[0001]本发明涉及具有不饱和的或者不饱和的并且被定向的结合性表面的支持物，包括 具有用于亲合分析的包含配体的结合性表面的支持物。本发明的方面尤其涉及包含生物 素、或生物素以及生物素特异性的配体结合剂比如链霉抗生物素蛋白(SA)的结合性表面。 提供了用于免疫测定的结合性表面，包括包含抗原或抗体或它们的片段的结合性表面。本 发明进一步的实施方式涉及封闭的固体支持物表面和分散的微粒。提供了用于制备并使用 这些支持物的方法。

[0002]结合性表面在多种应用，例如，亲合分析中被广泛使用。典型地，通过最大化每 单位固相支持物表面的表面面积上的配体结合剂量而制备出普通的结合性表面。尽管常规 方法可以得到具有高密度配体结合剂的支持物表面，但简单地最大化支持物表面上的配体 结合剂的数量不会一成不变地提高结合性表面的性能。一些在亲合分析中使用的普通结合 性表面可以通过将配体结合剂直接涂敷到固相上、并且用牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋 白封闭固相而最大化结合力，该配体结合剂比如是抗体，或者是生物素特异性的配体结合 剂比如SA。尽管这最大化结合性表面的抗原或生物素结合力，但各个抗体或生物素特异 性的配体结合剂在结合性表面上很拥挤，没有特定的定向。并且传统的封闭策略不能必要 地抑制或者减轻抗体或者生物素特异性的配体结合剂从结合性表面上脱落。另外，脱落能 够引起很弱的分析灵敏度(最佳以下的信噪比)、准确度、精确性、稳定性、或可制造性、 或其组合。由于空间位阻，结合性表面的拥挤和随机定向能够降低结合性表面的结合效率 或能力。因此，需要有改进的结合性表面和组成、以及用于不依靠简单地最大化结合性表 面上的配体结合剂的密度而制备改进的结合性表面的方法。

[0003]本发明提供了不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面；提供了用于制 备不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方法；并且提供了用于制备不饱和 的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的成分的方法。本发明还提供了用于亲合分析 比如，例如，免疫测定的不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方法和组成。

[0004]在一个方面，本发明提供了用于制备用于免疫测定的不饱和的、或者不饱和的并 且被定向的捕获部分的方法和组合物，其中，由于结合至不饱和的、或者不饱和的并且被 定向的结合性表面，该捕获部分是不饱和的、或者不饱和的并且被定向的。在一个特定的 实施方式中，捕获部分包含免疫球蛋白或其片段，其中，捕获部分通过与固定在支持物连 接物(coupler)上的配体结合而被固定在不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表 面上，其中，支持物连接物被固定在固相支持物上。在一个特定的实施方式中，免疫球蛋 白或其片段被生物素化，生物素化的免疫球蛋白或其片段与生物素特异性的配体结合剂 (生物素结合性部分)相连接，并且生物素特异性的配体结合剂与直接地或者通过支持物 连接物而附接于支持物的生物素相连接。在一个特定的实施方式中，支持物连接物包含蛋 白质，并且固相支持物包含微粒。

[0005]在另一个方面，本发明提供一种用于通过使用具有不饱和的、或者不饱和的并且 被定向的结合性表面的支持物进行免疫测定的方法，其中，该方法包括使用免疫球蛋白或 其片段来捕获分析物，其中免疫球蛋白或其片段是不饱和的、或者不饱和的并且被定向在 结合性表面上。在各种实施方式中，免疫球蛋白或其片段的不饱和的、或者不饱和的并且 被定向的性质由结合性表面的不饱和的、或者不饱和的并且被定向的性质所确定，因为免 疫球蛋白或其片段被结合于该结合性表面。

[0006]在另一个方面，本发明提供了一种具有不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面的支持物，其包含直接地或通过偶联于支持物连接物间接地与支持物偶联的配 体，其中所述支持物连接物被偶联于支持物。其中，配体的密度是约1.0×10-3至约5.0× 10-1微摩尔配体/每平方米支持物；或者约0.5×10-2至约2.0×10-1微摩尔配体/每平方米支 持物；或约1.0×10-2至约1.6×10-1微摩尔配体/每平方米支持物；或约1.0×10-2至约2.0× 10-1微摩尔配体/每平方米支持物。作为另一种选择，配体的密度是约0.5×10-4至约10×10-4 微摩尔配体/每毫克(mg)微粒；或约1.0×10-4至约5.5×10-4微摩尔配体/每mg微粒。 在各种实施方式中，支持物连接物以约1.2×10-2微摩尔/每平方米分析物支持物至约7.5× 10-2微摩尔/每平方米分析物支持物的密度存在于分析物支持物上。在各种实施方式中，配 体与配体结合剂相连接，其中，配体结合剂的密度是小于约0.4×10-2至小于约8×10-2微 摩尔配体结合剂/每平方米支持物、或者其密度是约1.0×10-2至约5.0×10-2微摩尔/每平方 米分析物支持物。

[0007]本发明实施方式的目的在于使捕获部分以约1.0×10-4微摩尔/每平方米分析物支持 物至约2.0×10-2微摩尔/每平方米分析物支持物的密度存在于分析物支持物上。在各种实 施方式中，结合性表面还包括捕获部分，其中，捕获部分的密度是小于约2×10-3至小于约 4×10-2微摩尔捕获部分/每平方米支持物。在一个特定的实施方式中，配体(例如，生物 素)的密度是约1.9×10-2至约1.6×10-1微摩尔配体/每平方米支持物，配体结合剂(例如， 生物素结合性部分比如SA)的密度是约1.0×10-2至约5.0×10-2微摩尔/每平方米分析物支 持物、或者约1.2×10-2至小于约4.6×10-2微摩尔配体结合剂/每平方米支持物，并且捕获 部分(例如，生物素化捕获部分比如生物素化对分析物特异的抗体)的密度是约2.5×10-3 至约1.4×10-2微摩尔捕获部分/每平方米支持物。在本发明的至少一种实施方式中，支持 物连接物是任选的。在这样的一个实施方式中，配体可以是生物素或其衍生物。

[0008]在一个特定的实施方式中，配体包含生物素或其衍生物。在另一个特定的实施方 式中，配体结合剂包含生物素结合性部分或其片段比如，例如：抗生物素蛋白、SA、 NeutrAvidin(卵白素)、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其 混合物。在各种实施方式中，捕获部分包含抗体、抗体的结合性片段、受体、受体配体、 激素、激素受体、酶、酶的底物、单链的低聚核苷酸、单链的多聚核苷酸、双链的低聚核 苷酸、双链的多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白质中的一种或多种。在各种实施方式中，配体 通过支持物连接物与支持物偶联，并且支持物连接物依次与支持物偶联。在一个特定的实 施方式中，支持物连接物包含蛋白质。在一个特定的实施方式中，该蛋白质是BSA、卵清 蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在一个特定的实施方式中，支持物是 微粒。在一个特定的实施方式中，结合性表面具有约1×10-2至约5×10-1微摩尔配体/每平 方米支持物；或者作为另一种选择，结合性表面具有约2×10-2至约2×10-1微摩尔配体/ 每平方米支持物。在另一个特定的实施方式中，结合性表面具有约1.9×10-2至约1.6× 10-1微摩尔配体/每平方米支持物。在另一个特定的实施方式中，结合性表面具有约1.6× 10-2至约6.6×10-2微摩尔配体/每平方米支持物。在另一个特定的实施方式中，结合性表 面具有约1.6×10-2至约3.2×10-2微摩尔配体/每平方米支持物。在另一个特定的实施方 式中，结合性表面具有约1.6×10-2至约2.0×10-1微摩尔配体/每平方米支持物。

[0009]在各种实施方式中，结合性表面包含附接于配体的配体结合剂和附接于配体结合 剂的捕获部分，其中，捕获部分以一定密度存在。在各种实施方式中，捕获部分的密度为 配体密度的约75％、配体密度的约50％、以及配体密度的约25％。

[0010]在一个特定的实施方式中，配体包含生物素。该生物素通过支持物连接物蛋白质 而与支持物偶联，所述蛋白质选自于下组：BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片 段、或其混合物。该生物素被附接于配体结合剂，所述配体结合剂包含选自下组的生物素 结合性部分：抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin 的片段、或其混合物。并且生物素结合性部分被附接于生物素化的捕获部分，其中，该捕 获部分选自下组中的一种或多种：抗体、抗体的结合性片段、受体、受体配体、激素、激 素受体、酶、酶的底物、单链的低聚核苷酸、双链的低聚核苷酸、单链的多聚核苷酸、双 链的多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白质。

[0011]在另一个方面，本发明提供了一种具有不饱和的并且被定向的结合性表面的支持 物，其包含：设置在支持物上的多个支持物连接物；以及与支持物连接物偶联的配体；其 中，配体是不饱和的，并且以提供空间上可接近的配体的方式被定向在表面上。在一个特 定的实施方式中，配体与二价的或多价的能够特异性地与配体相连接的配体结合剂相连 接，并且结合性表面基本上不含未结合的、游离的配体。

[0012]在各种实施方式中，支持物连接物偶联有约1.9×10-2至约1.6×10-1微摩尔配体/ 每平方米支持物。

[0013]支持物连接物能够被通过共价的或非共价的连接关系而与支持物相偶联。在各种 实施方式中，支持物连接物与支持物共价偶联。在其中支持物连接物与支持物共价偶联的 实施方式中，本技术领域已知的任何合适的结合性化学技术能够被用于将支持物连接物附 接于支持物上。合适的结合性化学技术包括，但不限于，通过一种以上选自下组的官能团 进行附着：羧基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基、醛、胺、酰胺、酰肼、异硫氰酸酯、顺丁 烯二酰亚胺、以及巯基。在一个特定的实施方式中，通过使用用于进行附着的甲苯磺酰基 化学技术而将支持物连接物与支持物共价偶联。

[0014]支持物连接物能够包含任何合适的能够与支持物偶联并且还能够与配体偶联的物 质。与支持物的偶联、以及与配体的偶联可以是共价的。合适的支持物连接物包括，但不 限于，大分子比如，例如：蛋白质或其他的聚合物。在各种实施方式中，支持物连接物包 含蛋白质。该蛋白质可以是，例如：单体、二聚体、多聚体、或融合蛋白。在特定的实施 方式中，该蛋白质包含至少一种白蛋白，例如：BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白 的片段、或其混合物。

[0015]在各种实施方式中，配体包含生物素。用于将生物素附接至支持物表面或支持物 连接物的合适的生物素试剂包括：胺反应性的生物素标签试剂比如，例如：硫代-NHS-生 物素、硫代-NHS-LC-生物素、硫代-NHS-LC-LC-生物素、硫代-NHS-SS-生物素、NHS -PEO4-生物素、NHS-生物素、NHS-LC-生物素、NHS-LC-LC-生物素、PFP-生物素、 TFP-PEO-生物素、或NHS-亚氨基生物素三氟乙酰胺；巯基反应性的生物素标签试剂比如， 例如：马来酰亚胺-PEO2-生物素、生物素-BMCC、PEO-碘代乙酰基生物素、碘代乙酰基- LC-生物素、或生物素-HPDP；羧基反应性的生物素标签试剂比如，例如：生物素PEO- 胺、或生物素PEO-LC-胺；碳水化合物反应性的生物素标签试剂比如，例如：生物胞素 酰肼、生物素酰肼、或生物素-LC-酰肼；或者光反应性的生物素标签试剂比如，例如：补 骨脂素-PEO-生物素。在一个特定的实施方式中，配体包含生物素，并且通过使用胺反应 性的生物素标签试剂硫代-NHS-LC-生物素而被附接于支持物或支持物连接物。

[0016]在其中配体包含生物素的实施方式中，支持物上的结合性表面能够进一步包含与 生物素相连接的配体结合剂。在特定的实施方式中，配体结合剂包含生物素结合性部分。 在各种实施方式中，生物素结合性部分包含蛋白质，例如，至少一种的生物素结合性蛋白 质比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin 的片段、或者其混合物。该生物素结合性部分还可以包含融合蛋白比如，例如：融合于不 同的结合性蛋白的抗生物素蛋白。

[0017]在各种实施方式中，支持物连接物包含蛋白质，并且配体包含生物素，并且蛋白 质以低的生物素投入比率而被生物素化，从而使得支持物连接物具有小于或等于5摩尔生 物素/每摩尔支持物连接物的掺入比率。在一个特定的实施方式中，该蛋白质是BSA、卵清 蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。

[0018]在各种实施方式中，其中支持物上的结合性表面包含生物素结合性部分，支持物 上的结合性表面还包括与生物素结合性部分相连接的生物素化的捕获部分。该生物素化的 捕获部分可以包含间隔物，例如，其中，间隔物是在生物素部分和捕获部分之间。该生物 素化的捕获部分能够根据待捕获的物质而包含任何合适的捕获部分。合适的捕获部分包括 抗体、抗体的结合性片段、受体、受体配体、激素、激素受体、酶、酶的底物、单链低聚 核苷酸、双链低聚核苷酸、单链多聚核苷酸、双链多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白质中的至 少一种。

[0019]在各种实施方式中，支持物上的结合性表面还包括嵌段共聚物。所述嵌段共聚物 包含疏水性的头部基团，该疏水性的头部基团的侧翼为至少两个亲水性的尾部，其中，疏 水性的头部基团接触支持物。

[0020]亲水性尾部的长度能够各自独立地是头部基团长度的约2至约2.5倍。该嵌段共聚 物能够包含下述通式I的结构，其具有聚氧化丙烯区段和聚氧化乙烯区段：HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH    (I)，
其中，x和y被选择从而使聚氧化丙烯区段与支持物相连接。在一个特定的实施方式 中，x是约100至约135，y是约40至约75，并且z是约100至约135。在其他的实施方 式中，x是约110至约125，y是约60至约70，并且z是约110至约125。在各种实施方 式中，嵌段共聚物的平均分子量为约12,700道尔顿(Da)-17,400Da；或者平均分子量是 约9,000至约18,000Da。在特定的实施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是约9,840Da 至约14,600Da。在一个特定的实施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是约14,600Da。在 另一个特定的实施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是约12,600Da。

[0021]在各种实施方式中，支持物包含有机聚合物或共聚物。在各种实施方式中，有机 聚合物或共聚物是疏水性的。合适的聚合物包括，但不限于：聚苯乙烯、聚(二乙烯基苯)、 苯乙烯-酰化共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-环 氧乙烷)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N，N′- 亚甲基二丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、吡 咯化的(pyrolized)材料、嵌段共聚物、以及前述化合物的共聚物、硅酮、或二氧化硅。 在一个特定的实施方式中，支持物包含苯乙烯和二乙烯基苯，并且涂敷有聚氨酯层。

[0022]在各种实施方式中，使用疏水性的聚合物或共聚物将导致支持物具有超过约60度 的水接触角(water contact angle)。在各种实施方式中，使用疏水性的聚合物或共聚物将 导致支持物具有超过约70度的水接触角。

[0023]在各种实施方式中，支持物包含微粒。在一个特定的实施方式中，微粒包含顺磁 性材料或超顺磁性材料比如，例如，强磁性氧化铁Fe3O4或Fe2O3。术语“顺磁性”和“超 顺磁性”，指的是在磁场梯度中经受力、但是不会变得永久磁化的材料。在一个特定的实 施方式中，支持物包含呈磁赤铁矿、或Fe2O3形式的铁。在各种实施方式中，微粒的平均 直径在100nm至22,900nm的范围内。在一个特定的实施方式中，微粒的平均直径在约 750nm至约3,000nm的范围内。在另一个特定的实施方式中，微粒的平均直径在约950nm 至约1,150nm的范围内。

[0024]在另一个方面，本发明提供了用于亲合分析的改性支持物，其包含：包含一种以 上选自下组材料的支持物：聚苯乙烯、聚(二乙烯基苯)、苯乙烯-酰化共聚物、苯乙烯- 丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-环氧乙烷)、聚甲基丙烯酸甲酯、 聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N.N′-亚甲基二丙烯酰胺、聚烯烃、聚 乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、吡咯化材料、嵌段共聚物、以及前 述化合物的共聚物、硅酮、或二氧化硅；共价附接于支持物的蛋白质，其中蛋白质包含生 物素，其中，有小于5摩尔的偶联的生物素/每摩尔蛋白质；与生物素相连接的生物素结合 性部分，其中，生物素结合性部分是至少二价的；与生物素结合性部分相连接的生物素化 的捕获部分，其中生物素化的捕获部分是选自下组中的至少一种：抗体、抗体的结合性片 段、受体、受体配体、激素、激素受体、酶、酶的底物、单链低聚核苷酸、双链低聚核苷 酸、单链多聚核苷酸、双链多聚核苷酸、抗原、肽、或蛋白质；接触支持物的嵌段共聚物， 其中，嵌段共聚物包含聚氧化丙烯头部基团，聚氧化丙烯头部基团的侧翼为聚氧化乙烯尾 部，其中聚氧化丙烯头部基团接触支持物，并且其中聚氧化乙烯尾部的长度独立地是聚氧 化丙烯头部基团长度的约2至约2.5倍，并且其中嵌段共聚物的平均分子量是约9,840Da 至约17,400Da。该改性支持物可以包含微粒。在一个特定的实施方式中，微粒包含顺磁性 材料或超顺磁性材料比如Fe2O3，并且微粒的平均直径在950nm至1,150nm的范围内。在 一个特定的实施方式中，生物素化的捕获部分包含免疫球蛋白或其片段。

[0025]在另一个方面，本发明提供了一种用于涂敷支持物的方法，其包括：以配体对被 选择的支持物连接物的投入比率来结合配体和支持物连接物，从而得到配体::支持物连接 物复合物的混合物，其中，配体::支持物连接物复合物至少基本上不含游离的配体；以及 将配体::支持物连接物复合物共价附接于支持物。在一个特定的实施方式中，配体对支持 物连接物的投入比率是小于或等于8摩尔配体∶1摩尔支持物连接物。作为另一种选择，配 体对支持物连接物的投入比率是小于或等于4摩尔配体∶1摩尔支持物连接物。

[0026]在一个特定的实施方式中，该方法中的配体包含生物素，其中，配体包含胺反应 性的生物素标签试剂比如硫代-NHS-LC-生物素。

[0027]在各种实施方式中，支持物连接物包含蛋白质，并且配体包含生物素，并且蛋白 质以低的生物素投入比率而被生物素化，从而使得支持物连接物具有小于或等于5摩尔生 物素/每摩尔支持物连接物的掺入比率。在一个特定的实施方式中，该蛋白质是BSA、卵清 蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。

[0028]在另一个方面，本发明提供了一种用于涂敷微粒的方法，其包括：将微粒暴露于 分散剂从而形成分散相，其中，微粒包含含有配体和支持物连接物的结合性表面，所述配 体和支持物连接物被偶联以产生配体::支持物连接物复合物，并且分散剂包含嵌段共聚物， 该嵌段共聚物具有疏水性的头部基团，该疏水性的头部基团的侧翼为亲水性尾部基团；以 及将分散相暴露于与配体::支持物连接物复合物的配体相连接的配体结合剂。

[0029]在该用于涂敷的方法的一个特定实施方式中，配体包含生物素，并且用胺反应性 的生物素标签试剂比如硫代-NHS-LC-生物素与支持物或支持物连接物相偶联。在各种实 施方式中，支持物连接物包含蛋白质，如上所述，支持物具有不饱和的、或者不饱和的并 且被定向的结合性表面。在一个特定的实施方式中，该蛋白质包含BSA、卵清蛋白、BSA 的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。

[0030]在该用于涂敷的方法的各种实施方式中，配体结合剂包含生物素结合性部分。在 一个特定的实施方式中，生物素结合性部分是至少二价的，并且包含抗生物素蛋白、SA、 NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物中的 至少一种。

[0031]在各种实施方式中，该用于涂敷的方法还包括：将生物素化的捕获部分与生物素 结合性部分相连接。在该用于涂敷的方法的一个特定实施方式中，生物素化的捕获部分包 含抗体、抗体的结合性片段、受体、受体配体、激素、激素受体、酶、酶的底物、单链低 聚核苷酸、双链低聚核苷酸、单链多聚核苷酸、双链多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白质中的 至少一种。在一个特定的实施方式中，生物素化的捕获部分包含间隔物。

[0032]在另一个方面，本发明提供了一种用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的 并且被定向的结合性表面的方法，其包括：制备分析物连接性部分与空间填充部分的混合 物，从而形成稀释的混合物；以及在足以使分析物连接性部分和空间填充部分与支持物相 偶联、并且形成不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的条件下，将混合物暴 露于分析物支持物，所述结合性表面相对于与支持物表面偶联的分析物连接性部分的数量 是不饱和的。这里使用的分析物连接性部分可以是任何分子，比如蛋白质、抗体、或核酸， 当该分子与支持物表面结合时，其将直接地或通过连接性分子间接地与所研究的分析物相 连接；即，其将形成结合性表面的一部分。这里使用的空间填充部分可以是任何分子，比 如蛋白质、抗体、或核酸，其将与支持物表面相偶联，但是将不会直接地或通过连接性分 子间接地与所研究的分析物相连接。该空间填充部分不会形成结合性表面的一部分，但是 将具有占据支持物表面上空间、并且抑制过量分析物连接性部分的结合性的功能。

[0033]在另一个方面，本发明提供了一种用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的 并且被定向的结合性表面的方法，其包括：稀释配体::支持物连接物复合物与缺乏配体的 支持物连接物的混合物，从而形成稀释的混合物；以及在足以使配体::支持物连接物复合 物与支持物相偶联、并且形成不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的条件下， 将稀释的混合物暴露于支持物。

[0034]在该用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方 法的各种实施方式中，其中，支持物包括微粒，不饱和的结合性表面具有约0.5×10-4至 约10×10-4微摩尔配体/每毫克(mg)微粒、约1.0×10-4至约5.5×10-4微摩尔配体/每mg 微粒、或约2×10-4至约4×10-4微摩尔配体/每mg微粒。在该用于在支持物上制造不饱和 的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方法的特定实施方式中，其中，支持物包括 微粒，不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面具有约1.0×10-4至约5.5×10-4 微摩尔配体/每mg微粒、、或约1.6×10-4至约4.9×10-4微摩尔配体/每mg微粒。

[0035]在该用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方 法的特定实施方式中，支持物是粗糙的，并且不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合 性表面具有约1.0×10-2至约2.0×10-1微摩尔配体/每平方米。作为另一种选择，结合性表 面具有约1.9×10-2至约6.6×10-2微摩尔配体/每平方米。在该用于在支持物上制造不饱和 的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方法的其他特定实施方式中，支持物是光滑 的，并且不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面具有约3.3×10-2至约1.6×10-1 微摩尔配体/每平方米。在该用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面的方法的其他特定实施方式中，粗糙的不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面具有约1.9×10-2至约6.6×10-2微摩尔支持物连接物/每平方米；并且光滑的不饱 和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面具有约2.7×10-2至约7.1×10-2微摩尔支持 物连接物/每平方米。术语“粗糙的”形态学上包括花椰菜状、或多孔状。术语“光滑的” 指的是形态学上基本光滑，并且基本上呈球形。对于具有相同直径的微粒，由于粗糙的支 持物表面上的凹槽、凹点、或孔提供了增加的支持物表面积，故“粗糙的”支持物表面将 比“光滑的”支持物表面具有更大的支持物表面面积。支持物连接物、配体、配体结合剂、 捕获部分等的实际微摩尔数，将落在计算的粗糙的支持物表面积和光滑的支持物表面积之 间某处，因为对于配体、或支持物连接物、附着物而言，不是所有粗糙的支持物表面积在 空间上均是可利用的。

