本发明涉及利用磁性离体(用于回输)或者体内处理干细胞的方法以 及与其相关的治疗方法。

以基于细胞治疗形式的干细胞的应用是目前疾病治疗和修复医学方 面最令人兴奋和有前景的领域。显然，对可控制例如胚胎和成人干细胞 的增殖和分化的方式的基础研究是极其重要的。

美国专利第6,548,264号公开了硅石包被的纳米颗粒，该纳米颗粒包 括磁性金属核心。存在于该颗粒中的磁性核心使该颗粒对磁场作出反应， 由此该颗粒可用在诊断、成像和记录系统中。但是，现有技术的纳米颗 粒可能有这样的缺点，即它们没有在细胞水平上确定活化的方法。

磁珠扭曲细胞计数(magnetic bead twisting cytometry)已用于确定单个 细胞的机械属性，并且证实外部的机械力通过如整合素的跨膜细胞粘附 分子可跨过细胞表面传送并穿过细胞骨架，参见，例如Wang，N和 Ingberger，DE(1995)Probing transmembrane mechanical coupling and cytomechanics using magnetic twisting cytometry(利用磁扭曲细胞计数探 测跨膜机械耦合和细胞机械学).Biochem.Cell Biol.73：327-335。

在生物相容磁性纳米颗粒合成、表征1-3和健康护理领域4-6中新的磁 技术应用方面已有很多进展。这项工作主要涉及研究药物的控制和定向 输送。在这些系统中，治疗性药物或基因可附着到磁性载体颗粒(通常为 聚合物包被的磁铁矿)，随后通过使用空间聚焦、高梯度磁场使它们在体 内的目标位点集中。一旦药物/载体复合物在目标位点积累，药物在该位 点的释放和吸收增强。已进行了新方法的研究，这些新方法用于基因治 疗的磁靶向以及理论性和试验性检验和改进磁性微颗粒和纳米颗粒在体 外和体内模型系统中4，6的沉积。

其中多位研究人员7，8描述了采用扭矩将力施加到细胞膜上或其中将 张力施加到如RGD或胶原分子的跨膜蛋白上的短期实验。这些实验采用 膜的“机械”刺激引发多种细胞内钙流动。已知，采用其它技术的机械信 号可在引发骨髓基质细胞到成骨细胞的分化途径11，特别地，低水平的跨 膜机械信号可上调成骨细胞特异的转录因子如cbfal和cfos的表达和 DNA结合活性12，13。

在这些研究中，可将力施加到数个不同的标记受体上。已经阐明我 们怎样能影响下游过程和增强抗原和其它基质蛋白的合成15。采用骨髓 衍生的已调节成沿成骨和软骨生成细胞分化的间充质干细胞，我们已经 研究了下游基因表达调节对特异受体的磁性颗粒活化的反应。初步的数 据显示出应答人间充质干细胞中钙通道的磁性颗粒刺激的Runx 2上调， 接着有机械敏感的基质蛋白骨桥蛋白的上调。此外，我们有证据表明在 刺激单层人去分化软骨细胞后上调SOX 9。这些研究延伸到长期培养过 程中细胞播种骨架的3D分析，以研究这些策略在体外组织工程中的结构 构建中的应用。另外，包括颗粒数量和施加的力的数量效应分析的初步 研究鼓舞人心，并表现出增加的基质合成和成骨表型的表达14。

骨髓含有能尤其分化为成纤维细胞、成骨细胞、成脂肪细胞和网织 细胞的多潜能基质干细胞或间充质干细胞。这些间充质干细胞，例如人 骨髓基质成纤维细胞可从自愿供血者分离并保持它们的多谱系(脂肪细胞 的、软骨形成的、成骨细胞的)潜能。使用和操作前述细胞的一个优点在 于它们无免疫原性，这为这些细胞尤其用于软骨和骨修复提供了可能性。

到目前还未公开的我们同时待批的国际专利申请 PCT/GB2003/002624将磁性纳米方法与机械敏感离子通道特别是TREK K+通道方面的知识组合起来。已知TREK通道存在于成骨细胞、软骨形 成细胞和骨髓基质细胞中。为了更加精密地确定控制活化的特定受体的 定向，我们采用了HIS标记的TREK基因的克隆。HIS标签插到TREK 分子的特定区域以便结合有HIS抗体或NI2+的磁性颗粒的附着，随后其 可采用磁场远程扭转。将细胞膜内外的离子通道蛋白位点加上标签，以 此方式，我们鉴定了分子的机械敏感区以及开关下游过程所需的信号频 率。图2显示了采用骨髓基质细胞的实验结果，作为向附着到His标记 的TREK通道的磁性纳米颗粒施加磁场的结果，内钙水平上调了。

