表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗及其制备方法
阅读：922发布：2020-05-24
专利汇可以提供表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 制药领域。本发明提供了一种重组 疫苗 ，其中含有重组猪痘病毒和一种或多种药物学上可接受的载体和／或佐剂，该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和猪 圆环病毒 2型的Cap蛋白的编码基因。本发明所述的重组猪痘病毒疫苗能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白，能够诱导动物体内产生较高效价的 抗体 ,并对免疫动物产生良好的保护作用。，下面是表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.用于预防和/或治疗猪圆环病毒2型所致疾病的疫苗。
2. 权利要求1中所述的疫苗，其中含有重组猪痘病毒和药物学上可接受的载体或佐剂，该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和猪圆环病毒2型的Cap蛋白编码基因。
3.权利要求1或2所述的疫苗，其中所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
4.权利要求1至3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述的猪痘病毒载体为VR-363。
5.一种猪圆环病毒2型的Cap蛋白的编码基因，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
6.一种重组猪痘病毒，其中含有权利要求5所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因。
7.权利要求6所述的重组猪痘病毒在制备用于预防和/或治疗猪圆环病毒2型引发疾病的药物中的用途。
8.权利要求5所述的用途，其中所述的猪圆环病毒2型引发疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（ PDNS）等疾病。
9.一种制备重组猪痘病毒的方法，该方法包括：
（1）利用特异性引物对扩增猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白的编码基因cap；
（2）把cap基因克隆入穿梭载体pUSG11/P28中，然后通过PCR和酶切鉴定，获得含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C；
（3）让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-cap；
（4）纯化重组猪痘病毒rSPV-cap。
10.权利要求7所述的方法，其中所述的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；其中所述的让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组的具体操作为：用猪痘病毒（SPV）感染PK15单层细胞，2小时后用脂质体转染法加入穿梭载体pUSG11/P28C，二者发生同源重组，PK15细胞在常规条件下培养4天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪痘病毒rSPV-cap；其中所述的纯化重组猪痘病毒rSPV-cap的具体操作为：将所述重组猪痘病毒rSPV-cap经倍比稀释，接种PK15单层细胞， 3-4天后在荧光显微镜下可观察到独立的绿色噬斑，挑取单独的病毒噬斑，适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复6次，直至最后得到的重组猪痘病毒能够稳定遗传。
表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗及
其制备方法
[0002] 背景技术猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）的主要病原，还与猪皮炎与肾病综合征（Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, PDNS）等疾病密切相关。Cap是PCV2的主要结构蛋白，具有良好的抗原性，能刺激机体产生特异性抗体，与PCV2致病性和机体的免疫保护作用密切相关，一直是研制PCV2疫苗的焦点。现有技术中已有多种用PCV2的Cap蛋白的编码基因为目的基因构建的用于防治猪圆环病毒的疫苗，其中所用载体各不相同，例如原核质粒、杆状病毒等。但是未见使用痘病毒载体报道，更未见使用猪痘病毒载体构建用于防治PCV2的疫苗的报道。