[0036]在该用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的方 法的各种实施方式中，支持物连接物包括蛋白质，如上所述，支持物具有不饱和的、或者 不饱和的并且被定向的结合性表面。在一个特定的实施方式中，该蛋白质包含BSA、卵清 蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。

[0037]在另一个方面，本发明提供了一种用于在支持物上制造不饱和的、或者不饱和的 并且被定向的结合性表面的方法，其包括：以配体对支持物连接物的任何投入比率制备配 体::支持物连接物复合物的混合物；用未与配体复合的支持物连接物稀释配体::支持物连接 物复合物的混合物，从而形成稀释的混合物；以及在足以使配体::支持物连接物复合物和 支持物连接物与支持物相偶联、并且形成不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表 面的条件下，将稀释的混合物暴露于支持物。然后可以根据在此描述的任何合适的方法处 理包含配体的支持物。

[0038]支持物连接物能够包含一种或多种蛋白质或者非蛋白质聚合物。在各种实施方式 中，配体通过在支持物连接物上的官能团被复合至支持物连接物。在将支持物连接物暴露 于配体之前，在一种以上支持物连接物上的官能团数量的一部分可以被省去或者中和，用 这样的方式降低能够与支持物连接物复合的配体的数量。在制备配体::支持物连接物复合 物的混合物中，全部或者仅一些被暴露于配体的支持物连接物可以具有一种以上被中和的 官能团。

[0039]在另一个方面，本发明提供了一种用于免疫测定的结合性表面，其中，结合性表 面包含多个能够结合配体结合剂的配体，所述配体结合剂可以结合所研究的捕获部分。结 合性表面上的配体是不饱和的、或者不饱和的并且被定向在支持物上，并且配体或者(a) 被直接地附接于支持物、或者(b)通过支持物连接物被附接，并且支持物连接物被附接 于支持物。在各种实施方式中，结合性表面基本上不含游离的(即，未结合的)配体。在 一个特定的实施方式中，支持物包含直径数量级为大约1微米至大约5微米的微粒，配体 包含生物素，并且生物素被复合至包含蛋白质的支持物连接物。在特定的实施方式中，配 体包含生物素；配体结合剂包含生物素结合性蛋白质；支持物连接物包含BSA、卵清蛋白、 BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物；并且BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清 蛋白的片段、或其混合物通过低投入比率的生物素而被生物素化。在一个特定的实施方式 中，生物素结合性蛋白质是SA，并且生物素化抗体存在于涂敷了SA的结合性表面上，其 中，生物素化抗体被挑选从而在免疫测定，例如竞争性免疫测定或夹心(sandwich)免疫 测定中捕获所研究的分析物。可以通过使用在此描述的任何合适的方法来制造免疫测定中 支持物上的结合性表面。

[0040]在另一个方面，本发明提供了一种具有不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面的支持物，其包含：多个设置在支持物上的支持物连接物；以及与支持物连接物 偶联的配体；其中，支持物连接物以约1.6×10-2至约7.1×10-2微摩尔/每平方米支持物的 密度存在于支持物上。在各种实施方式中，支持物连接物包含蛋白质。在一个特定的实施 方式中，该蛋白质是BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在各 种实施方式中，配体包含生物素。在一个特定的实施方式中，生物素的密度是约1.9×10-2 至约1.6×10-1微摩尔生物素/每平方米支持物。在各种实施方式中，结合性表面包含能够 特异性地与配体相连接的配体结合剂。在各种实施方式中，配体结合剂的密度是约1.2× 10-2至约4.6×10-2微摩尔配体结合剂/每平方米支持物。在各种实施方式中，配体结合剂是 抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、 或者其混合物。在各种实施方式中，结合性表面还包括能够特异性地与配体结合剂相连接 的捕获部分。在各种实施方式中，捕获部分的密度是约2.5×10-3至约1.4×10-2微摩尔 捕获部分/每平方米支持物。在一个特定的实施方式中，捕获部分包含免疫球蛋白或其片段。

[0041]在另一个方面，本发明提供了一种具有不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面的支持物，其包含：多个设置在支持物上的支持物连接物；以及与支持物连接物 偶联的配体；其中，支持物连接物以约1.3×10-4至约2.1×10-4微摩尔支持物连接物/ 每mg支持物的密度存在于支持物上。在各种实施方式中，配体包含生物素。在一个特定 的实施方式中，生物素的密度是约1.6×10-4至约4.9×10-4微摩尔生物素/每mg支持 物。在各种实施方式中，结合性表面包含能够特异性地与配体相连接的配体结合剂。在各 种实施方式中，配体结合剂的密度是约1.0×10-4至约1.4×10-4微摩尔配体结合剂/每 mg支持物。在各种实施方式中，配体结合剂是抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片 段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物。在各种实施方式中，结合 性表面还包括能够特异性地与配体结合剂相连接的捕获部分。在各种实施方式中，捕获部 分的密度是约2.1×10-5至约4.1×10-5微摩尔捕获部分/每mg支持物。在一个特定的实 施方式中，捕获部分包含生物素化免疫球蛋白或其片段。

[0042]在另一个方面中，本发明提供了一种支持物上的结合性表面，其中，结合性表面 特异性地结合至多约为4.0×10-4微摩尔生物素/每mg支持物。在一个特定的实施方式中， 支持物包含微粒，并且特异性地结合约2.5×10-5至不超过约4.0×10-4微摩尔生物素/ 每mg微粒。在一个特定的实施方式中，支持物包含微粒，并且特异性地结合约7.5×10-5 至约3.5×10-4微摩尔生物素/每mg微粒。在另一个特定的实施方式中，支持物包含微粒， 并且特异性地结合约1.0×10-4至约3.0×10-4微摩尔生物素/每mg微粒。在各种实施方 式中，支持物包含附接于(直接地或者通过支持物连接物)与生物素结合性部分比如、例 如SA相连接的支持物上的生物素，并且前述生物素结合能力指的是生物素结合性部分(例 如SA)结合游离生物素的能力。

[0043]在另一个方面，提供了支持物上的结合性表面，其中，结合性表面特异性地结合 不超过约1.3×10-1微摩尔生物素/每平方米支持物。在一个特定的实施方式中，支持物 特异性地结合约3.0×10-3至不超过约1.3×10-1微摩尔生物素/每平方米支持物。在一个 特定的实施方式中，支持物特异性地结合约8.9×10-3至约1.2×10-1微摩尔生物素/每 平方米支持物。在一个特定的实施方式中，支持物特异性地结合约1.2×10-2至约9.9× 10-2微摩尔生物素/每平方米支持物。在各种实施方式中，支持物包含附接于(直接地或者 通过支持物连接物)与生物素结合性部分比如、例如SA相连接的支持物上的生物素，并 且前述生物素结合能力指的是生物素结合性部分(例如SA)结合游离生物素的能力。

[0044]除非另有说明，或者由本公开暗示，与在此描述的任何特定方法或组成有关的任 何实施方式可以被用于与在此描述的任何其他实施方式相结合。附图说明

[0045]图1A图示了在顺磁性微粒(PMP)结合性表面上制备不饱和的并且被定向的SA 的工序。

[0046]图1B是图1A的工序示意图的续页。

[0047]图2图示了本发明的一种具体实施方式，其包含：固体支持物表面；共价附接于 支持物表面的BSA或卵清蛋白；共价附接于BSA或卵清蛋白的生物素；与生物素相连接 的链霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin或抗生物素蛋白；以及与链霉抗生物素蛋白、 NeutrAvidin、或抗生物素蛋白相连接的生物素化抗体。

[0048]图3图示了在低投入比率的生物素化方法中在BSA分子上一些可能的生物素分子 取向。

[0049]图4图示了用低投入比率的生物素化BSA涂敷固相来制备不饱和的结合性表面。

[0050]图5图示了使用嵌段共聚物作为封闭剂用于固相支持物表面。

[0051]图6图示了使用嵌段共聚物作为分散剂用于包含生物素的结合性表面。

[0052]图7图示了用SA涂敷被嵌段共聚物封闭的生物素化结合性表面。

[0053]图8图示了将各种生物素化捕获部分施加至根据本发明制备的固相支持物表面上 的涂敷了SA的结合性表面。

[0054]图9A图示了用生物素化抗体或Fab片段涂敷的普通的或者标准的涂敷了SA的微 粒结合性表面。

[0055]图9B图示了用生物素化抗体或Fab片段涂敷的不饱和的并且被定向的涂敷了SA 的微粒。

[0056]图10，在A栏和B栏中，图示了与使用本发明的分散步骤相关的增加的可结合的 表面面积。

[0057]图11图示了在4℃下或37℃下用SA涂敷3天后生物素从生物素-BSA固体支 持物上脱落的分析。

[0058]图12显示了实施例6的工序再现性(可制造性)研究的表格中的数据。

[0059]图13显示了实施例6的进一步工序再现性(可制造性)研究的表格中的数据。

[0060]图14A显示实施例7的增强的稳定性研究的表格中的数据。

[0061]图14B是图14A的续表，显示了实施例7的增强稳定性研究的数据。

[0062]图15A显示了脱落分析的结果。

[0063]图15B是脱落分析结果的进一步的示意图。

[0064]图16A显示了对于根据本发明的具体实施方式制备的实施例11的各种大量的微 粒，进行实际的结合性表面的密度计算获得的表格中的数据。

[0065]图16B显示了对于根据本发明的具体实施方式制备的微粒，进行实际的结合性表 面的密度计算获得的表格中的数据，该数据通过采用粗糙度假定而由微粒数据衍生得来。

[0066]图16C显示了对于根据本发明的具体实施方式制备的各种大量的微粒，假定支持 物表面光滑情况下进行结合性表面的面积计算获得的表格中的数据。

[0067]图16D显示了在假定根据本发明的具体实施方式制备的支持物表面光滑的前提 下，进行结合性表面的密度计算获得的表格中的数据，该数据由微粒数据衍生得来。

[0068]图17是示意图，显示了在本发明的不饱和的结合性表面和本发明的不饱和的并且 被定向的结合性表面之间的差异。

[0069]本发明至少部分地基于通过如下步骤而实现的结合性表面的设计：(a)通过连接 少于饱和量的配体，产生沿着可接近的空间取向被稀疏地分散穿过支持物的结合性表面的 含有捕获部分的复合物；以及任选地，(b)通过衔接着地定位配体，并且沿着线性或近 似线性的结构(物理)取向依次定位含有捕获部分的复合物的其他组成部分，与通过简单 地通过增加配体密度的挤满支持物表面来设计结合性表面相比，可以得到具有更期望的质 量的结合性表面以用于进行分析、比如亲合分析(例如，免疫测定或核酸测定)。

[0070]用于制备结合性表面的常规方法典型地致力于最大化单位面积支持物上的配体含 量，而不考虑配体的可接近性和/或取向，从而经常导致在支持物上挤满配体。最大化单位 面积结合性表面上的配体可能会导致结合性表面性能的下降，这至少部分地归因于位阻效 应。性能下降还可能因过量的配体从结合性表面脱落而引起。

[0071]在此使用的术语“与......偶联”或其语法上的等价用语，是指在两个部分之间 共价的或非共价的结合或相互作用。术语“与......偶联”不是用于暗示偶联的取向或方 向。

[0072]在此使用的术语“融合蛋白”包括重组体蛋白(比如嵌合蛋白)、杂化蛋白、以 及合成衍生的蛋白。其用途为本领域技术人员所熟知。

[0073]根据本发明的不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面包括通过在支持 物上偶联少于饱和量的配体(例如，通过直接地附接于支持物，或者通过附接于被附接到 支持物上的支持物连接物)而构建的结合性表面。相对于配体“不饱和的”结合性表面是 这样的结合性表面：其具有次最大密度的配体/每单位支持物表面面积、或者具有次最大 密度的配体/每单位重量支持物。在本发明的一个特定实施方式中，不饱和的结合性表面 上的配体被相间隔地定向。这里使用的术语“相间隔地定向”或其语法上的等价用语，指 的是被分散开一定距离或面积的部分。换句话说，这些部分在支持物表面上被定向或者相 间隔，以使得它们基本上不接触最接近的邻位。

[0074]“次最大”密度的配体/每单位支持物表面面积，指的是相对于可以存在于支持物 表面上的配体数量而言是不饱和的结合性表面。例如，其上配体饱和的支持物表面具有最 大百分比的在给定条件下可以设置于支持物表面上的配体，最大百分比由100％表示(例 如，给定配体::支持物连接物复合物，其中支持物连接物上配体是饱和的，并且在可以促 进配体::支持物连接物复合物最大附着于支持物的条件下，复合物以其最大可能的密度被 设置在支持物上)。

[0075]对于在免疫测定中使用的结合性表面，不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结 合性表面可以是特别期望的。大部分免疫测定使用支持物上的结合性表面。在许多这些应 用中，支持物是微粒或微孔板，其中用于捕获分析物例如抗原的部分被构造在其他分子上， 从而形成可结合分析物的含有捕获部分的复合物。其一个非限制性的实施例是具有固定在 微粒上的免疫球蛋白的免疫测定。该免疫球蛋白可以被直接地固定在支持物上，或者该免 疫球蛋白可以被偶联(例如，共价偶联)于依次被固定在支持物上的其他分子上。在此描 述在上述两种状态下制备不饱和的结合性表面。提供如下情形的详细实施例，其中免疫球 蛋白或其片段不是被直接附着于支持物，而是代之以与被附接于支持物的其他部分相连 接。

[0076]术语“偶联”包括：(a)共价结合(例如，直接地或通过一个以上碳-碳键、碳- 氮键、碳-氧键等间接地)；以及(b)非共价结合(间接地或者直接地)。

[0077]已知可特异性地彼此相互作用的实体可以被共价偶联。已知可特异性地相互作用、 并且可以被共价偶联的实体的一个非限制性实施例是抗原及其特异抗体，其可以通过例如 偶联化学技术而被共价附接。

[0078]不能特异性地彼此相互作用的实体可以被共价偶联。已知不能特异性地彼此相互 作用、但可以被共价偶联的实体的一个非限制性实施例是SA和BSA，其可以通过例如偶 联化学技术而被共价附接。

[0079]非共价结合的例子包括：亲合力、离子结合、范德华力(例如，偶极/偶极或者伦 敦力)、氢键结合(例如，在多聚核苷酸双链之间)、以及疏水作用。其中连接关系是非 共价的，在实体之间的连接关系优选是特异性的。特异性的非共价连接关系的非限定性的 例子包括：在生物素与生物素结合性蛋白质比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的 片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin片段、或其混合物之间的相互结合作用；生物素化 Fab、生物素化免疫球蛋白或其片段、生物素化小分子(比如，例如激素或受体配体)、 生物素化多聚核苷酸、生物素化大分子(例如，蛋白质或者天然或合成的聚合物)与生物 素结合性蛋白质比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段、 NeutrAvidin的片段、或其混合物的结合；底物与其酶的结合；糖蛋白与对糖蛋白特异的凝 集素的结合；配体与对配体特异的受体的结合；抗体与该抗体对其抗性升高的抗原的结合； 以及在多聚核苷酸与互补的或者基本上互补的多聚核苷酸之间形成双链；等等。

[0080]对于具有附接于微粒的生物素化蛋白质(配体::支持物连接物复合物)的微粒，提 供了特定的例子。其中，生物素化蛋白质被SA(生物素结合性部分)涂敷，并且涂敷了 SA-生物素化蛋白质的微粒然后用在测定中用于捕获分析物的生物素化免疫球蛋白或其生 物素化片段(生物素化的捕获部分)涂敷；或者结合另一种在测定中用于捕获分析物的免 疫球蛋白或其片段(例如，生物素化山羊x小鼠IgG被用于捕获小鼠IgG x抗原1，后者 是用于捕获抗原1)。在支持物表面上的生物素化蛋白质的不饱和本性被反映在SA涂层 中，由于与其连接的生物素的不饱和性质，该SA涂层也是不饱和的，这导致用于捕获分 析物的生物素化免疫球蛋白(或者生物素化免疫球蛋白片段)的不饱和性、或者用于捕获 可捕获分析物的额外的免疫球蛋白或片段的生物素化免疫球蛋白(或者生物素化免疫球蛋 白片段)的不饱和性。

[0081]在本发明的各种实施方式中，配体可以被共价结合于支持物连接物、或者非共价 结合于支持物连接物。在一个特定的实施方式中，配体被共价结合于支持物连接物，并且 配体结合剂是至少二价的。在另一种特定的实施方式中，配体是生物素并且被共价结合于 支持物连接物，而配体结合剂是至少二价的部分比如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、 或NeutrAvidin、链霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin的片段、或其 混合物。在其中配体结合剂是至少二价的实施方式中，配体共价偶联于支持物连接物可以 得到更稳定的结合性表面，因为过量配体的脱落被降低或消除。

[0082]在其他的实施方式中，配体共价偶联于支持物连接物是任选的。例如，其中配体 是具有单一结合位点的抗体片段，配体可以非共价地与支持物连接物偶联。

[0083]因此，本发明包含了用于提供用于免疫测定的不饱和量的捕获部分的方法和组合 物，其中，由于结合至不饱和的支持物表面，该捕获部分是不饱和的。在各种实施方式中， 捕获部分可以被用于进一步捕获捕获性部分。例如，用生物素-BSA(配体::支持物连接物 复合物)涂敷的支持物再用SA(配体结合剂)涂敷，用生物素化山羊x小鼠IgG涂敷的 支持物可以进一步用例如小鼠IgG x TSH涂敷，然后其可以用于捕获TSH分析物。

[0084]在支持物表面上的组分的密度可以用多种方式表示。对于微粒支持物比如，例如， 微粒，其适宜于用单位重量微粒来论述结合性表面上的组分密度，例如，微摩尔组分(例 如：配体，比如生物素；配体结合剂，比如SA；捕获部分，比如对分析物特异的生物素 化IgG；等等)/每mg微粒。对于非微粒支持物比如，例如，微孔板、其适宜于用支持物 的表面面积来论述组分密度，比如，例如，微摩尔配体结合剂/每平方米。对于下述物质， 可以用支持物表面上的组分密度表示：配体(例如，实施例中的生物素-BSA微粒上的生 物素，用生物素结合性来表示)或者构造在支持物表面上的任何其他组分(例如，在生物 素-BSA微粒的例子中，用与微粒结合的SA、或者与SA结合的对分析物特异的生物素化 免疫球蛋白来表示)。

[0085]由于小于地饱和量的配体与支持物偶联(直接或通过例如蛋白质间接地)，逐层 的配体结合剂将是不饱和的，并且在附接于支持物的配体层上的配体结合剂的密度将包含 连续地变小的密度(例如，连续地变小的微摩尔/每mg微粒、或微摩尔/每平方米)。因此， 对于根据本发明的生物素化微粒的实施例，在支持物表面上的SA密度将低于BSA支持物 连接物的密度，后者将低于支持物表面上的生物素配体的密度(在加入SA以前的估算值)。

[0086]因此、在微粒支持物比如约1.0微米直径的微粒、或非微粒的支持物(例如，微孔 板)的各种实施方式中，其中支持物连接物明显大于配体(例如，白蛋白支持物连接物的 分子量为约66,000Da，而生物素配体的分子量为约244Da)，配体结合剂(例如，SA) 的密度要小于配体::支持物连接物复合物(例如，生物素-BSA)的密度约10％至约90％， 在多种实施方式中，其密度小于配体::支持物连接物复合物的密度约30％至约70％，并且 在多种实施方式中，其密度小于配体::支持物连接物复合物密度约40％至约60％。在一个 特定的实施方式中，配体结合剂包含生物素结合性部分比如，例如SA；并且配体包含与 支持物连接物比如，例如，BSA或卵清蛋白或其混合物、或者BSA或卵清蛋白或其混合 物的片段偶联的生物素。

[0087]在多种实施方式中，附接于配体结合剂(其中配体结合剂依次与配体相连接)的 捕获部分也是不饱和的。在多种实施方式中，在微粒或非颗粒支持物上的捕获部分的密度 要小于配体结合剂的密度约10％至约90％，在多种实施方式中，其密度小于配体结合剂的 密度约30％至约70％，并且在多种实施方式中，其密度小于配体结合剂的密度约40％至约 60％。

[0088]另一种饱和水平的表示方式，是与可与支持物偶联的配体的最大含量相比较。在 各种实施方式中，相对于配体不饱和的支持物表面将具有少于100％的偶联配体。例如， 在支持物表面上的配体的百分比可能是可以设置于支持物表面的配体最大含量的约10％至 约90％。或者在支持物表面上的配体的百分比可能是可以设置于支持物表面的配体最大含 量的约20％至约80％。或者在支持物表面上的配体的百分比可能是可以设置于支持物表面 的配体最大含量的约30％至约70％。在支持物表面上的配体的最佳百分比(以100％为配 体的最大数值)是提供下述条件的配体百分比(或百分比范围)：最优信噪比、配体从结 合性表面上的最低解离、最大稳定性(在与应用有关的温度处)，以及与普通的结合性表 面相比在确认研究中相对低的变化(例如，小于10％、更优选5％以下)。如同在本申请 中在别处的解释，支持物连接物是任选的。例如，配体可以是与固相支持物表面偶联的生 物素或其衍生物。

[0089]由于小于饱和量的配体与支持物偶联(直接地或通过例如蛋白质间接地)，逐层 的配体结合剂和捕获部分将是不饱和的，并且在与支持物偶联的配体层上的逐层配体结合 剂和捕获部分的密度将包含连续地变小的密度(例如，连续地变小的微摩尔/每mg微粒、 或微摩尔/每平方米)。因此，对于根据本发明的生物素化微粒的实施例，支持物表面上的 生物素化IgG(生物素化的捕获部分)的密度将低于SA(生物素结合性部分)的密度，支 持物表面上的SA密度将低于BSA支持物连接物(生物素-BSA)的密度，后者将低于支 持物表面上的生物素密度(生物素-BSA；在加入SA之前的生物素密度估算值)。

[0090]在一个特定的实施方式中，表面包含的生物素(生物素-BSA)密度为约1×10-5 至约5×10-2微摩尔生物素/每mg微粒，或者作为另一种选择该密度为约1.6×10-4至约 4.9×10-4微摩尔生物素/每mg微粒。在其他实施方式中，表面包含的BSA(生物素-BSA) 密度为约1.6×10-4至约4.9×10-4微摩尔BSA/每mg微粒，包含的SA密度为约1.0× 10-4至约1.4×10-4微摩尔SA/每mg微粒，或者包含的生物素化IgG的密度为约2.1×10-5 至约4.1×10-5微摩尔生物素化IgG/每mg微粒。在一个特定的实施方式中，粗糙的支持 物表面包含的生物素(生物素-BSA)密度为约1.9×10-2至约6.6×10-2微摩尔生物素/ 每平方米，包含的BSA(生物素-BSA)密度为约1.6×10-2至约2.9×10-2微摩尔BSA/ 每平方米，包含的SA密度为约1.2×10-2至约1.9×10-2微摩尔SA/每平方米，并且包含 的生物素化IgG密度为约2.5×10-3至约5.5×10-3微摩尔生物素化IgG/每平方米。

