发明领域

本发明涉及一种新的蛋白质(本文同义地称作Mpl配体或MGDFs)， 该蛋白质刺激巨核细胞生长并增加巨核细胞分化或成熟，最终引起血 小板数目增加。本发明还涉及从天然来源中获取均质形式的所述蛋白 质并且通过重组遗传工程技术产生所述蛋白质的方法。

另一方面，广义地说本发明涉及一类新的MGDF衍生物(其中MGDF 分子结合在一种水溶性聚合物上)，以及制备这类分子的方法。本发 明还涉及MGDF分子结合到一个或多个聚乙二醇(“PEG”)基团上的 MGDF衍生物，以及它们的制备方法。

                         背景技术

本发明涉及至少两个主要的研究领域。第一个领域涉及巨核细胞 的发育以及由此引起的血小板生成；第二个领域涉及一个生长因子受 体族的多肽成员，本文称为Mpl受体及其配体。以下将概括说明每个 研究领域的情况： A.从巨核细胞生成血小板

血小板是一种对防止出血和血液凝结起关键性作用的循环细胞。 巨核细胞是血小板的细胞源，并且由一种能够产生所有造血细胞谱系 的共同骨髓前体细胞所生成。所述的共同前体细胞是已知的多能性干 细胞或PPSC。

巨核细胞祖代细胞体系是这样确定的，即基于在体外培养系统中 对适当的生长因子反应时巨核细胞(MK)集落出现的时间和大小。巨 核细胞暴发形成单元(BFU-MK)是最原始的巨核细胞祖代细胞。人 们认为BFU-MK最终产生了大量的巨核细胞集落形成单元(CFU-MK)， 它是分化程度更高的MK祖代细胞。

随着MK细胞不断地分化，它们不再具有有丝分裂能力却获得了核 内复制能力。核内复制(或核内有丝分裂)是在没有细胞分裂时的细 胞中的核分裂现象。核内复制最终造成多倍体MK。MK进一步成熟导致 产生具有血小板特征的胞质细胞器及膜组分。

经尚未明确解释的过程，由成熟的MK生成了血小板，人们认为 所述过程是MK自然断裂或其它机制的结果。通过观察巨核细胞内广 泛的膜结构，已得到一种血小板形成模型，其中在细胞体内有一个分 界膜系统勾划出新生血小板轮廓。通过观察已得到另一种血小板形成 模型，巨核细胞将形成以血小板大小间隔收缩的狭长的细胞质的突。 由于血液在骨髓和/或肺中流动产生压力，血小板可能从突中断裂下 来Becker和DeBruyn称这些细胞质的突为原血小板，以反映它们在血 小板形成中其假定的前体作用(见Becker和DeBruyn，Amer.J.Anat. 145：183(1976))。

附图1表示出了巨核细胞和血小板发育过程中涉及的各种前体细 胞。图最左边的细胞表示PPSC，图中在PPSC右边的其它细胞表示BFU -MK，接下来是CFU-MK。图中位于PPSC右边正在经历着核内复制的 细胞是一个成熟的巨核细胞。这个细胞经核内有丝分裂后变成多倍体。 该图再右边的结构表示从成熟巨核细胞的多倍体核产生的长的细胞质 的突。图的最右边表示由于细胞质突的断裂产生的大量的血小板。

以下归纳了与上述巨核细胞成熟和血小板生成有关的参考文献： 1.Williams N.和Levine R.F.， British Journal of Haematology   52：173-180(1982)； 2.Levin，J.， Molecular Biology and Differentiation of    Megakaryocytes，Wiley-Liss公司出版：1-10(1990)； 3.Gewirtz，A.M.， The Biology of Hematopoiesis，Wiley-Liss公司   出版：123-132(1990)； 4.Han，Z.C.等人， Int.J.Hematol.，54：3-14(1991)； 5.Nieuwenhuis H.K.和Sixma， J.New Eng J.of Med.327：1812-   1813(1992)： 6.Long.M， Stem Cell 11：33-40(1993)。 B.血小板形成的调节

许多实验室大量的数据表明可以通过体液因子调节血小板的生成。 最早人们并没有正确认识这个生物过程的复杂性而现在人们发现许多 人体生长因子都具有这种能力。

巨核细胞的调节发生在多细胞水平上。许多细胞因子通过扩张祖 代细胞池来增强血小板的生成。第二组体液因子作为成熟因子作用于 分化程度较高的细胞以促进其核内复制。另外，出现了两条独立的、 用来调节这些过程的生物反馈环。

数个谱系非特异性的造血因子对MK的成熟起了重要作用。粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素-3(IL-3)， IL-6，IL-11，白血病抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(EPO)， 通过测定它们对MK大小、数量或倍性的作用发现每种因子体外均能 促进人MK的成熟。LIF、IL-6和IL-11对MK成熟的作用对IL-3具有 部分地(LIF和IL-6)或全部地(IL-1 1)加合性。从这些参考文献 得到的数据表明细胞因子结合物是体内促进MK成熟所必不可少的因素。

以下归纳与涉及调节巨核细胞及血小板生成有关的参考文献： 7.Hoffman，R.，等人， Blood Cells 13：75-86(1987)； 8.Murphy，M.J.， Hematology/Oncology Clinics of North America   3(3)：465-478(1988)； 9.Hoffman.R.， Blood 74(4)：1196-1212(1989)； 10.Mazur，E.M.和Cohen，J.L.， Clin Pharmacol.Ther.，46(3)：    250-256(1989)； 11.Gewirtz，A.M.和Calabretta，B.， Int.J.Cell Cloning 8：    267-276(1990)； 12.Willams，N.， Progress in Growth Factor Reseach 2：81-95    (1990)； 13.Gordon，M.S.和Hoffman，R.， Blood 80(2)：302-307(1992)： 14.Hunt P.等人， Exp.Hematol.21：372-281(1993)； 15.Hunt P.等人， Exp.Hematol.21：1295-1304(1993)。

另外，还有报道(见参考文献16)说人发育不良血清具有一种与 IL-3、粒细胞集落刺激因子和存在于淋巴细胞-条件培养基中的因 子截然不同的巨核细胞集落刺激活性。但是，现有技术中既未分离出 也未表征过产生这种具有所述活性的分子。 16.Mazur，E.M.等人， Blood 76：290-297(1990)。 C.Mpl受体

脊髓增生性白血病病毒(MPLV)是一种在被感染哺乳动物中可引 起急性白血病的鼠复制缺陷性反转录病毒。人们早已发现由MPLV表达 的基因由用来编码病毒的反转录病毒属包膜(或表面蛋白质膜)的部 分基因组成，其中所说的基因与细胞因子受体族有关的序列相融合， 受体族包括GM-CSF、G-CSF和EPO的受体。

上述MPLV基因的表达具有一种令人感兴趣的生物学特性，即导致 各种类型的鼠祖代细胞在增殖和末端成熟时立刻获得生长因子不依赖 性。此外，用MPLV急性转化的某些骨髓细胞培养物中含有巨核细胞， 这说明MPLV基因与巨核细胞的生长及分化之间具有一定的联系。

现在发现MPLV病毒基因(称为v-Mpl)在哺乳动物细胞中有一个 被称作是细胞Mpl基因(c-Mpl)的同系物。使用v-Mpl-衍生探针 克隆出相应于人c-Mpl基因的cDNA。见PCT公开申请WO 92107074 (1992年4月30日公开：下文讨论)。序列分析表明由c-Mpl基因产 物编码的蛋白质属于高度保守的细胞因子受体超级族，正如同源的 v-Mpl基因产物一样。

基于通过RNAse探针保护和RT-RCR实验在正常小鼠的骨髓、脾和 胎的肝中发现了c-Mpl的表达，而在其它组织中没有发现这一事实， 认为这个细胞基因，c-Mpl，在血细胞生成中起到功能性作用。特别 是c-Mpl在巨核细胞中的表达。已阐明了人细胞基因，人cMpl在CD34 阳性细胞包括提纯的巨核细胞和血小板中表达。CD34是一种指示早期 造血祖代细胞的抗原。此外，将CD34阳性细胞暴露于与c-Mpl mRNA 或信息反义的合成的寡脱氧核苷酸显著地抑制CFU-MK巨核细胞祖代的 集落形成能力，但对红细胞或粒细胞巨噬细胞的祖代没有任何影响。

以上资料和观察结果表明c-Mpl编码结合到配体上的细胞表面分 子(本文称为Mpl受体)，配体能够激活受体，并且可能引起巨核细 胞的生成和/发育。

PCT专利出版物WO 92/07074涉及到用来自人和鼠的c-Mpl基 因生成的蛋白质序列。这个按上述解释称为受体的基因产物，至少由 三个常规区域组成：细胞外区、跨膜区和细胞内(或细胞质)区。这 些区全部结合在一起就组成了完整的Mpl受体。该PCT出版物还提及一 种受体的可溶形式，其基本上相应于成熟c-Mpl蛋白质的细胞外区。 细胞内区含有一个亲水区，当亲水区经过跨膜区和蛋白质的细胞外区 相结合时，整个蛋白质就变得凝集并且不可溶。另一方面，当c-Mpl 基因产物的细胞外区从跨膜区和细胞内区中分离出来时，细胞外区就 变成可溶的，因此，将该蛋白质的细胞外形式称为该受体的“可溶形 式”。

以下归纳了与上述的v-Mpl和c-Mpl受体及基因有关的参考文献：

17.Wendling，F.，et al.，Leukemia 3(7)：47-480

   (1989).

