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使用针对T/B细胞耗尽的特异性方案的用于稳定和长期植入的联合疗法

阅读:599发布:2021-08-11

专利汇可以提供使用针对T/B细胞耗尽的特异性方案的用于稳定和长期植入的联合疗法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且公开了 治疗 需要非同基因的细胞或组织移 植物 的受试者的方法。所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×105个CD3+T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×106个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将T细胞与未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:(i)将 抗体 添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用 磁性 敏感剂标记所述抗体;(ii)通过 磁场 将与标记有磁性敏感剂的抗体特异性结合的未成熟造血细胞固定在基体中;(iii)洗涤基体以移除未结合的细胞;和(iv)移除磁场以从基体洗脱经结合的细胞;并且随后(b)给该受试者施用 治疗有效量 的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。,下面是使用针对T/B细胞耗尽的特异性方案的用于稳定和长期植入的联合疗法专利的具体信息内容。

1.治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5 +
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:
(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;
(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;
(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和
(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;
并且随后
(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
2.权利要求1的方法,还包括在步骤(a)之前在降低强度预处理下预处理该受试者。
3.权利要求1的方法,还包括在步骤(a)之前采用体内T细胞减灭预处理该受试者。
4.权利要求1的方法,其中一定剂量的所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千
6
克该受试者的体重5-40×10 个CD34+细胞。
5.权利要求4的方法,其中一定剂量的所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千
6
克该受试者的体重至少约10×10 个CD34+细胞。
6.权利要求1的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞选自由T细胞被耗尽的骨髓细胞、T细胞被耗尽的G-CSF流动的外周血祖细胞、T细胞被耗尽的脐带血、通过从骨髓和/或从G-CSF流动的外周血祖细胞的阳性选择获得的纯化CD34+细胞、和体外扩增的+
CD34 细胞所组成的组。
7.权利要求1的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者
6 + -
的体重小于1×10 个CD8TCRα/β 细胞。
TM
8.权利要求1的方法,其中通过MACS 来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
9.权利要求1的方法,其中当所述表面标记是T细胞表面标记时,所述未结合的细胞包含T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
10.权利要求9的方法,其中所述T细胞表面标记选自CD2、CD3、CD4、CD8和TCRα/β。
11.权利要求1的方法,其中当所述表面标记是未成熟造血细胞表面标记时,所述经结合的细胞包含T细胞被耗尽的造血细胞。
12.权利要求11的方法,其中所述造血细胞表面标记选自由CD34、CD33和CD131所组成的组。
13.权利要求1的方法,还包括使用与B细胞表面标记特异性结合的抗体将B细胞与所述T细胞被耗尽的未成熟细胞分离。
14.权利要求13的方法,其中所述B细胞表面标记选自由CD19和CD20所组成的组。
15.权利要求1的方法,其中所述基体为磁性基体。
16.权利要求1的方法,其中所述基体包含磁性灵敏的材料或铁磁性材料的球。
17.权利要求1的方法,其中所述磁性敏感剂包含超顺磁性颗粒。
18.权利要求17的方法,其中所述超顺磁性颗粒与所述抗体接合,其中所述抗体与抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白和或抗-半抗原-特异性微珠组合。
19.权利要求1或17的方法,其中使用高梯度磁性分离(HGMS)来实施所述的将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离。
20.权利要求1的方法,其中使用分离柱来实施所述的将所述T细胞与所述未成熟细胞分离。
21.权利要求1的方法,其中所述抗体选自由抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、抗-TCRα/β抗体、抗-CD19抗体、和抗-CD20抗体、抗-CD21抗体、抗-CD34抗体、抗-CD33抗体和抗-CD131抗体所组成的组。
22.权利要求1的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞从同一非同基因的供体获得。
23.权利要求22的方法,其中所述非同基因的供体相对于该受试者是同种异体或异种的。
24.权利要求23的方法,其中所述同种异体的供体选自由HLA匹配的同胞、与HLA匹配无关的供体、与HLA单倍体同一性相关的供体和显示一个或多个不同的HLA决定簇的供体所组成的组。
25.权利要求1的方法,其中该受试者是人类受试者。
26.权利要求3的方法,其中通过抗体实施所述体内T细胞减灭。
27.权利要求26的方法,其中所述抗体包括抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体、抗-CD52抗体和抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
28.权利要求2的方法,其中所述降低强度预处理包括非清髓性预处理。
29.权利要求28的方法,其中所述非清髓性预处理包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI)、化疗剂和/或抗体免疫疗法中的至少一种。
30.权利要求29的方法,其中所述TBI包括选自由1-7.5Gy和1-3.5Gy所组成的组中的范围内的单次或分次照射剂量。
31.权利要求29的方法,其中所述化疗剂包括白消安、氟达拉滨、美法仑和塞替派中的至少一种。
32.权利要求29的方法,其中所述抗体包含抗-CD52抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体或抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
33.权利要求1的方法,其中所述环磷酰胺的所述浓度为每千克体重约100-200mg或约
100mg。
34.权利要求1的方法,其中以单次剂量或以两次剂量施用所述环磷酰胺。
35.权利要求34的方法,其中所述两次剂量每次包含每千克体重约50mg的浓度。
36.权利要求34的方法,其中在步骤(a)后的第3和4天施用所述两次剂量的各次剂量。
37.权利要求1的方法,其中该受试者具有恶性病。
38.权利要求37的方法,其中所述恶性病是造血癌症。
39.权利要求1的方法,其中该受试者具有非恶性病。
40.权利要求1的方法,其中所述细胞或组织移植物包含未成熟造血细胞。
41.权利要求1的方法,其中所述细胞或组织移植物选自由肝脏、胰脏、脾脏、肾脏、心脏、皮肤、肠和淋巴/造血组织或器官所组成的组。
42.权利要求41的方法,其中在将所述剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到所述受试者中之前、同时或之后,将所述细胞或组织移植物移植到该受试者中。
43.权利要求41的方法,其中所述细胞或组织移植物包含几个器官的共同移植。
44.权利要求42的方法,其中所述细胞或组织移植物和所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞从同一供体获得。
45.治疗需要未成熟造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到经预处理的受试者中,其中
5
所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细
6
胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:
(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;
(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;
(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和
(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;
并且随后
(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
46.治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:
(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;
(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试者中,其中所述T细胞
5
被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细胞,并且其中
6
所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:
(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;
(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;
(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和
(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;
并且随后
(c)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
47.在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5 +
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:
(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;
(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;
(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和
(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;
并且随后
(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。
48.治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5 +
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
49.治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5 +
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b的至少一种T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞;并且随后
(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
50.权利要求48或49的方法,还包括在步骤(a)之前在降低强度预处理下预处理该受试者。
51.权利要求48或49的方法,还包括在步骤(a)之前采用体内T细胞减灭预处理该受试者。
52.权利要求48或49的方法,其中一定剂量的所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包
6
含每千克该受试者的体重5-40×10 个CD34+细胞。
53.权利要求52的方法,其中一定剂量的所述T细胞被耗尽的未成熟细胞包含每千克
6
该受试者的体重约10×10 个C D34+细胞。
54.权利要求48或49的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞选自选自由T细胞被耗尽的骨髓细胞、T细胞被耗尽的G-CSF流动的外周血祖细胞、T细胞被耗尽的脐带血、通过从骨髓和/或从G-CSF流动的外周血祖细胞的阳性选择获得的纯化CD34+细胞、和+
体外扩增的CD34 细胞所组成的组。
55.权利要求48或49的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该
6 + -
受试者的体重小于1×10 个CD8TCRα/β 细胞。
56.权利要求48或49的方法,其中通过使用抗体实施所述分离。
57.权利要求56的方法,其中所述抗体与荧光染料、半抗原或磁性颗粒连接。
58.权利要求57的方法,其中使用流式细胞术或磁性细胞分选来进行所述分离。
TM
59.权利要求58的方法,其中所述磁性细胞分选包括MACS 。
60.权利要求48的方法,其中所述的基于由所述T细胞分泌的产物的将T细胞与造血细胞的分离包括分离标记有分泌产物的T细胞,其中所述T细胞结合于捕获部分,所述捕获部分特异性绑定由所述T细胞分泌的产物,并且其中所述T细胞在产物被分泌并绑定到所述捕获部分的条件下培养,由此制备标记有所述分泌产物的T细胞,其中所述T细胞不被所述方法溶解并且其中所述分泌产物用标记部分标记。
61.权利要求48的方法,还包括基于由所述B细胞分泌的产物的将B细胞与所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞进行分离,包括分离标记有分泌产物的B细胞,其中所述B细胞结合于捕获部分,所述捕获部分特异性绑定由所述B细胞分泌的产物,并且其中所述B细胞在产物被分泌并绑定到所述捕获部分的条件下培养,由此制备标记有所述分泌产物的B细胞,其中所述B细胞不被所述方法溶解并且其中所述分泌产物用标记部分标记。
62.权利要求60或61的方法,其中所述分泌产物是细胞因子、抗体或激素
63.权利要求60或61的方法,其中所述分泌产物选自由IFN-γ、IL1、IL2、IL4、IL10、IL12、TGF-β、TNF、GM-CSF和SCF所组成的组。
64.权利要求60或61的方法,其中所述捕获部分通过锚定部分与所述T细胞或B细胞结合。
65.权利要求60或61的方法,其中所述捕获部分是抗体或其抗原结合片段
66.权利要求65的方法,其中所述抗体是双特异性的。
67.权利要求65的方法,其中所述抗体是抵抗T细胞或B细胞表面标记的。
68.权利要求60或61的方法,其中所述标记部分是对于分泌产物为特异性的抗体。
69.权利要求60或61的方法,其中所述标记部分是荧光染色的、可磁化的或包含磁性颗粒。
70.权利要求56或67的方法,其中所述抗体选自由抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、抗-TCRα/β抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD21抗体、抗-CD34抗体、抗-CD33抗体和抗-CD131抗体所组成的组。
71.权利要求48或49的方法,其中所述T细胞被耗尽的未成熟细胞从非同基因的供体获得。
72.权利要求71的方法,其中所述非同基因的供体相对于该受试者为同种异体或异种的。
73.权利要求72的方法,其中所述同种异体的供体选自由HLA匹配的同胞、与HLA匹配无关的供体、与HLA单倍体同一性相关的供体和显示一个或多个不同的HLA决定簇的供体所组成的组。
74.权利要求48或49的方法,其中该受试者是人类受试者。
75.权利要求51的方法,其中通过抗体实施所述体内T细胞减灭。
76.权利要求75的方法,其中所述抗体包括抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体、抗-CD52抗体或抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
77.权利要求50的方法,其中所述降低强度预处理包括非清髓性预处理。
78.权利要求77的方法,其中所述非清髓性预处理包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI)、化疗剂和/或抗体免疫疗法中的至少一种。
79.权利要求78的方法,其中所述TBI包括在选自由1-7.5Gy和1-3.5Gy所组成的组中的范围内的单次或分次照射剂量。
80.权利要求78的方法,其中所述化疗剂包括白消安、氟达拉滨、美法仑和塞替派中的至少一种。
81.权利要求78的方法,其中所述抗体包括抗-CD52抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体和抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
82.权利要求48或49的方法,其中所述环磷酰胺的所述浓度为每千克体重约100-200或约100mg。
83.权利要求48或49的方法,其中以单次剂量或以两次剂量施用所述环磷酰胺。
84.权利要求83的方法,其中所述两次剂量的各次包含每千克体重约50mg的浓度。
85.权利要求83的方法,其中在步骤(a)后的第3和4天施用所述两次剂量的各次剂量。
86.权利要求48或49的方法,其中所述受试者患有恶性病。
87.权利要求86的方法,其中所述恶性病是造血癌症。
88.权利要求48或49的方法,其中所述受试者患有非恶性病。
89.权利要求48或49的方法,其中所述细胞或组织移植物包含未成熟造血细胞。
90.权利要求48或49的方法,其中所述细胞或组织移植物选自由肝脏、胰脏、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠和淋巴/造血组织或器官所组成的组。
91.权利要求90的方法,其中在将所述剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到所述受试者之前、同时或之后,将所述细胞或组织移植物移植到该受试者中。
92.权利要求90的方法,其中所述细胞或组织移植物包含几个器官的共同移植。
93.权利要求91的方法,其中所述细胞或组织移植物和所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞从同一供体获得。
94.治疗需要未成熟造血细胞移植的受试者的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞的分离;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
95.治疗需要未成熟造血细胞移植的受试者的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞
5
被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细胞,并且其中
6
所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞是基于选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b所组成的组中的至少一种T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得的;并且随后
(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
96.治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:
(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;
(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试者中,其中所述T细胞
5
被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细胞,并且其中
6
所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞与所述未成熟造血细胞的分离是基于由所述T细胞分泌的产物来实施的;并且随后(c)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
97.治疗需要未成熟造血细胞移植的受试者的方法,所述方法包括:
(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,其中所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;
(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试者中,其中所述T细胞
5
被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3+T细胞,并且其中
6
所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞是基于选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b所组成的组中的至少一种T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得的;并且随后
(c)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
98.在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被
5 +
耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所
6
述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞与所述未成熟造血细胞的分离是基于由所述T细胞分泌的产物来实施的;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。
99.在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:
(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞
5 +
被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中
6
所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞是基于选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b所组成的组中的至少一种T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得的;并且随后
(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。

说明书全文

使用针对T/B细胞耗尽的特异性方案的用于稳定和长期植

入的联合疗法

[0001] 相关申请
[0002] 2011年12月22日提交的美国临时专利申请号61/578,917,以如在本文中完全阐述的方式通过引用将其加入。
[0003] 技术领域和背景技术
[0004] 本发明在其一些实施方案中涉及用于获得稳定和长期的细胞或组织移植的联合疗法。
[0005] 采用全单倍型的不匹配的单倍体同一性供体作为用于造血干细胞移植(HSCT)的替代源是非常有吸引的,因为几乎所有的患者都具有可容易得到的单倍体同一性家庭成员,其可以充当HSCT供体。避免致命的移植物抗宿主病(GVHD)的危险和在白血病患者中运用严格单倍体同一性T细胞被耗尽骨髓移植(TDBMT)的早期尝试表明,移植物内没有供体T细胞导致高的移植物排斥率,由残余的耐放疗和化疗的得自宿主的T细胞(HTC)介导。为了克服这个障碍,考虑了TDBM细胞的“大剂量”,其可克服这种HTC介导的免疫障碍,并且即使在使用完全不匹配的鼠类品系组合时也可被成功移植[Bachar-Lustig等人,Nat Med.+(1995)1:1268-1273]。随后它还表明在作为啮齿动物的人类中,CD34 造血干细胞剂量增加可用于克服基因障碍,使得接下来的纯化的HSCT令人满意的存活率成为可能[Reisner Y和Martelli MF.Immunol Today.(1995)16:437-440以及美国专利号5,806,529]。
[0006] 虽然纯化的“大剂量”CD34+HSCT的使用使得在白血病患者中单倍体同一性移植称为可能,但是对于所有的T细胞被耗尽移植体的一个主要缺点是受体的免疫系统的缓慢恢复速率。这归因于移植前大量的免疫烧蚀预处理方案、该移植物内注入的低数目的供体T+细胞和成年受体降低的胸腺功能。因此,在单倍体同一性CD34 干细胞移植物的成年受体中,显著的移植相关死亡率(TRM)由机会性感染引起。
[0007] 正在开发几种方法来应对这一挑战。这包括新颖的方式来改善胸腺功能、抗病毒特异性T细胞的移植后过继转移、部分多克隆的宿主非反应性异体耗尽的T细胞的转移或用诱导性自杀基因转染的完全多克隆的T细胞的转移。一种保护宿主免疫的替代性和其它的方法是使用降低强度预处理(RIC)。该非清髓性方法不用大量的宿主免疫细胞,因而可通过改进移植后免疫重建和减少与预处理剂相关的毒性两者减少TRM。由于通过存活的宿主T细胞呈现的实质性免疫障碍,RIC下的单倍体同一性移植甚至更加复杂。最近尝试克服这一障碍,主要是利用非T细胞被耗尽移植物,这使高植入率成为可能,但是牺牲了GVHD增加的速率。对于在RIC下施加单倍体同一性移植的另一种方法使用CD3/CD19耗尽移植物,它+不仅包含CD34 干细胞,而且还包含CD34阴性原本、NK、移植物促进细胞和树状细胞,然而,这也牺牲了GVHD和TRM增加的速率。
[0008] 在20世纪70年代George Santos在啮齿动物中证明,,骨髓移植(BMT)不久后高剂量环磷酰胺(CY)的短过程针对活化的供体或同种异体反应性宿主T细胞[Owens AH Jr和GW.S.Transplantation.(1971)11:378-382]。由于它们的解毒酶脱氢酶的高表达,观察到环磷酰胺对造血干细胞为无毒的,并且Slavin等人进一步证明了高剂量的环磷酰胺给药可减少老鼠中的GVHD和移植物排斥,而对干细胞植入没有不利的影响[Brodsky RA和RJ.J.Lancet.(2005)365:1647-1656]。由ohn Hopkins and Fred Hutchinson Cancer Research Center组的临床试验,评估了环磷酰胺、氟达拉滨和2Gy TBI的非清髓性方案,和具有环磷酰胺(50mg/kg天+3和+4)、MMF(天+5至+35)和他克莫司(天+5至+180)移植后GVHD预防[Luznik L等人,Biology of blood and marrow transplantation:journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation.(2008)14:641]。据由他们的教导可见的,这种方案导致高的复发率,这可能是由于非清髓性预处理的差的疾病消灭和缺乏与移植物抗白血病(GVL)效应相关的GVHD[Munchel A等人,Pediatric Reports(2011)3:43-47].
