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具有一个氨基的聚乙二醇的纯化方法

阅读：847发布：2020-05-12

专利汇可以提供具有一个氨基的聚乙二醇的纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化方法，其在工业规模上具有良好的效率和纯度，并且不产生诸如吸附剂和离子交换树脂的废料。制备聚乙二醇的水溶液，该水溶液的pH为1～5。在10℃以上并且不高于55℃将该水溶液与混合有机溶剂混合在一起，引起分层为有机层和水性层。混合有机溶剂中有机溶剂I的比例为25～65 质量％并且有机溶剂II的比例为75～35质量％。有机溶剂I选自总碳数为8以下的芳烃系溶剂和不包含杂原子并且总碳数为5以下的酯类化合物溶剂，并且有机溶剂II为卤代烃系溶剂。有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)Y、温度 T(℃)和聚乙二醇化合物的分子量M满足以下关系。，下面是具有一个氨基的聚乙二醇的纯化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有一个氨基并且其分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为20～2300的聚乙二醇化合物的纯化方法，
该方法包括以下步骤(A)、(B)和(C)：
(A)制备所述具有一个氨基的聚乙二醇化合物的水溶液的步骤，该溶液的pH为1～5，(B)在10℃以上且55℃以下的温度下将在所述步骤(A)中获得的所述水溶液与混合有机溶剂相混合并引起分层为有机层和水性层的萃取步骤，其中，所述混合有机溶剂中有机溶剂I的比例为25～65质量％并且有机溶剂II的比例为75～35质量％，所述有机溶剂I选自总碳数为8以下的芳烃系溶剂和不包含杂原子并且总碳数为5以下的酯类化合物溶剂，所述有机溶剂II为卤代烃系溶剂，并且所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)Y、所述混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的分子量M满足以下关系：
-6 -6
1.9×10 M+0.09≤Y-0.015T≤-1.4×10 M+0.44，以及
(C)从所述水性层回收所述聚乙二醇化合物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)Y、所述混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的分子量M满足以下关系：
1.0×10-6M+0.19≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对在所述步骤(B)中分离的所述水性层进行一次以上的所述萃取步骤(B)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(A)中，所述水溶液含有选自由盐酸、磷酸和和三氟乙酸所组成的组中的酸性试剂。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述有机溶剂I选自由甲苯和乙酸乙酯所组成的组。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述有机溶剂II为氯仿。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(B)中的所述有机溶剂I的质量和所述有机溶剂II的质量各自为所述聚乙二醇化合物的质量的1～50倍，并且所述步骤(A)中的所述水溶液中所含的水的质量为所述聚乙二醇化合物的质量的1～50倍。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(C)中，在使所述水性层成为中性或碱性之后，经萃取至有机层中，通过浓缩、结晶或干燥来回收所述聚乙二醇。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，加成在所述聚乙二醇化合物分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为40～2050。

说明书全文

具有一个氨基的聚乙二醇的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化方法，该化合物用于药物用途。更具体地，本发明是用于获得高纯的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化方法，该聚乙二醇化合物是用于在药物递释系统中的化学改性用途的高分子量的活化的聚乙二醇并且用作其原材料。

[0002] 本发明特别适合于包括多肽、酶、抗体和其他低分子药物、包括基因、寡核苷酸等的核酸化合物、核酸药物、以及其他生理活性物质的改性或诸如脂质体、聚合物胶束和纳米粒子的药物递释系统载体的应用的药物用途。

背景技术

[0003] 最近，活化的聚乙二醇已经被广泛用作药物递释系统的重要载体。作为用于药物用途目的的此类活化聚乙二醇，从通过对其改性而制造的药物的性质和安全的角度，已经要求那些活化聚乙二醇仅含极少杂质。具有氨基的聚乙二醇自身就是药物的改性剂，并且也是用于合成其他活化聚乙二醇的原材料。当具有一个氨基的聚乙二醇中含有不具有氨基的聚乙二醇作为杂质时，在使用其作为原材料合成活化聚乙二醇的情况下，不能合成高纯的具有一个氨基的活化聚乙二醇。因此，当产物键合至药物时改性率降低，并且存在不能获得期望的效果的可能性。由于作为杂质的不具有氨基的聚乙二醇化合物和具有一个氨基的聚乙二醇是高分子量化合物，所以物理化学性质是相似的，使得难以通过普通技术相互分离。

[0004] 另一方面，键合至聚乙二醇后的药物纯化也存在其分离困难的技术问题。在进行纯化的情况下，药物收率显著降低，并因此制作成本上升。因此，希望尽可能地在键合至药物之前除去作为杂质的聚乙二醇化合物。

[0005] 通常，在从大分子化合物除去诸如低分子化合物和盐的杂质的情况下，经常执行结晶操作和萃取操作。在要除去的杂质是低分子的情况下，取决于分子量的巨大差异，物理化学性质显著不同，并且特别是，由于产生溶解性方面的巨大差异，所以使分离和纯化成为可能。另一方面，在杂质的分子量大的情况下，在诸如溶解性的物理化学性质方面不会出现巨大差异。因此，难以通过用于除去低分子杂质的普通操作从具有一个氨基的聚乙二醇化合物中分离并除去不具有氨基的聚乙二醇化合物。

[0006] 另一方面，关于具有氨基的低分子量化合物，当其在低pH下质子化时，由于离子相互作用而使亲水性增强。因此，在杂质的亲水性低的情况下，使用适合的有机溶剂通过萃取操作能够将杂质萃取至有机层以将其除去。然而，由于聚乙二醇化合物自身具有强亲水性，所以难以利用水性层和单一疏水有机层通过萃取将具有一个氨基的聚乙二醇化合物作为杂质的不具有氨基的聚乙二醇化合物分离。另一方面，当使用诸如作为聚乙二醇化合物的良好溶剂的卤代烃的有机溶剂时，聚乙二醇化合物无视氨基的存在而被萃取至有机层，使得也不可能分离和纯化。

