — 5/5
23 5 5/5 —
24 5 — 5/5
25 5 0/5 —
26 5 — 0/5

[0143] 注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。

[0144] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对副猪嗜血杆菌4型、5型菌感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒3 型SG株抗原的疫苗组合物中的4型、5型副猪嗜血杆菌抗原部分均具有很好的保护效力。

[0145] 7、猪肺炎支原体部分免疫原性试验

[0146] 将14～21日龄仔猪经ELISA检测PCV2、PCV3、Mhp抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，第27组免疫实施例12 制备的疫苗7，第28组免疫实施例12制备的疫苗8，第29组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基
2ml/头。免疫后35天，取免疫组第27组、第28组，攻毒对照组第29组，用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射 5ml/头(100MID)，攻毒后观察28天，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。具体结果见表10。

[0147] 肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％

[0148] 表10含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物Mhp部分免疫原性试验结果[0149]

[0150]

[0151] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同表示差异显著(P＜0.05)

[0152] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，针对猪肺炎支原体感染，各免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与攻毒对照组平均肺病变存在显著差异。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型 SG株抗原的疫苗组合物中的猪肺炎支原体抗原部分具有很好的保护效力。

[0153] 综上所述，从以上不同疫苗组合物针对PCV3、CSFV、PRV、PRRSV、 PPV、HPs 4型菌、HPs 5型菌、Mhp的免疫原性试验结果来看，各疫苗组合物均能达到较好的保护效果，表明本发明提供的含猪圆环病毒3 型SG株抗原的疫苗组合物中不同的抗原成分具有很好的保护效力。说明本发明的猪圆环病毒3型SG株灭活抗原能与不同病原抗原成分组成免疫组合物共同施用。

[0154] 实施例14含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物广谱性保护试验

[0155] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪225头随机分成45组，5头/组，第30～34组免疫实施例12制备的疫苗1，第35～39组免疫实施例12制备的疫苗2，第40～44组免疫实施例12制备的疫苗3，第45～49组免疫实施例12制备的疫苗4，第50～54组免疫实施例12制备的疫苗5，第55～59组免疫实施例12 制备的疫苗6，第60～64组免疫实施例12制备的疫苗7，第65～69组免疫实施例12制备的疫苗8，第70～74组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第30组、第35组、第40组、第45组、第50组、第55组、第60组、第65组、第70组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒3型HN12株强毒株攻毒；第31组、第36组、第41组、第46 组、第
51组、第56组、第61组、第66组、第71组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒3型JS08株强毒株攻毒；第32组、第37组、第42组、第47组、第52组、第57组、第62组、第67组、第72组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒3型JL11株强毒株攻毒；第33 组、第38组、第43组、第48组、第53组、第58组、第63组、第 68组、第73组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒3型CQ04株强毒株攻毒；第34组、第39组、第44组、第49组、第54组、第59组、第64组、第69组、第74组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒3 型GD05株强毒株攻毒；攻毒剂量均为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表11～19。

[0156] 表11疫苗1广谱性保护试验结果

[0157]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
30 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
31 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
32 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
33 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
34 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0158] 表12疫苗2广谱性保护试验结果

[0159]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
35 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
36 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
37 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
38 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
39 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0160] 表13疫苗3广谱性保护试验结果

[0161]

[0162]

[0163] 表14疫苗4广谱性保护试验结果

[0164]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
45 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
46 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
47 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
48 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
49 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0165] 表15疫苗5广谱性保护试验结果

[0166]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
50 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
51 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
52 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
53 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
54 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0167] 表16疫苗6广谱性保护试验结果

[0168]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
55 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
56 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
57 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
58 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
59 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0169] 表17疫苗7广谱性保护试验结果

[0170]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
60 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
61 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
62 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
63 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
64 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0171] 表18疫苗8广谱性保护试验结果

[0172]组别临床症状病理变化病毒检测(阳性率) 保护率
65 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
66 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
67 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
68 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)
69 无异常无异常 0％(0/5) 100％(5/5)

[0173] 表19广谱性保护试验攻毒对照组试验结果

[0174]

[0175]

[0176] 结果显示，第70～74组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型病毒；而第30～69组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示 PCV3阴性。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物可对猪只针对不同地域来源的猪圆环病毒3型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV3株。本发明的疫苗组合物具有广谱的免疫原性，对于不同地域来源的猪圆环病毒3型均能提供完全保护。