[0009] 已经尝试了用于实现同种异体造血干细胞的稳定植入的其它方法,一些在美国专利申请号20110110909、美国专利申请号20050118142、美国专利申请20070098693号、美国专利号5,876,692、美国专利号5,514,364、美国专利号6,217,867、美国专利号5,635,156、美国专利申请号20060140912、美国专利申请号20040005300、美国专利申请号
20070141027、美国专利申请号20030017152、美国专利申请号20030165475和美国专利申请号20010009663中得到描述。

发明内容

[0010] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重5 + 6
小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特别结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到经预处理的受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体5 + 6
重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10个CD34+细胞,并且其中所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括包括全身照射(TBI)和化疗剂;(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者5 +
的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约
6
5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;(ii)通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;并且随后(c)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0013] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每5 +
千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的
6
体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离而获得,该分离通过一种方法,其包括:(i)将抗体添加至与表面标记特异性结合的未成熟造血细胞,其中用磁性敏感剂标记所述抗体;(ii)[0014] 通过磁场将与标记有所述磁性敏感剂的所述抗体特异性结合的所述未成熟造血细胞固定在基体中;(iii)洗涤所述基体以移除未结合的细胞;和(iv)移除所述磁场以从所述基体洗脱经结合的细胞;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。
[0015] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重5 + 6
小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0016] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重5 + 6
小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10个CD34+细胞,并且其中基于至少一种选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b的T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0017] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟造血细胞或组织移植的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5 + 6
5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0018] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟造血细胞或组织移植的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5 + 6
5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于至少一种选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b的T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞;并且随后(b)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0019] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法,该方法包括:(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重5 + 6
小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离;并且随后(c)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0020] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了治疗需要未成熟造血细胞或组织移植的受试者的方法,所述方法包括:(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者5 +
的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约
6
5×10 个CD34+细胞,并且其中基于至少一种选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITRCD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b的T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞;
并且随后(c)给受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0021] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每5 +
千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的
6
体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于由所述T细胞分泌的产物实施所述将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。
[0022] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供了在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每5 +
千克该受试者的体重小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的
6
体重至少约5×10 个CD34+细胞,并且其中基于至少一种选自4-1BB、FoxP3、CD154、CD4、CD8、CD25、GITR CD137、潜伏性TGF-β(LAP)、GARP(LRRC32)和CD121a/b的T细胞的表面标记的表达通过将所述T细胞与所述未成熟造血细胞分离来获得所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此诱发该受试者中的特异性耐受性。
[0023] 根据本发明的一些实施方案,所述方法还包括在步骤(a)之前在降低强度预处理下预处理该受试者。
[0024] 根据本发明的一些实施方案,所述方法还包括在步骤(a)之前采用体内T细胞减灭(debulking)预处理该受试者。
[0025] 根据本发明的一些实施方案,一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每6
千克该受试者的体重5-40×10 个CD34+细胞。
[0026] 根据本发明的一些实施方案,一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每6
千克该受试者的体重至少约10×10 个CD34+细胞。
[0027] 根据本发明的一些实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞选自T细胞被耗尽的骨髓细胞、T细胞被耗尽的G-CSF流动的(mobilized)外周血祖细胞、T细胞被耗尽的脐带血、通过从骨髓和/或从G-CSF流动的外周血祖细胞的阳性选择获得的纯化CD34+细胞、+和体外扩增的CD34 细胞。
[0028] 根据本发明的一些实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试6 + -
者的体重小于1×10 的CD8TCRα/β 细胞。
[0029] 根据本发明的一些实施方案,通过MACSTM来获得T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0030] 根据本发明的一些实施方案,当表面标记为T细胞表面标记时,未结合的细胞包含T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0031] 根据本发明的一些实施方案,所述T细胞表面标记选自CD2、CD3、CD4、CD8和TCRα/β。
[0032] 根据本发明的一些实施方案,当表面标记为未成熟造血细胞表面标记时,未结合的细胞包含T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0033] 根据本发明的一些实施方案,未成熟造血细胞表面标记选自CD34、CD33和CD131。
[0034] 根据本发明的一些实施方案,所述方法还包括通过使用与B细胞表面标记特异性结合的抗体将B细胞与T细胞被耗尽的未成熟造血细胞分离。
[0035] 根据本发明的一些实施方案,B细胞表面标记选自CD19抗体和CD20。
[0036] 根据本发明的一些实施方案,所述基体为磁性基体。
[0037] 根据本发明的一些实施方案,所述基体包含磁性灵敏材料或铁磁性材料的球。
[0038] 根据本发明的一些实施方案,所述磁性敏感剂包含超顺磁性颗粒。
[0039] 根据本发明的一些实施方案,所述超顺磁性颗粒与所述与抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白和或抗-半抗原-特异性微珠组合的抗体接合。
[0040] 根据本发明的一些实施方案,使用高梯度磁性分离(HGMS)来实施将T细胞与未成熟造血细胞分离。
[0041] 根据本发明的一些实施方案,使用分离柱来实施将T细胞与未成熟造血细胞分离。
[0042] 根据本发明的一些实施方案,所述抗体选自抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、抗-TCRα/β抗体、抗-CD19抗体、和抗-CD20抗体、抗-CD21抗体、抗-CD34抗体、抗-CD33抗体和抗-CD131抗体。
[0043] 根据本发明的一些实施方案,由非同基因的供体获得T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0044] 根据本发明的一些实施方案,非同基因的供体相对于所述受试者是同种异体或异种的。
[0045] 根据本发明的一些实施方案,同种异体的供体选自HLA匹配的同胞、与HLA匹配无关的供体、与HLA单倍体同一性相关的供体和显示一个或多个不同的HLA决定簇(determinant)的供体。
[0046] 根据本发明的一些实施方案,受试者是人类受试者。
[0047] 根据本发明的一些实施方案,通过抗体实施体内T细胞减灭。
[0048] 根据本发明的一些实施方案,所述抗体包括抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体、抗-CD52抗体和抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
[0049] 根据本发明的一些实施方案,降低强度预处理包括非清髓性预处理。
[0050] 根据本发明的一些实施方案,非清髓性预处理包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI)、化疗剂和/或抗体免疫疗法中的至少一种。
[0051] 根据本发明的一些实施方案,TBI包括在选自1-7.5Gy和1-3.5Gy的范围内的单次或分次照射剂量。
[0052] 根据本发明的一些实施方案,所述化疗剂包括白消安、氟达拉滨、美法仑和塞替派中的至少一种。
[0053] 根据本发明的一些实施方案,所述抗体包含抗-CD52抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体和抗-CD3(OKT3)抗体中的至少一种。
[0054] 根据本发明的一些实施方案,环磷酰胺的浓度为每千克体重约100-200mg或约100mg。
[0055] 根据本发明的一些实施方案,以单次剂量或以两次剂量施用环磷酰胺。
[0056] 根据本发明的一些实施方案,两次剂量每次包含每千克体重约50mg的浓度。
[0057] 根据本发明的一些实施方案,在步骤(a)后的第3和4天施用所述两次剂量的每次剂量。
[0058] 根据本发明的一些实施方案,所述受试者具有恶性病。
[0059] 根据本发明的一些实施方案,恶性病是造血癌症。
[0060] 根据本发明的一些实施方案,所述受试者具有非恶性病。
[0061] 根据本发明的一些实施方案,所述细胞或组织移植物包含未成熟造血细胞。
[0062] 根据本发明的一些实施方案,所述细胞或组织移植物选自肝脏、胰脏、脾脏、肾脏、心脏、皮肤、肠和淋巴/造血组织或器官。
[0063] 根据本发明的一些实施方案,在将该一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中之前、同时或之后,将所述细胞或组织移植物移植到受试者中。
[0064] 根据本发明的一些实施方案,所述细胞或组织移植物包含几个器官的共同移植。
[0065] 根据本发明的一些实施方案,所述细胞或组织移植物和T细胞被耗尽的未成熟造血细胞是从同一供体获得。
[0066] 根据本发明的一些实施方案,使用抗体实施分离。
[0067] 根据本发明的一些实施方案,将抗体与荧光染料、半抗原活磁性颗粒连接。
[0068] 根据本发明的一些实施方案,使用流式细胞术或磁性细胞分选进行分离。
[0069] 根据本发明的一些实施方案,磁性细胞分选包括MACSTM。
[0070] 根据本发明的一些实施方案,基于由所述T细胞分泌的所述产物的所述将T细胞与所述造血细胞分离包括分离标记有分泌产物的T细胞,其中所述T细胞与特异性结合通过所述T细胞分泌的产物的捕获部分连接,并且其中在其中分泌产物并将该产物与所述捕获部分结合的条件下培养所述T细胞,由此制备标记有所述分泌产物的T细胞,其中所述T细胞不被所述方法溶解并且其中用标记部分标记所述分泌产物。
[0071] 根据本发明的一些实施方案,还包括基于由所述B细胞分泌的产物的将所述B细胞与所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞分离,包括分离标记有分泌产物的B细胞,其中所述B细胞与特异性结合由所述B细胞分泌的产物的捕获部分连接,并且其中在其中分泌产物并将该产物与所述捕获部分结合的条件下培养所述B细胞,由此制备标记有所述分泌产物的B细胞,其中所述B细胞不被所述方法溶解并且其中用标记部分标记所述分泌产物。
[0072] 将理解的是,本教导可以与其它耐受性诱发方案一起使用,例如PCT公开号WO2001/49243、WO2007/023491和WO2010/049935中描述的那些,通过引用以其整体并入本文。
[0073] 除非另有定义,本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与由本发明所涉及的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试中,但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下,以包括定义的本专利说明书为准。此外,所述材料、方法和实施例仅为说明性的,而并非旨在进行必要的限制。附图说明
[0074] 参考附图举例描述了本文中的本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图,需要强调的是所示的细节是举例并且出于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这点上,取自附图的描述使得如何实践本发明的实施方案对于本领域的技术技术人员来说是清楚的。
[0075] 在附图中:
[0076] 图1A-B是说明了在“大剂量”严格移植T细胞被耗尽的BM和后移植环磷酰胺后的不匹配的供者骨髓(BM)的持久植入的图。第-6天使用抗-CD4和抗-CD8抗体采用T细胞减灭(TCD)并且第-1天通过暴露于2.0Gy的全身照射(TBI)来预处理小鼠。在移植后第+3和+4天给高剂量环磷酰胺(CY,100mg/kg)剂量。在移植后第35天(图1A)和95天(图1B)对供者型嵌合状态进行了评估。
[0077] 图2A-C是说明了典型的FACS嵌合状态分析的点图。图2C描绘了在采用“大剂6
量”(25×10)的严格T细胞被耗尽的BM移植并采用高剂量的CY治疗的受体中获得混合的
6
嵌合状态。相比之下,仅接受预处理方案(图2A)或仅接种有5×10 个BM细胞和CY的受体老鼠并没有表现出供体型嵌合状态(图2B)。
