猪圆环病毒2型疫苗
阅读：809发布：2020-05-21
专利汇可以提供猪圆环病毒2型疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是基于猪 圆环病毒 2型(PCV2)的ORF3基因以及对其凋亡作用的鉴定。本公开内容导致开发了针对PCV2的减毒活 疫苗 。，下面是猪圆环病毒2型疫苗专利的具体信息内容。
1.免疫原性的减毒PCV2病毒，其中所述减毒至少部分地归因于 异常ORF3表达。
2.如权利要求1所述的病毒，其中从ORF3表达的蛋白具有减弱 的功能或无功能。
3.如权利要求1所述的病毒，其中所述ORF3蛋白表达减弱或不 表达。
4.如权利要求1或2所述的病毒，其中在所述病毒的ORF3中有 至少一个突变，以及其中ORF3中的所述突变是这样的：所述突变不 导致ORF1编码的蛋白中的任何变化。
5.如权利要求4所述的病毒，其中ORF3的起始密码子被突变， 以至于所述起始密码子是无功能的，并且以至于ORF1编码的蛋白无 变化。
6.如权利要求4所述的病毒，其中所述突变包括插入到ORF3中 的终止密码子。
7.如权利要求6所述的病毒，其中所述插入到ORF3中的终止密 码子为SEQ ID NO.19中所示。
8.如权利要求4所述的病毒，其中所述突变包括SEQ ID NO.21 中所列的ORF3α螺旋区的突变。
9.如权利要求4所述的病毒，其在ORF3中包含一个或多个突变。
10.如权利要求9所述的病毒，其中所述两个或多个突变选自起 始密码子、Ala27终止和Glu61Lys的突变。
11.如权利要求4所述的病毒，其包含两个突变，所述突变由起 始密码子的突变和第二突变组成，所述第二突变选自SEQ ID NO.19 中所列的插入终止密码子，或SEQ ID NO.21中所列的α螺旋区的突 变。
12.如权利要求11所述的病毒，其中所述ORF3包含SEQ ID NO. 23或SEQ ID NO.24中所列的核苷酸序列。
13.如权利要求4所述的病毒，其包含起始密码子突变、SEQ ID NO.19中所列的插入终止密码子以及SEQ ID NO.21中所列α螺旋区 的突变。
14.如权利要求13所述的病毒，其中所述ORF3包含SEQ ID NO. 25中所列的核苷酸序列。
15.疫苗，其包含免疫学有效量的权利要求1至10中任一权利要 求所述的病毒。
16.药物组合物，其包含免疫学有效量的权利要求1至14中任一 权利要求所述的病毒，连同药物可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释 剂。
17.诱导针对PCV2的免疫反应的方法，所述方法包括对个体给 予权利要求15的疫苗。
18.权利要求1至14中任一权利要求所述的病毒在药物中的用 途，优选在个体中诱导针对PCV2的免疫反应的用途。
19.权利要求1至14中任一权利要求所述的病毒在制备用于在个 体中诱导针对PCV2的免疫反应的药物中的用途。
20.如权利要求16所述的方法、如权利要求18所述的病毒或如 权利要求19的用途，其中所述个体为猪。
21.用于产生权利要求1至14中任一权利要求所述的病毒的宿主 细胞。
22.治疗或预防动物疾病的方法，所述方法包括对所述动物给予 免疫学有效量的权利要求1至14所述的病毒。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述动物为猪。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病为断奶仔猪多系统 衰竭综合征。
25.产生权利要求1至14中任一权利要求所述的病毒的方法，所 述方法包括在适合条件下以使得能够产生所述病毒的方式培养权利要 求21所述的宿主细胞。
26.如权利要求22所述的方法，其还包括从培养基分离所述病毒。
27.能够诱导凋亡并且包含SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列的 蛋白。
28.能够诱导凋亡并且与SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列有至 少65％、80％或90％序列一致性的蛋白。
29.能够诱导凋亡并且为权利要求27或28所述的蛋白的活性片 段的蛋白。
30.如权利要求27至29中任一权利要求所述的蛋白，其中所述 蛋白以融合蛋白的形式提供。
31.核酸分子，其编码权利要求27至30中任一权利要求所述的 蛋白。
32.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO.2中所列的序列，或者包含在遗传密码简并性内对应于SEQ ID NO.2的序列。
33.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与 SEQ ID NO：2的核酸序列或者其在遗传密码简并性内的对应序列有至 少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％同源性 的序列。
34.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述核酸分子能够在高 严紧条件下与SEQ ID NO.2中定义的核酸序列或与其在遗传密码简并 性内的对应序列杂交。
35.包含权利要求32至34中任一权利要求所述的核酸分子的突 变形式的核酸分子，所述核酸分子是突变的以至于由权利要求32至 34中任一权利要求所述的核酸分子编码的蛋白异常表达。
36.如权利要求35所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO.3中所列的核酸序列或者其简并形式。
37.权利要求36所述的核酸分子编码的蛋白。
38.包含权利要求33至36中任一权利要求所述的核酸分子的载 体、病毒或宿主细胞。
39.能够结合权利要求27至30中任一权利要求或权利要求37所 述的蛋白的抗体。
40.产生权利要求39所述的抗体的方法，所述方法包括对动物给 予权利要求27至30中任一权利要求或权利要求37所述的蛋白，并且 从所述动物收集抗体。
41.鉴定权利要求27至30中任一权利要求或权利要求37所述的 蛋白的激动剂或拮抗剂的方法，其中所述方法包括确定测试化合物是 否增强或减弱所述蛋白诱导凋亡的能力。
42.根据其诱导断奶仔猪多系统衰竭综合征而筛选出至少一种候 选分子的方法，其中所述方法包括：
(a)使所述至少一种候选分子与生物样品接触；以及
(b)测定所述至少一种候选分子在所述生物样品中诱导的凋亡水 平，
其中所述凋亡水平表明所述至少一种候选分子诱导断奶仔猪多系 统衰竭综合征的能力。
43.鉴定权利要求42所述的蛋白的激动剂或拮抗剂的方法，其中 所述方法包括确定候选分子是否增强或减弱所述蛋白诱导凋亡的能 力。
发明领域
本发明涉及产生新的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2， PCV2)病毒和提供针对该病毒的疫苗。
出于所有目的，将在本文中引用的所有文件(“本文引用文件”) 以及在本文引用文件中引用或参考的所有文件在此通过参考并入本 文。
并非承认本文中引用的多个文件中的任一个为本发明的现有技 术。
发明背景
断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)
PMWS是新出现的影响幼猪和断奶猪的疾病，现在在很多产猪国 流行，对全球养猪产业造成潜在的经济影响。尽管在4-20周龄的猪中 有该疾病的描述(42)，但PMWS主要影响5至18周龄的猪。临床PMWS 迹象包括渐进的体重减轻、呼吸困难、呼吸急促、贫血、腹泻和黄疸。 死亡率可以在1至2％之间变动，在复杂病例中可高至30％。
猪圆环病毒(PCV)最初作为猪肾细胞培养物(PK15 ATCC CCL-33) 的污染物而被鉴定(47)。PCV病毒体为二十面体，无被膜，直径17nm， 具有约1.76kb的单链环状DNA。PCV在分类上属于圆环病毒科 (Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，其包括其它的动物圆环病毒， 例如鹦鹉喙羽病毒、鹅圆环病毒、金丝雀圆环病毒和鸽圆环病毒(35，38， 50，51，52)。已经识别出两种PCV基因型。PK15细胞来源的PCV被 认为对猪是不致病的(3，48)，并被指定为PCV 1型(PCV1)。血清学观 察表明PCV1在猪体内广泛分布，但没有已知的动物疾病与PCV1相 关。另一方面，PCV 2型(PCV2)现在被认为是与断奶仔猪多系统衰竭 综合征(PMWS)有关的主要传染原(2，6，20)，该疾病自其在1991年在 加拿大出现以来成为新的全球性猪病(1，8)。
PCV2和其作用模式
凋亡为具有特异形态学和生物化学变化的细胞自我破坏的主动生 理学过程(39)。很多病毒将诱导凋亡作为它们天然生活周期的一部分 (39)。一方面，凋亡可能是释放和传播宿主细胞产生的子代病毒体的 重要机制，通过使对病毒剂的炎性或免疫反应降至最低。另一方面， 病毒诱导的凋亡可视为多细胞宿主生物有目的的破坏被感染细胞的防 御机制。大多数导致凋亡细胞死亡的病毒触发caspase(半胱氨酸天冬 氨酸蛋白酶)级联来执行该死亡程序过程。有人提出凋亡为导致天然感 染PMWS的猪中B细胞减少的机制(43)，但是最近报道了相反的结果： 淋巴细胞凋亡在PMWS淋巴样减少损伤的发生中并非普遍现象(24， 37)。
在PCV1或PCV2分离群内总体DNA序列同源性大于90％，但是 PCV1和PCV2分离群之间的同源性为68-76％。已鉴别了两个主要的 PCV开放阅读框(ORF)-ORF1，也称为rep基因，编码与病毒复制有 关的35.7kDa蛋白(26)，和ORF2，cap基因，编码27.8kDa的主要免 疫原性衣壳蛋白(9，30，31)。除了复制酶ORF1和衣壳蛋白ORF2，通 过计算机搜索预计还含有其它五个编码大于5kDa蛋白的潜在ORF (27)。这些潜在ORF是否被表达以及表达的蛋白是否为病毒复制所必 需还有待阐明。
对于PCV2，这五个ORF中最大的是长度315bp的片段，这里称 为ORF3，其没有显示出与任何已知蛋白的相似性。相反，位于PCV1 的对应区域内的ORF片段为612bp长，远大于PCV2中的ORF3。此 外，在PCV2的ORF3和PCV1的对应区域之间仅有61.5％的氨基酸 一致性。这种变异是否与PCV2的病原性有关还有待确认。
PMWS患病猪的组织病理学发现和疾病特征提示，在一些情况下， PCV2可能是猪继发性免疫缺陷的诱因。PMWS患病猪中显微损伤的 特征是滤泡和滤泡间细胞区域的淋巴细胞减少，以及淋巴组织的巨噬 细胞渗透。此外，其它传染原与PCV2的共同感染增加了该疾病的发 生率和严重性。(2，3)
由于死亡率在一些农场仍然相当高，目前PMWS在全球养猪业中 仍是重要问题。尽管在开发针对PCV2的DNA疫苗或亚单位疫苗方面 有些资料，但是针对某些病原体的活减毒疫苗的潜在和保护效力仍应 是重要考虑内容。现在仍未知在防止该疾病散布方面有效的减毒活疫 苗。
目前可得到两种疫苗：ORF2重组亚单位疫苗和DNA疫苗。尽管 两种疫苗在完全抑制PCV2的复制方面有效，但是缺乏有利的特点降 低了它们作为针对PCV2的有效疫苗的商业价值。DNA疫苗能够在猪 体内诱导体液和细胞应答，但是缺乏适合的递送系统来适当地给予该 疫苗。这影响了其在减弱PCV2感染中的有效性，而这只有在感染后 3周才能看到(5)。尽管亚单位疫苗对PCV2更有效，但其仅能刺激体 液免疫。通过使用杆状病毒系统获得的低蛋白浓度也意味着要使动物 对PCV2免疫需要对动物进行多次给药，由此而降低了其有效性。另 外，实验动物的显著生长迟缓在PCV2感染后的第三和第四周仍很明 显。而且，对两种疫苗的初免-加强方案还有待确认。
因此，需要改进的疫苗以对抗PMWS。
概要
本发明基于对ORF3基因的发现和对其在病毒中的凋亡作用的鉴 定。该发现导致开发针对PCV2的减毒活疫苗。
本发明的第一方面提供免疫原性的减毒PCV2病毒，其中该减毒 至少部分地归因于异常ORF3表达。
本发明的第二方面提供疫苗，其包含免疫学有效量的本发明第一 方面的病毒。
本发明的第三方面提供诱导针对PCV2的免疫反应的方法，所述 方法包括向个体给予本发明第二方面的疫苗。
本发明的第四方面提供本发明第一方面的病毒在药物中的用途。
本发明的第五方面提供在个体中诱导针对PCV2的体液免疫反应 和细胞免疫反应的病毒。
本发明的第六方面提供本发明第一方面的病毒在制备用于在个体 中诱导针对PCV2的免疫反应的药物中的用途。
本发明的第七方面提供用于产生本发明第一方面的病毒的宿主细 胞。
本发明的第八方面提供采用本发明第一方面的病毒的治疗方法， 该方法包括对所述动物给予免疫学有效量的病毒。
本发明的第九方面提供产生本发明第一方面的病毒的方法，该方 法包括在适当条件下以使得能够产生所述病毒的方式培养本发明第七 方面的宿主细胞。
本发明的第十方面提供能够诱导凋亡的蛋白。在一个实施方案中， 该蛋白包含如SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列： MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLH FPAHFQKFSQPAEISDKRYRVLLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSL RSRSSTFYQ。
本发明的第十一方面提供编码本发明第十方面的蛋白的核酸。
在一个实施方案中，该核酸分子包含SEQ ID NO.2中所列的序列： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA。
本发明的第十二方面提供包含突变形式的本发明第十一方面核酸 分子的核酸分子，所述核酸分子是这样突变的，以至于该核酸分子编 码的蛋白异常表达。
本发明的第十三方面提供由本发明第十二方面的核酸分子编码的 蛋白。
本发明的第十四方面提供包含本发明第十一或第十二方面的核酸 分子的载体、病毒或宿主细胞。
本发明的第十五方面提供能够结合本发明第十或第十三方面的蛋 白的抗体。
本发明的第十六方面提供产生能够结合本发明第十或第十三方面 的蛋白的抗体的方法。
本发明的第十七方面提供药物组合物，其包含本发明的核酸分子、 蛋白、抗体、拮抗剂、激动剂、病毒、载体或宿主细胞。
本发明的第十八方面提供鉴定本发明第十方面的蛋白的激动剂或 拮抗剂的方法。
该方法可以包括：
(i)使测试化合物与本发明第十方面的蛋白接触并确定该测试化 合物是否增强或减弱该蛋白诱导凋亡的能力；或者
(ii)在细胞中表达本发明第十方面的蛋白，将细胞暴露于测试化 合物并确定该测试化合物是否增强或减弱该蛋白诱导凋亡的能力。
本发明的第十九方面提供通过本发明第十八方面鉴定的激动剂或 拮抗剂。
本发明的第二十方面提供根据其诱导断奶仔猪多系统衰竭综合征 的能力而筛选出至少一种候选分子的方法。
所述方法可以包括：
(a)使所述至少一种候选分子与生物样品接触；以及
(b)测定所述至少一种候选分子在所述生物样品中诱导的凋亡水 平。所述凋亡水平表明所述至少一种候选分子诱导断奶仔猪多系统衰 竭综合征的能力
在一个实施方案中，所述方法还包括确定候选分子是否增强或减 弱蛋白诱导凋亡的能力。
术语词汇
这部分旨在提供对以下列出的词语和短语(及其合适的语法变体) 的解释的指导。
当用在本申请中时，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数指代， 除非上下文清楚地指明并非如此。例如，术语“试剂”包括多种试剂， 包括其混合物。
用在本文时，术语“包含(comprising)”指“包括(including)”。 在本说明书的上下文中，术语“包含”指“主要包括，但不必仅为”。 单词“包含(comprising)”的变体，如“包含(comprise)”和“包含 (comprises)”具有相应的变化的含义。
用在本文时，术语“疫苗”包括可以被用于刺激动物的免疫系统 的试剂。以此方式可以提供针对不被免疫系统识别为自身抗原的抗原 的免疫保护。
术语“免疫”包括向个体递送免疫原的过程。例如，免疫可以引 起持续的高水平抗体和/或细胞应答，其中T淋巴细胞能够杀死或抑制 经免疫的动物中的病原体，这是针对该动物之前接触过的病原体或抗 原。
术语“蛋白”指由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。术语“蛋 白”和“多肽”本文中可互换使用，尽管出于本发明的目的，“多肽” 可以构成全长蛋白的一部分，例如其功能或活性片段。或者，术语“蛋 白”也可以构成功能变体。
用在本文时，术语“多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 碱基或已知的类似物或天然核苷酸或其混合物的单链或双链聚合物。
遍及整个公开内容，本发明的多个方面都以范围形式呈现。应理 解的是，范围形式的描述仅仅是出于方便和简洁的目的，不应被理解 为对本发明的范围的不变限定。因此，范围说明应被认为是已经明确 公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1 至6的范围的说明应被理解为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1 至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值， 例如1、2、3、4、5和6。其使用与范围的宽度无关。
除非另有说明，本文使用的所有科技术语的含义与本发明所属领 域普通技术人员所通常理解的相同。
附图说明
图1 (A)感染性PCV2分子DNA克隆的构建。用于扩增完整PCV2 基因组的引物对的相对位置用箭头表示(反向引物，R-PCVPST1；正向 引物，F-PCVPST1)。通过PCR扩增的PCV2基因组DNA用PstI限制 酶消化并纯化。将纯化和消化的基因组DNA连接到pSK载体中，其 之前用PstI酶预消化以产生分子PCV2 DNA克隆。该DNA克隆被进 一步消化和凝胶纯化用于PCV2的自身连接，然后将环化的PCV2 DNA转染进PK15细胞。(B)图解缺乏ORF3基因的PCV2突变体的 构建。(C)PCV2株BJW的遗传图(GenBank登录号AY847748)。三个 开放阅读框的编码序列用nt坐标表示，其表明每个基因的核苷酸位点。 ORF2和ORF3基因向左方转录，ORF1向右转录。也标出了PstI限制 酶位点。(D)通过RT-PCR分析PCV2感染细胞内的ORF3基因。从 PCV2感染或假感染细胞分离RNA并逆转录成cDNA。用成对的ORF3 引物扩增cDNA。采用PCR反应从PCV2基因组扩增阳性片段。(E)从 PCV2感染的PK15细胞通过ISH检测ORF3 RNA。采用反义ORF3 DIG 标记的RNA探针(riboprobe)在感染后24(a)，48(b)，72(c)，和96(d)h 在感染细胞的核中检测到ORF3 mRNA表达。还采用有义ORF3 DIG 标记的RNA探针在感染后48h在感染细胞中检测到ORF1 mRNA表 达(e)。采用反义ORF3 RNA探针在假感染细胞(f)中没有检测到信号。 标尺，10μm。
图2 ORF3蛋白在PCV2感染细胞中的表达。(A)用针对PCV2的 ORF3蛋白产生的抗血清检测PCV2感染的PK15细胞。使用PCV2株 BJW在感染后24(b)，48(c)，和72(d)h时的感染后PK15细胞的IFA 染色。当通过IFA染色假感染的PK15细胞时将(a)用作阴性对照。采 用荧光显微镜观察和拍照细胞。ORF3抗原位于细胞核中，在感染细 胞的细胞质中较少。标尺，10μm。(B)将来自PCV2株BJW感染的 PK15细胞的总细胞裂解物在15％ SDS-PAGE中电泳，转移至硝酸纤 维膜，并通过抗ORF3抗体的抗血清检测。感染后ORF3蛋白在PCV2 感染的细胞中表达。
图3 将ORF3缺陷PCV2感染的细胞的IFA染色用于检测ORF3 蛋白表达。用重组PCV2病毒储备(stock)(A和B)或用第五代ORF3 缺陷PCV2病毒储备(D和E)以MOI为1感染PK15细胞。将假感染 PK15细胞用作阴性对照(C和F)。在感染后48h，将细胞固定并通过 小鼠抗ORF3血清(A，D，和F)或猪抗PCV2血清(B，C，和E)免疫荧光 染色来进行分析。标尺，10μm。
图4 ORF3缺陷PCV2以及重组PCV2和野生型PCV2的复制动力 学。用标明的病毒以MOI为1感染PK15细胞并在标明的时间点收集 细胞，通过IFA确定以TCID50/ml表示的感染滴度。
图5 PCV2在培养的PK15细胞中诱导凋亡。(A)通过DAPI染色 PCV2感染的PK15细胞显示核小体DNA片断化。用PCV2株BJW感 染的细胞在感染后48(a和b)和72(d和e)h分别用猪抗PCV2血清通 过IFA检测和用DAPI染色。在c和f中显示了叠加图。标尺，10μm。 (B)在电子显微镜下观察PCV2诱导的凋亡。假感染细胞(a)，完整的 细胞核(N)显示大的、唯一的电子致密核仁(n)。感染后48(b)和72(c)h 时的细胞显示典型的凋亡标志，如染色质向外围浓缩至新月形物质(短 箭头)，和细胞核片断化，它们各自形成凋亡小体。标尺，2μm。
图6 定量测定PCV2诱导的凋亡细胞。(A)通过对用PCV2株BJW 感染的PK15细胞的碘化丙啶染色和流式细胞术分析来确定凋亡的代 表图。对于每个小图，表明了具有亚二倍体(凋亡)DNA含量的PK15 细胞的百分比(M1)。B显示A中所示的三个实验的凋亡的平均百分比。 C显示在标明的时间三个实验中脱离细胞的平均百分比。
图7 单独的ORF3蛋白在感染的细胞中诱导凋亡。(A)用 GFP-ORF3质粒转染的PK15和Cos-7细胞在24h时分别显示ORF3 表达(a和d)和DAPI染色显示的核小体DNA片断化(b和e)。在c和f 中显示了叠加的图像。标尺，10mm。(B)定量分析ORF3蛋白诱导的 凋亡。通过DAPI染色的核形态分析对三个实验的凋亡细胞百分比进 行评价。(C)显示了B中所示的三个实验中脱离细胞的平均百分比。
图8 (A)对三个实验组腹股沟淋巴结的组织病理学检查显示感染 后的第7和14天时阴性对照和mPCV2组的生发中心处健康和密集的 淋巴细胞。然而野生型PCV2在感染后第7天显示组织细胞炎性渗透 以及淋巴细胞减少的迹象，且在感染后第14天时有显著大量的凋亡细 胞(箭头)。HE，标尺＝200μm。
(B)阴性对照的腹股沟淋巴结显示没有PCV2抗原，而突变体 PCV2和野生型PVC2在感染后第14天显示在淋巴细胞的细胞质中大 量存在PCV2抗原(暗褐色染色)。在免疫组织化学技术中，甲基绿复 染，标尺＝200μm。
图9 PCV2病毒基因组的序列信息。
图10 ORF3中突变的位置。突变体27将Ala变为终止密码子， 导致表达截短的26个氨基酸长的ORF3蛋白。突变体52和61通过分 别将His+改为Asp-以及将Glu-改为Lys+反转了氨基酸电荷。突变体 85通过将His+改为Tyr失去了正电荷。将突变的病毒基因组转染进 PK15细胞，使其生长5天。5天后，收集细胞并通过3X冻融溶解。 然后将总细胞溶解物用于新鲜PK15细胞的感染。
图11在细胞培养第十五次传代后四天时突变体和PCV2转染细胞 的凋亡引起的细胞死亡。相较于突变体52、85和PCV2的70-90％细 胞死亡，突变体27、61及ORF3起始密码子的删除和突变导致的突变 体引起10％的细胞死亡。
图12 ORF3突变体27的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图13 ORF3突变体52的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图14 ORF3突变体61的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图15 ORF3突变体85的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图16 ORF3双突变体ATG & 27的DNA序列。突变点以小写字 体表示。
图17 ORF3双突变体ATG & 61的DNA序列。突变点以小写字 体表示。
图18 ORF3三突变体ATG，27 & 61的DNA序列。突变点以小写 字体表示。
实施方式的详细公开
减毒病毒
本发明提供免疫原性减毒PCV2病毒，其中该减毒至少部分地归 因于异常ORF3表达。
本发明的减毒病毒为免疫原性的，即其能够引起免疫反应。该减 毒病毒可以用在下文描述的疫苗组合物中，以引起针对野生型PCV2 病毒随后攻击的保护性免疫反应。
尽管本发明的病毒能够引起免疫反应并且是有传染性的，但是它 们被充分减毒，以至于不会在经免疫的宿主中引起不可接受的PMWS 症状(或PCV2可能引起的任何其它疾病)。在一个实施方案中，该病 毒被充分减毒，以至于在大多数经免疫的个体中不会发生感染症状。
该减毒至少部分地归因于异常ORF3表达。因而，本发明的病毒 诱导凋亡的能力减弱或缺乏。在一个实施方案中，该减毒完全归因于 异常ORF3表达。
为了避免不确定性，用在本文中时术语“减弱的”包括术语缺乏， 除非上下文明确指明并非如此。
在一个实施方案中，异常ORF3表达是定性的。因此，例如与野 生型ORF3蛋白表达相比，从ORF3表达的蛋白可以具有减弱的功能 或无功能。
使用“减弱的功能或无功能”，我们包括这样的情况，ORF3蛋 白具有一个或多个突变，其导致编码的蛋白与野生型ORF3蛋白相比 诱导凋亡的能力减弱或丧失。