[0003] 重组痘病毒载体疫苗已经有近30年的安全应用，作为表达载体，痘病毒有许多特有的优点：(1)冻干疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使用；(2)疫苗有多种用药途径，包括口服，尤其是针对野生动物进行免疫预防时，给药特别方便；(3)接种一次就能获得长期的免疫效果，能诱导抗外来抗原的抗体和细胞毒性T细胞反应；(4)基因组容易组装，允许大片段的基因丢失或删除，以及外源DNA的插入。
[0004] 应用重组痘病毒已经成功地表达了来源于动植物，乃至人类的许多种基因。被表达的外源蛋白在感染细胞中能忠实地进行修饰，与其它哺乳动物病毒表达载体相比，具有较高的表达效率。通过对动物接种重组痘病毒的办法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答。表达抗原基因的重组痘病毒，可作为基因重组疫苗。痘病毒作为基因重组活疫苗的载体，不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可刺激机体产生免疫应答，不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导很强的细胞免疫。目前常用表达载体的痘病毒主要有：痘苗病毒、禽痘病毒等。猪痘病毒载体构建疫苗乃本发明人独创。 [0005] 本发明人经过大量实验成功构建了表达Cap的重组猪痘病毒载体疫苗，由于猪痘病毒为猪源病毒，能在免疫猪体内进行有效的增殖，因而以其为载体构建的疫苗相对于其他载体疫苗取得了更好的免疫效果。
[0006] 发明内容本发明的目的是研制一种能够有效控制猪圆环病毒的重组猪痘病毒载体疫苗，对猪圆环病毒病的防治工作提供有力的支持。
[0007] 一方面，本发明提供了一种猪圆环病毒2型的Cap蛋白的编码基因，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
[0008] 另一方面，本发明提供了一种重组猪痘病毒(rSPV-cap)，该重组猪痘病毒是在猪痘病毒载体中插入本发明所述cap基因重组制备得到的。
[0009] 在优选的实施方案中，本发明所述cap基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0010] 本发明通过动物免疫试验发现：本发明提供的重组猪痘病毒能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白Cap，能够诱导动物体内产生较高效价的抗体,并对免疫动物产生良好的保护作用。
[0011] 因此，另一方面，本发明提供了一种疫苗，其中含有本发明所述的重组猪痘病毒和一种或多种药物学上可接受的载体或佐剂。该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和本发明所述的cap基因。
[0012] 在一个优选实施方案中,所述的cap基因具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
[0013] 在一个优选实施方案中,所述的猪痘病毒载体为VR-363。
[0014] 另一方面，本发明提供了本发明所述的重组猪痘病毒及含有其的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒引发的疾病的药物中的用途，优选用于制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型引发的疾病的药物中的用途。
[0015] 本发明中所述的猪圆环病毒2型引发疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（ PDNS）等疾病。
[0016] 本发明所述的重组猪痘病毒及含有其的疫苗组合物的免疫接种途径包括但不限于肌肉注射等。
[0017] 另一方面，本发明提供了一种制备重组猪痘病毒的方法，该方法包括： （1）利用基因工程方法构建通用穿梭载体pUSG11/P28；（2）利用特异性引物对扩增猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白的编码基因cap；
（3）把cap基因克隆入通用穿梭载体pUSG11/P28中，然后通过PCR和酶切鉴定，获得含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C；
（4）让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-cap。
（3）把cap基因克隆入通用穿梭载体pUSG11/P28中，然后通过PCR和酶切鉴定，获得含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C；
（4）让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-cap。
[0018] （5）纯化重组猪痘病毒rSPV-cap。
