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一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法

阅读：1010发布：2021-02-09

专利汇可以提供一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法。抗肿瘤药物给药后，在机体内呈非特异性分布，毒副作用大，治疗指数低。采用纳米技术构建的具有主动靶向功能的药物载体—纳米粒，可有效解决这一问题。叶酸是常用的靶向分子，可引导药物主动靶向含叶酸受体的肿瘤细胞，提高药物抗肿瘤效果。本发明选用植物甾醇.海藻酸钠构建叶酸靶向的新型纳米粒植物甾醇-海藻酸钠纳米粒，将疏水性的抗肿瘤药物阿霉素包载在其疏水内核内，制备成载药的纳米粒，使海藻酸钠、植物甾醇成为抗肿瘤药物载体的新型材料，自组装的植物甾醇-海藻酸钠纳米粒作为抗肿瘤药物载体具有安全性、有效性和靶向性，为将来其作为一种新型药物载体应用于临床提供理论基础。，下面是一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种叶酸靶向的纳米粒，其特征在于，其为以植物甾醇作为疏水部分，海藻酸钠作为亲水部分，将叶酸偶联在纳米粒中构建的植物甾醇-海藻酸钠纳米粒。
2.如权利要求1所述叶酸靶向的纳米粒的用途，其特征在于，用作药物载体。
3.如权利要求2所述叶酸靶向的纳米粒的用途，其特征在于，作为抗肿瘤药物载体。
4.如权利要求1所述叶酸靶向的纳米粒的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将植物甾醇和海藻酸钠聚合成核壳式的结构；
（2）将叶酸偶联于其上，形成叶酸靶向的纳米粒。
5.如权利要求4所述叶酸靶向的纳米粒的合成方法，其特征在于，步骤（1）中通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将植物甾耦合在海藻酸钠分子上。
6.如权利要求4或5所述叶酸靶向的纳米粒的合成方法，其特征在于，步骤（2）中通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将叶酸耦合在聚合物分子上。
7.如权利要求6所述叶酸靶向的纳米粒的合成方法，其特征在于，自组装的纳米粒可在水介质中用探针声波降解法制备，形成粗糙的球形结构。
8.如权利要求1所述叶酸靶向的纳米粒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.利用傅里叶红外光谱学(FTIR)和荧光光谱学实验对其结构进行检测；
b.用透析法制备包载阿霉素的纳米粒，用透射电镜对纳米粒的粒径和形态进行检测；
c.进行纳米粒临界聚集浓度的测定；
d.进行阿霉素载药、释药实验；
e.在体外进行细胞摄取和毒性检测以及叶酸竞争实验；
f.进行体内外抗肿瘤效应检测。
9.如权利要求8所述叶酸靶向的纳米粒的检测方法，其特征在于，步骤a中，纳米粒子和海藻酸钠的红外光谱学检测（FTIR）采用KBr压片法测定纳米粒子和壳聚糖样品的红外光谱；纳米粒子的荧光光谱学检测采用芘作为疏水探针，采用荧光光谱学检测纳米粒子的自聚合行为，检测其临界聚集浓度。
10.如权利要求8或9所述叶酸靶向的纳米粒的检测方法，其特征在于，步骤b中将制备得到的纳米粒溶液滴于载有碳膜的铜网上,用滤纸吸干表面液体,用2%的磷钨酸(pH6.0)负染,室温下自然干燥后在透射电镜下对纳米粒的形态进行观察。

说明书全文

一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术，具体涉及一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法。