[0007] 此处，描述了传统技术的性能特征并描述了通过传统技术纯化具有一个氨基的聚乙二醇化合物是否可能和传统技术是否能够在工业规模中进行。

[0008] 作为一种方法，如专利文献1(JP-A-8-165343)中所示，在具有氨基的聚乙二醇的情况下，能够使用离子交换树脂通过层析来分离。然而，由于这样的使用离子交换树脂的纯化方法是主要利用固体表面的相互作用及吸附现象的方法，所以必须在稀释溶液条件下使用大量树脂来执行纯化处理。由于必须在步骤中的聚乙二醇化合物的浓度为约1～2％的这样的稀释下进行该步骤，以抑制分离能力的降低，使得该方法从工业生产率的角度来讲不是充分令人满意的。而且，最后，排放大量的离子交换树脂的废料，因此该方法也是在工业应用中存在问题的纯化方法。

[0009] 另一方面，如专利文献2(JP-A-2010-254978)中所示，存在使作为杂质的聚乙二醇化合物物理吸附在吸附剂上并除去的方法。当使用适合的吸附剂时，优先吸附作为杂质的具有两个羟基的聚乙二醇杂质，但是并未描述能够根据氨基的存在与否选择性地除去杂质。此外，在于工业规模中执行该方法的情况下，存在吸附处理之后大量的过滤掉的吸附剂成为废料的问题。

[0010] 另一方面，如专利文献3(JP-A-2010-254981)中所示，存在将高分子量聚乙二醇与有机溶剂在水中混合，以分馏并除去具有不同分子量的杂质的方法。通过控制水溶性的盐浓度和萃取温度使除去具有不同分子量的杂质变为可能。由于该方法是简单方法，所以该方法能够在工业规模中进行，并且存在不排放诸如吸附剂的废料的巨大优势。然而，通过该方法，不能根据氨基的存在与否来将具有相同分子量的聚乙二醇化合物彼此分离。

[0011] 另一方面，如专利文献4(US2009/000834)中所示，存在分离在结构中具有两个叔胺的低分子化合物与具有一个叔胺的低分子化合物的方法。利用酸将具有叔胺的低分子化合物的水溶液调节至pH4，以使胺基质子化。当将乙酸乙酯与其混合以引起分层时，能够将具有一个叔胺的目标低分子化合物选择性地萃取至乙酸乙酯层。而且，如专利文献5(WO2006/057778)中所示，存在将作为仲胺的甲基苯丙胺与作为叔胺的甲基苯异丙基苄胺分离的方法。将甲基苯异丙基苄胺的粗纯化产品溶解在水中并用酸将该溶液调节至pH6，以使氨基质子化。当将甲苯与其混合以引起分层时，能够将目标甲基苯异丙基苄胺选择性地萃取至甲苯层。在两种方法中，通过利用酸将水溶液调节至适当的pH，使得能够将目标物质与杂质的分离。这些方法包括相对简单的步骤并几乎不排放废料，因此即使在工业规模中这些方法也能充分应用。然而，由于聚乙二醇化合物具有高亲水性，所以无论氨基的存在与否，都不能利用在上述体系中使用的乙酸乙酯或甲苯来将化合物萃取至有机层。另一方面，在使用诸如在卤代烃系有机溶剂的有机溶剂时，即使当降低pH以使氨基质子化并因此增强亲水性时，具有一个氨基的聚乙二醇化合物和不具有氨基的聚乙二醇化合物二者均被萃取至有机层中，使得无法实现选择性。因此，不能通过应用这些方法获得萃取纯化。

[0012] 用于药物用途的具有一个氨基的聚乙二醇化合物均包含在制造过程中形成的聚乙二醇杂质。这些杂质是具有与目标物质的分子量大约相同的分子量的聚乙二醇化合物，因此这些杂质的去除包括许多问题。

[0013] 现有技术文献

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1：JP-A-8-165343

[0016] 专利文献2：JP-A-2010-254978

[0017] 专利文献3：JP-A-2010-254981

[0018] 专利文献4：US2009/000834

[0019] 专利文献5：WO2006/057778

[0020] 专利文献6：JP-A-2004-197077

[0021] 专利文献7：JP-T-9-504299(本文中使用的术语“JP-T”表示PCT专利申请的公布的日译文)

发明内容

[0022] 本发明要解决的技术问题

[0023] 本发明的目的是提供一种工业实用的纯化方法，该方法能够以良好的效率和纯度纯化具有一个氨基的聚乙二醇化合物，并且不排放诸如任何吸附剂和任何离子交换树脂的任何废料。

[0024] 解决问题的技术方案

[0025] 作为为了解决上述问题而深入研究的结果，本发明人已经发现了通过在特定温度范围内、在由以一定比例混合的两种以上有机溶剂和酸性水溶液所组成的体系中执行萃取操作来纯化具有一个氨基的聚乙二醇化合物的方法。本发明的特征在于其能够通过将特定芳烃溶剂或酯类化合物溶剂与卤代烃系溶剂的混合比例和萃取温度控制在适当范围内来实现，并且该方法即使在不使用大量诸如树脂或凝胶的载体(support)/吸附剂、和超滤膜等的情况下也能够实施，并且因此是工业上可以实用的。

[0026] 即，本发明如下。

[0027] (1)一种用于纯化具有一个氨基并且加成在其分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为20～2300的聚乙二醇化合物的方法，

[0028] 该方法包括以下步骤(A)、(B)和(C)：

[0029] (A)制备具有一个氨基的聚乙二醇化合物的水溶液的步骤，该溶液的pH为1～5，[0030] (B)在10℃以上且55℃以下的温度下将在步骤(A)中获得的水溶液与混合的有机溶剂混合并引起分层为有机层和水性层的萃取步骤，其中，混合有机溶剂中有机溶剂I的比例为25～65质量％并且有机溶剂II的比例为75～35质量％，有机溶剂I选自总碳数为8以下的芳烃系溶剂和不包含杂原子并且总碳数为5以下的酯类化合物溶剂，有机溶剂II为卤代烃系溶剂，并且有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)Y、混合时的温度T(℃)和聚乙二醇化合物的分子量M满足以下关系：