[0019] 在本发明的一个优选实施方案中，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示：
在本发明的一个优选实施方案中，所述让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组具体操作为：用猪痘病毒（SPV）感染PK15单层细胞，2小时后用脂质体转染法加入穿梭载体pUSG11/P28C，二者发生同源重组。PK15细胞在常规条件下培养4天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪痘病毒rSPV-cap。
在本发明的一个优选实施方案中，所述让含有cap基因的穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒同源重组具体操作为：用猪痘病毒（SPV）感染PK15单层细胞，2小时后用脂质体转染法加入穿梭载体pUSG11/P28C，二者发生同源重组。PK15细胞在常规条件下培养4天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪痘病毒rSPV-cap。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，所述纯化重组猪痘病毒rSPV-cap的具体操作为：将所述重组猪痘病毒rSPV-cap经倍比稀释，接种PK15单层细胞，加入甲基纤维素营养液，使其在3-4天内形成独立的绿色荧光噬斑，在荧光显微镜下挑取单独的病毒噬斑，适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复6次，直至最后得到的重组猪痘病毒能够稳定遗传。 [0021] 另一方面，本发明提供了一种将上述重组猪痘病毒制成疫苗的方法，该方法包括：（1）将纯化的重组猪痘病毒rSPV-cap在PK15细胞上连续传代30次，检测其cap基因
7.8
的表达情况，至Cap稳定表达，且重组猪痘病毒的毒价稳定在10 PFU/mL。
7.8
的表达情况，至Cap稳定表达，且重组猪痘病毒的毒价稳定在10 PFU/mL。
[0022] （2）在扩大培养过程中取用保存的rSPV-cap按5 MOI接种长成单层的PK15细胞，当细胞病变达70-90%时收毒，经反复冻融2次，即可获得表达Cap的重组猪痘病毒载体疫苗。
[0023] 有益效果相对于现有技术中的同类疫苗，本发明重组猪痘病毒载体疫苗，具有以下优点：
1. 使用猪源的猪痘病毒载体构建疫苗，相对用其他载体构建的疫苗，具有更强的免疫特异性，且在猪体内更易复制。重组猪痘病毒载体疫苗在猪体内不断表达Cap蛋白，使机体持续受到Cap的刺激，不断产生针对PCV2的中和抗体，这样就能对猪体提供持久的保护力。
试验证明，本发明构建的表达Cap的重组猪痘病毒对外源蛋白表达稳定，种毒的毒价稳定
7.8
在10 PFU/mL。猪体免疫试验证明本发明所述重组猪痘病毒载体疫苗能够产生针对Cap的高效价中和抗体，具有很好的免疫保护作用。
1. 使用猪源的猪痘病毒载体构建疫苗，相对用其他载体构建的疫苗，具有更强的免疫特异性，且在猪体内更易复制。重组猪痘病毒载体疫苗在猪体内不断表达Cap蛋白，使机体持续受到Cap的刺激，不断产生针对PCV2的中和抗体，这样就能对猪体提供持久的保护力。
试验证明，本发明构建的表达Cap的重组猪痘病毒对外源蛋白表达稳定，种毒的毒价稳定
7.8
在10 PFU/mL。猪体免疫试验证明本发明所述重组猪痘病毒载体疫苗能够产生针对Cap的高效价中和抗体，具有很好的免疫保护作用。
[0024] 2. 本发明重组猪痘病毒载体疫苗相对于现有技术同类疫苗具有群体免疫优势。本发明重组猪痘病毒载体疫苗可以通过多种途径对目的动物进行免疫，包括口服免疫，这种特性能使目标动物避免出现漏免的情况，使群体的抗体水平较一致，能够更好的抵抗外源病毒的攻击。
[0025] 3. 本发明首次成功构建了表达Cap的重组猪痘病毒载体疫苗，该疫苗兼具弱毒疫苗的免疫原性和灭活疫苗的安全性，而且对人、猪等动物没有致病性，是一种理想的生物工程疫苗。
[0027] 图2图示的是穿梭载体pUSG11/P28酶切产物电泳检测结果，其中泳道M：DL 15000 DNA Marker，泳道1：穿梭载体pUSG11/P28；泳道3：穿梭载体pUSG11/P28酶切产物。 [0028] 图3 图示的是重组猪痘病毒的PCR产物电泳检测结果，其中泳道1： DL 5000 DNA Marker，泳道2: 重组猪痘病毒rSPV-cap，泳道3：猪痘病毒野毒株，泳道4：无病毒感染的PK15细胞。
[0029] 图4 图示的是western blot检测Cap在重组猪痘病毒rSPV-cap中的表达情况，其中泳道M：预染蛋白Marker，泳道1：感染rSPV-cap的PK15细胞，泳道2：猪痘病毒野毒株感染的PK15细胞，泳道3：无病毒感染的PK15细胞。
[0030] 图5图示的是间接免疫荧光检测Cap在重组猪痘病毒rSPV-cap中的表达情况，其中图（A）为重组猪痘病毒rSPV-cap感染的PK15细胞，能够看到明显的红色荧光；图（B）为猪痘病毒野毒株感染的PK15细胞，未见红色荧光。