已显示，尤其是通过能将磁场在体外施加到2D单层培养物和3D细 胞种植骨架的磁力生物反应器的开发，可得到体外调节性结缔组织细胞。

但是，无论美国‘264还是Wang都没有解决或甚至指出围绕两基础 性问题的难题，而该问题需要解决，其围绕着工程细胞的临床应用的终 极目标，即：

(i)细胞怎样定向到修复位点并保持在该位点；以及

(ii)细胞如干细胞在体外和/或体内怎样调节或分化。

令人吃惊的是，现在我们发现了通过外部磁操作可将用磁性纳米颗 粒标记的干细胞输送或保持在特定位点的方法。另外，我们还将这些概 念进一步发展，以包括远程活化特异的细胞膜受体，其实际上涉及细胞 如干细胞的定位。简言之，这涉及干细胞在一位点如修复位点的沉积、 将细胞保持在该位点以及远程原位活化患者体内细胞。

具体而言，本发明解决了细胞上特异受体靶向的问题，用于远程活 化干细胞中跨膜离子通道。重要的是，基于磁性纳米颗粒的技术越来越 多地用在临床健康护理的很多方面，例如用于MRI的相差增强。

在本发明中，我们实现了这些细胞类型的早期分化。另外，该实现 的分化作为结合性策略的模型，其允许在体内远程靶向和/或当定位后在 特异位点活化。

因此，本发明使人骨髓干细胞中存在的多种干细胞受体类型，诸如 机械活化的离子通道例如K+通道(TREK)、钙通道、整合素以及表面膜结 合位点如RGD的靶向成为可能。重要的是，这些受体具有远程活化的可 能。也可以实现其它已知的对干细胞分化重要的受体的靶向，这些受体 例如已显示出活化下游转录因子如Runx和Osterix的外部的生长因子(例 如TGFB和BMP2)。

因此，本发明提供了尤其是人间充质干细胞的真正植入、对受伤或 修复位点的干细胞的长期生物作用的机会。另外，采用磁性纳米颗粒选 择、扩充和分化这些细胞以及靶向这些细胞的能力特别具有优势。此外， 本发明的应用具有治疗性含义，尤其是在基因治疗和组织工程方面。

主要由具有硅石、葡聚糖或PVA包被的磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿 (Fe2O3)核心组成的生物相容磁性纳米颗粒可用在本发明中。这些颗粒可 用本领域中已知的方法合成。但是，应理解的是，也可使用其它的磁性 纳米颗粒。颗粒大小可从约10nm到数微米，例如1-10μm。也可以使用 可购得的具有不同表面化学性质的磁性微颗粒和纳米颗粒。包被层可官 能化并与如上所述的那些的膜附着部分(motifs)交联。可对磁性纳米颗粒 进行修饰以便尤其是定制欲检查的颗粒内在频率，结合效率和稳定性， 以及检查结合对细胞活存性和功能的影响。修饰还可包括内结合位点以 及外膜上位点的定制。多种包被层可用于磁性纳米颗粒在人成骨细胞中 的结合和加载14，15，并且这些技术可进一步优化干细胞的结合、输送和活 化，例如采用成人原始髓人干细胞和/或胚胎干细胞。

靶向

通常已知的高梯度磁体，例如外源性稀土(主要为NdFeB)高梯度磁体 可用于将干细胞靶向到体外测试系统和/或体内特定位点。显然，本发明 优选在体内将干细胞靶向。这些磁体产生高场/梯度产物，其对装载进细 胞中的磁性颗粒产生平移力，按照下式将它们保持在靶位点：

$F_{\mathrm{mag}}=(X_2-X_1)V\frac{1}{{\mu }_0}B(▿B).$

活化

可采用例如磁调节性生物反应器实现远程机械活化。这些本身为已 知的生物反应器可将力施加到附着在体外多孔2D系统中或体内基于3D 骨架的系统中培养的细胞的磁性颗粒上。如间充质干细胞的干细胞和其 产生的细胞群，例如成骨细胞、软骨形成细胞和脂肪形成细胞群可采用 如STRO-1的单克隆抗体利用本身为已知的标准方法14通过磁活化细胞 分选(MACS)进行分离。这些方法包括那些已知用于BMSc单层培养的方 法和采用由诸如聚乳酸(PLLA)或胶原凝胶的生物可降解聚合物组成的 3D骨架的方法21。