[0031] 1.9×10-6M+0.09≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44

[0032] ，以及

[0033] (C)从水性层回收聚乙二醇化合物的步骤。

[0034] (2)在步骤(B)中，有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)Y、混合时的温度T(℃)和聚乙二醇化合物的分子量M满足以下关系：

[0035] 1.0×10-6M+0.19≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44。

[0036] (3)根据(1)或(2)的方法，其中，对在步骤(B)中分离的水性层进行一次以上的萃取步骤(B)。

[0037] (4)根据(1)至(3)任意一项的方法，其中，在步骤(A)中，水溶液含有选自由盐酸、磷酸和和三氟乙酸所组成的组中的酸性试剂。

[0038] (5)根据(1)至(4)任意一项的方法，其中，有机溶剂I选自由甲苯和乙酸乙酯所组成的组。

[0039] (6)根据(1)至(5)任意一项的方法，其中，有机溶剂II为氯仿。

[0040] (7)根据(1)至(6)任意一项的方法，其中，步骤(B)中的有机溶剂I的质量和有机溶剂II的质量各自为聚乙二醇化合物的质量的1～50倍，并且步骤(A)中的水溶液中所含的水的质量为聚乙二醇化合物的质量的1～50倍。

[0041] (8)根据(1)至(7)任意一项的方法，其中，在步骤(C)中，在使水性层为中性或碱性之后，经萃取至有机层中，通过浓缩、结晶或干燥来回收聚乙二醇。

[0042] (9)根据(1)至(8)任意一项的方法，其中，加成在聚乙二醇化合物分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为为40～2050。

[0043] 本发明的优点

[0044] 本发明涉及一种用于获得用于药物用途目的的高纯的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的新颖纯化方法。在该纯化方法中，利用聚乙二醇固有的溶解度能够将不具有氨基的聚乙二醇与目标物质分离。此外，还能够分离具有与目标物质的分子量大约相同的分子量并且不具有氨基的、通过传统技术难以分离的聚乙二醇。此外，该方法是容易工业实践的、生产率优异、并且能够利用不形成诸如吸附剂或离子交换树脂的废料的步骤以高收率执行。附图说明

[0045] 图1是示出聚乙二醇的分子量为5000的情况下溶剂混合比例Y与萃取温度T之间的关系的曲线图。

[0046] 图2是示出聚乙二醇的分子量为60000的情况下溶剂混合比例Y与萃取温度T之间的关系的曲线图。

[0047] 图3是示出聚乙二醇的分子量M与溶剂混合比例Y的截距之间的关系的曲线图。

[0048] 图4是示出聚乙二醇的溶剂混合比例Y与萃取温度T之间的关系的曲线图，并且是示出萃取处理可行的范围的曲线图。

[0049] 图5示出在实施例1的萃取纯化中使用的原材料的HPLC色谱图。

[0050] 图6示出在实施例1中获得的纯化原产品的HPLC色谱图。

具体实施方式

[0051] 本发明的具有一个氨基的聚乙二醇化合物是指在聚乙二醇分子中具有一个能够与另一个分子反应的氨基的化合物。

[0052] 加成在本发明的具有一个氨基的聚乙二醇化合物分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为20以上，优选为40以上，更优选为110以上。此外，加成在本聚乙二醇化合物分子中的环氧乙烷单元的总平均摩尔数为2300以下，优选为2050以下，更优选为1850以下，进一步优选为1350以下。

[0053] 本发明的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的分子量为1000以上，优选为2000以上，更优选为5000以上。此外，聚乙二醇化合物的分子量为106060以下，优选为104167以下，更优选为90000以下，但是进一步优选为80000以下，最优选为60000以下。

[0054] 本发明的具有一个氨基的高分子量聚乙二醇化合物具有线性或分枝结构。分枝结构优选为甘油骨架、季戊四醇骨架或木糖醇骨架，更优选为甘油骨架。例如，如专利文献6(JP-A-2004-197077)中所述的通过环氧乙烷聚合的步骤和随后的活化步骤由具有羟基的单羟基或多羟基初始材料获得这些化合物，或者如专利文献7(JP-T-9-504299)中所述的通过两个以上线性聚乙二醇的偶联反应和活化步骤来典型地获得这些化合物。

[0055] 能够在本发明中被纯化的聚乙二醇化合物是在结构中只具有一个氨基的聚乙二醇化合物。氨基不限于键合至碳原子的氨基，并且包括氨基键合至氧原子的羟亚胺基和氨基键合至氮原子的肼基等。除了氨基之外的键合至聚乙二醇链末端的官能团为具有1～7个碳原子的烃基、不会被酸离子化的官能团或官能团的保护基团。之外，具有1～7碳原子的烃基，可以提及诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基和异庚基的烷基、苯基和苄基等。烃基优选为甲基、乙基、叔丁基和苄基，更优选为甲基。不会被酸离子化的官能团优选为羧基、羟基、硫醇基、乙酰基和叠氮基，更优选为羟基。官能团的保护基团优选为氨基、羧基、羟基、硫醇基、肼基、酰肼基或羟亚氨基的保护基团，更优选为羟基的保护基团。

[0056] (步骤(A))

[0057] 作为本发明使用的酸性水溶液，使用无机酸或有机酸的水溶液。此处，对无机酸和有机酸没有特别限制，但通常来讲，可以提及盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸、甲磺酸和柠檬酸等。优选地，酸为盐酸、磷酸或三氟乙酸，更优选为磷酸。

[0058] 由于pH高时氨基的质子化不充分并且因此不能增强亲水性，而当pH太低时会发生聚乙二醇化合物的分解，所以将酸性水溶液的pH控制在1～5，更优选为1～3。

[0059] (步骤(B))