[0031] 图 6图示的是用本发明重组猪痘病毒rSPV-cap免疫的猪血清抗体效价的测定结果，从图可知重组猪痘病毒rSPV-cap免疫的巴马香猪血清抗体效价明显高于其他组，证明本发明所述重组能有效的刺激机体产生免疫反应。
[0032] 图7图示的是对经本发明重组猪痘病毒rSPV-cap免疫过的猪进行PCV2攻毒后，其血清中PCV2病毒含量的测定结果，从图可知重组猪痘病毒rSPV-cap免疫的巴马香猪血清中PCV2病毒的含量显著低于其他组。
[0033] 下列实施例的给出是为了更好地理解和阐述本发明，而决不应理解为对本发明的任何限制。<0}{0>Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. <}0{>除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。<0}{0>Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. <}0{>{0>Any patents, patent applications, and publications cited herein are incorporated by reference. <}0{>本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。
[0034] 实施例实施例1 通用穿梭载体pUSG11/P28的构建
1.1 pUS01载体的构建
根据猪痘病毒（GenBank: AF410153）的基因序列设计两对特异性引物：
LF1: 5’-GAATTCTAAATCTACTTCTTCAACGG-3’
LF2: 5’-GGTACCTATAACTACTAGGTCCACAC-3’
RF1: 5’-GTCGACAGGCGATTATTTATGTTATTA-3’
RF2: 5’-AAGCTTATTTTTATCCTATTGTTGTTC-3’
TM
用病毒核酸提取试剂盒（Geneaid）提取猪痘病毒（ATCC: VR-363 ）的基因组，作为模板，用上述引物通过PCR方法分别扩增出穿梭载体中的左右同源交换序列LF和RF。PCR扩增产物经回收纯化后，LF片段插入到质粒pUC19 (Takara)的EcoR I-Kpn I酶切位点，同时将RF片段插入到质粒pUC19的Sal I-Hind III酶切位点，构建出pUS01载体。
1.1 pUS01载体的构建
根据猪痘病毒（GenBank: AF410153）的基因序列设计两对特异性引物：
LF1: 5’-GAATTCTAAATCTACTTCTTCAACGG-3’
LF2: 5’-GGTACCTATAACTACTAGGTCCACAC-3’
RF1: 5’-GTCGACAGGCGATTATTTATGTTATTA-3’
RF2: 5’-AAGCTTATTTTTATCCTATTGTTGTTC-3’
TM
用病毒核酸提取试剂盒（Geneaid）提取猪痘病毒（ATCC: VR-363 ）的基因组，作为模板，用上述引物通过PCR方法分别扩增出穿梭载体中的左右同源交换序列LF和RF。PCR扩增产物经回收纯化后，LF片段插入到质粒pUC19 (Takara)的EcoR I-Kpn I酶切位点，同时将RF片段插入到质粒pUC19的Sal I-Hind III酶切位点，构建出pUS01载体。
[0035] 通用穿梭载体pUSG11/P28的构建以质粒pEGFP-N1(Takara)为模板，用引物：
11G1: 5’-GGTACCGGCTGATTATGATCTAGAGTCG-3’
11G2: 5’-CTCGAGATATAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACATGG TGAGCAAGGGCGAGGAG-3’。扩增出绿色荧光蛋白GFP的基因，通过酶切、连接，克隆到1.1中构建的载体pUS01中的Kpn I-Sal I位点，形成转移载体pUSG11。
11G1: 5’-GGTACCGGCTGATTATGATCTAGAGTCG-3’
11G2: 5’-CTCGAGATATAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACATGG TGAGCAAGGGCGAGGAG-3’。扩增出绿色荧光蛋白GFP的基因，通过酶切、连接，克隆到1.1中构建的载体pUS01中的Kpn I-Sal I位点，形成转移载体pUSG11。
[0036] 设计并合成两条互补的寡核苷酸链：P281: 5’-CAGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGTCGACTCGAGAGCT CCCGGGGATCCATCGATGC-3’