在一个实施方案中，异常ORF3表达是定量的。因此，与野生型 致病性PCV2相比，从ORF3的蛋白表达减弱或缺乏。
在一个实施方案中，异常ORF3表达可以是定量的和定性的，即 该ORF3蛋白与野生型ORF3蛋白相比功能减弱或缺乏并且ORF3蛋 白的表达量比野生型PCV2病毒的ORF3蛋白表达少。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有突变。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有双突变。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有三突变。
在一个实施方案中，在病毒的另一区域中有突变(即在除ORF3之 外的区域)，其影响ORF3表达。
在本发明病毒中的突变应该使得病毒复制依然发生。
在一个实施方案中，突变使得仍产生有功能的ORF1，即ORF1 编码的蛋白仍能够履行其复制角色。在一个这样的实施方案中，在 ORF3序列中有突变，该突变不导致ORF1编码的蛋白中的任何变化。
在一个实施方案中，ORF3的起始密码子被突变，以至于其是无 功能的。ORF3的起始密码子ATG例如可以被突变为A被G替换， 即起始密码子ATG突变为GTG。由于遗传密码的简并性，这种突变 是具有不导致ORF1编码的蛋白中任何变化的优势。
在一个实施方案中，终止密码子替代了ORF3中的丙氨酸，导致 产生无功能的截短的26个氨基酸长的ORF3蛋白。
在一个实施方案中，ORF3中的氨基酸序列被置换，以至于在该 蛋白的α区中所选氨基酸的电荷被反转或变为中性，由此使得到的蛋 白不折叠并变得无功能。在一个实施方案中，61位氨基酸谷氨酰胺- 变为赖氨酸+。
如在下文实施例部分所描述的，通过采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)将特定突变引入PCV2克隆 的基因组来产生这类突变。根据生产商的说明，使用一套诱变引物(正 向引物：5′-GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3′，反向引 物：TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3′)产生突变体 质粒。该突变[以粗体表示在图1B中，(nt671)]不在该位点改变ORF1 蛋白的氨基酸序列，但是将终止ORF3蛋白的表达。
可以用在本发明中的突变的实例包括：引入终止密码子；重排； 置换突变(例如错义和无义突变)；缺失突变(缺失一个或多个核苷酸或 缺失一个或多个密码子)；移码突变；以及插入(插入一个或多个核苷 酸或插入一个或多个密码子)。引入突变的方法在现有技术中是公知 的，技术人员能容易地完成。例如，定点诱变能够增加、删除或改变 一个或多个核苷酸。
突变对ORF3功能/表达的影响例如可以采用在下文材料和方法部 分描述的凋亡测定来确定。
在一个实施方案中，相对于ORF1蛋白而言所述突变为沉默突变 (即对ORF1功能无显著有害影响的突变，且在一个实施方案中对ORF1 功能无影响)。
除了在病毒中存在导致异常ORF3功能的一个或多个突变之外， 病毒中还任选地可以有一个或多个其它突变。例如，该突变可以是以 上描述的任何类型的突变，例如缺失突变。
在一个实施方案中，该病毒在其基因组中不包含任何有损于其诱 导针对PCV2的免疫反应的变化。
在一个实施方案中，该病毒在ORF2序列中不包含任何导致被编 码的ORF2蛋白改变的任何变化。
在一个实施方案中，该病毒在ORF1序列中不包含任何导致被编 码的ORF1蛋白改变的任何变化。
在本发明的一个实施方案中，该PCV2病毒与野生型(致病的) PCV2病毒无区别或无根本区别，除了在病毒中引入了导致异常ORF3 表达的一个或多个突变。
本发明的PCV2病毒在一个实施方案中以分离的形式被提供。分 离的指PCV2处于与野生型病毒的天然环境不同的环境中。例如，所 述病毒可以是细胞培养物或其它人工培养基的组分，在其中其能够在 可控情况下增殖并被表征；作为细胞培养物上清的组分；作为药物组 合物的组分；或从其天然环境中被部分或完全纯化。
尽管以上的讨论涉及本发明的减毒病毒，但适合时上述某些部分 也涉及本发明的其它方面，例如本发明的核酸分子(见下文)。
疫苗
本发明提供包含本发明病毒的疫苗。这类组合物可以按照兽医或 药物领域技术人员熟知的标准技术来制备。
本发明的疫苗包含免疫学有效量的病毒。作为如本文所述产生的 使用免疫学有效量病毒接种的结果，个体变得至少部分地或完全地对 PCV2感染免疫，或对发展中等或严重PCV2感染有抵抗力。本发明 的病毒可以被用于引起体液和细胞应答。
优选地，所述个体被保护至这样的程度：其中PMWS的一至多个 有害生理学症状或影响被减弱、改善或完全防止。
实际上，免疫学有效剂量所需的确切量随个体不同而变化，取决 于多个因素，例如个体的年龄和一般状况，制剂的性质和给药模式， 等等。因此，不可能指定确切的“有效量”。但是，对于任何给定的 病例，本领域普通技术人员仅采用例行试验就可以确定合适的“有效 量”。
例如，现有技术中已知确定或滴定活性抗原剂的合适剂量来得到 基于猪体重的最小有效剂量、抗原浓度和其它典型因素的方法。引起 适当免疫反应的组合物的剂量、其中的组分浓度和组合物给药时间安 排可通过以下方法来确定，例如通过血清的抗体滴定，例如通过ELISA 和/或血清中和测定分析和/或通过在猪中进行接种激发评价。
本发明的疫苗可以包含药物可接受的载体。用语“药物可接受的” 指生理学上可忍受的分子实体和组合物，并且当向个体给药时，通常 不产生变应性或类似的不利反应，例如嘈杂、眩晕等等。有用的载体 在现有技术中是公知的，包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨 酸、透明质酸等等。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗包含佐剂。佐剂为提高个 体(例如猪)对疫苗的免疫反应的物质。适合的佐剂包括但不限于氢氧 化铝(明矾)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子嵌段聚合物或共聚物、 细胞因子(如IL-1，IL-2，IL-7，IFN-α，IFN-β，IFN-γ等)、皂甙、单磷脂酰 脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等。其它适合的佐剂例如包括硫酸 钾铝、分离自大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热的或热稳定的内毒 素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗 氏不完全或完全佐剂等。基于毒素的佐剂如白喉毒素、破伤风毒素和 百日咳毒素可以在使用前被灭活，例如通过用甲醛处理。
在一个实施方案中，提供疫苗，其还包含至少一种来自至少一种 其它病原体的免疫原，所述病原体例如为猪病原体，例如猪繁殖和呼 吸综合征(PRRS)、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、伪狂犬病、猪霍乱、猪流感以及猪细 小病毒(PPV)。来自其它病原体的免疫原可以被包括在本发明病毒的基 因组内或作为本发明疫苗组合物内的独立部分而存在。
根据本发明产生的PCV2可与其它PCV2株等的病毒联合。或者， 多种类型的保护性表位可以被设计进一个病毒中。这种技术在现有技 术中是已知的，技术人员能够容易地实现。
本发明的疫苗能够方便地通过鼻内给予、经皮给予(即应用在皮肤 上或皮肤表面用于全身吸收)、胃肠外给予等。胃肠外给药途径包括但 不限于肌内、静脉内、腹膜内、皮内(即注射或以其它方式置于皮肤下) 途径等。
本发明的疫苗可以适应于任何一种上述途径给药。
当作为液体给药时，本发明的疫苗可以制备为水溶液、糖浆、酏 剂、酊剂等的形式。这类制剂在现有技术中是已知的，通常通过将抗 原和其它典型的添加剂溶解在合适的载体或溶剂系统中来制备。药物 可接受的载体、赋形剂或稀释剂的实例为去矿物质水或蒸馏水；盐水 溶液；基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米 油、芝麻油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、 花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅 氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，如液体石蜡、凡士 林或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤 维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，如乙醇或异 丙醇；低级芳烷醇；低聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二 醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸脂， 如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼 脂；角叉菜胶、西黄蓍胶或阿拉伯胶以及石油胶冻。通常，载体或多 种载体形成组合物重量的10％至99.9％，并且可以采用现有技术中已 知的试剂通过常规方法来缓冲，例如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢 钾、磷酸二氢钾、其混合物，等等。
液体制剂还可以包括含有与其它标准辅配剂(co-formulant)联合的 助悬或乳化试剂的混悬液和乳剂。这类液体制剂可以通过常规方法制 备。混悬液例如可以采用胶体磨来制备。乳剂例如可以使用匀浆器来 制备。
通常，本发明的疫苗会包含病毒的混悬液和稳定剂。
本发明的疫苗能够作为单一剂量或以重复剂量给药。
本发明的疫苗能够单独给药，或者能够与一种或多种其它组合物 (例如其它的猪免疫原性或疫苗组合物)同时(即在同一时间)或相继给 药(即在不同时间)。当组合物在不同时间给药时(即相继给药)，给药可 以是分开的或者是在时间上有重叠的。
在本发明的一个实施方案中，采用单次剂量的本发明病毒免疫个 体。
在一个实施方案中，含有本发明PCV2的疫苗组合物被给予易感 于PCV2感染或者有PCV2感染风险的个体，以增强该个体的自身免 疫反应能力。
在一个实施方案中被给予该疫苗的个体为猪。但是，该个体可以 是可能希望在其中引起针对所述病毒的免疫反应的任何动物(例如哺 乳动物)。该动物可以是易感于PCV2或密切相关病毒的感染。
尽管通常考虑该个体为猪，但也可能希望将本发明的疫苗给予其 它类型的动物。例如，“试验”动物可以被给予本发明的疫苗，以便 评估该疫苗的性能，目的是为了最终的用途或开发猪疫苗。
期望的是，所述疫苗被给予还未暴露于PCV2病毒的个体。
在一个实施方案中，所述个体是猪，其需要针对断奶仔猪多系统 衰竭综合征(PMWS)的疫苗接种。
可预见的是，所述疫苗不仅可用于向成体猪给药，也可向小猪或 怀孕雌性给药。对后者的疫苗接种使得赋予新生幼崽被动免疫成为可 能(母体抗体)。在一个实施方案中，所述猪小于7，6，5，4，3，2或1周 龄。
在一个实施方案中，所述猪为1至6周龄；2至5周龄；或3至4 周龄。
产生病毒
本发明的一个方面提供产生本发明减毒PCV2的宿主细胞。
多种宿主细胞可以用于产生本发明的病毒，包括猪细胞，例如猪 肾细胞，如PK15细胞。
本发明还提供产生本发明减毒PCV2的方法，该方法包括在适合 条件下以允许该减毒PCV2产生的方式培养本发明的宿主细胞。该方 法还可以包括从培养基分离减毒的PCV2并且任选地进一步处理该减 毒的PCV2。
宿主细胞的适合生长条件对本领域技术人员来说是已知的，或者 可容易地由本领域技术人员确定，其中将包括对适合营养条件的选择。 在一个实施方案中，所述培养基至少包含水、盐、营养物、必需氨基 酸、维生素和抗生素，并且还可以包含一种或多种生长因子。
能够诱导凋亡的蛋白
本发明的第十方面提供能够诱导凋亡的蛋白。在一个实施方案中， 该蛋白包含SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列： MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLH FPAHFQKFSQPAEISDKRYRVLLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSL RSRSS TFYQ。
在一个实施方案中，提供由SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列组 成的蛋白。
本发明的蛋白包括功能等同物、变体、活性片段和包含SEQ ID NO：1中所列氨基酸序列或由其组成的那些蛋白的融合蛋白。为了避免 不确定，以下的均包括在本发明的范围内：活性片段和融合蛋白的功 能等同物；功能等同物和融合蛋白的活性片段；以及包含功能等同物 或活性片段的融合蛋白。
术语“片段”指核酸或多肽序列，其编码全长蛋白的成分或为全 长蛋白的成分。就多肽而言，所述片段具有与全长蛋白一样的定性生 物活性。根据本发明使用的生物活性片段通常可以具有对应的全长蛋 白的至少约50％的活性，更通常地是这种活性的至少约60％，更通常 地是这种活性的至少约70％，更通常地是这种活性的至少约80％，更 通常地是这种活性的至少约90％，并且更通常地是这种活性的至少约 95％。
用在本文时，术语“变体”指基本类似的分子。一般而言，核酸 序列变体编码具有共同定性生物活性的多肽。一般而言，多肽序列变 体也具有共同的定性生物活性。此外，这些多肽序列变体可以具有至 少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，82％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％或99％的序列一致性。
本发明第八方面的功能等同物、活性片段和融合蛋白保留野生型 ORF3蛋白(SEQ ID NO.1)的诱导凋亡的能力。凋亡活性例如可采用描 述在下文材料和方法部分的凋亡测定法来评估。但是，本领域技术人 员能够设计替代的或其它的测定法或手段来评估凋亡活性。
在本发明的一个实施方案中，提供SEQ ID NO.1的功能等同物， 其例如含有单个或多个氨基酸置换、添加、插入和/或缺失和/或化学修 饰氨基酸的置换。但是，如上所述，这些功能等同物将保留诱导凋亡 的能力。
根据本发明的这个方面，功能上等同的蛋白包括与SEQ ID NO.1 中所列的氨基酸序列具有至少65％序列一致性的蛋白。
测定蛋白序列一致性的方法在现有技术中是公知的，本领域技术 人员应理解的是，在本发明上下文中，序列一致性是基于氨基酸一致 性来计算的(有时被称为“硬同源性”)。例如，UWGCG程序包提供 了BESTFIT程序，其可被用来计算序列一致性(例如以其缺省设置使 用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。 PILEUP和BLAST算法可被用来计算序列一致性或排列序列(通常是 以其缺省设置)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300； Altschul，S，F et al(1990)J Mol Biol 215：403中所描述的。用于进行 BLAST分析的软件可通过因特网在如www.ncbi.nlm.nih.gov/通过万 维网上的National Center for Biotechnology Information(国家生物技术 信息中心)公开获得。这种算法首先包括通过在查询序列中鉴定长度W 的短字串(word)来鉴别高分序列对(HSP)，当这些短字串与数据库序列 中相同长度的字串比对时匹配或满足某些正值域分值T。T被称为邻 近字串得分阈值(neighbourhood word score threshold)(Altschul et al， 见前)。这些起初的邻近字串采样用作起始检索的种子(seed)来发现含 有它们的HSP。字串采样沿每个序列的两个方向延伸，只要累积的比 对分值可增加。对两条链延伸。BLAST算法在两序列间进行相似性的 统计学分析；参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nad.Acad.Sci. USA 90：5873。BLAST算法提供的对相似性的一个测量为最小总可能 性(P(N))，其提供了对相互替代的两核苷酸或氨基酸序列之间匹配可 能性的指示。
在一个实施方案中，本发明此方面的功能上的等同蛋白表现出与 SEQ ID NO.1中所列的蛋白或其片段有大于65％的序列一致性程度。 该蛋白可以具有至少70％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％的序 列一致性程度。
由此，本发明功能上等同的蛋白旨在包括突变体(例如含有氨基酸 置换、插入或缺失的突变体)。这种突变体可以包括其中一个或多个氨 基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换的蛋 白，并且这些置换的氨基酸残基可以或不能被遗传密码编码。典型的 这种置换在Ala，Val，Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残 基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间； 或者在芳族残基Phe和Tyr之间。
尤其优选这样的蛋白，其中有几个即5至10个、1至5个、1至 3个、1至2个或仅1个氨基酸以任何组合被置换、删除或添加。尤其 优选的是沉默置换、添加和删除，其并不改变蛋白的性质和活性。这 方面也尤其优选保守置换。“突变体”蛋白还包括其中一个或多个氨 基酸残基包括取代基的蛋白。
包括在本发明范围内的还有活性片段，其中“活性片段”指保留 了野生型ORF3蛋白(SEQ ID NO.1)诱导凋亡能力的截短的蛋白。
本发明的活性片段应该包括来自本发明蛋白(例如来自SEQ ID NO.1或其功能等同物)的至少n个连续氨基酸。n通常为50，75，85，90， 95或100或更多。
在一个实施方案中，所述活性片段包含SEQ ID NO.1或其功能等 同物的序列的至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或99％。
这些片段可以是“独立的”，即不是其它氨基酸或蛋白的一部分 也不融合至其它氨基酸或蛋白，或者它们可以被包含在较大蛋白内， 形成该较大蛋白的一部分或区域。当包含在较大蛋白中时，在一个实 施方案中本发明的片段形成单一连续区域。此外，几个片段可以被包 含在单个较大蛋白中。
在本发明的一个实施方案中，提供融合蛋白，其包含融合至肽或 其它蛋白如标签的本发明蛋白，所述标签例如为生物活性的、放射活 性的、酶活性的或荧光的，或抗体。
例如，通常有利的是包括一个或多个其它的氨基酸序列，这些氨 基酸序列可以含有分泌或前导序列、前序列、协助纯化的序列或例如 在重组生产中赋予更高蛋白稳定性的序列。作为选择或补充，成熟蛋 白可以融合至其它的化合物，例如增加蛋白半衰期的化合物(例如，聚 乙二醇)。
编码本发明第十方面蛋白的核酸分子
本发明的第十一方面提供编码本发明第十方面蛋白的核酸分子。
在一个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO.2中所列序 列。
在一个实施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO.2中所列序列组 成。
本领域技术人员应理解的是，作为遗传密码简并性的结果，可以 产生多种编码本发明第八方面蛋白的核酸分子，一些与SEQ ID NO.2 具有最低限度的序列一致性。因此，本发明涉及多核苷酸序列的每种 和所有的可能变化，该变化可以通过根据可能的密码子选择而选择组 合形成。
在本发明的一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO.2的简并版本 的核酸分子，即该核酸分子包含其中一个或多个SEQ ID NO.2的密码 子被简并密码子替换的核酸序列，该简并密码子与SEQ ID NO.2的天 然密码子编码相同的氨基酸。
本发明的核酸分子例如可以为RNA形式，例如mRNA，或者DNA 形式，例如包括通过克隆或合成产生而获得的cDNA和基因组DNA。 DNA可以为双链的或单链的。单链DNA或RNA可以为编码链，也 称为有义链，或者其可以为非编码链，也称为反义链。
术语“核酸分子”(和类似的表达如“核酸”、“核酸序列”等) 也包括DNA和RNA的类似物，例如含有修饰骨架的那些。
通常，本发明的核酸分子在其范围内还包括核酸序列的功能等同 物或片段，其中所述功能等同物或片段编码保留了野生型ORF3蛋白 诱导凋亡能力的蛋白。可采用分子生物学中的标准技术定位和分离这 些功能等同物和片段，而无需过多的试验和实验。
所述功能等同物可以与SEQ ID NO.2或其在遗传密码简并性内 的对应序列同源，同时仍编码保留了诱导凋亡能力的蛋白。在本发明 的一个实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其 在遗传密码简并性内的对应序列有至少70％，80％，85％，90％，92％， 95％，97％，98％，或99％同源性的序列，同时仍编码保留了诱导凋亡能 力的蛋白。
两核酸序列之间的同源程度可以通过现有技术中已知的计算机程 序来确定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1996，Genetics Computer Group， 575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B. and Wunsch，CD.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使 用如下设置的GAP进行DNA序列比较：GAP产生罚分为5.0，GAP延 伸罚分为0.3。
可以采用作为GCG程序包一部分的Pileup比对软件将核酸分子 相互比对，例如采用缺口产生罚分为5和缺口宽度罚分为0.3的缺省 设置。
本发明的核酸分子在其范围内还可以包括能够在低严紧条件、更 优选地在中等严紧条件以及更优选地在高严紧条件下与SEQ ID NO.2 中定义的核酸序列或其在遗传密码简并性内的对应序列杂交的功能等 同物。低严紧杂交条件可以对应在2 x SSC中在50℃下进行杂交。
用于确定给定的核酸分子是否与特异的核酸杂交的适合实验条件 可以包括将含有待检核酸相关样品的滤膜事先浸泡在5xSSC中10分 钟，并将该滤膜在5 x SSC、5 x Denhardt′s溶液、0.5％ SDS和100μg/ml 的变性的超声处理的鲑精DNA溶液中预杂交，随后在含有浓度为10 ng/ml的32P-dCTP标记的探针的相同溶液中在约45℃下杂交12小时， 与Sambrook等人(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition(分子克隆，实验室手册，第二版)，Cold Spring Harbour，New York)描述的杂交方法一致。
然后将滤膜在至少55℃(低严紧)、至少60℃(中等严紧)、至少 65℃(中/高严紧)、至少70℃(高严紧)、或至少75℃(超高严紧)下在 2xSSC、0.5％ SDS中洗涤两次，每次30分钟。可以通过将滤膜暴露 于X射线胶片来检测杂交。
另外，本领域技术人员熟知有多个条件和因素可以被用来改变杂 交严紧性。例如，待杂交至特定核酸的核酸的长度和性质(DNA、RNA、 碱基组成)；盐和其它组分的浓度，例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、 聚乙二醇等；以及改变杂交和/或洗涤步骤的温度。
此外，也可能从理论上预测两给定核酸序列是否会在某些特定条 件下杂交。因此，作为以上描述的实验方法的替代，确定变体核酸序 列是否与SEQ ID NO：2中定义的核酸分子或其在遗传密码简并性内的 对应序列杂交能够基于对Tm(熔化温度)的理论计算，在该Tm下序列 已知的两异源核酸序列在诸如盐浓度和温度的特定条件下将杂交。
在确定异源核酸序列的熔化温度(Tm(异))中，必需首先确定同源 核酸序列的熔化温度(Tm(同))。两完全互补的核酸链(同质双链结构)之 间的熔化温度(Tm(同))可以根据下式确定，如Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)，John Wiley and Sons，1995 中所概述的：
Tm(同)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％ form)-500/L
M＝表示一价阳离子的摩尔浓度，
％GC＝序列中碱基总数的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的％，
％ form＝杂交缓冲液中的甲酰胺的％，以及
L＝核酸序列的长度。