[0060] 该步骤是通过搅拌或震动将有机溶剂与包含溶解在其中的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的酸性水溶液混合并且通过将混合物静置一定时间段而使分层为有机层和水性层的步骤。在萃取步骤中，由于当化合物以预先溶解在有机溶剂中的状态与酸性溶液混合时的乳化，导致杂质的分离和目标物质的回收变得不可能的可能性高，所以优选地将具有一个氨基的高分子量聚乙二醇化合物预先溶解在酸性溶液中。

[0061] 该步骤中的混合和分层的时间没有特别限制，但优选为在1分钟至12小时之间，更优选为10分钟至3小时。此外，对执行萃取操作的气氛没有特别限制，但出于使氧化最小化的目的，操作优选地在诸如氮气的惰性气体的存在下执行。此外，对装置也没有特别限制，但是，考虑到在氮气下并且在密封状态下操作以减少氧化降解的发生，也可以在压力容器中执行操作。

[0062] 在本发明的萃取操作中使用的有机溶剂I是总碳数为8以下的芳烃系溶剂和/或总碳数为5以下的酯类化合物溶剂，并且优选为二甲苯、甲苯、苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丁酯，更优选为甲苯或乙酸乙酯，最优选为甲苯。

[0063] 本发明的萃取操作中使用的有机溶剂II是卤代烃系溶剂，并且优选为二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，更优选为二氯甲烷或氯仿，最优选为氯仿。

[0064] 本发明中使用的普通聚乙二醇化合物表现出特征的溶解度，该溶解度如下所示：有机溶剂II＞水＞有机溶剂I。另一方面，具有质子化的氨基的聚乙二醇化合物的亲水性高于不具有氨基的聚乙二醇化合物的亲水性。因此，当使用将适量的有机溶剂II与有机溶剂I混合的有机溶剂时，具有氨基的聚乙二醇化合物的溶解度变得如下所示：水＞(有机溶剂I+有机溶剂II)，并且不具有氨基的聚乙二醇化合物的溶解度变得如下所示：(有机溶剂I+有机溶剂II)＞水。即，由于具有氨基的聚乙二醇化合物分布在水性层中而不具有氨基的聚乙二醇化合物分布在有机层中，所以能够选择性地执行分离和纯化。

[0065] 在本发明的萃取操作中使用的有机溶剂是混合比例为有机溶剂I：25～65质量％并且有机溶剂II：75～35质量％的混合溶液。由于有机溶剂I的比重小于1而有机溶剂II的比重大于1，所以当有机溶剂I的比例增加时，混合溶剂的比重接近水溶液的比重，并且因此分层能力倾向于变差。因此，混合溶液优选为混合比例为有机溶剂I：25～50质量％并且有机溶剂II：75～50质量％的混合溶液。

[0066] 如以下实施例中所示，当将有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)取作Y，将步骤(B)中的温度取作T(℃)，并且将聚乙二醇化合物的分子量取作M时，能够在满足以下关系的范围内进行纯化。从而，本发明首次成功地提供了一种能够工业化分离高纯的上述聚乙二醇化合物的纯化方法。

[0067] 1.9×10-6M+0.09≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44

[0068] 有机溶剂I的质量和有机溶剂II的质量各自优选为聚乙二醇化合物的质量的1～50倍，并且水的质量优选为聚乙二醇化合物的质量的1～50倍。更优选地，有机溶剂I的质量和有机溶剂II的质量各自优选为聚乙二醇化合物的质量的2～20倍，并且水的质量优选为聚乙二醇化合物的质量的2～20倍。特别优选地，有机溶剂I的质量和有机溶剂II的质量各自优选为聚乙二醇化合物的质量的5～20倍，并且水的质量优选为聚乙二醇化合物的质量的5～20倍。

[0069] 由于当温度变高时迁移至有机溶剂的聚乙二醇的量增加，所以将执行萃取操作的温度控制在55℃以下，温度更优选为45℃以下，并且进一步优选为35℃以下。此外，将执行萃取操作的温度控制在10℃以上，更优选为15℃以上，并且进一步优选为20℃以上。

[0070] (步骤(C))

[0071] 本发明的萃取步骤之后的回收步骤(C)包括从水性层回收具有一个氨基的聚乙二醇化合物的方法。

[0072] 利用碱将含有具有一个氨基的聚乙二醇化合物的酸性水溶液变为中性或碱性。随后，通过萃取至有机层中，通过包括浓缩、结晶和干燥等的任意一种的步骤回收具有一个氨基的聚乙二醇化合物。

[0073] 实施例

[0074] 以下将参考实施例更加详细的描述本发明。

[0075] 实施例中待分离并除去的不具有氨基的聚乙二醇杂质是具有与具有一个氨基的聚乙二醇化合物的分子量大约相同的分子量的杂质。顺便提及，使用GPC和HPLC用于聚乙二醇化合物的分析。实施例中所述的胺收率表示(纯化后的质量(g)×纯化后的胺纯度(％))÷(原材料的质量(g)×原材料的胺纯度(％))×100。

[0076] 使用LC-10Avp(Shimadzu)作为GPC系统在以下条件下测量原材料的分子量。

[0077] GPC装置：LC-10Avp(Shimadzu)

[0078] 展开液(Developing liquid)：DMF(10mM LiBr)

[0079] 流速：0.7mL/min

[0080] 色谱柱：PL gel MIXED-D(Polymer Laboratory)

[0081] 柱温：65℃

[0082] 检测器：RI

[0083] 样品浓度(注射量)：30mg/30mL(100μL)

[0084] 制作作为聚乙二醇化合物的标准物的校准曲线。

[0085]

[0086] [氨基的情况]

[0087] 通过将50mg具有氨基的聚乙二醇化合物溶解在10g作为在HPLC测量中使用的洗脱液的磷酸钠缓冲液中，来制备测量样品。在以下条件下进行HPLC测量。

[0088] HPLC装置：alliance(Waters)

[0089] 色谱柱：阳离子交换柱TSK-gel SP-5PW(Tosoh)

[0090] 流速：0.5mL/分钟

[0091] 分析时间：20分钟

[0092] 柱温：40℃

[0093] 注射量：20μL

[0094] 检测器：RI

[0095] 移动相：磷酸钠缓冲液(pH 6.5)