18.Wendling，F.，et al.，Blood 73(5)：1161-1167

   (1989).

19.Souyri，M.，et al.，Cell 63：1137-1147(1990).

20.Vigon，I.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：

   5640-5644(1992).

21.Skoda，R.C.，et al.，The EMBO Journal 12(7)：

   2645-2653(1993).

22.Ogawa，M.，Blood 81(11)：2844-2853(1993).

23.Methia，N.，et al.，Blood 82(5)：1395-1401(1993).

24.Wendling，F，et al.，Blood 80：246a(1993).

D.对能够刺激血小板生成的试剂的需要

   近来已报道在北美、西欧和日本许多医疗中心采用血小板输注的 比率不断增长。见Gordon M.S.和Hoffman，R.， Blood 80(2)： 302-307(1992)。这种增长是由于医药技术的较大进步和更多地利 用类似技术如心脏手术及骨髓、心脏和肺移植而造成的。癌症患者和 HTV-1流行病的一种治疗方法是剂量增强，这也造成了对血小板的急 需。

血小板的使用使得有可能传播许多出血性传染病和异源免疫。而 且，生产纯化的血小板是一个花费很高且又费力的事情，结果是增加 使用血小板使全部医疗费用增加。因此，迫切需要找到新的和改进的 方法以生产用于人的血小板。

以下是关于增加血小板生成的现有技术的举例：

US专利5,032,396报道了白细胞介素-7(IL-7)能够刺激血 小板生成。白细胞介素-7也是人们已知的淋巴细胞生成素-1，而 且是一种淋巴细胞生长因子，能够刺激骨髓中B-和T-细胞祖代的生 长。PCT专利申请系列号88/03747(1988年10月19日申请)以及欧洲 专利申请号88309977.2(1988年10月24日申请)公开了通过重组DNA 技术生成哺乳动物的IL-7蛋白质的DNA、载体和有关的方法。记载 在US专利中的资料表明IL-7可以增加正常的和亚致死辐射小鼠中的 血小板循环。

US专利5,087,448公开了用白细胞介素-6处理哺乳动物可以刺 激巨核细胞和血小板的增殖。重组人白细胞介素-6是一种分子量为 26,000具有多种生物活性的糖蛋白。该专利所记载的资料表明IL-6 具有体外增加巨核细胞集落的作用。

以上提及的专利都没有涉及到本发明所说的Mpl配体。

虽然有以上文献，但仍迫切需要哺乳动物中巨核细胞和/或血小 板的新的刺激因子。 E.关于化学性修饰之MGDF的背景

随着重组DNA技术大幅度地进步，目前人们可以大量生产出适当 形式的用于治疗的蛋白质。这种蛋白质的化学衍生物有效地阻断了蛋 白水解酶与蛋白质骨架本身的物理性接触从而阻止其降解作用。其它 优点还包括在某种情况下它可以增加治疗性蛋白质的稳定性和循环时 间并且降低致免疫性。然而，值得注意的是人们无法预测到某个特定 蛋白质的修饰作用的效果。关于描述蛋白质修饰和融合蛋白质的综述 文章是Francis， Focus on Growth Factors 3：4-10(1992年5月) (Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N20，OLD，UK出版)。

聚乙二醇(“PEG”或“peg”)是一种已用来制备治疗性蛋白质 产物的这样一种化学成分。例如Adagen_是一种允许用来治疗许多结 合性免疫缺陷性疾病的腺苷脱氨酶药物；聚乙二醇化的(pegylated) 过氧化歧化酶在临床实验中已用于治疗头部受伤；聚乙二醇化的α 干扰素已经通过了肝炎治疗I期临床实验测试；有报道说聚乙二醇化 的糖脑苷酯酶和聚乙二醇化的血红蛋白正处于预临床测试阶段。对某 些蛋白质而言，聚乙二醇的结合可以使其受到保护避免了蛋白水解酶 的作用，见Sada等人， J.Fermentation Bioengineering 71：137 -139(1991)，另外和某些聚乙二醇部分结合的方法也是已知的。见 US专利No 4,179,327，Dayis等人“Non-Immunogenic Polypeptides”， 1979年12月18日公开；以及US专利4,002,531，Royer“Modifying Enzymes with Polythylene Glycol and Product Produced Thereby”， 1992年1月11日公开。有关综述，见Abuchowski等Enzymes as Drugs (J.S.Holcerberg和J.Roberts，eds pp.367-383(1981))。

用来修饰蛋白质的其它可溶性聚合物有，例如乙二醇/丙二醇共 聚物，羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3 -二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物 以及聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)。

对于聚乙二醇，人们使用了许多将聚乙二醇分子与蛋白质相连接 的方法。一般地，聚乙二醇分子通过一个在蛋白质上的活性基团结合 到蛋白质上。对于那些如赖氨酸残基或N-末端上的氨基基团，这种 连接是很方便的事情。例如Royer(上述US专利4,002,531)记述了通 过还原性烷基化将聚乙二醇分子连接到酶上。EP0 539 167(1993年 4月28日公开，Wright“Peg Imidates and Protein Derivates Thereof”)记述了用PEG的亚氨酸衍生物或相关的水溶性有机聚合物 修饰肽和具有游离氨基的有机化合物。US专利4,904,584(Shaw，1990 年2月27日公开)涉及了蛋白质中大量赖氨酸残基的修饰，所述的赖 氨酸残基用于经反应性氨基基团连接聚乙二醇分子。

一种经化学修饰的特定治疗性蛋白质是粒细胞集落刺激因子 “G-CSF”。见欧洲专利公开EP0 401 384，EP0 473 268和 EP0 335 423。

另一个实例是聚乙二醇化的IL-6，EP0 442 724，标题为 “Modified hIL-6”(见共同未决的U.S.S.N.07/632,070)公开 了将聚乙二醇分子加到IL-6上。EP0 154 316，(1985年9月11日 公开)报道了用聚乙二醇的醛与淋巴因子反应。

由于用来修饰的每种单个蛋白质对修饰的敏感性是通过所述蛋白 质的特定结构参数来确定的，所以现有技术中修饰MGDF的能力是未知 的。再者，从现有技术中也无法预见到这种对每种蛋白质之生物特性 的影响。由于有很多MGDF的临床应用(正如以下所述的那样)，人们 需要一种具有改变特性的衍生MGDF产物。这种分子在体内可以具有增 加的半衰期和/或活性，以及其它特性。

蛋白质分子的聚乙二醇化通常将产生化学修饰蛋白质分子的混合 物。举例来说，有五个赖氨酸残基及一个N-末端游离氨基基团的蛋 白质分子用以上方法反应会产生一种异质混合物，其中有的分子含有 六个聚乙二醇部分，有的含有五个聚乙二醇部分，有的含有四个，有 的含有三个，有的两个，有的一个甚至有的没有。而且，在带有数个 聚乙二醇部分的分子中，聚乙二醇部分可能不能连接在不同分子的相 同位置上。人们常常希望获得一种均质产物，这种产物含有基本上只 有一个或数目很小(如2-3)的被修饰的蛋白质种类，这些蛋白质 种类在化学部分如PEG的数量和/或位置上有变化。然而，如单-、 双-和/或三-聚乙二醇化的蛋白质种类的混合物对于给定的治疗目 的来说可能是合意的或可以接受的。

当开发治疗性聚乙二醇化的蛋白质产物时，混合物随不同的批次 而变化是不利的。在这种开发过程中，预测生物活性是很重要的。例 如，在非选择性连接超氧化物歧化和聚乙二醇时，这个被修饰的酶的 几个部分都完全失活了(P.McGoff et al.， Chem Pharm.Bull. 36：3079-3091(1988)，Rose et al.， Bioconjugate Chemistry 2：154-159(1991))也报道了把连接基团碳酰肼选择性地连接到蛋 白质底物(胰岛素)的C-末端羧基基团上。如果治疗性蛋白质的组 成随不同批次而不同，那么，就不会有如此的预测性。一些聚乙二醇 部分在某些位置上结合得不如在其它位置上稳定，而且所述部分会因 此从蛋白质中分离出来。当然，如果所述部分是随机连接上去的且因 此也会随机分离出来，就不能准确预测治疗性蛋白质的药代动力学。