现在我们已发现将干细胞选择性活化和/或靶向的方法，其随后可使 细胞以远程方式被机械操作。

术语“以远程方式”是指例如非接触性方式，以及在从体外进行体内 的特异地活化/靶向的情况下。

因此根据本发明，我们提供了体内或体外磁操作干细胞的方法，其 包括将能磁化的颗粒与干细胞结合。

该方法可包括体内过程的离体操作。此外，技术人员应理解的是细 胞应被解释成包括多种细胞。

更具体地，本发明提供了如前所述的方法，其包括结合有如上所述 的干细胞的磁化颗粒的活化和/或靶向。

根据本发明的另一方面，我们提供了磁操作干细胞的方法，其包括 将可磁化颗粒结合到细胞，特征在于该方法通过将可磁化颗粒结合到细 胞而激动或拮抗细胞内的离子通道。

根据本发明的另一方面，我们提供了如前所述的方法，其包括分化 步骤。

在本发明的这一方面，可磁化颗粒可直接与细胞结合。或者，该方 法包括将可磁化颗粒与抗体、酶等结合，随后与细胞结合。

可磁化颗粒与细胞的结合可包括将这种颗粒引入细胞、将这种颗粒 附着到细胞，如细胞外部或内部，或其任意组合。因此，可磁化颗粒可 细胞内结合或细胞外结合或为细胞内和细胞外结合的组合。但是，在本 发明优选的方式中，该颗粒为细胞内结合。

当本发明的方法包括细胞内结合，这将包括与内结合位点的结合。 仅举例来说，对于TREK-1，颗粒可与离子通道的N末端区结合。可选 择地，颗粒可与离子通道的COOH末端区结合。本领域技术人员可理解 的是，多种离子通道和连接位点可用在本发明的方法中。因此，可以采 用与可在TREK-1中看到的离子通道的N末端区对应的或与可在TREK-1 中看到的离子通道的COOH末端区对应的内结合位点以及其它本身为已 知的结合位点。

因此，我们还提供了操作机械敏感离子通道的方法，特征在于该方 法包括将可磁化颗粒与离子通道直接或间接结合。

本发明的方法可包括操作哺乳动物细胞或其它细胞类型，例如细菌 细胞、植物细胞等。但是，技术人员应理解的是本发明的方法可用于操 作这里未提到的其它细胞类型。此外，该方法可为体外方法或体内方法， 尽管优选体内方法。

本发明的方法可包括在干细胞中上调或下调基因表达，以应答如上 所述的干细胞的机械操作。通过操作基因表达模式或水平，干细胞可被 引导延如本文所述的特定的分化途径分化。

优选地，本发明的方法包括远程操作细胞和/或激动或拮抗离子通道， 例如从体外进行操作，即远程机械活化。

本发明的方法可用于多种本身为已知的细胞。但是，优选地，本方 法适用于哺乳动物干细胞。

本发明的方法可用于如上所述的任何通常已知的细胞内离子通道。 该方法特别适用于机械敏感离子通道。这些机械敏感离子通道已在很多 细胞类型中得到鉴定并主要描述为钙或钾离子通道，但应理解的是本发 明的方法并不限于用在钙或钾离子通道。仅举例来说，一种神经细胞内 已经在分子水平和功能水平上很好表征的这样的通道是染色体基因 TREK-1，它是2P K+通道家族的一部分。TREK-1通道曾在骨细胞中鉴 定，并已知应答剪切力、细胞膨胀和膜拉伸以及如脂肪酸和普通麻醉剂 的其它外源试剂。

本发明的特别方面是提供操作机械敏感离子通道的方法。

这些“机械敏感”离子通道存在于多种哺乳动物如人和细菌细胞中， 本发明使细胞在体内和/或细胞培养物中选择性的活化，参见，例如Sokabe， M，F Sachs，A Jing(1991)Quantitative video microscopy of patch clamped membranes：Stress，strain，capacitance，and stretch channel activation(膜片钳 膜的定量图像显微方法：压力、张力、容量和伸展的通道活化).Biophys J. 59：722-728；Stewart，Z，B Martinac and J Dobson(2000)Evidence for mechanosensitive transmembrane ion channels of small conductance in magnetotactic bacteria(磁性趋向细菌中小电导的机械敏感跨膜离子通道 的证据).Electro-and Magnetobiol.19：81-89。由于这些通道在正常细胞功 能中有作用并在例如骨和结缔组织的产生或外围神经系统的活化中其特 别重要的作用，因此能够远程操作，例如从体外进行操作对用于尤其是 疼痛缓解如麻醉剂、治疗剂、组织工程和修复以及肿瘤治疗特别有利。