由上式确定的Tm为两完全互补的核酸序列之间的同质双链结构 的(Tm(同))。为了使Tm值适合于两异源核酸序列，假定两异源序列之 间核苷酸序列中1％的差异等于Tm降1℃。因此，异质双链结构的 Tm(异)是通过从Tm(同)减去所讨论的相似序列和上述核苷酸探针之 间的同源性％差异而得到的。
突变的核酸分子
本发明的第十二方面提供核酸分子，其包含本发明第十一方面的 核酸分子的突变形式，该核酸分子被突变以至于本发明第九方面的核 酸分子编码的蛋白异常表达。
关于本发明的这方面，可参照标题为“减毒病毒”的上文部分的 相关部分。但是，应强调的是，本发明第十二方面的核酸分子不仅可 以以病毒的形式提供，也可以以其它形式提供，例如核酸分子本身， 载体等，并且标题为“减毒病毒”部分的相关部分经必要的改变相应 地以除病毒以外的形式提供本发明的第十二方面。
关于“本发明第九方面核酸分子编码的蛋白的异常表达”，应理 解的是，这包括：(i)从突变的核酸分子表达的蛋白减少或不表达(相 对于本发明第十一方面的核酸分子)的情况；(ii)由突变的核酸分子表 达的蛋白具有减弱的凋亡功能或无凋亡功能(相对于本发明第十一方 面的核酸分子编码的蛋白)。
在一个实施方案中，ORF3可以包含导致ORF3蛋白表达减少或 不表达的突变(例如，由于ORF3起始密码子中的点突变)，或者存在 导致得到的ORF3蛋白具有减弱的功能或无功能的突变，即所编码的 蛋白诱导凋亡的能力减弱(并且在一个实施方案中不能诱导凋亡)。
在本发明第十二方面的一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO.3： GTGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表在起始密码 子中具有点突变的ORF3突变序列，以至于不表达ORF3蛋白。
在本发明第十二方面的另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO.19： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTtgaTTTACCACAA CCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACG CTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCG GAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCA CCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGG TCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAGT AA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表在氨基酸序 列第27位具有插入了终止密码子的点突变的ORF3突变序列，以至于 ORF3蛋白以截短的形式表达。
在本发明第十二方面的另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO.21： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GaAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表具有使氨基 酸Glu-被改变为Lys+的点突变的ORF3突变序列，以至于ORF3蛋白 的二级结构的构象受到影响。
由本发明突变的核酸分子编码的蛋白
由上文可知，在一些情况下，本发明第十二方面的核酸分子不编 码蛋白。但是，当本发明第十二方面的核酸分子编码蛋白时，这些蛋 白作为本发明的其它方面被提供。这些蛋白可能以比野生型核酸序列 (SEQ ID NO.2)编码的蛋白低的水平表达，或者为相对于野生型蛋白 (SEQ ID NO.1)具有减弱的功能或无功能(就诱导凋亡的能力而言)的蛋 白。
提供多种形式的核酸分子
本发明的核酸分子可以以多种形式提供。它们可以以核酸分子本 身(“裸”核酸分子)、载体、病毒或宿主细胞等的形式被提供。
载体包括含有本发明核酸分子的表达载体。本发明的载体例如可 以包含转录启动子以及转录终止子，其中启动子与该核酸分子可操作 地连接以及该核酸分子与终止子可操作地连接。
在一个实施方案中，提供用本发明第十一或十二方面的核酸分子 转化的宿主细胞。宿主细胞的合适例子对本领域技术人员来说是已知 的，并且可由本领域技术人员容易地选择。宿主细胞例如可以包括真 核细胞和原核细胞。真核细胞的实例包括哺乳动物(例如猪)、真菌(例 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫和植物细胞。原核细胞 例如包括大肠杆菌(E.coli)。
本发明的核酸分子(包括可以包含它们的各种部分，如载体、病毒、 宿主细胞)可以用于产生本发明的蛋白。因此，例如，本发明提供产生 本发明蛋白的方法，该方法包括在适于表达本发明的蛋白的条件下培 养本发明的宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明的蛋白可以通过蛋白的化学合成来产 生。化学合成例如可以通过固相肽合成来实现。这些技术在现有技术 中是已知的，并且可由技术人员容易地进行。
在产生了本发明的蛋白之后可以纯化蛋白。纯化蛋白的方法在现 有技术中是已知的，可由技术人员容易地进行。
抗体和产生抗体的方法
本发明的第十五方面提供能够结合本发明第十或十三方面的蛋白 的抗体。
本发明的第十六方面提供产生能够结合本发明第十或十三方面的 蛋白的抗体的方法。该方法可以包括用本发明第十或第十三方面的蛋 白免疫动物(例如兔、豚鼠、啮齿动物等)并收集由此产生的抗体。
在本发明第十五和十六方面的一个实施方案中，所述抗体能够结 合包含在SEQ ID NO.1所列序列中的氨基酸序列。
本发明的抗体可以为多克隆或单克隆抗体制剂、单特异性抗血清、 人抗体，或者可以为杂种或嵌合抗体，例如人源化抗体、改变的抗体 (Fab′)2片段、F(ab)片段、Fv片段、单结构域抗体、二体或三体抗体 片段或构建体、小抗体(minibody)、或其结合所讨论抗原的功能片段。
可以采用本领域技术人员公知的技术产生抗体，例如公开在美国 专利4,011,308、4,722,890、4,016,043、3,876,504、3,770,380和4,372,745 中的。还参见Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册)， Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988)。例 如通过以目的抗原免疫适合的动物如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊来 产生多克隆抗体。为了增强免疫原性，抗原可以在免疫之前被连接至 载体。这些载体为本领域普通技术人员所熟知。通常是通过将抗原混 合或乳化在盐水中，优选在诸如弗氏完全佐剂的佐剂中，并且胃肠外 (通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂来进行该免疫过程。通常在 2-6周后通过一次或多次注射抗原的盐水溶液，优选采用弗氏不完全佐 剂，来加强。也可以采用现有技术中已知的方法通过体外免疫产生抗 体。然后从经免疫的动物获得多克隆抗血清。
通常采用Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497的方法或其 修饰形式来制备多克隆抗体。通常，以上述方式免疫小鼠或大鼠。也 可以使用兔。但是，不是从动物取血来提取血清，而是取出脾(以及任 选的几个大淋巴结)并解离成单个细胞。如果需要，也可以通过将细胞 悬浮液应用到所述抗原包被的板或孔来筛选脾细胞(在除去非特异性 粘附细胞之后)。表达特异于该抗原的膜结合免疫球蛋白的B细胞将结 合至板，不会与剩余的悬浮液一起被洗涤出。然后诱导得到的B细胞 或者所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来形成杂交瘤，并在选择培 养基(例如，次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷培养基，″HAT″)中培养。得到 的杂交瘤通过有限稀释接种，并测定特异结合免疫抗原(并且不结合无 关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或空心纤维反 应器中)或在体内(例如作为小鼠腹水)培养所选的分泌单克隆抗体的杂 交瘤。
人源化和嵌合抗体也可以用在本发明中。杂种(嵌合)抗体分子在 Winter et al.(1991)Nature 349：293-299和美国专利4,816,567中有一般 性讨论。人源化抗体分子在Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-327； Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534-1536；以及1994年9月21日 公开的英国专利公开GB2,276,169中有一般性讨论。
如果抗体能够特异地与分子反应并由此结合该分子，则该抗体被 称为“能够结合”该分子。
在一个实施方案中，抗体或其片段具有高于约105M-1、更优选高 于约106M-1、更优选高于约107M-1且最优选高于约108M-1或109M-1 的亲和力或亲合性。抗体的结合亲和力可由本领域普通技术人员容易 地确定，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660 (1949))。
提供分离形式的本发明部分
本发明的蛋白、核酸分子和抗体可以是“分离的”。用在本文时， 术语分离的指从其天然状态“人工”改变；即如果其天然产生，则其 已被改变或者其已被从其天然宿主或环境中取出。相关的杂质可以被 减少或者去除。
本发明的多个部分例如可以以药物组合物的形式提供，例如作为 疫苗制剂。因此，在本发明的一个方面，提供包含本发明的核酸分子、 蛋白、抗体、拮抗剂、激动剂、病毒、载体或宿主细胞的药物组合物。
关于药物组合物和疫苗，读者可参考以上说明的相关部分。
筛选激动剂或拮抗剂
本发明提供筛选本发明蛋白的激动剂或拮抗剂的方法。这些激动 剂和拮抗剂可以具有多种用途。例如，ORF3蛋白的拮抗剂可以用在 PMWS的治疗中，因为这些拮抗剂将减弱ORF3蛋白诱导凋亡的能力， 因此PCV2的病原性和症状会被减弱。
本发明的蛋白可被用在多种药物筛选技术的任一种中用于筛选化 合物库。这些化合物可以调节(激动或拮抗)本发明蛋白(例如本发明第 十或第十三方面的蛋白)的活性。
在一个实施方案中，所述方法包括使测试化合物与本发明的蛋白 接触，并确定测试化合物是否结合本发明的蛋白。该方法还可以包括 确定测试化合物是否增强或减弱本发明蛋白的活性(即其诱导凋亡的 能力)。
确定测试化合物是否增强或减弱本发明蛋白的活性的方法对于本 领域技术人员来说是已知的，并且例如包括停泊实验/软件或X射线晶 体学。
用在本发明筛选方法中的本发明蛋白可以游离在溶液中、附着到 固体支持物、负载在细胞表面或定位在细胞内。
测试化合物(即可能的激动剂或拮抗剂)可以为多种形式，包括天 然或修饰的底物、酶、受体、小有机分子如高至2000Da、优选800Da 或更小的小天然或合成有机分子、肽模拟物、无机分子、肽、蛋白、 抗体、前述物质的结构或功能模拟物。
其它的鉴别ORF3蛋白的拮抗剂或激动剂的方法可以包括在细胞 中表达能够诱导凋亡的本发明第十方面的蛋白，使细胞暴露于测试化 合物并确定测试化合物是否影响该蛋白诱导凋亡的能力，由此确定测 试化合物是否表现出拮抗或激动活性。
测试化合物可以从例如细胞、无细胞制剂、化学物质库或天然产 物混合物分离。这些激动剂或拮抗剂可以为天然或修饰的底物、配体、 酶、受体或结构或功能模拟物。作为对这些筛选技术的适合的综述， 参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(免 疫学的当前方法1(2)：第五章)(1991)。
最可能作为良好拮抗剂或激动剂的化合物为结合本发明蛋白的分 子(为拮抗剂时，与其结合时不诱导该蛋白的生物作用)。
拮抗剂或者也可以通过竞争结合本发明蛋白的受体来起作用。
激动剂或者也可以通过结合本发明蛋白的受体并增强该受体和本 发明蛋白结合的亲和力来起作用。
潜在拮抗剂包括结合本发明蛋白并因此抑制或消除其活性的小有 机分子、肽、蛋白和抗体。以此方式，蛋白与正常细胞结合分子的结 合可以被抑制，以至于蛋白的天然生物活性被阻止。
在上述的某些实施方案中，可以采用样品结合测定，其中测试化 合物与带有所述蛋白的表面的粘附通过直接或间接与测试化合物结合 的标签检测或在包括用标记的竞争剂竞争的测定法中检测。
可以使用的其它药物筛选技术提供了对与所述蛋白具有适合结合 亲和力的化合物的高通量筛选(参见W084/03564)。这种方法中，在固 体基层上合成大量不同的小测试化合物，然后将它们与所述蛋白反应 并洗涤。一种固定蛋白的方式是使用非中和抗体。随后采用现有技术 中已知的方法来检测结合的蛋白。纯化的蛋白也可以直接包被在板上， 用于上述的药物筛选技术。
电子(In silico)方法也可以用于鉴别激动剂和拮抗剂。然后，如果 需要，可以通过实验确认激动剂和拮抗剂部分的活性。
本发明的其它方面提供通过本发明筛选方法鉴定的激动剂或拮抗 剂。
尽管本发明已就本发明的特定方面在某些位置进行了描述，但是 技术人员应意识到这些说明也可以同等地应用到本发明的其它方面， 并且该说明应被相应地解释。
根据本发明，可以在现有技术内采用常规的分子生物学、微生物 学、免疫学和重组DNA技术。
这些技术在文献中有充分的说明。例如Sambrook et al，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)＂(3rd edition， 2001)；＂Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)＂ Volumes I-III[Ausubel，R.M.，ed.(1999，并每两月更新一次)]；＂Cell Biology：A Laboratory Handbook(细胞生物学：实验室手册)＂Volumes I-III[J.E.Celis，ed.(1994)]；＂Current Protocols in Immunology(免疫学 的当前方法)＂Volumes I-IV[Coligan，J.E.，ed.(1999，并每两月更新一 次)]；＂Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)＂(M.J.Gait ed.1984)； ＂Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)＂[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；＂Transcription And Translation(转录和翻译)＂[B.D. Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；＂Culture of Animal Cells，4th edition (动物细胞的培养，第四版)＂[R.I.Freshney，ed.(2000)]；＂Immobilized Cells And Enzymes(固定的细胞和酶)＂[IRL Press，(1986)]；B.Perbal， ＂A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆的实践指南)＂ (1988)；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol No.I (使用抗体：实验室手册，便携方法，第一册)，Harlow，Ed and Lane， David(Cold Spring Harbor Press，1998)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Harlow，Ed and Lane，David(Cold Spring Harbor Press，1999)。
实施例
提供以下实施例以解释本发明的实施方案，不应被视为对本发明 范围的限制。
本发明人在PCV2在PK15细胞中的产毒性感染中发现了新的病 毒基因，ORF3。定点诱变的ORF3缺陷PCV2的感染结果表明该蛋白 不为病毒复制所必需。
单独用ORF3转染细胞诱导了凋亡，采用了类似于病毒感染情况 中描述的途径。这得到了进一步证实，由于不存在ORF3表达时感染 细胞的凋亡活性显著降低，提示该蛋白在诱导病毒诱导的凋亡中有重 要作用，暗示其可以涉及病毒的致病性。。
在用缺乏ORF3基因表达的突变PCV2感染Balb/C小鼠后，与用 野生型PCV2感染的那些相比，在这些小鼠中没有观察到病理学变化， 由此提示突变的PCV2具有作为针对PCV2诱导的PMWS的减毒活疫 苗的潜力。
在本发明中，我们采用抗ORF3的特异抗体来显示其确实在PCV2 感染的细胞中被表达并且不为培养细胞中PCV2的复制所必需。此外， 已显示ORF3蛋白在PCV2诱导的凋亡中起重要作用，采用了类似于 在病毒感染情况中描述的途径。这通过无ORF3表达的感染细胞中凋 亡活性的显著降低来进一步证实。
在本发明中，将突变体PCV2接种物给予成组的8周龄小鼠，采 用健康小鼠作为阴性对照以及PCV2感染小鼠作为阳性对照。将105 TCID50(50％组织培养感染剂量)的单剂量注射进每只实验小鼠。该实 验设置在一方面显示出显微损伤程度和有害身体影响的显著减少，在 另一方面显示出具有与阳性对照一样丰富的针对PCV2抗原的细胞质 标记。
材料与方法
病毒和细胞
在37℃下在加湿的5％CO2孵育箱中，将无PCV的永久PK15细 胞系维持在补充了5％热灭活胎牛血清，5％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉 素G和100μl/ml链霉素的基本必需培养基(MEM，Gibco)中。用于瞬 时表达测定的Cos-7细胞维持在补充了10％ FBS的Dulbecco改良的 Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。用在本项研究中的PCV2病毒株BJW 起初是从中国北方的患有天然发生的PMWS的猪肾组织样品分离的。 该肾组织经处理并接种至PK15细胞，其基因组序列已存在GenBank 中(登记号：AY847748)。
产生抗ORF3抗体
如图1A中所示，在PCV2株BJW的遗传图中指明了ORF1和 ORF2以及ORF3基因。编码ORF3全长的DNA被克隆到PQE30中并 转化至大肠杆菌BL21细胞中。用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 诱导这些细胞表达ORF3，并让它们在37℃生长4h。纯化His标签 融合蛋白并将该制剂注射进小鼠以产生多克隆抗体。在四次注射之后， 对小鼠取血，测试血清对ORF3的反应性。抗体显示出对用PCV2病 毒感染或用ORF3表达构建体转染的PK15细胞中表达的ORF3的特 异反应性。
构建PCV2突变体和质粒
根据PCV2分离株BJW的序列设计了一对PCR引物：正向引物 F-PCVPST(5′-TGCACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTAC-3′)和反向引 物R-PCVPST(5′-TGCACTGCAGTATTCTTTATTCTGCTG-3′)。这对引 物扩增完整的PCV2基因组，交叠区域含有单个PstI限制酶位点(Fig. 1A & C)。简言之，采用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)从患有天然产 生的PMWS的猪的肾组织样品提取DNA。通过PCR(Perkin-Elmer) 扩增提取的DNA，条件如下：起始酶活化步骤94℃ 5分钟，然后是 35个循环的94℃变性1分钟，48℃退火1分钟，72℃延伸2分钟， 以及最后延伸的72℃ 10分钟。通过凝胶电泳分离期望大小的PCR产 物并采用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
为了构建含有PCV2基因组的分子DNA克隆，将PCR产物克隆 至pBlueScript SK(pSK)载体中。采用M13正向和反向通用引物以及 PCV2基因组特异引物和ABI Prism Dye终止子循环测序试剂盒 (terminator cycle sequencing kit)(PE Biosystems)对克隆的两条链进行 测序。
采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)将特 定的突变引入克隆的PCV2基因组中。按照生产商的说明，采用成套 的诱变引物(正向引物：5′- GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3′，反向引物： TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3′)来产生突变体 质粒。突变(nt 671)以斜体粗体字母表示(图1B)，且不能在该位点改变 ORF1蛋白的氨基酸序列。在从pSK质粒切下PCV2基因组并通过连 接成环之后，将连接的DNA混合物转染至大约60-80％融合的PK 15 细胞。
为了制备重组真核表达质粒，从PCV2基因组扩增ORF1，ORF2， 和ORF3基因的编码序列。分别使用以下的引物来扩增这三个基因： GFP-ORF1(5)：5′-CCGCTCGAGCTATGCCCAGCAAGAAGAATGG-3′ 和GFP-ORF1(3)：5′-CGGGGTACCTCAGTAATTTATTTCATATG-3′， GFP-ORF2(5)：5′-CCCAAGCTTCGATGACGTACCCAAGGAGGCG-3′ 和GFP-ORF2(3)：5′-CGGGGTACCTTATGGTTTAAGTGGGGGGTC-3′， GFP-ORF3(5)：5′- CCCAAGCTTCGATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′和 GFP-ORF3(3)：5′-CGGGGTACCTTACTTATCGAGTGTGGAGCTC-3′。 将XhoI/KpnI片段ORF1和HindIII/KpnI片段ORF2和ORF3定向克隆 至真核表达载体pEGFP-C1(Clontech)的对应位点，置于人巨细胞病毒 (HCMV)启动子下游，分别获得GFP-ORF1，GFP-ORF2和GFP-ORF3。 对它们进行测序以确认PCR扩增中没有引入错误。
转染和感染
对于基因组转染，从对应的克隆基因组得到分别用于产生重组 PCV2(rPCV2)或突变PCV2(rPCV2ORF3Δ)的PstI消化的PCV2或 ORF3缺陷PCV2，凝胶纯化并且转染前在T4DNA连接酶(BioLab)存 在下在16℃环化过夜。在转染后24h还用300mM D-葡萄糖胺对细 胞进行处理，如以前所述(49)。为了进行感染测试，使基因组转染的 细胞接受三个连续的冻融循环。收集总裂解液，用于感染无PCV的 PK 15细胞。随后，感染后按上文的描述使它们接受葡萄糖胺处理并 通过IFA进行分析。
在采用PK 15细胞的瞬时表达实验中测试GFP-ORF1，-ORF2和 -ORF3构建体的体外表达。采用LipofectaminePlus(GIBCO/BRL， USA)，按生产商的方案，用仅有GFP的载体、GFP-ORF1、GFP-ORF2、 或GFP-ORF3转染(每瓶2μg质粒)培养在25x25mm培养瓶中的细胞。 转染24小时后，采用小鼠抗ORF1、ORF2(Liu和Kwang，私人数据) 或ORF3多克隆抗体通过免疫印迹分析证实ORF1、ORF2和ORF3的 表达。
RT-PCR
通过使用Trizol RNA Extract试剂(Invitrogen)从病毒感染的PK15 细胞制备总细胞RNA用于ORF3基因的逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。将RNA样品与DNase I在37℃孵育60分钟以除去任何 污染的病毒DNA。有义引物和反义引物分别为R671：5′- ATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′和F357：5′- TTACTGATAGAATGTGGAGC-3′。寡核苷酸的前缀(F或R)表明了引 物的方向。F表明从nt 0至1767的向前方向，而R表明从nt 1767至 0的相反方向。通过使用AMV Reverse Transcriptase试剂盒(Roche)和 Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche)来进行RT-PCR，并将PCR产 物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳并照相。
原位杂交(ISH)