P282: 5’-GGCCGCATCGATGGATCCCCGGGAGCTCTCGAGTCGACCATTTATATGCCAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCTGGTAC-3’。二者退火形成带Kpn I和Not I粘性末端的双链DNA片段。此片段中含经过改造的痘苗病毒强启动子P28序列及9个可用于外源基因插入的限制性酶切位点Sal I、Hinc II、Xho I、Sac I、Xma I、Sma I、BamH I、Cla I和Not I。然后把这个DNA片段克隆到载体pUSG11的Kpn Ⅰ和Not Ⅰ位点，得到通用穿梭载体pUSG11/P28。
P282: 5’-GGCCGCATCGATGGATCCCCGGGAGCTCTCGAGTCGACCATTTATATGCCAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCTGGTAC-3’。二者退火形成带Kpn I和Not I粘性末端的双链DNA片段。此片段中含经过改造的痘苗病毒强启动子P28序列及9个可用于外源基因插入的限制性酶切位点Sal I、Hinc II、Xho I、Sac I、Xma I、Sma I、BamH I、Cla I和Not I。然后把这个DNA片段克隆到载体pUSG11的Kpn Ⅰ和Not Ⅰ位点，得到通用穿梭载体pUSG11/P28。
[0037] 实施例2 cap基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析2.1 PCR引物设计及合成
根据PCV2中国分离株（GenBank: FJ644559.1）的基因序列设计一对针对cap基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶BamHI和SalI的酶切位点。引物由上海invitrogen生物公司合成。序列如下：
P1：5’-ACGCGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’ （SEQ ID NO: 1）
P2：5’-CGCGGATCCTTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3’ （ SEQ ID NO: 2）。
根据PCV2中国分离株（GenBank: FJ644559.1）的基因序列设计一对针对cap基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶BamHI和SalI的酶切位点。引物由上海invitrogen生物公司合成。序列如下：
P1：5’-ACGCGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’ （SEQ ID NO: 1）
P2：5’-CGCGGATCCTTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3’ （ SEQ ID NO: 2）。
[0038] 扩增目的基因片段取2* PCR Mix 25.0 µL，P1 1.0 µL、P2 1.0 µL，纯化的PCV2核酸模板3.0 µL，用无菌超纯水补至总体积50.0 µL。在PCR仪上进行反应。循环参数为94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共进行35个循环；然后72 ℃延伸10 min。
PCR产物进行1 % (g/mL)琼脂糖凝胶电泳。
PCR产物进行1 % (g/mL)琼脂糖凝胶电泳。
[0039] 产物回收与纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶块，用DNA快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。具体操作步骤按Geneaid公司凝胶回收试剂盒的说明书进行。
[0040] 产物酶切与纯化酶切反应总体积为40 µL：PCR回收片段30.0 µL，1 0× T buffer 6.0 µL，BamH I 2.0 µL，Sal I 2.0 µL。37 ℃作用3.0 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
[0041] 酶切纯化酶切反应总体积为40 µL：pUSG11/P28质粒30.0 µL，10 × T buffer 6.0 µL，BamH I
2.0 µL，Sal I 2.0 µL。37 ℃作用3.0 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
2.0 µL，Sal I 2.0 µL。37 ℃作用3.0 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。
[0042] 目的片段cap与pUSG11/P28的连接酶切回收PCR产物6.0 µL，载体pUSG11/P28酶切回收产物2.0 µL，10*T4连接酶缓冲液1.0 µL，T4 DNA连接酶1.0 µL，混匀各产物后在16 ℃连接过夜。连接产物pUSG11/P28C（图1）转化DH5α。