另外，非常理想的是衍生的MGDF产物，其中聚合物部分和MGDF部 分之间没有任何联接部分。用上述的方法存在的一个问题是它们在蛋 白质和聚乙二醇分子之间一般需要一个联接部分。这些联接部分可以 是抗原性的，这在研制治疗性蛋白质时是不利的。

一种涉及无联接基团的方法在Francis等人的“Stability of Protein Pharmaceuticals：in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization”((Eds.Ahern.，T.和 Manning，M.C.)Plenum，New York，1991)中有详述。另外，Delgado 等人“Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride，Applications In Immunoaffinity Cell Preparation”， In：Fisher et al.，et.，Separtions Using Aqueous Phase Systems， Applications Cell Biology and Biotechnology，plenum出版，N. Y.，N.Y.1989 pp.211-213中涉及使用tresyl氯化物这使聚乙二醇部 分和蛋白质部分之间没有联接基团，由于使用tresyl氯化物会产生有 毒的副产品，因此用这种方法去生产治疗学产品是困难的。

Chamow等人在 Bioconjugate Chem.5：133-140(1994)中报 道了用单甲氧基聚乙二醇(“MePEG glycol”)醛通过还原性烷基化 作用修饰CD4免疫黏附蛋白。作者报道了50％的CD4-Ig通过N-末端 α-氨基的选择性反应而被MePEG修饰(出处同上，p137)。还报道 了被修饰的CD4-Ig(到蛋白质gp120)的体外结合能力以与MePEG化 反应程度有关的比率降低(出处同上)。

因此人们需要MGDF衍生物，更确切地说，需要聚乙二醇化的MGDF。 当然，还需要完成这种衍生反应的方法。

                        发明概述

一方面，本发明提供一种新的特异性促进巨核细胞生长和/或发 育的多肽(“Mpl配体”或“MGDFs”)，所述多肽基本上不含(即分 离于)其它蛋白质(即，从哺乳动物来源获取Mpl配体时的哺乳动物 蛋白质)。所述蛋白质可以从天然或用其它因子诱导产生因子的细胞 源中纯化得到。也可以通过重组基因工程技术生产所述的蛋白质。 Mpl配体可以进一步用化学方法或以上列举技术的结合方法合成。

本发明可以从哺乳动物源中得到天然形式的Mpl配体。本文实施 例部分描述了两例从犬发育不良血浆中分离的Mpl配体。然而，其它 实施例证明人源和猪源发育不良的血浆中存在着密切相关的Mpl配体。 值得注意的是，无论人、猪还是犬的Mpl配体活性都被可溶形式的鼠 Mpl受体特异性地抑制，证实了所有的Mpl配体(以及从其它哺乳动 物源(包括鼠)得到的配体)之间无论在结构上还是在活性水平上都 是紧密相关的。

本发明期望基本上用如本文所述的方法可从天然来源中分离人、 猪和其它哺乳动物Mpl配体。见实施例10。因此，本发明一般包括 哺乳动物Mpl配体，例如，狗、猪、人、鼠、马、羊和兔。特别优选 的Mpl配体来源于狗、猪和人。

另外，正如以下实施例部分描述的那样，用于编码人Mpl配体的 基因已经从人胎肾和肝文库中克隆并且测序。用以细胞为基础的检测 方法鉴定了两种人多肽序列具有活性(见实施例4)。这些序列在长 度上有所不同，但在一大段区域的氨基酸序列上具有一致性。相同的 部分与促红细胞生成素同源。本文也把Mpl配体称为巨核细胞生长和 发育因子(MGDF)；所有关于Mpl配体的参考文献都将适于本文称作 的MGDF而且反之亦然。其中“MGDF多肽”是指一种具有特异性刺激或 抑制巨核细胞生长/或发育活性的多肽。本发明公开了这种多肽的实 例。

正如以下实施例2和4检测实验证明的那样，已发现本发明的 Mpl配体在巨核细胞谱系中有特异性活性，能够增进巨核细胞成熟和 /或增殖。其中“特异性”是指与对很多其它类型细胞相比，多肽对 巨核细胞显示出相对较高程度的生物活性。人们希望对巨核细胞有刺 激作用的那些多肽通过巨核细胞的成熟和分化的刺激作用具有刺激血 小板生成的体内活性。

两种来自犬源的优选的Mpl配体在非还原条件下经十二烷基硫酸 钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，分别具有约25KD和31KD 的表观分子量。经相同的纯化处理，可以提纯这两种蛋白质，纯化处 理方法如下实施例所详述。

两种优选的人配体，MGDF-1和MGDF-2，在长度上分别具有332 和174个氨基酸，不包括21个氨基酸的推定的信号肽。附图11和12列 出了这些序列以及第三个相关分子，MGDF-3。

本发明的又一个方面是从哺乳动物源，优选的是从全血、血清或 血浆中，分离并纯化本发明的Mpl配体或其片段的方法。特别优选的 原料是发育不良的血液、血清或血浆。通过一种方法，涉及用例如钴 -60的放射源在大约400-800拉德的辐射程度下辐射哺乳动物使其发 育不良，可以得到发育不良的血液、血清或血浆。下面实施例1引证 的文献举证的那样，这种方法是公知技术。对人而言，可以从经过放 射治疗(如癌症治疗)的患者体内获得被辐射的血液、血清或血浆。

此外，将发育不良血液、血清或血浆进行纯化处理。本发明提出 的纯化方法包括以下关键步骤：外源凝集素亲和层析和Mpl受体亲和 层析。以上所说步骤每一步都能使来自犬发育不良血浆中的25和31KD 蛋白质纯化大约300-500倍。其它标准的蛋白质纯化方法，如以下详 述的那些方法，可以包括在以上所述的过程中以进一步纯化本发明的 Mpl配体。

另一方面，本发明包括编码哺乳动物Mpl配体蛋白质表达的聚核 苷酸。所述DNA序列可以包括一种如本文所述的编码哺乳动物Mpl配 体蛋白质表达的分离的DNA序列。该DNA序列还可以包括位于Mpl配体 编码序列侧翼的5′和3′哺乳动物非编码序列。DNA序列还可以编 码氨基末端的信号肽。可以用任何公知的方法制备所述的序列，包括 完全的或不完全的化学合成方法。可以优化密码子以便在用于表达的 宿主细胞(例如， E.coli或CHO细胞)中进行表达。

本发明还涉及一种重组DNA分子，每种分子含有载体DNA和编码 哺乳动物Mpl配体的DNA序列。DNA分子提供与调节序列有效相连的 Mpl配体DNA，其中的调节序列能够支配Mpl配体在所选宿主细胞中的 复制和表达。本发明还涉及用所述DNA分子转化的宿主细胞(例如， 细菌、哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞)，用于表达重组Mpl配体 蛋白质。

本发明的另一方面是应用本发明的DNA分子和转化的细胞，提供 一种新的生成重组哺乳动物Mpl配体蛋白质或其肽片段的方法。在该 方法中，在允许重组DNA表达的适宜条件下，培养用DNA序列转化的细 胞系，所述DNA序列编码与适当的能够控制蛋白质表达的调节或表达 控制序列有效相连的Mpl配体蛋白质或其片段(或上述的重组DNA分 子)的表达。这种要求保护的方法可以用许多已知的细胞作为用于表 达蛋白质的宿主细胞。到目前为止，优选的用于生产Mpl配体的细胞 系是哺乳动物细胞系(如CHO细胞)和细菌细胞(如 E.coli.)。

若用 E.coli生产Mpl配体，由于表达产物的产率比较高，所以优选 的方法是使用将被表达之蛋白质N-末端上的Met和Lys残基。特别优 选的表达产物是总共具有165个氨基酸的Met-Lys人MGDF(即， Met-2-Lys-1[1-163]MGDF)(从成熟蛋白质的第一个氨基酸开始计 数)。纯化在如E.coli细菌细胞中被表达的产物后，可以用如二肽 酶(组织蛋白酶C)处理去除末端的Met-Lys残基。

接着用适宜的常规方法从宿主细胞、细胞溶解产物或培养基中分 离被表达的Mpl配体蛋白质。可以用与从发育不良血浆中分离Mpl配 体相同的纯化步骤或其变化方法来处理条件培养基。(见实施例7)。

本发明还涉及重组Mpl配体蛋白质。所述蛋白质基本上不含其它 哺乳动物物质，尤其是蛋白质。本发明Mpl配体蛋白质以包括一种或 多种本文所述的物理、生化、药理或生物学活性为特征。