在本发明的另一方面中，通过将通道转染进否则就不应答的细胞， 该方法还可适用于通常非机械敏感的细胞和/或离子通道。

所有的离子通道在受力时会开放和关闭(即改变构象状态)，这是离子 通道活化的原理。对于机械敏感离子通道来说，该受力导致膜变形，触 发通道的开放。电压门和配体门控离子通道也是“机械应答的”，因为它 们对库仑力(对于电压门离子通道)和结合力(对于配体门离子通道)引起的 离子通道上的机械张力做出应答。由此，所有的离子通道可用本文描述 的方法活化，只要可磁化颗粒直接或间接地偶合到通道蛋白的机械应答 区。

因此，在本发明的一个方面中，离子通道为电压门控离子通道，或 者，离子通道为配体门控离子通道。

大量的各种不同的颗粒可用在本发明的方法中。用在本发明方法中 的可磁化颗粒可以是固有磁性的，或可选地，可以是在磁场中作出反应 的颗粒。一般而言，任何磁性材料都可以采用，但是对于术语磁性，我 们指例如顺磁性的超顺磁性的、铁磁性的和/或反铁磁性的材料，其实例 包括元素铁(Fe)或化合物，例如铁盐，诸如磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3) 和硫复铁矿(Fe3S4)，或铬化合物，例如铬盐，诸如氧化铬(CrO2)，或上述 任何组合。优选的磁性材料包括颗粒，例如纳米颗粒，其包括具有生物 相容包被的磁性核心。因此，这些优选的颗粒为纳米颗粒，特别是具有 核心和包被该核心的例如硅石壳的纳米颗粒。但是，还可以是在核心内 具有多个磁性中心的多孔颗粒。这些颗粒的实例为描述在美国专利 6,548,264中的那些纳米颗粒，将该专利引入本文作为参考。因此，现有 技术的纳米颗粒可具有小于1微米的平均尺寸，每一所述纳米颗粒包括(a) 包括可磁化颗粒的核心和(b)包被该核心的硅石壳，其中可磁化颗粒为上 述磁性材料。

微颗粒和纳米颗粒(待附着到细胞)通常为大致的球形或椭圆形。颗粒 的尺寸可尤其是按照可磁化材料的性质、应用等进行改变。但是，颗粒 的例子可以是纳米颗粒，其具有的平均尺寸如直径为5000nm或更小，例 如1nm-5000nm，优选1nm-1000nm，更优选1nm-1000nm，或2nm-10nm)。

用于附着到细胞的颗粒可以有或无包被层的、单结构域或多结构域。 合适的颗粒的例子包括但不限于：

(i)Spherotech，Inc提供的有包被层的磁性微球(d＝4μm)。这些微球 由包被有聚合物的磁块状核心(magnetically blocked core)组成。

(ii)单一结构域、掺有铁氧体(Ferrite)的硅石纳米颗粒，具有可调的 尺寸(d＝50-300nm)和窄尺寸分布。

在本发明的方法中，通过将上述的可磁化颗粒附着到细胞膜的特异 区域和/或离子通道自身的特异“受体”上可活化所述的离子通道。因此， 随后活化通道所需的机械力可通过作用到这些磁性颗粒上的磁场进行远 程施加。

特别是，本发明的方法包括通过将一种或多种识别细胞内关键细胞 元件的特异抗体或蛋白质结合基序(motif)标记到颗粒而对上述的可磁化 颗粒进行修饰。这些包括跨膜粘附分子，例如整合素、钙粘素、选择素 以及免疫球蛋白或分散的膜粘附蛋白如RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨 酸)，参见，例如J.Chen，B.Fabry，E.L.Schiffrin，和N.Wang(2001) Twisting integrin receptors increases endothelin-1 gene expression in endothelial cells(扭曲整合素受体来增加内皮细胞中内皮素-1的基因表达) Am J Physiol Cell Physiol 280：1475-84；A.R.Bausch，U.Hellerer，M.Essler， M.Aepfelbacher，and E.Sackmann(2001)Rapid stiffening of integrin receptor-actin linkages in endothelial cells stimulated with thrombin：a magnetic bead microrheology study(由凝血酶刺激的内皮细胞中整合素受 体-肌动蛋白连接的快速钢化：磁株流变学研究)Biophys J 80：2649-57； Cartmell SH，J Dobson，S Verschueren，A El Hai(2002)Development of magnetic particle techniques for long-term culture of bone cells with intermittent mechanical activation(利用间歇机械活化开发用于骨细胞长期 培养的磁颗粒技术).IEEE Transactions on NanoBioscience 1：92-97。