如下文所述进行原位杂交。简言之，将在室式载玻片(chamber slide) (IWAKI)中生长至80％融合的PK 15细胞用野生型PCV2或突变PCV2 以1 TCID50(50％组织培养感染剂量)的MOI感染。在感染后24，48，72， 和96h用PBS洗涤载玻片，在室温(RT)下在含4％多聚甲醛溶液的PBS 中固定30分钟，干燥。在0.1M三乙醇胺、0.2N HCl和0.5％醋酸酐 中乙酰化后，将载玻片在杂交溶液中(50％甲酰胺；5xSSC；50μg鲑精 DNA/ml)在60℃预杂交2小时，然后用1μg/ml浓度的地高辛(DIG) 标记的RNA探针在60℃杂交过夜。洗涤后，将载玻片与抗荧光AP (Roche)(150μl，在缓冲液[10％胎牛血清；100mM Tris-HCl；150mM NaCl，pH 7.5]中1:5,000稀释的)一起在4℃孵育过夜。洗涤载玻片， 与NBT-BCIP混合物一起孵育并封片用于显微镜检。
通过使用T7 RNA聚合酶的体外转录从含有ORF3 cDNA的被 KpnI线性化的pSK质粒合成有义RNA探针。对于反义RNA探针， 采用引物对(正向引物： 5′-ATGGTAACCATCCCACCATTGTTTCTAGGTGGTTTCCAG-3′，反 向引物： 5′-TAATACGACTCACTATAGGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGG-3′， T7启动子加有下划线)扩增ORF3片段，并用T7 RNA聚合酶转录。两 RNA探针都采用NTP-DIG标记混合物(Roche)进行标记。
PCV2复制的测定
为了分析PCV2的生长特征，以野生型、重组或突变的PCV2病 毒储备(在PK 15细胞中传代3次后产生的)以1 TCID50的MOI感染融 合的PK 15细胞。通过三个循环的冻融以及随后的澄清，在不同的时 间段从细胞收集感染的细胞培养物。通过IFA在PK 15细胞上确定存 在于细胞培养物中的感染病毒的滴度，如先前所述(14)。
凋亡测定
将生长在室式载玻片上的PK 15细胞在感染后的24，48，72和96 小时用4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液固定并用猪抗PCV2血清和 FITC-偶联的抗体染色。对于转染，将GFP-ORF1，GFP-ORF2，或 GFP-ORF3质粒转染的PK15或Cos-7细胞在转染后24和48小时时分 别用4％ PFA固定。然后用浓度为1μg/ml的DAPI(2，4-二脒基-2-苯基 吲哚)在37℃孵育载玻片30分钟，并在配有Plan-Novofluar 63x/1.4油 镜的LSM 510 META共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss，Germany)下检查。
收集感染后不同时段的感染的PK15细胞(2-3 x 106)并在4℃下在 1,000xg离心10分钟。在PBS中洗涤沉淀并在2.5％戊二醛中固定。 随后，将细胞在1％ S2O4中后固定并包埋在EPON-812中。切出超薄 切片并在Hitachi H-700电子显微镜下检查。
用野生型PCV2感染生长在75x75mm培养瓶中的PK15细胞。 处理后，合并漂浮的和胰蛋白酶分离的细胞，用冰冷的PBS洗涤两次 并在70％的冷乙醇中固定，然后在PBS中洗涤两次。离心后，细胞沉 淀物在PBS碘化丙啶(50μg/ml)中染色，并用RNA酶A(100μg/ml)处 理45分钟。通过荧光活化细胞分选(FACSort，Becton Dickinson)分析 PK15细胞的DNA含量。至少分析10,000个事件，并计算亚G1(sub-G1) 群细胞的百分比。从亚G1细胞的分析中排除直方图起始处的细胞碎片 聚集物。在每个实验中，假感染的PK15细胞被用作对照并与PCV2 感染的细胞比较。
分别收集来自用野生型PCV2感染的细胞或用GFP-ORF1， GFP-ORF2，或GFP-ORF3质粒转染的细胞的贴壁和非贴壁细胞，以 200xg沉淀10分钟，用冰冷的PBS洗涤，在4％ PFA中固定，用1μg/ml DAPI染色，并用荧光显微镜检查。对每样品最少300个细胞评估凋亡 变化(细胞核片段化为多个不连续的片段)。
间接荧光测定(IFA)
对于感染，将生长在室式载玻片(IWAKI)上的PK15细胞用野生 型、重组或突变PCV2以1 TCID50的MOI在37℃孵育60分钟，并加 入MEM来孵育。在37℃孵育后，用PBS洗涤感染后24，48，72和96 小时时的细胞并在室温下用4％ PFA的PBS溶液固定30分钟。固定 后，用含有3％BSA的PBS-T室温封闭细胞1小时。将初级抗体，小 鼠抗ORF3多克隆抗体或猪抗PCV2抗体稀释在含有1％ BSA的PBS-T 中，并与细胞一起在37℃孵育1小时。在用PBS洗涤后，将细胞用 稀释在含有1％ BSA的PBS-T中的兔抗小鼠或抗猪的FITC-偶联抗体 (Sigma)在37℃下孵育1小时。用PBS将细胞洗涤三次，用dH2O冲 洗，干燥并用荧光封固介质封片，采用荧光显微镜检查。
Western印迹分析
将来自野生型PCV2感染的PK15细胞的总细胞裂解物用15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，用半干电转仪(Bio-Rad Trans-Blot SD)转印至硝酸纤维素(NC)膜(Stratagene)。将膜在室温下在 含有5％脱脂乳粉的封闭缓冲TBST(20mM Tris-HCl[pH 7.4]，150mM NaCl，0.1％ Tween-20)中封闭2小时以防止非特异性结合，然后与小鼠 抗ORF3抗体在室温下孵育2小时。接着，将膜用TBST洗涤三次， 在室温下与稀释在封闭缓冲液(1:2,000)中的辣根过氧化物酶偶联的抗 小鼠二级抗体(DAKO)孵育1小时。洗涤后，使膜与3，3′-二氨基联苯胺 四盐酸盐(Pierce，Rockford，Il1.，USA)底物(20ml 0.1M pH 7.4 Tris-HCl， 20mg DAB，和6.8μl H2O2)反应，然后用蒸馏水终止反应。
免疫和活疫苗剂量
在本项研究中，将TCID50减毒突变PCV2细胞通过鼻内和腹膜 间途径给予每组的实验Balb/c小白鼠。
病理学和免疫组织化学研究
对所有动物进行所选器官的尸检。收集肺、肝和淋巴结样品并通 过浸入4％ DEPC处理的磷酸缓冲多聚甲醛进行固定。使固定的样品 脱水、包埋在固体石蜡中，以6μm切片，然后用苏木精和伊红(HE) 染色。对所有样品评估身体恶化或显微损伤的任何迹象。对淋巴器官 还评估淋巴细胞的减少、组织细胞渗透和/或多核细胞的存在。
将抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术用于免疫组织化学研 究。将以5μm切片的组织置于硅烷包被的载玻片上。通过以3％ H2O2 的含有1％ Triton的磷酸缓冲盐水溶液冲洗载玻片10分钟来抑制内源 的过氧化物酶活性。采用5％正常小鼠血清在室温下进行封闭1小时。 然后将切片在室温下与纯化的、在猪中产生的、1:00稀释在 PBS-Triton中的PCV2初级抗体孵育过夜。生物素化的抗猪抗体和过 氧化物酶偶联的抗生物素蛋白以1:200的稀释度在室温下被应用于该 载玻片1小时。然后将切片在二氨基联苯胺(DAB)-过氧化氢溶液中孵 育5分钟，并用1％甲基绿复染、脱水、用Permount(Fisher Scientific Inc.) 封片，显微镜检。
实施例1：在PCV2感染细胞中鉴定新的病毒蛋白ORF3
通过逆转录(RT)-PCR分析感染的和假感染的PK15细胞的全细胞 核酸。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(图1D)。在标明的时间采用 分离自PCV2感染细胞的RNA扩增了315-bp的片段，ORF3基因，提 示ORF3基因能够在PCV2感染细胞中以该转录水平表达。进一步分 析PCV2感染的PK15细胞以确定ORF3 mRNA的相对分布。如图1E (小图a-d)中所显示的，采用反义RNA探针在标明的时间在PCV2感 染的细胞中检测到ORF3 mRNA的信号，并观察到ORF3 mRNA主要 位于感染细胞的细胞核中。有趣的是，采用有义ORF3 RNA探针在感 染细胞中也检测到mRNA信号(图1E，小图e)。这可以解释为，全长 ORF3基因在PCV2整个基因组中反方向完全重叠ORF1基因(图1C)， 由此检测到ORF1 mRNA信号。此外，在没有PCV2感染的对照细胞 中没有检测到信号(图1E，小图f)。这些结果进一步证实在PCV2感染 细胞中可检测到ORF3 mRNA，并且其位于细胞核中。
将ORF3基因克隆到大肠杆菌载体PQE30中并表达(数据未显示)。 通过采用抗组氨酸单克隆抗体的Western印迹进一步证实了这种重组 蛋白(数据未显示)，并且可制备该重组蛋白用于产生针对蛋白ORF3 的单特异性抗体，用于以下的实验。
为了确定ORF3蛋白是否在PCV2感染的PK15细胞中表达，如 材料和方法部分所述用PCV2(BJW株)感染细胞。在直接免疫荧光实 验中使用抗ORF3小鼠多克隆抗体确定ORF3在PCV2感染的PK15 细胞中的表达和定位。在感染后24，48，72，和96小时时(图2A，小图 b-d，数据未显示)在PCV2感染的细胞中可检测到成簇的表达ORF3 的细胞。ORF3蛋白主要位于细胞核中，在感染细胞的细胞质中较少。 如图2A(小图c)所示，在感染后48小时ORF3蛋白在感染细胞中的表 达最高。在假感染细胞中没有观察到显著染色(图2A，小图a)，表明 了小鼠抗体抗ORF3的特异性。还在感染后的标明时间从PK15细胞 收集总蛋白，并进行Western印迹分析(图2B)。采用小鼠抗ORF3抗 体，在感染后24小时时在PCV2感染细胞中检测到蛋白，其为弱但清 晰可辨的信号。之后条带强度显著增强，但在感染后72小时降低。在 假感染的细胞中没有检测到信号(图2B)。合并考虑，这些结果显示由 于ORF3在PCV2感染的细胞中在转录和翻译水平表达，ORF3被认为 是新的病毒蛋白。
在PCV基因组内已鉴定了两个主要的开放阅读框。cap基因ORF2 编码病毒衣壳，主要的结构蛋白。另一基因，rep基因(ORF1)指导合 成两种Rep同工型，Rep和Rep′，它们对于病毒复制是必需的(9，25)。 此外，在猪肾细胞的产毒性感染中检测到PCV2的六个其它的RNA(三 个Rep相关RNA：Rep3a，Rep3b和Rep3c，和三个NS相关RNA： NS515，NS672和NS0)(9，10)，提示这些转录单元对病毒蛋白合成或 DNA复制没有任何影响。NS515，NS672和NS0被认为从ORF1内Rep 启动子下游的三个不同的启动子转录(9)，并且可能不编码任何蛋白或 功能蛋白。在鉴定的9个PCV2特异的RNA中，只有ORF2 RNA从 互补DNA链转录并编码病毒衣壳蛋白ORF2。在本项研究中，我们在 PCV2感染的PK15细胞中检测到从基因组互补DNA链转录的新病毒 RNA，并进一步证实其编码新的病毒蛋白(本文称为ORF3)，其涉及培 养细胞中PCV2诱导的凋亡。
这种新的转录本ORF3 RNA可容易地通过RT-PCR在PCV2感染 的细胞中检测到(图1D)，并通过ISH测定进一步在感染细胞的细胞核 中检测到(图1E)。此外，采用针对ORF3抗原的特异性抗体，我们通 过免疫荧光证实该蛋白在PCV2感染的PK15细胞中表达(图2A)，并 且主要位于感染细胞的细胞核中，在细胞质中较少(图2A)。感染细胞 中的蛋白表达也可通过Western印迹分析检测到(图2B)。对超过20个 不同地理位置的PCV2分离群(得自GenBank数据库)的序列分析提示， ORF3蛋白在所研究的PCV2株中是高度保守的，在氨基酸水平上有 高于94.5％的一致性(数据未显示)。但是，PCV1株的对应区域显示出 不同，仅有61.5％的氨基酸序列一致性。由于PCV1病毒是天然不致 病的且不在猪中引起任何病理学损伤(3，48)，这些残基可能在病毒的 致病性中起了作用。
实施例2：ORF3不为病毒复制所必需
如所述，通过将起始密码子ATG突变为GTG的点突变来删除 ORF3基因，以产生缺乏ORF3基因的PCV2突变体(图1B)。为了研 究ORF3蛋白在病毒复制中的功能，用野生型PCV2或突变体PCV2 感染性克隆DNA转染PK15细胞。尽管如预期的，野生型PCV2 DNA 产生重组PCV2(rPCV2)，但是用突变体PCV2 DNA转染的PK15细胞 也产生可存活的突变体病毒(rPCV2ORF3Δ)。突变体病毒在PK15细胞 中传代三次以增加病毒滴度。之后，通过RT-PCR分析感染和假感染 细胞的全细胞核酸。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应产物(数据未显示)。 通过采用从突变体PCV2感染细胞分离的RNA扩增了315-bp片段， 如同在野生型PCV2感染细胞中看到的，这表明在ORF3基因的起始 密码子中产生的点突变不影响其转录，并进一步提示ORF3转录的起 始位点可能位于上游。采用假感染PK15细胞没有得到PCR产物。 RT-PCR产物的序列分析证实在产生的PCV2突变体中存在所期望的 变化(数据未显示)。此外，采用反义ORF3 RNA探针在突变体PCV2 感染细胞的细胞核中检测到ORF3基因的mRNA信号(数据未显示)。
为了检测ORF3蛋白的表达，用回收的病毒感染PK15细胞并采 用ORF3特异抗血清通过IFA进行分析。图3显示了重组或突变体 PCV2感染细胞的免疫荧光染色结果。用rPCV2病毒感染的细胞表达 ORF3蛋白，并给出阳性免疫荧光信号(图3A)。但是，用突变体 rPCV2ORF3Δ病毒感染的细胞没有给出任何荧光信号(图3D)，表明缺 乏ORF3蛋白表达，甚至在传代12次之后也是如此(数据未显示)。相 反，抗PCV2猪血清可容易地在重组以及突变体PCV2感染细胞的细 胞核中检测到病毒抗原(图3B和3E)。在假感染的细胞中采用抗ORF3 小鼠血清(图3C)或抗PCV2猪血清(图3F)均未检测到荧光。
为了确定野生型、重组和ORF3缺陷PCV2的复制动力学，用每 种病毒感染PK15细胞并在感染后5天通过IFA测定法来确定病毒滴 度。图4A显示了每种病毒在感染后不同时间的生长曲线(表示为 TCID50/毫升)。感染后不同时间的TCID50显示突变体病毒(缺乏ORF3 蛋白表达)的复制比母体病毒PCV2或回收的重组PCV2(rPCV2)病毒 慢些。在感染后36小时时，ORF3缺陷PCV2病毒显示的滴度比母体 病毒PCV2或回收的rPCV2病毒分别约低33或31倍。但是在感染后 72小时，ORF3缺陷PCV2病毒达到105.5TCID50/ml的滴度，类似于 母体病毒PCV2的滴度(105.8TCID50/ml)和回收的rPCV2病毒的滴度 (105.6TCID50/ml)。这些结果表明ORF3蛋白不是在细胞培养物中复制 所必需的。
在不存在ORF3时，PCV2的体外复制被延迟(图4)。但是，最大 滴度与野生型病毒复制后发现的一样高。可以想象复制的延迟转变为 体内的减毒，导致病毒株具有疫苗潜能。对于PCV2，ORF2蛋白已被 认为是主要的免疫原性衣壳蛋白(9，30，31)，并且能够刺激对接种有杆 状病毒表达的重组ORF2(5)或者注射有来自ORF2的DNA疫苗(5，19) 的猪的保护性应答。具有克隆至非致病性PCV1基因组骨架内的PCV2 ORF2基因的嵌合PCV1-2病毒也可以诱导针对PCV2的强免疫反应， 同时其是中等致病性的(5)，说明PCV2的ORF2蛋白为良好的宿主保 护免疫原。进一步显示ORF2蛋白的免疫显性表位可能位于氨基酸残 基47至84，165至200以及该蛋白的最后4个氨基酸内(22)。这些表 明ORF3蛋白诱导的抗体可能不包括在对宿主的保护性免疫反应内。 还有，缺乏ORF3蛋白的PCV2突变体可以导致其不能在动物体内诱 导对应的抗体，且可以预期其如野生型PCV2一样引起适当的免疫反 应。
实施例3：PCV2感染诱导培养细胞的凋亡
在感染后期阶段PCV2在PK15中的复制导致细胞病变效应 (CPE)，例如变圆、感染的细胞脱离培养瓶、细胞溶解和死亡。还未完 全了解导致PCV2感染的细胞死亡的机制。为了确定PCV2感染是否 在培养的细胞中诱导凋亡，我们用野生型PCV2以1 TCID50的MOI 接种PK15细胞并在感染后标明的不同时间通过IFA分析它们的PCV2 病毒抗原表达和通过DAPI染色分析凋亡。完好的细胞核被均匀染色， 但是凋亡的细胞核通常片断化并显示不规则或弱的DNA染色，这是 由于DNA的浓缩和片断化(45)。图5A显示在感染后48小时(上图)和 72小时(下图)时PCV2感染细胞中可见染色质浓缩和片断化。相反， 感染后在假感染细胞中没有观察到明显的细胞核形态学变化(数据未 显示)。
对感染和假感染PK15细胞分析它们的超微结构。在感染后48小 时，用PCV2感染的细胞显示细胞程序性死亡的典型特征，例如染色 质密度和分布的变化，其向外围浓缩成新月形物质，并观察到核周腔 的膨胀(图5B，小图b)。在感染后72小时时，细胞显示凋亡细胞死亡 的典型标志，例如细胞核分割和细胞质紊乱，它们负责形成凋亡小体 (图5B，小图c)。在96小时时，细胞表现出进一步的核片断化，导致 凋亡小体的广泛分散(数据未显示)。相反，假感染的细胞在超微结构 水平没有表现出可检测的变化(图5B，小图a)。
通过碘化丙啶(PI)染色的、固定的PK15细胞的流式细胞术确定亚 二倍体细胞的比例，以此来评估PCV2诱导的凋亡。凋亡细胞与正常 细胞相比具有较低的DNA含量，它们的存在以较低荧光的亚二倍体 峰的出现来区分。对于假感染的细胞，基于对PI染色细胞的荧光活化 细胞分选分析，～1％的细胞为亚二倍体(图6A)。而在感染后72小时时 亚二倍体细胞显著增加，随后减少(图6A和数据未显示)。还通过使用 DAPI染色的细胞核形态学分析来评估PCV2诱导的凋亡，如在材料和 方法中所述。对染色细胞的检测证实感染后凋亡细胞显示如在流式细 胞分析中所描述的类似的方式(图6B)。如图6C所示，与假接种的培 养物相比，更多的细胞脱离细胞培养瓶，进入接种培养物的底层。
病毒诱导的细胞死亡在病毒感染的发病机理方面起重要作用。凋 亡可能是子代散播至相邻细胞且同时逃避宿主免疫系统的重要步骤 (46)，并通过去除由于DNA损伤而产生的异常细胞或被病毒病原体感 染的那些细胞而起作用(39)。很多病毒已被证实在它们的复制循环中 直接或间接引起或抑制凋亡(39)。在圆环病毒科，鸡贫血病毒(CAV) 诱导感染后胸腺细胞和细胞系的凋亡(18)，VP3蛋白为CAV编码的凋 亡素(apoptin)，其在多种培养的转化细胞系中引发凋亡(34)。对于 PCV2，已显示其在受影响猪中诱导B细胞凋亡，然后是选择性的B 细胞清除(43)，并且PCV2也在PCV2感染的小鼠模型中引发淋巴组织 中组织细胞凋亡(21)。但是，最近也报道了相反的结果，与正常对照 相比，在天然受影响的猪中淋巴细胞凋亡未被显著诱导且caspase-3活 性未受到显著刺激(24，37)，提示淋巴组织减少主要涉及淋巴组织的增 殖活性降低。但是，这里我们通过DAPI染色、电子显微镜观察和流 式细胞分析已证实PCV2能够诱导培养的PK15细胞凋亡。DAPI染色 显示由于DNA的浓缩和片断化引起的不规则或弱的DNA染色(图 5A)，这与电子显微镜观察下的形态学变化一致，包括广泛的染色质浓 缩和出现凋亡小体(图5B)。在PCV2感染后，通过评估DAPI染色和 通过流式细胞术分析亚二倍体细胞(图6A)确认的凋亡细胞(图6B)与假 感染对照相比显著增加。用PCV2感染后，40％的细胞脱离并漂浮进 底层，而在假感染对照中漂浮细胞少于5％(图6C)。通过在培养的细 胞系中表达单个病毒蛋白，我们进一步证实ORF3基因编码的新病毒 蛋白在PCV2感染中促进凋亡的诱导。
实施例4：单独的ORF3蛋白诱导凋亡
在确认PCV2感染在PCV2感染的允许细胞系PK15细胞中诱导 凋亡后，我们接着试图筛选可能负责诱导凋亡的由PCV2编码的蛋白 (病毒编码的凋亡前体蛋白)。将ORF1、ORF2和ORF3基因克隆至哺 乳动物表达载体pEGFP-C1中，置于人巨细胞病毒启动子控制下。用 这些质粒转染PK15和Cos-7细胞，在荧光显微镜下直接检查每种蛋 白的表达并采用小鼠抗ORF1、ORP2或ORF3抗体通过免疫印迹分析 进一步证实(数据未显示)。蛋白ORF1、ORF2或ORF3定位至转染的 细胞核区域，类似于在感染细胞中所看到的(数据未显示)。在用单个 构建体转染细胞之后，在转染后24小时和48小时时用DAPI对细胞 染色。如图7A所示，在转染后24小时时通过细胞核DAPI染色在表 达ORF3的PK15细胞(上图)和Cos-7细胞(下图)中观察到染色质浓缩 和片断化，这些为凋亡的典型特征。相反，在ORF1或ORF2转染的 细胞中没有明显的细胞核形态学变化(数据未显示)。此外，对总的GFP 阳性细胞和GFP阳性细胞中具有片断化或浓缩的细胞核的细胞数量进 行计数，并计算死亡细胞的百分比。如图7B所示，在转染的PK15细 胞中以GFP融合构建体表达的ORF3蛋白在转染后24小时和48小时 时分别诱导10％和25％的死亡细胞。当转染至Cos-7细胞中时，ORF3 蛋白在该时间点也引起12％和28％的细胞死亡(数据未显示)。在该筛 选中ORF1和ORF2蛋白的表达不引起比对照更显著的细胞死亡，不 论是转染的PK15(图7B)还是Cos-7细胞(数据未显示)。相反，当单独 的GFP被转染至PK15和Cos-7细胞中时，在转染后的该时间点其可 诱导小于4％的细胞死亡(图7B，数据未显示)。此外，与GFP单独转 染对照以及ORF1或ORF2转染的细胞相比，ORF3转染的PK15细胞 (图7C)和Cos-7细胞(数据未显示)中有更多的细胞脱离培养瓶并进入 底层。
为了确定rPCV2ORF3Δ在PK15细胞中的凋亡作用，将突变体病 毒以1 TCID50的MOI转染细胞，在不同的时间段收集细胞，分析 caspase-3活性。感染后，突变体病毒诱导的凋亡活性显著低于野生型 PCV2病毒诱导的活性(图9C)。在假感染细胞中没有检测到可评估水 平的凋亡(图9C)。该结果表明，由于缺乏ORF3蛋白表达，PCV2诱 导的细胞死亡被显著减弱。
用PCV2感染猪导致滤泡和滤泡间区域淋巴细胞的减少，以及淋 巴组织的巨噬细胞渗透及其后的免疫抑制(42)。ORF2被认为是PCV2 的主要衣壳蛋白，并且在通过杆状病毒表达系统表达后可形成病毒样 颗粒(31)，暗示PCV2的其它病毒蛋白可能是非结构蛋白，它们不是 病毒组装所必需的。此外，当PCV2被接种至VIDO R1细胞时，ORF2 蛋白显示出在感染的后期阶段以高水平表达(23)。还如我们所证实的， 在PCV2感染的PK15细胞中，在感染后72-96小时时ORF2蛋白表达 达到峰值(数据未显示)。在这项研究中，已证实在感染后48小时时 ORF3在PCV2感染的细胞中在转录和翻译水平都具有更高的表达(图 1和图2)，提示ORF3也可能是PCV2的非结构蛋白。动物病毒的非 结构蛋白可能在病毒复制和/或致病性中起重要作用。对于免疫抑制性 病毒，显示CAV的非结构蛋白VP3引起淋巴母细胞样T细胞的凋亡 并参与致病性(34)；鸡传染性法氏囊病病毒的非结构蛋白VP5对于病 毒复制不是必需的(29)，但是发现通过其凋亡活性参与病毒致病性 (53)。在我们的研究中，我们显示PCV2的ORF3蛋白不是病毒体外复 制所必需的，并且PCV2诱导的凋亡活性由于没有ORF3蛋白表达而 显著减弱。我们的数据还提示单独的ORF3蛋白的表达可在转染细胞 中诱导凋亡，其通过活化起始物caspase-8，接着活化效应物caspase-3 途径，类似于在PCV2感染的细胞中。合并考虑，ORF3蛋白可能通 过其凋亡活性在病毒致病性方面起作用。诱导免疫系统细胞的凋亡可 能是病毒诱导的免疫抑制所需条件之一(12)，这可以促进使用删除 ORF3的突变体作为潜在的针对PCV2感染的活疫苗株。但是，在猪 中使用这种ORF3蛋白缺陷病毒是否能够引起免疫抑制仍需进一步确 认。
实施例5：病理和免疫组织化学研究
在该项实验设计中，用ORF3缺陷PCV2突变体(mPCV2)感染一 组8周龄balb/C小鼠，而另一组用野生型PCV2感染。在这项研究中， 将正常的小鼠用作阴性对照。在感染后7和14天进行小鼠的死后检查。 将淋巴结样品在4％磷酸盐缓冲的多聚甲醛中固定。将组织脱水并用苏 木精和伊红(HE)染色，用于组织病理学检查。然后通过组织免疫化学 技术染色系列切片，用于PCV2蛋白表达。
所有的阴性对照小鼠和突变体PCV2感染的小鼠在感染后第7和 14天没有显示出或显示出轻微的身体恶化迹象，但是在感染后第14 天腹股沟淋巴结轻微膨大。对于野生型PCV2感染的小鼠，在感染后 第7天观察到肝轻度变色和腹股沟淋巴结的轻微膨大。在感染后第14 天，在大多数野生型感染的小鼠中还观察到肝明显变色和非萎陷肺以 及肠系膜和腹股沟淋巴结的显著膨大。在图8A中，对三个实验组的 腹股沟淋巴结的组织病理学检查显示了感染后第7和14天时阴性对照 和mPCV2组生发中心处健康和密集的淋巴细胞。而在感染后第7天， 野生型PCV2显示轻微的淋巴细胞减少迹象，在感染后第14天还在不 同的野生型PCV2感染小鼠中观察到不同程度的淋巴细胞减少和显著 大量的凋亡细胞(箭头)。
在突变体PCV2感染小鼠和野生型感染小鼠中都检测到PCV2抗 原。在所有检查过的组织中，在淋巴细胞和巨噬细胞细胞质中最大量 地观察到对PCV2抗原的免疫标记。但是，在感染后第14天，野生型 PCV2感染小鼠中免疫标记的强度与突变体PCV2感染小鼠相比显著 要低(如图8B所示)。
除了低水平的淋巴细胞减少和高水平的PCV2抗原积累之外，没 有显微损伤和身体恶化显示了突变体PCV2株的保护有效性和复制能 力。这些证据也揭示这种突变体成为用于生产针对PCV2诱导的 PMWS的有效疫苗的合适候选物的潜力。
我们的减毒活疫苗mPCV2能够在实验小鼠中诱导体液和细胞应 答。不仅毒性减弱，还对其病毒复制没有影响，因此提供了对抗PCV2 的持续保护效果，为疫苗商业化的首要候选物。