本发明还涉及一种化学修饰的MGDF及其制备方法和这种成分的用 途，所述修饰的MGDF含有一个与至少一种水溶性聚合物结合的MGDF蛋 白质部分。具体地说，本发明包括化学修饰的MGDF，其中所述MGDF类 与反应性聚乙二醇分子反应，以使PEG与MGDF结合。这种结合可以用 本文所讨论的聚乙二醇化反应来完成，例如，酰基化作用或烷基化作 用。与PEG的酰基化或烷基化反应在主要产物为单聚乙二醇化或多聚 乙二醇化产物的条件下完成。多聚乙二醇化作用一般包括PEG结合到 Lys残基的ε-氨基基团上，另外，还包括在多肽的N末端进行的聚 乙二醇化反应。优选的单聚乙二醇化反应包括PEG结合到蛋白质N- 末端的α-氨基基团上，这种单聚乙二醇化反应的产率和均一性可通 过一类选择性修饰MGDF蛋白质部分的N-末端残基的α-氨基的还原 性烷基化作用来提高，从而使水溶性聚合物部分选择性地结合到蛋白 质N-末端上。这样本发明提供了基本上均质的聚合物/MGDF蛋白质 共轭物分子制品，以及(假设用聚乙二醇)具有直接连在蛋白质部分 上的聚乙二醇部分的聚乙二醇化MGDF蛋白质分子的制备。

本发明的另一方面是提供一种药物组合物，该组合物含有治疗有 效量的已分离的天然产生的或重组的Mpl配体和药物学可接受的载体、 稀释剂或赋形剂，其中的Mpl配体可用水溶性聚合物如聚乙二醇衍生 化。所述的药物组合物可以用在治疗以巨核细胞和/或血小板缺乏以 及Mpl配体体内缺乏为特征的疾病或失调的方法中。还可以预防性地 用来改善预料到的巨核细胞或血小板缺乏(例如，由于外科手术造成 的)。

因此，本发明的Mpl配体可以用来治疗再生障碍性贫血，例如可 以增强那些血小板生成损伤患者的血小板的生成(例如爱滋病患者或 经过化学治疗的患者)。Mpl配体可以治疗血液失调例如血小板减少 症。Mpl配体可以用于骨髓移植患者的辅助性治疗。这些患者可以是 人，也可以是其它的哺乳动物。人们还希望来自一种物种的Mpl配体 可以适用于另外一种物种。

因此，更进一步地说，本发明的另一方面是一种给患者施用治疗 有效量的上述治疗组合物而治疗由血小板缺少引起的这种和其它病理 学疾病的方法。这些治疗方法可以包括同时或依次地施用Mpl配体、 有效量的至少一种其它巨核细胞集落刺激因子，细胞因子(如EPO)、 可溶性Mpl受体、促红细胞生成素、白细胞介素、生长因子或抗体。

本发明还提供了直接抗(即与具有反应性)哺乳动物Mpl配体或 配体片段的抗体(如多克隆的、单克隆的、人化的和重组的)以及抗 体片段。因此，就这一方面，本发明包括能够分泌这些抗体的细胞 (例如，单克隆抗体时的杂交瘤)以及生产抗体的方法和抗体在诊断 或治疗过程中的应用。

本发明还涉及一种检测体液中是否存在Mpl配体的方法。这种检 测可以使用抗体，所述抗体以单个抗体形式或“夹层”形式特异性地 识别Mpl配体。这种检测可以测定患者是否需要外部施用Mpl配体和/ 或测定损伤患者是否可能患有血小板缺乏症或失调。这种检测可以在 某种试剂盒中进行，所述试剂盒包括阳性对照和阴性对照、抗体、以 及其它标准试剂盒成分。

考虑了以下详述的本发明优选实施例后，可以看出本发明的其它 方面和优点。

附图的简要描述

在浏览了附图后，本发明的许多特征和优点将是显而易见的，其 中：

附图1描述了巨核细胞和血小板的发育和成熟的概况。

附图2说明了可溶性鼠Mpl受体基本上完全抑制来自辐射狗 (“发育不良犬”或“APK9”)的血浆以诱导巨核细胞发育的能力。 在实施例2中描述了对巨核细胞发育的检测。

附图3表示通过外源凝集素亲和和Mpl受体亲和层析方法从APK9 富集的活性(“Mpl配体”)刺激1A6.1细胞的生长，而可溶性鼠Mpl 受体阻断其生长。

附图4概括了从发育不良的犬血浆中纯化犬Mpl受体25和31kd形 式所涉及的纯化步骤。

附图5表示用反相HPLC(RP-HPLC)纯化Mpl配体。组分21含有 高度纯化的31kd Mpl配体；组分22含有31kd和25kd Mpl配体；组 分23含有高度纯化的25kd Mpl配体。

附图6表示在含有25和/或31kd Mpl配体蛋白的反相HPLC(C4柱) 组分中，Mpl配体活性的比较。

附图7表示从CD34筛选的外周血细胞培养物中产生的巨核细胞的 数目，所述的外周血细胞用APK9，Mpl配体和各种其它因子刺激。

附图8表示从CD34筛选的外周血细胞培养物中产生的总白细胞的 数目，所述的外周血细胞用APK9，Mpl配体和各种其它因子刺激。

附图9表示在CD34筛选的外周血细胞培养物中产生的巨核细胞的 百分比，所述的外周血细胞用APK9，Mpl配体和各种其它因子刺激。

附图10表示人IL-3与Mpl配体诱导的巨核细胞发育无关。

附图11表示人MGDF-1和MGDF-2的cDNA和推测的氨基酸序列。

附图12表示人MGDF-3的cDNA和推测的氨基酸序列。

附图13表示来自犬源(A)和鼠源(B)的MGDF-1和MGDFs (Mpl配体)之间的比较。

附图14表示用单甲氧基-聚乙二醇的N-羟琥珀酰亚胺基 (NHS)活性酯酰化MGDF以得到多聚乙二醇化的产物的实例。

附图15是用单甲氧基-聚乙二醇醛进行非特异性还原烷基化 MGDF以得到多聚乙二醇化的产物的实例。

附图16是用单甲氧基-聚乙二醇醛进行N-末端残基的α-氨 基的位点特异性还原烷基化MGDF以得到基本上单聚乙二醇化的产物的 实例。

附图17表示用MW 20kDa MePEG的活化衍生物制备的MePEG- MGDF共轭物的筛析(SEC)HPLC分析。

A.用MePEG(PEG 11)的NHS酯通过MGDF酰化而制备的多-MePEG -MGDF共轭物，

B.用MePEG醛(PEG 20)通过MGDF烷基化而制备的多-MePEG- MGDF共轭物，

C.用MePEG醛(PEG 16)通过MGDF烷基化而制备的多-MePEG- MGDF共轭物。

附图18表示用重组人MGDF处理的小鼠的血小板计数：空心 (open)菱形＝CHO-衍生的22-353MGDF；空心圆＝未聚乙二醇化的 E.coli 22-184 MGDF(即，1-163 MGDF)；实心(closed)圆＝聚 乙二醇化的 E.coli 22-184 MGDF。

附图19表示r-HuMGDF的纯化流程图。

附图20表示在鼠卡铂(carboplatin)模型中，r-HuMGDF( E. coli 1-163)对血小板计数的影响。在0天，给Balb/c小鼠腹膜 内注射单剂量的卡铂(1.25mg/小鼠)。只注射赋形剂的组不接受卡 铂。24小时后，给卡铂-处理的动物每天皮下注射赋形剂或100ug/kg 的r-HuMGDF以进行以后的研究。(每组，n＝10；在每个时间点，饲 养5只动物)。

附图21表示在辐射处理的小鼠中，r-HuMGDF(E.coli 1-163) 对血小板计数的影响。在0天，用500拉德的γ-射线(铯源)辐射 Balb/c小鼠。只注射赋形剂的组不接受辐射。24小时后，给辐射处 理的动物每天皮下注射赋形剂或100ug/kg的r-HuMGDF以进行以后 的研究。(每组，n＝8；在每个时间点，饲养4只动物)。

附图22表示在辐射和卡铂结合处理的小鼠中，r-HuMGDF(E.coli 1-163)对血小板计数的影响。在0天，用500拉德的γ-射线(铯 源)辐射Balb/c小鼠并注射卡铂(1.25mg/小鼠)。24小时后， 给综合处理的动物每天皮下注射赋形剂或100ug/kg的r-HuMGDF以 进行以后的研究。没有r-HuMGDF支持，大多数动物在该研究中都不 能存活。在对照组中，8只动物中的1只存活。在处理组中，所有8 只动物全部存活。

附图23表示在恒河猴中，r-HuMGDF(E.coli 1-163)对辐射 诱导的血小板减少症的作用。使恒河猴经受辐射(700cGy Co-80)。 从辐射后24小时开始，连续18天皮下施用r-HuMGDF(n＝3)或 人血清白蛋白(n＝9)(各25ug/kg/天)。用电子血细胞分析仪 进行血细胞分析。每个符号代表平均值(+/-均值标准误差)。