[0078] 图3是说明了采用“大剂量”(25×106)T细胞被耗尽的BM移植并且采用高剂量CY治疗的受体老鼠中在移植后第180和225天的持久混合嵌合状态的图。要注意的是,该接6
种有5×10 个T细胞被耗尽的BM和CY的老鼠并没有表现出混合嵌合状态。
[0079] 图4A-B说明了嵌合状态老鼠中的供体型或第三方皮肤移植物的移植。图4A6
是说明了在移植后第+3和+4天采用高剂量CY治疗的具有常规剂量(5×10)或“大剂
6
量”(25×10)T耗尽的BM的受体中供体型(Balb/c)或第三方(C57BL/6)皮肤移植物的接受(由“+”标记)或排斥(由“-”标记)的图。图4B为在移植后第+3和+4天采用高剂量
6
CY治疗的具有“大剂量”(25×10)T耗尽的BM的受体中供体型(Balb/c)皮肤植入物(白色毛皮)或第三方(C57BL/6)皮肤植入物(黑色毛皮)的照片。
[0080] 图5是说明了不同剂量的照射对在具有“大剂量”(25×106)T耗尽的BM并且采用高剂量CY后移植物治疗的受体老鼠中的供体型嵌合状态的影响的图。
[0081] 图6是说明了增加剂量的环磷酰胺(CY)对具有“大剂量”(25×106)T耗尽的BM和2Gy TBI的受体中的受体型嵌合状态的影响的图。
[0082] 图7是说明了通过结合“大剂量”CD8+T细胞被耗尽的BM和后植入(trasplant)+CY实现的不匹配的供体BM的植入的图。要注意的是,来自BM制剂中残留的CD8T细胞的耗尽并未对在结合“大剂量”T细胞被耗尽的BM细胞与后植入CY时实现的嵌合状态的平造成任何不利影响。

具体实施方式

[0083] 本发明在其一些实施方案中涉及用于获得稳定和长期的细胞或组织移植的联合疗法。
[0084] 参考附图和伴随的描述可更好地理解本发明的原理和操作。
[0085] 在详细解释本发明的至少一个实施方案前,应当理解本发明并不必将其应用限制于下面的描述给出的或通过实施例例示的细节。本发明包括以各种方式实践或进行的其它实施方案。此外,要理解的是,本文中使用的习语和术语是出于描述的目的,而不应被视为限制。
[0086] 同种异体造血干细胞移植(HSCT)的应用受到了在家庭内或在无关的志愿捐赠者的国际登记处中缺乏可得到的HLA匹配的供体的限制。相反,几乎所有需要进行移植的患者有完整的单倍体型不匹配的家庭供体。
[0087] 从全单倍体型不匹配的相关供体的骨髓移植的主要障碍是移植物抗宿主病(GVHD)和移植物排斥反应。使用非常大量的造血干细胞与最少的残留T细胞污染和积极的免疫抑制和清髓性方案已导致植入具有很少的严重GVHD的高植入率。然而,在这种方法后免疫重建被延迟且不完整,并且显著的移植相关死亡(TRM)率由机会性感染引起。
[0088] 在将本发明还原至实践时,本发明人发现了可以通过严格的T细胞被耗尽的“大剂量”骨髓的移植和随后在移植后早期给受试者高剂量环磷酰胺来实现不匹配的骨髓的成功移植。本发明人示出了这样的方案仅需要短期的免疫清髓性预处理方案。本发明人还示出了这样的移植过程导致了长期和稳定的嵌合状态,并且实现了耐受性。
[0089] 如在下文和在接下来的实施例部分中所示的,本发明人经过繁复的实验揭示了“大剂量”T细胞被耗尽的骨髓移植(TDBMT)和移植后高剂量的环磷酰胺(CY)的结合允许不匹配的供体骨髓的耐久性植入(参见图1A-B和2A-C)。对于在移植后延长的时间段(在老鼠中移植后第180和225天,参见图3)表现出耐久的混合嵌合状态。重要的是,“大剂量”TDBMT和在移植后的高剂量CY的结合允许在降低强度预处理下的造血干细胞植入(参见图5),并导致如由供体皮肤移植物的接受所示的耐受性诱发(参见图4B)。
[0090] 因此,根据本发明的一个方面,提供了治疗需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受5
试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10+ 6
个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞;
并且随后(b)给该受试者以治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0091] 如本文中使用的,术语“治疗”包括消除、实质上抑制、减慢或逆转状况的进展,实质上改善状况的临床或美学症状,或实质性上预防状况的临床或美学症状的出现。
[0092] 如本文中使用的,术语“受试者”或“有此需要的受试者”是指哺乳动物,优选人类-为需要细胞或组织移植的任何年龄段的男性或女性。通常,由于通过细胞或组织移植而易于治疗的紊乱或病理或不希望的状况、状态或综合症或物理、形态学或生理异常,受试者需要细胞或组织移植(在本文中也称为受体)。
[0093] 根据一个实施方案,例如由于老化、创伤、外伤或导致器官功能丧失的任何病理状况,受试者需要组织再生(实体或软组织)。
[0094] 根据一个实施方案,受试者具有恶性病。
[0095] 根据一个实施方案,恶性病是造血癌症。
[0096] 示例性的造血癌症包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、急性粒细胞性白血病(AML)、急性非淋巴母细胞性白血病(ANLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、幼髓单核细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、结节外自然杀伤/T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变性大T/裸细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、未指定的T-细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)/慢性淋巴性白血病(CLL)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、结节外边缘区B细胞淋巴瘤-粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、膜细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、Lymphoplasmocytic淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈状真菌病和多发性骨髓瘤。
[0097] 根据一个实施方案,造血癌症包括白血病或淋巴瘤。
[0098] 根据一个实施方案,受试者具有非恶性病。
[0099] 根据一个实施方案,非恶性病是遗传性疾病或紊乱,自身免疫性疾病或代谢紊乱。
[0100] 示例性的非恶性病包括但不限于,重症联合免疫缺陷综合症(SCID)、镰状细胞贫血病(镰状细胞性贫血)、先天性嗜中性白细胞减少症、血小板减少症、再生障碍性贫血(例如重度再生障碍性贫血)、骨髓增生异常综合征、单倍体7、骨硬化症、高歇氏病、胡尔勒氏症、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、地中海贫血、先天性或基因决定的造血异常、腺苷脱酶(ADA)、狼疮、自身免疫性肝炎乳糜泻、I型糖尿病、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、重症肌无力、类湿性关节炎、硬皮病及屑病。
[0101] 根据一个实施方案,本发明的受试者可遭受通过细胞或组织移植可治疗的任何心血管疾病、类风湿疾病、腺体疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、肌肉疾病、肾脏疾病、结缔组织疾病、系统疾病和/或与生殖相关的疾病。
[0102] 如本文中使用的,短语“细胞或组织移植物”是指身体的细胞(例如单细胞或一组细胞)或组织(例如实体组织或软组织,其可以全部或部分被移植)。根据本发明的教导可以被移植的示例性组织包括但不限于肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠和淋巴/造血组织(例如淋巴结、淋巴集结、胸腺或骨骨髓)。,根据本发明的教导可以被移植的示例性细胞包括但不限于包括干细胞的未成熟造血细胞。本发明还考虑整个器官例如肾脏、心脏、肺、肝脏、胰腺或脾脏的移植。
[0103] 根据一个实施方案,该细胞或组织移植物包含未成熟造血细胞。
[0104] 根据一个实施方案,使用与受试者为非同基因的细胞或组织来实施该方法。
[0105] 取决于应用,可以使用与受试者为同种异体或异种的细胞或组织移植物来实施该方法。
[0106] 如本文中使用的,术语“同种异体的”是指源自于与受试体同一物种的供体、但与受试者为基本上非纯系的细胞或组织。通常,同一物种的远亲杂交、非同卵双生的哺乳动物彼此为同种异体的。将理解,同种异体供体相对于该受试者可以是HLA同一性或HLA非同一性的(即显示一个或多个不同的HLA决定因素)。
[0107] 根据一个实施方案,同种异体供体是HLA匹配的同胞、与HLA匹配无关的供体、与HLA单倍体同一性相关的供体或显示一个或多个不同的HLA决定因素的供体。
[0108] 如本文中使用的,术语“异种的”是指相对于相当比例的受试者的淋巴细胞细胞基本上表达不同物种的抗原的细胞或组织。通常,不同物种的远亲杂交的哺乳动物彼此为异种的。
[0109] 本发明设想,异种细胞或组织源自于各种物种,例如衍但不限于类(例如奶牛)、类(例如马)、猪类(例如猪)、羊类(ovids)(例如山羊、绵羊),猫类(例如家猫)、犬类(例如家犬)、啮齿类动物(例如家鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)或灵长类动物(例如黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。
[0110] 优选由已知免于人畜共通病(例如猪类内源性反转录病毒)的来源获得异种来源(例如猪类来源)的细胞或组织。类似地,优选由基本上无病原体的来源获得源自于人类的细胞或组织。
[0111] 根据本发明的一个实施方案,受试者和供体都是人类。
[0112] 取决于应用和可用的来源,可由产前有机体、产后有机体、成人或尸体供体获得本发明的细胞或组织移植物。此外,取决于所需的应用,所述细胞或组织移植物可以是幼稚的或遗传改性的。待使用的细胞或组织移植物的类型的确定充分地处于本领域普通技术人员的能力范围之内。此外,在本领域中已知的任何方法可用于获得细胞或组织移植物(例如用于移植)。
+
[0113] 如所提到的,将一定剂量的包括未成熟造血细胞(包括例如CD34)的T细胞被耗尽的造血细胞或组织移植到受试者中。
[0114] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞与受试者为非同基因的(例如同种异体或异种的)。
[0115] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞和所述细胞或组织移植物为同基因的(例如从同一供体获得)。
[0116] 如本文中使用的短语“未成熟造血细胞”是指包含前体造血细胞的造血组织或细胞制剂。这样的组织/细胞制剂包括或源自于生物样品,例如骨髓、流动的外周血(例如CD34细胞的流动,以提高它们的浓度)、脐带血(例如脐带)、胎肝、卵黄囊和/或胎盘。此外,可以根据本发明的教导使用纯化的CD34+细胞或其它造血干细胞例如CD131+细胞,具有或不具有体外扩增。
[0117] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞包含T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0118] 如本文中使用的短语“T细胞被耗尽的未成熟造血细胞”是指被耗尽T淋巴细胞的造血细胞群。T细胞被耗尽的未成熟造血细胞可包括例如CD34+、CD33+和/或CD56+细胞。T细胞被耗尽的未成熟造血细胞可被耗尽CD3+细胞、CD2+细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
[0119] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞包含T细胞被耗尽的G-CSF流动的富集CD34+未成熟造血细胞的血细胞。
[0120] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞被耗尽CD3+T细胞。
[0121] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小5 + 5 + 5 + 5 +
于50×10 个CD3T细胞、40×10 个CD3T细胞、30×10 个CD3T细胞、20×10 个CD3T细
5 + 5 + 5 + 5 +
胞、15×10 个CD3T细胞、10×10 个CD3T细胞、9×10 个CD3T细胞、8×10 个CD3T细
5 + 5 + 5 + 5 +
胞、7×10 个CD3T细胞、6×10 个CD3T细胞、5×10 个CD3T细胞、4×10 个CD3T细胞、
5 + 5 + 5 +
3×10 个CD3T细胞、2×10 个CD3T细胞或1×10 个CD3T细胞。
[0122] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小5 +
于5×10 个CD3T细胞。
5
[0123] 根据一个特定的实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含小于20×10 个+ +CD3T细胞,但大于10个CD3T细胞。
3 5
[0124] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含至少1×10-1×10 个3
CD+T细胞。
[0125] 根据一个实施方案,未成熟的造血细胞被耗尽CD8+细胞。
[0126] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小4 5 +
于1×10-5×10 个CD8 细胞。
[0127] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小5 + 5 + 5 + 5 +
于50×10 个CD8 细胞、25×10 个CD8 细胞、15×10 个CD8 细胞、10×10 个CD8 细胞、
5 + 5 + 5 + 5 + 5
9×10 个CD8 细胞、8×10 个CD8 细胞、7×10 个CD8 细胞、6×10CD8 细胞、5×10 个+ 5 + 5 + 5 + 5 +
CD8 细胞、4×10 个CD8 细胞、3×10 个CD8 细胞、2×10 个CD8 细胞、1×10 个CD8 细
4 + 4 + 4 + 4 + 4
胞、9×10 个CD8 细胞、8×10 个CD8 细胞、7×10 个CD8 细胞、6×10 个CD8 细胞、5×10+ 4 + 4 + 4 + 4 +
个CD8 细胞、4×10 个CD8 细胞、3×10 个CD8 细胞,2×10 个CD8 细胞或1×10 个CD8细胞。
[0128] 根据一个特定的实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的5 +
体重小于4×10 个CD8 细胞。
[0129] 根据一个特定的实施方案中,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含小于4×105个+ +CD8 细胞,但大于10个CD8 细胞。
[0130] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小6 +
于1×10 个CD8TCRα/β-细胞。
[0131] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小6 + - 6 + - 5 +
于1×10 个CD8TCRα/β 细胞、0.5×10 个CD8TCRα/β 细胞、1×10 个CD8TCRα/
- 5 + - 4 + - 4
β 细 胞、0.5×10 个 CD8TCRα/β 细 胞、1×10 的CD8TCRα/β 细 胞、0.5×10 个+ - 3 + - 3 + -
CD8TCRα/β 细胞、1×10 个CD8TCRα/β 细胞或0.5×10 个CD8TCRα/β 细胞。
[0132] 根据一个特定的实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克受试者的6 + -
体重小于1×10 个CD8TCRα/β 细胞。
[0133] 根据一个特定的实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含小于1×106个+ - + -CD8TCRα/β 细胞,但大于10个CD8TCRα/β 细胞。
[0134] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞被耗尽B细胞。
[0135] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞被耗尽B细胞(CD19+和/或CD20+B细胞)。
[0136] 根据一个实施方案,未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小于50×105个B5 5 5 5 5
细胞、40×10 个B细胞、30×10 个B细胞、20×10 个B细胞、10×10 个B细胞、9×10 个
5 5 5 5 5
B细胞、8×10 个B细胞、7×10 个B细胞、6×10 个B细胞、5×10 个B细胞、4×10 个B
5 5 5
细胞、3×10 个B细胞、2×10 个B细胞或1×10 个B细胞。
[0137] 根据一个特定的实施方案,未成熟造血细胞包含每千克受试者的体重小于4×1055
个B细胞。根据一个特定的实施方案,未成熟造血细胞包含小于50×10 个B细胞,但大于
10个B细胞。
[0138] T细胞例如CD3+、Cd2+、TCRα/β+、CD4+和/或CD8+细胞、或B细胞例如CD19+和/或CD20+细胞的耗尽,可使用本领域中已知的任何方法例如通过用特异性抗体根除(例如杀死)或通过基于亲和力的纯化例如通过使用从Miltenyi Biotec可获得的磁性活化细胞TM分选(MACS )(将在下文进一步描述)、FACS分选器和/或捕获ELISA标记来进行。