[0043] 大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备和转化DH5α感受态细菌的制备及连接产物的转化过程详见《分子克隆 实验指南》。
[0044] 重组质粒的提取和鉴定用质粒提取试剂盒提取重组质粒pUSG11/P28C并用PCR和双酶切鉴定，在PCR和双酶切鉴定中都可以见到目的条带（图2）。
[0045] 目的基因cap序列分析测序工作由invitrogen公司协助完成。测序结果如SEQ ID NO: 3所示，克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。
[0046] 实施例3 含有cap基因的重组猪痘病毒的制备及测定3.1 PK15细胞的复苏、培养与冻存
在37℃水浴中轻轻振荡融化一管冻存的PK15细胞；用70 %的酒精仔细洗涤外壁后放入超净工作台中；把细胞转入一个无菌的15mL的离心管中，加入10 %血清的MEM，600 g 离心5 min，以沉淀细胞；弃去上清，用10.0 mL的10 %的新生牛血清的MEM重悬细胞，然后加入100 mL的细胞瓶中；37 ℃ 5 %的二氧化碳培养箱中培养。至形成单层，再用胰酶在室温下消化1-3min分离细胞；轻敲细胞瓶壁使细胞移动，用倒置显微镜来观察细胞是否变圆和分离；用新的营养液对细胞按需要分瓶。为了保存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细胞密度必须低于50 %。把健康生长处于对数期的细胞完全消化下来；离心，沉淀细胞；用少量含10 %血清的MEM重悬细胞；用血细胞计数器进行记数；用50 % MEM+10% DMSO+40%
6
新生牛血清使每毫升细胞密度达到1×10 个；在1.8 mL的冻存管分装1.0 mL的细胞；把冻存管放在泡沫盒内置低温冰箱24 h；24h后迅速把低温冰箱的细胞转入液氮中。
在37℃水浴中轻轻振荡融化一管冻存的PK15细胞；用70 %的酒精仔细洗涤外壁后放入超净工作台中；把细胞转入一个无菌的15mL的离心管中，加入10 %血清的MEM，600 g 离心5 min，以沉淀细胞；弃去上清，用10.0 mL的10 %的新生牛血清的MEM重悬细胞，然后加入100 mL的细胞瓶中；37 ℃ 5 %的二氧化碳培养箱中培养。至形成单层，再用胰酶在室温下消化1-3min分离细胞；轻敲细胞瓶壁使细胞移动，用倒置显微镜来观察细胞是否变圆和分离；用新的营养液对细胞按需要分瓶。为了保存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细胞密度必须低于50 %。把健康生长处于对数期的细胞完全消化下来；离心，沉淀细胞；用少量含10 %血清的MEM重悬细胞；用血细胞计数器进行记数；用50 % MEM+10% DMSO+40%
6
新生牛血清使每毫升细胞密度达到1×10 个；在1.8 mL的冻存管分装1.0 mL的细胞；把冻存管放在泡沫盒内置低温冰箱24 h；24h后迅速把低温冰箱的细胞转入液氮中。
[0047] 重组猪痘病毒的获取用脂质体转染法使穿梭载体pUSG11/P28C与猪痘病毒（SPV）株VR-363（购自ATCC）发生同源重组。提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞。先用
0.05 MOI的SPV感染PK15单层细胞，1 h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到24孔细胞培养板中。PK15细胞继续在37 ℃ 5 %的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-cap原液。
0.05 MOI的SPV感染PK15单层细胞，1 h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到24孔细胞培养板中。PK15细胞继续在37 ℃ 5 %的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-cap原液。
[0048] 重组猪痘病毒的噬斑纯化5
在6孔细胞板的每一个孔接种3.0×10 个细胞，5%的二氧化碳温箱中静止培养；待细胞长成完全单层后，把重组病毒原液按1：5倍比稀释接种到单层细胞上，37 ℃吸附1.5 h；
弃去感染液，用DHanks缓冲液轻轻地洗两次；然后每孔加入3.0 mL左右的甲基纤维素营养液，37℃ 5%的二氧化碳温箱中静止培养3-5天，观察噬斑；待能观察到明显的噬斑后，在荧光显微镜下，用灭菌枪头挑取显绿色荧光的噬斑放入含200.0 µL无菌PBS的无菌离心管中，反复冻融三次；12000 rpm离心5 min；收获的病毒接种于一新的6孔细胞培养板中，重复10次。
在6孔细胞板的每一个孔接种3.0×10 个细胞，5%的二氧化碳温箱中静止培养；待细胞长成完全单层后，把重组病毒原液按1：5倍比稀释接种到单层细胞上，37 ℃吸附1.5 h；