附图24表示在卡铂和辐射处理的小鼠中，聚乙二醇化的和糖基 化的r-HuMGDF对血小板计数的影响。按照附图22所完成的研究的描 述，使小鼠经受卡铂和辐射结合处理。从损伤后24小时开始，每天皮 下注射按说明制备的r-HuMGDF(50ug/kg/天)。在指明的天数，用电 子细胞计数器(Sysmex，Baxter)取血细胞计数。

附图25表示含有 E.coli优选密码子的重组人MGDF，氨基酸1- 163的合成基因序列。

                      发明详述

一旦考虑了详细说明本发明实践的下列描述，那么，本发明的其 它方面和优点对于本领域专业人员来说是显而易见的。

本发明提供的新的哺乳动物巨核细胞生长促进，和/或血小板产 生因子(称为Mpl配体)是基本上不合其它蛋白类物质的均质蛋白质。 优选的，所述蛋白质无其它蛋白质，达到约90％，更优选的，无其它 蛋白质达到约95％，且最优选的，无其它蛋白质＞＝98％。经重组技 术可以生产这些蛋白质，以便能大量生产可用于治疗的纯的，活性的 Mpl配体。另外，从哺乳动物发育不良的血液，血浆或血清，或从分 泌或表达Mpl配体的哺乳动物细胞系中也可以得到均质的所述蛋白质。 此外，可以化学合成Mpl配体或其活性片段。

总的来说，本发明所用的“Mpl配体”是指本文公开的Mpl配体以 及下文更详细描述的其活性片段和变异体。

在非还原条件下，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)确定，来自犬源的两个优选Mpl配体的表观分子量为25kd和 31kd。这两种蛋白质均用下文实施例部分详细描述的方法纯化。因此， 例如这两个Mpl配体均结合小麦精外源凝集素并固定Mpl受体。25kd形 式包括下列氨基酸序列： Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu- Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro- Asp-Ile-Tyr(SEQ ID NO：1). 31kd形式包括下列氨基酸序列： Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu- Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His(SEQ ID NO：2). 在SEQ ID NOS：1和2中，“Xaa”氨基酸不是很肯定的，但预期是 Cys、Ser、Thr或(可能性很小)Try。

从上述序列可以看出，31kd配体含有至少部分25kd形式。具体 地说，31kd的前21个氨基酸与25kd蛋白质的完全相同。该证据，特 别是在本文的Mpl配体活性检测中，两种蛋白质均有活性的事实可以 得出这样的结论：这两种蛋白质从结构和活性上讲，是非常相近的。 可能该蛋白质的31kd形式与25kd的差异在于，C-末端序列不同， 糖基化不同，和/或编码该蛋白质之基因的拼接不同。

除上述序列信息外，在最后纯化步骤(用反相HPLC)前，于25kd 带定序期间，确定另一序列。发现在非还原条件，而不是还原条件下， 该序列与25kd带有关，这表明，它是25kd蛋白质裂解成两部分 (例如用蛋白酶)的结果，这两部分是通过二硫键连在一起的。该序 列是： Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-Ala- Val-Ala-Leu (SEQ ID NO：3)

尽管不清楚在25kd蛋白质序列中SEQ ID NO：3的精确位置， 但是与其它细胞因子，例如促红细胞生成素类比支持了在25kd蛋白 质氨基酸编号114的周围的可能性。应该指出，这是可能的，尽管未 证实，SEQ ID NO：3也在31kd蛋白质中，而且也可能从氨基酸编 号114周围开始。该序列的情况将在实施例7中进一步讨论。

综合上述，自从开始犬配体的纯化实验以来，已经克隆了编码犬 配体的基因。结果是已经确定该犬配体的全部氨基酸序列是列于FIG. 13A中的序列。以分子量计算为基础，预测25kd和31kd犬配体是 示于FIG.13A的全长配体的C-末端加工形式。另外，已经得到鼠 mMpl配体，序列示于FIG.13B。

所述纯化配体的特征是在实施例2的人巨核细胞检测中其比活性 为至少约5.7×109巨核细胞单位/mg。巨核细胞单位的定义是用在 实施例2描述的检测中，可以产生与1μl APK9标准对照一样多的巨 核细胞的物质的数量。

所述纯化的配体的特征还在于在实施例4的Mpl-依赖性细胞生 长检测中比活性至少为约6.9×109个细胞生长单位/mg。“细胞生 长单位”指在实施例4的检测中，使200 1A6.1细胞生长所需的配体 的数量。下列表1表示根据本发明制备的实际纯化之犬Mpl配体的活 性的其它特定计算值。

                       表1 Mpl                 1A6.1检测               人Meg检测 配体                (单位/mg)               (单位/mg) 31kd                6.52×109              5.7×109 25kd                10.5×109              14×109

总结上述资料，本发明的一些示例性的Mpl配体特征在于有下列 一种或多种生物化学和生物学特性：

(a)所述Mpl配体是从犬的发育不良的血浆中分离的；

(b)在非还原条件下，用12-14％十二烷基硫酸钠凝胶电泳 (SDS-PAGE)确定的所述Mpl配体的表观分子量约为25kd或31kd；

(c)该Mpl配体含有下列氨基酸序列：

对于25kd蛋白质来说是SEQ ID NO：1，

对于31kd蛋白质来说是SEQ ID NO：2，

(d)另外，Mpl配体还含有氨基酸序列SEQ ID NO：3(特别是对 于25kd蛋白质来说)；

(e)Mpl配体与小麦精外源凝集素结合；

(f)Mpl配体与固定化的可溶性鼠Mpl受体结合；

(g)可溶性Mpl受体体外可以抑制Mpl配体活性；和

(h)在pH为约8-9时，Mpl配体与阴离子交换柱结合。

本发明优选的Mpl配体的生物学活性通过其在实施例2的巨核细 胞生长促进检测中，特异性刺激巨核细胞生长和发育的能力来说明。 在该检测中，Mpl配体在8天的培养期间刺激人外周血CD34+(即通 过免疫吸附筛选的CD-34细胞)的分化。用特异性的抗-血小板抗原 抗体染色鉴定巨核细胞，然后显微计数。Mpl配体还刺激因子依赖性 细胞系，1A6.1的生长。不存在Mpl配体时，细胞会死亡。与Mpl配体 培养2天后，估测1A6.1细胞数。

上述Mpl配体有上述表1中所述的特异性活性。

已经确定Mpl的来源是发育不良哺乳动物的血液、血浆或血清。 但是，该配体源不限于所述的已知源并可以包括其它哺乳动物体液， 从中得到的细胞等。

从哺乳动物源纯化天然Mpl配体是以两个关键的纯化步骤为基础：

(a)外源凝集素亲和层析，优选的是使用小麦精凝集素；和

(b)固定化的Mpl受体亲和层析。

对蛋白质的进一步纯化来说，也可以包括其它步骤，例如，离子 交换层析，凝胶过滤层析，和反相层析。

从犬发育不良血浆获得Mpl配体的实际所用的纯化技术包括下列 步骤(见实施例7)：

(a)外源凝集素亲和层析(特别优选的是小麦精凝集素层析)；

(b)可溶性Mpl受体(Mpl-X)亲和层析(优选的是使用固定 化的鼠Mpl-X)；

(c)离子(阴离子或阳离子)交换层析(优选的是阳离子交换 层析；特别优选的是用Mono Q柱)：

(d)在离解条件下，凝胶过滤层析(优选的是用Superdex 200 加SDS)；和

(e)反相层析(优选的是用C-4柱)。

对发育不良血液，血清或血浆或哺乳动物Mpl配体的其它源(例 如细胞或组织源)使用上述纯化步骤，可以得到均质的哺乳动物Mpl 配体(包括人配体)。这些步骤并无特定的顺序，但所列的顺序是优 选的。培养可生产Mpl配体的细胞(或)组织源的方法是本领域专业 人员熟知的，并且可以采用，例如可以用来扩大起始物质的供给。

经重组技术也可以生产Mpl配体或其一个或多个肽片段。为了得 到特定Mpl配体的DNA序列，还原纯化的Mpl配体物质，并用蛋白酶 例如胰蛋白酶任选地消化。分离酶促后的片段并用常规技术测序。另 外，作为本文实施例中的举证，以可得到的蛋白质量为基础，可以将 完整的纯化蛋白质直接测序达到可能的程度，然后，在下列方法中类 似于测序的胰片段可以使用测序区。用遗传密码子合成寡核苷酸探针 以预测编码测序的片段氨基酸序列的所有可能的序列。优选的是，生 产数个简并序列作为探针。用这些探针鉴定Mpl配体基因以筛选哺乳 动物基因组文库或其它源。另外，可以用来自Mpl配体细胞源的mRNA 以得到用探针可筛选的cDNA文库，从而鉴定编码Mpl配体多肽的cDNA。 此外，用适宜的引物，可以用PCR技术扩增cDNA序列。