[0139] 在本文中以及在THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,Volumes1to4,(D.N.Weir,editor) 和 FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING(A.Radbruch,editor,Springer Verlag,1992)中描述了这样的方法。例如,例如通过流式细胞仪或FACS可以对细胞进行分选。因此,可以使用荧光活化的细胞分选(FACS),并且其可以有不同程度的颜色通道、低度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道。在本领域中已知的任何依赖于配体的分离技术可以与依赖于细胞的物理性质而不是抗体亲和力的正和负分离技术一起使用,其包括但不限于淘析和密度梯度离心。
[0140] 用于细胞分选的其它方法包括例如使用亲和力技术(包括使用固体载体例如板、珠和柱的那些技术)的淘选和分离。因此,可以通过“淘选”将生物样品与附着于固体基质(例如附着于板)的抗体分离。
[0141] 或者,可以通过磁性分离技术对细胞进行分选/分离,并且这些方法中的一些方法利用磁珠。不同的磁珠可从许多来源获得,包括例如Dynal(Norway)、Advanced Magnetics(Cambridge,MA,U.S.A.)、Immuncon(Philadelphia,U.S.A.),Immunotec(Marseille,France)、Invitrogen、Stem cell Technologies(U.S.A)、Cellpro(U.S.A)和Miltenyi Biotec GmbH(Germany)。或者,抗体可以被生物素化或偶联有地高辛配基,并与抗生物素蛋白或涂覆抗地高辛配基的亲和柱结合使用。
[0142] 根据一个实施方案,可以结合不同的耗尽/分离方法,例如可以将磁性细胞分选与FACS组合,以提高分离品质或允许通过多个参数的分选。
[0143] 根据一个实施方案,通过T细胞减灭(TCD)获得T细胞被耗尽的未成熟造血细胞。
[0144] 可以使用抗体来实施T细胞减灭,所述抗体包括例如抗-CD8抗体、抗-CD4抗体、抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、抗-TCRα/β抗体和/或抗-TCRγ/δ抗体。
[0145] 根据一个实施方案,通过B细胞减灭来实施B细胞的耗尽。
[0146] 可以使用抗体来实施B细胞减灭,所述抗体包括例如抗-CD19或抗-CD20抗体。或者,可以通过注入抗-CD20抗体来实现B细胞的体内减灭。
[0147] 或者,可以使用例如如上面更详细地描述的磁性细胞分离技术(例如MACSTM)、FACS分选器和/或捕获ELISA标记来进行CD34+或CD131+干细胞的阳性选择。
[0148] 接下来是根据本发明在未成熟造血细胞的移植之前从其耗尽所关注的细胞(例如T和/或B细胞)群:
[0149] I.根据PCT公开号WO2007/110249和美国专利号8,129,126(通过引用以其全文并入本文)的教导分离活化的调节T辅助细胞:
[0150] 根据一个实施方案,提供了通过使用4-1BB受体将活化的调节CD4+CD25+T辅助(Th)细胞与细胞制剂(例如未成熟造血细胞)分离的方法。
[0151] 可以通过一种和/或多种标记的表达来识别和/或分离所述调节细胞。出于这种目的可以采用本领域技术人员已知的用于识别和/或分离的任何标记。示例性标记是4-1BB、CD25、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)、GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体)、FoxP3、IL-10、CD69、CD40L、ICOS、OX40和TGFbeta,这些标记可以单独或组合使用。出于该目的,还可以组合采用本领域技术人员已知的用于非调节细胞的排除或耗尽的所有标记。
然而,在特别的实施方案中,4-1BB受体(CD137)用作活的活化调节细胞的标记。
[0152] II.根据美国专利申请号20110097313(通过引用以其整体并入本文)的教导分离T调节细胞或非调节T细胞:
[0153] 根据一个实施方案,提供了通过使用CD154分子[CD40配体(CD40L)]将调节T细胞(Tregs)或非调节T细胞(常规T细胞)与细胞制剂(例如未成熟造血细胞)分离的方法。
[0154] 由于活化的Treg细胞(CD4+CD25+Treg)不表达CD154,因而本发明考虑使用能够识别CD154的试剂(例如抗-CD154抗体)来分离活化(例如抗原活化)的常规T细胞(CD154+细胞)与Treg(CD154-细胞)。
[0155] 因此,根据一个实施方案,本发明提供了使用能够识别CD154的试剂将活化的Treg细胞与细胞制剂(例如未成熟造血细胞)分离的方法。本发明还考虑了使用对于调节细胞为特异性的其它标记例如CD25、GITR、CTLA4,或对于活化的调节T细胞为特异性的标记例如CD137、"潜伏性TGF-β(LAP)"、GARP(LRRC32)、CD121a/b,用于Treg的阳性选择。
[0156] 根据另一个实施方案,提供了使用CD154标记从细胞制剂(例如未成熟造血细胞)获得活化的常规T辅助(Th)细胞的方法。特别地,使用CD154标记,可以从细胞制剂(包含调节T细胞)移除活化的常规Th细胞(表达CD154的细胞),特别是当同时或随后使用其它的使用标记用于活化/非活化的调节细胞(分别为CD137和CD25)的选择方法时,这允许本发明用于识别孤立的抗原-特异性调节Th细胞的用途。
[0157] 因此,在从供体和/或受试者获得细胞制剂(例如未成熟造血细胞)后,可以使用例如CD25使调节T细胞富集。随后可以采用特定的抗原刺激这些细胞。出于这个目的,可以使用抗体、肽、蛋白质、化学物质(或其混合物)、或邪气(pathogen)或细胞。在特定的活化时间后,通过使用CD137标记来识别和/或分离该调节Th细胞。由此,优选识别和/或分离抗原-特异性的调节Th细胞。
[0158] III.根据美国专利号7,659,084(通过引用以其整体并入本文)的教导分离抗原特异性T细胞:
[0159] 根据一个实施方案,提供了CD154[CD40配体(CD40L)]用于抗原特异性T细胞的隔离的用途,其中使细胞制剂(例如未成熟造血细胞)与CD40/CD154系统抑制剂接触
[0160] 根据本发明的一个实施方案,T细胞是T辅助(Th)CD4+或CD8+Th淋巴细胞。
[0161] 根据本发明的一个实施方案,检测和/或获得炎症性、抗炎症性、调节和/或抑制的T细胞。
[0162] 本发明还涉及用于在采用抗原活化后隔离细胞制剂(例如未成熟造血细胞)中的抗原特异性T细胞的方法,在所述方法中使细胞制剂(例如未成熟造血细胞)与CD40/CD154系统抑制剂接触,实施CD154的细胞内和/或细胞外测定,并且隔离具有CD154的细胞。
[0163] 将理解细胞制剂(例如未成熟造血细胞)与CD40/CD154系统抑制剂这样的接触允许CD154的细胞内和/或细胞外测定,并且因此允许具有CD154的细胞、特别是代表整个抗原特异性CD4+Th淋巴细胞的细胞的隔离或分离。
[0164] 特别地,CD40/CD154系统抑制剂的添加损害或抑制CD40与CD154之间的相互作用或信号。在本发明的含义内,CD40/CD154系统抑制剂可为能够阻碍或抑制CD40与CD154之间的相互作用的任何分子或甚至物理曝光。
[0165] 因此,抑制剂可以是抗体,例如定向抵抗CD40的抗体或定向抵抗CD154的抗体、对CD40与CD154之间的相互作用具有影响的分子、铯或锂离子。该试剂还可以是抑制细胞中的分泌或胞吞作用的物质,例如布雷菲德菌素A(Bref-A)和/或莫能菌(monsensin)。布雷菲德菌素是布雷菲德真菌青霉(Penicillium brefeldianum)的代谢物,并且为羧化物离子载体,阻碍了新合成的蛋白质从内质(endoplasmatic)网状组织输送到高尔基体中并且损害内颗粒与溶菌酶(lysome)之间的交换,而细胞膜与内颗粒之间的循环保持不受打扰。
[0166] 这些物质确保了以这样的方式对CD40、CD154、它们两者之间的相互作用、或CD40/CD154系统进行改性使得CD154在细胞表面上不再下调和/或劣化,或者假设其仍然在细胞内,不再在其中输送。细胞内这样的输送中断防止CD154的劣化。因此,CD154在细胞内或外作为外部受体得到稳定化,由此允许使用本领域技术人员公知的检测方法的检测和随后的隔离(在本文中进一步详细解释)。
[0167] IV.根据PCT公开号WO94/09117和美国专利号7,166,423(通过引用以其全文并入本文)的教导分离细胞:
[0168] 根据一个实施方案,提供了用于将细胞与基于一种或多种选自由这些细胞(例如细胞活素,包括但不限于IFNγ、IL1、IL2、IL4、IL10、IL12、TGF-β、TNF、GM-CSF和SCF、抗体、激素、酶和蛋白质)分泌的产物的细胞制剂(例如未成熟造血细胞)分离的方法。该方法允许在细胞(例如B细胞或T细胞)的表面处捕获由细胞(例如B细胞或T细胞)分泌的产物。捕获的产物允许根据产物存在、不存在或存在量来分选该细胞(例如B细胞或T细胞)。捕获的手段包含捕获部分,其通过适合于分选细胞的手段而锚定于细胞表面。
[0169] 捕获部分可以任选地通过连接部分与锚定手段(“锚定部分”)连接,并且还可包括连接部分,该连接部分扩大可得到的捕获部分的数目并且因此扩大产物例如分枝聚合物(例如改性的葡聚糖分子、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷)的捕获潜力。
[0170] 对于细胞表面合适的锚定部分包括亲脂性分子例如脂肪酸。合适的细胞表面分子的实例包括但不限于与细胞表面相关的任何分子。合适的分子包括但不限于细胞表面标记例如CD45(平底白细胞)、CD3(T细胞(活化的))、CD4、CD8、CD19、CD20、CD14、CD16、CD15、I类MHC和II类MHC分子、CD34、CD38、CD33、CD56T细胞受体、Fc受体、β2微球蛋白或免疫球蛋白和其它CD标记或细胞粘附分子。或者,还可以使用抗体或与细胞表面分子特异性结合的其它试剂例如MHC抗原或糖蛋白。
[0171] 特异性结合配偶体包括捕获部分和标记部分。捕获部分是附接于细胞(直接或间接)和产物两者的那些。标记部分是附接于产物并且可为直接或间接被标记的那些。特异性结合配偶体包括任何部分,对于其在产物和其结合配偶体之间存在相对高的亲和力和特异性,并且其中产物:配偶体复合体的解离相对缓慢使得在标记或细胞分离技术过程其中检测该产物:配偶体复合体。
[0172] 特异性标记部分可以包括但不限于荧光染色(fluorochromated)的抗产物抗体,其可包括接合磁珠的、接合胶体珠的、FITC、藻红蛋白、PerCP、AMCA、荧光颗粒或接合脂质体的抗体。
[0173] 特异性结合配偶体可包括但不限于产物将结合的衬底或衬底类似物。这些衬底包括但不限于肽、多糖、甾、生物素、洋地黄毒苷、洋地黄皂苷或能够结合该分泌的产物的其它分子,并且在一个特别的实施方案中其将包括抗体。当捕获部分为抗体时,其可称为“捕获抗体”或“捕捉抗体”。如本文中使用的,术语“抗体”旨在包括多克隆或单克隆的。
[0174] 如本文中使用的,术语“抗体”旨在包括多克隆或单克隆的抗体、嵌合抗体、半抗原和抗体碎片、双特异性抗体和为抗体等效物的分子(它们与产物抗原上的表位特异性结合)。双特异性抗体,也称为双功能抗体,具有至少一个用于第一抗原的抗原识别部位和至少一个用于第二抗原的抗原识别部位。可以通过重组DNA方法或化学上通过本领域中已知的方法来制备这样的抗体。化学上产生的双特异性抗体包括但不限于已经被复位和重整从而保留它们的二价特性的抗体和已经被化学上连接使得它们具有至少两个用于每个抗原的抗原识别部位的抗体。双特异性抗体能够识别两种不同的抗原的所有抗体或抗体连接体或聚合物形式的抗体。可将抗体固定在聚合物或颗粒上。
[0175] 根据一个实施方案,可以通过各种方法将捕获部分附接于细胞膜。合适的方法包括但不限于直接化学连接至蛋白质组分的氨基;与蛋白质组分的硫醇(在二硫键的还原后形成)连接;通过抗体(包括抗体对)的间接连接;通过疏水性锚定部分在脂双层中锚定;和通过多聚阳离子与带负电荷的细胞表面结合。
[0176] 在本发明的其它实施方案中,使用两个或更多个步骤引入捕获部分,例如通过采用至少一个锚定部分标记该细胞,所述锚定部分允许捕获部分与锚定部分直接(例如通过生物素/抗生物素蛋白合成物)或间接(通过一种或多种合适的连接部分)的连接。
[0177] 用于抗体与细胞的直接化学连接的方法在本领域是已知的并且包括例如使用戊二醛或马来酰亚胺活化的抗体连接。用于使用多步骤过程的化学连接的方法包括例如生物素标记、使用例如这些化合物的琥珀酰亚胺酯的TNP或地高辛配基的连接。例如可以通过使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺完成生物素化作用。琥珀酰亚胺基团与氨基在高于7、且优选约pH8.0至约pH8.5的pH值下有效反应。例如还可以通过采用二硫苏糖醇(DTT)接着添加生物素马来酰亚胺处理该细胞来完成生物素化作用。
[0178] 还可使用抵抗细胞表面抗原的抗体(“标记”)来完成与细胞的连接。可需要通常7
指向表面抗原的抗体处于每10 个细胞约0.1至1μg的抗体的范围内,然而,这要求将变化巨大以响应抗体对产物的亲和力并且将需要根据经验来测定。这样的测定完全在本领域技术人员范围内。因此,抗体的合适的量必须根据经验来测定并且在本领域技术人员范围内。这允许在细胞型特异性标记表达上连接特异性细胞。例如可特异性地标记基于例如T细胞或其亚群的细胞类。作为捕获部分,可使用双特异性抗体,其具有用于细胞的抗原识别部位或置于其上的锚定部分以及产物。
[0179] 应该基于分泌产物的量来选择捕获部分,特别是捕获抗体。例如,对于仅分泌少量分子的细胞,应该选择高亲和力抗体从而捕捉大部分分泌的分子。或者,在其中细胞在孵化时间期间分泌许多分子的情况下,可以优选较低亲和力抗体来防止捕捉基体的过早饱和。对于所分泌的蛋白质水平的合适亲和力的确定根据经验来测定并且在本领域技术人员范围内。
[0180] 在本发明的一些实施方案中,通过疏水性锚定部分到细胞膜将捕获部分与细胞连接。将与膜的脂双层反应的合适的疏水性锚定部分在本领域中是已知的并且包括但不限于脂肪酸和非离子型洗涤剂(包括例如Tween-80)。捕获部分通过锚定部分的插入而附接于细胞的缺点在于锚定部分集成到细胞中的速率为低的。因此,经常需要高浓度的锚定部分。当捕获部分是相对有限或昂贵的物质例如抗体时,后者的这个情况经常是不经济的。将它们自身嵌入膜中的疏水性部分的低产率仅在这些分子以相对优先的数量可得到时为有关的。可以通过使用包括锚定部分和捕获部分的桥键系统克服这个问题,其中一个部分具有较高的可获得性,并且其中桥键系统的两个部分对于彼此具有高程度的特异性和亲和力。
例如,在一个实施方案中,通过疏水性锚定部分将抗生物素蛋白或抗生蛋白链霉素附接于细胞表面,而捕获部分是生物素化的抗产物抗体。
[0181] 在另一个实施方案中,采用地高辛配基将该细胞表面标记,接着采用对于地高辛配基和产物两者具有特异性的双特异性抗体。可将该方法与能够形成连接的其它分子对(例如具有抗半抗原抗体的半抗原或具有多组氨酸残基的NTA)一起使用。一个特别的实施方案是通过增加每个锚定部分的捕获部分的数目“放大”该系统的实施方案。
[0182] 在一个说明性的实施方案中,分枝葡聚糖与棕榈酸结合,从而提供大量可得到的结合部位。葡聚糖进而与生物素连接并且采用对于该产物为特异性的配合抗生物素蛋白的抗体来处理。在本发明的实施方案中当然考虑了当锚定部分以任何方式与细胞表面连接时可以在锚定部分与捕获部分之间使用连接部分。因此,例如抗生物素蛋白(或抗生蛋白链霉素)生物素连接部分可连接锚定部分与捕获部分。双特异性抗体还可充当连接体部分。
[0183] 为了选择具有分泌所关注的产物的能力的细胞,在允许以充足的量的产物制备和分泌的条件下培养如上所述经改性以含捕获部分的细胞,以便允许与包含捕获产物的细胞的结合和检测。这些条件对于本领域技术人员来说是已知的并且尤其是包括孵化介质中合适的温度、pH和盐的浓度、生长因子和衬底,以及气相中的气体的合适浓度。当需要区分高产生器(producer)细胞和低产生器细胞时,孵化时间使得由细胞的产物分泌仍然为线性期。合适的条件可根据经验来测定并且这样的测定在本领域技术人员范围内。
[0184] 此外,可以对细胞的分泌进行改性,这使用生物改性剂来上调、诱发或复位。合适的生物改性剂包括但不限于分子和其它细胞。合适的分子包括但不限于药物、细胞因子、小分子、激素、白细胞激素和其它刺激剂例如双特异性抗体和对细胞功能或蛋白质表达进行改性的其它试剂的组合。其它细胞包括但不限于直接的细胞至细胞(例如肿瘤与T细胞之间)相互作用和间接细胞至细胞相互作用,例如由分泌生物改性剂的其它细胞附近诱发的那些。合适的细胞包括但不限于血细胞、外周骨髓细胞(PBMC)和各种细胞系。可以在任何时间添加生物改性剂但优选将其添加至孵化介质。
[0185] 或者,可以在孵化步骤之间采用这些试剂或细胞预处理该细胞。孵化条件还使得由产生器细胞分泌的产物基本上不被另一个细胞捕获,从而区分非产生细胞与产生产物的细胞或高产生器与低产生器是可能的。通常孵化时间为5分钟至10小时并且更通常为1至5小时。孵化介质可任选地包括减缓分泌的产物从产生器细胞的扩散的物质。抑制液体介质中的产物扩散并且对于细胞为无毒的物质在本领域中是已知的并且包括例如各种部分或完全凝胶的物质,包括例如藻酸盐、低熔琼脂糖和明胶。
[0186] 通过改变介质的粘度或渗透性,可以调制具有一定尺寸的分泌产物的产生细胞的局部捕获。可以调整介质的分子量尺寸排除以优化反应。介质的优化组成可根据经验来测定并且受细胞浓度、产物的分泌水平和分子量和用于产物的捕获抗体的亲和力所影响。这样的测定在本领域技术人员范围内。
[0187] 优选地,在孵化后使凝胶溶解以允许通过细胞分选技术将细胞或细胞群与介质隔离。因此,例如凝胶可以通过二硫键连接,所述二硫键可以通过巯基还原剂例如3-巯基乙醇或DTT被裂解,或者凝胶可以包含离子型交联剂,包括例如通过添加螯合剂例如EDTA溶解的离子。
[0188] 在一个特别的实施方案中,在分泌期过程中,在凝胶状介质中孵化细胞,并且优选地渗入凝胶中的尺寸限制防止产物大量进入凝胶中。