[0091]根据在此描述的方法和组合物，可以制备出，包含使用任何配体的不饱和的、或 者不饱和的并且被定向的结合性表面的支持物。例如，通过以二、或三、或四、或更大的 选择的低聚核苷酸或多聚核苷酸对支持物或支持物连接物的投入比率而(直接地或者通过 支持物连接物)将低聚核苷酸或多聚核苷酸结合至表面，低聚核苷酸或多聚核苷酸结合性 表面可以是不饱和的。因为通常要选择本技术领域已知的投入比率来最大化支持物表面上 的配体含量，故适当的起始投入比率是本技术领域已知的投入比率，然后逐步降低投入比 率(例如，二分之一、八分之一、十六分之一等)一旦低聚核苷酸或多聚核苷酸被附接于 支持物表面上，通过使用本技术领域已知的任何合适的方法(例如，对于与配体低聚核苷 酸或多聚核苷酸互补的荧光性低聚核苷酸或多聚核苷酸，用定量的结合荧光)，可以测量 结合的效率。通过测量由表面产生的对于固定量的结合性表面(例如，涂敷有低聚核苷酸 或多聚核苷酸配体的1微米微粒的克数)的信号量(例如，通过测量结合荧光性的互补低 聚核苷酸或多聚核苷酸)，可以确定配体低聚核苷酸或多聚核苷酸对支持物连接物或支持 物的合适的投入比率。得到期望的饱和水平，其中信号量对微粒重量的比率为最高(所有 其他的变量近似恒定)。该一般程序可以用于评价在任何期望的结合性表面上的期望饱和 水平。这里使用的低聚核苷酸是长度为约30个碱基或以下的核酸，而多聚核苷酸是长度 约30个碱基以上的核酸。

[0092]通过使用在此描述的用于基于生物素应用的方法的同类方法，本领域的技术人员 可以确定给定应用中结合性表面上配体的最佳百分比。例如，如果低聚核苷酸或多聚核苷 酸被用作配体以代替生物素，那么可将低聚核苷酸或多聚核苷酸与支持物连接物(例如， 蛋白质或核蛋白)偶联，并且合适的固相可以用低聚核苷酸或多聚核苷酸及其支持物连接 物涂敷。类似于在此描述的方法，可以进行稳定性、脱落或解离、信噪比、以及确认研究， 以得到最佳的每单位面积结合性表面的配体含量(例如，最大值的10％至90％、20％至80％、 30％至70％等)。一个便利的方法是：首先最大化每单位表面面积的低聚核苷酸或多聚核 苷酸含量；然后使用在此描述的方法(例如，在制备配体::支持物连接物复合物中，以低 聚核苷酸或多聚核苷酸对支持物连接物的数种较低的摩尔投入比率)制备不饱和的并且被 定向的表面；并且比较由各种制品得到的稳定性、解离、信噪比、以及验证。

[0093]在结合性表面上定向配体包括物理地定向配体，即，调节配体相对于其围绕物的 布局。含有最大含量的配体/支持物连接物结合性表面通常会导致许多配体是空间上不可接 近的，并且在间距小的相邻的配体间会竞争进入的所研究的用于结合复合物中配体的分 子。这里使用的术语“物理(结构性)定向”、或其语法上的等价用语，意思指以如下方 式被操控的部分：大多数部分被定向至朝向特定的方向。在本发明的一个实施方式中，这 些部分被这样定向：识别部位或结合位点基本上被定向成离开支持物表面。在本发明的另 一个实施方式中，物理地定向的部分被衔接着地连接。

[0094]通过在此用于任何配体::支持物连接物配对的方法，可以实现定向。一个在结合性 表面上定向配体的方法是：以低的配体对支持物连接物的摩尔投入比率来制备配体::支持 物连接物复合物(在此提供生物素-BSA复合物的实施例)。如同在别处描述的那样，使 用低的配体对支持物连接物的摩尔投入比率的目的是，制备具有控制量的偶联配体/支持物 连接物的复合物。通过提供基本上不含游离配体的表面(例如，抑制或者减轻配体脱落) 来取得控制量(即，次最大值)的配体/支持物连接物，可能会导致在表面上的配体的较好 的空间可接近性、相邻配体之间较少的相互作用、结合性表面上的配体之间更均一的的距 离(平均)、以及提高的稳定性。

[0095]本发明的组合物和方法包括对测定性能参数包括灵敏度(信噪比)、准确度、测 定精确性(定量测定)、测定再现性(定性分析)、以及稳定性的改进、以及对测定生产 参数比如顺磁性微粒(PMP)生产工艺再现性(PMP可制造性)的改进，或对上述参数的 组合的改进。在本发明中包括的组合物和方法用于：用于亲合分析的不饱和的、或者不饱 和的并且被定向的生物素结合分子(例如，不饱和的、或者不饱和的并且被定向的生物素 化抗体被用作在夹心和竞争性测定中的固相捕获抗体)；减小测定中的与非特异性结合或 者异嗜性干扰相关的噪音、或背景；由于增强微粒分散(增加有效表面面积和碰撞率；降 低测定扩散距离)而提高测定信号；由于SA不饱和、或者不饱和和定向(空间自由度用 以结合较大的和较小的结合生物素的分子，提高结合效率)而提高测定信号；由于结合生 物素的分子的不饱和、或者不饱和并且定向(空间自由度用以捕获或结合较大的或较小的 分析物结合剂(生物素化的捕获部分)和/或分析物，改进分析物结合剂(生物素化的捕获 部分)和/或分析物识别性以及分析物结合剂(生物素化的捕获部分)比活力)而提高测定 信号；增强产品稳定性(改进封闭效率并且减少SA从表面上脱落)；以及/或者由于用于 在微粒表面上制备不饱和的、或者不饱和的并且被定向的SA的工艺优化而提高免疫测定 实用性和工序再现性。在各种实施方式中，通过将不同水平的配体结合剂(例如，SA)滴 至配体(例如，生物素)，并且/或者将不同水平的捕获部分(例如，生物素化抗体)滴至 配体结合剂(例如，SA)，可以增强在不饱和的、或者不饱和的并且被定向的支持物表面 上的信噪比，以便取得最佳的信噪比。

[0096]在如下一种实施方式中，通过使用3～6微克生物素化IgG/每mg微粒的生物素化 抗体投入量，得到了免疫测定中的最优信噪比和IgG结合力：该实施方式基于涂敷有低投 入比率的生物素化BSA的微粒、用嵌段共聚物F108(购自BASF公司)封闭、 用F108分散、并且用SA涂敷。当IgG投入量大于10微克生物素化IgG/每mg 微粒时，在IgG结合力的信噪比方面没有显著的变化。IgG投入量小于3微克生物素化IgG/ 每mg微粒会导致信噪比和IgG结合力的显著降低，并且当抗体投入量接近零时，信噪比 和IgG结合力接近于零。

[0097]虽然在此进行了讨论，并且例举了实施例、和相关的附图、使用生物素作为配体 的本发明实施方式，但是，本发明不局限于具有生物素的结合性表面。即，在此的描述可 以被概括为使用所述方法和组合物的其配体可以是不饱和的、或者不饱和的并且被定向的 任何结合性表面。下述具有生物素作为配体的结合性表面的描述被用于说明用于制备不饱 和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面的组合物和制造方法。

[0098]此外，如同在该说明书的其它部分的解释，支持物连接物是任选的。因此，支持 物连接物只是本发明的一个具体实施方式，并且对支持物连接物的描述并非是对本发明的 限制。