[0096] [羟亚氨基的情况]

[0097] 将20mg具有羟亚氨基的聚乙二醇化合物溶解在2mL的0.1M乙酸酯缓冲液中。然后，向其添加68μL对苯二甲醛的甲醇溶液(45mg/mL)和128μL氰基硼氢化钠水溶液(10mg/mL)并溶解，随后搅拌并在75℃下反应3小时。将全部量的反应溶液添加至使用作为HPLC测量中使用的洗脱液的甲酸铵缓冲液(pH 8.0)平衡的凝胶渗透柱(PD-10(Amersham Bioscience))，进一步添加洗脱液，并且将率先洗脱出的高分子量物质馏分收集在用于HPLC测量的小瓶中。在以下条件下进行HPLC测量。

[0098] HPLC装置：alliance(Waters)

[0099] 色谱柱：阴离子交换柱ES-502N(Asahipak)

[0100] 流速：1.0mL/分钟

[0101] 分析时间：20分钟

[0102] 柱温：30℃

[0103] 注射量：20μL

[0104] 检测器：RI

[0105] 移动相：甲酸铵缓冲液(pH 8.0)

[0106] 对于具有不同分子量的聚乙二醇化合物，调查萃取纯化的效果。代表性地，以下参考分子量为5000和60000的数据进行解释。

[0107] 将聚乙二醇化合物溶解在水中并添加酸将pH调节至2。向其添加有机溶剂I与有机溶剂II的混合溶液并在15、25、35或55℃下进行萃取操作。在蒸发器上在减压下蒸馏有机层，并且进行所得浓缩物的质量测量和HPLC测量。由HPLC谱图中的具有一个氨基的聚乙二醇化合物和不具有氨基的聚乙二醇化合物的峰面积的比例计算每种质量。

[0108] 酸性水溶液中具有一个质子化的氨基的聚乙二醇化合物在萃取时主要保留在水性层中，而杂质趋向于迁移至有机层。然而，除非以适当的溶剂混合比例和萃取温度执行萃取，否则不能实现纯化。

[0109] 此处，将包含在通过浓缩有机层而获得的浓缩物中的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量变为20％的有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例Y取作Y3。Y3是相对于通过萃取而获得的收率的混合比例的指数。在溶剂的混合比例Y小于Y3的情况下，具有一个氨基的聚乙二醇化合物与不具有氨基的聚乙二醇化合物一起分布并移除至有机层中，使得具有一个氨基的聚乙二醇化合物的收率降低。

[0110] 更具体解释混合比例Y为Y3的情况下的收率。例如，当使用100g胺纯度为90％的聚乙二醇化合物进行萃取并且浓缩了有机层之后，获得10g浓缩物。对应于浓缩物的20％的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量如下：10g×20％÷100＝2g。收率的降低率如下：2g÷(100g×90％÷100)×100＝2.2％。

[0111] 接下来，将通过有机层的浓缩开始获得浓缩物的混合比例Y取作Y2。Y2是变得能够通过本发明的萃取方法进行纯化的混合比例的指数。即，其是作为杂质的不具有氨基的聚乙二醇化合物开始优先分布至有机层中的点。当溶剂的混合比例Y大于Y2时，不具有氨基的聚乙二醇化合物不能分布并移除至有机层中，使得不能进行纯化。

[0112] Y3与Y2之间的关系永远是Y3＜Y2。

[0113] 因此，溶剂的混合比例Y处于Y3与Y2之间，这表示能够以工业可利用的高效率通过萃取来纯化上述聚乙二醇化合物。

[0114] 如图1和2中所示，以纵坐标表示混合比例Y并以横坐标表示萃取温度T(℃)，标绘出包含在通过浓缩有机层而获得的浓缩物中的目标物质的质量为20％的混合比例(Y3)和通过有机层的浓缩开始获得浓缩物的混合比例(Y2)。

[0115] 如图1和2中所示，Y3和Y2能够以如下所示的温度T的函数来表示。

[0116] 在分子量M＝5000的情况下：Y3＝0.015T+0.11，Y2＝0.015T+0.43

[0117] 在分子量M＝60000的情况下：Y3＝0.015T+0.22，Y2＝0.015T+0.35

[0118] 如上所述，温度改变的曲线的斜率，即0.015，是独立于聚乙二醇化合物的分子量的，并且是常数。换言之，Y3和Y2都能够由(0.015T+截距)来表示。

[0119] 因此，以纵坐标表示Y的截距并以横坐标表示分子量M，标绘出Y3和Y2的截距。如下图3所示，两者均与分子量M成比例关系。

[0120] 即，由图3可知，当将Y3和Y2视作分子量M的函数时，能够衍生出以下等式。

[0121] Y3＝1.9×10-6M+0.015T+0.09

[0122] Y2＝-1.4×10-6M+0.015T+0.44

[0123] 另一方面，当使用具有一定分子量的聚乙二醇化合物来进行萃取纯化时，可以将分子量M视为常数，因此，当温度T为变量并且将Y3和Y2各自的截距取作A和B时，获得以下等式：Y3＝0.015T+A以及Y2＝0.015T+B。这些关系在图4中示出。

[0124] 如图4所示，当混合比例Y落入图4中的灰色区域内，即落入满足Y≤0.015T+B和Y≥0.015T+A的区域内时，能够通过萃取来纯化。

[0125] 总而言之，当将有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)取作Y，将步骤(B)中的温度取作T(℃)并且将聚乙二醇化合物的分子量取作M时，以下示出能够纯化的范围：

[0126] 1.9×10-6M+0.09≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44。

[0127] 另一方面，当截距A和B相互一致时，在图4中不会出现能够进行萃取纯化的区域。由于A＝B的事实，此时的分子量M为M＝106060。也就是说，能够进行萃取纯化的分子量的上限为106060。

[0128] 此外，优选条件如下。

[0129] 将包含在通过浓缩有机层而获得的浓缩物中的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量变为5％时的混合比例Y取作Y1。