[0189] 使用粘性或凝胶状介质来防止非特异性细胞交叉感染的备选或附加是提供用于捕获没有被分泌细胞上的细胞表面捕获的产物的捕获系统。例如,在其中许多细胞类型产生产物或如果在细胞之间不能产生足够的扩散阻挡的情况下可使用该技术。这可通过添加至围绕与来自上清液的抗体产品配合的细胞珠(例如胶乳珠)的介质来完成。或者,可利用具有固定的抗体或能够从该介质移除未结合的产物的其它部分。这些捕捉部分能够保留这些不想要的产物或防止它们通过结合至未保留的产物而与不分泌的细胞结合。这种“废物捕获系统”可包括固定至凝胶基体中或其可附接于磁性或其它类型的颗粒。应该调整该废物捕获系统的位置和捕捉特性使得将充足的产物分子与分泌细胞特异性接合,从而使非产生细胞上的背景最小化。
[0190] 在分泌期结束时,使凝胶基体(如果有的话)溶解。然后采用标记部分标记该包含捕获产物的细胞。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来完成标记。例如,可以使用抗产物抗体来直接或间接标记该包含产物的细胞。所使用的标记是适用于其中基于标记部分与产物的连接来分析或分选的细胞的那些。
[0191] 在其它实施方案中,可以检测不包含捕获产物的捕获部分。这允许例如通过采用阴性分离方法的分泌大量产物的细胞的隔离,即没有高度饱和有产物的细胞的检测。可以采用其它识别物质标记该细胞,其包括但不限于细胞表面标记、细胞类型、细胞参数例如DNA含量、细胞状态、或捕获部分的数目。
[0192] 例如由于细胞的不同配合电势,实际捕获部分的计数对于补偿这些分子的变化量为重要的。对于稀有细胞的隔离,排除具有增加或降低的用于结合产物捕获系统(包括锚定部分和捕获部分)的能力的细胞是特别重要的。
[0193] 基于标记的存在的细胞群和细胞分选的分析可以通过大量本领域中已知的技术来完成并且将在本文中得到进一步详细描述。
[0194] V.根据美国专利号6,576,428(通过引用以其全文并入本文)的教导分离抗原特异性T细胞:
[0195] 根据一个实施方案,提供了基于由这些T细胞(例如细胞因子或生长因子,包括但不限于IL-3、GM-CSF、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10和/或IL-13)分泌的一种或多种产物响应抗原刺激的抗原特异性T细胞与细胞制剂(例如未成熟造血细胞)的细胞分离的方法。该T细胞提供有用于产物的捕获部分(例如抗体),在一些情况下其随后可以直接用作标记,或者可以经由与产物特异性结合和标记有传统的标记材料例如荧光团、放射性同位素、生色团或磁性颗粒的标记部分(即可检测的部分)进一步标记该经结合的产物。随后使用基于这些标记的细胞分选技术将经标记的细胞分离。这样的技术包括流式细胞术、磁性梯度分离、离心等(如本文中进一步描述的那样)。
[0196] 根据一个实施方案,通过在有效引发至少一种T细胞的抗原特异性刺激的条件下将细胞制剂(例如未成熟造血细胞)暴露于至少一种抗原来实现抗原刺激。通过以下方法实现产物的标记:对细胞表面进行改性以包含至少一种捕获部分、在其中分泌、释放产物并将其与捕获部分特异性结合(“捕获”或“捕捉”)的条件下培养细胞;和采用标记部分标记该捕获的产物,其中经标记的产物不溶解为标记过程的一部分或分离过程的一部分。
[0197] 根据另一个实施方案,还可以使细胞制剂(例如未成熟造血细胞)经受一种或多种基于细胞表面标记的表达的分离方案。例如,可以使细胞经受基于一种或多种细胞表面多肽的表达的阳性选择,其包括但不限于“分化簇(CD)”细胞表面标记例如CD2、CD3、CD4、CD8、TCR、CD45、CD45RO、CD45RA、CD11b、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD40L;与淋巴细胞活化相关的其它标记,例如淋巴细胞活化基因3产物(LAG3)、信号淋巴细胞活化分子(SLAM)、T1/ST2;趋化因子受体,例如CCR3、CCR4、CXCR3、CCR5;归巢受体例如CD62L、CD44、CLA、CD146、α.4.β.7、α.E.β.7;活化标记,例如CD25、CD69和OX40;和由CD1表示的脂多糖。或者,还可以使细胞制剂(例如未成熟造血细胞)经受用于耗尽非T细胞和/或特别的T细胞亚群的阴性选择。可以基于各种分子(包括但不限于B细胞标记例如CD19和CD20;单核细胞标记CD14;NK细胞标记CD56)来进行阴性选择。
[0198] 如前所述,可以在体外或体内(例如在由其获取未成熟造血细胞前的供体中)实施T细胞或B细胞减灭。
[0199] 以下是根据本发明用于携带T/B细胞减灭的多个非限制性实施例。
[0200] I.根据PCT公开号WO2009/066180(通过引用以其全文并入本文)的MACSTM:
[0201] 根据一个实施方案,通过磁性活化细胞分选(MACSTM)实施T或B细胞(TCD和/或TMBCD)的体内减灭。因此,MACS 提供了用于特别的活细胞与活细胞群分离的手段。
[0202] 通常通过将抗体添加至与表面标记(在这种情况下为T/B细胞标记例如分化簇即CD,多肽)的细胞外表位特异性结合的细胞群来进行细胞分离。采用适合于细胞分选(细胞分离)的可检测的试剂例如荧光染料(例如FITC)或磁性敏感剂(例如珠)标记该抗体是有利的。
[0203] 因此,可以将该抗体与磁性敏感剂连接,因此,在足以特异性结合抗体与表位(抗原)的条件下该抗体用于分离与其结合的细胞。
[0204] 根据一个实施方案,并且如WO/2009/066180中所教导的,该方法还包括以下步骤:通过磁场将表达与标记有磁性敏感剂的抗体特异性结合的表面标记的细胞固定在铁磁性基体(下文进一步详细描述)中;洗涤基体以移除未结合的细胞;和移除磁场以从该基体洗脱细胞。由此,提供了富集表达表面标记的细胞或由表达表面标记的细胞组成的细胞样品。
[0205] 可以使用重力流动、离心、真空过滤或通过例如使用柱塞正压力来进行铁磁性基体的洗脱。
[0206] 如本文中使用的术语“磁性细胞分选”是指用于细胞分离的过程(细胞分选),其包括但不限于使用与胶体磁性颗粒连接的抗体的磁性分离、亲和色谱法和与单克隆抗体接合或与本领域中已知的任何依赖于抗体的分离技术结合使用的细胞毒素剂。
[0207] 在一个示例性实施方案中,可以将单克隆抗体与具有有机涂层例如多糖(Miltenyi等人.(1990)Cytometry11:231-238)的胶体超顺磁性微颗粒结合使用。这些颗粒可以使用具有10-200nm、优选40-100nm的尺寸,并且可以与抗体直接配合或与抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白或抗-半抗原-特异性微珠组合使用。涂覆有多糖的超顺磁性颗粒为从德国的Miltenyi Biotec GmbH可商购的。
[0208] 可以将如美国专利号4,770,183中描述的制备超顺磁性颗粒的方法与本教导结合使用。
[0209] 关于术语,其为本领域中的通常用法:
[0210] 如本文中使用的,术语“铁磁性”涉及强烈地易受磁场影响并且当移除该磁场后能够保留磁性性质的材料。仅在在晶体晶格中包含材料中未成对的电子时因而允许为成对的电极的耦合时出现铁磁性。
[0211] 如本文中使用的,术语“超顺磁性”涉及为高度磁性敏感的材料,即当置于磁场中时,它们变得强烈磁性的,但是快速丧失它们的磁力。当晶体直径降低至小于临界值时,在铁磁性材料中出现超顺磁性。
[0212] 将理解,通过颗粒获得的磁化程度是其磁化率和所施加的磁场的函数。磁化强度是所得的磁矩和颗粒体积的函数。磁矩越高且体积越小,磁化强度越高。
[0213] II.根据美国专利5,411,863(通过引用以其全文并入本文)的教导的MACSTM。
[0214] 根据一个实施方案,并且如美国专利号5,411,863教导的,细胞分离[T或B细胞(TCD和/或BCD的体内减灭)]可以在高梯度磁性分离(HGMS)中进行,即通过在置于磁场中的室或柱中选择性保留磁性材料或标记有磁性颗粒的非磁性靶。因此,例如,包含磁性颗粒的流体通过置于磁梯度中的容器或柱。在指导细胞分离所需的方法中,用基体填充容器,该基体能够在其表面附近产生高磁性梯度。虽然施加在颗粒上的磁场的强度确定它们的磁化强度,但是它们的保留是磁性梯度强度的函数。通过高磁性梯度保留磁化的颗粒。典型的基体是丝状或粒状金属例如、线或丝或粒或网。
[0215] 本发明还提供了涂覆这样的基体的方法,其有效率且有力地保护经受通过基体的生物材料免受可由这些材料暴露于金属性表面所致的损害。基体上的涂层有效地防止金属性表面的腐蚀并防止在表面处可形成的任何离子通向周围的流体中。此外,由本发明提供的不能透过的涂层增加了基体的物理稳定性
[0216] 描述各种HGMS系统的其它出版物在本领域中是已知的并且包括例如美国专利号4,452,773、美国专利号4,230,685、PCT申请WO85/04330、美国专利号4,770,183和PCT/EP89/01602;系统还在美国序列号07/291,177中和在美国序列号07/291,176中得到描述,通过引用将所有这些并入本文。
[0217] III.根据美国专利号5,786,161和5,711,871(通过引用以其全文并入本文)的TM教导的磁性分离(MACS )装置。
[0218] 根据一个实施方案,可以使用与本发明一致的磁性分离设备。
[0219] 根据一个实施方案,用于磁性分离过程的磁性分离设备包含提供均匀的孔隙或通道的基体,该孔隙或通道减少空气或非靶物质的捕集并且降低因机械破碎所致的靶损失。将来自各种生物样品的靶细胞(例如B或T细胞)与合适的特异性结合元件(例如如上所述的T/B细胞特异性抗体)结合标记,并且使用本发明的设备和方法来隔离。
[0220] 该分离系统能够从混合的细胞群例如外周血、骨髓、来自脐带或胎盘的血、胎血或白细胞分离产物特异性地选择和分离所限定的细胞(靶细胞)群。
[0221] 根据一个实施方案,使用与本发明一致的高梯度磁性分离(HGMS)设备。
[0222] 常规的高梯度磁性分离基体通常由材料例如线材、涂覆有金属的纤维或钢棉制得。在本发明的改进的磁性分离设备中,高梯度磁性分离机的梯度增强的基体由磁性敏感材料或铁磁性材料的小球形成。这样的材料包括但不限于铁、钢、钴镍和其它铁磁性稀有金属或其合金。例如,基体材料可以包括铁磁性金属球例如铁球(例如MARABU Balls,Kugelfabrik Schulte&Co.,Wermelskirchen,德国)。
[0223] 已知制造球的许多不同的方法。通常该球对于大细胞或胞腔复形的分离具有0.2-1.5mm的平均直径,并且对于亚细胞材料具有约0.05-0.2mm的直径。特别地,该球具有约0.2-0.5mm的平均直径,并且最特别地,选择该球具有约0.2-0.3mm的平均直径。需要球的尺寸相对均匀,从平均尺寸通常变化不大于约15%,更通常不大于约10%,并且优选不大于约5%。
[0224] 该球由铁磁性材料(例如铁、钢等)组成,其可涂覆有不能透过的涂层一防止细胞与金属接触。不能透过的涂层意指聚合物涂层,其包含基本上小于30重量%的水,其不允许粒子的通过,并且由于相对疏水性的聚合物或共聚物的积极施加、交联或聚合其在球上形成。合适的聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚砜、氟化或氯化的聚合物例如聚氯乙烯、聚乙烯和聚丙烯、聚酸酯和聚酯等。
[0225] 球的基体应具有足够的表面积以在分离设备中产生充足的磁场梯度,从而允许经磁性标记的细胞的有效保留。对于给定的分离所必要的体积可以根据经验来测定,并且将随着细胞尺寸、细胞表面上的抗原密度、抗体亲和力等而变化。流量将由柱的尺寸所确定,但是将通常不需要套管来调节该流。
[0226] 在通常至少约100mT、更通常至少约500mT、通常不大于约2T、更通常不大于约1T的磁场的存在下,经标记的细胞保留在磁性分离设备中。磁场的来源可以为永久的或电磁体。在初始结合后,可以采用任何合适的生理缓冲剂洗涤该设备以移除未结合的细胞。
[0227] 通过移除磁场和在合适的缓冲剂中洗脱来使经结合的细胞从磁性分离装置释放。可以在任何合适的介质、优选维持细胞活性的介质中收集细胞。各种介质是可商购的并且可以根据细胞的属性来使用,包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、PBS-EDTA、PBS、Iscove's介质等,其可补充胎牛血清、BSA、HAS等。然后可以合适地或如本文中教导的使用该细胞。
[0228] 在其最简单的形式中,本发明的细胞制剂系统具有两种主要组分:磁性分离机和细胞分离试剂。一种更复杂的分离设备包括流体通过、收集和储存容器和分离柱。可以构造具有集成阀的流体线路,或者可以向流体路径外部施加阀。
[0229] 可以与本发明一致使用的其它磁性分离设备在WO/90/07380、PCT/US96/00953和EP438,520、US5,779,892、US6,417,011中得到描述,通过引用将所有这些并入本文。
[0230] IV.根据美国专利号6,900,029(通过以其全文并入本文)的教导的MACSTM。
[0231] 根据本发明的另一个实施方案,可以利用如美国专利号6,900,029中教导的颗粒和重力沉降来选择细胞群。因此,T/B细胞减灭可以通过移除不需要的细胞群或细胞亚群(例如表达CD20、CD19、CD2、CD4、CD8的细胞)来进行:通过快速并且使用使用多个致密、相对重的具有一种或多种反应剂(例如单克隆或多克隆抗体)的颗粒将其从生物样品(例如流体样品)例如整体外周血或骨髓分离,在那里结合混合有生物样品(例如流体样品)。与颗粒结合的抗体可以指向T或B细胞,其将被从生物样品移除。使具有结合到细胞的颗粒通过重力沉降并且随后移除保留的样品(包含T/B细胞被耗尽的样品例如未成熟造血细胞)用于进一步的使用。这增加了样品中所关注的保留细胞(未成熟造血细胞)的数目,所述细胞不是颗粒的目标。因此,提供了甚至在多个移除步骤后所关注的细胞的高产率。与颗粒结合的抗体还可指向所关注的细胞(例如表达例如CD34的未成熟造血细胞)。随后可以从颗粒移除靶向细胞(例如CD34+未成熟造血细胞)用于进一步的使用。
[0232] 根据一个实施方案,颗粒材料可以是镍。可以加热该镍颗粒以在需要的地方将颗粒消毒。如果样品已被净化并且将被移植到人类中,则可以利用磁场和洗涤步骤(如上详细描述的)以移除其它不需要的细胞(例如红血细胞)并且进一步确保从生物样品移除所有的致密颗粒。
[0233] 根据一个实施方案,T细胞被耗尽的未成熟造血细胞(例如包括CD34+细胞)包含T细胞被耗尽的骨髓细胞、T细胞被耗尽的流动的外周血祖细胞(例如由G-CSF固定)、+T细胞被耗尽的脐血/胎肝/卵黄囊和/或纯化的CD34 细胞(从所有上面提到的20种来源例如从骨髓和/或从G-CSF流动的外周血祖细胞获得),并通过阳性选择来选择(例如采TM
用使用抗-CD34抗体的磁珠,例如如上所述使用MACS )。此外,还考虑通过本发明的方法+
体外扩增以增加细胞数目的纯化的CD34 细胞。
[0234] 根据本发明的一个实施方案,给受试者以一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造6 6 6 6 6 6
血细胞,其包含每千克体重至少约4×10、4.5×10、5×10、5.5×10、6×10、6.5×10、
6 6 6 6 6 6 6 6 6
7×10、7.5×10、8×10 、8.5×10 、9×10、9.5×10、10×10 、12.5×10、15×10 、
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
20×10、25×10、30×10、35×10、40×10、45×10、50×10、60×10、70×10、80×10、
6
90×10 个CD34+细胞。
[0235] 根据一个特定的实施方案,给受试者以一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细6
胞,其包含每千克体重至少约10×10 个CD34+细胞。
[0236] 根据一个特定的实施方案,给受试者以一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细6
胞,其包含每千克体重至少约5×10 个CD34+细胞。
[0237] 根据一个实施方案,给受试者以一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞,6 6 6 6 6
其包含每千克受试者的体重约4-30×10、4-40×10、4-50×10、4-60×10、4-70×10、
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4-80×10 、4-90×10 、4-100×10 、5-10×10 、5-20×10 、5-30×10 、5-40×10 、
6 6 6 6 6 6 6
5-50×10、5-60×10 、5-70×10 、5-80×10 、5-90×10 、5-100×10 、10-20×10 、
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10-30×10、10-40×10、10-50×10、10-60×10、10-70×10、10-80×10、10-90×10、
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10-100×10、20-30×10、20-40×10、20-50×10、20-60×10、20-70×10、20-80×10、
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20-90×10、20-100×10、30-40×10、30-50×10、30-60×10、30-70×10、30-80×10、
6 6 6 6 6 6 6
30-90×10、30-100×10、40-50×10、40-60×10、40-70×10、40-80×10、40-90×10、
6 6 6 6 6 6 6
40-100×10、50-60×10、50-70×10、50-80×10、50-90×10、50-100×10、60-70×10、
6 6 6 6 6 6 6
60-80×10、60-90×10、60-100×10、70-80×10、70-90×10、70-100×10、80-90×10、
6
80-100×10 个CD34+细胞。
[0238] 根据一个特定的实施方案,给受试者以一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细6