实施例6：产生凋亡缺陷的PCV2突变体
上文已讨论了在ORF3起始密码子中的点突变在产生凋亡缺陷病 毒中的功能。在本实施例中，发明人鉴定了不同于起始密码子突变的 ORF3的功能可突变位点。
ORF3以相反方向位于ORF1中。由于ORF1编码病毒复制必需的 复制酶，所以必须保留ORF1的蛋白转录功能。因此在ORF1内的冗 余密码子被选择用来产生ORF3突变体。
为了形成异常ORF3表达，发明人选择了这样的策略：改变氨基 酸序列中的电荷模式以便影响得到的蛋白的二级结构。例如，发明人 反转电荷或使序列中特定位置的特定氨基酸变为电中性。在该方式中， 蛋白功能失去。此项研究中采用定点诱变方法向病毒基因组引入上述 突变。
设计了五种突变体，并根据突变的氨基酸编码命名。突变体27 将丙氨酸改变为终止密码子，如SEQ ID NO.19中所示。结果，这种 突变体表达截短的长26个氨基酸的ORF3蛋白。
其它的突变体通过改变蛋白的构象来改变ORF3蛋白的功能，如 上所述。为了改变蛋白的构象，蛋白中的带电氨基酸被选为突变靶点。 由于存在很多带电氨基酸，ORF3蛋白的α螺旋区是适当的。在突变 体52和61中，氨基酸电荷被反转，由此改变蛋白的二级结构，这是 由于该蛋白的α区被解折叠。在突变体52中，通过实现如SEQ ID NO. 20中所示的核苷酸序列变化使氨基酸His+被改变为Asp-。在突变体 61中，通过实现如SEQ ID NO.21中所示的核苷酸序列变化使氨基酸 Glu-被改变为Lys+。在突变体85中，通过实现如SEQ ID NO.22中所 示的核苷酸序列变化将His+改变为Tyr，结果正电荷被改变为中性电 荷。结果，由于该蛋白的一个卷曲区被打开，改变了突变体85的二级 结构。
突变体缺失50-62用作对照，其中氨基酸50至氨基酸62被删除。 如上所述，所产生的突变体将不影响ORF1的氨基酸序列，由此对复 制酶的转录无影响，这是由于突变位点位于ORF1的冗余密码子处。 参见图10。
将突变的病毒基因组转染至PK15细胞中，让其生长5天。5天后， 收集细胞并通过3X冻融溶解。然后用总细胞溶解物感染新鲜的PK15 细胞。在细胞传代15次后，突变体52和85以及野生型PCV2开始显 示细胞死亡。在野生型PCV2、突变体52或突变体85感染的PK15细 胞中观察到约70-90％的细胞死亡。相反，突变体61、突变体27或源 自ORF3的ATG起始密码子的删除突变的突变体都显示细胞死亡的显 著减少(约10％)。参见图11。
这些具有低凋亡率的突变体适合于产生活减毒疫苗。因此，发明 人发现在核酸水平上在特定氨基酸处改变构象使得能够产生突变体， 该突变体适于生产用于疫苗生产的活减毒病毒。
此外，通过将这些突变组合成双或三突变，有可能减少病毒恢复 至野生型毒性的可能性。例如，可能将ATG突变与SEQ ID NO.23中 所示的突变体27组合，或与SEQ ID NO.24中所示的突变体61组合。 上述突变可被组合成由ATG突变体、突变体27和突变体61组成的三 突变，如SEQ ID NO.25中所示。
很明显，在阅读了前述公开内容后，在不脱离本发明的精神和范 围的情况下，本发明的各种修饰和改变对于本领域技术人员是显而易 见的，意味所有的这些修饰和改变都处于所附权利要求的范围内。
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PMWS是新出现的影响幼猪和断奶猪的疾病，现在在很多产猪国 流行，对全球养猪产业造成潜在的经济影响。尽管在4-20周龄的猪中 有该疾病的描述(42)，但PMWS主要影响5至18周龄的猪。临床PMWS 迹象包括渐进的体重减轻、呼吸困难、呼吸急促、贫血、腹泻和黄疸。 死亡率可以在1至2％之间变动，在复杂病例中可高至30％。
猪圆环病毒(PCV)最初作为猪肾细胞培养物(PK15 ATCC CCL-33) 的污染物而被鉴定(47)。PCV病毒体为二十面体，无被膜，直径17nm， 具有约1.76kb的单链环状DNA。PCV在分类上属于圆环病毒科 (Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，其包括其它的动物圆环病毒， 例如鹦鹉喙羽病毒、鹅圆环病毒、金丝雀圆环病毒和鸽圆环病毒(35，38， 50，51，52)。已经识别出两种PCV基因型。PK15细胞来源的PCV被 认为对猪是不致病的(3，48)，并被指定为PCV 1型(PCV1)。血清学观 察表明PCV1在猪体内广泛分布，但没有已知的动物疾病与PCV1相 关。另一方面，PCV 2型(PCV2)现在被认为是与断奶仔猪多系统衰竭 综合征(PMWS)有关的主要传染原(2，6，20)，该疾病自其在1991年在 加拿大出现以来成为新的全球性猪病(1，8)。
PCV2和其作用模式
凋亡为具有特异形态学和生物化学变化的细胞自我破坏的主动生 理学过程(39)。很多病毒将诱导凋亡作为它们天然生活周期的一部分 (39)。一方面，凋亡可能是释放和传播宿主细胞产生的子代病毒体的 重要机制，通过使对病毒剂的炎性或免疫反应降至最低。另一方面， 病毒诱导的凋亡可视为多细胞宿主生物有目的的破坏被感染细胞的防 御机制。大多数导致凋亡细胞死亡的病毒触发caspase(半胱氨酸天冬 氨酸蛋白酶)级联来执行该死亡程序过程。有人提出凋亡为导致天然感 染PMWS的猪中B细胞减少的机制(43)，但是最近报道了相反的结果： 淋巴细胞凋亡在PMWS淋巴样减少损伤的发生中并非普遍现象(24， 37)。
在PCV1或PCV2分离群内总体DNA序列同源性大于90％，但是 PCV1和PCV2分离群之间的同源性为68-76％。已鉴别了两个主要的 PCV开放阅读框(ORF)-ORF1，也称为rep基因，编码与病毒复制有 关的35.7kDa蛋白(26)，和ORF2，cap基因，编码27.8kDa的主要免 疫原性衣壳蛋白(9，30，31)。除了复制酶ORF1和衣壳蛋白ORF2，通 过计算机搜索预计还含有其它五个编码大于5kDa蛋白的潜在ORF (27)。这些潜在ORF是否被表达以及表达的蛋白是否为病毒复制所必 需还有待阐明。
对于PCV2，这五个ORF中最大的是长度315bp的片段，这里称 为ORF3，其没有显示出与任何已知蛋白的相似性。相反，位于PCV1 的对应区域内的ORF片段为612bp长，远大于PCV2中的ORF3。此 外，在PCV2的ORF3和PCV1的对应区域之间仅有61.5％的氨基酸 一致性。这种变异是否与PCV2的病原性有关还有待确认。
PMWS患病猪的组织病理学发现和疾病特征提示，在一些情况下， PCV2可能是猪继发性免疫缺陷的诱因。PMWS患病猪中显微损伤的 特征是滤泡和滤泡间细胞区域的淋巴细胞减少，以及淋巴组织的巨噬 细胞渗透。此外，其它传染原与PCV2的共同感染增加了该疾病的发 生率和严重性。(2，3)
由于死亡率在一些农场仍然相当高，目前PMWS在全球养猪业中 仍是重要问题。尽管在开发针对PCV2的DNA疫苗或亚单位疫苗方面 有些资料，但是针对某些病原体的活减毒疫苗的潜在和保护效力仍应 是重要考虑内容。现在仍未知在防止该疾病散布方面有效的减毒活疫 苗。
目前可得到两种疫苗：ORF2重组亚单位疫苗和DNA疫苗。尽管 两种疫苗在完全抑制PCV2的复制方面有效，但是缺乏有利的特点降 低了它们作为针对PCV2的有效疫苗的商业价值。DNA疫苗能够在猪 体内诱导体液和细胞应答，但是缺乏适合的递送系统来适当地给予该 疫苗。这影响了其在减弱PCV2感染中的有效性，而这只有在感染后 3周才能看到(5)。尽管亚单位疫苗对PCV2更有效，但其仅能刺激体 液免疫。通过使用杆状病毒系统获得的低蛋白浓度也意味着要使动物 对PCV2免疫需要对动物进行多次给药，由此而降低了其有效性。另 外，实验动物的显著生长迟缓在PCV2感染后的第三和第四周仍很明 显。而且，对两种疫苗的初免-加强方案还有待确认。
因此，需要改进的疫苗以对抗PMWS。
概要
本发明基于对ORF3基因的发现和对其在病毒中的凋亡作用的鉴 定。该发现导致开发针对PCV2的减毒活疫苗。
本发明的第一方面提供免疫原性的减毒PCV2病毒，其中该减毒 至少部分地归因于异常ORF3表达。
本发明的第二方面提供疫苗，其包含免疫学有效量的本发明第一 方面的病毒。
本发明的第三方面提供诱导针对PCV2的免疫反应的方法，所述 方法包括向个体给予本发明第二方面的疫苗。
本发明的第四方面提供本发明第一方面的病毒在药物中的用途。
本发明的第五方面提供在个体中诱导针对PCV2的体液免疫反应 和细胞免疫反应的病毒。
本发明的第六方面提供本发明第一方面的病毒在制备用于在个体 中诱导针对PCV2的免疫反应的药物中的用途。
本发明的第七方面提供用于产生本发明第一方面的病毒的宿主细 胞。
本发明的第八方面提供采用本发明第一方面的病毒的治疗方法， 该方法包括对所述动物给予免疫学有效量的病毒。
本发明的第九方面提供产生本发明第一方面的病毒的方法，该方 法包括在适当条件下以使得能够产生所述病毒的方式培养本发明第七 方面的宿主细胞。
本发明的第十方面提供能够诱导凋亡的蛋白。在一个实施方案中， 该蛋白包含如SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列： MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLH FPAHFQKFSQPAEISDKRYRVLLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSL RSRSSTFYQ。
本发明的第十一方面提供编码本发明第十方面的蛋白的核酸。
在一个实施方案中，该核酸分子包含SEQ ID NO.2中所列的序列： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA。
本发明的第十二方面提供包含突变形式的本发明第十一方面核酸 分子的核酸分子，所述核酸分子是这样突变的，以至于该核酸分子编 码的蛋白异常表达。
本发明的第十三方面提供由本发明第十二方面的核酸分子编码的 蛋白。
本发明的第十四方面提供包含本发明第十一或第十二方面的核酸 分子的载体、病毒或宿主细胞。
本发明的第十五方面提供能够结合本发明第十或第十三方面的蛋 白的抗体。
本发明的第十六方面提供产生能够结合本发明第十或第十三方面 的蛋白的抗体的方法。
本发明的第十七方面提供药物组合物，其包含本发明的核酸分子、 蛋白、抗体、拮抗剂、激动剂、病毒、载体或宿主细胞。
本发明的第十八方面提供鉴定本发明第十方面的蛋白的激动剂或 拮抗剂的方法。
该方法可以包括：
(i)使测试化合物与本发明第十方面的蛋白接触并确定该测试化 合物是否增强或减弱该蛋白诱导凋亡的能力；或者
(ii)在细胞中表达本发明第十方面的蛋白，将细胞暴露于测试化 合物并确定该测试化合物是否增强或减弱该蛋白诱导凋亡的能力。
本发明的第十九方面提供通过本发明第十八方面鉴定的激动剂或 拮抗剂。
本发明的第二十方面提供根据其诱导断奶仔猪多系统衰竭综合征 的能力而筛选出至少一种候选分子的方法。
所述方法可以包括：
(a)使所述至少一种候选分子与生物样品接触；以及
(b)测定所述至少一种候选分子在所述生物样品中诱导的凋亡水 平。所述凋亡水平表明所述至少一种候选分子诱导断奶仔猪多系统衰 竭综合征的能力
在一个实施方案中，所述方法还包括确定候选分子是否增强或减 弱蛋白诱导凋亡的能力。
术语词汇
这部分旨在提供对以下列出的词语和短语(及其合适的语法变体) 的解释的指导。
当用在本申请中时，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数指代， 除非上下文清楚地指明并非如此。例如，术语“试剂”包括多种试剂， 包括其混合物。
用在本文时，术语“包含(comprising)”指“包括(including)”。 在本说明书的上下文中，术语“包含”指“主要包括，但不必仅为”。 单词“包含(comprising)”的变体，如“包含(comprise)”和“包含 (comprises)”具有相应的变化的含义。
用在本文时，术语“疫苗”包括可以被用于刺激动物的免疫系统 的试剂。以此方式可以提供针对不被免疫系统识别为自身抗原的抗原 的免疫保护。
术语“免疫”包括向个体递送免疫原的过程。例如，免疫可以引 起持续的高水平抗体和/或细胞应答，其中T淋巴细胞能够杀死或抑制 经免疫的动物中的病原体，这是针对该动物之前接触过的病原体或抗 原。
术语“蛋白”指由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。术语“蛋 白”和“多肽”本文中可互换使用，尽管出于本发明的目的，“多肽” 可以构成全长蛋白的一部分，例如其功能或活性片段。或者，术语“蛋 白”也可以构成功能变体。
用在本文时，术语“多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 碱基或已知的类似物或天然核苷酸或其混合物的单链或双链聚合物。
遍及整个公开内容，本发明的多个方面都以范围形式呈现。应理 解的是，范围形式的描述仅仅是出于方便和简洁的目的，不应被理解 为对本发明的范围的不变限定。因此，范围说明应被认为是已经明确 公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1 至6的范围的说明应被理解为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1 至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值， 例如1、2、3、4、5和6。其使用与范围的宽度无关。
除非另有说明，本文使用的所有科技术语的含义与本发明所属领 域普通技术人员所通常理解的相同。
附图说明
图1 (A)感染性PCV2分子DNA克隆的构建。用于扩增完整PCV2 基因组的引物对的相对位置用箭头表示(反向引物，R-PCVPST1；正向 引物，F-PCVPST1)。通过PCR扩增的PCV2基因组DNA用PstI限制 酶消化并纯化。将纯化和消化的基因组DNA连接到pSK载体中，其 之前用PstI酶预消化以产生分子PCV2 DNA克隆。该DNA克隆被进 一步消化和凝胶纯化用于PCV2的自身连接，然后将环化的PCV2 DNA转染进PK15细胞。(B)图解缺乏ORF3基因的PCV2突变体的 构建。(C)PCV2株BJW的遗传图(GenBank登录号AY847748)。三个 开放阅读框的编码序列用nt坐标表示，其表明每个基因的核苷酸位点。 ORF2和ORF3基因向左方转录，ORF1向右转录。也标出了PstI限制 酶位点。(D)通过RT-PCR分析PCV2感染细胞内的ORF3基因。从 PCV2感染或假感染细胞分离RNA并逆转录成cDNA。用成对的ORF3 引物扩增cDNA。采用PCR反应从PCV2基因组扩增阳性片段。(E)从 PCV2感染的PK15细胞通过ISH检测ORF3 RNA。采用反义ORF3 DIG 标记的RNA探针(riboprobe)在感染后24(a)，48(b)，72(c)，和96(d)h 在感染细胞的核中检测到ORF3 mRNA表达。还采用有义ORF3 DIG 标记的RNA探针在感染后48h在感染细胞中检测到ORF1 mRNA表 达(e)。采用反义ORF3 RNA探针在假感染细胞(f)中没有检测到信号。 标尺，10μm。
图2 ORF3蛋白在PCV2感染细胞中的表达。(A)用针对PCV2的 ORF3蛋白产生的抗血清检测PCV2感染的PK15细胞。使用PCV2株 BJW在感染后24(b)，48(c)，和72(d)h时的感染后PK15细胞的IFA 染色。当通过IFA染色假感染的PK15细胞时将(a)用作阴性对照。采 用荧光显微镜观察和拍照细胞。ORF3抗原位于细胞核中，在感染细 胞的细胞质中较少。标尺，10μm。(B)将来自PCV2株BJW感染的 PK15细胞的总细胞裂解物在15％ SDS-PAGE中电泳，转移至硝酸纤 维膜，并通过抗ORF3抗体的抗血清检测。感染后ORF3蛋白在PCV2 感染的细胞中表达。
图3 将ORF3缺陷PCV2感染的细胞的IFA染色用于检测ORF3 蛋白表达。用重组PCV2病毒储备(stock)(A和B)或用第五代ORF3 缺陷PCV2病毒储备(D和E)以MOI为1感染PK15细胞。将假感染 PK15细胞用作阴性对照(C和F)。在感染后48h，将细胞固定并通过 小鼠抗ORF3血清(A，D，和F)或猪抗PCV2血清(B，C，和E)免疫荧光 染色来进行分析。标尺，10μm。
图4 ORF3缺陷PCV2以及重组PCV2和野生型PCV2的复制动力 学。用标明的病毒以MOI为1感染PK15细胞并在标明的时间点收集 细胞，通过IFA确定以TCID50/ml表示的感染滴度。
图5 PCV2在培养的PK15细胞中诱导凋亡。(A)通过DAPI染色 PCV2感染的PK15细胞显示核小体DNA片断化。用PCV2株BJW感 染的细胞在感染后48(a和b)和72(d和e)h分别用猪抗PCV2血清通 过IFA检测和用DAPI染色。在c和f中显示了叠加图。标尺，10μm。 (B)在电子显微镜下观察PCV2诱导的凋亡。假感染细胞(a)，完整的 细胞核(N)显示大的、唯一的电子致密核仁(n)。感染后48(b)和72(c)h 时的细胞显示典型的凋亡标志，如染色质向外围浓缩至新月形物质(短 箭头)，和细胞核片断化，它们各自形成凋亡小体。标尺，2μm。
图6 定量测定PCV2诱导的凋亡细胞。(A)通过对用PCV2株BJW 感染的PK15细胞的碘化丙啶染色和流式细胞术分析来确定凋亡的代 表图。对于每个小图，表明了具有亚二倍体(凋亡)DNA含量的PK15 细胞的百分比(M1)。B显示A中所示的三个实验的凋亡的平均百分比。 C显示在标明的时间三个实验中脱离细胞的平均百分比。
图7 单独的ORF3蛋白在感染的细胞中诱导凋亡。(A)用 GFP-ORF3质粒转染的PK15和Cos-7细胞在24h时分别显示ORF3 表达(a和d)和DAPI染色显示的核小体DNA片断化(b和e)。在c和f 中显示了叠加的图像。标尺，10mm。(B)定量分析ORF3蛋白诱导的 凋亡。通过DAPI染色的核形态分析对三个实验的凋亡细胞百分比进 行评价。(C)显示了B中所示的三个实验中脱离细胞的平均百分比。
图8 (A)对三个实验组腹股沟淋巴结的组织病理学检查显示感染 后的第7和14天时阴性对照和mPCV2组的生发中心处健康和密集的 淋巴细胞。然而野生型PCV2在感染后第7天显示组织细胞炎性渗透 以及淋巴细胞减少的迹象，且在感染后第14天时有显著大量的凋亡细 胞(箭头)。HE，标尺＝200μm。
(B)阴性对照的腹股沟淋巴结显示没有PCV2抗原，而突变体 PCV2和野生型PVC2在感染后第14天显示在淋巴细胞的细胞质中大 量存在PCV2抗原(暗褐色染色)。在免疫组织化学技术中，甲基绿复 染，标尺＝200μm。
图9 PCV2病毒基因组的序列信息。
图10 ORF3中突变的位置。突变体27将Ala变为终止密码子， 导致表达截短的26个氨基酸长的ORF3蛋白。突变体52和61通过分 别将His+改为Asp-以及将Glu-改为Lys+反转了氨基酸电荷。突变体 85通过将His+改为Tyr失去了正电荷。将突变的病毒基因组转染进 PK15细胞，使其生长5天。5天后，收集细胞并通过3X冻融溶解。 然后将总细胞溶解物用于新鲜PK15细胞的感染。
图11在细胞培养第十五次传代后四天时突变体和PCV2转染细胞 的凋亡引起的细胞死亡。相较于突变体52、85和PCV2的70-90％细 胞死亡，突变体27、61及ORF3起始密码子的删除和突变导致的突变 体引起10％的细胞死亡。
图12 ORF3突变体27的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图13 ORF3突变体52的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图14 ORF3突变体61的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图15 ORF3突变体85的DNA序列。突变点以小写字体表示。
图16 ORF3双突变体ATG & 27的DNA序列。突变点以小写字 体表示。
图17 ORF3双突变体ATG & 61的DNA序列。突变点以小写字 体表示。
图18 ORF3三突变体ATG，27 & 61的DNA序列。突变点以小写 字体表示。
实施方式的详细公开
减毒病毒
本发明提供免疫原性减毒PCV2病毒，其中该减毒至少部分地归 因于异常ORF3表达。
本发明的减毒病毒为免疫原性的，即其能够引起免疫反应。该减 毒病毒可以用在下文描述的疫苗组合物中，以引起针对野生型PCV2 病毒随后攻击的保护性免疫反应。
尽管本发明的病毒能够引起免疫反应并且是有传染性的，但是它 们被充分减毒，以至于不会在经免疫的宿主中引起不可接受的PMWS 症状(或PCV2可能引起的任何其它疾病)。在一个实施方案中，该病 毒被充分减毒，以至于在大多数经免疫的个体中不会发生感染症状。
该减毒至少部分地归因于异常ORF3表达。因而，本发明的病毒 诱导凋亡的能力减弱或缺乏。在一个实施方案中，该减毒完全归因于 异常ORF3表达。
为了避免不确定性，用在本文中时术语“减弱的”包括术语缺乏， 除非上下文明确指明并非如此。
在一个实施方案中，异常ORF3表达是定性的。因此，例如与野 生型ORF3蛋白表达相比，从ORF3表达的蛋白可以具有减弱的功能 或无功能。
使用“减弱的功能或无功能”，我们包括这样的情况，ORF3蛋 白具有一个或多个突变，其导致编码的蛋白与野生型ORF3蛋白相比 诱导凋亡的能力减弱或丧失。
在一个实施方案中，异常ORF3表达是定量的。因此，与野生型 致病性PCV2相比，从ORF3的蛋白表达减弱或缺乏。
在一个实施方案中，异常ORF3表达可以是定量的和定性的，即 该ORF3蛋白与野生型ORF3蛋白相比功能减弱或缺乏并且ORF3蛋 白的表达量比野生型PCV2病毒的ORF3蛋白表达少。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有突变。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有双突变。
在一个实施方案中，在ORF3序列中有三突变。
在一个实施方案中，在病毒的另一区域中有突变(即在除ORF3之 外的区域)，其影响ORF3表达。
在本发明病毒中的突变应该使得病毒复制依然发生。
在一个实施方案中，突变使得仍产生有功能的ORF1，即ORF1 编码的蛋白仍能够履行其复制角色。在一个这样的实施方案中，在 ORF3序列中有突变，该突变不导致ORF1编码的蛋白中的任何变化。
在一个实施方案中，ORF3的起始密码子被突变，以至于其是无 功能的。ORF3的起始密码子ATG例如可以被突变为A被G替换， 即起始密码子ATG突变为GTG。由于遗传密码的简并性，这种突变 是具有不导致ORF1编码的蛋白中任何变化的优势。
在一个实施方案中，终止密码子替代了ORF3中的丙氨酸，导致 产生无功能的截短的26个氨基酸长的ORF3蛋白。
在一个实施方案中，ORF3中的氨基酸序列被置换，以至于在该 蛋白的α区中所选氨基酸的电荷被反转或变为中性，由此使得到的蛋 白不折叠并变得无功能。在一个实施方案中，61位氨基酸谷氨酰胺- 变为赖氨酸+。
如在下文实施例部分所描述的，通过采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)将特定突变引入PCV2克隆 的基因组来产生这类突变。根据生产商的说明，使用一套诱变引物(正 向引物：5′-GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3′，反向引 物：TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3′)产生突变体 质粒。该突变[以粗体表示在图1B中，(nt671)]不在该位点改变ORF1 蛋白的氨基酸序列，但是将终止ORF3蛋白的表达。
可以用在本发明中的突变的实例包括：引入终止密码子；重排； 置换突变(例如错义和无义突变)；缺失突变(缺失一个或多个核苷酸或 缺失一个或多个密码子)；移码突变；以及插入(插入一个或多个核苷 酸或插入一个或多个密码子)。引入突变的方法在现有技术中是公知 的，技术人员能容易地完成。例如，定点诱变能够增加、删除或改变 一个或多个核苷酸。
突变对ORF3功能/表达的影响例如可以采用在下文材料和方法部 分描述的凋亡测定来确定。
在一个实施方案中，相对于ORF1蛋白而言所述突变为沉默突变 (即对ORF1功能无显著有害影响的突变，且在一个实施方案中对ORF1 功能无影响)。
除了在病毒中存在导致异常ORF3功能的一个或多个突变之外， 病毒中还任选地可以有一个或多个其它突变。例如，该突变可以是以 上描述的任何类型的突变，例如缺失突变。
在一个实施方案中，该病毒在其基因组中不包含任何有损于其诱 导针对PCV2的免疫反应的变化。
在一个实施方案中，该病毒在ORF2序列中不包含任何导致被编 码的ORF2蛋白改变的任何变化。
在一个实施方案中，该病毒在ORF1序列中不包含任何导致被编 码的ORF1蛋白改变的任何变化。
在本发明的一个实施方案中，该PCV2病毒与野生型(致病的) PCV2病毒无区别或无根本区别，除了在病毒中引入了导致异常ORF3 表达的一个或多个突变。
本发明的PCV2病毒在一个实施方案中以分离的形式被提供。分 离的指PCV2处于与野生型病毒的天然环境不同的环境中。例如，所 述病毒可以是细胞培养物或其它人工培养基的组分，在其中其能够在 可控情况下增殖并被表征；作为细胞培养物上清的组分；作为药物组 合物的组分；或从其天然环境中被部分或完全纯化。