[0130] 更具体地解释混合比例Y为Y1的情况下的收率。例如，当使用100g胺纯度为90％的聚乙二醇化合物进行萃取并且浓缩了有机层之后，获得10g浓缩物。对应于浓缩物的5％的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量如下：10g×5％÷100＝0.5g。收率的降低率如下：0.5g÷(100g×90％÷100)×100＝0.55％。

[0131] 将在有机层的浓缩过程中开始获得浓缩物的混合比例Y取作Y2。

[0132] Y1与Y2之间的关系永远是Y1＜Y2。

[0133] 因此，溶剂的混合比例Y处于Y1与Y2之间，这表示能够以工业可利用的高效率通过萃取来纯化上述聚乙二醇化合物。

[0134] 如图1和2中所示，以纵坐标表示混合比例Y并以横坐标表示萃取温度T(℃)，标绘出包含在通过浓缩有机层而获得的浓缩物中的目标物质的质量为5％的混合比例(Y1)和通过有机层的浓缩开始获得浓缩物的混合比例(Y2)。

[0135] 如图1和2中所示，Y1和Y2能够以如下所示的温度T的函数来表示。

[0136] 在分子量M＝5000的情况下：Y1＝0.015T+0.19，Y2＝0.015T+0.43

[0137] 在分子量M＝60000的情况下：Y1＝0.015T+0.25，Y2＝0.015T+0.35

[0138] 如上所述，温度改变的曲线的斜率，即0.015，是独立于聚乙二醇化合物的分子量的并且是常数。换言之，Y1和Y2都能够由(0.015T+截距)来表示。

[0139] 因此，以纵坐标表示Y的截距并以横坐标表示分子量M，标绘出Y1和Y2的截距。如下图3所示，两者均与分子量M成比例关系。

[0140] 即，由图3可知，当将Y1和Y2视作分子量M的函数时，能够衍生出以下等式。

[0141] Y1＝1.0×10-6M+0.015T+0.19

[0142] Y2＝-1.4×10-6M+0.015T+0.44

[0143] 另一方面，当使用具有一定分子量的聚乙二醇化合物来进行萃取纯化时，可以将分子量M视为常数，因此，当温度T为变量并且将Y1和Y2各自的截距取作C和B时，获得以下等式：Y1＝0.015T+C以及Y2＝0.015T+B。这些关系在图4中示出。

[0144] 如图4所示，当混合比例Y落入图4中的灰色区域内，即落入满足Y≤0.015T+B和Y≥0.015T+C的区域内时，能够通过萃取来纯化。

[0145] 总而言之，当将有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)取作Y，将步骤(B)中的温度取作T(℃)并且将聚乙二醇化合物的分子量取作M时，以下示出优选条件的范围：

[0146] 1.0×10-6M+0.19≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44。

[0147] 另一方面，当截距C和B相互一致时，在图4中不会出现能够以优选模式通过萃取进行纯化的区域。由于A＝B的事实，此时的分子量M为M＝104167。也就是说，能够以优选模式进行纯化的分子量的上限为104167。

[0148] 综上所述，当将有机溶剂I与有机溶剂II的混合比例(有机溶剂I/有机溶剂II)取作Y，将步骤(B)中的温度取作T(℃)并且将聚乙二醇化合物的分子量取作M时，以下为能够以优选模式进行纯化的范围：

[0149] 1.9×10-6M+0.09≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44

[0150] ，并且以下是优选的：

[0151] 1.0×10-6M+0.19≤Y-0.015T≤-1.4×10-6M+0.44。

[0152] (实施例1)

[0153] 在本实施例中，分子量M为5000，萃取温度为25℃，并且Y为0.67。

[0154] 将由式[1]表示的α-甲氧基-ω-氨乙基聚乙二醇(分子量：5000，胺纯度：90.5％)：1250g和水：6250g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth 冷凝器、温度计和氮气入口管的20L四颈可分离烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加85％的磷酸将pH调节至
2。向其添加甲苯：2500g和氯仿：3750g的混合溶剂，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：2500g和氯仿：3750g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：2000g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液：59.5g将pH调节至11。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：6250g并在50℃下搅拌30分钟，并且，在停止搅拌之后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：3125g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加乙酸乙酯：
1250g稀释之后，以硫酸镁：375g进行脱水，随后过滤。以乙酸乙酯：1250g洗涤滤饼，并且将洗涤液与滤液合并。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：
3750g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以3750g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(1076g，胺纯度：99.0％，胺收率：94.2％)。

[0155] CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2NH2 [1]

[0156] (实施例1-1)

[0157] 在实施例1中，在25℃的萃取温度下不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.57并且Y3为0.47。

[0158] (实施例1-2)

[0159] 在实施例1中，在25℃的萃取温度下不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.81。

[0160] (实施例1-3)

[0161] 在与实施例1相同的条件下将萃取温度设定为15、35和55℃，并且像实施例1-1和实施例1-2那样调查Y1、Y2和Y3。图1是标绘出结果的图。

[0162] (实施例2)

[0163] 在本实施例中，分子量M为10000，萃取温度T为25℃，并且Y为0.67。

[0164] 将由式[2]表示的α-甲氧基-ω-氨丙基聚乙二醇(分子量：10000，胺纯度：88.1％)：20g和水：100g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的
300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加85％的磷酸将pH调节至2。向其添加甲苯：40g和氯仿：60g的混合溶剂，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：40g和氯仿：60g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：26g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液将pH调节至12。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：100g并在
50℃下搅拌30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：100g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于
50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加乙酸乙酯：100g稀释之后，以硫酸镁：10g进行脱水，随后过滤。以乙酸乙酯：50g洗涤滤饼，并且将洗涤液与滤液合并。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：140g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以140g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(16g，胺纯度：
98.6％，胺收率：89.5％)。

[0165] CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NH2 [2]

[0166] (实施例2-1)

[0167] 在实施例2中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.58并且Y3为0.48。

[0168] (实施例2-2)

[0169] 在实施例2中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.80。

[0170] (实施例3)