[0099]提供了包含不饱和的并且被定向的配体的结合性表面。该结合性表面可以被用于 构造适合于捕获任何所研究分子的捕获部分的表面。在表面上的配体的不饱和的本性和定 向允许更多组分比如捕获部分的设置，所述更多组分在结合性表面上的布置反映了衬底配 体的不饱和的本性和定向。[00100]提供了多种实施方式的配体::支持物连接物复合物，根据在此描述的方法，使用 低的配体对支持物连接物的摩尔投入比率而制备所述复合物，以使得在支持物连接物上设 置次最大量的配体，并且因此使得脱落被降低。这些复合物可以被用于产生本发明的不饱 和的并且被定向的结合性表面。在制备配体::支持物连接物复合物中使用低的配体对支持 物连接物的投入比率的实施方式可能对如下情况特别有用：其中二价或多价的配体结合剂 被使用(比如，例如，其中生物素是配体，而二价或多价的生物素结合性蛋白质比如SA 是配体结合剂)。
[00101]提供了分散剂和制造包含结合性表面的微粒的方法、以及制造具有结合性表面的 微粒的方法，例如，在加入生物素结合性部分比如SA(配体结合剂)之前，在分散涂敷 有生物素(配体)的微粒中使用嵌段共聚物比如嵌段共聚物。这里可以使用的具 体嵌段共聚物、以及它们的数均分子量，包括F108(约12,700-17,400Da，平均 值为约14,600Da)和F127(约9,840-14,600Da，平均值为约12,600Da)。根据厂商，在 此描述的各个的嵌段长度为近似值，因为精确的嵌段长度将随批次而变。除非另 有说明、或者由上下文显而易见，嵌段共聚物的分子量被表示为数均分子量。
[00102]本发明提供的方法用于制备在涂敷表面中使用的稳定的生物素化分子(例如，生 物素-BSA和生物素-卵清蛋白)用于捕获具有两个以上生物素结合性结构域的分子(例如， 抗生物素蛋白、SA、以及NeutrAvidin)。这些物质被依次用于结合在结合性测定中可以 捕获所研究的其他分子的生物素化捕获部分(例如，对于生物素化抗体，所研究的分子是 抗原；对于生物素化小分子，所研究的分子可以是酶、抗体、或者可结合小分子的结合性 蛋白；等等)。提供了特定的实施例，当生物素化BSA时，使用通过以低摩尔的生物素投 入比率而制备的低投入比率的生物素化BSA，用于涂敷支持物来捕获SA。然后可以将该 SA复合至合适的生物素化的捕获部分。
[00103]本发明提供的方法用于将生物素化分子涂敷到支持物上来捕获、定向、以及连接 少于饱和量的分子，所述分子具有两个以上生物素结合性结构域(例如抗生物素蛋白、SA、 或者NeutrAvidin)。提供的特定实施例显示了在PMP表面上涂敷低摩尔投入比率的生物 素-BSA用于捕获、定向、以及连接少于饱和量的SA。
[00104]本发明提供的方法使用嵌段共聚物作为用于涂敷有生物素化和/或未生物素化的 分子的支持物的封闭剂。提供的特定实施例显示了使用三区段共聚物F108作为 用于涂敷有低投入比率的生物素-BSA的PMP的封闭剂。
[00105]本发明提供的方法用于通过使用嵌段共聚物作为用于涂敷有生物素化和/或未生 物素化的分子的微粒的分散剂。提供的特定实施例显示了使用F108作为用于涂 敷有低投入比率的生物素-BSA的PMP的分散剂。
[00106]本发明提供的方法用于在涂敷含有两个以上生物素结合性结构域的分子(例如， 抗生物素蛋白、SA、以及NeutrAvidin)期间，使用嵌段共聚物作为用于涂敷有生物素化 分子的微粒的分散剂。提供的特定实施例显示了在涂敷有低投入比率生物素-BSA的PMP 表面上涂敷SA期间使用F108作为分散剂(例如，在加入SA之前，先加入 F108来制备低投入比率生物素-BSA微粒的单分散体)。
[00107]本发明提供的方法用于将少于饱和量的包含两个以上生物素结合性位点的分子 (例如，抗生物素蛋白、SA、或者NeutrAvidin)涂敷、定向、以及连接到生物素化表面。 提供的特定实施例显示了在涂敷有低投入比率生物素-BSA的PMP表面上涂敷、定向、以 及连接少于饱和量的SA。
[00108]本发明提供的方法用于将少于饱和量的生物素结合分子连接、并且任选地定向到 表面上。提供的特定实施例显示了在特别地涂敷有SA(即，不饱和的并且被定向的)的 PMP表面上涂敷、定向、并且连接少于饱和量的含生物素的结合物(例如，生物素化抗体、 Fab片段、小分子、大分子、载体分子等)，用于亲合分析比如，例如，免疫测定。
[00109]亲合分析包括，可以确定样品中存在或不含分析物、和/或定量样品中的分析物含 量的测定，该测定直接或间接地基于在分析物和可优选地结合分析物的分子之间的特异性 的或者相对特异性的相互作用。亲和分析包括，在至少一些方面依赖于一种实体对另一种 实体的特异性或者相对特异性结合亲合力的分析。亲和分析包括，但不限于，依赖下述结 合性相互作用的测定：在受体和配体之间、酶与其底物之间、多聚核苷酸与其补体或者基 本上的补体之间、小分子与可特异性结合小分子的结合性蛋白之间等。免疫测定包括依赖 于在例如抗原与可识别抗原的抗体之间相互作用的测定。免疫测定还包括，例如，利用抗 体或其片段来结合样品中所研究抗原的测定。亲和分析还包括，例如，竞争性测试和夹心 法测试。这些测定包括：依赖于表面被结合的抗原的相互作用的测定，用来检测样品中所 研究的抗体；以及依赖于表面被结合的抗体或其片段的相互作用的测定，用来检测样品中 所研究的抗原。这里使用的术语“抗原”不局限于多肽或者蛋白质，而是还可以包括小分 子(比如，例如，半抗原)和抗体(例如，抗体可以被用作抗原来产生可识别它们的其他 抗体)。一般来讲，在此使用的抗原包括样品中通过使用本发明的组合物或方法用抗体或 其片段进行免疫测定的任何所研究的分析物。
[00110]在此描述的组合物和方法的特定实施方式的应用显示在图1A和1B中，显示了 在PMP表面上定向并连接少于饱和量的SA的特别情形。将在别处提供在该工序中的不同 步骤的更祥细说明。
[00111]对于表面包含生物素化BSA、能够结合SA、依次能够结合生物素化的捕获部分 比如例如免疫球蛋白或其片段的情况，提供了制备不饱和的并且被定向的表面的工序的一 般说明。提供的这些论述和实施例描述了生物素/SA体系，虽然本发明不局限于生物素化 的表面。
[00112]应当注意的是，因为论述和实施例使用了生物素，并且典型地利用生物素来结合 二价或多价的生物素结合性部分(比如，例如，SA)，所以使用多价生物素结合性部分的 事实存在这样的特殊的问题：可能不会与未使用多价配体结合剂的许多结合性表面相接 触。这些问题之一是，当使用涂敷有SA的生物素化微粒时，非共价结合的生物素的脱落 可能会妨碍结合性表面的性能(例如，游离的生物素可以与SA分离和复合)。在这种情 况下，该现象可以通过导入低投入比率的生物素化的BSA、而不是导入任意大大过量的生 物素化BSA而被减少，因为低投入比率的生物素可以降低与BSA相连接的非共价结合的 生物素的含量。
[00113]而且，当在微粒上用多价的部分比如SA涂敷支持物时，在涂敷SA期间可能会 出现聚集现象。这是因为各个SA分子结合了一个以上生物素分子。SA是四聚体蛋白质， 分子量约为56,000Da，并且生物分子的具体例子是其具有两个以上生物素结合性结构域。 抗生物素蛋白-生物素相互作用是已知的在蛋白质和配体之间最强烈的非共价相互作用，并 且SA四个亚基中的每一个都可以结合生物素，结合常数为Ka＝1015M-1。SA的三级结构 导致其四个生物素结合性结构域位于分子的相对侧。如果SA生物素结合性结构域之一结 合于生物素化表面，三个未被占据的生物素结合性结构域中的至少两个将仍然是空间上可 用于结合生物素化捕获部分的。抗生物素蛋白和NeutrAvidin是具有四个生物素结合性结 构域的四聚体蛋白质的其他实施例；它们不同于SA之处在于它们的pI、溶解性、以及非 特异性的结合特性。
[00114]当生物素化表面暴露于SA时，游离的SA将与表面上的生物素结合，但是与表 面结合的SA然后可以结合已与另一种微粒结合的生物素。按这种方法，可以形成大的微 粒聚集体。这可以通过在SA加入步骤产生单分散的微粒而被阐明。
[00115]简言之，用于在微粒上制备生物素-BSA表面的工序应从低投入比率的生物素化 的BSA开始。然后通过生物素-BSA中BSA中的伯胺对PMP的表面官能团的共价连接， 将低投入比率的生物素化BSA与PMP偶联。得到的生物素化PMP被悬浮于合适的 中一段时间(封闭步骤)，清洗，然后分离。接着，生物素化的PMP被悬浮于 合适的中(增强分散的步骤)，并且加入SA。微粒在室温下保温一段时间，清 洗，然后分离。一旦分离出来，可以加入合适的生物素化分子(比如生物素化捕获部分)， 用于任何特定的测定应用。
[00116]上述使用合适的的封闭步骤使非特异性、人为的结合现象最小化，同 时允许所要求的特异性连接产生本发明的基于配体的复合物，该非特异性的、人为的结合 现象涉及到本发明的不饱和的结合性表面上别的未被占据的结合位点(图5和图7)。这 样的封闭促进了作为它们的连接部分的本发明的基于配体的复合物的空间(立体的)可接 近性，并且便于本发明的各个基于配体的复合物按照形成目的的线性结构定向，借此提高 本发明的各个获得的含有捕获部分的复合物的优化测定性能参数作用的可能性，所述参数 包括作为实施例而非限定性的信噪比。另外，由于对免疫测定通常来说是正确的，封闭步 骤也使非特异性结合最小化，该非特异性结合可以被描述为在免疫测定中的人为结合现 象，该现象涉及其产生不期望有的副产品的组分和/或支持物表面，该副产品可能会对测定 性能参数包括作为非限制性的实施例的信噪比产生不利影响。这种人为的结合现象对信噪 比的不利影响可能采用如下形式：降低信号、提高噪音、或者同时采用上述两者。最终， 因为与支持物表面和结合性表面的特异性结合同时被优化、而与这些表面的非特异性结合 被最小化，所以本发明的基于配体的组分从支持物和微粒或微孔板的结合性表面上的脱落 附随地被最小化。因为这些原因，用合适的封闭的步骤导致性能和制造性的改进， 其对下述性能产生有益的影响：测定灵敏度(信噪比)、测定准确度、测定精确性(定量 测定)、测定再现性(定性分析)、测定稳定性、或者PMP生产工艺再现性(PMP可制 造性)、或它们的组合。
[00117]上述在微粒上制备生物素-BSA表面的工序期间通过在添加SA之前使用合适的 的增强分散步骤，，可以减轻微粒聚集，并且附随地提高暴露在微粒上的表面面 积(图6和10)，借此赋予微粒表面上最小数量的不能用于结合的基于配体的复合物。这 样的介导的抑制聚集性可用于包括、但不限于如下应用：增强PMP可制造性 (PMP工序再现性)，并且改进测定性能和其中使用这种PMP的试剂盒。当来自不同批 次PMP的微粒聚集水平在PMP生产工艺之前、期间、和之后是可控制时，增强了PMP 可制造性。在PMP生产工艺后，使用这种PMP进行测定的性能可以通过包括、但不限于 下述的手段被优化：在免疫测定期间在添加样本以前将微粒暴露于含有的溶液和 /或在免疫测定期间在添加底物之前将微粒暴露于含有的溶液。因为这些原因， 用合适的增强分散的步骤导致性能和制造性的改进，其对下述性能产生有益的影 响：测定灵敏度(信噪比)、测定准确度、测定精确性(定量测定)、测定再现性(定性 分析)、测定稳定性、或者PMP生产工艺再现性(PMP可制造性)、或它们的组合。
[00118]图1A和1B所示的工艺是这样的特定实施方式：其使用均一尺寸(＜5％CV)1.0 μm的MyOneTM甲苯磺酰基活化的(没有要求进一步的表面激活)PMP(Invitrogen 公司)、低投入比率(4分子生物素试剂∶1分子BSA)的生物素化BSA、F108 三区段共聚物(合成的、非生物学的；BASF公司)、SA21 SA-PLUSTM(冷冻，从不冻 干；)、磁石，来分离并洗涤微粒(缓冲液交换)。微粒处理涉及利用25mg PMP/mL 的浓度、在高处的混合和超声处理，从而再悬浮并分散微粒用于重悬浮工序，利用在高处 混合进行保温工序、升温(38-42℃)保温和室温保温，利用甲苯磺酰基化学技术将生物 素化BSA经由BSA伯氨基团而共价偶联于微粒表面甲苯磺酰基基团。利用F108 三区段共聚物用于微粒表面封闭(除去被动吸附的蛋白质、最小化蛋白质对微粒表面的非 特异性结合)，利用F108三区段共聚物用于PMP的单分散，并且当存在 F108三区段共聚物时将SA二级偶联(亲合)至生物素-BSA PMP中间体上(在 SA偶联工艺期间减轻微粒聚集)。
[00119]一种用于显示在制备不饱和的、或者不饱和的并且被定向的表面中以低投入比率 的生物素化后原理的便利途径是，通过泊松分布的透镜(the lens of a Poisson distribution) 来显示生物素化工艺。随后的示意图所示原理适用于所有的配体和支持物连接物配对(并 不仅仅是生物素和BSA)。当配体支持物连接物被涂敷在支持物上时，通过使用低的配体 对支持物连接物的投入比率制备的配体::支持物连接物复合物被认为可以得到更优选的配 体分子定向。该更优选的配体分子的定向有助于支持物上涂层的空间可接近性。为了示意 仅用于但并非限于任何特定的支持物连接物或配体的原理，在此使用生物素化的BSA说明 该现象。下述示意图适用于任何配体和支持物连接物，其中支持物连接物能够与一个以上 配体相连接。对于除生物素和BSA之外的配体和支持物连接物，如同在实施例1中的BSA 和生物素那样(参见表1)，通过选择可提供期望稳定性的投入比率、确定平均取代(λ)、 并且图示在合适的分布例如泊松分布中的定向效应，可以确定配体对支持物连接物的投入 比率。
[00120]就生物素化的BSA而言，在BSA的氨基酸序列中有大量能够通过使用伯胺反应 性的生物素化试剂硫代-NHS-LC-生物素而被生物素化的可能位点。赖氨酸--一种含有游离 伯胺的氨基酸，在BSA的氨基酸序列中出现59次。然而，在BSA中仅约30至35个赖氨 酸伯胺可以用来与胺反应性的生物素化试剂起反应。例如，N-末端胺类可以被掩埋、或封 闭在BSA的三级结构内部。仅位于分子表面(例如，顶部、底部、侧面、沟部、凹处等) 的伯胺可用于生物素化。已经凭经验确定(参见实施例1)，以4摩尔硫代-NHS-LC-生 物素/每摩尔BSA的摩尔投入比率来生物素化BSA可以得到平均约1.63生物素分子/每 BSA分子(参见表1)。
[00121]对于BSA生物素化，假定硫代-NHS-LC-生物素与BSA分子(4摩尔硫代-NHS -LC-生物素对1摩尔BSA)进行任意反应、并且平均取代值(λ)为1.63分子生物素/每 BSA分子，那么生物素化BSA分子的分布可以近似地使用泊松分布(参见图3：20％的 BSA具有0个生物素；32％的BSA具有1个生物素；26％的BSA具有2个生物素；14％ 的BSA具有3个生物素；6％的BSA具有4个生物素；2％的BSA具有5个生物素；并且 ＜1％的BSA具有6个生物素)。如图3所示，泊松分布显示，在选择的摩尔投入比率的生 物素∶BSA下，至少50％的生物素-BSA复合物具有少于或等于3个生物素/每个支持物连 接物(即，BSA)。该分布也显示，在选择的摩尔投入比率下，每个BSA分子结合有0 至6个生物素。
[00122]低投入比率的生物素化BSA可以被与支持物共价偶联，因为BSA具有约30至 35个伯胺可用于伯胺化学技术，并且泊松分布预计，在低投入比率的生物素化后，BSA的 0～6个伯胺被结合于生物素。因此，约24至35个伯胺仍然可以用来将各个BSA分子经由 伯胺化学技术(例如，甲苯磺酰基、环氧基、碳二亚胺等)共价偶联于支持物。多个可利 用的伯胺可以提高BSA偶联至支持物官能团的效率，并且可以经由多个连接点(即，一个 以上支持物对BSA共价键/每BSA分子)提高稳定性。
[00123]根据生物素化试剂厂商说明书(Pierce化合物公司.抗生物素蛋白-生物素化学技 术：手册A。M.Savage等，第二版，1992.第34页)，用2.5摩尔生物素/每摩尔蛋白质 生物素化的蛋白质还可以得到蛋白质库中的高斯(钟形)分布。虽然在该库中的一些蛋白 质可以不具有被结合的生物素，但大多数具有2-3摩尔被结合的生物素，并且库中非常小 的部分可以具有5摩尔被结合的生物素。因为生物素可能与任何可利用的伯胺结合，因此 非常有可能产生不同的具有生物素的生物素-BSA结合物，该生物素被结合于各个BSA分 子上不同的可利用的胺。
[00124]显示如何使用低投入比率的生物素化BSA的示意图如图4所示，其显示了低投 入比率的生物素-BSA偶联于1.0微米甲苯磺酰基活化的微粒固相，该固相的表面官能团 (即，羧酸、甲苯磺酰基活化基团、环氧基等)被用于共价结合生物素-BSA原始的氨基 或巯基官能团。相对于其表面上的生物素，得到的支持物是不饱和的并且被定向的。
[00125]因为生物素-BSA结合物(配体::支持物连接物复合物)可以具有不同数量的生物 素/每BSA分子，并且BSA分子的定向和表面生物素的位置是任意的，因此生物素-BSA 结合物将与支持物表面相偶联，从而使得那些延伸进入溶液的生物素作为结合性表面是空 间上可利用的，并且面向支持物表面的那些生物素作为结合性表面是空间上不能利用的。
[00126]主要市售微粒是基于聚苯乙烯的微粒，并且蛋白质对微粒表面的吸附被动地发生 (例如，通过疏水性相互作用和/或离子相互作用)，并且是非特异性的。尽管显示了甲苯 磺酰基活化的微粒，但支持物可以用任何合适的可以共价结合生物素-BSA官能团(例如， BSA的原始氨基或硫氢基)的官能团(例如，羧酸、环氧基等)活化。如果BSA分子的 表面上的各个ε胺具有相同的峰值，那么生物素在BSA表面上的分布将是高斯型曲线 (Pierce化合物公司.抗生物素蛋白-生物素化学技术：手册A.M.Savage等，第二版，1992。 第34页)。图4显示了通过将平均取代值(λ)为1.63个生物素/每BSA分子的生物素-BSA 共价连接至1.0微米支持物而制备的不饱和表面。由示意图可以看出，在此至少部分地通 过用低投入比率的生物素化BSA涂敷支持物而取得了不饱和性。
[00127]另一种在支持物上取得不饱和的结合性表面的方法包括：以选择的配体对支持物 连接物的摩尔投入比率制备配体::支持物连接物复合物；制备得到的配体::支持物连接物复 合物的稀释制品；以及在将配体::支持物连接物复合物与支持物连接的过程中，使用配体:: 支持物连接物复合物的稀释制品来涂敷支持物。对于结合了至少二价生物素结合性部分的 生物素化表面，所选择的摩尔投入比率优选是低的生物素对支持物连接物的摩尔投入比 率，从而减少由于脱落造成的性能降低。在该方法中，低的投入比率并不决定得到的支持 物的不饱和特性，因为与支持物偶联的配体的不饱和本质是通过限制在支持物上每单位面 积的配体::支持物连接物复合物的浓度而取得的，而不是通过限制每个支持物连接物上的 配体含量取得。因此，例如，通过使用该方法，BSA可以以超过4摩尔生物素/每摩尔BSA 的摩尔投入比率与生物素结合，虽然生物素化优选是以低的生物素投入比率进行，以便降 低在结合性表面上非共价结合的生物素含量。
[00128]虽然在许多情形中，在较高的配体对支持物连接物的摩尔投入比率下(例如，以 约20以上摩尔生物素化试剂/每摩尔BSA的摩尔投入比率)会有不期望的和/或浪费的生 物素化BSA(或者偶联任何配体与任何支持物连接物)，但采用该方法，以这样的高投入 比率制备的配体::支持物连接物复合物(例如，生物素-BSA)也可以被用于制造不饱和的 结合性表面。因此，与限制配体/每支持物连接物的平均取代值(λ)(例如，生物素/每BSA) 无关，通过在将配体::支持物连接物复合物偶联至支持物的反应中限制配体::支持物连接物 复合物的浓度，可以实现对支持物上的配体饱和性的限制。例如，通过控制反应速度，例 如，控制反应温度(例如，对于吸热的偶联反应进行冷却，或者对于放热的偶联反应进行 加热)、选择较慢的或较少的反应性偶联化学技术、限制反应时间等，可以进一步控制饱 和程度。
[00129]如上所述，主要市售微粒是基于聚苯乙烯的微粒。已知通过例如疏水性作用和/ 或离子相互作用，蛋白质可被动吸附至这些表面。在此论述了通过使用封闭剂比如，例如， 至少一种来改良非特异性结合。如同在别处详细地公开的那样，这些试剂也可用 于产生包含结合性表面的单分散或者基本上单分散的微粒制品。
[00130]嵌段共聚物作为封闭剂用于固相的应用、以及对于使用嵌段共聚物作 为封闭剂用于涂敷有低投入比率的生物素化BSA的微粒的特定情况，如图5所示。图中， F108(分子量＝13,518Da；亲水亲油平衡值(HLB)＝27)，封闭了固相的暴 露的疏水性聚合物表面，并且在没有除去共价附接的蛋白质的情况下替换、除去、或者剥 离被动吸附的蛋白质。由于在的尾部存在表面羟基，故该表面仍然保持亲水性。
[00131]可以使用任何合适的有能力与支持物表面相连接、并且也延伸出相对亲水性的尾 部进入周围介质的嵌段共聚物。三区段共聚物(比如，例如，购自BASF公司的 F108)具有约17至约69个单体单元长度的单一疏水性的聚丙烯(PPO)头部基 团、以及两个有1至约129个单体单元长度的亲水性聚乙烯(PEO)尾部。三区段共聚物 的亲水亲油平衡值(HLB)直接地与PPO头部基团和PEO尾部的长度或大小相关，并且 HLB值可以是1(在水中不溶解)至29(可高度溶于水)。如果PPO头部基团是至少56 个单体单元长度，那么三区段共聚物的头部基团不仅用作疏水性的探针并强烈地结合到疏 水表面上，而且其能与来自相同疏水表面的另一种分子相竞争并且替换。如果两个PEO尾 部都是至少105个单体单元长度，那么它们将离开固相表面而延伸进入溶液。在各个PEO 尾部末端的羟基提供了亲水性的小环境，因为该尾部足够长并且在溶液中自由地从一侧移 动至另一侧，并且该羟基尾部用作空间屏障以抑制蛋白质的被动吸附或者再吸附至固相支 持物表面。
[00132]基于假定0.82至1.03微米的球形微粒的光滑表面具有1.5g/cm3的密度的理论有效 表面面积(38.83至48.77cm2/每mg微粒)、、以及F127分子的理论上的界面 表面积(15.1至20.0nm2)，微粒表面上的理论上单层的F127被计算出为约4.05 ×10-4至约5.43×10-4nmol的F127/每mg微粒。用5-(4，6-二氯三嗪基)氨 基荧光素(5-DTAF)标记的F127的荧光分析表明，约3.68×10-4至约8.37× 10-4nmol的F127可结合每微克的0.82至1.03微米的球形微粒。
[00133]血球计数分析被用于确定要求完全破裂所有基于聚苯乙烯的PMP聚集体、并且 导致微粒单分散的F108、F127、以及908的最小浓度。浓度 优化研究表明，F108产生了浓度为约5mM(0.007％w/v)至约500mM(0.67％ w/v)的仅为单体和二聚体的微粒单分散。用F127得到了浓度为约6.67mM (0.009％w/v)至约33.33mM(0.043％w/v)的微粒单体、二聚体和三聚体，以及浓度为 约50mM(0.064％w/v)至约667mM(0.850％w/v)的单体、二聚体和较大的聚集体。 然而，908产生了最大测试浓度的聚集体。浓度为约0.4％w/v至约0.6％w/v的 F108可用作生物素-BSA PMP封闭剂。在本发明的其他实施方式中， F108以约0.1％w/v至约1.0％w/v、或约0.5％w/v至约0.75％w/v的浓度被加入。
[00134]在加入具有两个以上生物素结合性结构域的生物素结合性分子之前将嵌段共聚 物作为用于涂敷有生物素化分子的微粒的分散剂的应用如图6所示，图中所示为在将SA 加至涂敷生物素的微粒之前使用F108作为分散剂的特定实施方式。图中显示， F108被用于促进单分散并阻断对表面的非特异性结合。图中显示了存在或不存 在F108时添加至少二价的生物素结合性分子的情况。当不存在F108 时，在加入生物素结合性分子期间微粒可能会聚集。当存在F108时，在加入生 物素结合性分子期间和之后，微粒是单分散的。
[00135]分散步骤优选是在用于最优结果的特定情况下进行的，因为，例如，显示为可与 具有两个以上生物素结合性结构域的生物素结合性部分(例如，抗生物素蛋白、SA、或 NeutrAvidin)结合的生物素-BSA的生物素化微粒显示出如下倾向：由于生物素化微粒经 由各个生物素结合性部分的两个以上生物素结合性结构域的交联而聚集或者凝块。
[00136]例如，涂敷有合成的或生物学的包含两个以上生物素结合性结构域/每个生物素结 合性部分的配体结合剂(生物素结合性部分)的生物素化微粒具有如下倾向：由于在一种 生物素化的微粒上生物素结合性部分的未被占据的、可以接近的结合性结构域与在另一种 生物素化微粒上的未结合的、可以接近的生物素(配体)相结合而聚集或者凝块。通过将 生物素化微粒慢慢地滴入(即，逐滴加入)含有非常高浓度或摩尔过量的生物素结合性部 分(例如，抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段或NeutrAvidin 的片段)的连续地混合的溶液中，可以减轻微粒聚集。该方法可以通过在交联可能发生之 前用生物素结合性分子来饱和微粒表面生物素而减轻微粒聚集。然而，滴定方法并不是非 常成本有效的或实用的，因为有多个参数需要控制，并且其由于特定的生物素结合性部分 的成本而可能是相当昂贵的。但是其在用挑选的生物素结合性部分涂敷后可以取得微粒单 分散。
[00137]对于上述缓慢滴定方法，使用嵌段共聚物比如可能是较好的可选方法。 F108(购自BASF公司的三区段共聚物)具有约56个单体单元长度的单一疏水 性的聚丙烯(PPO)头部基团、以及两个有约129个单体单元长度的亲水性聚乙烯(PEO) 尾部。F108的PPO头部基团用作疏水性的探针并且较强地结合于在蛋白质或固 相支持物表面比如微粒支持物表面上的疏水性斑点(patch)或位点。其结果是，由于表面 蛋白质相互作用(即疏水性的或离子性的蛋白质相互作用)，F108可以被用于 破坏微粒聚集。由于疏水性相互作用或离子性相互作用，该PEO尾部提供了亲水性的小环 境并且可以用作空间屏障以抑制蛋白质再连接。其结果是，一旦微粒用F108处 理，它们是非常亲水性的并且被单分散在溶液中。
[00138]本发明的一个实施方式提供了与微粒有关的改进的亲合分析。本实施方式中，通 过使用嵌段共聚物比如F108或F127，制备出分散的微粒的群体、比如微粒的单 分散群体。分散的微粒然后被并入普通的亲合分析。因为微粒被分散，亲合分析将具有提 高的灵敏度(信噪比)、提高的测定准确度、提高的测定精确性(定量测定)、以及提高 的测定再现性(定性分析)。
[00139]图6和图7示意了对于F108和涂敷了SA的微粒的特定情形，在分散 步骤中使用嵌段共聚物。
[00140]图7显示，用低投入比率的生物素化BSA涂敷、并且用F108封闭的微 粒被分散或者再悬浮于0.4％至0.6％(w/v％)F108中。一旦生物素化微粒被单 分散，就加入SA来涂敷生物素化微粒。因为SA(分子量约56kDa)稍小于BSA(分子 量约66kDa)，很可能仅一个SA分子空间上可以与一个生物素-BSA分子结合(即使BSA 具有多个可以接近的生物素)。另外，并非每个BSA分子都具有可利用的生物素(参见上 述泊松分布的论述)。因此，在结合性表面上捕获的SA分子总数将小于与支持物表面偶 联的BSA分子的总数，并且SA在结合性表面上将是不饱和的(将有少于最大含量的SA 分子/每单位表面面积)(参见实施例11)。
[00141]在用生物素化的合成分子或生物分子(配体::支持物连接物复合物)涂敷支持物 表面之后，其可以被用于捕获、或者捕获并定向小于饱和量的含有两个以上生物素结合性 结构域的合成或生物学配体结合剂(生物素结合性部分)。假定生物素结合性结构域位于 各个生物素结合性部分相反的或近似相反的末端或侧面，则其生物素结合性结构域中的至 少一个将与固相生物素结合，反之，其剩余的相反的或近似相反的生物素结合性结构域将 可以用来与生物素化的捕获部分(例如，生物素化抗体或抗原)结合。
[00142]正如以上的讨论，通过在加入生物素结合性部分之前将生物素化微粒分散在约 0.4％至约0.6％的F108(三区段共聚物)中，或者通过将生物素化微粒慢慢地滴 入(例如，逐滴)含有非常高浓度或摩尔过量的生物素结合性部分的连续地混合的溶液中， 生物素化微粒可以用含有两个以上生物素结合性结构域的合成的或生物学的配体结合剂 (生物素结合性部分)涂敷，而没有微粒聚集的情况。
[00143]实际上，F108以约0.1％至约1.0％(w/v％)、或者作为另一种选择为 约0.4％至约0.6％(w/v％)的浓度分散涂敷有低投入比率的生物素化BSA的微粒。一旦 生物素化、微粒被处理并且被分散在约0.4％至约0.6％(w/v％)F108溶液中， 就可以将低水平或含量的SA加至生物素化微粒，而不形成微粒聚集体或凝块。该工艺导 致在涂敷特异性的生物素结合性部分(例如SA)后微粒单分散。与如上所述微粒滴定法 相比较，该工艺成本有效得多，并且是非常实用的和可再现的方法，可用于用含有两个以 上生物素结合性结构域的合成的或生物学的配体结合剂(生物素结合性部分)涂敷生物素 化微粒。
[00144]因此，在至少一种实施方式中，可以以约0.1％w/v至约1.0％w/v、或约0.4％至 约0.6％(w/v％)的浓度使用嵌段共聚物，从而减少非特异性的结合同时有助于促进微粒 的单分散。
[00145]产生不饱和的并且被定向的结合性表面的一个目标在于，提供一种基础，用于为 亲合分析构建组分。因为根据本发明构建的衬底的配体::支持物连接物复合物是不饱和的 并且被定向的，在该配体::支持物连接物复合物上构造的任何组分将反映出其不饱和的本 质和定向性。这样一种结构的实施例如8图所示。
[00146]图8显示了将生物素化捕获部分涂敷到通过下述步骤制备出的生物素特异性的微 粒结合性表面上：(1)用低投入比率的生物素化BSA涂敷表面；(2)用三区段共聚物 F108封闭表面；(3)在加入含有两个以上生物素结合性结构域的合成的或生物 学的生物素结合性部分(例如，SA)之前在F108中分散微粒；以及(4)将SA 加至表面。得到的涂敷了SA的微粒可以被用于定向并且捕获不饱和量的所研究的任何生 物素化的捕获部分。
[00147]图8显示了如何将涂敷了SA的微粒用于定向并捕获不饱和量的所研究的特定的 生物素化捕获部分，所述捕获部分包括：(a)抗体的Fab片段(不含Ig Fc区域可以降低 或减轻非特异性的结合现象)；(B)免疫球蛋白(多克隆抗体和/或单克隆抗体)；以及 (C、D和E)分别为小的、中等的、和/或大的分子，无论它们是合成的还是生物学的分 子。任何所研究的生物素化捕获部分可以包含，例如，在分子和生物素部分之间的间隔物。
[00148]间隔物可以对相对小的生物素化分子特别有用。因为SA分子中的生物素结合性 结构域被掩埋在表面下9埃处，由于空间位阻，生物素化小分子(例如，分子量小于约1,000 Da的小分子)可能不会被较大的免疫测定示踪(可检测的结合剂)检测到。通过使用具有 附接于它们的间隔物臂的生物素衍生物、或者通过将小分子结合于较大的生物素化分子 (即，载体分子)，可以获得更大的结合力和更高的检测灵敏度。
[00149]为了达到它们可用的程度，用于辨别小分子与中等分子或大分子的方针可以按下 述方法表示：小分子通常被认为分子量小于约5,000Da；中等分子通常被认为分子量为约 5,000以上至约150,000Da；大分子通常被认为分子量为大于约150,000Da。
[00150]在根据本发明制备具有结合性表面的微粒中的本发明的某些方面如图9A和9B 所示。
[00151]图9A和9B显示了将小于饱和量的生物素化抗体、或生物素化Fab片段定向并 涂敷到根据本发明制备的生物素结合性微粒(例如，涂敷了SA的微粒)上。
[00152]根据本发明制备的涂敷了SA的PMP可以提高免疫测定灵敏度(提高信噪比)， 因为生物素结合性固相可以被用于定向并捕获少于饱和量的生物素化捕获部分比如对分 析物特异的生物素化抗体或Fab片段。因为各个涂敷了SA的微粒的SA分子总数/每支持 物表面积的降低导致生物素化捕获抗体结合力降低、但是由于空间自由度的提高而引起生 物素化捕获抗体结合性能的提高，故测定灵敏度得到改善。即，在表面上提供低于最大含 量的SA分子的目的在于提高各个SA分子结合较大的生物素化捕获部分(例如，生物素 化抗体)的空间自由度，并且提高各个SA分子的结合效率。
[00153]图9A显示了普通的或标准的涂敷了SA的微粒表面，其中通过伯胺或其他偶联 化学技术，SA被直接涂敷到微粒表面上，并且使用BSA封闭表面。在这样一种普通的或 标准的表面上，SA分子在表面上未被特定地不饱和化或定向；也就是说，其附着是任意 的。加入生物素化抗体或Fab片段会得到如下结合性表面：未被显著地不饱和化或定向， 因为表面上的SA被随机定向。抗体或Fab拥挤可能会产生空间障碍(可接近性低)并且 降低抗原捕获效率，尤其当抗原是大分子时。
[00154]图9B显示了根据本发明制备的涂敷了SA的微粒结合性表面。在该结合性表面 上，SA分子是不饱和的(总的SA分子/每单位微粒结合性表面下降)并且在表面上被定 向。该微粒支持物表面被低投入比率的生物素化BSA共价涂敷，并且用F108封 闭。然后在SA加入之前，将生物素化微粒分散在F108中。SA附着是特异性的 并且是非随机的。
[00155]附着于根据本发明制备的SA微粒结合性表面的生物素化抗体或者生物素化Fab 片段是不饱和的并且被定向的，因为在结合性表面上SA分子也是不饱和的并且被定向的。 生物素化抗体或者生物素化Fab片段的这种定向并且不饱和的性质会促进抗原(分析物) 捕获效率(信号被提高)，尤其是当抗原是大分子时。另外，归因于F108封闭 剂，微粒的表面是亲水性的，并且对表面的非特异性结合被最小化或消除(噪音被降低)。
[00156]本发明的另一个特征如图10所示，其显示了增加的与微粒单分散有关的可利用 的表面面积。
[00157]图10中，A栏显示了由于微粒-微粒表面间相互作用而产生的微粒聚集体或凝集 物。该聚集现象将同时降低：(1)总的可利用的微粒表面面积，因为聚集体内侧任何面 积都不是空间上可利用的(可以接近的)；以及(2)结合性表面上生物素结合性部分(例 如，SA)的结合力和效率，导致测定信号降低。
[00158]图10中，B栏显示了根据本发明的微粒增加了结合性表面面积，从而得到结合 性表面上生物素结合性部分(例如，SA)的提高的结合力和提高的结合效率，导致测定信 号增强。与聚集体微粒或微粒凝块相比，单分散的微粒具有更多的总的可利用的表面面积， 并且由于提高的碰撞率和降低的测定扩散距离，而将提供改进的测定动力学。
[00159]根据本发明的微粒设计如下：用嵌段共聚物比如三区段共聚物F108封 闭低投入比率的生物素化BSA结合性表面，并且正如以上的讨论，在加入SA分子之前将 生物素化微粒分散在F108中。当然，F108仅是本实施方式的示例。应 理解，本发明的任何嵌段共聚物可以以这种方式使用。
[00160]通过使用生物素作为配体、并且使用BSA或卵清蛋白作为支持物连接物，来制 备根据本发明的微粒。也制备涂敷了SA的微粒，以及具有特异性的捕获部分的微粒。在 下文和在实施例中论述这些研究的结果。
[00161]研究了生物素化反应中改变生物素摩尔投入比率的影响，并且结果显示在实施例 1中。BSA以不同的生物素对BSA的摩尔投入比率3.4∶1至30∶1进行生物素化，确定生物 素化的程度，并且确定在4℃下和37℃下3天的稳定性(参见表1)。稳定性降低至少 部分地反映生物素或生物素试剂从生物素-BSA结合物上的脱落或者解离(参见图11)。 结果表明，以较高的生物素摩尔投入比率(例如，8∶1、15∶1、以及30∶1)制备的生物素-BSA 显示出微弱的稳定性，但是随着生物素试剂对BSA的摩尔投入比率从30∶1降低至4∶1，稳 定性从4％提高到100％。因此，选择相对低的配体对支持物连接物的投入比率，并且将配 体::支持物连接物复合物连接至固相，可以得到比通常制备的具有生物素作为配体的结合 性表面更稳定的结合性表面。
[00162]可以通过在配体::支持物连接物复合物制备之后、但在其被涂敷到支持物表面之 上之前向其加入合适的分散剂来促进通过用以任何投入比率而制备的配体::支持物连接物 复合物(尤其是用以较高配体对支持物连接物的投入比率而制备的配体::支持物连接物复 合物)涂敷支持物表面来制备不饱和的结合性表面。在此论述用于该方法的合适分散剂。 在此提供一个示意图，用于解释使用合适的分散剂与以低的生物素对BSA的投入比率而制 备的生物素-BSA一起来制备不饱和的表面，虽然该使用分散剂的方法不局限于生物素化 涂层。
[00163]提供一种制造不饱和的结合性表面方法，其通过使用合适的分散剂来抑制固相支 持物比如，例如，微粒的聚集。该方法是至少部分地基于下述现象：相对分散(例如，近 似单分散)的微粒制品是所期望的。
[00164]当微粒可能发生聚集时，例如，其中配体是生物素并且生物素用SA涂敷，可以 使用该方法。当配体结合剂是至少二价时，也就是说，当单一的、至少二价的生物素结合 性部分比如SA可将一个微粒上的生物素-BSA分子中的生物素与另一个微粒上的生物素 -BSA分子中的生物素交联时，该分散方法特别有用。对于在下文和实施例2中的实施方 式：其中配体::支持物连接物复合物是生物素-BSA，并且配体结合剂(生物素结合性部分) 是SA，在此提供一种该分散方法的示意图。如同此前的解释，该方法不局限于生物素/SA 结合性表面。
[00165]分散剂比如嵌段共聚物可以用于制备不饱和的结合性表面的方法。在此提供一个 示意图，在加入包含两个以上生物素结合性结构域的合成的或生物学的生物素结合性部分 (配体结合剂)之前，嵌段共聚物被用作分散剂而用于涂敷有合成的或者生物学的配体:: 支持物连接物复合物的微粒。在此提供一个示意图，使用嵌段共聚物F108；然 而，该方法不局限于示意图中特定的嵌段共聚物。
[00166]一般地，图7显示了用含有两个以上生物素结合性结构域的合成的或生物学的生 物素结合性部分(配体结合剂)来涂敷合成的或生物学的生物素化表面。更具体地讲，图 7显示，将SA涂敷到用F108封闭并且在SA加入之前分散在F108中 的低投入比率的生物素化BSA微粒结合性表面。
[00167]在此提供的方法和组合物可以用于制备用于固相支持物表面的不饱和涂层，其 中，涂层包含与支持物表面偶联的配体::支持物连接物复合物、与配体::支持物连接物复合 物中的配体相连接的配体结合剂(生物素结合性部分)、以及与配体结合剂相连接的捕获 部分(例如，生物素化的捕获部分)。可以选择捕获部分，从而便于捕获所研究的任何分 子比如分析物。对于生物素/SA体系，在下文和图8中提供了说明，但是本发明不局限于 生物素/SA体系。
[00168]通过在支持物表面上定向并连接少于饱和量的含有两个以上生物素结合性结构 域的合成的或生物学的配体结合剂(生物素结合性部分)，可以设计不饱和的结合性表面。 该表面可以通过一个实施例显示，其中在微粒例如PMP的表面上定向并提供了小于饱和 量的SA。图8显示了通过将生物素化捕获部分涂敷到生物素结合性微粒结合性表面上而 制备不饱和的并且被定向的结合性表面，其中所述生物素结合性微粒结合性表面通过下述 步骤制备：