用这些探针筛选基因组文库，得到DNA克隆。为了得到全长的克 隆，可以用以得到的DNA序列为基础的探针再筛选文库并与全长Mpl配 体DNA序列杂交。

通过将全长人基因组克隆亚克隆到表达载体中，将其转染到COS 细胞中，从这些转染的COS细胞制备cDNA文库，通过杂交筛选Mpl配体 cDNA，也可以得到人Mpl配体的cDNA。一旦鉴定了完整的cDNA，便可 将其或其编码Mpl配体活性片段的任何部分导入各种表达载体的任一 之中以得到Mpl配体或其一个或多个片段的表达系统。

通过使用重组技术，得到了编码Mpl配体多肽的优选DNA序列。本 发明还包括这些DNA序列，它们不含编码其它蛋白质的DNA序列(即是 分离的)，但编码有Mpl配体活性(例如巨核细胞生长和/或发育)之 Mpl配体多肽的表达。这些DNA序列包括编码所有或一个Mpl配体片段 的那些序列和优选的，在严格条件下与cDNA序列杂交的那些序列(参 见，T.Maniatis et al.， Molecular Cloning(A laboratory Manual)；Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，p387-389)。

举例性的严格的杂交条件是于62-67℃在4×SSC中杂交，然后 于62-67℃用0.1×SSC洗涤约1小时。另外，举例性的严格的杂交 条件是于40-45℃在45-55％甲酰胺，4×SSC中杂交。

在松弛的杂交条件下与Mp 配体序列杂交并编码具有Mpl配体生 物学特性之Mpl配体肽的DNA序列也编码本发明的新的Mpl配体多肽。 所述的松弛严格杂交条件例如是4×SSC，40-45℃。或在40-45℃ 用30-40％甲酰胺杂交。例如，与Mpl配体之序列有显著同源性区域 (例如糖基化或二硫键合位点)，且编码有一种或多种Mpl配体生物 学特性的DNA序列明显编码Mpl配体多肽，即使所述的DNA序列并不能与Mpl 配体序列严格杂交。

本发明也包括编码Mpl配体肽的DNA序列的等位变异体(在种群中 天然发生的碱基改变，这种改变可以或不会导致氨基酸的改变)，还 包括其类似物或其衍生物。类似地，本发明还包括编码Mpl配体多肽 但在密码子使用上不同的DNA序列，所述的密码子使用上的不同是由 于遗传密码的简并性或由为提高活性、半衰期或由其编码之多肽的产 生而进行的点突变或诱导修饰而引起的Mpl配体DNA序列的变异。

采用下文实施例11所述的克隆方法，产生本文公开的人蛋白质 MGDF-1、MGDF-2、MGDF-3的氨基酸和cDNA序列。MGDF-1是图11所示 的氨基酸22-353并含有332个氨基酸。MGDF-2是MGDF-1的截断的部 分，如图11中所示的氨基酸22-195。因此MGDF-2含有174个氨基酸。 MGDF-3是图12所示的氨基酸22-286，含有265个氨基酸。在本文公 开的每个MGDF中，包括信号肽的分子，在图11和12中是氨基酸1-21， 也是本发明多肽的一部分，但优选的是除去该部分以表现巨核细胞生 长和发育活性。总之，MGDF 1-3定义如下：

MGDF-1    氨基酸    22-353    图.11

MGDF-2    氨基酸    22-195    图.11

MGDF-3    氨基酸    22-286    图.12。

在本文的试验中，MGDF-1和MGDF-2是有活性的，而MGDF-3 没有活性。

以本文所列的活性为基础，假设在体内，人MGDF是以含有可变的 C-末端氨基酸之基本无活性或活性较低的前体多肽而被表达的。在 裂解了C-末端氨基酸(以及信号肽)后，分子的加工形式保留了活 性或变得活性更高。从上述假设看，为了表现出其活性，认为MGDF -1需要加工(例如，用蛋白酶裂解)。MGDF-1的截断形式(MGDF -2)具有活性的事实支持了该假设。

在下文实施例4的细胞检测中，来自用MGDF-1基因转染的人肾 293细胞(Invitogen)的条件培养基有活性。另一方面，在其它细胞 系，例如，32 D细胞中，该分子没有活性。假设这意味着293细胞可 以加工MGDF-1分子，可能通过截断，以致于主要产生活性的该分子 是一种截断形式，而32 D细胞不能加工该分子。

从上述假设看，截断上述MGDF-1序列(图11)可产生不同的活 性分子。在细胞因子家族，例如促红细胞生成素(EPO)中，保守的 结构特征包括四个α-螺旋群和四个Cys。对于MGDF-1序列，Cys 172是这些进化保守和功能必需结构中最重要的C-末端元素。因此， 优选的MGDF-1截断变异体是含有氨基酸173-353(与信号肽裂解一 起)C-末端截断的任何分子。优选的，MGDF-1序列除去了其C-末 端的50-185位氨基酸，特别优选的是从C末端除去了90-172位氨基 酸。按本文公开的，认为信号肽是21个氨基酸长；但是，基于MGDF-1 序列，信号肽可以有23个氨基酸。因此，还特别包括对应于本文所列 的，但从图11或12的位置24开始的多肽。

下列是特别优选的可有活性(即，促进巨核细胞/或血小板生长 的能力；或对天然受体的抑制/刺激能力)的MGDF-1变异体：

MGDF-4    氨基酸  22-172    图11

MGDF-5    氨基酸  22-177    图11

MGDF-6    氨基酸  22-191    图11

MGDF-7    氨基酸  22-198    图11

MGDF-8    氨基酸  22-265    图11

MGDF-11   氨基酸  22-184    图11

在一些克隆中，不存在MGDF-1序列中的氨基酸133-136，以致 于相应于上述，但其中丢失了这些氨基酸(C末端氨基酸数有4个的 差异)的序列也是有活性的。

在一个克隆中，在位置192有一个终止密码子，发现在图11中的 位置191上Ala残基代替了Thr残基。因此，本发明包括在位置191上Ala 代替了Thr的MGDF变异体分子。

由于该序列是在序列中的第5外显子内拼接的，所以，MGDF一3 是由除去本文所称的IVS-5(间插序列-5)序列而产生的。由于 IVS-5的5′末端在密码子内，因此它的除去会在剩余的MGDF序列 中产生框移，在MGDF-3的位置160到分子的末端均可以发生。

在转染到293细胞中并在实施例4的以细胞为基础的检测中检测 了所得条件培养基的活性后发现MGDF-3本身没有活性。显然，与 MGDF-1不同，293细胞不能将MGDF-3加工成活性形式。但是，基于 与MGDF-1有关的上述截断假设，截断MGDF-3的C末端氨基酸可能也 会产生活性。例如，截断MGDF-3的C末端的40-102氨基酸可能产 生活性。优选的，除去50-90氨基酸。两个特别优选的MGDF-2变异 体是：

MGDF-9  22-179    图12

MGDF-10 22-190    图12

在本文公开的所有Mpl配体中，包括上述举例的MGDF，在其N- 末端可以有甲硫氨酰残基，特别是当在细菌宿主中表达所述的多肽时。

通过已知的常规化学合成方法，也可以产生Mpl配体多肽。用合 成方法构建本发明多肽的方法是本领域专业人员熟知的。依据与Mpl 配体多肽共有的一级、二级或三级结构和构型特征，合成构建的Mpl 配体多肽可以具有与此共有的Mpl配体生物学特性。因此，在治疗和 免疫过程中，可以用它们作为生物学活性或免疫取代物取代天然的、 纯化的Mpl配体多肽。

本领域专业人员用已知按术，可以修饰肽或编码Mpl配体的DNA 序列。在Mpl配体中的所需修饰可以包括编码序列中的所选氨基酸残 基的取代、插入或缺失。用于所述取代、插入或缺失的诱变技术是本 领域专业人员熟知的(参见，U.S.专利4,518,584)。在1-20氨基 酸中的保守改变是优选的。优选的肽可以通过蛋白水解酶，或直接的 化学合成得到。本发明Mpl配体多肽和多核苷酸的含义包括所述的变 异体。

Mpl配体多肽序列的特定突变可能涉及糖基化位点(例如，Ser， Thr，或Asn)的修饰。没有糖基化或只有部分糖基化是由于在任何 Asn-连接的糖基化识别位点或在通过加入O-连接的碳水化合物修 饰的分子的任何位点的取代或缺失而引起的。Asn-连接的糖基化识 别位点包括由适宜的细胞糖基化酶特异识别的三肽序列。这些三肽序 列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中，Xaa可以是除Pro以外的 任何氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三中的一个或两个氨基酸 位置上不同氨基酸的取代或缺失(和/或在第二位置上的氨基酸缺失) 导致修饰三肽序列的非糖基化。所述改变核苷酸序列的表达得到在此 位点非糖基化的变异体。 MGDF的其它类似物/衍生物