[0171] 在本实施例中，分子量M为20000，萃取温度T为20℃，并且Y为0.57。

[0172] 将由式[3]表示的α-甲氧基-ω-氨丙基聚乙二醇(分子量：20000，胺纯度：89.1％)：9g和水：60g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的
300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加85％的磷酸将pH调节至1。向其添加甲苯：20g和氯仿：35g的混合溶剂，将整体在20℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：26g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加50质量％的KOH水溶液将pH调节至12。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：50g并在50℃下搅拌30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。
添加甲苯：50g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加甲苯：50g稀释之后，以硫酸镁：5g进行脱水，随后过滤。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：50g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以50g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(7.4g，胺纯度：
98.0％，胺收率：90.4％)。

[0173] CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NH2 [3]

[0174] (实施例3-1)

[0175] 在实施例3中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.51并且Y3为0.43。

[0176] (实施例3-2)

[0177] 在实施例3中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.71。

[0178] (实施例4)

[0179] 在本实施例中，分子量M为20000，萃取温度T为15℃，并且Y为0.5。

[0180] 将由式[4]表示的分枝型聚乙二醇衍生物(分子量：20000，胺纯度：74.9％)：4g和水：50g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加6N HCl水溶液将pH调节至2。向其添加甲苯：20g和氯仿：40g的混合溶剂，将整体在15℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：10g和氯仿：20g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：12g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液将pH调节至12。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：30g并在50℃下搅拌
30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加甲苯：50g稀释之后，以硫酸镁：2g进行脱水，随后过滤。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：50g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以50g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(3.0g，胺纯度：96.0％，胺收率：96.1％)。

[0181]

[0182] (实施例4-1)

[0183] 在实施例4中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.44并且Y3为0.35。

[0184] (实施例4-2)

[0185] 在实施例4中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.64。

[0186] (实施例5)

[0187] 在本实施例中，分子量M为60000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.67。

[0188] 将由式[5]表示的分枝型聚乙二醇衍生物(分子量：60000，胺纯度：81.5％)：1190g和水：12kg放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的50L四颈可分离烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加85％的磷酸将pH调节至2。向其添加甲苯：4.8kg和氯仿：7.2kg的混合溶剂，将整体在27.5℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：4.8kg和氯仿：7.2kg的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：3.08kg，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液：51.0g将pH调节至12。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：12.2kg并在50℃下搅拌30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：6.76kg以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层并且以硫酸镁：605g进行脱水，随后过滤。以甲苯：3.61kg洗涤滤饼，并且将洗涤液与滤液合并。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：9.61kg以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以1.21kg己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(877g，胺纯度：97.4％，胺收率：88.0％)。

[0189]

[0190] (实施例5-1)

[0191] 在实施例5中，在27.5℃的萃取温度下不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.66并且Y3为0.62。

[0192] (实施例5-2)

[0193] 在实施例5中，在27.5℃的萃取温度下不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.77。

[0194] (实施例5-3)

[0195] 在与实施例5相同的条件下将萃取温度设定为15、35和55℃，并且像实施例5-1和实施例5-2那样调查Y1、Y2和Y3。图2是标绘出结果的图。

[0196] (实施例6)

[0197] 在本实施例中，分子量M为40000，萃取温度T为25℃，并且Y为0.67。

[0198] 将由式[6]表示的分枝型聚乙二醇衍生物(分子量：40000，胺纯度：73％)：1g和水：10g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加三氟乙酸将pH调节至2。向其添加甲苯：10g和氯仿：15g的混合溶剂，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：10g和氯仿：15g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加水：10g和氯化钠：5g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液将pH调节至12。添加氯仿：50g并在室温下进行搅拌30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。添加氯仿：50g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于40℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加乙酸乙酯：50g稀释之后，以硫酸镁：1g进行脱水，随后过滤。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：50g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以10g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(0.7g，胺纯度：95.0％，胺收率：
91.1％)。

[0199]

[0200] (实施例6-1)

[0201] 在实施例6中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.61并且Y3为0.54。

[0202] (实施例6-2)

[0203] 在实施例6中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.76。

[0204] (实施例7)

[0205] 在本实施例中，分子量M为20000，萃取温度T为20℃，并且Y为0.57。

[0206] 将由式[7]表示的聚乙二醇衍生物(分子量：20000，胺纯度：77.7％)：4g和水：50g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加85％的磷酸将pH调节至1。向其添加甲苯：10g和氯仿：17.5g的混合溶剂，将整体在20℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：10g和氯仿：20g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：12g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液将pH调节至14。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：50g并在50℃下搅拌30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将下层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：50g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加甲苯：50g稀释之后，以硫酸镁：1g进行脱水，随后过滤。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：40g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以50g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(2.8g，胺纯度：
95.9％，胺收率：86.4％)。

[0207]

[0208] (实施例7-1)

[0209] 在实施例7中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.51并且Y3为0.43。

[0210] (实施例7-2)

[0211] 在实施例7中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.71。

[0212] (实施例8)

[0213] 在本实施例中，分子量M为2000，萃取温度T为25℃，并且Y为0.67。

[0214] 将由式[8]表示的α-羟基-ω-氨丙基聚乙二醇(分子量：2000，胺纯度：89.0％)：92g和水：50g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的2L四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加三氟乙酸将pH调节至2。向其添加甲苯：200g和氯仿：300g的混合溶剂，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其添加新制备的甲苯：
200g和氯仿：300g的混合溶剂，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：165g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液将pH调节至11。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：500g并在50℃下搅拌
30分钟。停止搅拌之后将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将上层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：250g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加甲苯：150g稀释之后，以硫酸镁：30g进行脱水，随后过滤。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：300g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以300g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(80g，胺纯度：98.5％，胺收率：96.2％)。

[0215] HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NH2 [8]

[0216] (实施例8-1)

[0217] 在实施例8中，不断改变Y，并且调查浓缩物的质量中具有一个氨基的聚乙二醇化合物的质量为5％的混合比例(Y1)和该化合物的质量为20％的混合比例(Y3)。结果，Y1为0.57并且Y3为0.47。