(1)用低投入比率的生物素化BSA涂敷表面；
(2)用三区段共聚物F108封闭表面；
(3)(在加入含有两个以上生物素结合性结构域的合成的或生物学的生物素结合性 部分之前)将微粒分散在F108中；以及
(4)加入SA作为生物素结合性部分。如图8所示，涂敷了SA的微粒可以被用于定 向和/或捕获小于饱和量的生物素化捕获部分例如：(A)抗体的Fab片段(不含Ig Fc区 域可以降低或减轻非特异性的结合现象)；(B)免疫球蛋白(多克隆抗体和/或单克隆抗 体)；以及(C、D和E)分别为小的、中等的、和/或大的分子，无论它们是合成的还是 生物学的分子。
[00169]图8显示了在采用生物素/SA体系的不饱和的结合性表面上的生物素化捕获部 分。共价附接于微粒表面的低投入比率的生物素化BSA用三区段共聚物F108封 闭，在加入SA之前，微粒被分散在F108中，接着加入SA，并且然后期望的生 物素化的捕获部分被暴露于不饱和的涂敷了SA的表面。显示的生物素化捕获部分实施例 包括(图8中从左至右：生物素化Fab片段(分子量为约30,000Da)、生物素化抗体(IgG、 分子量为约150,000Da)；生物素化小分子、或具有间隔臂的生物素化小分子(例如，分 子量小于约5,000Da)；生物素化中等分子、或作为小分子载体的生物素化中等分子(例 如，分子量约5,000Da至约150,000Da)；以及生物素化大分子(例如，分子量大于约150,000 Da)。如图8所示，在固相支持物的表面，生物素-BSA的定向和不饱和的性质被反映在 不饱和的涂敷了SA的表面，并且同样反映在不饱和的捕获部分涂层。F108的疏 水性头部基团被显示出与支持物表面相连接，并且F108的亲水性尾部基团被显 示出延伸离开支持物表面。
[00170]根据本发明的不饱和的结合性表面典型地具有与市售结合性表面相比较低的结 合力。提供了一个使用生物素/SA体系的实施例(参见表2、实施例2)。用每单位表面面 积较少的SA分子涂敷的支持物将固有地具有降低的结合生物素的能力，因为该表面将具 有较少的生物素结合性位点。该在表面上提供低于最大含量的SA分子的目的在于提高各 个SA分子结合较大的生物素化捕获部分(例如，生物素化抗体)的空间自由度，并且提 高各个SA分子的结合效率。
[00171]实施例2显示，在结合性表面上具有被定向并且小于饱和量的分子降低了结合力， 但是提高了测定信号，导致较好和更有效的用于亲合分析的结合性表面。根据本发明的微 粒显示出与类似的、市售、普通的或者标准产品(参见，例如，表2)相比降低的结合力， 但是显示出增强的测定性能(参见，例如，表3和表4)。由于较低的背景而提高的信噪 比和提高的信号反应反映了增强的测定性能。总体上，本发明得到的支持物允许用于生产 涂敷了SA的微粒，该微粒具有与市售涂敷有SA的微粒相比更低的结合力、但是由于微 粒表面上的链霉抗生物素蛋白定向和空间可接近性而具有增强的测定性能，并且具有新颖 的结合性表面封闭性。
[00172]实施例3显示，根据本发明的分散步骤制备的微粒得到了基本上不含聚集体或凝 块的微粒单分散群体。
[00173]实施例4显示，在一个涂敷了SA的微粒的特定实施方式中，根据本发明的微粒 与普通或标准的微粒相比，显示出由于SA的不饱和和定向的性质而更优选的信噪比特性、 增强的表面封闭性、以及提高的结合效率。
[00174]实施例5显示，使用根据本发明的微粒非特异性的结合减小。甚至在其中分析物 倾向与固相上的涂层相连接、例如甲状腺激素比如T3(三碘甲腺原氨酸)和T4(甲状腺 素)对于BSA的倾向的测定中，在根据本发明的微粒中非特异性的结合也被减少。
[00175]实施例6通过验证研究表明，本发明用于涂敷支持物的工艺是可再现的并且是可 靠的，对于诊断性亲合分析具有期望的特征。
[00176]实施例7显示，对于涂敷了SA的微粒的特定实施方式，根据本发明的微粒在多 组验证中显示出增强的稳定性。实施例8表明，在本发明的微粒中配体脱落不成问题；并 且实施例9显示了用卵清蛋白代替BSA根据本发明制备的结合性表面。
[00177]虽然大量论述和许多实施例描述了通过用具有复合其上的配体的支持物连接物 涂敷支持物表面而制备不饱和的表面，其中支持物连接物包含蛋白质，但可以通过以多种 方式使用本发明来得到不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面。例如，支持物 连接物可以是非蛋白质比如，例如，聚合物。在特定设定的条件下，该聚合物可以被赋予 与配体反应并复合的功能，或者可以挑选聚合物/配体配对以使得自然地存在于聚合物上的 官能团将与配体的官能团结合。通过钝化一些反应基团，可以控制在聚合物上的反应性的、 或功能性的基团数量，借此允许较少配体被附接于每个聚合物分子上。
[00178]还可以用缺乏配体的聚合物来稀释聚合物/配体复合物，并且稀释的混合物可以被 用于涂敷支持物表面从而制备不饱和的、或者不饱和的并且被定向的结合性表面。可以使 用一个种类的聚合物、或者聚合物的混合物。
[00179]因此，在多种实施方式中，本发明包含这样的支持物：其包含用于亲合分析的结 合性表面、包含有附接于聚合物的配体，其中，配体在表面上是不饱和的、或者不饱和的 并且被定向的。然后可以根据在此描述的任何合适的方法处理包含配体的支持物。在各种 实施方式中，表面可以包含没有附接任何配体的聚合物混合物、以及附接有配体的聚合物。 在各种实施方式中，支持物是微粒，结合性表面用嵌段共聚物封闭，测定是免疫测定法， 并且配体结合至少二价的配体结合剂，所述配体结合剂本身可以与捕获部分比如修饰或未 修饰的免疫球蛋白或其片段结合。
[00180]在特定的实施方式中，配体可以被直接地偶联在支持物表面上，而无需使用支持 物连接物。在这些实施方式中，在足以使配体附接于支持物的条件下，将具有能够与配体 反应的官能团的支持物表面暴露于配体。在各种实施方式中，附接是在活化的配体和支持 物表面之间的共价键，其也可以被活化。可以通过控制附接于支持物表面的配体数量来实 现配体的不饱和性。在各种实施方式中，支持物表面包含多个能够在给定条件下与配体反 应的官能团。通过操控反应条件、或者加入降低支持物表面上的官能团数量的试剂，可以 以一种降低能够与配体反应的官能团数量的方式来处理支持物表面。然后可以根据在此描 述的任何合适的方法处理包含配体的支持物表面。
[00181]因此、本发明还提供了一种用配体涂敷的支持物表面，其中，在支持物表面的表 面上配体是不饱和的。在各种实施方式中，结合性表面用嵌段共聚物封闭，测定是免疫测 定法，并且配体结合至少二价的配体结合剂，所述配体结合剂本身可以与捕获部分比如修 饰或未修饰的免疫球蛋白或其片段结合。在各种实施方式中，在支持物表面上的配体密度 是在此处描述的范围内，所述范围是用于描述附接于支持物连接物上的配体的实施方式。 任何合适的配体比如，例如，免疫球蛋白或其片段、低聚核苷酸、以及凝集素可以被用于 直接地附接于支持物表面。如同在其他实施方式中那样，配体可以包含连接物，并且连接 物可以被附接于支持物表面。
[00182]本发明提供了用于在微粒(例如，PMP)表面上定向并连接小于饱和量的配体比 如SA的方法。可商业购买的生物素结合性表面(例如，DYNABEADSTMMyOne 链霉抗生物素蛋白T1、以及DYNABEADS M-280链霉抗生物素蛋白)被设计成具有最大 的生物素结合力。可商业购买的生物素结合性表面典型地通过在微粒表面上直接涂敷SA 或其他生物素结合性分子而生产。相反，本发明提供的方法是：用低投入比率的生物素化 BSA涂敷微粒，用F108封闭生物素-BSA微粒，在F108中分散被封闭 的生物素-BSA微粒，并且最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。
[00183]由于不饱和并定向，根据本发明的微粒显示出更优良的信噪比特性、增强的表面 封闭性、以及提高的结合效率。如实施例所示，这一状况被涂敷有SA的低投入比率的生 物素化BSA微粒所显示。
[00184]本发明的方法和组合物可以与本技术领域已知的任何合适的测定法相结合使用， 所述测定法例如是本技术领域已知的任何合适的亲合分析或免疫测定，其中可以优选使用 不饱和的、或者不饱和的并且被定向的表面，包括但不限于：蛋白质-蛋白质亲合分析、蛋 白质-配体亲合分析、核酸亲合分析、间接荧光抗体测定(IFAs)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、放射免疫测定(RIAs)、以及酶免疫测定(EIAs)、直接或间接的测定、竞 争性测试、夹心法测试等。合适的测定形式包括但不限于，在实施例中使用的测定和形式。
[00185]本发明的方法和组合物可以与本技术领域已知的任何支持物例如合适的固体支 持物组合使用。这样的固相支持物的例子被论述，但是本发明不局限于明确地论述的支持 物。例如，固相支持物不局限于微粒支持物、微粒、聚苯乙烯微粒、微孔板、涂敷试管等。 其它固相支持物也可以被用于本发明，包括但不限于本技术领域已知的被用于与亲合分析 相关联的任何支持物。例如，可以使用包含以Mylar做后衬的硝化纤维素(mylar-backed nitrocellulose)的固相支持物、和/或尼龙。例如，可以使用包含滤膜或薄膜的固相支持物。 例如，可以使用包含微小管、纳米颗粒、或纳米管例如碳纳米管的固相支持物。固相支持 物可以包含任何大小的微粒，并且可以使用具有大的平整表面区域的固相支持物。
[00186]本发明的方法和组合物可以被用于与任何其中期望提高信噪比的测定相结合。例 如，可以在平整的或基本上平整的固相支持物上制备根据本发明的不饱和的、并且用合适 的嵌段共聚物比如，例如，处理过的结合性表面，用于横向流动测定(1ateral flow assay)和/或扩散测定(diffusion assay)。横向流动测定的一个实施例是：其中样本被设置 于结合性表面(固定化或未固定化)上，并且液相中的一种以上分析试剂经过样本上方(在 扩散测定中，通过在表面上方扩散)，并且当与液相中的试剂接触时，通过合适的信号而 检测和/或定量分析物。横向流动测定的另一个实施例是：其中一种以上分析试剂被设置于 结合性表面(固定化或未固定化)上，并且液相中的样本经过一种以上分析试剂上方(在 扩散测定中，通过在表面上方扩散)，并且当在结合性表面上与一种以上分析试剂接触时， 通过合适的信号而检测和/或定量样品中的分析物。横向流动测定的另一个实施例是包含根 据本发明的不饱和的结合性表面的测深标尺(dipstick)。横向流动测定和/或扩散测定不局 限于移动穿过平整支持物的一个结合性表面的液体；这些测定包括穿过薄膜或滤膜的液 体，其中薄膜或者滤膜包含不饱和的结合性表面。因此，在各种实施方式中，根据在此描 述的任何实施方式，提供了用于横向流动测定和/或用于扩散测定的结合性表面、以及制备 用于横向流动测定和/或扩散测定的结合性表面的方法和组合物。
[00187]在另一个方面，在此提供了在免疫测定中任何方法和组合物的应用。在各种实施 方式中，在免疫测定中提供了一种具有不饱和的结合性表面的支持物的应用，该不饱和的 结合性表面包含设置在支持物上的多个支持物连接物、以及与支持物连接物偶联的配体， 其中，配体是不饱和的并且以提供空间上可接近的配体的方式被定向在表面上。在一个特 定的实施方式中，具有结合性表面的微粒被用于样品中所研究的分析物例如抗原的免疫测 定，该结合性表面包含生物素化蛋白质(配体::支持物连接物复合物)；与生物素化蛋白 质中的生物素部分相连接的至少二价的生物素结合性部分，该生物素结合性部分选自于抗 生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin的片段、或 其混合物；以及与至少二价的生物素结合性部分(配体结合剂)相连接的生物素化免疫球 蛋白或其片段(生物素化的捕获部分)。在另一个实施方式中，与生物素化蛋白质中的生 物素部分相连接的至少二价的生物素结合性部分与生物素化抗原或其片段(生物素化的捕 获部分)相连接，并且微粒被用于样品中所研究的分析物例如抗体的免疫测定。在免疫测 定中使用的组合物的特性、以及组合物的制造方法包括在此描述的任何特性(包括，例如， 叙述表面组分密度的特定实施方式)。
[00188]本发明的方法、组合物、以及试剂盒可以与任何合适的免疫测定体系一起使用。 合适的免疫测定体系的例子包括，但不限于，免疫测定体系、2免疫测定 体系、Synchron725临床体系、DxI 800免疫测定体系、 免疫化学体系(全部购自贝克曼考尔特公司)、以及体系(Biosite公司)。一个 合适的免疫测定基阵系统是Microassay体系(贝克曼考尔特公司)。
[00189]在下文详细列举出非限制性的物质表，取决于待设计的亲合分析的应用，这些物 质可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分析物的结合性配对中的一个、或可选地作 为其他成员。这些物质可以被用作，例如，捕获部分(分析物结合剂)，或者可以被用于 产生可以用于本发明的捕获部分(例如，通过使用它们作为半抗原/抗原来产生特异性的抗 体)。包括免疫测定在内的亲和分析，可以根据本发明被设计用于检测这些物质的存在和 /或水平，其中这些物质是样品中的分析物。在一个特定的实施方式中，本发明的分析物结 合性捕获部分可以被用于按下述方法检测作为样品中的分析物的这些物质：捕获部分可以 被生物素化并且与根据本发明的涂敷了SA的固相支持物表面(例如具有其上涂覆了SA 的低投入比率的生物素化BSA涂层)相连接，并且被用于捕获这些物质。作为另一种选择， 列于下表的物质可以被生物素化并且与根据本发明的涂敷了SA的固相支持物表面相连 接，并且被用来捕获与它们互相作用的分子(比如，例如，对所列物质特异的抗体或其片 段、结合性蛋白、或酶)。
[00190]可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分析物的结合性配对中的一个成员、 或者可选地作为其他成员的非限制性的物质列表包括：可诱导的氧化氮合酶(iNOS)、 CA19-9、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-t、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、sIL-2R、 sIL-4R、sIL-6R、SIV核心抗原、IL-1RA、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF；PSA(前列腺-特 异性的抗原)同种型比如PSA、pPSA、BPSA、inPSA、非α1-抗凝乳蛋白酶-复合物PSA、 α1-抗凝乳蛋白酶-复合物PSA；前列腺激肽释放酶比如hK2、hK4、以及hK15、ek-rhK2、 Ala-rhK2、TWT-rhK2、Xa-rhK2、HWT-rhK2、以及其他的激肽释放酶；HIV-1 p24；铁蛋 白、L铁蛋白、肌钙蛋白I、BNP、瘦素(leptin)、地高辛、肌红蛋白、B型促尿钠排泄 肽或脑促尿钠排泄肽(BNP)、前房的促尿钠排泄肽(ANP)；人生长激素、骨碱性磷酸 酶、人类促卵泡激素、人促黄体生成激素(leutinizing hormone)、催乳激素；人绒毛膜促 性腺激素(例如，CGα、CGβ)；甲状腺球蛋白；抗甲状腺球蛋白；IgE、IgG、IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、B.anthracis保护性抗原、炭疽杆菌(B.Anthracis)致死因子、B.anthracis 孢子抗原、土拉热弗朗西丝菌(F.tularensis LPS)、S.aureas肠毒素B、Y.pestis荚膜F1 抗原、胰岛素、α甲胎蛋白(例如，AFP 300)、癌胚抗原(CEA)、CA 15.3抗原、CA 19.9 抗原、CA 125抗原、HAV Ab、HAV Igm、HBc Ab、HBc Igm、HIV1/2、HBsAg、HBsAb、 HCV Ab、抗p53、组胺；新蝶呤；s-VCAM-1、血清素、sFas、sFas配体、sGM-CSFR、 s1CAM-1、胸苷激酶、IgE、EPO、内因子Ab、结合珠蛋白、抗心磷脂、抗dsDNA、抗 Ro、Ro、抗La、抗SM、SM、抗nRNP、抗组蛋白、抗Scl-70、Scl-70、抗核抗体、抗着 丝粒抗体、SS-A、SS-B、Sm、U1-RNP、Jo-1、CK、CK-MB、CRP、局部缺血修饰白蛋白、 HDL、LDL、oxLDL、VLDL、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、微小白蛋白、淀粉酶、ALP、ALT、 AST、GGT、IgA、IgG、前清蛋白、抗链球菌溶血素、衣原体、CMV IgG、毒IgG、毒IgM、 脱脂蛋白A、脱脂蛋白B、C3、C4、备解素因子B、白蛋白、α1-酸性糖蛋白、α1-抗胰蛋 白酶、α1-小球蛋白、α2-巨球蛋白、抗链球菌溶血素O、抗凝血酶-III、脱脂蛋白A1、脱脂 蛋白B、β2-小球蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C3、补体C4、C-反应蛋白、DNase B、铁蛋 白、游离k轻链、游离λ轻链、结合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白A(脑脊髓液)、 免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G(脑脊髓液)、免疫球蛋白G(尿液)、免 疫球蛋白G亚类、免疫球蛋白M、免疫球蛋白M(脑脊髓液)、k轻链、λ轻链、脂蛋白 (a)、微小白蛋白、前清蛋白、备解素因子B、类风湿因子、铁蛋白、转铁蛋白、转铁蛋 白(尿液)、风疹IgG、甲状腺球蛋白抗体、弓型属IgM、弓型属IgG、IGF-I、IGF结合 性蛋白质(IGFBP)-3、七菌素、pim-1激酶、E-钙黏着蛋白、EZH2、以及α-甲基乙酰基- 辅酶A消旋酶、TGF-β、IL6SR、GAD、IA-2、CD-64、嗜中性CD-64、CD-20、CD-33、 CD-52、细胞色素P450同种型、s-VCAM-1、sFas、sICAM、乙型肝炎表面抗原、促凝血 酶原激酶、HIV p24、HIV gp41/120、HCV C22、HCV C33、血红蛋白A1c、以及GAD65、 IA2。
[00191]取决于待设计的亲合分析的应用，可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分 析物的结合性配对中一个成员、或者可选地作为其他成员、并且可以被用于本发明的合适 物质还包括对世界卫生组织国际生物学标准制品(WHO International Biological Reference Preparations)持有的并且被世界卫生组织国际生物学标准实验室(WHO International Laboratories for Biological Standards)表征、和/或经销的任何产品(可利用 http://www.who.int/bloodproducts/re_materials，2005年6月30日起更新，其列出了为本领 域技术人员所熟知的物质；在此将该列表引入本文以供参考)具有特异性的部分，比如， 例如，抗体或其片段。
[00192]这些合适的由紧随物质名称后的括号中的WHO代码注明的国际参考标准的部分 列表包括：人重组促凝血酶原激酶(rTF/95)、兔促凝血酶原激酶(RBT/90)、甲状腺刺 激抗体(90/672)、重组人组织纤溶酶原激活物(98/714)、高分子量尿激酶(87/594)、 前列腺特异性的抗原(96/668)、前列腺特异性的抗原90∶10(96/700)；人血浆蛋白质C (86/622)、人血浆蛋白质S(93/590)、变形性关节炎血清(W1066)、血清淀粉状A 蛋白质(92/680)、链激酶(00/464)、人凝血酶(01/580)、牛结合促凝血酶原激酶 (OBT/79)、抗D阳性对照静脉注射免疫球蛋白(02/228)、小岛细胞抗体(97/550)、 脂蛋白a(IFCCSRM 2B)、人细小病毒B19 DNA(99/800)、人胞浆素(97/536)、人 血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1(92/654)、血小板因子4(83/505)、前激肽释放酶 活化剂(82/530)、人脑CJD对照物和人脑散发性CJD制品1以及人脑散发性CJD制品 2和人脑变异CJD(无；WHO TRS ECBS Report No.926，第53个报告，脑组织均浆引用 的每一个)、人血清补体组分C1q、C4、C5、因子B、以及所有的功能性补体CH50(W1032)、 人血清免疫球蛋白E(75/502)、人血清免疫球蛋白G、A、以及M(67/86)、人血清 蛋白白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C3、转铁蛋白(W1031)、 抗D阴性对照静脉注射免疫球蛋白(02/226)、甲型肝炎RNA(00/560)、乙型肝炎表 面抗原亚型adw2基因型A(03/262和00/588)、乙型肝炎病毒DNA(97/746)、丙型肝 炎病毒RNA(96/798)、HIV-1 p24抗原(90/636)、HIV-1 RNA(97/656)、HIV-1 RNA 基因型(10101/466组)、人纤维蛋白酶原浓缩物(98/614)、人血浆纤维蛋白原(98/612)、 升高A2血红蛋白(89/666)、升高F血红蛋白(85/616)、血红蛋白氰化物(98/708)、 低分子量肝素(85/600和90/686)、未分段的肝素(97/578)、凝血因子VIII和von Willebrand 因子(02/150)、人凝血因子VIII浓缩物(99/678)、人凝血因子XIII血浆(02/206)、 人凝血因子II、VII、IX、X(99/826)、人凝血因子II和X浓缩物(98/590)、人癌胚 抗原(73/601)、人C-反应蛋白(85/506)、重组人铁蛋白(94/572)、脱脂蛋白B(SP3- 07)、β-2-小球蛋白(B2M)、人β-血小板球蛋白(83/501)、人凝血因子IX浓缩物(96 /854)、人凝血因子IXa浓缩物(97/562)、人凝血因子V Leiden、人gDNA样本Fv野 生型、FVL同合子、FVL杂合子(03/254、03/260、03/248)、人凝血因子VII浓缩物(97 /592)、人凝血因子Vlla浓缩物(89/688)、人治梅毒血清(HS)、人抗破伤风免疫球 蛋白(TE-3)、人抗凝血酶浓缩物(96/520)、人血浆抗凝血酶(93/768)、人抗甲状 腺球蛋白血清(65/93)、抗弓型属血清(TOXM)、人抗弓型属血清(IgG)(01/600)、 人抗水痘带状疱疹免疫球蛋白(W1044)、脱脂蛋白A-1(SP1-01)、人抗干扰素β血清 (G038-501-572)、人抗囊虫血清(66/202)、抗核的核糖核酸蛋白质血清(W 1063)、 抗核因子(同源)血清(66/233)、抗细小病毒B19(IgG)血清(91/602)、抗脊髓灰 质炎病毒血清类型1，2，3(66/202)、人抗狂犬病免疫球蛋白(RAI)、人抗风疹免疫球蛋 白(RUB1-1-94)、抗平滑肌血清(W 1062)、人抗双链DNA血清(Wo/80)、人抗E 完全血液型血清(W1005)、人抗棘球属血清(ECHS)、人抗甲型肝炎免疫球蛋白(97/ 646)、人抗乙型肝炎免疫球蛋白(W1042)、人抗戊型肝炎血清(95/584)、抗人血小 板抗原-1a(93/710)、抗人血小板抗原-5b(99/666)、人抗干扰素α血清(B037-501-572)、 人甲胎蛋白(AFP)、安克洛酶(74/581)、人抗A血型血清(W1001)、人抗B血型血 清(W1002)、人抗C完全血型血清(W1004)、抗D(抗ρ)完全血型试剂(99/836)、 人抗D(抗ρ)不完全血型血清(W1006)、以及人抗D免疫球蛋白(01/572)。
[00193]取决于待设计的亲合分析的应用，可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分 析物的结合性配对中的一个成员、或者可选地作为其他成员的合适物质的其他例子包括这 样的化合物：其可以用作半抗原而产生能够识别该化合物的抗体，并且包括但不局限于下 述物质的任何盐、酯、或醚：激素，其包括但不限于黄体酮、雌激素、以及睾丸激素、孕 酮、皮质甾类、以及脱氢表雄甾酮；以及可以列举的被WHO作为国际参考标准的任何非 蛋白质/非多肽抗原。由紧随物质名称的括号中的WHO代码注明的这些合适的国际参考标 准的部分列表包括：维生素B12(WHO 81.563)、叶酸(WHO 95/528)、同型半胱氨酸、 运钴胺素蛋白、T4/T3、以及在WHO的国际生物学的标准制品目录中公开的其他物质(可 利用世界卫生组织网址，例如http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/，2005年3月 30日更新)，将其引入本发明作为参考。在此描述的方法和组合物可以包含一种或多种上 述的世界卫生组织参考标准或含有参考标准的混合物。
[00194]在至少一种实施方式中，本发明提供了一种具有两个以上不同捕获部分的结合性 表面。
[00195]取决于待设计的亲合分析的应用，可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分 析物的结合性配对中的一个成员、或者可选地作为其他成员的物质的其他例子包括禁用药 物。禁用药物包括，例如，下面的药物列表和它们的代谢产物(例如，存在于血液、尿液 中的代谢产物以及其他生物材料)、以及其任何盐、酯、或醚：海洛因、吗啡、氢吗啡酮、 可待因、14-羟基二氢可待因酮、氢可酮、芬太尼、地美罗、美沙酮、达而丰、斯达多(stadol)、 镇痛新、止痛剂、丁丙奈斯(buprenex)；兴奋剂比如安非他明、脱氧麻黄碱；甲基苯丙 胺、乙基苯内胺、甲基菲内特(methyiphenidate)、麻黄素、假麻黄碱、麻黄、麻黄、亚 甲基二氧安非他明(methylenedioxyamphetamine，MDS)、苯丁胺、苯丙醇胺；阿米苯唑、 波米利德(bemigride)、甲基苯异丙基苄胺、波罗马坦(bromatan)、对氯苯丁胺、克罗 丙胺、克罗乙胺、二乙胺苯丙酮、二甲基苯丙胺、吗乙苯吡酮、乙迷奋、芬坎法明、氯酯 醒、哌甲酯、尼可刹米、佩默林、喷达唑(pentetrazol)、苯基双五甲烯四氮嗪、苯甲吗啉、 苯丁胺、苯丙醇胺、匹罗托欣(picrotoxine)、匹拉多(pipradol)、丙林坦(prolintane)、 士的宁、对羟福林、苯西克定和类似物比如安琪得特(angel dust)、PCP、开他敏；镇静 剂，比如巴比妥酸盐、谷希米得(gluthethimide)、安眠酮、以及安宁、美索比妥、希米 尔(thiamyl)、戊硫代巴比妥、异戊巴比妥、戊巴比妥、司可巴比妥、布他比妥、布塔巴 比妥、他布酮、以及阿普比妥、苯巴比妥、甲苯巴比妥；苯二氮平类比如艾司唑仑、氟胺 安定、羟基安定、三唑苯二氮、咪达唑仑、阿普唑仑、利眠宁、氯拉齐佩(clorazepate)、 安定、哈拉西泮、氯羟安定、去甲羟基安定、环丙二氮卓、夸西泮、氯硝西泮、氟硝西泮； 重伤(GBH)药物比如γ羟基丁酸和γ丁内酯；导眠能、安眠酮、安宁、肌安宁、唑吡坦、 扎来普隆；大麻醇类药物比如四氢大麻醇和类似物；古柯碱、3-4-亚甲基二氧甲基苯丙胺 (MDMA)；迷幻剂比如墨斯卡灵和LSD。
[00196]取决于待设计的亲合分析的应用，可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分 析物的结合性配对中的一个成员、或者可选地作为其他成员的物质的其他例子包括： 甾族化合物及其它与性能增强相关的药物，包括通常在黑市上遇到、或者用作强力助剂 (ergogenic aid)的那些药物，比如下面的化合物和其任何盐、酯、或醚：睾丸激素(包括 其具有比如庚酸酯、环戊丙酸酯(cypionate)、以及丙酸酯部分的酯)、二氢睾酮(DHT)、 四氢孕三烯酮、诺龙、诺睾酮、甲基雄烯醇酮、康力龙、羟甲雄二烯酮、去氢甲睾酮、雄 烯二酮(例如，5a-雄-3，17-二酮)、雄烯二醇比如1-雄烯二醇(3β，17β-二羟-5α-雄-1- 烯；)、4-雄烯二醇(3b，17b-二羟-雄-4-烯)、5-雄烯二醇(3b，17b-二羟-雄-5-烯)、雄 烯二酮，比如1-雄烯二酮([5a]-雄-1-烯-3，17-二酮)、4-雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)、 5-雄烯二酮(雄-5-烯-3，17-二酮)、诺龙雄烯二酮、19-诺龙雄烯二醇、19-诺龙雄烯二酮、 诺龙雄烯二醇、脱氢表雄甾酮(DHEA)、勃地酮、氟烃甲基睾丸素、甲基雄烯二醇、甲 基睾甾酮、氧甲氢龙、康复龙、去甲雄三烯醇酮、氯睾酮、脱氢氯甲睾甾酮、屈他雄酮、 17α-乙炔基雄二醇、孕三烯酮、甲二氢睾酮、去氢甲睾酮、甲基雄烯醇酮、诺生卓隆、氧 甲氢龙、康复龙、四氢孕三烯酮(THG)、去甲雄三烯醇酮、克林勃醇(clenbutorol)、 以及包括在2004年促蛋白合成甾类控制行动中的甾族化合物(将其引入本发明作为参考)， 包括3b，17b-二羟-5a-雄甾烷；3a，17b-二羟-5a-雄甾烷；雄烷二酮、17-二甲睾酮(7a，17a -二甲基-17b-羟基雄-4-烯-3-酮)、勃地酮(17b-羟基雄-1，4，-二烯-3-酮)、二甲睾酮(7b，17a -二甲基-17b-羟基雄-4-烯-3-酮)、氯睾酮(4-氯-17b-羟基雄-4-烯-3-酮)、脱氢氯甲 睾酮(4-氯-17b-羟基-17a-甲基-雄-1，4-二烯-3-酮)、4-二氢睾酮(17b-羟基-雄-3- 酮)、屈他雄酮(17b-羟基-2a-甲基-5a-雄-3-酮)、乙基雌烯醇(17a-乙基-17b-羟基 雌-4-烯)、氟烃甲基睾丸素(9-氟代-17a-甲基-11b，17b-二羟雄-4-烯-3-酮)、甲酰勃龙 (2-甲酰-17a-甲基-11a，17b-二羟雄-1，4-二烯-3-酮)、呋拉扎勃(17a-甲基-17b-羟基雄 甾酮[2，3-c]-呋咱)、18a-同型(homo)-17b-羟基雌-4-烯-3-酮(18-甲基炔诺酮)、4- 羟睾甾酮(4，17b-二羟-雄-4-烯-3-酮)、4-羟基-19-去甲睾酮(4，17b-二羟-雌-4-烯-3- 酮)、二氢睾酮(17a-甲基-17b-羟基-5a-雄甾-3-酮)、甲二氢睾酮(1a-甲基-17b-羟基 -[5a]-雄-3-酮)、去氢甲睾酮(17a-甲基-17b-羟基雄-1，4-二烯-3-酮)、甲基雄烯二醇 (17a-甲基-3b，17b-二羟雄-5-烯)、甲基雄烯醇酮(1-甲基-17b-羟基-5a-雄-1-烯-3- 酮)、乙睾酮(17a-甲基-17b-羟基雄-4-烯-3-酮)、米勃龙(7a，17a-二甲基-17b-羟基雌 -4-烯-3-酮)、诺龙(17b-羟基雌-4-烯-3-酮)、诺龙雄烯二醇、19-诺龙-4-雄烯二醇(3b，17b -二羟基雌甾-4-烯)、19-诺龙-4-雄烯二醇(3a，17b-二羟基雌甾-4-烯)、19-诺龙-5-雄 烯二醇(3b，17b-二羟基雌甾-5-烯)、19-诺龙-5-雄烯二醇(3a，17b-二羟基雌甾-5烯)、 诺龙雄烯二酮、19-诺龙-4-雄烯二酮(雌-4-烯-3，17-二酮)、19-诺龙5-雄烯二酮(雌-5 -烯-3，17-二酮)、诺勃龙(18a-同型-17b-羟基孕-4-烯-3-酮)、诺司替勃(4-氯-17b- 羟基雌-4-烯-3-酮)、诺生卓隆(17a-乙基-17b-羟基雌-4-烯-3-酮)、氧甲氢龙(17a- 甲基-17b-羟基-2-氧杂[5a]-雄-3-酮)、羟甲睾酮(17a-甲基-4，17b-二羟雌-4-烯-3-酮)、 康复龙(17a-甲基-2-羟基亚甲基-17b-羟基-[5a]-雄-3-酮)、康力龙(17a-甲基-17b-羟 基-[5a]-雄-2-烯[3，2-c]-吡唑)、司腾勃龙(17b-羟基-2-甲基-[5a]-雄-1-烯-3-酮)、 睾内酯(13-羟基-3-氧代-13，17-司考雄-1，4-二烯-17-酮酸内酯)、1-睾甾酮(17b- 羟基-5a-雄-1-烯-3-酮)、睾甾酮(17b-羟基雄-4-烯-3-酮)、四氢孕三烯酮(13b，17a- 二乙基-17b-羟基性(hydroxygon)-4，9，11-三烯-3-酮)、去甲雄三烯醇酮(17b-羟基雌 -4，9，11-三烯-3-酮)。
[00197]取决于待设计的亲合分析的应用，可以作为包含分析物结合剂(捕获部分)和分 析物的结合性配对中的一个成员、或者可选地作为其他成员的物质的其他例子，包括给药 于动物(包括人类)、并且对其的检测在临床实践中是有用的、以及通过使用例如免疫测 定可在生物制品中实现对其的检测的抗生素及其他药物。这些药物的例子包括抗生素比 如，列在WHO国际生物学标准制品上的抗生素(可利用因特网 http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/Ant-Sept05.pdf，2005年9月21日更新，将 其引入本发明作为参考)。这些例子包括庆大霉素(92/670)、链霉素(76/539)、托 普霉素(82/510)、以及万古霉素(50/020)。
[00198]在至少一种实施方式中，本发明提供了一种具有两个以上不同捕获部分的结合性 表面。
[00199]在此描述的各种实施方式中的任何特征可以被用来与公开的任何其他实施方式 的有关特征相结合。例如，与本发明的组合物有关的公开的特征可以被用于在此描述的任 何方法等。不应把与各种或特定的实施方式有关的所描述的特征理解为与在此公开的其他 实施方式不相关，除非这样的排他性被明确地陈述或者在上下文中被暗示。
[00200]本发明的特定实施方式被显示在附图和实施例中，提供这些附图和实施例是为了 显示本发明的特定实施方式，并非用以限制本发明。
实施例
实施例1
牛血清白蛋白的低投入比率生物素化
[00201]BSA用硫代-NHS-LC-生物素(硫代琥珀酰亚胺-6-[生物素酰氨基]己酸；Pierce生 物技术公司/Thermo Scientific公司)以生物素对BSA的不同摩尔投入比率进行生物素化 (参见表1)。简言之，硫代-NHS-LC-生物素(556.59g/mol)以30毫克/每毫升(mg/mL) 的浓度溶于DMF(二甲基甲酰胺)，并且冻干的BSA(牛血清白蛋白，游离的蛋白酶； Celliance公司--一家血清公司；66,000g/mol)以15～20mg/mL的浓度溶于pH 8.2的0.05M 硼酸盐缓冲液。将该硫代-NHS-LC-生物素溶液加至BSA溶液，以使得硫代-NHS-LC- 生物素对BSA的最终摩尔投入比率是3.4至30(硫代-NHS-LC-生物素的摩尔数∶BSA的 摩尔数)。将反应物在4℃下保温2小时，然后立即用pH8.2的0.05M硼酸盐缓冲液透 析(即，渗滤或透渗析)以除去过量的硫代-NHS-LC-生物素(即，生物素试剂、以及水 解的生物素试剂、游离的生物素)。在整个制备低投入比率的生物素化BSA中使用这种一 般程序。
[00202]通过使用本技术领域任何已知的用于定量生物素的方法可以估算生物素化程度。 一个合适的方法是HABA比色测定，其使用对于生物素具有选择性的4′-羟基偶氮苯-2-羧 酸(HABA)。通过HABA分析估算每摩尔BSA结合的生物素的摩尔数。结果如表1所 示。
[00203]通过下述步骤完成17组单独生物素化的生物素化BSA的稳定性分析：在37～42 ℃下，在pH 9.0-9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中用生物素-BSA涂敷25mg/mL甲苯磺酰基 活化的PMP(DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基活化物，1.0微米直径，Invitrogen 公司)(0.030-0.050毫克生物素-BSA/每mg PMP)18～24小时；用pH 7.4的TBS(0.02M Tris、0.15M氯化钠)洗涤微粒三次；在37～42℃下，用含在TBS pH 7.4中的0.4％～0.6 ％(w/v)的三区段共聚物F108(F-108 NF金属颗粒；BASF公司)封闭 涂敷了生物素-BSA的微粒表面4-4.5小时；用TBS pH 7.4洗涤微粒三次；将生物素-BSA 微粒分散在含有0.4％～0.6％(w/v)F108的TBS pH 7.4中；在室温下，用在TBS pH 7.4中的SA(冷冻，未曾冻干，加SA21 SA，Prozyme公司)涂敷生物素-BSA微粒(0.025-0.050 毫克SA/每mg生物素-BSA PMP)30-50分钟；用含有叠氮化钠(0.1％w/v)的TBS pH 7.4 洗涤微粒三次；用对Free T4测定特异的微粒缓冲液洗涤微粒三次；用对 Free T4测定特异的微粒缓冲液将微粒从25mg/mL稀释到0.35mg/mL；在4℃下 或37℃下保温涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒3天；以及在Free T4测 定(贝克曼考尔特公司)中，测试涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒结合对生物素化 Free T4特异的抗体的能力。通过计算单个Free T4标准RLU(相对光单元、信号、或应答) 回收率的平均值来确定稳定性。该Free T4测定使用了具有0ng/ml至6ng/ml的抗 原水平的6个不同的标准(S0、S1、S2、S3、S4、以及S5)(参见表4)。通过用4℃ 标准RLU应答除以37℃下标准RLU应答、并且乘以100％，计算出回收率。通过平均全 部6个标准的回收率，计算出稳定性。结果如表1所示。
[00204]稳定性是在4℃或37℃下保温固相3天之后SA结合力变化的指示。稳定性降 低起因于被动地结合的生物素或生物素试剂从生物素-BSA结合物上脱落或解离(参见图 11；虚线：37℃下；实线：4℃下)、以及随后的游离生物素或生物素试剂随时间被SA 捕获。结果表明，以较高的摩尔投入比率(即，8∶1、15∶1、30∶1)制备的生物素-BSA显示 非常差的稳定性。当生物素试剂对BSA的摩尔投入比率从30∶1降低至4∶1时，稳定性由 4％提高到100％。
[00205]