胞,其包含每千克体重约5-40×10 个CD34+细胞。
[0239] 可以使用本领域中已知的用于细胞移植的任何方法将本发明的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受体中,例如但不限于细胞注入(例如I.V.)、通过腹腔内途径或通过骨内途径。
[0240] 如所提到的,还可以用细胞或组织移植物(例如肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠和/或淋巴/造血组织)对本发明的受试者进行移植。
[0241] 可以以各种方式来实施细胞或组织移植到受试者中,这取决于各种参数,例如细胞或组织类型;受体的疾病类型、阶段或严重程度(例如器官衰竭);受试者所特有的物理或生理参数;和/或所期望的治疗效果。
[0242] 移植本发明的细胞或组织移植物可以通过将细胞或组织移植物移植到各种解剖位置中的任何一个来实施,这取决于应用。可以将该细胞或组织移植物移植到等位解剖位置(移植的正常解剖位置)中,或移植到异位解剖位置(移植的异常解剖位置)中。取决于应用,可以有利地将细胞或组织移植物移植到肾小囊下,或移植到肾脏、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、静脉、肝脏、脾脏、心室、心脏、胸腔、肺、皮肤、胰腺和/或腹腔内的空间中。
[0243] 例如,可以将根据本教导的肝脏组织移植到肝脏、门静脉、肾小囊、皮下组织、网膜、脾脏和腹腔内的空间中。在本领域中通常将肝脏移植到各种解剖位置例如这些以治疗通过肝移植易于治疗的疾病(例如肝衰竭)。类似地,移植根据本发明的胰腺组织可以有利地通过将该组织移植到门静脉、肝脏、胰腺、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、肠弯(小肠U弯的浆膜下层)和/或腹腔内的空间中。胰腺组织的移植可以用于治疗通过胰腺移植易于治疗的疾病(例如糖尿病)。同样地,出于治疗患有例如肾衰竭、心脏衰竭、肺衰竭或皮肤损伤(例如烧伤)的受体的目的,可以进行组织例如肾脏、心脏、肺或皮肤组织到上面描述的任何解剖位置中的移植。
[0244] 任选地,当将本发明的细胞或组织移植物移植到具有有缺陷的器官的受试者中时,可能是有利的,首先至少部分地将衰竭的器官从受试者移除,从而使移植的最佳发展及其具有受试者的解剖学/生理学的结构/功能整合成为可能。
[0245] 在受试者可有益地通过这样的过程实施的情况下,本发明的方法还设想几个器官的共同移植(例如心脏和肺、肝脏和脾脏、胰腺和骨髓,例如造血干细胞,肾脏和骨髓,例如造血干细胞等)。
[0246] 根据一个实施方案,共同移植包括未成熟造血细胞和一个实体组织/器官或多个实体器官/组织的移植。
[0247] 根据一个实施方案,从同一供体获得未成熟造血细胞和实体器官。
[0248] 根据一个实施方案,在将T细胞被耗尽的未成熟造血细胞(例如包括CD34+细胞)移植到受试者中之前、同时或之后,将该细胞或组织移植物(例如实体器官)移植到受试者中。
[0249] 在将细胞或组织移植物移植到受试者中后,根据标准的医学实践,根据各种标准现有技术中的任何一种来监视器官的生长功能和免疫相容性。例如,可以在移植后通过标准的胰腺功能测试(例如胰岛素的血清水平分析)来监视胰腺组织移植体的功能。同样,可以在移植后通过标准的肝脏功能测试(例如清蛋白的血清水平、总蛋白、ALT、AST和胆红素的分析,以及凝血时间的分析)来监视肝脏组织移植体。可以通过计算机化断层显像或超声成像来监视该细胞或组织移植物的结构发展。
[0250] 不管移植类型,为了减少至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%,或优选避免移植物排斥和/或移植物抗宿主病(GVHD),本发明考虑了移植后的环磷酰胺给药。
[0251] 根据一个实施方案,除了在如本文所述的移植后给药以外,本发明还考虑了在移植前(例如在移植前第4、3或2天,即T-4、-3或-2)的环磷酰胺给药。
[0252] 要注意的是,(细胞或组织移植物的)移植日期被认为是T=零。
[0253] 如本文中使用的,术语“环磷酰胺”是指芥子气烷基化剂,其特别地将烷基(CnH2n+1)添加到DNA(也称为cytophosphane)。在一个特定的实施方案中,环磷酰胺是指分子式C7H15Cl2N2O2P·H2O和化学名称2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氮磷环2-氧化物一水合物。环磷酰胺是从例如Zydus(German Remedies)、Roxane Laboratories Inc-Boehringer Ingelheim、Bristol-Myers Squibb Co-Mead Johnson and Co 和Pfizer-Pharmacia&Upjohn以Endoxan,Cytoxan、Neosar、Procytox和RevimmuneZydus的商品名可商购的。
[0254] 通常在细胞或组织移植物的移植后给受试者以环磷酰胺的治疗有效量。
[0255] 不受理论束缚,治疗有效量是有效杀死活化的供体或宿主同种异体T细胞而对受试者为无毒的环磷酰胺的量。
[0256] 例如,在细胞或组织移植物的情况下,环磷酰胺的治疗有效量包含每千克受试者的体重约1-25mg、1-50mg、1-75mg、1-100mg、1-250mg、1-500mg、1-750mg、1-1000mg、5-50mg、5-75mg、5-100mg、5-250mg、5-500mg、5-750mg、5-1000mg、10-50mg、10-75mg、10-100mg、
10-250mg、10-500mg、10-750mg、10-1000mg、25-50mg、25-75mg、25-100mg、25-125mg、
25-200mg、25-300mg、25-400mg、25-500mg、25-750mg、25-1000mg、50-75mg、50-100mg、
50-125mg、50-150mg、50-175mg、50-200mg、50-250mg、50-500mg、50-1000mg、75-100mg、
75-125mg、75-150mg、75-250mg、75-500mg、75-1000mg、100-125mg、100-150mg、100-200mg、
100-300mg、100-400mg、100-500mg、100-1000mg、125-150mg、125-250mg、125-500mg、
125-1000mg、150-200mg、150-300mg、150-500mg、150-1000mg、200-300mg、200-400mg、
200-500mg、200-750mg、200-1000mg、250-500mg、250-750mg、250-1000mg。
[0257] 根据一个特定的实施方案,环磷酰胺的治疗有效量为每千克受试者的体重约25-200mg。
[0258] 如接下来的实施例部分所示,本发明人已经表明两种剂量的环磷酰胺移植后的给药(在移植后第3和4天)允许耐久的植入和“大剂量”T细胞被耗尽的不匹配的供体骨髓的耐受性。
[0259] 根据一个实施方案,以单次剂量施用环磷酰胺。
[0260] 根据一个实施方案,环磷酰胺以多次剂量例如以2、3、4、5次或更多次剂量给药。
[0261] 根据一个特定的实施方案,环磷酰胺以2次剂量给药。
[0262] 根据一个实施方案,每天例如每天一次或每天两次给环磷酰胺。
[0263] 每次环磷酰胺给药的剂量可以包含每公斤受试者的体重约5mg、7.5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、
160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、
280mg、290mg、300mg、350mg、400mg、450mg或500mg。
[0264] 根据一个特定的实施方案,环磷酰胺的剂量为每千克受试者的体重50mg。
[0265] 如前所述,在移植后给环磷酰胺。因此,例如可以在移植后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天(即T+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10)对受试者给环磷酰胺。根据一个具体的实施方案,在移植后第3和4天以两次剂量对受试者给环磷酰胺。
[0266] 根据一个实施方案,在移植前和在移植后给环磷酰胺。因此,例如可以在移植前第3天(T-3)然后在移植后(例如在第T+3、+4天,等等)对受试者给环磷酰胺。
[0267] 考虑到移植的类型和受试者对服药时间的反应,根据需要可以调整给药次数和环磷酰胺的治疗有效量。特别是考虑到本文中提供的详细公开,给药次数和治疗有效量的确定充分处于本领域技术人员的能力范围内。
[0268] 为了促进细胞或组织移植物的植入,在细胞或组织移植物的移植之前、同时或之后该方法还可以有利地包括采用其它的免疫抑制药物和/或免疫抑制照射来预处理该受试者。
[0269] 将理解的是,在其中在T细胞被耗尽的未成熟造血细胞前移植该细胞或组织移植物(例如实体器官)的情况下,使用一般的免疫抑制药物(例如环孢霉素A,如下面进一步详细描述的)以避免器官排斥。一旦移植T细胞被耗尽的未成熟造血细胞和实现嵌合状态,就可以减少该一般的免疫抑制剂,随后停止。与在其中在T细胞被耗尽的未成熟造血细胞后移植该细胞或组织移植物(例如实体器官)的情况相反,在嵌合状态诱发后,可能不需要使用一般的免疫抑制。
[0270] 选择和施用对于移植合适的免疫抑制方案的大量指导提供在现有技术的文献中(例如 参见:Kirkpatrick CH.和Rowlands DT Jr.,1992.JAMA.268,2952;Higgins RM. 等 人 ,1996.Lancet348,1208;Suthanthiran M. 和 Strom TB.,1996.New Engl.J.Med.331,365;Midthun DE. 等 人 ,1997.Mayo Clin Proc.72,175;Morrison VA. 等人,1994.Am J Med.97,14;Hanto DW.,1995.Annu Rev Med.46,381;Senderowicz AM.等人,1997.Ann Intern Med.126,882;Vincenti F.等人,1998.New Engl.J.Med.338,161;Dantal J.等人1998.Lancet351,623)。
[0271] 因此,根据本发明的一个实施方案,在细胞或组织移植物的移植前在降低强度预处理下预处理该受试者。
[0272] 根据一个实施方案,在细胞或组织移植物的移植前实施降低强度预处理长达2周(例如1-10或1-7天)。
[0273] 因此,例如可以采用清髓性或者非清髓性预处理来治疗该受试者。这样的预处理可以包括,例如并且如在接下来的实施例部分所详细描述的,例如通过抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、抗-CD3(OKT3)抗体、抗-CD52抗体(例如CAMPATH)和/或抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体的体内T细胞减灭(例如在移植前6天以每次约300μg的治疗有效剂量)。
[0274] 预处理可以额外地或替代地包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI,所有淋巴结、胸腺和脾脏的曝光)、化疗剂和/或抗体免疫疗法。
[0275] 因此,根据一个实施方案,TBI包含0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2.5Gy、0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、
1-4.5Gy、1-1.5Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、
2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、
4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、
7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy或10-15Gy的单次或分次照射剂量。
[0276] 根据一个具体的实施方案,TBI包含1-3.5Gy的单次或分次照射剂量。
[0277] 根据一个实施方案,在移植前1-10天(例如1-3天)对受试者施用TBI治疗。根据一个实施方案,在移植前1或2天采用TBI预处理该受试者一次。
[0278] 根据一个具体的实施方案,TLI包含0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2.5Gy、0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、
1-4.5Gy、1-1.5Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、
2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、
4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、
7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy、10-15Gy、10-20Gy、10-30Gy、10-40Gy、10-50Gy、
0.5-20Gy、0.5-30Gy、0.5-40Gy或0.5-50Gy的照射剂量。
[0279] 根据一个具体的实施方案,TLI包含1-3.5Gy的单次或分次照射剂量。
[0280] 根据一个实施方案,在移植前1-10天(例如1-3天)对受试者施用TLI治疗。根据一个实施方案,在移植前2-7天采用TLI预处理该受试者一次。
[0281] 根据一个实施方案,预处理包括化疗剂。示例性的化疗剂包括但不限于白消安、马利兰、白舒非、氟达拉滨、美法仑和塞替派以及环磷酰胺。可以在移植前以单次剂量或以几次剂量例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次剂量(例如每日剂量)对受试者施用化疗剂。根据一个实施方案,在移植前连续5天(例如第-7至-3天)对受试者施用化疗剂(例如
2
以约30mg/m/天的剂量的氟达拉滨)。
[0282] 根据一个实施方案,预处理包括抗体免疫疗法。示例性的抗体包括但不限于,抗-CD52抗体(例如,以例如Campath、MabCampath、Campath-1H和Lemtrada的商品名出售的阿仑珠单抗)和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)剂[例如,Thymoglobulin(可从Genzyme获得的兔ATG、RATG,)和Atgam(可从Pfizer获得的马ATG、eATG)]。其它的抗体免疫疗法可以包括抗-CD3(OKT3)、抗-CD4或抗-CD8剂。根据一个实施方案,可以在移植前(例如在移植前6天)以单次剂量或以几次剂量例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次剂量(例如每日剂量)对受试者施用抗体。
[0283] 根据一个实施方案,在移植后不采用GVHD预防法长期治疗该受试者(例如持续延长的时间段,例如持续超过10天)。
[0284] 根据一个实施方案,在造血干细胞移植后复发的情况下,可以通过供体淋巴细胞输注(DLI)进一步治疗该受试者。例如,可以采用先前由Dazzi等人描述([Dazzi,Szydlo et al.,Blood,(2000)96:2712-6],通过引用将其全部内容并入本文)的具有梯度剂量的T-细胞施用于受试者。
[0285] 根据一个实施方案,对于在T细胞被耗尽的单倍体同一性移植后的复发治疗,可4 + 4
以通过输注每千克受体体重约0.5-5×10 个CD3 淋巴细胞(例如每千克受体体重1×10+ +
个CD3 淋巴细胞,例如未处理的CD3 淋巴细胞)。
[0286] 根据一个实施方案,将采用每千克受体体重约1×104个CD3+细胞的第一剂量进一步治疗具有早期的分子和/或血液复发的患者。在不存在GVHD下,大约45天以后通常将给5 +
出每千克受体体重约1×10 个CD3 细胞的第二次输注,接着是2个月以后的每千克受体体
6 +
重约1×10 个CD3 细胞的第三次剂量。将理解,在造血干细胞的活动化(例如用于移植)前,供体通常经历leukoapheresis以收集淋巴细胞。根据需要将冷冻产品解冻并在5-10分钟的时间段内快速输注。表现出急性GVHD或不能证明血液移植的患者通常不会接收任何DLI。
[0287] 根据一个实施方案,通常将采用利妥昔单抗(例如每周375mg/m2,持续约4周)进一步治疗患有复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者,第二次利妥昔单抗剂量伴随DLI。
[0288] 根据一个实施方案,在开始DLI前将采用替佐米(例如在第1、4、8和11天,1.3mg/sqm)进一步治疗患有复发性多发性骨髓瘤的患者。
[0289] 根据一个实施方案,后DLI免疫抑制剂不与本方法一起使用。
[0290] 根据本发明的一个方面,提供了治疗需要T细胞耗尽的未成熟造血干细胞移植的受试者的方法,该方法包括:(a)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到经预处理的受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重5 + 6
小于5×10 个CD3T细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞;并且随后(b)给该受试者以治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0291] 根据本发明的一个方面,提供了治疗需要未成熟造血干细胞移植的受试者的方法,该方法包括:(a)在降低强度预处理方案下预处理受试者,所述降低强度预处理包括全身照射(TBI)和化疗剂;(b)将一定剂量的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到该受试5