背景技术

[0002] 抗肿瘤药物给药后，在机体内呈非特异性分布，毒副作用大，治疗指数低。采用纳米技术构建的具有主动靶向功能的药物载体—纳米粒，可有效解决这一问题。叶酸是常用的靶向分子，可引导药物主动靶向含叶酸受体的肿瘤细胞，提高药物抗肿瘤效果。本发明选用植物甾醇.海藻酸钠构建叶酸靶向的新型纳米粒植物甾醇-海藻酸钠纳米粒，将疏水性的抗肿瘤药物阿霉素包载在其疏水内核内，制备成载药的纳米粒，使海藻酸钠、植物甾醇成为抗肿瘤药物载体的新型材料，自组装的植物甾醇-海藻酸钠纳米粒作为抗肿瘤药物载体具有安全性、有效性和靶向性，为将来其作为一种新型药物载体应用于临床提供理论基础。主动靶向优于被动靶向给药系统，它是经过特殊和周密的生物识别设计，将药物导向至特异性的识别靶区，实现到达预定目标的靶向给药。叶酸是人体必需的维生素,也是主动靶向常用的靶向分子。叶酸受体介导的抗肿瘤药物载体是利用肿瘤细胞和正常细胞表面FR表达的差异性，特异性结合肿瘤细胞表面高表达的FR，来实现叶酸结合物的靶向传递，从而减少药物治疗癌症时对正常细胞的损害。叶酸具有与FR的高亲和力、低免疫原性、易于修饰、体积小、高度化学稳定性和生物学稳定性、高的肿瘤渗透性以及低成本等优点，因此叶酸介导肿瘤靶向的研究得到迅速发展，成为对肿瘤有高度选择性的新一代靶向剂。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种叶酸靶向的纳米粒，其用途以及合成和检测方法，以植物甾醇作为疏水部分，海藻酸钠作为亲水部分，构建新型两亲性的抗肿瘤药物载体——植物甾醇-海藻酸钠纳米粒，同时将叶酸偶联在纳米粒中，使其具有叶酸靶向的特性，并对其作为药物载体的可行性进行研究。研究中将植物甾醇和海藻酸钠聚合成核壳式的结构，并将叶酸偶联于其上，制备靶向叶酸的纳米粒。利用傅里叶红外光谱学(FTIR)和荧光光谱学实验对其结构进行检测，用透析法制备包载阿霉素的纳米粒，用透射电镜对纳米粒的粒径和形态进行检测，并进行纳米粒临界聚集浓度的测定以及阿霉素载药、释药实验。在体外进行细胞摄取和毒性检测以及叶酸竞争实验，最后进行体内外抗肿瘤效应检测。

[0004] 具体技术方案如下：

[0005] 一种叶酸靶向的纳米粒，其为以植物甾醇作为疏水部分，海藻酸钠作为亲水部分，将叶酸偶联在纳米粒中构建的植物甾醇-海藻酸钠纳米粒。

[0006] 上述叶酸靶向的纳米粒的用途，进一步地，用作药物载体。

[0007] 进一步地，作为抗肿瘤药物载体。

[0008] 上述叶酸靶向的纳米粒的合成方法，包括如下步骤：

[0009] （1）将植物甾醇和海藻酸钠聚合成核壳式的结构；

[0010] （2）将叶酸偶联于其上，形成叶酸靶向的纳米粒。

[0011] 进一步地，步骤（1）中通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将植物甾耦合在海藻酸钠分子上。

[0012] 进一步地，步骤（2）中通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将叶酸耦合在聚合物分子上。

[0013] 进一步地，自组装的纳米粒可在水介质中用探针声波降解法制备，形成粗糙的球形结构。

[0014] 上述叶酸靶向的纳米粒的检测方法，包括如下步骤：

[0015] a.利用傅里叶红外光谱学(FTIR)和荧光光谱学实验对其结构进行检测；

[0016] b.用透析法制备包载阿霉素的纳米粒，用透射电镜对纳米粒的粒径和形态进行检测；

[0017] c.进行纳米粒临界聚集浓度的测定；

[0018] d.进行阿霉素载药、释药实验；

[0019] e.在体外进行细胞摄取和毒性检测以及叶酸竞争实验；

[0020] f.进行体内外抗肿瘤效应检测。

[0021] 进一步地，步骤a中，纳米粒子和海藻酸钠的红外光谱学检测（FTIR）采用KBr压片法测定纳米粒子和壳聚糖样品的红外光谱；纳米粒子的荧光光谱学检测采用芘作为疏水探针，采用荧光光谱学检测纳米粒子的自聚合行为，检测其临界聚集浓度。

[0022] 进一步地，步骤b中将制备得到的纳米粒溶液滴于载有碳膜的铜网上,用滤纸吸干表面液体,用2%的磷钨酸(pH6.0)负染,室温下自然干燥后在透射电镜下对纳米粒的形态进行观察。

[0023] 与目前现有技术相比，本发明含有叶酸的抗肿瘤药物载体可通过设计自组装的纳米粒来实现。纳米技术在药物输送系统中的应用，将有助于克服化疗过程中的靶向问题，这种应用也将成为今后制药工业和生物技术工业发展的重点方向。为达到叶酸靶向的目的，在制备过程中，可采用偶联剂将叶酸与纳米粒进行偶联，制备成具有叶酸靶向的纳米粒。在制备纳米粒时可通过加入海藻酸钠和植物甾醇来合成，构建叶酸靶向的新型两亲性壳聚糖纳米粒——植物甾醇--海藻酸钠，将疏水性的抗肿瘤药物阿霉素包载在其疏水内核内，制备成载药的纳米粒，探讨海藻酸钠、植物甾醇能否成为抗肿瘤药物载体的新型材料，评价自组装的纳米粒作为抗肿瘤药物载体的安全性、有效性和靶向性，为将来其作为一种新型药物载体应用于临床提供理论基础。