[00206]BSA以30摩尔硫代-NHS-LC-生物素/每mol BSA的摩尔投入比率进行生物素化。 通过下述步骤，将该按30∶1生物素化的BSA附接于MyOne甲苯磺酰基活化的PMP： 在37～42℃下，在pH 9.0-9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中用生物素-BSA涂敷25mg/mL甲 苯磺酰基活化的PMP(0.030-0.050毫克生物素-BSA/每mg PMP)18～24小时；用pH 7.4 的TBS洗涤微粒三次；在37～42℃下，用含在TBS pH 7.4中的0.4％～0.6％(w/v)的三区 段共聚物F108封闭涂敷了生物素-BSA的微粒表面4-4.5小时；用TBS pH 7.4 洗涤微粒三次；将生物素-BSA微粒分散在含有0.4％～0.6％(w/v)F108的TBS pH 7.4中；在室温下，用在TBS pH 7.4中的SA涂敷生物素-BSA微粒(0.025-0.050毫克SA/ 每mg PMP)30～50分钟；以及用TBS pH 7.4洗涤微粒三次。在4℃或37℃下，将25mg/mL 涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的PMP放置3天；并且放置于磁石上10分钟以分离PMP (从4℃或37℃下的缓冲液中除去微粒)。通过使用筛析(size-exclusion)高效液相色 谱(SEC-HPLC；贝克曼考尔特系统黄金HPLC系统，32KARATM5.0软件，Phenomenex 300×7.80mM BioSep-SEC-S 3000柱，PBS pH 7.2流动相，1.0ml/min流速，0.050mL 样本体积，17分钟运行时间，200至400nm光电二极管阵列检测)，收集4℃和37℃ 无微粒的上清液，并且分析上清液。
[00207]与4℃上清液相比，在37℃的上清液中210nm处的SEC-HPLC分析显示出在 10.8分钟保持时间(RT)处和12.4分钟RT处明显较高水平的低分子量分析物。这些峰值 被认为是在以30∶1(生物素试剂∶BSA)投入比率的生物素化工序期间被动地吸附至BSA 分子上、并且未通过透渗析或脱盐而除去的生物素和/或生物素试剂的峰值。该结果也表明， 在液体上清液中没有检测到BSA或SA(RT为7.8至8.2min)(低于该方法的检测极限)。 并且生物素-BSA结合物和/或SA未从固相上脱落。
[00208]SEC-HPLC的结果支持了稳定性结果(参见表1)，在该结果中，与4℃下的稳 定性相比，30分子生物素试剂∶1分子BSA的样本在37℃下的稳定性有最显著的降低(稳 定性降低95.9％，或稳定性为4.1％)；并且与4℃的上清液相比，在37℃的上清液中还 显示出显著含量的低分子量分析物的存在。稳定性降低起因于被动地结合的生物素或生物 素试剂从生物素-BSA结合物上脱落或解离、以及随后的游离生物素或生物素试剂随时间 被SA捕获。
[00209]通过下述步骤优化生物素-BSA涂覆工艺：使用4摩尔硫代-NHS-LC-生物素/每 mol BSA来生物素化BSA；提供30、40、50、或60微克生物素-BSA/每mg微粒 (DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基活化物，1.0微米直径，Invitrogen公司)；在 37℃或40℃下将生物素-BSA与微粒一起在0.1M硼酸盐pH 9.5中保温2、4、或18小 时；用TBS pH 7.4洗涤微粒三次；在37℃下用含有0.4％(w/v)F108的TBS pH 7.4封闭微粒4小时；用TBS pH 7.4洗涤微粒三次；在含有0.4％(w/v)F108的 TBS中分散生物素-BSA微粒；通过加入35微克SA/每mg微粒并在室温下保温30分钟来 偶联SA；以及用TBS pH 7.4洗涤涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒三次。
[00210]测定性能试验(Free T4和AccuTnl测定；贝克曼考尔特公司)、 以及生物素化IgG结合力测试的结果表明，当以25mg/mL的微粒浓度将30至50μg生物 素-BSA/每mg微粒加入pH 9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中、并且在37℃至42℃下孵育18 至24小时时，生物素-BSA涂覆工艺是实用的。简言之，将125I-标记的生物素化IgG方法 用于评价结合力，该方法通过使用标准碘化作用程序(抗体和生物素化抗体在室温下各自 与Na125I和氯胺T三水合物一起孵育，各个反应用偏亚硫酸氢钠终止，并且被125I标记的 未生物素化的抗体和被125I标记的生物素化抗体各自通过使用经0.5％BSA/PBS/0.1％叠氮 化钠预处理的SEPHADEX G-50进行纯化)，用125I标记生物素化IgG和未生物素化的IgG； 通过使用γ粒子计数管计算出总的CPM(每分钟计数)/mg生物素化的125I-IgG和未生物 素化的125I-IgG；对涂敷了SA的微粒提供摩尔过量的125I-生物素-IgG(经由生物素结合性 结构域主动吸收)或125I-IgG(被动吸收或非特异性结合)；用洗涤缓冲液洗涤微粒5次； 洗涤后的微粒被置于γ粒子计数管中以确定总CPM；并且通过用125I-生物素-IgG SA微粒 的CPM减去涂敷了125I-IgG的SA微粒(非特异性结合对照物)的CPM来确定特异性地 捕获的生物素-IgG的量。
实施例2
不饱和性降低了结合力但是增强了测定信号
[00211]通过使用PMP、以低的生物素对BSA的摩尔投入比率(4∶1)制备的生物素-BSA 来制备采用生物素/SA体系的不饱和的并且被定向的结合性表面。简言之，通过下述步骤 制备出一组具有不饱和的并且被定向的结合性表面的微粒：用低投入比率的生物素化BSA 涂敷AKT-100甲苯磺酰基活化的PMP；用F108封闭生物素-BSA微粒； 在F108中分散被封闭的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微 粒。参见表2，“BCI样本”。为进行比较，测试了市售生物素结合性微粒 (DYNABEADS MyOne链霉抗生物素蛋白T1，Invitrogen公司)。参见表2， “对照物”。通过使用相同的未加工的微粒(MyOne甲苯磺酰基活化的1.0 微米PMP，购自Invitrogen公司)，各自制备不饱和的表面和市售生物素结合性表面。
[00212]通过使用14C-生物素结合力测试方法(Invitrogen公司)，对不饱和的生物素结 合性表面和市售生物素结合性(即，涂敷了SA)表面进行生物素结合力测试。结果如表2 所示。标准水平表示为纳克/每mL。市售微粒的生物素结合力是1,400pmol生物素/mg， 然而根据本发明制备的具有不饱和的结合性表面的微粒的生物素结合力仅为214pmol生 物素/mg。因此，与根据本发明制备的相同直径微粒相比，市售生物素结合性微粒显示出 高出6倍的对于生物素的结合力。
[00213]还测试了微粒结合生物素化IgG的能力。市售微粒显示出的生物素化IgG结合力 为20.0微克生物素化IgG/每mg微粒，然而根据本发明的微粒显示出的结合力为6.7微克 生物素化IgG/每mg微粒。因此，与根据本发明的微粒相比，市售生物素结合性微粒显示 出高3倍的生物素化IgG结合力。然而，与根据本发明的微粒相比，市售微粒的生物素结 合力要高出6倍。
[00214]