本发明的方法是特别有利的，因为它提供了治疗多种病症的方法。 实际上本发明提供了治疗方法，其可应用到一种或多种离子通道在其中 起作用的任何病症。此外，本发明提供了潜在控制离子通道活化包括疼 痛缓解如麻醉作用的方法。

因此根据本发明，我们提供了治疗患有其中离子通道起作用的病症 的患者的方法，其包括向这种患者施用如上所述的可磁化颗粒并利用磁 场操作这些颗粒。

上述的治疗方法不应被理解为限制到组织和/或骨修复，而是在组织 和/或骨修复中特别有利。通过向身体的靶标区提供疼痛缓解，例如用于 局部麻醉的方法，该治疗方法可用于促进进一步的治疗。

这些细胞的性质可随目标组织的性质而变化。例如用于生长新的韧 带的细胞可为韧带细胞，肌腱细胞用于生长新的肌腱。可选择地，细胞 可以是软骨细胞和/或其它基质细胞，例如软骨细胞祖细胞。

因此本发明的方法可包括组织再生或诸如皮肤、软骨、韧带、肌腱、 肌肉或骨的人工组织产生。

可选择地，所述方法可包括伤口愈合和/或组织粘附。

在优选的实施方案中，该方法可包括骨修复和/或骨生长。

在另一备选方案中，本发明的方法可包括例如牙科应用和/或兽医应 用。

所述方法还可用作在体内选择性杀伤细胞(例如肿瘤细胞)的途径。这 时，可磁化颗粒附着到靶细胞膜或离子通道蛋白，且磁场施加到体内靶 区。细胞膜中离子通道快速的进行开放和关闭循环(通过应用随时间变化 的磁场)和/或保持关闭(通过应用静态磁场)使离子(例如Ca++)涌入细胞， 引起渗透压休克，接着细胞死亡。

因此，根据本发明的这一方面，我们还提供了破坏细胞或抑制细胞 生长的方法，其包括通过将可磁化颗粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内 的离子通道。

所述方法可包括诱导细胞渗透压休克的方法，例如通过将可磁化颗 粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道。该方法在治疗或减少肿 瘤细胞如癌症细胞方面特别有用。

因此，所述方法可包括通过采用靶向的静态磁场保持离子通道开放 而杀死细胞。或者，该方法可包括通过采用靶向的随时间变化磁场使离 子通道进行开放和关闭的循环而杀死细胞。

在本发明的方法中，磁场可尤其随待治疗病症的性质而变化，但可 为例如0.1-10Hz的频率。然而，也可采用这个范围之外的频率。磁场将 典型地具有(但不限于)10mT-1400mT数量级的通量密度。

在本发明的方法中，可在体外产生体内应用的磁场，且可由永磁体 或电磁体产生。该磁场可以为恒定或可变场，例如永磁体可相对所述细 胞移动。对于电磁体，磁场可通过向电磁体提供合适的电流水平而产生， 可任意地与交变电流组合。

根据本发明的另一方面，我们提供了在细胞中诱导治疗作用的方法， 其包括通过将可磁化颗粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道并 磁操作该可磁化颗粒。

另外，我们提供了治疗方法，其包括施用治疗性活性试剂，该活性 设计与激动或拮抗细胞内离子通道的可磁化颗粒同时、分开或依次施用。

我们还提供将治疗性活性试剂定向到细胞的方法，其包括通过将可 磁化颗粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道，磁操作该可磁化 颗粒并同时、分开或依次施用治疗性活性试剂。

根据本发明的另一方面，我们还提供了可磁化颗粒在磁操作体内细 胞方法中的应用。

所述应用可包括体内过程的离体操作。更加具体地，本发明提供可 磁化颗粒在制备用于磁操作细胞的系统中的应用，该系统包括将可磁化 颗粒结合到细胞并激动或拮抗细胞内的离子通道。