[0024] 具体来说：

[0025] 1、纳米粒的结构中偶联有叶酸，可与肿瘤细胞表面的叶酸受体相识别，将阿霉素靶向运输至肿瘤细胞，达到良好的治疗效果。已通过叶酸竞争实验得到证实。

[0026] 2、纳米粒结构中的植物甾醇等具有很好的生物相容性、生物降解能力、无毒性和低免疫原性等特征，大大提高了纳米粒的生物安全性。

[0027] 3、纳米粒结构的设计的壳-核结构在水溶液中很稳定，且临界聚集浓度很低，这为将来这种纳米粒应用于疏水药物的运输载体提供了必要的保证。

[0028] 4、纳米粒具有较高的EE比例，减少了药物的浪费和载体系统使用的限制。

[0029] 5、纳米粒在偏酸性的肿瘤组织中具有较高的释药性能，叶酸受体过表达的肿瘤细胞药物摄取率高，取得了较好的靶向肿瘤治疗效果。

[0030] 6、载药的纳米粒对叶酸受体过表达的口腔上皮癌KB细胞和叶酸受体失表达的肺癌A549细胞中具有不同的毒性作用。在叶酸受体过表达的细胞中具有更好的抗肿瘤作用。

[0031] 7、载药的纳米粒经检测可在体内外发挥较好的抗肿瘤效应。

具体实施方式

[0032] 下面为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

[0033] 1、植物甾醇-海藻酸钠的合成：通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将植物甾耦合在海藻酸钠分子上。

[0034] 2、叶酸靶向的自组装纳米粒的制备：先通过二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）介导的酯化反应将叶酸耦合在聚合物分子上。方法同上。自组装的纳米粒可在水介质中用探针声波降解法制备，形成粗糙的球形结构。

[0035] 3、纳米粒子和海藻酸钠的红外光谱学检测（FTIR）:采用KBr压片法测定纳米粒子和壳聚糖样品的红外光谱。

[0036] 4、纳米粒子的荧光光谱学检测：采用芘作为疏水探针，采用荧光光谱学检测纳米粒子的自聚合行为，检测其临界聚集浓度（criticalaggregationconcentration，CAC）。CAC水平出现在两条直线的交叉点。

[0037] 5、透射电镜检测纳米粒的大小及形态：将制备得到的纳米粒溶液滴于载有碳膜的铜网上,用滤纸吸干表面液体,用2%的磷钨酸(pH6.0)负染,室温下自然干燥后在透射电镜下对纳米粒的形态进行观察。

[0038] 6、纳米粒对DOX的包载：采用透析的方法进行包载。

[0039] 7、DOX载药量及包封率检测：为评价DOX的载药量和包封率，采用紫外分光光度计在进行检测并采用空白纳米粒的上清液作为对照。

[0040] 8、药物释放实验：通过透析的方法检测载药纳米粒的DOX释放性能。

[0041] 9、细胞摄取实验：以异硫氰基荧光素(FITC)为标记,采用激光共聚焦显微镜观察叶酸受体过表达的口腔上皮癌KB细胞和叶酸受体失表达的肺癌A549细胞对载药纳米粒的摄取情况。

[0042] 10、肿瘤细胞培养：选择叶酸受体过表达的口腔上皮癌KB细胞和叶酸受体缺失的肺癌A549细胞进行体外培养后倒置显微镜下观察细胞生长状况。

[0043] 11、MTT比色法检测细胞毒性：取对数生长期细胞，调整浓度为1×104/ml，接种于96孔板。药物作用24、48、72h后取出培养板，每孔加入MTT(5g/L)20μl,37℃继续培养4h后，离心弃上清，加DMSO150μl,震荡后酶标仪570nm下测定各孔的吸光度A，按下式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(A对照–A实验)/A对照×100%

[0044] 12、叶酸竞争抑制实验：将特定浓度的载药纳米粒加入含有不同浓度（0-500mg/L）的游离叶酸的培养基，与两种类型的肿瘤细胞共培养，通过MTT法检测细胞毒性。

[0045] 13、体内抗肿瘤效果检测：利用建立的荷瘤小鼠模型,研究载药纳米粒的体内抑瘤效果。检测载药纳米粒注入动物体内对小鼠肿瘤大小、质量、组织学等的影响。同时以健康小鼠为模型观察载药纳米粒在正常小鼠体内的组织分布情况。

[0046] 采用天然植物甾醇和海藻酸钠合成纳米粒子，探讨天然产物植物甾醇、海藻酸钠

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