弃去感染液，用DHanks缓冲液轻轻地洗两次；然后每孔加入3.0 mL左右的甲基纤维素营养液，37℃ 5%的二氧化碳温箱中静止培养3-5天，观察噬斑；待能观察到明显的噬斑后，在荧光显微镜下，用灭菌枪头挑取显绿色荧光的噬斑放入含200.0 µL无菌PBS的无菌离心管中，反复冻融三次；12000 rpm离心5 min；收获的病毒接种于一新的6孔细胞培养板中，重复10次。
[0049] 重组猪痘病毒滴度的测定按病毒学操作手册介绍的方法，用含青霉素和链霉素的DHanks缓冲液将病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满PK15细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔接种100 µL。同时设定阴、阳性对照。37 ℃ 5% CO2温箱培养2 h后，换维持液继
7.8
续培养。逐日观察细胞病变，并按Reed-Muech法计算病毒滴度。滴度为10 PFU/mL。
7.8
续培养。逐日观察细胞病变，并按Reed-Muech法计算病毒滴度。滴度为10 PFU/mL。
[0050] 检测重组猪痘病毒取出同步接种重组猪痘病毒的PK15细胞和接种猪痘病毒野毒的PK15细胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取试剂盒按其说明提取病毒DNA，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物电泳检测结果如图3所示，结果表明重组猪痘病毒中含有cap基因片段，而对照的猪痘病毒野毒中扩增不出cap基因。
[0051] 检测目的蛋白Cap的表达按5 MOI将重组猪痘病毒rSPV-cap接种到PK15细胞单层上，37 ℃ 5 %的二氧化碳温箱中培养2天，使病毒大量增殖；弃去细胞培养液，并用灭菌PBS冲洗两次，加入少量灭菌PBS，用细胞刮子将单层细胞刮下，收获细胞；反复冻融两次，使重组猪痘病毒充分释放，进行SDS-PAGE电泳，同时设SPV野毒感染的阴性对照和PK15细胞空白对照；再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上；然后用5%脱脂奶封闭，置4 ℃冰箱中过夜；次日将膜放入含1：5000 稀释的含一抗（PCV2多抗）的封闭液中置37 ℃摇床中50 rpm作用1 h，将膜取出用TBST 洗三次，每次5 min，再将膜放入含1：10000稀释的含酶标二抗（HRP标记的SPA）的封闭液中，同样条件作用1 h，再用TBST 洗三次，每次5 min，将膜放入“沉淀型TMB单组份底物”中，使其显色。结果（图4）表明目的蛋白Cap在重组猪痘病毒中有较高效率的表达，而在阴性对照和空白对照中则没有目的蛋白出现。
[0052] 间接免疫荧光实验在24孔细胞培养板上接种PK15细胞，使其长成细胞单层；用DHanks缓冲液将重组猪痘病毒进行稀释，按15 PFU/孔接种细胞，同时设定阴性对照；在37℃ 5%的二氧化碳温箱中温育60 h；弃去营养液，用PBS洗涤细胞，然后弃去PBS；加入-20 ℃预冷的甲醇，固定
10min；用PBST冲洗3次后加入含10 % BSA 的PBST，37 ℃封闭1h；加入鼠源PCV2多抗，
37℃孵育1h；PBST冲洗3次，加入罗丹明标记的羊抗小鼠IgG-R二抗，37 ℃作用0.5 h；最后用PBST冲洗3次后，在荧光显微镜下观察。
10min；用PBST冲洗3次后加入含10 % BSA 的PBST，37 ℃封闭1h；加入鼠源PCV2多抗，
37℃孵育1h；PBST冲洗3次，加入罗丹明标记的羊抗小鼠IgG-R二抗，37 ℃作用0.5 h；最后用PBST冲洗3次后，在荧光显微镜下观察。
[0053] 结果（图5）表明：A组接种了重组猪痘病毒，感染的PK15细胞胞浆内出现了明显的荧光；而阴性对照组B组接种了猪痘病毒野毒，未观察到荧光。
[0054] 实施例4 免疫保护实验4.1 重组猪痘病毒诱导巴马香猪体内产生抗体试验
取24头4周龄PCV2血清阴性的巴马香猪，购自上海农业科学院，随机分成四组。第一
8.0
组8头，用3.5 × 10 TCID50的本发明重组猪痘病毒rSPV-cap通过颈部肌肉注射的方
8.0
式免疫接种；第二组8头，用3.5 × 10 TCID50的猪痘病毒野毒株（wtSPV）以同样方式颈部肌肉注射免疫；第三组4头，为PBS免疫的阴性对照组；第四组4头，为不免疫、不攻毒的空白对照组。初次免疫后的第14天按相同方法进行二免；免疫后每天观察实验猪，以记录其免疫反应；免疫前及免疫后每周采血，分离血清，用间接ELISA法测其抗体效价，测定结果见图6。
取24头4周龄PCV2血清阴性的巴马香猪，购自上海农业科学院，随机分成四组。第一
8.0
组8头，用3.5 × 10 TCID50的本发明重组猪痘病毒rSPV-cap通过颈部肌肉注射的方
8.0