在本发明的这一方面中，可磁化颗粒可直接与细胞结合。可选择地， 所述应用包括将可磁化颗粒与抗体、酶等结合，其随后与细胞结合。

当本发明的应用包括细胞内结合时。仅举例说明，对于TREK-1，颗 粒可与该离子通道的N末端区结合。可选择地，颗粒可与该离子通道的 COOH末端区结合。

本发明的应用包括操作哺乳动物细胞或其它细胞类型，例如细菌细 胞、植物细胞等。该应用可以为体外应用或体内应用，尽管优选体内应 用。

优选地，本发明的应用包括操作细胞和/或激动或拮抗离子通道，例 如从体外操作，即远程机械活化。

本发明的应用可应用到多种本身为已知的细胞。但是，优选该应用 适用于哺乳动物体细胞，例如骨、软骨、肌肉(骨骼肌和心肌)、淋巴细胞、 内分泌细胞、泌尿系统细胞、与生殖系统有关的细胞、神经细胞和肿瘤 细胞。

本发明的应用可用于如前所述的细胞内任何通常已知的离子通道。 该应用特别适用于上述的机械敏感离子通道。

本发明的特别方面是提供在制备用于操作机械敏感离子通道的系统 中的应用。

在本发明的另一方面中，通过将通道转染进否则就不应答的细胞， 该应用还适用于通常为非机械敏感细胞和/或离子通道。

在本发明的一个方面中，所述的离子通道为电压门控离子通道，或 者，所述离子通道为配体门控离子通道。

大量的各种不同的颗粒可用在本发明的应用中。一般而言，任何磁 性材料都可以采用，其例子包括元素铁(Fe)或铁化合物，例如铁盐，诸如 磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)和硫复铁矿(Fe3S4)，或铬化合物，例如 铬盐，诸如氧化铬(CrO2)，或上述的任何组合。优选的磁性材料包括颗粒， 其包括具有生物相容包被层的磁性核心。因此，这些优选的颗粒为纳米 颗粒，特别是具有核心和包被该核心的例如硅石壳的纳米颗粒。但是， 还可以是在核心内具有多个磁性中心的多孔颗粒。这些颗粒的例子为描 述在美国专利6,548,264中的那些纳米颗粒，将该专利引入本文作为参考。

特别是，本发明的应用包括通过将一种或多种识别细胞内关键细胞 元件的特异抗体或蛋白质结合基序连接到所述颗粒而对上述的可磁化颗 粒进行修饰。这些包括跨膜粘附分子，例如整合素、钙粘素、选择素以 及免疫球蛋白或如RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)的分散的膜粘附蛋 白。

本发明的应用是特别有利的，因为它提供了适用于用在多种病症治 疗中的系统。实际上本发明提供了在制备适用于治疗的药物中的应用， 其可应用到一种或多种离子通道在其中起作用的任何病症。此外，本发 明提供了潜在控制离子通道活化的应用包括疼痛缓解如麻醉作用。

因此根据本发明，我们提供了可磁化颗粒在制备药物中的应用，该 药物适用于治疗患有离子通道在其中起作用的病症的患者，其包括向这 种患者施用如上所述的可磁化颗粒并利用磁场磁场操作这些颗粒。

上述的应用不应被理解为限制到组织和/或骨修复，而是在组织和/ 或骨修复中特别有利。通过向身体的靶区提供疼痛缓解的方法，例如用 于局部麻醉，该应用可用于促进进一步的治疗。

这些细胞的性质可随目标组织的性质而变化。例如用于生长新的韧 带的细胞可为韧带细胞，肌腱细胞用于生长新的肌腱。可选择地，细胞 可以是软骨细胞和/或其它基质细胞，例如软骨细胞祖细胞。

因此所述应用可包括组织再生或人工组织如皮肤、软骨、韧带、肌 腱、肌肉或骨的产生。

可选择地，所述应用可包括伤口愈合和/或组织粘附。

在优选的实施方案中，所述应用可包括骨修复和/或骨生长。

在另一备选方案中，本发明的应用可包括例如牙科应用和/或兽医应 用。

所述应用还可用作如上所述在体内选择性杀伤细胞(例如肿瘤细胞) 的途径。

因此，根据本发明的这一方面，我们还提供了可磁化颗粒在制备一 系统中的应用，该系统用于破坏细胞或抑制细胞生长，其包括通过将可 磁化颗粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道。