尽管以上的讨论涉及本发明的减毒病毒，但适合时上述某些部分 也涉及本发明的其它方面，例如本发明的核酸分子(见下文)。
疫苗
本发明提供包含本发明病毒的疫苗。这类组合物可以按照兽医或 药物领域技术人员熟知的标准技术来制备。
本发明的疫苗包含免疫学有效量的病毒。作为如本文所述产生的 使用免疫学有效量病毒接种的结果，个体变得至少部分地或完全地对 PCV2感染免疫，或对发展中等或严重PCV2感染有抵抗力。本发明 的病毒可以被用于引起体液和细胞应答。
优选地，所述个体被保护至这样的程度：其中PMWS的一至多个 有害生理学症状或影响被减弱、改善或完全防止。
实际上，免疫学有效剂量所需的确切量随个体不同而变化，取决 于多个因素，例如个体的年龄和一般状况，制剂的性质和给药模式， 等等。因此，不可能指定确切的“有效量”。但是，对于任何给定的 病例，本领域普通技术人员仅采用例行试验就可以确定合适的“有效 量”。
例如，现有技术中已知确定或滴定活性抗原剂的合适剂量来得到 基于猪体重的最小有效剂量、抗原浓度和其它典型因素的方法。引起 适当免疫反应的组合物的剂量、其中的组分浓度和组合物给药时间安 排可通过以下方法来确定，例如通过血清的抗体滴定，例如通过ELISA 和/或血清中和测定分析和/或通过在猪中进行接种激发评价。
本发明的疫苗可以包含药物可接受的载体。用语“药物可接受的” 指生理学上可忍受的分子实体和组合物，并且当向个体给药时，通常 不产生变应性或类似的不利反应，例如嘈杂、眩晕等等。有用的载体 在现有技术中是公知的，包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨 酸、透明质酸等等。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗包含佐剂。佐剂为提高个 体(例如猪)对疫苗的免疫反应的物质。适合的佐剂包括但不限于氢氧 化铝(明矾)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子嵌段聚合物或共聚物、 细胞因子(如IL-1，IL-2，IL-7，IFN-α，IFN-β，IFN-γ等)、皂甙、单磷脂酰 脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等。其它适合的佐剂例如包括硫酸 钾铝、分离自大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热的或热稳定的内毒 素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗 氏不完全或完全佐剂等。基于毒素的佐剂如白喉毒素、破伤风毒素和 百日咳毒素可以在使用前被灭活，例如通过用甲醛处理。
在一个实施方案中，提供疫苗，其还包含至少一种来自至少一种 其它病原体的免疫原，所述病原体例如为猪病原体，例如猪繁殖和呼 吸综合征(PRRS)、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、伪狂犬病、猪霍乱、猪流感以及猪细 小病毒(PPV)。来自其它病原体的免疫原可以被包括在本发明病毒的基 因组内或作为本发明疫苗组合物内的独立部分而存在。
根据本发明产生的PCV2可与其它PCV2株等的病毒联合。或者， 多种类型的保护性表位可以被设计进一个病毒中。这种技术在现有技 术中是已知的，技术人员能够容易地实现。
本发明的疫苗能够方便地通过鼻内给予、经皮给予(即应用在皮肤 上或皮肤表面用于全身吸收)、胃肠外给予等。胃肠外给药途径包括但 不限于肌内、静脉内、腹膜内、皮内(即注射或以其它方式置于皮肤下) 途径等。
本发明的疫苗可以适应于任何一种上述途径给药。
当作为液体给药时，本发明的疫苗可以制备为水溶液、糖浆、酏 剂、酊剂等的形式。这类制剂在现有技术中是已知的，通常通过将抗 原和其它典型的添加剂溶解在合适的载体或溶剂系统中来制备。药物 可接受的载体、赋形剂或稀释剂的实例为去矿物质水或蒸馏水；盐水 溶液；基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米 油、芝麻油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、 花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅 氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，如液体石蜡、凡士 林或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤 维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，如乙醇或异 丙醇；低级芳烷醇；低聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二 醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸脂， 如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼 脂；角叉菜胶、西黄蓍胶或阿拉伯胶以及石油胶冻。通常，载体或多 种载体形成组合物重量的10％至99.9％，并且可以采用现有技术中已 知的试剂通过常规方法来缓冲，例如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢 钾、磷酸二氢钾、其混合物，等等。
液体制剂还可以包括含有与其它标准辅配剂(co-formulant)联合的 助悬或乳化试剂的混悬液和乳剂。这类液体制剂可以通过常规方法制 备。混悬液例如可以采用胶体磨来制备。乳剂例如可以使用匀浆器来 制备。
通常，本发明的疫苗会包含病毒的混悬液和稳定剂。
本发明的疫苗能够作为单一剂量或以重复剂量给药。
本发明的疫苗能够单独给药，或者能够与一种或多种其它组合物 (例如其它的猪免疫原性或疫苗组合物)同时(即在同一时间)或相继给 药(即在不同时间)。当组合物在不同时间给药时(即相继给药)，给药可 以是分开的或者是在时间上有重叠的。
在本发明的一个实施方案中，采用单次剂量的本发明病毒免疫个 体。
在一个实施方案中，含有本发明PCV2的疫苗组合物被给予易感 于PCV2感染或者有PCV2感染风险的个体，以增强该个体的自身免 疫反应能力。
在一个实施方案中被给予该疫苗的个体为猪。但是，该个体可以 是可能希望在其中引起针对所述病毒的免疫反应的任何动物(例如哺 乳动物)。该动物可以是易感于PCV2或密切相关病毒的感染。
尽管通常考虑该个体为猪，但也可能希望将本发明的疫苗给予其 它类型的动物。例如，“试验”动物可以被给予本发明的疫苗，以便 评估该疫苗的性能，目的是为了最终的用途或开发猪疫苗。
期望的是，所述疫苗被给予还未暴露于PCV2病毒的个体。
在一个实施方案中，所述个体是猪，其需要针对断奶仔猪多系统 衰竭综合征(PMWS)的疫苗接种。
可预见的是，所述疫苗不仅可用于向成体猪给药，也可向小猪或 怀孕雌性给药。对后者的疫苗接种使得赋予新生幼崽被动免疫成为可 能(母体抗体)。在一个实施方案中，所述猪小于7，6，5，4，3，2或1周 龄。
在一个实施方案中，所述猪为1至6周龄；2至5周龄；或3至4 周龄。
产生病毒
本发明的一个方面提供产生本发明减毒PCV2的宿主细胞。
多种宿主细胞可以用于产生本发明的病毒，包括猪细胞，例如猪 肾细胞，如PK15细胞。
本发明还提供产生本发明减毒PCV2的方法，该方法包括在适合 条件下以允许该减毒PCV2产生的方式培养本发明的宿主细胞。该方 法还可以包括从培养基分离减毒的PCV2并且任选地进一步处理该减 毒的PCV2。
宿主细胞的适合生长条件对本领域技术人员来说是已知的，或者 可容易地由本领域技术人员确定，其中将包括对适合营养条件的选择。 在一个实施方案中，所述培养基至少包含水、盐、营养物、必需氨基 酸、维生素和抗生素，并且还可以包含一种或多种生长因子。
能够诱导凋亡的蛋白
本发明的第十方面提供能够诱导凋亡的蛋白。在一个实施方案中， 该蛋白包含SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列： MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLH FPAHFQKFSQPAEISDKRYRVLLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSL RSRSS TFYQ。
在一个实施方案中，提供由SEQ ID NO.1中所列的氨基酸序列组 成的蛋白。
本发明的蛋白包括功能等同物、变体、活性片段和包含SEQ ID NO：1中所列氨基酸序列或由其组成的那些蛋白的融合蛋白。为了避免 不确定，以下的均包括在本发明的范围内：活性片段和融合蛋白的功 能等同物；功能等同物和融合蛋白的活性片段；以及包含功能等同物 或活性片段的融合蛋白。
术语“片段”指核酸或多肽序列，其编码全长蛋白的成分或为全 长蛋白的成分。就多肽而言，所述片段具有与全长蛋白一样的定性生 物活性。根据本发明使用的生物活性片段通常可以具有对应的全长蛋 白的至少约50％的活性，更通常地是这种活性的至少约60％，更通常 地是这种活性的至少约70％，更通常地是这种活性的至少约80％，更 通常地是这种活性的至少约90％，并且更通常地是这种活性的至少约 95％。
用在本文时，术语“变体”指基本类似的分子。一般而言，核酸 序列变体编码具有共同定性生物活性的多肽。一般而言，多肽序列变 体也具有共同的定性生物活性。此外，这些多肽序列变体可以具有至 少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，82％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％或99％的序列一致性。
本发明第八方面的功能等同物、活性片段和融合蛋白保留野生型 ORF3蛋白(SEQ ID NO.1)的诱导凋亡的能力。凋亡活性例如可采用描 述在下文材料和方法部分的凋亡测定法来评估。但是，本领域技术人 员能够设计替代的或其它的测定法或手段来评估凋亡活性。
在本发明的一个实施方案中，提供SEQ ID NO.1的功能等同物， 其例如含有单个或多个氨基酸置换、添加、插入和/或缺失和/或化学修 饰氨基酸的置换。但是，如上所述，这些功能等同物将保留诱导凋亡 的能力。
根据本发明的这个方面，功能上等同的蛋白包括与SEQ ID NO.1 中所列的氨基酸序列具有至少65％序列一致性的蛋白。
测定蛋白序列一致性的方法在现有技术中是公知的，本领域技术 人员应理解的是，在本发明上下文中，序列一致性是基于氨基酸一致 性来计算的(有时被称为“硬同源性”)。例如，UWGCG程序包提供 了BESTFIT程序，其可被用来计算序列一致性(例如以其缺省设置使 用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。 PILEUP和BLAST算法可被用来计算序列一致性或排列序列(通常是 以其缺省设置)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300； Altschul，S，F et al(1990)J Mol Biol 215：403中所描述的。用于进行 BLAST分析的软件可通过因特网在如www.ncbi.nlm.nih.gov/通过万 维网上的National Center for Biotechnology Information(国家生物技术 信息中心)公开获得。这种算法首先包括通过在查询序列中鉴定长度W 的短字串(word)来鉴别高分序列对(HSP)，当这些短字串与数据库序列 中相同长度的字串比对时匹配或满足某些正值域分值T。T被称为邻 近字串得分阈值(neighbourhood word score threshold)(Altschul et al， 见前)。这些起初的邻近字串采样用作起始检索的种子(seed)来发现含 有它们的HSP。字串采样沿每个序列的两个方向延伸，只要累积的比 对分值可增加。对两条链延伸。BLAST算法在两序列间进行相似性的 统计学分析；参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nad.Acad.Sci. USA 90：5873。BLAST算法提供的对相似性的一个测量为最小总可能 性(P(N))，其提供了对相互替代的两核苷酸或氨基酸序列之间匹配可 能性的指示。
在一个实施方案中，本发明此方面的功能上的等同蛋白表现出与 SEQ ID NO.1中所列的蛋白或其片段有大于65％的序列一致性程度。 该蛋白可以具有至少70％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％的序 列一致性程度。
由此，本发明功能上等同的蛋白旨在包括突变体(例如含有氨基酸 置换、插入或缺失的突变体)。这种突变体可以包括其中一个或多个氨 基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换的蛋 白，并且这些置换的氨基酸残基可以或不能被遗传密码编码。典型的 这种置换在Ala，Val，Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残 基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间； 或者在芳族残基Phe和Tyr之间。
尤其优选这样的蛋白，其中有几个即5至10个、1至5个、1至 3个、1至2个或仅1个氨基酸以任何组合被置换、删除或添加。尤其 优选的是沉默置换、添加和删除，其并不改变蛋白的性质和活性。这 方面也尤其优选保守置换。“突变体”蛋白还包括其中一个或多个氨 基酸残基包括取代基的蛋白。
包括在本发明范围内的还有活性片段，其中“活性片段”指保留 了野生型ORF3蛋白(SEQ ID NO.1)诱导凋亡能力的截短的蛋白。
本发明的活性片段应该包括来自本发明蛋白(例如来自SEQ ID NO.1或其功能等同物)的至少n个连续氨基酸。n通常为50，75，85，90， 95或100或更多。
在一个实施方案中，所述活性片段包含SEQ ID NO.1或其功能等 同物的序列的至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或99％。
这些片段可以是“独立的”，即不是其它氨基酸或蛋白的一部分 也不融合至其它氨基酸或蛋白，或者它们可以被包含在较大蛋白内， 形成该较大蛋白的一部分或区域。当包含在较大蛋白中时，在一个实 施方案中本发明的片段形成单一连续区域。此外，几个片段可以被包 含在单个较大蛋白中。
在本发明的一个实施方案中，提供融合蛋白，其包含融合至肽或 其它蛋白如标签的本发明蛋白，所述标签例如为生物活性的、放射活 性的、酶活性的或荧光的，或抗体。
例如，通常有利的是包括一个或多个其它的氨基酸序列，这些氨 基酸序列可以含有分泌或前导序列、前序列、协助纯化的序列或例如 在重组生产中赋予更高蛋白稳定性的序列。作为选择或补充，成熟蛋 白可以融合至其它的化合物，例如增加蛋白半衰期的化合物(例如，聚 乙二醇)。
编码本发明第十方面蛋白的核酸分子
本发明的第十一方面提供编码本发明第十方面蛋白的核酸分子。
在一个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO.2中所列序 列。
在一个实施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO.2中所列序列组 成。
本领域技术人员应理解的是，作为遗传密码简并性的结果，可以 产生多种编码本发明第八方面蛋白的核酸分子，一些与SEQ ID NO.2 具有最低限度的序列一致性。因此，本发明涉及多核苷酸序列的每种 和所有的可能变化，该变化可以通过根据可能的密码子选择而选择组 合形成。
在本发明的一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO.2的简并版本 的核酸分子，即该核酸分子包含其中一个或多个SEQ ID NO.2的密码 子被简并密码子替换的核酸序列，该简并密码子与SEQ ID NO.2的天 然密码子编码相同的氨基酸。
本发明的核酸分子例如可以为RNA形式，例如mRNA，或者DNA 形式，例如包括通过克隆或合成产生而获得的cDNA和基因组DNA。 DNA可以为双链的或单链的。单链DNA或RNA可以为编码链，也 称为有义链，或者其可以为非编码链，也称为反义链。
术语“核酸分子”(和类似的表达如“核酸”、“核酸序列”等) 也包括DNA和RNA的类似物，例如含有修饰骨架的那些。
通常，本发明的核酸分子在其范围内还包括核酸序列的功能等同 物或片段，其中所述功能等同物或片段编码保留了野生型ORF3蛋白 诱导凋亡能力的蛋白。可采用分子生物学中的标准技术定位和分离这 些功能等同物和片段，而无需过多的试验和实验。
所述功能等同物可以与SEQ ID NO.2或其在遗传密码简并性内 的对应序列同源，同时仍编码保留了诱导凋亡能力的蛋白。在本发明 的一个实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其 在遗传密码简并性内的对应序列有至少70％，80％，85％，90％，92％， 95％，97％，98％，或99％同源性的序列，同时仍编码保留了诱导凋亡能 力的蛋白。
两核酸序列之间的同源程度可以通过现有技术中已知的计算机程 序来确定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1996，Genetics Computer Group， 575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B. and Wunsch，CD.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使 用如下设置的GAP进行DNA序列比较：GAP产生罚分为5.0，GAP延 伸罚分为0.3。
可以采用作为GCG程序包一部分的Pileup比对软件将核酸分子 相互比对，例如采用缺口产生罚分为5和缺口宽度罚分为0.3的缺省 设置。
本发明的核酸分子在其范围内还可以包括能够在低严紧条件、更 优选地在中等严紧条件以及更优选地在高严紧条件下与SEQ ID NO.2 中定义的核酸序列或其在遗传密码简并性内的对应序列杂交的功能等 同物。低严紧杂交条件可以对应在2 x SSC中在50℃下进行杂交。
用于确定给定的核酸分子是否与特异的核酸杂交的适合实验条件 可以包括将含有待检核酸相关样品的滤膜事先浸泡在5xSSC中10分 钟，并将该滤膜在5 x SSC、5 x Denhardt′s溶液、0.5％ SDS和100μg/ml 的变性的超声处理的鲑精DNA溶液中预杂交，随后在含有浓度为10 ng/ml的32P-dCTP标记的探针的相同溶液中在约45℃下杂交12小时， 与Sambrook等人(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition(分子克隆，实验室手册，第二版)，Cold Spring Harbour，New York)描述的杂交方法一致。
然后将滤膜在至少55℃(低严紧)、至少60℃(中等严紧)、至少 65℃(中/高严紧)、至少70℃(高严紧)、或至少75℃(超高严紧)下在 2xSSC、0.5％ SDS中洗涤两次，每次30分钟。可以通过将滤膜暴露 于X射线胶片来检测杂交。
另外，本领域技术人员熟知有多个条件和因素可以被用来改变杂 交严紧性。例如，待杂交至特定核酸的核酸的长度和性质(DNA、RNA、 碱基组成)；盐和其它组分的浓度，例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、 聚乙二醇等；以及改变杂交和/或洗涤步骤的温度。
此外，也可能从理论上预测两给定核酸序列是否会在某些特定条 件下杂交。因此，作为以上描述的实验方法的替代，确定变体核酸序 列是否与SEQ ID NO：2中定义的核酸分子或其在遗传密码简并性内的 对应序列杂交能够基于对Tm(熔化温度)的理论计算，在该Tm下序列 已知的两异源核酸序列在诸如盐浓度和温度的特定条件下将杂交。
在确定异源核酸序列的熔化温度(Tm(异))中，必需首先确定同源 核酸序列的熔化温度(Tm(同))。两完全互补的核酸链(同质双链结构)之 间的熔化温度(Tm(同))可以根据下式确定，如Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)，John Wiley and Sons，1995 中所概述的：
Tm(同)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％ form)-500/L
M＝表示一价阳离子的摩尔浓度，
％GC＝序列中碱基总数的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的％，
％ form＝杂交缓冲液中的甲酰胺的％，以及
L＝核酸序列的长度。
由上式确定的Tm为两完全互补的核酸序列之间的同质双链结构 的(Tm(同))。为了使Tm值适合于两异源核酸序列，假定两异源序列之 间核苷酸序列中1％的差异等于Tm降1℃。因此，异质双链结构的 Tm(异)是通过从Tm(同)减去所讨论的相似序列和上述核苷酸探针之 间的同源性％差异而得到的。
突变的核酸分子
本发明的第十二方面提供核酸分子，其包含本发明第十一方面的 核酸分子的突变形式，该核酸分子被突变以至于本发明第九方面的核 酸分子编码的蛋白异常表达。
关于本发明的这方面，可参照标题为“减毒病毒”的上文部分的 相关部分。但是，应强调的是，本发明第十二方面的核酸分子不仅可 以以病毒的形式提供，也可以以其它形式提供，例如核酸分子本身， 载体等，并且标题为“减毒病毒”部分的相关部分经必要的改变相应 地以除病毒以外的形式提供本发明的第十二方面。
关于“本发明第九方面核酸分子编码的蛋白的异常表达”，应理 解的是，这包括：(i)从突变的核酸分子表达的蛋白减少或不表达(相 对于本发明第十一方面的核酸分子)的情况；(ii)由突变的核酸分子表 达的蛋白具有减弱的凋亡功能或无凋亡功能(相对于本发明第十一方 面的核酸分子编码的蛋白)。
在一个实施方案中，ORF3可以包含导致ORF3蛋白表达减少或 不表达的突变(例如，由于ORF3起始密码子中的点突变)，或者存在 导致得到的ORF3蛋白具有减弱的功能或无功能的突变，即所编码的 蛋白诱导凋亡的能力减弱(并且在一个实施方案中不能诱导凋亡)。
在本发明第十二方面的一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO.3： GTGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表在起始密码 子中具有点突变的ORF3突变序列，以至于不表达ORF3蛋白。
在本发明第十二方面的另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO.19： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTtgaTTTACCACAA CCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACG CTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCG GAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCA CCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGG TCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAGT AA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表在氨基酸序 列第27位具有插入了终止密码子的点突变的ORF3突变序列，以至于 ORF3蛋白以截短的形式表达。
在本发明第十二方面的另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO.21： ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGT GGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACA ACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCAC GCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGC GaAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTC ACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAG GTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAG TAA或由其组成的核酸序列，或其简并形式。该序列代表具有使氨基 酸Glu-被改变为Lys+的点突变的ORF3突变序列，以至于ORF3蛋白 的二级结构的构象受到影响。