本领域专业人员用本文公开的方法，也可以制备可以保留全部或 部分MGDF(Mpl配体)活性的MGDF(Mpl配体)序列的其它类似物和衍 生物。本发明也包括所述的修饰物。

更具体地说，本发明还包括化学修饰的MGDF组合物以及制备和使 用它们的方法。本发明公开的内容表明，可以修饰MGDF并提高其特性。

一方面，本发明涉及一种MGDF产物，它含有与至少一种水溶性聚 合物部分相连的MGDF产物。

另一方面，本发明涉及一种MGDF产物，其中所述MGDF蛋白质与至 少一个聚乙二醇分子相连。

另一方面本发明涉及经一酰基或烷基键与至少一个聚乙二醇分子 相接的MGDF分子。

通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应，可以完成MGDF的聚乙二 醇化。参见例如： Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)； EP 0 154 316；EP 0 401 384；以及涉及聚乙二醇化的本文公开的其 它文献。优选的，用有反应性的聚乙二醇分子(或类似反应性的水溶 性聚合物)经酰基化反应或烷基化反应完成聚乙二醇化。现在，更详 细地讨论用聚乙二醇衍生的这些优选方法。 酰基化

通过酰基化的聚乙二醇化通常涉及聚乙二醇(PEG)的活性酯衍 生物与MGDF蛋白质反应。可以用任何已知或随后发现的反应性PEG分 子完成MGDF的聚乙二醇化。优选的活化的PEG酯是进行N-羟琥珀酰 亚胺(“NHS”)酯化的PEG。如本文所用的，“酰基化”非限定性地 包括在MGDF和水溶性聚合物如PEG之间的下列类型的键：酰胺、氨基 甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。参见 Bioconjugate Chem.5：133-140 (1994)。可以从聚乙二醇化领域已知的或随后研制的任何反应条件 中选择反应条件，但是应避免使待修饰的MGDF失活的条件，例如，温 度、溶剂和pH。下文将讨论通常使MGDF聚乙二醇化的反应条件。在图 14中描述了与单甲氧基PEG的NHS酯的举例性反应。

经酰基化的聚乙二醇化通常会产生多-聚乙二醇化的MGDF产物， 其中赖氨酸ε-氨基经酰基连接键而被聚乙二醇化。优选的，连接键 是酰胺。优选的还有，所得的产物基本上只是(例如，＞＝95％)单， 二，三-聚乙二醇化的。但是，依据所用的特定反应条件一般会形成 一定数量的一些有较高聚乙二醇化程度(直到最大数目的MGDF Lys ε-氨基酸基团加上一个在MGDF氨基末端的α-氨基)的种类，如果 需要，用标准纯化技术(包括透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝 胶过滤层析和电泳)可以从混合物中分离更纯的聚乙二醇化种类，特 别是未反应的种类。 烷基化

通过烷基化的聚乙二醇化通常涉及在还原剂存在的条件下，PEG 的末端醛衍生物与蛋白质例如MGDF的反应。与上述讨论的酰基化一样， 反应条件描述如下。

经烷基化的聚乙二醇化也可以得到多-聚乙二醇化的MGDF。在图 15中列出了为得到多聚乙二醇化产物的举例性的与MGDF的还原性烷基 化反应。另外，人们可以控制本文的反应条件以有利于基本上只在 MGDF-末端α-氨基上聚乙二醇化(即单聚乙二醇化种类)。在图 16中列出了举例性的与MGDF的还原性烷基化反应，以得到单聚乙二 醇化的产物。在单聚乙二醇化或多聚乙二醇化的情况下，PEG基团优 选的经-CH2-NH-基与蛋白质相接。特别对于-CH2-基，本文将 该类型的键称为“烷基”键。

经还原性烷基化的衍生作用得到单聚乙二醇化的产物，它利用了 MGDF衍生中不同类型一级氨基(Lys对N-末端)的不同反应性。反应 在一定的pH(见下文)下完成的，所述的pH使人们可以利用Lys残基 的ε-氨基和蛋白质N-末端残基的α-氨基之间pKa的差异。用所 述的选择性衍生作用，可以控制含有反应性基因(例如醛)的水溶性 聚合物与蛋白质的连接：与聚合物的共轭主要发生在蛋白质的N-末 端，而对其它反应性基团(例如Lys侧链氨基)没有发生明显的修饰。 在一个重要的方面，本发明提供了基本上均质的单聚合物/MGDF蛋白 质共轭物分子(意思是聚合物分子基本上仅在一个位置(即＞＝95％) 连接的MGDF蛋白质)的制品。更具体地说，如果使用聚乙二醇，本发 明还提供了可能缺乏抗原连接基团，但是具有与MGDF蛋白质直接结合 的聚乙二醇分子的聚乙二醇化的MGDF蛋白质。

因此，在优选的方面，本发明涉及聚乙二醇化的MGDF，其中PEG 基经酰基或烷基连接。按上述讨论的，所述产物可以是单聚乙二醇化 或多聚乙二醇化(例如，含有2-6，优选的2-5个PEG)的。通 常在氨基酸的α或ε氨基位置上PEG与蛋白质相接，但是，PEG基也 可以考虑与蛋白质上任何氨基相接，所述的氨基有足够反应性以便在 适宜的反应条件下与PEG基相接。

从水溶性聚合物或其混合物中，可以选择在酰基化和烷基化方法 中所用的聚合物分子。所选的聚合物应是水溶性的，以便它所相接的 蛋白质在含水环境(例如生理环境)中不会沉淀。应修饰所选的聚合 物以使其具有一个反应基团，例如适于酰基化的一个活性酯或适于烷 基化的一个醛，优选地以便按本发明提供的方法控制聚合的程度。优 选的反应性PEG醛是水溶性的聚乙二醇丙醛或其单C1-C10烷氧或芳氧 基衍生物(见美国专利5,252,714)。聚合物可以是带侧链或不带侧 链的。优选的，对于末端产物制品的治疗用途来说，聚合物是药物可 接受的。水溶性聚合物可以选自例如，聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、 葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚 环氧烷/环氧乙烷共聚物、聚氧化乙烯化的多元醇(如，甘油)和 聚乙烯醇。对于酰基化反应来说，所选的聚合物应有一个反应性酯基。 对于本发明的还原性烷基化来说，所选的聚合物应有一个醛基。通常， 不从天然存在的糖基残基中选择水溶性聚合物，原因在于，这些常常 更常规地是由哺乳动物重组表达系统制备的。聚合物可以是任何分子 量的，并且可以是带侧链或不带侧链的。

本发明所用的特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇，缩写为PEG。 如本文所用使的，聚乙二醇是包括用于衍生其它蛋白质的任何形式的 PEG，例如，单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。

如本文所使用的，MGDF包括本文所述的任何各种形式的MGDF。例 如，全长或截断的，糖基化的或非糖基化形式的MGDF均包括在内。下 列是将被衍生的优选的MGDF分子(在每种情况下，数字指根据图11 的氨基酸编号)：

MGDF-1    氨基酸    22-353    图11

MGDF-2    氨基酸    22-195    图11

MGDF-4    氨基酸    22-172    图11

MGDF-11   氨基酸    22-184    图11

MGDF-12   氨基酸    27-353    图11

MGDF-13   氨基酸    27-195    图11

MGDF-14   氨基酸    27-172    图11

MGDF-15   氨基酸    27-184    图11

上述优选的种类可以是糖基化的、非糖基化的或去糖基化的，优 选是非糖基化的。可以用细菌(例如， E.coli)或哺乳动物(例如， CHO)细胞重组产生。

下列是本发明化学衍生化分子特别优选的一组(在每种情况下， 它们是经酰基或烷基相接的单-或多-(例如，2-4个)PEG部 分)：    

聚乙二醇化的  MGDF-11

聚乙二醇化的  MGDF-4

聚乙二醇化的  MGDF-2。

通常，化学衍生作用可以在用于使生物活性物质与活化的聚合物 分子反应的任何条件下完成。制备聚乙二醇化MGDF的方法通常包括步 骤(a)在MGDF可与一个或多个PEG基相连的条件下，将MGDF多肽与聚 乙二醇(例如，PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，和(b)获得反应 产物。一般地说，以已知的参数和所需的结果为基础，逐个确定酰基 化反应的最佳反应条件。例如，PEG：蛋白质比例越大，多聚乙二醇 化产物的百分比越大。

生产基本上均质的单-聚合物/MGDF蛋白质共轭物分子群的还原 性烷基化通常含有以下步骤：(a)在还原烷基化条件下，在使所述 MGDF蛋白质氨基末端的α-氨基选择性修饰的pH下，将MGDF蛋白质与 反应性PEG分子反应；和(b)得到反应产物。