所述应用可包括用在诱导细胞渗透压休克的方法中，例如通过将可 磁化颗粒结合到细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道。本发明这一方面 中的应用在治疗或减少如癌症细胞的肿瘤细胞方面特别有用。

因此，所述应用可包括通过采用靶向的静态磁场保持离子通道开放 而杀死细胞。可选择地，所述应用可包括通过采用随时间变化的靶向磁 场使离子通道循环开放和关闭而杀死细胞。

根据本发明的另一方面，我们提供了可磁化颗粒在制备用于在细胞 中诱导治疗作用的系统中的应用，其包括通过将可磁化颗粒结合到所述 细胞而激动或拮抗细胞内的离子通道并磁操作该可磁化颗粒。

另外，我们提供了可磁化颗粒在制备包括治疗性活性试剂的系统中 的应用，其中该活性试剂可与激动或拮抗细胞内离子通道的可磁化颗粒 同时、分开或依次施用。

我们还提供了可磁化颗粒在制备用于将治疗性活性试剂靶向到细胞 的系统中的应用，其包括通过将可磁化颗粒结合到所述细胞而激动或拮 抗细胞内的离子通道，磁操作该可磁化颗粒并同时、分开或依次施用所 述的治疗性活性试剂。

根据本发明的另一方面，我们提供了包括治疗性活性试剂的试剂盒 或用于将可磁化颗粒与细胞结合的装置。

技术人员应理解的是，任何通常已知的治疗性活性试剂或治疗性活 性试剂的组合可用在本发明的试剂盒中。

由此，该试剂盒可包括含有治疗性活性试剂的容器、可磁化颗粒源 和用于同时、次序或分开施用它们的说明书。本发明的试剂盒可包括其 它本身为已知的试剂。本发明还包括上述试剂盒在制备药物中的用途。

本发明以下将仅通过实施例并参考附图进行说明，其中

图1a)为代表TREK-1结构的示意图，显示用以机械操作的用于标记 磁珠的12×组氨酸插入的三位点；

图1b)显示具有膜结合RGD包被的羧基铁磁性颗粒(4μm)的原始人 星形细胞(放大倍数×1000)；

图2为TREK离子通道的示意图，显示该蛋白中His.标签的结构和 位点。红圆圈表示在三个位置的His标签的位点，主环、COOH末端和 NH末端；

图3代表通过下游细胞内钙变化而监测的Trek-1的磁活化；以及

图4代表TREK-1的磁活化诱导共转染有flashpericam的HEK293T 细胞内钙的瞬间上升。

实施例1

靶向模型系统

所述的模型系统由连接到向琼脂凝胶块中通道加样的管的蠕动泵组 成。所述磁体可相对于通道放置在不同位置，靶位点的磁场和梯度采用 高斯计(gaussmeter)界面连接的轴向霍耳(Hall)探测器测量。由稀土磁体产 生的磁场采用该项目中所需的Redcliffe Diagnostic MagScan场强图绘制 系统进行表征。在每次实验运行后，凝胶通道会被切开并采用染色技术 分析细胞捕获。磁性颗粒捕获通过对冷冻干燥的凝胶块进行超导量子干 涉仪(SQUID)磁力测定而进行定量。模型可用于优化递送和靶向参数，诸 如磁场强度和几何形状、磁性颗粒特征、每细胞的颗粒数等。

实施例2

采用磁性细胞计数的非特异性膜变形

特别地，取决于骨架尺寸，将106-109BMSc种植于骨架，在放置在 生物反应器中之前培养24小时。构建物随后接受不同的磁负载方案，例 如1Hz频率1小时，每颗粒上的力为1-100pN。这些参数为可控的，并 允许对不同的细胞类型和骨架材料进行系统的优化。处理之后，可取出 细胞并在活化后接受不同点的RNA和蛋白质分析。采用蛋白印迹、FAC 分析和定量PCR技术，可对如runx 2和osterix的成骨细胞转录因子、以 及如骨桥蛋白、1型胶原的基质蛋白、碱性磷酸酶和骨钙素进行测试。

实施例3

在动物模型中证实新骨形成以确认这些磁性微颗粒和纳米颗粒的适用性

采用小鼠SCID模型，通过将细胞保持在体内皮下扩散室中以远程活 化干细胞而促进骨细胞分化和新骨形成的能力得到了这项技术的动物实 验的支持。以此方式，可与体外实验进行比较。还可建议将细胞靶向到 特异组织。