由本发明突变的核酸分子编码的蛋白
由上文可知，在一些情况下，本发明第十二方面的核酸分子不编 码蛋白。但是，当本发明第十二方面的核酸分子编码蛋白时，这些蛋 白作为本发明的其它方面被提供。这些蛋白可能以比野生型核酸序列 (SEQ ID NO.2)编码的蛋白低的水平表达，或者为相对于野生型蛋白 (SEQ ID NO.1)具有减弱的功能或无功能(就诱导凋亡的能力而言)的蛋 白。
提供多种形式的核酸分子
本发明的核酸分子可以以多种形式提供。它们可以以核酸分子本 身(“裸”核酸分子)、载体、病毒或宿主细胞等的形式被提供。
载体包括含有本发明核酸分子的表达载体。本发明的载体例如可 以包含转录启动子以及转录终止子，其中启动子与该核酸分子可操作 地连接以及该核酸分子与终止子可操作地连接。
在一个实施方案中，提供用本发明第十一或十二方面的核酸分子 转化的宿主细胞。宿主细胞的合适例子对本领域技术人员来说是已知 的，并且可由本领域技术人员容易地选择。宿主细胞例如可以包括真 核细胞和原核细胞。真核细胞的实例包括哺乳动物(例如猪)、真菌(例 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫和植物细胞。原核细胞 例如包括大肠杆菌(E.coli)。
本发明的核酸分子(包括可以包含它们的各种部分，如载体、病毒、 宿主细胞)可以用于产生本发明的蛋白。因此，例如，本发明提供产生 本发明蛋白的方法，该方法包括在适于表达本发明的蛋白的条件下培 养本发明的宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明的蛋白可以通过蛋白的化学合成来产 生。化学合成例如可以通过固相肽合成来实现。这些技术在现有技术 中是已知的，并且可由技术人员容易地进行。
在产生了本发明的蛋白之后可以纯化蛋白。纯化蛋白的方法在现 有技术中是已知的，可由技术人员容易地进行。
抗体和产生抗体的方法
本发明的第十五方面提供能够结合本发明第十或十三方面的蛋白 的抗体。
本发明的第十六方面提供产生能够结合本发明第十或十三方面的 蛋白的抗体的方法。该方法可以包括用本发明第十或第十三方面的蛋 白免疫动物(例如兔、豚鼠、啮齿动物等)并收集由此产生的抗体。
在本发明第十五和十六方面的一个实施方案中，所述抗体能够结 合包含在SEQ ID NO.1所列序列中的氨基酸序列。
本发明的抗体可以为多克隆或单克隆抗体制剂、单特异性抗血清、 人抗体，或者可以为杂种或嵌合抗体，例如人源化抗体、改变的抗体 (Fab′)2片段、F(ab)片段、Fv片段、单结构域抗体、二体或三体抗体 片段或构建体、小抗体(minibody)、或其结合所讨论抗原的功能片段。
可以采用本领域技术人员公知的技术产生抗体，例如公开在美国 专利4,011,308、4,722,890、4,016,043、3,876,504、3,770,380和4,372,745 中的。还参见Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册)， Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988)。例 如通过以目的抗原免疫适合的动物如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊来 产生多克隆抗体。为了增强免疫原性，抗原可以在免疫之前被连接至 载体。这些载体为本领域普通技术人员所熟知。通常是通过将抗原混 合或乳化在盐水中，优选在诸如弗氏完全佐剂的佐剂中，并且胃肠外 (通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂来进行该免疫过程。通常在 2-6周后通过一次或多次注射抗原的盐水溶液，优选采用弗氏不完全佐 剂，来加强。也可以采用现有技术中已知的方法通过体外免疫产生抗 体。然后从经免疫的动物获得多克隆抗血清。
通常采用Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497的方法或其 修饰形式来制备多克隆抗体。通常，以上述方式免疫小鼠或大鼠。也 可以使用兔。但是，不是从动物取血来提取血清，而是取出脾(以及任 选的几个大淋巴结)并解离成单个细胞。如果需要，也可以通过将细胞 悬浮液应用到所述抗原包被的板或孔来筛选脾细胞(在除去非特异性 粘附细胞之后)。表达特异于该抗原的膜结合免疫球蛋白的B细胞将结 合至板，不会与剩余的悬浮液一起被洗涤出。然后诱导得到的B细胞 或者所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来形成杂交瘤，并在选择培 养基(例如，次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷培养基，″HAT″)中培养。得到 的杂交瘤通过有限稀释接种，并测定特异结合免疫抗原(并且不结合无 关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或空心纤维反 应器中)或在体内(例如作为小鼠腹水)培养所选的分泌单克隆抗体的杂 交瘤。
人源化和嵌合抗体也可以用在本发明中。杂种(嵌合)抗体分子在 Winter et al.(1991)Nature 349：293-299和美国专利4,816,567中有一般 性讨论。人源化抗体分子在Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-327； Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534-1536；以及1994年9月21日 公开的英国专利公开GB2,276,169中有一般性讨论。
如果抗体能够特异地与分子反应并由此结合该分子，则该抗体被 称为“能够结合”该分子。
在一个实施方案中，抗体或其片段具有高于约105M-1、更优选高 于约106M-1、更优选高于约107M-1且最优选高于约108M-1或109M-1 的亲和力或亲合性。抗体的结合亲和力可由本领域普通技术人员容易 地确定，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660 (1949))。
提供分离形式的本发明部分
本发明的蛋白、核酸分子和抗体可以是“分离的”。用在本文时， 术语分离的指从其天然状态“人工”改变；即如果其天然产生，则其 已被改变或者其已被从其天然宿主或环境中取出。相关的杂质可以被 减少或者去除。
本发明的多个部分例如可以以药物组合物的形式提供，例如作为 疫苗制剂。因此，在本发明的一个方面，提供包含本发明的核酸分子、 蛋白、抗体、拮抗剂、激动剂、病毒、载体或宿主细胞的药物组合物。
关于药物组合物和疫苗，读者可参考以上说明的相关部分。
筛选激动剂或拮抗剂
本发明提供筛选本发明蛋白的激动剂或拮抗剂的方法。这些激动 剂和拮抗剂可以具有多种用途。例如，ORF3蛋白的拮抗剂可以用在 PMWS的治疗中，因为这些拮抗剂将减弱ORF3蛋白诱导凋亡的能力， 因此PCV2的病原性和症状会被减弱。
本发明的蛋白可被用在多种药物筛选技术的任一种中用于筛选化 合物库。这些化合物可以调节(激动或拮抗)本发明蛋白(例如本发明第 十或第十三方面的蛋白)的活性。
在一个实施方案中，所述方法包括使测试化合物与本发明的蛋白 接触，并确定测试化合物是否结合本发明的蛋白。该方法还可以包括 确定测试化合物是否增强或减弱本发明蛋白的活性(即其诱导凋亡的 能力)。
确定测试化合物是否增强或减弱本发明蛋白的活性的方法对于本 领域技术人员来说是已知的，并且例如包括停泊实验/软件或X射线晶 体学。
用在本发明筛选方法中的本发明蛋白可以游离在溶液中、附着到 固体支持物、负载在细胞表面或定位在细胞内。
测试化合物(即可能的激动剂或拮抗剂)可以为多种形式，包括天 然或修饰的底物、酶、受体、小有机分子如高至2000Da、优选800Da 或更小的小天然或合成有机分子、肽模拟物、无机分子、肽、蛋白、 抗体、前述物质的结构或功能模拟物。
其它的鉴别ORF3蛋白的拮抗剂或激动剂的方法可以包括在细胞 中表达能够诱导凋亡的本发明第十方面的蛋白，使细胞暴露于测试化 合物并确定测试化合物是否影响该蛋白诱导凋亡的能力，由此确定测 试化合物是否表现出拮抗或激动活性。
测试化合物可以从例如细胞、无细胞制剂、化学物质库或天然产 物混合物分离。这些激动剂或拮抗剂可以为天然或修饰的底物、配体、 酶、受体或结构或功能模拟物。作为对这些筛选技术的适合的综述， 参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(免 疫学的当前方法1(2)：第五章)(1991)。
最可能作为良好拮抗剂或激动剂的化合物为结合本发明蛋白的分 子(为拮抗剂时，与其结合时不诱导该蛋白的生物作用)。
拮抗剂或者也可以通过竞争结合本发明蛋白的受体来起作用。
激动剂或者也可以通过结合本发明蛋白的受体并增强该受体和本 发明蛋白结合的亲和力来起作用。
潜在拮抗剂包括结合本发明蛋白并因此抑制或消除其活性的小有 机分子、肽、蛋白和抗体。以此方式，蛋白与正常细胞结合分子的结 合可以被抑制，以至于蛋白的天然生物活性被阻止。
在上述的某些实施方案中，可以采用样品结合测定，其中测试化 合物与带有所述蛋白的表面的粘附通过直接或间接与测试化合物结合 的标签检测或在包括用标记的竞争剂竞争的测定法中检测。
可以使用的其它药物筛选技术提供了对与所述蛋白具有适合结合 亲和力的化合物的高通量筛选(参见W084/03564)。这种方法中，在固 体基层上合成大量不同的小测试化合物，然后将它们与所述蛋白反应 并洗涤。一种固定蛋白的方式是使用非中和抗体。随后采用现有技术 中已知的方法来检测结合的蛋白。纯化的蛋白也可以直接包被在板上， 用于上述的药物筛选技术。
电子(In silico)方法也可以用于鉴别激动剂和拮抗剂。然后，如果 需要，可以通过实验确认激动剂和拮抗剂部分的活性。
本发明的其它方面提供通过本发明筛选方法鉴定的激动剂或拮抗 剂。
尽管本发明已就本发明的特定方面在某些位置进行了描述，但是 技术人员应意识到这些说明也可以同等地应用到本发明的其它方面， 并且该说明应被相应地解释。
根据本发明，可以在现有技术内采用常规的分子生物学、微生物 学、免疫学和重组DNA技术。
这些技术在文献中有充分的说明。例如Sambrook et al，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)＂(3rd edition， 2001)；＂Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)＂ Volumes I-III[Ausubel，R.M.，ed.(1999，并每两月更新一次)]；＂Cell Biology：A Laboratory Handbook(细胞生物学：实验室手册)＂Volumes I-III[J.E.Celis，ed.(1994)]；＂Current Protocols in Immunology(免疫学 的当前方法)＂Volumes I-IV[Coligan，J.E.，ed.(1999，并每两月更新一 次)]；＂Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)＂(M.J.Gait ed.1984)； ＂Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)＂[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；＂Transcription And Translation(转录和翻译)＂[B.D. Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；＂Culture of Animal Cells，4th edition (动物细胞的培养，第四版)＂[R.I.Freshney，ed.(2000)]；＂Immobilized Cells And Enzymes(固定的细胞和酶)＂[IRL Press，(1986)]；B.Perbal， ＂A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆的实践指南)＂ (1988)；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol No.I (使用抗体：实验室手册，便携方法，第一册)，Harlow，Ed and Lane， David(Cold Spring Harbor Press，1998)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Harlow，Ed and Lane，David(Cold Spring Harbor Press，1999)。
实施例
提供以下实施例以解释本发明的实施方案，不应被视为对本发明 范围的限制。
本发明人在PCV2在PK15细胞中的产毒性感染中发现了新的病 毒基因，ORF3。定点诱变的ORF3缺陷PCV2的感染结果表明该蛋白 不为病毒复制所必需。
单独用ORF3转染细胞诱导了凋亡，采用了类似于病毒感染情况 中描述的途径。这得到了进一步证实，由于不存在ORF3表达时感染 细胞的凋亡活性显著降低，提示该蛋白在诱导病毒诱导的凋亡中有重 要作用，暗示其可以涉及病毒的致病性。。
在用缺乏ORF3基因表达的突变PCV2感染Balb/C小鼠后，与用 野生型PCV2感染的那些相比，在这些小鼠中没有观察到病理学变化， 由此提示突变的PCV2具有作为针对PCV2诱导的PMWS的减毒活疫 苗的潜力。
在本发明中，我们采用抗ORF3的特异抗体来显示其确实在PCV2 感染的细胞中被表达并且不为培养细胞中PCV2的复制所必需。此外， 已显示ORF3蛋白在PCV2诱导的凋亡中起重要作用，采用了类似于 在病毒感染情况中描述的途径。这通过无ORF3表达的感染细胞中凋 亡活性的显著降低来进一步证实。
在本发明中，将突变体PCV2接种物给予成组的8周龄小鼠，采 用健康小鼠作为阴性对照以及PCV2感染小鼠作为阳性对照。将105 TCID50(50％组织培养感染剂量)的单剂量注射进每只实验小鼠。该实 验设置在一方面显示出显微损伤程度和有害身体影响的显著减少，在 另一方面显示出具有与阳性对照一样丰富的针对PCV2抗原的细胞质 标记。
材料与方法
病毒和细胞
在37℃下在加湿的5％CO2孵育箱中，将无PCV的永久PK15细 胞系维持在补充了5％热灭活胎牛血清，5％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉 素G和100μl/ml链霉素的基本必需培养基(MEM，Gibco)中。用于瞬 时表达测定的Cos-7细胞维持在补充了10％ FBS的Dulbecco改良的 Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。用在本项研究中的PCV2病毒株BJW 起初是从中国北方的患有天然发生的PMWS的猪肾组织样品分离的。 该肾组织经处理并接种至PK15细胞，其基因组序列已存在GenBank 中(登记号：AY847748)。
产生抗ORF3抗体
如图1A中所示，在PCV2株BJW的遗传图中指明了ORF1和 ORF2以及ORF3基因。编码ORF3全长的DNA被克隆到PQE30中并 转化至大肠杆菌BL21细胞中。用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 诱导这些细胞表达ORF3，并让它们在37℃生长4h。纯化His标签 融合蛋白并将该制剂注射进小鼠以产生多克隆抗体。在四次注射之后， 对小鼠取血，测试血清对ORF3的反应性。抗体显示出对用PCV2病 毒感染或用ORF3表达构建体转染的PK15细胞中表达的ORF3的特 异反应性。
构建PCV2突变体和质粒
根据PCV2分离株BJW的序列设计了一对PCR引物：正向引物 F-PCVPST(5′-TGCACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTAC-3′)和反向引 物R-PCVPST(5′-TGCACTGCAGTATTCTTTATTCTGCTG-3′)。这对引 物扩增完整的PCV2基因组，交叠区域含有单个PstI限制酶位点(Fig. 1A & C)。简言之，采用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)从患有天然产 生的PMWS的猪的肾组织样品提取DNA。通过PCR(Perkin-Elmer) 扩增提取的DNA，条件如下：起始酶活化步骤94℃ 5分钟，然后是 35个循环的94℃变性1分钟，48℃退火1分钟，72℃延伸2分钟， 以及最后延伸的72℃ 10分钟。通过凝胶电泳分离期望大小的PCR产 物并采用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
为了构建含有PCV2基因组的分子DNA克隆，将PCR产物克隆 至pBlueScript SK(pSK)载体中。采用M13正向和反向通用引物以及 PCV2基因组特异引物和ABI Prism Dye终止子循环测序试剂盒 (terminator cycle sequencing kit)(PE Biosystems)对克隆的两条链进行 测序。
采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)将特 定的突变引入克隆的PCV2基因组中。按照生产商的说明，采用成套 的诱变引物(正向引物：5′- GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3′，反向引物： TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3′)来产生突变体 质粒。突变(nt 671)以斜体粗体字母表示(图1B)，且不能在该位点改变 ORF1蛋白的氨基酸序列。在从pSK质粒切下PCV2基因组并通过连 接成环之后，将连接的DNA混合物转染至大约60-80％融合的PK 15 细胞。
为了制备重组真核表达质粒，从PCV2基因组扩增ORF1，ORF2， 和ORF3基因的编码序列。分别使用以下的引物来扩增这三个基因： GFP-ORF1(5)：5′-CCGCTCGAGCTATGCCCAGCAAGAAGAATGG-3′ 和GFP-ORF1(3)：5′-CGGGGTACCTCAGTAATTTATTTCATATG-3′， GFP-ORF2(5)：5′-CCCAAGCTTCGATGACGTACCCAAGGAGGCG-3′ 和GFP-ORF2(3)：5′-CGGGGTACCTTATGGTTTAAGTGGGGGGTC-3′， GFP-ORF3(5)：5′- CCCAAGCTTCGATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′和 GFP-ORF3(3)：5′-CGGGGTACCTTACTTATCGAGTGTGGAGCTC-3′。 将XhoI/KpnI片段ORF1和HindIII/KpnI片段ORF2和ORF3定向克隆 至真核表达载体pEGFP-C1(Clontech)的对应位点，置于人巨细胞病毒 (HCMV)启动子下游，分别获得GFP-ORF1，GFP-ORF2和GFP-ORF3。 对它们进行测序以确认PCR扩增中没有引入错误。
转染和感染
对于基因组转染，从对应的克隆基因组得到分别用于产生重组 PCV2(rPCV2)或突变PCV2(rPCV2ORF3Δ)的PstI消化的PCV2或 ORF3缺陷PCV2，凝胶纯化并且转染前在T4DNA连接酶(BioLab)存 在下在16℃环化过夜。在转染后24h还用300mM D-葡萄糖胺对细 胞进行处理，如以前所述(49)。为了进行感染测试，使基因组转染的 细胞接受三个连续的冻融循环。收集总裂解液，用于感染无PCV的 PK 15细胞。随后，感染后按上文的描述使它们接受葡萄糖胺处理并 通过IFA进行分析。
在采用PK 15细胞的瞬时表达实验中测试GFP-ORF1，-ORF2和 -ORF3构建体的体外表达。采用LipofectaminePlus(GIBCO/BRL， USA)，按生产商的方案，用仅有GFP的载体、GFP-ORF1、GFP-ORF2、 或GFP-ORF3转染(每瓶2μg质粒)培养在25x25mm培养瓶中的细胞。 转染24小时后，采用小鼠抗ORF1、ORF2(Liu和Kwang，私人数据) 或ORF3多克隆抗体通过免疫印迹分析证实ORF1、ORF2和ORF3的 表达。
RT-PCR
通过使用Trizol RNA Extract试剂(Invitrogen)从病毒感染的PK15 细胞制备总细胞RNA用于ORF3基因的逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。将RNA样品与DNase I在37℃孵育60分钟以除去任何 污染的病毒DNA。有义引物和反义引物分别为R671：5′- ATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′和F357：5′- TTACTGATAGAATGTGGAGC-3′。寡核苷酸的前缀(F或R)表明了引 物的方向。F表明从nt 0至1767的向前方向，而R表明从nt 1767至 0的相反方向。通过使用AMV Reverse Transcriptase试剂盒(Roche)和 Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche)来进行RT-PCR，并将PCR产 物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳并照相。
原位杂交(ISH)
如下文所述进行原位杂交。简言之，将在室式载玻片(chamber slide) (IWAKI)中生长至80％融合的PK 15细胞用野生型PCV2或突变PCV2 以1 TCID50(50％组织培养感染剂量)的MOI感染。在感染后24，48，72， 和96h用PBS洗涤载玻片，在室温(RT)下在含4％多聚甲醛溶液的PBS 中固定30分钟，干燥。在0.1M三乙醇胺、0.2N HCl和0.5％醋酸酐 中乙酰化后，将载玻片在杂交溶液中(50％甲酰胺；5xSSC；50μg鲑精 DNA/ml)在60℃预杂交2小时，然后用1μg/ml浓度的地高辛(DIG) 标记的RNA探针在60℃杂交过夜。洗涤后，将载玻片与抗荧光AP (Roche)(150μl，在缓冲液[10％胎牛血清；100mM Tris-HCl；150mM NaCl，pH 7.5]中1:5,000稀释的)一起在4℃孵育过夜。洗涤载玻片， 与NBT-BCIP混合物一起孵育并封片用于显微镜检。
通过使用T7 RNA聚合酶的体外转录从含有ORF3 cDNA的被 KpnI线性化的pSK质粒合成有义RNA探针。对于反义RNA探针， 采用引物对(正向引物： 5′-ATGGTAACCATCCCACCATTGTTTCTAGGTGGTTTCCAG-3′，反 向引物： 5′-TAATACGACTCACTATAGGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGG-3′， T7启动子加有下划线)扩增ORF3片段，并用T7 RNA聚合酶转录。两 RNA探针都采用NTP-DIG标记混合物(Roche)进行标记。
PCV2复制的测定
为了分析PCV2的生长特征，以野生型、重组或突变的PCV2病 毒储备(在PK 15细胞中传代3次后产生的)以1 TCID50的MOI感染融 合的PK 15细胞。通过三个循环的冻融以及随后的澄清，在不同的时 间段从细胞收集感染的细胞培养物。通过IFA在PK 15细胞上确定存 在于细胞培养物中的感染病毒的滴度，如先前所述(14)。
凋亡测定
将生长在室式载玻片上的PK 15细胞在感染后的24，48，72和96 小时用4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液固定并用猪抗PCV2血清和 FITC-偶联的抗体染色。对于转染，将GFP-ORF1，GFP-ORF2，或 GFP-ORF3质粒转染的PK15或Cos-7细胞在转染后24和48小时时分 别用4％ PFA固定。然后用浓度为1μg/ml的DAPI(2，4-二脒基-2-苯基 吲哚)在37℃孵育载玻片30分钟，并在配有Plan-Novofluar 63x/1.4油 镜的LSM 510 META共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss，Germany)下检查。
收集感染后不同时段的感染的PK15细胞(2-3 x 106)并在4℃下在 1,000xg离心10分钟。在PBS中洗涤沉淀并在2.5％戊二醛中固定。 随后，将细胞在1％ S2O4中后固定并包埋在EPON-812中。切出超薄 切片并在Hitachi H-700电子显微镜下检查。
用野生型PCV2感染生长在75x75mm培养瓶中的PK15细胞。 处理后，合并漂浮的和胰蛋白酶分离的细胞，用冰冷的PBS洗涤两次 并在70％的冷乙醇中固定，然后在PBS中洗涤两次。离心后，细胞沉 淀物在PBS碘化丙啶(50μg/ml)中染色，并用RNA酶A(100μg/ml)处 理45分钟。通过荧光活化细胞分选(FACSort，Becton Dickinson)分析 PK15细胞的DNA含量。至少分析10,000个事件，并计算亚G1(sub-G1) 群细胞的百分比。从亚G1细胞的分析中排除直方图起始处的细胞碎片 聚集物。在每个实验中，假感染的PK15细胞被用作对照并与PCV2 感染的细胞比较。