者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个+ 6
CD3 细胞,并且其中所述剂量包含每千克该受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞;并且随后(c)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重
25-200mg,由此治疗该受试者。
[0292] 根据本发明的一个方面,提供了在需要非同基因的细胞或组织移植物的受试者中诱发供体特异性耐受性的方法,所述方法包括:(a)将一定剂量的从非同基因的供体获得的T细胞被耗尽的未成熟造血细胞移植到受试者中,其中所述T细胞被耗尽的未成熟造血5 +
细胞包含每千克该受试者的体重小于5×10 个CD3 细胞,并且其中所述剂量包含每千克该
6
受试者的体重至少约5×10 个CD34+细胞;并且随后(b)给该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺,其中所述治疗有效量包含每千克体重25-200mg,由此治疗该受试者。
[0293] 如本文中使用的,如本文中使用的术语“供体特异性耐受性”是指一种条件,其中与在这种治疗方法的不存在下供体的细胞的反应性相比,当受体的细胞(例如受体的T细胞)与供体的细胞(例如供体造血细胞)接触时存在它们降低的反应性。
[0294] 耐受性诱发使具有降低的移植物排斥或GVHD风险的细胞或组织移植物的移植(如在上文中更详细地描述的)成为可能。
[0295] 根据本发明一个实施方案,患有早期分子和/或血液复发的患者可接收供体淋巴细胞输注(DLI)。
[0296] 根据本发明一个实施方案,DLI可包含1×103-1×106个CD3+T细胞/千克受者体重。
[0297] 根据一个实施方案,患有早期分子和/或血液复发的患者可接收单次剂量或多次剂量(两次、三次、四次、五次或更多次剂量)的DLI。
[0298] 因此,例如患有早期分子和/或血液复发的患者可接收1×104个CD3+T细胞/千克5
受体体重的第一剂量。在不存在移植物抗宿主病(GVHD)下,例如可在45天以后给予1×10+ 6 3
个CD3T细胞/千克受体体重的第二次输注,接着是例如两个以月后的1×10 个CD+T细胞/千克受体体重的第三次剂量。
[0299] 根据一个实施方案,患有早期分子和/或血液复发的患者可接收全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI)、化疗剂和/或抗体免疫疗法。
[0300] 因此,例如患有复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者可接收利妥昔单抗(例如以2
每周375mg/m 的剂量)约4周,第二次利妥昔单抗剂量伴随DLI。
[0301] 因此,可以在开始DLI前采用硼替佐米(例如在第1、4、8和11天以1.3mg/sqm的剂量)治疗例如患有复发性多发性骨髓瘤的患者。
[0302] 如本文中使用的,术语“约”是指±10%。
[0303] 术语“包含”、“含有”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”和它们的变化形式是指“包括但不限于”。
[0304] 术语“由......组成”是指包括并限于“。
[0305] 术语“基本上由......组成”是指组合物、方法或结构可包括其它的成分、步骤和/或部件,但仅是其它的成分、步骤和/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特性和新颖特性。
[0306] 如本文中使用的,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用,除非上下文另有明确规定。例如,术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物,包括其混合物。
[0307] 在整个本申请中,本发明的各种实施方案可以存在于一个范围形式内。应当理解,该范围形式内的描述仅仅是出于方便和简洁,并且不应视为对本发明范围的硬性限制。因此,应当认为一个范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如,应当认为一个范围例如从1到6的描述已经具体公开子范围例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等等,以及该范围内的单个数字,例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度这均适用。
[0308] 每当在本文中指出数值范围时,它意味着包括所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一指示数字与第二指示数字之间“变化”和从第一指示数字变化“到”第二指示数字在本文中可互换使用,并且意味着包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
[0309] 如本文中使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序,其包括但不限于对于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者而言要么是已知的要么是容易从已知的方式、手段、技术和程序发展来的那些方式、手段、技术和程序。
[0310] 要理解的是,为清楚起见,在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合提供于单个实施方案中。相反地,为简洁起见,在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征,也可以单独或以任何合适的子组合或合适地以本发明的任何其它描述的实施方案来提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的必要特征,除非该实施方案没有那些元素是不起作用的。
[0311] 如上文所描绘的和如下面的权利要求书部分请求保护的本发明的各个实施方案和方面,在下面的实施例中得到实验支持。
[0312] 实施例
[0313] 现在参考下面的实施例,连同上面的描述,说明本发明中的非限制性的方式。
[0314] 通常,本文中使用的命名法和在本发明中所利用的实验室程序包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中充分解释了这些技术。参见例如,"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook 等 人 ,(1989);"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel等人,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley 和 Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New
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Birren等 人.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998);如 在美 国专 利号4,666,828;
4,683,202;4,801,531;5,192,659和 5,272,057 中 提 出 的 方 法;"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994);Stites等人.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);
Mishell 和 Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980);在专利和科技文献中广泛地描述了可得到的免疫测定,例如参见美国专利号3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;
3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;
4,879,219;5,011,771 和 5,281,521;"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D. 和 Higgins S.J.,eds.(1985);
"Transcription and Translation"Hames,B.D. 和 Higgins S.J.,Eds.(1984);"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984) 和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak 等人 ,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996),以如在本文中完全阐述的方式通过引用将所有这些文献并入。贯穿该文件提供了其它的一般参考文献。认为其中的步骤在本领域中是众所周知的并且出于方便读者而被提供,通过引用将包含在其中的所有信息并入本文。
[0315] 实施例1
[0316] 按照“大剂量”骨髓移植和移植后环磷酰胺的HLA不匹配的骨髓的稳定植入[0317] 材料与实验过程
[0318] 动物
[0319] 在这些研究中所使用的小鼠为6-12周龄的雌性小鼠。Balb/c-Nude(H-2d)和C3H/HeN(H-2K)从Harlan Israel(Rehovot,Israel)购买小鼠。将所有的小鼠关在小笼子里(每个笼子5只动物)并且喂无菌的食物和酸性水。这些研究获得Weizmann Institute of Science、Institutional Animal Care and Use Committee的批准。
[0320] 移植方案
[0321] 在第-6天投递抗-CD4(克隆GK1.5)和抗-CD8(克隆53.6.72)抗体(各300μg;Bio X Cell,NH,USA)的体内T细胞减灭(TCD)和在第-1天暴露于2.0Gy全身照射(TBI)
6 6
后,在第0天将低剂量(5×10)和高剂量(25×10)Balb/c-Nude BM细胞(提供耗尽了T
细胞的BM源)移植到同种异体受体(C3H/HeN)中。在移植后第+3和+4天施用高剂量环磷酰胺(CY,100mg/kg,Baxter Oncology,Germany)并且在移植后35天和95天使用荧光素d
抗宿主和供体H-2抗体(例如标记FlTC的对供体型细胞为特异性的抗-H-2D 抗体和标记k
PE的对宿主型细胞为特异性的抗H-2K 抗体)评价供体型嵌合状态。
[0322] 皮肤移植方案
[0323] 将供体(Balb/c)和第三方(C57BL/6)皮肤移植物移植到如上所述的混合嵌合受6
体中[即移植到先前移植有大剂量(25×10)T细胞被耗尽的BM并采用高剂量CY治疗的那
6
些小鼠]以及移植到接种有常规(5×10)T细胞被耗尽的BM细胞剂量并采用高剂量CY治疗的受体小鼠。
[0324] 结果
[0325] 为了测试“大剂量”T细胞被耗尽的骨髓移植(BMT)与高剂量环磷酰胺(CY)后移植之间的潜在协同效应,在受体小鼠的降低强度预处理(RIC)后,进行了以下实验。
[0326] 在T细胞被耗尽的骨髓移植体的移植前,采用预处理方案治疗受体小鼠(C3H/HeN)。具体地,采用使用在第-6天投递的抗-CD4和抗-CD8抗体的T细胞减灭(TCD)并通过在第-1天暴露于2.0Gy的全身照射(TBI)来体内治疗小鼠。接着,在第0天将低剂量6 6
(5×10)或高剂量(25×10)Balb/c-NudeBM细胞(提供耗尽了T细胞的BM源,因为Nude
小鼠具有微乎其微的成熟T细胞)移植到同种异体受体(C3H/HeN)中。在移植后第+3和+4天施用高剂量环磷酰胺(CY,100mg/kg)。通过在移植后35天和95天的供者型嵌合状态来评估骨髓细胞植入。
[0327] 如图1A-B和图2A-B所示,在第35和95天的嵌合状态分析显示,没有一只对照小鼠(采用TCD、2Gy TBI和任选的CY预处理,但没有接收BM)表现出供者型嵌合状态。同6
样,没有一只移植有常规剂量的5×10 个T细胞被耗尽的BM的BM小鼠受体,在存在或不存在环磷酰胺治疗下,表现出施主型嵌合状态。然而,当T细胞被耗尽的BM的剂量增加至
6
25×10 个细胞时,在还在移植后第+3和+4天采用环磷酰胺治疗的7只小鼠中的4只中实现了持久的混合嵌合状态(参见图1A-B和图2C)。
[0328] 移植后180和225天的这些受体小鼠的进一步追踪观察表明,诱发的嵌合状态是稳定和持久的(图3)。如图3所示,供体型嵌合受体的数目和供体嵌合状态的水平在移植后225天保持不变,这提示实现了耐受性。
[0329] 通过将供体(Balb/c)和第三方(C57BL/6)皮肤移植物移植到混合嵌合受体中,6
该混合嵌合受体移植有大剂量(25×10)个T细胞被耗尽的BM并且采用高剂量的CY治疗
6
(如上文所述),与移植到接种有常规(5×10)个T细胞被耗尽的BM细胞剂量的受体(如上所述)相比,测量了耐受性诱发。
[0330] 如图4A-B所示,三出的移植有25×106个T细胞被耗尽的BM的4只嵌合状态小6
鼠中的三只接受供体移植物并排斥第三方皮肤移植物。相比之下,接种有5×10 个T细胞被耗尽的BM细胞和CY的受体小鼠同时排斥供体和第三方皮肤移植物(图4A)。
[0331] 这些结果表明,大剂量的T细胞被耗尽的BM和高剂量环磷酰胺治疗的结合允许在降低强度预处理下造血干细胞的成功植入以及诱发耐受性。
[0332] 受这些结果所激励,启动了一组校准实验以确定用于通过这种方法来改善嵌合状态诱发的优化的照射和环磷酰胺剂量。
[0333] 实施例2
[0334] 不同剂量的全身照射(TBI)对嵌合状态的影响
[0335] 材料与实验过程
[0336] 动物
[0337] 如上面的实施例1中所述。
[0338] 移植方案
[0339] 在第-6天投递抗-CD4(克隆GK1.5)和抗-CD8(克隆53.6.72)抗体(各300μg;Bio X Cell,NH,USA)的体内T细胞减灭(TCD)和在第-1天暴露于1-3.5Gy TBI后,在第0
6
天将高剂量(25×10)个Balb/c-Nude BM细胞(提供耗尽了T细胞的BM源)移植到同种异体受体(C3H/Hen)中。在移植后第+3和+4天施用高剂量环磷酰胺(CY,100mg/kg,Baxter Oncology,Germany)并且在移植后30天使用荧光素抗宿主和供体H-2抗体(例如标记FlTCd k
的对供体型细胞为特异性的抗-H-2D 抗体和标记PE的对宿主型细胞为特异性的抗H-2K抗体)评价供体型嵌合状态。
[0340] 结果
[0341] 在该实验中,定义了最小照射剂量。在第-6天的T细胞减灭(采用抗-CD4和抗-CD8抗体)和在第-1天的不同剂量的照射(1-3.5Gy TBI)后,在第0天将“大剂6
量”(25×10)个Balb/c-Nude T细胞被耗尽的BM移植到5组同种异体受者(C3H/Hen)中。
在移植后第+3和+4天施用高剂量环磷酰胺(CY)并且在移植后30天对供体型嵌合状态进行了评价。
[0342] 如从图5可以看出的,所有采用2.5、3或3.5Gy的TBI照射的受体小鼠(6/6)为嵌合的,表现出58-83%的供体型嵌合状态。类似地,87%(13/15)的采用2Gy的TBI治疗的小鼠表现出56-85%的供体型嵌合状态。
[0343] 照射剂量进一步减少至1.0Gy引起嵌合状态小鼠百分比的少量减少,即83%(5/6),然而,供体型嵌合范围显著减少到14.5-58%。
[0344] 实施例3
[0345] 不同的环磷酰胺(CY)剂量对嵌合状态的影响
[0346] 材料与实验过程
[0347] 动物
[0348] 如上面的实施例1中所述。
[0349] 移植方案
[0350] 在第-6天投递抗-CD4(克隆GK1.5)和抗-CD8(克隆53.6.72)抗体(各300μg;Bio X Cell,NH,USA)的体内T细胞减灭(TCD)和在第-1天暴露于2.0Gy全身照射(TBI)
6
后,在第0天将高剂量(25×10)个Balb/c-Nude BM细胞(提供耗尽了T细胞的BM源)移植到同种异体受体(C3H/Hen)中。在移植后第+3和+4天施用不同剂量的环磷酰胺(CY,
100mg/kg、125mg/kg或150mg/kg,Baxter Oncology,Germany)并且在移植后30天使用荧d
光素抗宿主和供体H-2抗体(例如标记FlTC的对供体型细胞为特异性的抗-H-2D 抗体和k
标记PE的对宿主型细胞为特异性的抗H-2K 抗体)评价供体型嵌合状态。
[0351] 结果
[0352] 在该实验中,定义了移植后CY的优化剂量。在第-6天采用抗-CD4和抗-CD8抗体6
的T细胞减灭(TCD)和在第-1天2Gy的TBI后,在第0天将“大剂量”(25×10)个Balb/c-Nude T细胞被耗尽的BM移植到3组同种异体受者(C3H/Hen)中。在移植后第+3和+4天施用不同剂量(100mg/kg、125mg/kg或150mg/kg)的环磷酰胺(CY)并且在移植后30天对供体型嵌合状态进行了评价。
[0353] 如从图6可看出的,增加CY剂量至125mg/kg或150mg/kg没有提供嵌合状态的显著增强。因此,采用100mg/kg、125mg/kg或150mg/kg CY治疗的受体小鼠分别表现出平均为57.5±25.8、66.5±20.6或67.4±27.4的供体型嵌合状态。当将采用100mg/kg治疗的受体与采用125mg/kg或150mg/kg治疗的那些(分别为P=0.5和p=0.469)相比时,发现没有统计学意义。
[0354] 实施例4
[0355] CD8+非T细胞对于通过结合“大剂量”T细胞被耗尽的BM与移植后CY达到嵌合状态不是重要的
[0356] 材料与实验过程
[0357] 动物
[0358] 如上面的实施例1中所述。
[0359] 移植方案
[0360] 在第-6天投递抗-CD4(克隆GK1.5)和抗-CD8(克隆53.6.72)抗体(各300μg;Bio X Cell,NH,USA)的体内T细胞减灭(TCD)和在第-1天暴露于2.0Gy全身照射(TBI)