实施例4

体内骨形成的证实

可采用来自间充质干细胞的人衍生骨祖细胞。体内骨形成可采用重 症联合免疫缺陷(SCID)小鼠的皮下移植模型和扩散室模型进行评估。这 提供了在体内确认磁性微颗粒和纳米颗粒靶向效果的快速和可靠的模 型。通过与宿主细胞相对的植入细胞，扩散室试验提供了骨形成的明确 证明。皮下植入模型保持评估骨骼组织形成的产业标准不变，在授予 RO(30/1759)的项目许可之下，我们之一(RO)公开了sc和DC模型在骨组 织工程评估方面的应用。简言之，选择的人骨祖细胞皮下植入到SCID小 鼠4周，对于扩散室研究，细胞和磁性颗粒复合物放置进每一扩散室及 腹膜内植入无胸腺裸鼠(MFI-nu-nu；4-6周大；Harlan UK Ltd)的这些室中 10周。此后，取出扩散室，固定过夜(95％乙醇，4℃)并在4℃无脱钙地 包埋在聚(甲基丙烯酸羟甲酯)树脂中。通过包括冷冻、石蜡和甲基丙烯酸 甲酯可塑性的切片的组织学技术评估新骨的形成。软骨和骨形成的评估 将通过采用甲苯胺蓝姬姆萨、阿尔新蓝/天狼星红和番红-O染色进行组织 学检测。该模型目前正在Southampton在授予RO(30/1759)的项目许可之 下运行。

实施例5

体内将细胞靶向到特异位点

这项工作集中在经动脉内和静脉内注射将装载有磁性颗粒的细胞递 送到特定组织位点。简言之，用磁性颗粒装载选择的和扩充的间充质干 细胞，并经尾静脉注射入麻醉的MF1nu/nu小鼠。采用外部高梯度NdFeB磁体，这些细胞被定位在特定的靶位点。对照小鼠也将被注射，但是无 磁体用于靶向。在4、7和14天后采用MRI(磁性纳米颗粒在临床MR成 像中用作对比增强剂)和SQUID磁力测定分析切片的冻干靶组织来评价 靶向效果。采用上述技术的初步实验已在人骨衍生的间充质干细胞 (Cambrex poietics-hMSC)上进行。在含有10％FCS和1％抗生素、抗坏血 酸(50微克/ml)和β-甘油磷酸(10mM)的αMEM中培养5天(样品组E-H)。

电压门钙离子通道受体的抗体的生物素化α2/δ-1亚基包被磁性微颗 粒(d-4μm)。4天后，通过钙通道受体将颗粒附着到干细胞40分钟。40 分钟后，细胞暴露于1Hz的磁场，该磁场对每个颗粒施加约30微微牛顿 的力(约2颗粒/细胞)。2小时40分钟后，将颗粒与细胞分开并通过抽吸 取出。将起初的培养基返回到样品，随后进一步培养另一24小时的时间 段。在第5天收集对照和刺激组的RNA。对每一样品进行基因芯片分析。 采用HG-Focus人基因组芯片(Affymetrix)分析8000基因/样品对磁活化的 反应(两倍的增加/下降视为上调和下调)。

这些实验的基因芯片数据显示机械刺激导致如神经生长因子和成纤 维细胞生长因子下调的某些基因(表1)。这显示利用磁性颗粒施加机械力 引导干细胞分化偏离神经元和成纤维细胞途径。如tetranectin的上调的基 因对机械力施加的反应表明细胞向成骨途径分化。涉及细胞骨架重构和 细胞粘附蛋白的基因上调与施加机械力后期望的细胞过程相关。

表达的基因的总数  82(42▲40)

表达的基因的选择  胰岛素样GF结合蛋白1(2.1倍▲)

                  FK506结合蛋白(2.1倍▲)

                  关节蛋白(Zyxin)(2.1倍▲)

                  整合素α5(2倍▲)

                  早期生长反应因子-1(Early growth response 1)(2倍▲

                  )

                  IV型胶原α3(2.1倍)

                  神经GF(2倍)

                  成纤维细胞GF 7和9(2.1和2.5倍)

                  Tetranectin(2.1倍▲)

表1：基因芯片分析结果显示，与分化和机械刺激有关的特定基因的 活性以及它们相对于非刺激的对照培养的相对上调和下调。符号：上调 和＝下调。