分别收集来自用野生型PCV2感染的细胞或用GFP-ORF1， GFP-ORF2，或GFP-ORF3质粒转染的细胞的贴壁和非贴壁细胞，以 200xg沉淀10分钟，用冰冷的PBS洗涤，在4％ PFA中固定，用1μg/ml DAPI染色，并用荧光显微镜检查。对每样品最少300个细胞评估凋亡 变化(细胞核片段化为多个不连续的片段)。
间接荧光测定(IFA)
对于感染，将生长在室式载玻片(IWAKI)上的PK15细胞用野生 型、重组或突变PCV2以1 TCID50的MOI在37℃孵育60分钟，并加 入MEM来孵育。在37℃孵育后，用PBS洗涤感染后24，48，72和96 小时时的细胞并在室温下用4％ PFA的PBS溶液固定30分钟。固定 后，用含有3％BSA的PBS-T室温封闭细胞1小时。将初级抗体，小 鼠抗ORF3多克隆抗体或猪抗PCV2抗体稀释在含有1％ BSA的PBS-T 中，并与细胞一起在37℃孵育1小时。在用PBS洗涤后，将细胞用 稀释在含有1％ BSA的PBS-T中的兔抗小鼠或抗猪的FITC-偶联抗体 (Sigma)在37℃下孵育1小时。用PBS将细胞洗涤三次，用dH2O冲 洗，干燥并用荧光封固介质封片，采用荧光显微镜检查。
Western印迹分析
将来自野生型PCV2感染的PK15细胞的总细胞裂解物用15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，用半干电转仪(Bio-Rad Trans-Blot SD)转印至硝酸纤维素(NC)膜(Stratagene)。将膜在室温下在 含有5％脱脂乳粉的封闭缓冲TBST(20mM Tris-HCl[pH 7.4]，150mM NaCl，0.1％ Tween-20)中封闭2小时以防止非特异性结合，然后与小鼠 抗ORF3抗体在室温下孵育2小时。接着，将膜用TBST洗涤三次， 在室温下与稀释在封闭缓冲液(1:2,000)中的辣根过氧化物酶偶联的抗 小鼠二级抗体(DAKO)孵育1小时。洗涤后，使膜与3，3′-二氨基联苯胺 四盐酸盐(Pierce，Rockford，Il1.，USA)底物(20ml 0.1M pH 7.4 Tris-HCl， 20mg DAB，和6.8μl H2O2)反应，然后用蒸馏水终止反应。
免疫和活疫苗剂量
在本项研究中，将TCID50减毒突变PCV2细胞通过鼻内和腹膜 间途径给予每组的实验Balb/c小白鼠。
病理学和免疫组织化学研究
对所有动物进行所选器官的尸检。收集肺、肝和淋巴结样品并通 过浸入4％ DEPC处理的磷酸缓冲多聚甲醛进行固定。使固定的样品 脱水、包埋在固体石蜡中，以6μm切片，然后用苏木精和伊红(HE) 染色。对所有样品评估身体恶化或显微损伤的任何迹象。对淋巴器官 还评估淋巴细胞的减少、组织细胞渗透和/或多核细胞的存在。
将抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术用于免疫组织化学研 究。将以5μm切片的组织置于硅烷包被的载玻片上。通过以3％ H2O2 的含有1％ Triton的磷酸缓冲盐水溶液冲洗载玻片10分钟来抑制内源 的过氧化物酶活性。采用5％正常小鼠血清在室温下进行封闭1小时。 然后将切片在室温下与纯化的、在猪中产生的、1:00稀释在 PBS-Triton中的PCV2初级抗体孵育过夜。生物素化的抗猪抗体和过 氧化物酶偶联的抗生物素蛋白以1:200的稀释度在室温下被应用于该 载玻片1小时。然后将切片在二氨基联苯胺(DAB)-过氧化氢溶液中孵 育5分钟，并用1％甲基绿复染、脱水、用Permount(Fisher Scientific Inc.) 封片，显微镜检。
实施例1：在PCV2感染细胞中鉴定新的病毒蛋白ORF3
通过逆转录(RT)-PCR分析感染的和假感染的PK15细胞的全细胞 核酸。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(图1D)。在标明的时间采用 分离自PCV2感染细胞的RNA扩增了315-bp的片段，ORF3基因，提 示ORF3基因能够在PCV2感染细胞中以该转录水平表达。进一步分 析PCV2感染的PK15细胞以确定ORF3 mRNA的相对分布。如图1E (小图a-d)中所显示的，采用反义RNA探针在标明的时间在PCV2感 染的细胞中检测到ORF3 mRNA的信号，并观察到ORF3 mRNA主要 位于感染细胞的细胞核中。有趣的是，采用有义ORF3 RNA探针在感 染细胞中也检测到mRNA信号(图1E，小图e)。这可以解释为，全长 ORF3基因在PCV2整个基因组中反方向完全重叠ORF1基因(图1C)， 由此检测到ORF1 mRNA信号。此外，在没有PCV2感染的对照细胞 中没有检测到信号(图1E，小图f)。这些结果进一步证实在PCV2感染 细胞中可检测到ORF3 mRNA，并且其位于细胞核中。
将ORF3基因克隆到大肠杆菌载体PQE30中并表达(数据未显示)。 通过采用抗组氨酸单克隆抗体的Western印迹进一步证实了这种重组 蛋白(数据未显示)，并且可制备该重组蛋白用于产生针对蛋白ORF3 的单特异性抗体，用于以下的实验。
为了确定ORF3蛋白是否在PCV2感染的PK15细胞中表达，如 材料和方法部分所述用PCV2(BJW株)感染细胞。在直接免疫荧光实 验中使用抗ORF3小鼠多克隆抗体确定ORF3在PCV2感染的PK15 细胞中的表达和定位。在感染后24，48，72，和96小时时(图2A，小图 b-d，数据未显示)在PCV2感染的细胞中可检测到成簇的表达ORF3 的细胞。ORF3蛋白主要位于细胞核中，在感染细胞的细胞质中较少。 如图2A(小图c)所示，在感染后48小时ORF3蛋白在感染细胞中的表 达最高。在假感染细胞中没有观察到显著染色(图2A，小图a)，表明 了小鼠抗体抗ORF3的特异性。还在感染后的标明时间从PK15细胞 收集总蛋白，并进行Western印迹分析(图2B)。采用小鼠抗ORF3抗 体，在感染后24小时时在PCV2感染细胞中检测到蛋白，其为弱但清 晰可辨的信号。之后条带强度显著增强，但在感染后72小时降低。在 假感染的细胞中没有检测到信号(图2B)。合并考虑，这些结果显示由 于ORF3在PCV2感染的细胞中在转录和翻译水平表达，ORF3被认为 是新的病毒蛋白。
在PCV基因组内已鉴定了两个主要的开放阅读框。cap基因ORF2 编码病毒衣壳，主要的结构蛋白。另一基因，rep基因(ORF1)指导合 成两种Rep同工型，Rep和Rep′，它们对于病毒复制是必需的(9，25)。 此外，在猪肾细胞的产毒性感染中检测到PCV2的六个其它的RNA(三 个Rep相关RNA：Rep3a，Rep3b和Rep3c，和三个NS相关RNA： NS515，NS672和NS0)(9，10)，提示这些转录单元对病毒蛋白合成或 DNA复制没有任何影响。NS515，NS672和NS0被认为从ORF1内Rep 启动子下游的三个不同的启动子转录(9)，并且可能不编码任何蛋白或 功能蛋白。在鉴定的9个PCV2特异的RNA中，只有ORF2 RNA从 互补DNA链转录并编码病毒衣壳蛋白ORF2。在本项研究中，我们在 PCV2感染的PK15细胞中检测到从基因组互补DNA链转录的新病毒 RNA，并进一步证实其编码新的病毒蛋白(本文称为ORF3)，其涉及培 养细胞中PCV2诱导的凋亡。
这种新的转录本ORF3 RNA可容易地通过RT-PCR在PCV2感染 的细胞中检测到(图1D)，并通过ISH测定进一步在感染细胞的细胞核 中检测到(图1E)。此外，采用针对ORF3抗原的特异性抗体，我们通 过免疫荧光证实该蛋白在PCV2感染的PK15细胞中表达(图2A)，并 且主要位于感染细胞的细胞核中，在细胞质中较少(图2A)。感染细胞 中的蛋白表达也可通过Western印迹分析检测到(图2B)。对超过20个 不同地理位置的PCV2分离群(得自GenBank数据库)的序列分析提示， ORF3蛋白在所研究的PCV2株中是高度保守的，在氨基酸水平上有 高于94.5％的一致性(数据未显示)。但是，PCV1株的对应区域显示出 不同，仅有61.5％的氨基酸序列一致性。由于PCV1病毒是天然不致 病的且不在猪中引起任何病理学损伤(3，48)，这些残基可能在病毒的 致病性中起了作用。
实施例2：ORF3不为病毒复制所必需
如所述，通过将起始密码子ATG突变为GTG的点突变来删除 ORF3基因，以产生缺乏ORF3基因的PCV2突变体(图1B)。为了研 究ORF3蛋白在病毒复制中的功能，用野生型PCV2或突变体PCV2 感染性克隆DNA转染PK15细胞。尽管如预期的，野生型PCV2 DNA 产生重组PCV2(rPCV2)，但是用突变体PCV2 DNA转染的PK15细胞 也产生可存活的突变体病毒(rPCV2ORF3Δ)。突变体病毒在PK15细胞 中传代三次以增加病毒滴度。之后，通过RT-PCR分析感染和假感染 细胞的全细胞核酸。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应产物(数据未显示)。 通过采用从突变体PCV2感染细胞分离的RNA扩增了315-bp片段， 如同在野生型PCV2感染细胞中看到的，这表明在ORF3基因的起始 密码子中产生的点突变不影响其转录，并进一步提示ORF3转录的起 始位点可能位于上游。采用假感染PK15细胞没有得到PCR产物。 RT-PCR产物的序列分析证实在产生的PCV2突变体中存在所期望的 变化(数据未显示)。此外，采用反义ORF3 RNA探针在突变体PCV2 感染细胞的细胞核中检测到ORF3基因的mRNA信号(数据未显示)。
为了检测ORF3蛋白的表达，用回收的病毒感染PK15细胞并采 用ORF3特异抗血清通过IFA进行分析。图3显示了重组或突变体 PCV2感染细胞的免疫荧光染色结果。用rPCV2病毒感染的细胞表达 ORF3蛋白，并给出阳性免疫荧光信号(图3A)。但是，用突变体 rPCV2ORF3Δ病毒感染的细胞没有给出任何荧光信号(图3D)，表明缺 乏ORF3蛋白表达，甚至在传代12次之后也是如此(数据未显示)。相 反，抗PCV2猪血清可容易地在重组以及突变体PCV2感染细胞的细 胞核中检测到病毒抗原(图3B和3E)。在假感染的细胞中采用抗ORF3 小鼠血清(图3C)或抗PCV2猪血清(图3F)均未检测到荧光。
为了确定野生型、重组和ORF3缺陷PCV2的复制动力学，用每 种病毒感染PK15细胞并在感染后5天通过IFA测定法来确定病毒滴 度。图4A显示了每种病毒在感染后不同时间的生长曲线(表示为 TCID50/毫升)。感染后不同时间的TCID50显示突变体病毒(缺乏ORF3 蛋白表达)的复制比母体病毒PCV2或回收的重组PCV2(rPCV2)病毒 慢些。在感染后36小时时，ORF3缺陷PCV2病毒显示的滴度比母体 病毒PCV2或回收的rPCV2病毒分别约低33或31倍。但是在感染后 72小时，ORF3缺陷PCV2病毒达到105.5TCID50/ml的滴度，类似于 母体病毒PCV2的滴度(105.8TCID50/ml)和回收的rPCV2病毒的滴度 (105.6TCID50/ml)。这些结果表明ORF3蛋白不是在细胞培养物中复制 所必需的。
在不存在ORF3时，PCV2的体外复制被延迟(图4)。但是，最大 滴度与野生型病毒复制后发现的一样高。可以想象复制的延迟转变为 体内的减毒，导致病毒株具有疫苗潜能。对于PCV2，ORF2蛋白已被 认为是主要的免疫原性衣壳蛋白(9，30，31)，并且能够刺激对接种有杆 状病毒表达的重组ORF2(5)或者注射有来自ORF2的DNA疫苗(5，19) 的猪的保护性应答。具有克隆至非致病性PCV1基因组骨架内的PCV2 ORF2基因的嵌合PCV1-2病毒也可以诱导针对PCV2的强免疫反应， 同时其是中等致病性的(5)，说明PCV2的ORF2蛋白为良好的宿主保 护免疫原。进一步显示ORF2蛋白的免疫显性表位可能位于氨基酸残 基47至84，165至200以及该蛋白的最后4个氨基酸内(22)。这些表 明ORF3蛋白诱导的抗体可能不包括在对宿主的保护性免疫反应内。 还有，缺乏ORF3蛋白的PCV2突变体可以导致其不能在动物体内诱 导对应的抗体，且可以预期其如野生型PCV2一样引起适当的免疫反 应。
实施例3：PCV2感染诱导培养细胞的凋亡
在感染后期阶段PCV2在PK15中的复制导致细胞病变效应 (CPE)，例如变圆、感染的细胞脱离培养瓶、细胞溶解和死亡。还未完 全了解导致PCV2感染的细胞死亡的机制。为了确定PCV2感染是否 在培养的细胞中诱导凋亡，我们用野生型PCV2以1 TCID50的MOI 接种PK15细胞并在感染后标明的不同时间通过IFA分析它们的PCV2 病毒抗原表达和通过DAPI染色分析凋亡。完好的细胞核被均匀染色， 但是凋亡的细胞核通常片断化并显示不规则或弱的DNA染色，这是 由于DNA的浓缩和片断化(45)。图5A显示在感染后48小时(上图)和 72小时(下图)时PCV2感染细胞中可见染色质浓缩和片断化。相反， 感染后在假感染细胞中没有观察到明显的细胞核形态学变化(数据未 显示)。
对感染和假感染PK15细胞分析它们的超微结构。在感染后48小 时，用PCV2感染的细胞显示细胞程序性死亡的典型特征，例如染色 质密度和分布的变化，其向外围浓缩成新月形物质，并观察到核周腔 的膨胀(图5B，小图b)。在感染后72小时时，细胞显示凋亡细胞死亡 的典型标志，例如细胞核分割和细胞质紊乱，它们负责形成凋亡小体 (图5B，小图c)。在96小时时，细胞表现出进一步的核片断化，导致 凋亡小体的广泛分散(数据未显示)。相反，假感染的细胞在超微结构 水平没有表现出可检测的变化(图5B，小图a)。
通过碘化丙啶(PI)染色的、固定的PK15细胞的流式细胞术确定亚 二倍体细胞的比例，以此来评估PCV2诱导的凋亡。凋亡细胞与正常 细胞相比具有较低的DNA含量，它们的存在以较低荧光的亚二倍体 峰的出现来区分。对于假感染的细胞，基于对PI染色细胞的荧光活化 细胞分选分析，～1％的细胞为亚二倍体(图6A)。而在感染后72小时时 亚二倍体细胞显著增加，随后减少(图6A和数据未显示)。还通过使用 DAPI染色的细胞核形态学分析来评估PCV2诱导的凋亡，如在材料和 方法中所述。对染色细胞的检测证实感染后凋亡细胞显示如在流式细 胞分析中所描述的类似的方式(图6B)。如图6C所示，与假接种的培 养物相比，更多的细胞脱离细胞培养瓶，进入接种培养物的底层。
病毒诱导的细胞死亡在病毒感染的发病机理方面起重要作用。凋 亡可能是子代散播至相邻细胞且同时逃避宿主免疫系统的重要步骤 (46)，并通过去除由于DNA损伤而产生的异常细胞或被病毒病原体感 染的那些细胞而起作用(39)。很多病毒已被证实在它们的复制循环中 直接或间接引起或抑制凋亡(39)。在圆环病毒科，鸡贫血病毒(CAV) 诱导感染后胸腺细胞和细胞系的凋亡(18)，VP3蛋白为CAV编码的凋 亡素(apoptin)，其在多种培养的转化细胞系中引发凋亡(34)。对于 PCV2，已显示其在受影响猪中诱导B细胞凋亡，然后是选择性的B 细胞清除(43)，并且PCV2也在PCV2感染的小鼠模型中引发淋巴组织 中组织细胞凋亡(21)。但是，最近也报道了相反的结果，与正常对照 相比，在天然受影响的猪中淋巴细胞凋亡未被显著诱导且caspase-3活 性未受到显著刺激(24，37)，提示淋巴组织减少主要涉及淋巴组织的增 殖活性降低。但是，这里我们通过DAPI染色、电子显微镜观察和流 式细胞分析已证实PCV2能够诱导培养的PK15细胞凋亡。DAPI染色 显示由于DNA的浓缩和片断化引起的不规则或弱的DNA染色(图 5A)，这与电子显微镜观察下的形态学变化一致，包括广泛的染色质浓 缩和出现凋亡小体(图5B)。在PCV2感染后，通过评估DAPI染色和 通过流式细胞术分析亚二倍体细胞(图6A)确认的凋亡细胞(图6B)与假 感染对照相比显著增加。用PCV2感染后，40％的细胞脱离并漂浮进 底层，而在假感染对照中漂浮细胞少于5％(图6C)。通过在培养的细 胞系中表达单个病毒蛋白，我们进一步证实ORF3基因编码的新病毒 蛋白在PCV2感染中促进凋亡的诱导。
实施例4：单独的ORF3蛋白诱导凋亡
在确认PCV2感染在PCV2感染的允许细胞系PK15细胞中诱导 凋亡后，我们接着试图筛选可能负责诱导凋亡的由PCV2编码的蛋白 (病毒编码的凋亡前体蛋白)。将ORF1、ORF2和ORF3基因克隆至哺 乳动物表达载体pEGFP-C1中，置于人巨细胞病毒启动子控制下。用 这些质粒转染PK15和Cos-7细胞，在荧光显微镜下直接检查每种蛋 白的表达并采用小鼠抗ORF1、ORP2或ORF3抗体通过免疫印迹分析 进一步证实(数据未显示)。蛋白ORF1、ORF2或ORF3定位至转染的 细胞核区域，类似于在感染细胞中所看到的(数据未显示)。在用单个 构建体转染细胞之后，在转染后24小时和48小时时用DAPI对细胞 染色。如图7A所示，在转染后24小时时通过细胞核DAPI染色在表 达ORF3的PK15细胞(上图)和Cos-7细胞(下图)中观察到染色质浓缩 和片断化，这些为凋亡的典型特征。相反，在ORF1或ORF2转染的 细胞中没有明显的细胞核形态学变化(数据未显示)。此外，对总的GFP 阳性细胞和GFP阳性细胞中具有片断化或浓缩的细胞核的细胞数量进 行计数，并计算死亡细胞的百分比。如图7B所示，在转染的PK15细 胞中以GFP融合构建体表达的ORF3蛋白在转染后24小时和48小时 时分别诱导10％和25％的死亡细胞。当转染至Cos-7细胞中时，ORF3 蛋白在该时间点也引起12％和28％的细胞死亡(数据未显示)。在该筛 选中ORF1和ORF2蛋白的表达不引起比对照更显著的细胞死亡，不 论是转染的PK15(图7B)还是Cos-7细胞(数据未显示)。相反，当单独 的GFP被转染至PK15和Cos-7细胞中时，在转染后的该时间点其可 诱导小于4％的细胞死亡(图7B，数据未显示)。此外，与GFP单独转 染对照以及ORF1或ORF2转染的细胞相比，ORF3转染的PK15细胞 (图7C)和Cos-7细胞(数据未显示)中有更多的细胞脱离培养瓶并进入 底层。
为了确定rPCV2ORF3Δ在PK15细胞中的凋亡作用，将突变体病 毒以1 TCID50的MOI转染细胞，在不同的时间段收集细胞，分析 caspase-3活性。感染后，突变体病毒诱导的凋亡活性显著低于野生型 PCV2病毒诱导的活性(图9C)。在假感染细胞中没有检测到可评估水 平的凋亡(图9C)。该结果表明，由于缺乏ORF3蛋白表达，PCV2诱 导的细胞死亡被显著减弱。
用PCV2感染猪导致滤泡和滤泡间区域淋巴细胞的减少，以及淋 巴组织的巨噬细胞渗透及其后的免疫抑制(42)。ORF2被认为是PCV2 的主要衣壳蛋白，并且在通过杆状病毒表达系统表达后可形成病毒样 颗粒(31)，暗示PCV2的其它病毒蛋白可能是非结构蛋白，它们不是 病毒组装所必需的。此外，当PCV2被接种至VIDO R1细胞时，ORF2 蛋白显示出在感染的后期阶段以高水平表达(23)。还如我们所证实的， 在PCV2感染的PK15细胞中，在感染后72-96小时时ORF2蛋白表达 达到峰值(数据未显示)。在这项研究中，已证实在感染后48小时时 ORF3在PCV2感染的细胞中在转录和翻译水平都具有更高的表达(图 1和图2)，提示ORF3也可能是PCV2的非结构蛋白。动物病毒的非 结构蛋白可能在病毒复制和/或致病性中起重要作用。对于免疫抑制性 病毒，显示CAV的非结构蛋白VP3引起淋巴母细胞样T细胞的凋亡 并参与致病性(34)；鸡传染性法氏囊病病毒的非结构蛋白VP5对于病 毒复制不是必需的(29)，但是发现通过其凋亡活性参与病毒致病性 (53)。在我们的研究中，我们显示PCV2的ORF3蛋白不是病毒体外复 制所必需的，并且PCV2诱导的凋亡活性由于没有ORF3蛋白表达而 显著减弱。我们的数据还提示单独的ORF3蛋白的表达可在转染细胞 中诱导凋亡，其通过活化起始物caspase-8，接着活化效应物caspase-3 途径，类似于在PCV2感染的细胞中。合并考虑，ORF3蛋白可能通 过其凋亡活性在病毒致病性方面起作用。诱导免疫系统细胞的凋亡可 能是病毒诱导的免疫抑制所需条件之一(12)，这可以促进使用删除 ORF3的突变体作为潜在的针对PCV2感染的活疫苗株。但是，在猪 中使用这种ORF3蛋白缺陷病毒是否能够引起免疫抑制仍需进一步确 认。
实施例5：病理和免疫组织化学研究
在该项实验设计中，用ORF3缺陷PCV2突变体(mPCV2)感染一 组8周龄balb/C小鼠，而另一组用野生型PCV2感染。在这项研究中， 将正常的小鼠用作阴性对照。在感染后7和14天进行小鼠的死后检查。 将淋巴结样品在4％磷酸盐缓冲的多聚甲醛中固定。将组织脱水并用苏 木精和伊红(HE)染色，用于组织病理学检查。然后通过组织免疫化学 技术染色系列切片，用于PCV2蛋白表达。
所有的阴性对照小鼠和突变体PCV2感染的小鼠在感染后第7和 14天没有显示出或显示出轻微的身体恶化迹象，但是在感染后第14 天腹股沟淋巴结轻微膨大。对于野生型PCV2感染的小鼠，在感染后 第7天观察到肝轻度变色和腹股沟淋巴结的轻微膨大。在感染后第14 天，在大多数野生型感染的小鼠中还观察到肝明显变色和非萎陷肺以 及肠系膜和腹股沟淋巴结的显著膨大。在图8A中，对三个实验组的 腹股沟淋巴结的组织病理学检查显示了感染后第7和14天时阴性对照 和mPCV2组生发中心处健康和密集的淋巴细胞。而在感染后第7天， 野生型PCV2显示轻微的淋巴细胞减少迹象，在感染后第14天还在不 同的野生型PCV2感染小鼠中观察到不同程度的淋巴细胞减少和显著 大量的凋亡细胞(箭头)。
在突变体PCV2感染小鼠和野生型感染小鼠中都检测到PCV2抗 原。在所有检查过的组织中，在淋巴细胞和巨噬细胞细胞质中最大量 地观察到对PCV2抗原的免疫标记。但是，在感染后第14天，野生型 PCV2感染小鼠中免疫标记的强度与突变体PCV2感染小鼠相比显著 要低(如图8B所示)。
除了低水平的淋巴细胞减少和高水平的PCV2抗原积累之外，没 有显微损伤和身体恶化显示了突变体PCV2株的保护有效性和复制能 力。这些证据也揭示这种突变体成为用于生产针对PCV2诱导的 PMWS的有效疫苗的合适候选物的潜力。
我们的减毒活疫苗mPCV2能够在实验小鼠中诱导体液和细胞应 答。不仅毒性减弱，还对其病毒复制没有影响，因此提供了对抗PCV2 的持续保护效果，为疫苗商业化的首要候选物。
实施例6：产生凋亡缺陷的PCV2突变体
上文已讨论了在ORF3起始密码子中的点突变在产生凋亡缺陷病 毒中的功能。在本实施例中，发明人鉴定了不同于起始密码子突变的 ORF3的功能可突变位点。
ORF3以相反方向位于ORF1中。由于ORF1编码病毒复制必需的 复制酶，所以必须保留ORF1的蛋白转录功能。因此在ORF1内的冗 余密码子被选择用来产生ORF3突变体。
为了形成异常ORF3表达，发明人选择了这样的策略：改变氨基 酸序列中的电荷模式以便影响得到的蛋白的二级结构。例如，发明人 反转电荷或使序列中特定位置的特定氨基酸变为电中性。在该方式中， 蛋白功能失去。此项研究中采用定点诱变方法向病毒基因组引入上述 突变。
设计了五种突变体，并根据突变的氨基酸编码命名。突变体27 将丙氨酸改变为终止密码子，如SEQ ID NO.19中所示。结果，这种 突变体表达截短的长26个氨基酸的ORF3蛋白。
其它的突变体通过改变蛋白的构象来改变ORF3蛋白的功能，如 上所述。为了改变蛋白的构象，蛋白中的带电氨基酸被选为突变靶点。 由于存在很多带电氨基酸，ORF3蛋白的α螺旋区是适当的。在突变 体52和61中，氨基酸电荷被反转，由此改变蛋白的二级结构，这是 由于该蛋白的α区被解折叠。在突变体52中，通过实现如SEQ ID NO. 20中所示的核苷酸序列变化使氨基酸His+被改变为Asp-。在突变体 61中，通过实现如SEQ ID NO.21中所示的核苷酸序列变化使氨基酸 Glu-被改变为Lys+。在突变体85中，通过实现如SEQ ID NO.22中所 示的核苷酸序列变化将His+改变为Tyr，结果正电荷被改变为中性电 荷。结果，由于该蛋白的一个卷曲区被打开，改变了突变体85的二级 结构。
突变体缺失50-62用作对照，其中氨基酸50至氨基酸62被删除。 如上所述，所产生的突变体将不影响ORF1的氨基酸序列，由此对复 制酶的转录无影响，这是由于突变位点位于ORF1的冗余密码子处。 参见图10。
将突变的病毒基因组转染至PK15细胞中，让其生长5天。5天后， 收集细胞并通过3X冻融溶解。然后用总细胞溶解物感染新鲜的PK15 细胞。在细胞传代15次后，突变体52和85以及野生型PCV2开始显 示细胞死亡。在野生型PCV2、突变体52或突变体85感染的PK15细 胞中观察到约70-90％的细胞死亡。相反，突变体61、突变体27或源 自ORF3的ATG起始密码子的删除突变的突变体都显示细胞死亡的显 著减少(约10％)。参见图11。
这些具有低凋亡率的突变体适合于产生活减毒疫苗。因此，发明 人发现在核酸水平上在特定氨基酸处改变构象使得能够产生突变体， 该突变体适于生产用于疫苗生产的活减毒病毒。
此外，通过将这些突变组合成双或三突变，有可能减少病毒恢复 至野生型毒性的可能性。例如，可能将ATG突变与SEQ ID NO.23中 所示的突变体27组合，或与SEQ ID NO.24中所示的突变体61组合。 上述突变可被组合成由ATG突变体、突变体27和突变体61组成的三 突变，如SEQ ID NO.25中所示。
很明显，在阅读了前述公开内容后，在不脱离本发明的精神和范 围的情况下，本发明的各种修饰和改变对于本领域技术人员是显而易 见的，意味所有的这些修饰和改变都处于所附权利要求的范围内。
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