[00215]在对于蛋白质、肌钙蛋白I的测定中将市售生物素结合性微粒的功能特性与根据 本发明制备的不饱和的微粒的性能相比较。简言之，市售一微米直径的用重组体SA涂敷 的生物素结合性微粒(DYNABEADS MyOne链霉抗生物素蛋白T1，Invitrogen公 司)、以及根据本发明的不饱和的一微米直径的用SA涂敷的微粒被用于对于肌钙蛋白I 的测定，该测定使用AccuTnl测定即夹心法测定(贝克曼考尔特公司)，其用生 物素化的抗肌钙蛋白I处理涂敷了SA的微粒并且测量对肌钙蛋白I标准(贝克曼考尔特公 司)的分析应答。结果如表3所示。
[00216]

[00217]表3显示，在整个标准水平(S1至S5)范围内，根据本发明的不饱和的微粒显 示出比市售微粒更高的RLU读数、以及比市售微粒更低的背景RLU读数(S0)。这一结 果令人惊奇并且预料不到，因为根据本发明的不饱和的微粒显示出比市售生物素结合性微 粒更低的生物素结合力(参见表2)。在几乎全部范围内不饱和的微粒的标准应答都较高。 对不饱和的微粒来说，S0的％CV标准应答(CV＝变化系数)的测定精确性要高出两倍。 然而，与市售微粒相比，不饱和的微粒具有明显地较低的S0 RLU应答(8,116对13,023)， 并且随着RLU信号下降，在重复性之间RLUs的较小差异可以导致更大的％CV。平均起 来，不饱和的微粒的表示为％CV标准剂量的测定不精确性明显地较低。至于动态范围， 不饱和的微粒的比率S1/S0和S5/S0高约两倍。因此，与市售微粒相比，虽然根据本发明 的微粒结合较少的生物素(并且因此，结合较少的生物素化IgG)，但它们在功能性亲合 分析中表现得出乎意料的好，并且具有降低的噪音或非特异性结合。
[00218]在Free T4测定(贝克曼考尔特公司)中，将市售2.8微米直径的涂敷了 SA的微粒(DYNABEADS M-280链霉抗生物素蛋白，生物素结合性能力为650至 900皮可摩尔生物素/每mg，Invitrogen公司)的性能与根据本发明制备的1.0微米涂敷了 SA的微粒的性能相比较(生物素结合力为约214皮可摩尔生物素/每mg；参见表2)。通 过使用Free T4测定法--一种竞争性测试来测定Free T4，步骤包括：用根据本发明 的生物素化的抗T4处理涂敷了SA的微粒(市售涂敷了SA的2.8微米直径PMP用“ 方法”；根据本发明制备的1.0微米直径涂敷了SA的PMP用“BCI方法”)；并且测量 对T4标准(贝克曼考尔特公司)的分析应答。测定在2免疫测定体系(贝克曼考 尔特公司)上进行，并且在该系统上得到的RLUs结果如表4所示。
[00219]

[00220]如表4所示，根据本发明制备的1.0微米涂敷了SA的微粒对于分析物(Free T4) 发出与市售2.8微米直径涂敷了SA的微粒大致一样的信号。这一结果令人惊奇并且预料 不到，因为与市售抗生物素微粒(DYNABEADS M-280链霉抗生物素蛋白，生物 素结合力为650至900皮可摩尔生物素/每mg，Invitrogen公司)相比，根据本发明的不饱 和的微粒显示出更低的生物素结合力。如上述表格(参见表2、3和4)所示，根据本发明 制备微粒可以得到结合性表面的不饱和性，从而使得配体(生物素)的数量被降低。根据 本发明的微粒结合更少的生物素(与市售DYNABEADS M-280微粒的650至900皮可摩 尔/每mg、以及DYNABEADS MyOne SA T1微粒的大于1,000皮可摩尔/每mg相比，根据 本发明的微粒为214皮可摩尔/每mg)，但是它们具有更好的功能(参见表3和表4)。 根据本发明的1.0微米微粒的结合性稍小于2.8微米微粒，但是本发明的微粒产生更多的 信号。
[00221]总之，结果表明，与市售微粒相比，虽然根据本发明的不饱和的微粒具有更低的 结合力，但它们产生的分析信号和市售微粒一样好，或者比市售微粒更好。尽管存在本发 明的结合性表面具有与市售微粒相比明显更低的结合力这一事实。
实施例3
使用分散步骤制备不饱和的表面
[00222]通过使用低的生物素化试剂对BSA的摩尔投入比率(4∶1)制备的生物素-BSA在 用于制造不饱和结合性表面的的分散方法中被使用。简言之，将(如上所述制备的)生物 素-BSA共价附接于如上所述微粒，从而产生相对于每单位支持物表面积生物素数 量不饱和的表面。在加入SA之前，然后在分散步骤中使用该涂敷的微粒。
[00223]最初的研究使用血球计数器(显微镜分析)在如下阶段评价如上所述制备的涂敷 了生物素-BSA的微粒的聚集状况：(1)在加入SA之前；(2)在将10mg/mL涂敷了生 物素-BSA的微粒的溶液逐滴加至连续地混合的SA溶液(0、125、250、375、500、750、 或1000微克SA/每mL)后；以及(3)在将不同含量的18mg/mL的SA溶液(25、50、 75、100、150或200微克SA/每mg微粒)加至连续地混合的10mg/mL生物素-BSA涂敷 微粒的溶液后进行。报道了包括单体(单一微粒)、二聚体(两个微粒的聚集体)、三聚 体(三个微粒的聚集体)、小聚集体(4至10个微粒的聚集体)、以及大聚集体(大于 10个微粒的聚集体)的血球计数结果。聚集体定义为两个以上生物素-BSA微粒经由SA 交联的连接体(即，SA是多价的，具有四个亚基，并且各个亚基具有一个生物素结合性 结构域)。血球计数结果表明，在加入SA之前生物素-BSA微粒是单分散(仅为单体和二 聚体)的，当将生物素-BSA微粒(逐滴)滴入SA溶液直到750微克SA/每毫升时，大部 分生物素-BSA微粒发生聚集(大聚集体)；当将生物素-BSA微粒(逐滴)滴入1000微 克SA/每毫升的SA溶液时，生物素-BSA微粒发生单分散(三聚体、二聚体、以及单体)； 并且当将SA以全部测试浓度加入至生物素-BSA微粒时，生物素-BSA微粒发生高度聚集 (大聚集体)。这里使用的术语“基本上单分散”，意思是指微粒群体基本上仅以单体和 二聚体形态存在。
[00224]通过将涂敷了生物素-BSA的微粒逐滴加入至SA的混合溶液、或者通过将SA溶 液加入至生物素-BSA微粒的混合溶液制备出的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒， 可以通过使涂敷了SA的微粒与混合物一起经受超声能量处理(2×300瓦特，60秒)而被 驱逐成临时的单分散状态(大部分为三聚体，具有二聚体和单体)，但是微粒不会随时间 保持单分散，并且会再次变得高度聚集。超声能量不会得到永久性地单分散的涂敷了生物 素-BSA、涂敷了SA的微粒，并且不能减轻生物素-BSA微粒由于SA交联而聚集的倾向。
[00225]完成血球计数研究来确定疏水性的微粒单分散(1.03微米聚苯乙烯PMP，目录编 号M1-070/40、EMD生物科学公司)所要求的F108的含量(在水中从0μM到 1000μMF108的17个稀释水平)。这些研究结果表明，在F108浓度为 27.04μgF108/mg微粒(稀释度水平6)到2027.7μgF108/mg微粒(稀 释度水平15)处，M1-070/40微粒是基本上单分散的(即，仅有单体和二聚体)。当 F108浓度小于27.04μgF108/mg微粒时、以及当浓度大于2027.7μg F108/mg微粒时，微粒发生聚集(很可能由于三区段共聚物的多层堆积)。假定 界面表面积为20nm2/每F108分子、并且微粒表面面积为38.38cm2/mg(基于1.03 μm、光滑表面、完美的圆球形)，表面面积计算预计单层的F108理论上将需要 至少4.1μgF108/mg微粒。应该注意，M1-070/40微粒的尺寸或光滑表面是不均 一的(粒径分布不均匀)，并且含有大量直径小于1.03微米的细微粒(基于通过使用贝克 曼考尔特公司LS13 320激光衍射颗粒分级机的微粒粒度分析)。细微粒和粗糙的微粒表面 都表明，M1-070/40微粒具有比上述计算值更大的表面面积/每mg。该血球计数结果支持 这一假设，因为微粒单分散需要大于27μgF108/mg微粒。该研究结果表明，在 浓度为27.04至2027.7μgF108/mg微粒(稀释度水平6到15)处，F108 可以导致微粒单分散。
[00226]用生物素-BSA涂敷的特定组的微粒(DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基 活化，1.0微米直径，Invitrogen公司)具有从74至84cm2/mg的表面面积(分析证明上提 供的数据；Invitrogen公司)。基于这些数值、以及上述的F108血球计数研究， 计算出含有25mg生物素-BSA微粒/每mL的0.4％(w/v)的F108溶液(或4 mg/mL)将提供大约160μgF108/mg微粒。因为在F108血球计数研究 中使用的1.03微米M1-070/40微粒(EMD生物科学公司)具有大于38.38cm2/mg的表面 面积，并且在27.04至2027.7μgF108/mg微粒的浓度处是单分散地，故0.4％ (w/v)F108、或者160μgF108/mg微粒的溶液被用于最初的分散研究， 以确保存在足够量的F108来促进生物素-BSA微粒单分散。
[00227]通过将SA(25至50μg SA/mg微粒)加入至25mg/mL生物素-BSA微粒制备 出的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒在加入SA后是单分散的，该生物素-BSA微粒 分散在含有0.4％(w/v)F108(F-108 NF金属颗粒，BASF公司)的PBS (20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2)缓冲液、或者含有0.4％(w/v)F108 的TBS(20mM Tris、150mM氯化钠、pH 7.2)缓冲液中。
[00228]微粒保持单分散，与SA的加入顺序无关(即，将生物素-BSA微粒逐滴加入至 SA、或者将SA加入至生物素-BSA微粒)，只要在与SA结合之前将生物素-BSA微粒分 散在含有0.4％(w/v)F108的溶液中。不同于如上所述超声处理的应用，如果在 与SA结合之前，将生物素-BSA微粒分散在含有F108的缓冲液中，那么涂敷了 生物素-BSA、涂敷了SA的微粒就会保持单分散。因此，在生物素-BSA微粒与SA结合之 前和之后，通过提高微粒胶体稳定性(由于F108悬挂的羟基而降低微粒支持物 表面疏水性、提高微粒支持物表面负电荷，并且由于表面对表面的负电荷排斥性而提高微 粒排斥力)，并且在微粒交联可能发生之前通过允许SA分子与全部可利用的(未结合的 和可以接近的)微粒表面生物素结合，0.4％(w/v)F108成功地用作分散剂来促进 生物素-BSA微粒单分散。只有当微粒生物素可被利用时，并且当四个SA结合性结构域中 的至少两个可以与在两个不同的微粒上的未结合的和可以接近的生物素结合时，交联才可 能发生。
[00229]凭经验确定，F108可以0.4％至0.6％(w/v)的浓度用作用低投入比率的 生物素化BSA涂敷的微粒的分散剂。简言之，组合评估SA的投入比率(10、15、25和 35μg SA/mg生物素-BSA微粒)、保温时间(30和60分钟)、以及F108百分 比(0.4至0.6％w/v)，来优化分散步骤。测定性能试验(Free T4和AccuTnl 测定；贝克曼考尔特公司)、以及生物素化IgG结合力测试的结果表明，当符合如下条件 时，分散过程是实用的：以在含有0.4％至0.6％(w/v)F108的TBS缓冲液(20mM Tris，150mM氯化钠，pH 7.2)中25mg生物素-BSA微粒/mL的微粒浓度加入25至35μg SA/每mg生物素-BSA微粒，并且孵育30至60分钟。
[00230]一旦生物素化微粒被处理并且被分散在0.4％至0.6％(w/v％)F108溶 液中，就可以将低水平或含量的SA加至生物素化微粒，而不形成微粒聚集体或凝块。该 工艺导致在用SA涂敷微粒后，微粒单分散。在图6所示的工艺示意图中，其显示了在没 有F108时涂敷的微粒用SA处理的情况，并且显示了由F108处理导致 的单分散。
实施例4
由于SA不饱和性和定向性而提高的信噪比、增强的表面封闭性、以及提高的结合效率
[00231]在普通微粒的信噪比与本发明的的不饱和微粒的信噪比之间的两个测定平台上 进行比较，本发明微粒的特征为SA不饱和性和定向性、增强的表面封闭性、以及提高的 结合效率。
[00232]通过使用涂敷至微粒表面上的GxBiotin(山羊抗生物素)抗体一次涂层、接着使 用指示BNP的生物素化(Biosite公司)Fab片段的二次涂层，将指示B 型促尿钠排泄肽或脑促尿钠排泄肽(BNP)的结合性表面构造在普通的微粒(M1-070/40 微粒，EMD生物科学公司)上。简言之，通过下述步骤，使用碳二亚胺化学技术将GxBiotin IgG一次涂层涂敷于10mg/mL微粒：在MES pH 5.5中，用大约6至10摩尔EDC(1-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐；Pierce生物技术公司/Thermo Scientific公司)、 和6至10摩尔硫代-NHS(n-羟基硫代琥珀酰亚胺；Pierce生物技术公司/Thermo Scientific 公司)/每mol表面羧基来活化微粒表面羧基(70至100μmols COOH/g)；将微粒与活化 试剂一起保温30至35分钟；通过用MES pH 5.5洗涤微粒三次，除去过量的活化剂；加 入40微克的GxBiotin IgG/每mg活化微粒；将活化的微粒与GxBiotin IgG一起保温120 至135分钟；用基于甘氨酸的缓冲液除去过量的GxBiotin IgG，并淬火残余的活化羧基； 使用低pH(pH 2.5)和高pH(pH 8.0)含有表面活性剂X-100(聚乙二醇对(1，1，3，3 -四甲基丁基)-苯基醚)的缓冲液剥离被动地吸附的GxBiotin IgG；以及用BSA封闭微粒 表面。
[00233]通过下述步骤涂敷二次涂层：将GxBiotin IgG初次涂敷的微粒洗涤入对BNP测 定特异的稀释剂；加入10微克的生物素化BNP Fab/每mg的GxBiotin微粒；在室温下将 生物素化BNP Fab与微粒一起保温90至135分钟；洗涤微粒，以除去过量的生物素化BNP Fab；以及用对BNP测定特异的稀释剂将涂敷BNP的微粒稀释至1.0mg/mL。
[00234]通过下述步骤制备出根据本发明的不饱和的微粒：将低投入比率的生物素化BSA 共价连接于AKT-100甲苯磺酰基活化的PMP，其中BSA以4摩尔生物素对1摩尔 BSA的摩尔投入比率被生物素化；接着用F108封闭生物素-BSA微粒；在 F108中分散被封闭的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。 生物素化单克隆抗体的投入比率对于普通涂敷的微粒和不饱和的微粒是一样的。该生物素 化OMINCLONAL Fab可指示BNP。以相同的微粒浓度(1.0mg/mL)评估普通涂敷的微 粒和不饱和的微粒，并且对它们用相同的试剂、对照样品、以及病人样本按相同的 测定形式(贝克曼考尔特公司)进行测试。结果如表5所示。
[00235]对于普通的微粒和不饱和的微粒，在下述两个测定平台(贝克曼考尔特公司)中 的每一个上测量信噪比：DxI 800免疫测定体系(相对高通量的系统)和 2免疫测定体系(相对较低通量的系统)。对于13个分离的病人样本，在整个标 准水平范围内测量标准应答。以RLUs显示对于普通的微粒的结果(表5中“对照物”) 和对于不饱和微粒的结果(表5中“Dev 3”)。对于对照物和不饱和的微粒，以同样方式 确定表示为“％偏差”的测定平台偏差。术语“偏差”指的是可能发生在任何测定系统之 间的测定剂量差异，所述系统包括2免疫测定体系和DxI 800免 疫测定体系，该差异是由于硬件、设计、以及通量差异(即，2免疫测定体系可以 完成100个测试/每小时，而DxI免疫测定体系可以完成400个测试/每小时) 而造成的，即使两种平台使用相同的试剂和供给物。任何偏差可以被归因于在各个平台超 声处理、混合、洗涤、以及保温微粒试剂的方式中的差异。对于普通微粒和不饱和的微粒， 计算出平均剂量。
[00236]如表5显示，对于根据本发明的微粒的偏差测量总体上比对于普通微粒的偏差测 量更好。表5还显示，对于不饱和的微粒：(1)背景更低(将S0与S1-S5相比较)；(2) 在全部标准水平和全部病人样本范围内，背景信号更优良；并且(3)对于全部标准水平 和全部病人样本，灵敏度更高。因此，不饱和的微粒使得测定信号增大(例如，使用DxI 平台，对于普通的微粒在S5处为13×106RLUs，而对于本发明的不饱和微粒在S5处为 23×106RLUs)，并且使得测定噪音或者背景显著降低(例如，通过使用DxI平台，对于 普通的微粒在S0处为10×103RLUs，而对于本发明的不饱和微粒在S0处为7×103 RLUs)。
[00237]

[00238]根据本发明的微粒与市售结合性微粒进行另一个比较(参见表2对于微粒的描 述)。在该比较中，得到了通过用重组体SA初次涂敷AKT-100甲苯磺酰基活化的 PMP而制备的市售微粒(Invitrogen公司)。将市售涂敷了SA的微粒的性能与通 过下述步骤制备的根据本发明的微粒的性能相比较：用低投入比率的生物素化BSA涂敷 AKT-100甲苯磺酰基活化的PMP；用F108封闭生物素-BSA微粒；在 F108中分散被封闭的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。 市售微粒和不饱和的微粒都被用于肌钙蛋白I测定(AccuTnl测定；贝克曼考尔特 公司)，该测定使用抗作为捕获部分的Tnl的生物素化抗体。市售微粒和本发明的不饱和 的微粒都以相同的微粒浓度进行评估，并且用相同的试剂、对照样品、以及病人样本按相 同的测定形式进行测试。结果如表6所示。
[00239]