式免疫接种；第二组8头，用3.5 × 10 TCID50的猪痘病毒野毒株（wtSPV）以同样方式颈部肌肉注射免疫；第三组4头，为PBS免疫的阴性对照组；第四组4头，为不免疫、不攻毒的空白对照组。初次免疫后的第14天按相同方法进行二免；免疫后每天观察实验猪，以记录其免疫反应；免疫前及免疫后每周采血，分离血清，用间接ELISA法测其抗体效价，测定结果见图6。
[0055] 结果可知：用本发明重组猪痘病毒免疫的猪的血清抗体效价明显高于其余三组。这表明本发明的重组猪痘病毒载体疫苗能够有效激发特异性针对猪圆环病毒2型的体液免疫。
[0056] 重组猪痘病毒对巴马香猪的攻毒保护试验5
免疫（同4.1）后第37天，除空白对照组外，其他三组的试验猪均滴鼻攻毒5×10 TCID50临床分离的PCV2病毒。攻毒后4天，所有的攻毒猪均多点注射4.0ml（2.0mg）的匙孔血蓝蛋白（KLH），配合使用不完全弗氏佐剂（ICFA），分四点注射，分别为两腋窝及两胯，每点1ml。同时，每头攻毒猪均腹腔注射10.0ml的巯基乙醇酸钠培养液（glycan），以刺激腹膜巨噬细胞的渗出。3天后，以同样的方法再次注射KLH/ICFA和glycan。攻毒后第11天和第19天，再次注射glycan。
免疫（同4.1）后第37天，除空白对照组外，其他三组的试验猪均滴鼻攻毒5×10 TCID50临床分离的PCV2病毒。攻毒后4天，所有的攻毒猪均多点注射4.0ml（2.0mg）的匙孔血蓝蛋白（KLH），配合使用不完全弗氏佐剂（ICFA），分四点注射，分别为两腋窝及两胯，每点1ml。同时，每头攻毒猪均腹腔注射10.0ml的巯基乙醇酸钠培养液（glycan），以刺激腹膜巨噬细胞的渗出。3天后，以同样的方法再次注射KLH/ICFA和glycan。攻毒后第11天和第19天，再次注射glycan。
[0057] 攻毒后，所有猪均观察34天，每天记录体温、体重、日采食量以及其他临床症状，计算每组的平均日增重及饲料转化率（平均日采食量/平均日增重），结果见表1。 [0058] 表1 PCV2攻毒后的临床指标评价。
[0059] * rSPV-cap免疫组的平均日增重显著高于猪痘病毒野毒免疫组及阴性对照组(P < 0.01)。
[0060] 结果（表1）表明：用本发明重组猪痘病毒免疫的猪攻毒后的临床指标明显高于猪痘病毒野毒免疫组及阴性对照组。其中，平均日增重数值越大，表明试验猪生长速度越快，疫苗的免疫效果越好。平均日采食量(kg)为了计算饲料转化率（平均日采食量/平均日增重）而给出，饲料转化率的数值越小，表明试验猪对饲料的利用率越高，疫苗的免疫效果越好。
[0061] 在攻毒后第4、11、18、25及32天，从每个组中随机选3头猪，采血，分离血清，用病毒核酸提取试剂盒提取血清中的核酸，用Real-time PCR方法检测各头猪血清中的PCV2含量，结果见图7。
[0062] 结果表明：用本发明重组猪痘病毒免疫的猪攻毒后的血清中的PCV2含量显著低于猪痘病毒野毒免疫组及阴性对照组。
[0063] 攻毒后的组织病理学检测攻毒后第35天，所有试验猪安乐处死，进行组织病理学检查。
[0064] 肺部大体病变评分：取各试验猪的肺脏，用生理盐水冲掉表面血液，检查依次尖叶、心叶、膈叶和副叶各部分。肺部病变按其严重程度予以评分，最高10分（大面积坏死或淤血），最低0分（无肉眼可见病变）。综合评分按各部分的加权平均分计算：（0.1×左前叶）+（0.1×左中叶）+（0.25×左尾叶）+（0.1×右前叶）+（0.1×右中叶）+（0.25×右尾叶）+（0.1×副叶）。
[0065] 肺部组织病理学病变评分：切取每头被检猪的肺部，选取左右肺尾叶和右中叶三部分，先用10% 中性福尔马林液体固定，然后进行HE染色，最后进行组织病理学检查。重点观察肺不张、上皮细胞坏死、出血、气道堵塞、上皮细胞增生、间质的变化、炎性细胞浸润、肺泡壁较厚等病理变化，按病变的严重程度予以评分，从0（无病变）到3（严重病变），然后将三部分得分相加作为每头被检猪的肺部微观病变评分，结果见表2。
[0066] 表2 肺部病变评分。组号 个数 免疫情况 大体病变 显微病变
1 8 rSPV-Cap 2.52±0.49 2.80±0.32
2 8 wtSPV 7.43±0.68 5.28±0.33
3 4 PBS 7.87±0.73 5.63±0.62
4 4 ------ 0.00±0.00 0.00±0.00
1 8 rSPV-Cap 2.52±0.49 2.80±0.32
2 8 wtSPV 7.43±0.68 5.28±0.33
3 4 PBS 7.87±0.73 5.63±0.62
4 4 ------ 0.00±0.00 0.00±0.00
[0067] 结果表明：用本发明重组猪痘病毒免疫的猪攻毒后的肺部病变评分显著低于猪痘病毒野毒免疫组及阴性对照组。
[0068] 综上所述，本专利所涉及的重组猪痘病毒疫苗能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白Cap，能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用，是一种理想的新型疫苗。
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