[0218] (实施例8-2)

[0219] 在实施例8中，不断改变Y，并且调查所得浓缩物最少的混合比例(Y2)。结果，Y2为0.81。

[0220] (比较例1)

[0221] 接下来，将以与在专利文献1(JP-A-1-165343)的实施例相同的方式利用离子交换柱执行纯化。在该实施例中，分子量为12000的α-甲氧基-ω-氨丙基聚乙二醇用作原材料，但是为了阐明本发明的效果，使用分子量为5000的α-甲氧基-ω-氨乙基聚乙二醇进行纯化，并将结果相互比较。

[0222] 将由式[1]表示的α-甲氧基-ω-氨乙基聚乙二醇(分子量：5000，胺纯度：90.5％)：15g溶解在135g离子交换水中并且使用离子交换水作为移动层使溶液以1mL每分钟的流速流过以150g再生碱交换型离子交换树脂DIAION PK216[Mitsubishi Chemical
Corporation的产品，商品名]填充的色谱柱。在色谱柱的液体水平达到与填充树脂的表面边界相同水平的时间点，使1.5L离子交换水以4mL每分钟的流速流动。然后，使0.8L 5％的氨水以1mL每分钟的流速流动，并收集800mL流出液。随后，向收集的流出液添加氯化钠：24g并将整体在室温下搅拌并溶解。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：80g并在50℃下搅拌30分钟，并且，在停止搅拌之后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将上层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：40g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。
于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加乙酸乙酯：30g稀释之后，以硫酸镁：5g进行脱水，随后过滤。以乙酸乙酯：30g洗涤滤饼，并且将洗涤液与滤液合并。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：60g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以40g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得纯化产品(10.2g，胺纯度：
98.9％，胺收率：74.3％)。

[0223] (比较例2)

[0224] 在与实施例1相同的条件下，不使用混合溶剂而是使用氯仿作为萃取溶剂执行是否能够以单一溶剂进行纯化的比较调查。

[0225] 将由式[1]表示的α-甲氧基-ω-氨乙基聚乙二醇(分子量：5000，胺纯度：90.5％)：10g和水：50g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加6N HCl水溶液：0.5g将pH调节至
2。向其添加氯仿：30g，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的下层有机层并向其新添加氯仿：30g，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：16g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液：0.48g将pH调节至11。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：50g并在50℃下搅拌30分钟，并且，在停止搅拌之后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将上层有机层回收至茄形烧瓶中。添加甲苯：25g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。当在蒸发器上于50℃下浓缩有机层时，只获得痕量的浓缩物并且不能获得纯化产品。

[0226] (比较例3)

[0227] 在与实施例1相同的条件下，不使用混合溶剂而是使用甲苯作为萃取溶剂执行是否能够以单一溶剂进行纯化的比较调查。

[0228] 将由式[1]表示的α-甲氧基-ω-氨乙基聚乙二醇(分子量：5,000，胺纯度：90.5％)：10g和水：50g放置在装配机械搅拌装置、Dimroth冷凝器、温度计和氮气入口管的
300mL四颈烧瓶中并在室温下在氮气下通过搅拌溶解。通过向其添加6N HCl水溶液：0.5g将pH调节至2。向其添加甲苯：30g，将整体在25℃下搅拌30分钟，并且在停止搅拌后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。除去分层的上层有机层并向其添加新制备的甲苯：
30g，随后相似地进行萃取操作。在搅拌和分层之后，除去有机层并向剩余的水性层添加氯化钠：16g，随后搅拌并在室温下溶解。通过向溶液添加400g/L的NaOH水溶液：0.5g将pH调节至11。将整体缓慢搅拌并加热至50℃，添加甲苯：50g并在50℃下搅拌30分钟，并且，在停止搅拌之后，将整体在相同温度下静置30分钟以引起分层。将上层有机层回收至茄形烧瓶中。
添加甲苯：25g以再次进行萃取并将有机层回收至茄形烧瓶中。于50℃下在蒸发器上浓缩有机层，并且在通过添加乙酸乙酯：10g稀释之后，以硫酸镁：3g进行脱水，随后过滤。以乙酸乙酯：10g洗涤滤饼，并且将洗涤液与滤液合并。在使用磁力搅拌器搅拌下将溶液冷却至室温之后，向其添加己烷：30g以析出晶体。将浆液搅拌30分钟并过滤，并且在以30g己烷洗涤残留物之后，进行真空干燥以获得晶体。当测量质量时，其与装填质量几乎没有变化，并且胺纯度为与纯化之前相同的90.5％，因此不能获得纯化产品。

[0229] 实施例1和比较例1、2和3的结果示出在下表1中。

[0230] 表1

[0231]

[0232] *1：通过HPLC测量

[0233] 如表1所示，通过本发明的纯化方法获得的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的胺纯度与比较例1中通过离子交换柱获得的纯化产品的胺纯度相同，并且在胺收率方面，获得了明显高的结果。

[0234] 顺便提及，图5示出用于实施例1的萃取纯化的原材料的HPLC色谱图，并且图6示出了实施例1中获得的纯化产品的HPLC色谱图。

[0235] 另一方面，在比较例2和3中，不使用混合溶剂而是利用单一溶剂进行了比较调查。在使用氯仿作为萃取溶剂的比较例2中，几乎全部的聚乙二醇化合物都被萃取至有机层并且不能进行纯化。另外，在使用甲苯的比较例3中，没有任何聚乙二醇化合物被萃取至有机层，并且因此不能进行纯化。

[0236] 综上所述，本发明是能够以高纯度和高收率来工业制造具有一个氨基的聚乙二醇化合物的有用的纯化方法。

[0237] 尽管已经详细地并且参考其特定实施方式对发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的主旨和范围的情况下，能够对本发明进行各种改变和改进。

[0238] 本申请基于2013年3月27日提交的日本专利申请No.2013-66687，其内容通过引用并入本文。此外，本文中所引用的全部文献都整体并入本文。

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