[00240]本发明的不饱和的微粒导致测定信号与市售微粒的测定信号相比显著增大(例 如，对于S5，从9.6×106RLUs增大至12.4×106RLUs)、以及测定噪音或背景的显 著降低(例如，对于S0，由13×103RLUs降低至8×103RLUs)。因此，由于SA在 微粒结合性表面上的不饱和性和定向性、以及其累积的对随后加入的生物素化抗体的不饱 和性和定向性影响，本发明的不饱和的微粒显示出增大的测定信噪比。应注意，上述 方法和BCI方法的比较使用了优化的(商品化产品，DYNABEADS MyOne链霉抗 生物素蛋白T1；Invitrogen公司)方法，但没有使用优化的BCI方法。随后的使用 优化的BCI方法进行的不饱和微粒的Tnl测试(AccuTnl测定)导致了测定信号更 显著的增大(即，S1＝80,000RLUs、S5＝18,300,000RLUs)、类似的测定噪音或背景(即， S0＝8,500RLUs)、以及增大的曲率(即，S1/S0＝9.4、S5/S0＝2,130)。
实施例5
非特异结合性下降
[00241]通过使用根据本发明制备的微粒进行的研究显示了非特异的结合性下降，因为在 许多测定形式中非特异的结合性是不期望有的现象。非特异的结合性描述了在免疫测定中 涉及其组分和/或支持物表面的人为的结合现象，该人为的结合现象产生不期望有的副产 品，所述副产品可以不利地影响测定性能参数，包括作为非限制性的例子的信噪比。非特 异的结合性可以涉及对于固相支持物表面本身、和/或对于涂敷在支持物表面上的配体::支 持物连接物复合物的结合。检验了使用BSA作为支持物连接物的微粒的特定实施方式。
[00242]BSA是白蛋白(牛血清白蛋白)，并且白蛋白可以结合甲状腺激素。已经识别出 BSA作为对于甲状腺激素T3和T4的结合性蛋白。如果固相支持物表面用BSA涂敷，那 么结合性表面将会捕获或者结合这样的甲状腺激素，除非其被成功地封闭。
[00243]因为通过下述步骤制造出不饱和的SA微粒：用生物素化BSA涂敷微粒、用 F108封闭表面、以及用SA涂敷生物素-BSA表面，所以不饱和的SA微粒有潜 力去结合甲状腺激素比如T3和T4，除非它们的表面被足够地封闭。特别地，如果将不饱 和的SA微粒与T3碱性磷酸酶结合物一起保温，那么该微粒可以结合T3结合物，并且在 测定中产生非特异结合性(NSB)信号，除非表面被封闭并且非特异的结合性被减轻或者 消除。除了增大的背景之外，提高的标准信号可能由T3结合物的非特异的结合性引起。 凭经验确定，F108可以0.4％至0.6％(w/v)的浓度封闭用低投入比率的生物素化 BSA涂敷的微粒。
[00244]最初的封闭研究评估了作为封闭剂用于用生物素化BSA涂敷的甲苯磺酰基活化 顺磁性微粒的0.1M Tris pH 8.0中的0.1％(w/v)BSA、以及0.1M Tris pH 8.0中的0.4％(w/v) F108。在37℃下将生物素-BSA微粒与0.1％(w/v)BSA或0.4％(w/v) F108封闭缓冲液一起保温18小时，并且通过慢慢地将生物素-BSA微粒滴入摩 尔过量的SA而用SA涂敷。在封闭之前、并且也在封闭以后，使用下述缓冲液之一来洗 涤该生物素-BSA微粒三次：PBS，pH 7.4；含有0.1％(w/v)TRITON X-100的PBS，pH 7.4； 含有0.4％(w/v)F108的PBS，pH 7.4；TBS，pH 7.4；含有0.1％(w/v)TRITON X-100 的TBS，pH 7.4；或者含有0.4％(w/v)F108的TBS。测定性能试验 (AccuTnl测定；贝克曼考尔特公司)的结果表明，使用0.4％(w/v)F108 封闭缓冲液、以及用TBS pH 7.4洗涤会得到最最低的背景信号(最低的S0RLUs)、最高 的标准信号(最高的S1和S5RLUs)、最大的测定动态范围、以及最高的信噪比。
[00245]随后的封闭优化研究评估了通过下述方法制备的生物素-BSA微粒的性能：用硫 代-NHS-LC-生物素、硫代HHS-LC-LC-生物素、或PFP生物素生物素化BSA；用TBS pH 7.4洗涤三次；用0.1％(w/v)BSA封闭缓冲液或用0.4％(w/v)F108封闭缓冲液在 37℃下封闭4小时，或者在37℃下封闭18小时；用TBS pH 7.4洗涤三次；并且通过慢 慢地将生物素-BSA微粒滴入摩尔过量的SA或NeutrAvidin而用SA或NeutrAvidin涂敷。 测定性能试验(AccuTnl测定；贝克曼考尔特公司)的结果表明，用下述方法得到 的硫代-NHS-LC-生物素BSA微粒、以及PFP-生物素BSA微粒得到了最低的背景信号(S0)、 最高的标准信号(S1和S5)、最大的测定动态范围、以及最高的信噪比：用0.4％(w/v) F108在37℃下封闭4小时，并且用SA或NeutrAvidin涂敷。
[00246]使用通过下述步骤制备的生物素-BSA微粒进行最后的F108封闭优化 研究：在0.1M硼酸盐pH 9.5中，在40℃下将低投入比率的硫代-NHS-LC-生物素结合的 BSA(40微克生物素-BSA/每mg微粒)涂敷到MyOne甲苯磺酰基活化的微粒 (DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基活化，1.0微米直径，Invitrogen公司)上18 小时；用TBS pH 7.4洗涤该生物素-BSA微粒三次；在40℃下，用TBS pH 7.4中的0.2％、 0.4％、0.6％、或0.8％(w/v)F108封闭2、4、或24小时；用TBS pH 7.4洗涤三 次；并且通过在含有0.4％(w/v)F108pH 7.4的TBS中分散生物素-BSA微粒、然 后加入35微克SA/每mg微粒而用SA涂敷。测定性能试验(Free T4和 AccuTnl测定；贝克曼考尔特公司)、以及生物素化IgG结合力测试的结果表明， 用0.4％至0.6％(w/v)F108封闭4小时的微粒得到了最低的背景信号、最高的标 准信号、最大的测定动态范围、最高的信噪比、以及可再现的生物素化IgG结合力。
[00247]为了评价不饱和的涂敷了SA的微粒的非特异的结合性，在4℃或37℃下将许 多不饱和的涂敷了SA的微粒保温3天，并且通过使用Free T4标准和Free T4试剂包(贝克曼考尔特公司)在Free T4免疫测定中进行测试。在没有对生物素化Free T4特异的抗体(“无AB”)的情况下的测试样本将评价T3结合物对于微粒表面的的非 特异结合性。表7显示了本发明的具有用SA涂敷的生物素化BSA的微粒与市售微粒测定 (Free T4)中产生的信号相比较的结果，该测定使用卵清蛋白和生物素化抗体以 及购自Invitrogen公司的DYNABEADS M-280链霉抗生物素蛋白微粒(2.8微米微 粒)。
[00248]

[00249]结果表明，结合物的非特异结合不会发生，因为当从试剂包(无Ab)中除去对 生物素化Free T4特异的抗体时，在4℃和37℃下不饱和的样本中的S0测定信号皆是 ＜8,500RLUs。仅当非特异的结合发生时、或者当对生物素化Free T4特异的抗体存在于测 定中时，才产生测定信号，因为SA表面将捕获对生物素化Free T4特异的抗体，并且被捕 获的对Free T4特异的抗体确实结合了T3结合物(即，S0＞1.5×106RLUs)。市售微粒 使用具有卵清蛋白(无BSA)的SA微粒，以便降低非特异的结合性。尽管不饱和的微粒 使用低投入比率的生物素化BSA，但它们表现得更好。总之，结果表明，即使在升温下延 长期限(37℃下3天)，也未观察到非特异的结合性，该结果建议，在这些条件下 F108未从不饱和的微粒中被取代。因此，甚至在升高的温度下随时间延长，用 F108封闭的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的结合性表面也得到了降低的或最 小化的T3碱性磷酸酯结合物的非特异结合性。
实施例6
涂覆工艺再现性
[00250]对于根据本发明的不饱和的并且被定向的微粒，对SA涂敷工艺进行验证。结果 如表8和图12及图13所示。进行工艺验证的微粒是根据本发明制备的微粒。简言之，用 低投入比率的生物素化BSA涂敷AKT-100甲苯磺酰基活化的PMP(Invitrogen公 司)；用F108封闭生物素-BSA微粒；将被封闭的生物素-BSA微粒分散在 F108中；并且用SA涂敷生物素-BSA微粒。
[00251]用独立地制备的下述物质不同的组合物进行测定：SA涂敷(“工艺”)、微粒 组(“甲苯磺酰基活化的PMP组”)、低投入比率的生物素化BSA组(“低投入比率的 生物素化BSA组”)、F108组(“嵌段共聚物F108组”)、以及SA 组(“SA组”)。在表8中，术语“工艺”指的是用低投入比率的生物素化BSA涂敷微 粒、用F108封闭微粒、在F108中分散微粒、以及将SA涂敷在生物素 -BSA微粒上；“操作者”是指，SA涂敷或称“工艺”由四个不同的操作员中的一个进行。
[00252]

[00253]使用五种单独的市售对照物(“Bio-Rad液体1”、“Bio-Rad液体2”、“Bio-Rad 1”、“Bio-Rad 2”、以及“Bio-Rad 3”；Bio-Rad实验室公司)和两个库存的病人血清样 本(“病人库1”和“病人库2”)以及三个个体样本(“试样1”、“样本2”、和“样 本3”)，采用Free T4测定(参见图12)进行11组验证，该进一步验证研究的结果显示 出较好的一致性，CV小于或等于约5％。相反，传统制备的微粒(例如，DYNABEADS M-280 SA微粒)的CV至少为约10％。
[00254]使用三组其中抗原被掺入血清的对照物(对照物A、B、以及C)和三个病人血 清对照物(QC病人1、2、3)，采用BPH-A标记进行10组验证，该进一步的验证研究 (参见图13)得到类似的发现结果。
[00255]SA涂覆工艺验证的结果显示，全部验证说明符合全部验证组。另外，结果表明， 根据本发明制备微粒的工艺与低程度的差异有关，是可再现的，并且是可靠的。
实施例7
不饱和的微粒增强的稳定性
[00256]通过T4在标准或样本中的回收率进行测量的加快的稳定性试验，在多组连接有 生物素化抗T4抗体的不饱和的涂敷了SA的微粒的验证中进行，测试条件为：在 Free T4测定(贝克曼考尔特公司)中使用Free T4标准，在4℃下和在 37℃下为期4天、以及在4℃下和在37℃下为期127天。结果如表9和图14A及图14B 所示。
[00257]

[00258]表9显示了不饱和的涂敷了SA的微粒在37℃下保温4天与在4℃下保温4天 相比较的验证组中的平均标准、对照物剂量、以及病人剂量回收率。由表9可见，所有组 中的平均回收率是或约为100％。
[00259]在图14A和14B中，回收率被表示为通过在37℃下127天后测定FT4而测量 的RLUs与通过在4℃下127天后测定FT4而测量的RLUs相比的百分数。标准水平是： S0＝0.0ng/mL、S1＝0.54ng/mL、S2＝1.01ng/mL、S3＝1.98ng/mL、S4＝3.00ng/mL、以 及S5＝6.11ng/mL。除标准外，测定的其他样本包括：Bio-Rad对照物1＝0.64ng/mL、 Bio-Rad对照物2＝2.18ng/mL、以及Bio-Rad对照物3＝4.19ng/mL(“Bio-Rad lypho”)； 五个单独的病人样本(“病人#”)，剂量分别为病人1＝1.02ng/mL、病人2＝1.12ng/mL、 病人3＝1.83ng/mL、病人4＝2.74ng/mL、以及病人5＝3.80ng/mL。总体上，回收率是或 约为100％，这表明，在升高的温度下延长时间期限的处理不会不利地影响不饱和微粒的 性能。为比较目的，对于使用市售涂敷了SA的微粒的Free T4测定(Free T4测定； 贝克曼考尔特公司)的说明被包含于图14A和14B中(“当前的FT4测定说明书”)。 该不饱和的微粒落入了市售Free T4测定说明书的范围内。
[00260]总体上，加快的稳定性测试确认，独立地生产的涂敷了SA的微粒批次是很稳定 的。研究没有发现在4℃下保温3天或在37℃下保温3天的验证组之间有显著的差异。 标准信号非常类似(标准回收率为99.1％至113.5％)，并且平均对照物和病人剂量回收率 全部为97.2％至102.9％。
[00261]当单一组在4℃或37℃下保温127天时，没有发现显著的性能差异。标准信号 非常类似(标准回收率为95.1％至109.6％)、曲率非常类似(％回收率为91.3％至105.1％)， 并且平均对照物和病人剂量回收率全部为93.7％至107.6％。
实施例8
不饱和的微粒的脱落分析
[00262]对根据本发明制备的不饱和的微粒进行脱落研究。在根据本发明制备的使用生物 素-BSA并且涂敷有SA的微粒(参见实施例11)中有大约8.7-14.0μg生物素-BSA/mg PMP、以及5.6-7.8μgSA/mg PMP。如果1％的蛋白质从10mg总的PMP中脱落，在溶液 中将有大约0.7-1.0μg的蛋白质。对于这样的涂敷了SA的微粒进行脱落分析。在HPLC (SEC-HPLC)上的筛析色谱法结果显示，在210nm处未检测到SA或BSA、或者脱落小 于1％。如果SA和/或生物素-BSA在溶液中是游离的，那么它们低于SEC-HPLC方法的检 测极限(参见图15A和15B)。在图15B中，γ球蛋白和卵清蛋白SEC标准峰值(峰高 1,400mAU)代表在210nm处的83.5μg总蛋白。5mAU的峰高(毫吸收单位)将代表0.3 μg的蛋白质。在210nm处的筛析HPLC分析表明，微粒在37℃下加压3天后，在溶液 中没有可检测到的生物素-BSA或SA分子(例如，没有蛋白质从微粒表面上脱落)。因此， 对于根据本发明制备的微粒，不存在脱落的问题。上述的稳定性数据支持SEC-HPLC SA 脱落分析的结果，因为测定信号、以及假定的生物素化的IgG结合性不受微粒在37℃下 加压127天的影响(图14A-B)。
实施例9
卵清蛋白的低投入比率的生物素化
[00263]用与生物素偶联的卵清蛋白代替与生物素偶联的BSA来制备根据本发明的微粒。 如同实施例1中对于BSA的描述，卵清蛋白被以不同的生物素对卵清蛋白的摩尔投入比率 (参见表10)用硫代-NHS-LC-生物素(硫代琥珀酰亚胺-6-[生物素酰氨基]己酸，Pierce 生物技术公司/Thermo Scientific公司)生物素化。简言之，如表10所示，通过如下步骤制 备四个单独的生物素化组：以不同的投入比率用硫代-NHS-LC-生物素对在硼酸盐缓冲液、 pH 8.2和DMF中的卵清蛋白(在1.253mL中20mg)进行生物素化。
[00264]

[00265]产生的生物素化百分数是：对于投入比率2为75.6％；对于投入比率4为83.3％； 对于投入比率6为85.1％；以及对于投入比率8为79.1％。对各个投入比率进行HABA(4′- 羟基偶氮苯-2-羧酸)分析。结果如表11所示。
[00266]

[00267]通过下述步骤完成4个单独的生物素化卵清蛋白的生物素化组的稳定性分析：在 37℃下，在pH 9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中用卵清蛋白-生物素涂敷25mg/mL甲苯磺酰 基活化的PMP(DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基活化，1.0微米直径，Invitrogen 公司)(0.050毫克卵清蛋白-生物素/每mg PMP)18～24小时；用pH 7.4的TBS洗涤微粒 三次；在37℃下，在TBS pH 7.4中，用0.4％(w/v)的F108封闭涂敷了卵清蛋 白-生物素的微粒表面4小时；用TBS pH 7.4洗涤微粒三次；将卵清蛋白-生物素微粒分散 在含有0.4％(w/v)F108的TBS pH 7.4中；在室温下，用在TBS pH 7.4中的SA 涂敷卵清蛋白-生物素微粒30分钟(0.035mg SA/每mg卵清蛋白-生物素PMP)；用含有 叠氮化钠(0.1％w/v)的TBS pH 7.4洗涤微粒三次；用对Free T4测定特异的微粒 缓冲液洗涤微粒三次；用对Free T4测定特异的微粒缓冲液将微粒从25mg/mL稀 释至0.35mg/mL；在4℃或37℃下将涂敷了卵清蛋白-生物素-SA的微粒保温3天；以 及在Free T4测定(贝克曼考尔特公司)中测试卵清蛋白-生物素-SA微粒结合生 物素化抗Free T4抗体的能力。通过计算单个的Free T4标准RLU回收率的平均值来确定 稳定性。该Free T4测定使用了具有0ng/ml至6ng/ml的抗原水平的6个不同的标 准(S0、S1、S2、S3、S4、以及S5)(参见表4)。通过用4℃下的标准RLU应答除以 37℃下标准RLU应答、并且乘以100％，计算出回收率。通过平均全部6个标准的回收 率，计算出稳定性。结果如表11所示。
[00268]稳定性是在4℃或37℃下保温固相3天之后SA结合力变化的指示。稳定性降 低起因于被动地结合的卵清蛋白或卵清蛋白试剂从卵清蛋白-BSA结合物上脱落或解离、 以及随后的游离生物素或生物素试剂随时间被SA捕获。
[00269]表11表明，通过使用在此描述的低投入比率的生物素化，可以有效地制备除BSA 之外的蛋白质比如卵清蛋白。卵清蛋白-生物素稳定性测试的结果非常类似于较早描述的生 物素-BSA稳定性结果(参见表1)。结果表明，以较高的摩尔投入比率(即，8∶1)制备 的卵清蛋白-生物素显示出降低的稳定性。随着生物素试剂对卵清蛋白的摩尔投入比率从 8∶1降低至2∶1，稳定性从82％提高到97％(参见表11)。
实施例10
在用于亲合分析的微粒表面上的生物素、SA、以及免疫球蛋白的密度
[00270]通过使用生物素作为配体、并且使用BSA作为支持物连接物，来制备根据本发 明的PMP。SA被用于结合作为捕获部分的生物素化IgG。
[00271]简言之，根据实施例1所述的程序(即，用根据实施例1的方案制备的低投入比 率的生物素-BSA涂敷PMP)，制备PMP(Invitrogen公司)。微粒根据本发明制 备并且根据本发明用低投入比率的生物素-BSA涂敷，然后用SA涂敷。此后，用生物素化 IgG处理涂敷了SA的PMP。使用了下述IgG：生物素化M06IgG，其为Mc xAccuTnl 单克隆抗体，在AccuTnl测定(贝克曼考尔特公司)中用作检测抗体(即，其被 结合于碱性磷酸酶)；以及生物素化399.4IgG，其为Mc x FPSA单克隆抗体，在Free PSA测定(贝克曼考尔特公司)中用作捕获抗体(即，其被涂敷到山羊抗生物素PMP上)。 用M06IgG或399.4IgG涂敷根据本发明制备的各组SA PMP，如同较早描述的那样，通 过使用125I-标记的生物素化IgG方法来评价各SA PMP组的生物素化IgG结合力。微粒的 描述和表面上组分的表面密度的结果列于表12中。
[00272]

[00273]表12中的数据可以被转化为摩尔数值，转换结果显示，在所示的实施例中约有 2.46×10-4(μmol生物素)/(mg PMP)(参见A)。对于直径约为1微米、表面面积为7.7×10-3 m2/(mg的PMP)的微粒，约有3.19×10-2(μmol生物素)/(m2PMP)。
[00274]除如上所述各组之外，根据本发明制备生物素化PMP，并且发现对于表面面积为 7.7m2/g的1.10微米PMP，其密度为15.1(μg生物素-BSA)/(mg PMP)。
[00275]除如上所述各组之外，以同样方式制备三个进一步验证的组。这些进一步的组如 表13所述。
[00276]

[00277]从表13中的以摩尔计的数据看，假定有约6.1(μg SA)/(mg PMP)，并且使用的 SA分子量为56kDa，则约有1.41×10-2(μmol SA)/(m2PMP)。因此，与表12中数据相比， 在微粒上SA的量似乎约为生物素量的一半。
实施例11
[00278]对于在如上所述实施例中制备的各组，计算BSA、生物素、SA、以及IgG的表 面密度。显示较好稳定性(13组)的表1中所示低投入的生物素化组被用于产生微粒的表 面密度。对于微粒、以及对于非微粒支持物(基于微粒数据)的实际表面密度计算值如图 16A和16B以及下表14所示。假定表面光滑，则对于微粒、以及对于非微粒支持物(基 于“光滑的”微粒的数据)的表面密度计算值如图16A、16C、16D以及下表15所示。
[00279]表面密度计算是以物理试验参数为基础的。简言之，在涂敷步骤后，通过上清液 分析，使用蛋白质浓度测定的BCA方法(BCA蛋白质测定[二辛可宁酸]；Pierce生物技术 公司/Thermo Scientific公司)和/或在280nm处的吸光度(对于BSA和SA)，测量在涂 敷步骤期间涂敷在表面上的BSA和SA的量。HABA分析被用于定量BSA上生物素的含 量。125I结合性被用于评价生物素-IgG的结合力。简言之，向TBS中的微粒提供已知量的 BSA，保温，并且将微粒从上清液中分离出来。测量上清液中残留的蛋白质，并且减去加 入的蛋白质量。洗涤微粒，并且分析洗液中的蛋白质含量。Tris-缓冲盐水pH 7.4被用于偶 联以及用于将抗体结合至微粒。基于下述进行计算：(a)微粒厂商提供的实际测量的表面 面积，和(b)基于微粒直径和光滑假设而计算的表面面积。
[00280]对于表14中所示的表面密度测量值，微粒表面面积(基于使用干固体重量的计 算)的范围为：最小7.4m2/g至最大8.4m2/g，中值7.7m2/g。
[00281]

[00282]从基于市售微粒(DYNABEADS MyOne甲苯磺酰基活化，1.0微米直径； Invitrogen公司)测量值的表14中可以看出，一旦配体(例如，生物素)是不饱和的，则 结合性表面上随后的层也将是不饱和的。在一个特定的实施方式中，1微米微粒表面面积 为约0.0077m2/mg，并且涂敷有显示的量的生物素化BSA、和结合有2.1×10-5μmol生物 素-IgG/每mg PMP的SA。
[00283]对于表15中显示的表面密度测量值，微粒表面面积(基于光滑性假设，微粒直 径为0.90至1.10μm，并且微粒密度为1.4至1.8g/cm3)的范围为：最小0.0030m2/mg至 最大0.0048m2/mg。
[00284]

[00285]表15假定表面光滑。从表15中可以再一次看出，一旦配体(例如，生物素)是 不饱和的，则结合性表面中随后的层也将是不饱和的。然而，与在没有光滑性假设的情况 下的表面密度计算值相比，由于光滑性假设，表面密度计算得到更大的μmol配体(生物 素)/每平方米、更大的μmol支持物连接物(BSA)/每平方米、更大的μmol配体结合剂 (SA)/每平方米、以及更大的μmol捕获部分(生物素-IgG)/每平方米(参见表14)。 表面密度的增大起因于如下事实：生物素、BSA、SA、或生物素-IgG的μmol/mg是恒定 的，但是具有光滑性假设的微粒表面的总表面积小于在没有光滑性矫正的情况下的微粒总 表面积。例如，如果两个微粒具有相同的直径和形状，但是一个微粒是多孔的，而另一个 为完美地光滑的微粒，则多孔的微粒与光滑微粒相比就具有更大的可利用的表面面积/每单 位质量(m2/mg)。如果这两种微粒都可以结合配体，并且它们两个都被提供相同含量的 配体，则多孔的微粒与光滑的微粒相比将会结合较少的配体/每平方米。