[0177] 综上所述，从以上含猪圆环病毒3型SG株抗原的不同疫苗组合物针对不同地域来源的猪圆环病毒3型免疫原性试验结果来看，各疫苗组合物均能达到较好的保护效果，表明本发明提供的含猪圆环病毒3型 SG株抗原的疫苗组合物具有很好的广谱性保护效力。

[0178] 实施例15含猪圆环病毒3型SG株疫苗组合物混合感染保护试验

[0179] 1、猪圆环病毒3型、猪瘟病毒混合感染保护试验

[0180] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、CSFV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组。第75组免疫实施例12制备的疫苗1，第76组、第77组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒105.0TCID50/头，猪瘟石门系血毒 1.0ml/头(105MLD)，第75组同时攻毒猪圆环病毒和猪瘟病毒，第76 组为猪圆环病毒攻毒对照组，第77组为猪瘟病毒攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表20。

[0181] 表20猪圆环病毒3型、猪瘟病毒混合感染保护试验结果

[0182]

[0183] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪圆环病毒3型、猪瘟病毒混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，且没有体温反应，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物具有很好的保护效力及安全性，能对猪圆环病毒3型、猪瘟病毒混合感染提供有效保护。

[0184] 2、猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病病毒混合感染保护试验

[0185] 将9日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRV抗原、抗体阴性的健康仔猪20头随机分成4组，5头/组。第78组免疫实施例12制备的疫苗2，第79组免疫实施例12制备的疫苗4，第80组、第81组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒 105.0TCID50/头，猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，第78组、第79组同时攻毒猪圆环病毒和猪伪狂犬病病毒，第80组为猪圆环病毒攻毒对照组，第81组为猪伪狂犬病病毒攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表21。

[0186] 表21猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病病毒混合感染保护试验结果

[0187]

[0188] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病病毒混合感染为仔猪提供100％ (5/5)保护，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物具有很好的保护效力及安全性，能对猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病病毒混合感染提供有效保护。

[0189] 3、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染保护试验

[0190] 将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、PRRSV抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组。第82组免疫实施例12 制备的疫苗3，第83组、第84组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒105.0TCID50/头，猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株5.0
10 TCID50/头，第82组同时攻毒猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，第83组为猪圆环病毒攻毒对照组，第84 组为猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表22。

[0191] 表22猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染保护试验结果[0192]

[0193] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染为仔猪提供 100％(5/5)保护，而两组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病或死亡。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物具有很好的保护效力及安全性，能对猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染提供有效保护。

[0194] 4、猪圆环病毒3型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体混合感染保护试验[0195] 将21日龄经ELISA检测PCV2、PCV3、HPs、Mhp抗原、抗体阴性的健康仔猪25头随机分成5组，5头/组。第85组免疫实施例12制备的疫苗8，第86组、第87组、第88组、第89组不免疫作为攻毒对照组。免疫组注射疫苗2ml/头，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后35日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒105.0TCID50/头，副猪嗜血杆菌4型JS株9.0×109CFU/头、5型ZJ株6.0×109CFU/头，猪肺炎支原体CVCC354株100MID/头，第85组同时攻毒猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体，第86组为猪圆环病毒攻毒对照组，第87组为副猪嗜血杆菌4型攻毒对照组，第88组为副猪嗜血杆菌5型攻毒对照组，第89组为猪肺炎支原体攻毒对照组，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化进行判定，具体结果见表23。

[0196] 表23猪圆环病毒3型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体混合感染保护试验结果[0197]

[0198]

[0199] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同表示差异显著(P＜0.05)

[0200] 结果显示，含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物免疫仔猪后，能针对猪圆环病毒3型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体混合感染为仔猪提供100％(5/5)保护，而四组攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型SG株抗原的疫苗组合物具有很好的保护效力及安全性，能对猪圆环病毒3型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体混合感染提供有效保护。

[0201] 综上所述，从以上含猪圆环病毒3型SG株抗原的不同疫苗组合物针对猪圆环病毒3型与其他病原的混合感染免疫原性试验结果来看，各疫苗组合物均能达到较好的保护效果，表明本发明提供的含猪圆环病毒 3型SG株抗原的疫苗组合物中不同抗原成分均具有很好的保护效力。

[0202] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

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