6
后,在第0天将高剂量(25×10)的CD8被耗尽和未被耗尽的Balb/c-Nude BM细胞移植到
2组同种异体受体(C3H/Hen)中。在移植后第+3和+4天施用高剂量环磷酰胺(CY,100mg/kg,Baxter Oncology,Germany)并且在移植后30天使用荧光素抗宿主和供体H-2抗体(例d
如标记FlTC的对供体型细胞为特异性的抗-H-2D 抗体和标记PE的对宿主型细胞为特异k
性的抗H-2K 抗体)评价供体型嵌合状态。
[0361] 这些实验中的BM源是Balb/c-Nude小鼠。此外,在这些实验中,移植的小鼠无胸腺,并且因此它们缺乏T细胞。然而为了反驳该效果是剩余非T CD8细胞的贡献的可能性,使用细胞分选系统(例如抗-CD8磁珠或FACS分选机)对于CD8细胞阴性分选来自Balb/c-Nude小鼠的BM制剂。
[0362] 结果
[0363] 由于Ildstad等人以前教导CD8+TCR-BM细胞的亚群(subset)对于实现供体型嵌合状态为关键的[Fugier-Vivier IJ等人,J Exp Med(2005)201:373-383;Grimes HL等人,Exp Hematol.(2004)32:946-954;Huang Y等人,Blood(2011)117:2494-2505;Kaufman CL等人,Blood(1994)84:2436-2446;Leventhal J等人,BMC Med(2012)10:48;Leventhal J等人,Sci Transl Med.(2012)4:124ra128],本发明人从Balb/c-Nude“大剂量”BM制剂+ +耗尽残余的CD8 细胞,并测量与对照的非CD8 被耗尽的Nude BM细胞相比的嵌合状态诱发。
[0364] 如从图7可看出的,当结合“大剂量”T细胞被耗尽的BM细胞与移植后CY时,从BM+制剂耗尽CD8T细胞对所实现的嵌合状态的水平没有任何不利的影响。
[0365] 实施例5
[0366] 临床方案
[0367] 研究设计
[0368] 这是一项前瞻性的观察性的I/II期多中心临床研究。在一年期内将登记10个患有血液病的患者。
[0369] 该研究的主要重点是植入并且将输入10个可评估的患者(即存活超过28天的患者)。可接受的初级移植失败或排斥率约为10%。
[0370] 研究期限
[0371] 将采用6至12个月的随访数据进行主要分析。患者将被随访至移植后48个月。
[0372] 定义
[0373] 稳定持续的植入被定义为中性白细胞连续三天超过1000/μl,并且血小板连续三天超过20000/μl而没有输血。
[0374] 移植排斥被定义为中性白细胞迅速下降,在已记录的中性白细胞植入后低于100/μl,具有或不具有淋巴细胞的增加。
[0375] 移植失败被定义是在+28天连续三天没有达到超过1000/μl中性白细胞,并且连续三天没有达到超过20000/μl血小板而不输血。
[0376] 该研究的次要重点为Ⅱ~Ⅳ级急性GVHD的发生率。Ⅱ~Ⅳ级急性GVHD的可接受的发生率约为10%。
[0377] 在下面的表1A-B中显示了针对急性GVHD的分级标准。
[0378] 表1A:急性GVHD的临床分期
[0379]阶段 皮肤 肝脏 肠
+ 疹子大于25% 胆红素=2-3mg/dl 腹泻500-1000ml
++ 疹子25-50% 胆红素=3-6mg/dl 腹泻1000-1500ml
+++ 泛发性红皮病 胆红素=6-15mg/dl 腹泻大于1500ml
++++ 脱皮和肺大疱 胆红素大于15mg/dl 疼痛或肠梗阻
[0380] 表1B:急性GVHD的临床分度
[0381]级别 皮肤 肝脏 肠 功能损伤
0无 0 0 0 0
I弱 +至++ 0 0 0
II中度 +至+++ + + +
III重度 ++至+++ ++至+++ ++至+++ ++
IV/生命威胁 ++至++++ ++至++++ ++至++++ +++
[0382] 统计方面的考虑
[0383] 将从干细胞移植之日计算植入、存活的时间间隔、无病存活率、复发率及移植相关死亡率的风险。将根据Kaplan-Meier法计算精算曲线。
[0384] 合格标准
[0385] 选择标准–患者
[0386] -年龄-大于或等于18岁且小于或等于70岁
[0387] -由于受17p缺失和/或TP53突变的p53损失而对氟达拉滨具有不应性的CLL患者
[0388] -具有任何恶化细胞遗传学例如复杂核型、del17p、del6q23-26、TP53中的突变、负1P的滤泡淋巴瘤
[0389] -自体移植后复发的霍奇金淋巴瘤,不符合采用抗CD30的免疫治疗
[0390] -自体移植后复发的多发性骨髓瘤,且具有部分或完全缓解的恶化细胞遗传学[0391] -免疫治疗后复发的重度再生障碍性贫血
[0392] -不存在充分HLA匹配的或一个部位HLA不匹配的家庭供体
[0393] -不存在匹配的无关供体或无资格在捐赠者登记处(IBMDR)中的供体搜索
[0394] -存在单倍体同一性家庭供者和储存患者自体造血干细胞
[0395] -稳定的临床状况和超过12周的预期寿命
[0396] -卡氏-超过70%
[0397] -书面知情同意书
[0398] 治疗前评估
[0399] -完整的病历,以及体力状态和体表面积的检查和确定。
[0400] -完全血细胞计数
[0401] -血型、红血细胞亚群、抗-A和/或抗B凝集素滴定
[0402] -肌酐清除率、尿酸,铁蛋白、LDH、β2微球蛋白、蛋白电泳、SGOT、SGPT、尿检验、血糖、血氮、免疫球蛋白水平、库姆斯试验。
[0403] -妊娠试验
[0404] -HIV-ab、HBsAg、HBVDNA、HCV-AB、HCVRNA、CMV-ab、弓形虫-ab、HSVab[0405] -心电图和超声或闪烁法试验的射血分数的测量。
[0406] -胸部X射线
[0407] -肺部CT扫描、脑部CT扫描、上颌窦CT扫描。
[0408] -牙科X射线和检查。
[0409] -用于形态学和细胞遗传学分析的活检和骨髓穿刺,针对分子标记(如果未知)和FACS分析(根据隐晦的疾病)的搜索。
[0410] -处于危险之中的病人的神经系统检查和腰椎穿刺。
[0411] -已知疾病定位的放射扫描(CT、NMR)。
[0412] -完整的血清学和分子学HLA分型,采用所选择的供体的ML培养和细胞毒性试验。
[0413] -细胞毒性抗HLA抗体。
[0414] -腹部声波检查
[0415] 排除标准–患者
[0416] -中枢神经系统疾病局部化的病历
[0417] -对于HIV、HCV、HCVRNA、HBsAg、HBVDNA为阳性
[0418] -任何种类的活跃和已记录的肺炎、真菌性组织感染、呼吸道分泌物或血液的病毒阳性培养
[0419] -超过正常2倍的胆红素
[0420] -血液肌酐清除率小于50毫升/分钟
[0421] -小于预测值的50%的DLCO
[0422] -低于45%的射血分数(去年心肌中风)
[0423] -怀孕或哺乳
[0424] -精神疾病
[0425] 合格标准–供体
[0426] -不存在造血或骨髓功能相关的疾病(干扰足够数目的正常祖细胞的采集)。
[0427] -不存在通过经历外周血造血干细胞采集而会造成严重的健康风险的医疗条件[0428] -阴性HIV、HTLV-1测试
[0429] -任何健康的家庭成员将被视为用于造血干细胞捐献。供体的选择将基于在受体、兄弟姐妹、父母和可能的其它家庭成员例如阿姨、叔叔和表兄弟姐妹上待进行的HLA-A、B、C、DR部位的分型。有希望的相关供体必须与患者至少为单倍体同一性的遗传型HLA-A、B、C、DR,但在未共享的单倍型上的2-3个HLA等位基因可以不同。
[0430] -将优先在供体对受体NK同种异体反应性的基础上选择供体。
[0431] 供体评估
[0432] -完整的病史、体检和通过血液成分提取法的身体静脉检查(用于确定通过外周静脉的血液成分提取法的适合性)。
[0433] -血液试验:WBC、PLT、Hb、PT、PTT、总蛋白、白蛋白电解质、血糖、SGOT/SGPT、磷酸酶、胆红素、LDH、酸性尿、肌酐。
[0434] -CMV、EBV、HSV、VZV、肝炎B+C、HIV、弓形虫血清学。
[0435] -完全血红细胞分型
[0436] -梅毒、CMV、EBV、HSV、VZV、肝炎B+C、HTLV-1、HIV、弓形体病的血清学。
[0437] -在干细胞采集之前30和7天之间必须进行输血传播疾病试验
[0438] -胸部X射线
[0439] -EKG
[0440] -通过PCR的VNTR分析
[0441] -将年龄较小、身体较健康、并且是对于CMV阴性受体为CMV阴性的基础上将供体区分优先次序。
[0442] 排除标准–供体
[0443] -阳性HIV或HTLV-1试验或活性/持续性病毒性肝炎感染的证据将排除供体参与这项研究。
[0444] -存在通过经历外周血干细胞采集而会造成严重的健康风险(即胰岛素依赖型糖尿病、心血管疾病、慢性炎症性疾病)的任何医疗条件。
[0445] 治疗过程
[0446] 供体HSC和植入处理的活动化。
[0447] 患者需要有一个家庭供体(年龄18至60岁),愿意并能捐献非格司亭/来格司亭(lenogastrim)刺激的外周血造血细胞。将根据血库一般规则对供体进行筛选。在超过50岁年龄的供体中进行运动心电图测试是明智的。正常供体将每12小时皮下接收非格司亭或来格司亭5mcg/kg;在第5天将开始白细胞采集。将调整非格司亭/来格司亭剂量,以保9
持低于60×10/L的白血细胞。于非格司亭/来格司亭治疗的第4天,如果循环的CD34+细胞计数大于40/μL,供体将开始白细胞采集。每日白细胞采集将持续有计划的3天(最多
6
4天)以收集大于10×10 个CD34+细胞/kg的目标细胞剂量。如果早期达到该目标,则收集可以持续总共3天以给予最大可能的剂量。如果供体不容忍其任何组成部分中的过程,
6
则可使用替代性供体(如果可获得)。如果一个位点不能从合适的供体收集大于10×10 个CD34+细胞/kg,则患者可能不能进行研究。通过使用细胞分选系统(例如抗-CD3/19磁珠或FACS分选仪)选择CD3+和/或CD19+细胞,使PBPC耗尽供体T细胞和B细胞。CD34-阳
6
性细胞的目标值将是至少为10×10/kg的受体体重(b.w.)。
[0448] 将通过肘前静脉进行成分输血。
[0449] 表2:预处理方案
[0450]第-7天 氟达拉滨30mg/sqm
第-6天 氟达拉滨30mg/sqm
第-5天 氟达拉滨30mg/sqm
第-4天 氟达拉滨30mg/sqm
第-3天 氟达拉滨30mg/sqm
第-2天 TBI2Gy单一部分
第-1天 休息
第0天 植入
第+1天 休息
第+2天 休息
第+3天 CY50mg/kg
第+4天 CY50mg/kg
[0451] 如上面的表2所描述的,将以30mg/m2的剂量连续5天(第-7、-6、-5、-4和-3天)每天由静脉内施用氟达拉滨。每次剂量将在30分钟内注入。将在第-1天以单一部分给予TBI200cGy。
[0452] 在第0天,将CD3-/CD19-免疫选择的HSC解冻、洗涤并注入通过中心入口(central access)。
[0453] 将以50mg/kg/天在移植后第+3和+4天在一小时内由静脉内施用CY。
[0454] 特殊处置医嘱
[0455] a.将在预处理方案前放置双管腔中央静脉系;
[0456] b.为了预防尿酸盐,将给予口服别嘌呤醇300mg;
[0457] c.将根据单一中心指引给予止吐治疗;
[0458] d.经过滤和照射的血液制品的输血。在不存在发热或出血迹象下,保持血红蛋白水平大于8g/L并且血小板大于15000/μL;
[0459] 治疗期间的患者监护
[0460] a.每天全血计数和差别
[0461] b.在化疗和水分过多期间每天的血清肌酸酐、Na+、K+、Ca++、胆红素
[0462] c.每周两次肝功能试验、白蛋白、采用抗凝血酶(antitrombin)III的凝固试验、巨细胞病毒抗原血症和PCR。
[0463] D.根据中心指引监测培养
[0464] 毒性评价
[0465] 将根据WHO标准进行评价毒性,如下面的表3所示。
[0466] 表3:WHO毒性标准
[0467]
[0468]
[0469]*
[0470] N 正在研究下人口的正常值的上限。**
[0471] 这不包括由麻醉品所致的便秘
[0472] +仅考虑治疗相关的疼痛,而没有考虑疾病相关的疼痛。
[0473] 麻醉剂的使用可有助于根据患者的耐受性来进行疼痛分级。
[0474] 支持疗法
[0475] 细菌和真菌感染的监测及治疗
[0476] 在具有层式空气流或高效率空气微粒过滤的隔离病房中照顾患者。从第-5天到植入以1mg/kg/天给予脂质体两性霉素作为抗真菌预防。通过每周的拭子和血液培养来监测细菌感染。在感染的临床症状(原因不明的发热)或阳性血培养的基础上开始由静脉内的抗生素治疗。如果患者在72小时后仍然发热,则使用L-AMB3mg/kg/天或伏立康唑8mg/kg/天i.v.开始经验性抗真菌治疗,或者在额外的72小时发热后或在Gram+败血病或阳性血培养的存在下添加万古霉素。
[0477] 巨细胞病毒感染的预防、监测和治疗
[0478] 在对于CMV抗体为血清阳性的受体中,CMV预防包括在干细胞输注前第十天和第二天之间的更昔洛韦(10mg/kg/天)。从+21天直到360天再输入更昔洛韦作为预先治疗。每周在血液样品中确定CMV抗原血症/PCR。如果CMV抗原血症/PCR发展,则将采用更昔洛韦(10mg/kg/天)或膦甲酸(180mg/kg/天)治疗患者。
[0479] 在输血前对血液制品进行照射(30Gy)。
[0480] 移植后的实验室评价:
[0481] 1.每日完整的血液相直到粒细胞和血小板为自续的,然后3次/周直至出院;出院后至100天至少每周一次,然后每2周一次直到12个月。
[0482] 2.肝和肾功能试验的普检分析,对于头30天每周两次,然后每周一次直到出院;如果有临床指征则更加频繁。
[0483] 3.用于通过FISH(性别不匹配的植入物)或细胞遗传学的嵌合状态形态分析的骨髓抽吸将在大约1、3、6、12个月时进行,并且此后每4个月进行持续大约3年。将根据临床指征来进行额外的分析。还将监测患有CML的患者用于复发的bcr/abl证据。
[0484] 4.将通过体外分析来监测免疫重建,所述体外分析包括循环淋巴细胞的表型分析、自然杀伤细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞的功能评价、对T-细胞和B-细胞有丝分裂原和免疫球蛋白水平的淋巴细胞转化响应。
[0485] 随访
[0486] 将每周两次评估全血细胞计数、对于CMV的抗原血症和PCR、反应蛋白C、完整的肝和肾功能直到第+90天。
[0487] 每两周直到+90d的外周血表型(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD57、HLADR),胸部X射线。
[0488] 从+90至+180每两周:
[0489] 全血细胞计数、对于CMV的抗原血症和PCR、反应蛋白C、完整的肝和肾功能。
[0490] 每月:
[0491] 免疫球蛋白水平、蛋白电泳,
[0492] 在+90后外周血表型(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD57、HLADR),胸部X射线。
[0493] 在+180后全血细胞计数、对于CMV的抗原血症和PCR、反应蛋白C、完整的肝和肾功能。
[0494] 疾病的完整再分期将在移植后的2、4、6、8、12、18和24个月进行,然后每年进行,这将包括通过在外周血和骨髓细胞上的HLA的PCR分析评价供体嵌合状态。
[0495] 对于体能状态评分标准参见表4所示。
[0496] 表4:卡洛夫斯基行为表现量表
[0497]
[0498] 供者淋巴细胞的安排的输注
[0499] 供体淋巴细胞输注(DLI)对于治疗在同种异体HSCT后的复发是有效的。然而,DLI的成功在一定程度上受到与GVHD相关的发病率和死亡率的限制。与单次的大输注相比,分次剂量的T-细胞不太可能产生GVHD并且似乎对于诱发缓解为有效的[Dazzi,Szydlo等4
人,Blood,(2000)96:2712-6]。最近的一项剂量探索的研究表明,可以将1×10 个未处理的+
CD3 淋巴细胞/千克受体体重安全地输注到患者中,而该患者已接收T细胞被耗尽单倍体同一性移植[Lewalle P等人.Bone Marrow Transplant(2002)29(suppl 2):S26,0164a]。
[0500] 患有早期分子学和/或血液学复发的患者将接收1×104个CD3+细胞/Kg受体体5 +
重的第一剂量;在不存在GvHD下,在45天后给予1×10 个CD3 细胞/Kg的第二输注,接
6 +
着2个月后是1×10 个CD3 细胞/Kg的第三剂量。在造血细胞的活动化前供体将经历leukoapheresis以收集淋巴细胞,因为已经显示G-CSF对一些T淋巴细胞亚群具有免疫调节作用,从而降低其对同种异体刺激的响应性。将冷冻的产品解冻并在5-10分钟的时间段内迅速输注。患有急性GvHD的或不能显示血液植入的患者将不会接收任何DLI。
[0501] 患有复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者会每周接收利妥昔单抗375mg/m2,持续4周,第二次利妥昔单抗剂量伴随DLI。患有复发性多发性骨髓瘤的患者将在DLI开始前(第1、4、8天,1.3mg/sqm)采用硼替佐米来进行治疗。
[0502] 将不使用DLI后免疫抑制剂。
[0503] 虽然已结合其特定实施方案对本发明进行了描述,但是明显的是,许多替换、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此,旨在包括落入所附权利要求的精神和宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变化。
[0504] 将在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以其整体在此并入作说明书中,其程度如同具体地和单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请并入本文作为参考。此外,在本申请中的任何参考文献的引用或标识不应当被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的程度上,它们不应该被解释为必要的限制。
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