对于基本上均质的单-聚合物/MGDF蛋白质共轭物分子群，还原 性烷基化反应条件是使水溶性聚合物部分与MGDF之N-末端选择性连 接的条件。所述的反应条件通常给出Lys氨基和N-末端α-氨基之 间的pKa差异(pKa是50％氨基质子化，50％未质子化的pH)。pH还影 响聚合物与所用蛋白质的比例。通常，如果pH较低，就需要较大过量 的聚合物：蛋白质比(即，反应性N-末端α-氨基越少，为得到最 佳条件所需的聚合物越多)。如果pH较高，聚合物：蛋白质比就不需 太大(即，反应性基团越多，所需的聚合物分子越少)。对于本发明 的目的来说，pH一般在3-9，优选的3-6的范围内。

另一重要的考虑是聚合物的分子量。通常，聚合物的分子量越大， 可连接到蛋白质上的聚合物分子数越少。相似的，在优化这些参数时， 应考虑聚合物的分支情况。一般地说，分子量越大(或分支越多)， 聚合物：蛋白质比例越高。总之，对于本文的聚乙二醇化反应来说， 优选的平均分子量是约2kDa至约100kDa(术语“约”是指±1kDa)。 优选的平均分子量是约2kDa到约50kDa，特别优选的是约12kDa到 25kDa。水溶性聚合物与MGDF蛋白质的比例一般为1∶1到100∶1， 优选的是(对于多聚乙二醇化来说1∶1到20∶1和(对于单聚乙二 醇化来说)1∶1到5∶1。

使用上述条件，还原性烷基化将会使聚合物与任何在氨基末端有 α-氨基的MGDF蛋白质选择性相连，并且提供基本上均质的单聚合物 /MGDF蛋白质共轭物制品。本文所用的术语“单聚合物/MGDF蛋白质 共轭物”是指一种组合物，它含有一个与MGDF蛋白质分子相连的聚合 物分子。单聚合物/MGDF蛋白质共轭物优选的在N-末端有一个聚合 物分子，但在Lys氨基侧基上没有。该制品优选的有大于90％的单聚 合物/MGDF蛋白质共轭物，更优选的为大于95％的单聚合物/MGDF蛋 白质共轭物，其余的是未反应的可观察量的分子(即没有聚合物部分 的蛋白质)。下列实施例提供至少为约90％的单聚合物/MGDF蛋白质 共轭物和约10％未反应的蛋白质的制品。单聚合物/MGDF蛋白质共轭物 有生物活性。

对于本发明的还原性烷基化来说，还原剂在水溶液中应是稳定的， 并且优选的是仅还原在还原性烷基化开始时形成的Schiff碱。优选的 还原剂可以选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲 硼烷和吡啶甲硼烷。特别优选的还原剂是氰基硼氢化钠。

其它反应参数，如溶剂、反应时间、温度等以及纯化产物的方法 可以基于公开的与蛋白质与水溶聚合物衍生有关的资料来逐个确定 (参见本文引述的文献)。在下列实施例部分，给出了详细的举证。

可以通过酰基化和/或烷基化方法来选择制备聚合物/蛋白质共 轭物，而且本文所提供的优点就是可以选择在混合物中所含的单聚合 物/蛋白质共轭物的比例。因此，如果需要，可以制备具有不同数目 (即，二-，三-，四，等)的相连的聚合物分子的不同蛋白质的混 合物并且与用本发明的方法制备的单聚合物/蛋白质共轭物结合，而 且有具有预定比例的单聚合物/蛋白质共轭物。

下文的实施例描述了经酰基化和烷基化的化学修饰的MGDF制品和 聚乙二醇化的MGDF制品。因此，本发明的其它方面涉及这些制品。

通常，通过施用本发明的聚合物/MGDF可以减轻或调节的病症包 括上述一般有关MGDF分子的那些病症。但是，本文公开的聚合物/ MGDF分子与非衍生的分子相比，还可以有其它活性，提高的或降低的 活性，或其它特征。

本发明另一方面还提供了含有上述化学修饰的MGDF分子的药物组 合物。所述的药物组合物可以含有有关非衍生MGDF分子的本文所述的 任何成分。

随着进一步的研究，会提供在不同患者中治疗不同病症的适当剂 量水平，而本领域专业人员根据治疗内容，受者的年龄和一般健康情 况可以确定适当的剂量。一般来说，剂量在0.01μg/kg体重(只计 算蛋白质的质量，而不考虑化学修饰物)到300μg/kg(以相同的方 法计算)之间。优选的剂量通常是5μg/kg体重到100μg/kg体重之 间，特别优选的是10μg/kg体重到75μg/kg体重之间。

本发明还提供生产MGDF(即，Mpl配体)多肽或其活性片段的 方法。本发明的方法之一涉及将编码Mpl配体多肽的cDNA导入表达 载体以得到Mpl配体的表达系统。用载体转染所选的宿主细胞，然后 培养。因此本发明的方法包括培养适宜的细胞或细胞系，所述的细胞 或细胞系已用表达时编码Mpl配体多肽的DNA序列转染，所述的表达在 已知调节序列的控制下。调节序列包括启动子片段，终止子片段和在 适当的宿主细胞中指导/控制蛋白质表达的其它适宜的序列。然后通 过本领域专业人员熟知的适当方法从培养基(或细胞，如果是细胞内 表达)中回收，分离并纯化表达的因子。另外，也可以用US专利 5,272,071中公开的方法得到本发明的聚核苷酸/多肽。

适宜的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细 胞(CHO)或3T3细胞。适宜哺乳动物宿主细胞的选择、和转化、培养、 扩增、筛选以及产物产生和纯化方法是本领域熟知的(参见例如， Gething and Sambrook， Nature 293：620-625(1981)，或Kaufman et al.， Mol.Cell.Biol.，5(7)：1750-1759(1985)或Howley et al.， U.S.专利4,419,446)。其它适宜的哺乳动物细胞系是猴COS-1和 COS-7细胞系和CV-1细胞系。其它的宿主细胞实例包括灵长目细胞 系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。正常的二倍体细胞，原始组 织体外培养衍生的细胞株，以及原始移出物均是适宜的。候选细胞可 以对于所选的基因是基因型缺陷的或可以含有显性作用的选择基因。 其它适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa、小鼠L-929细胞、得 自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系，BHK或HaK仓鼠细胞系。

本发明中类似适用的宿主细胞是细菌细胞。例如，在生物技术领 域作为宿主细胞已知的各种 E.coli菌株(例如，HB101、DH5α、DH10 和MC 1061)。在该方法中也可以使用枯草芽孢杆菌、假单孢菌属、 其它杆菌属、链球菌属等的各种菌株。

也可以用本领域已知的许多酵母细胞菌株作为宿主表达本发明多 肽。另外，如果需要，在本发明的方法中也可以使用昆虫细胞作为宿 主。(参见，Miller et al.， Genetic Engineering 8：277-298(1986) 和其中引述的参考文献)。

本发明还提供用于表达新的Mpl配体多肽的方法中的重组分子或 载体。这些载体含有Mpl配体DNA序列并且只含有该序列或该序列和编 码本发明Mpl配体多肽(带或不带信号肽)或其活性片段的其它序列 的结合。另外，掺入上述修饰序列的载体也是本发明的实施方案，而 且在生产Mpl配体多肽中是有用的。本发明方法所用的载体还含有与 本发明DNA编码序列有效结合的并且能够指导其在所选的宿主细胞中 复制并表达的所选的调节序列。

一种载体是pXM，特别适用于在COS细胞中表达(Y.C.Yang et al.， Cell 47：3-10(1986))。特别适于在哺乳动物细胞(例如，CH0细 胞)中表达的另一载体是pEMC2B1。用本领域专业人员熟知的技术可 以合成本文描述的哺乳动物细胞表达载体。用已知方法可以从天然来 源得到或合成载体的组分(例如，复制子，选择基因，增强子，启动 子等)。(参见Kaufman et al.， J.Mol.Biol.159：511-521(1982)； 和Kaufman  Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：689-693(1985))。另 外，载体DNA可以包括全部或部分的牛乳头病毒基因组(Lusky et al.， Cell 36：391-401(1984))并在细胞系如C127小鼠细胞中作为稳定的 附加基因元件复制。这些载体转染到适宜的宿主细胞中后，就可以表 达Mpl配体多肽。

也可以将本领域已知的用于哺乳动物、昆虫、酵母、真菌和细菌 表达的许多其它适宜的表达载体用于该目的。

用本发明方法和组合物治疗的病症是出现巨核细胞/血小板缺乏 或将来预期会巨核细胞/血小板缺乏(例如因计划的手术)的那些病 症。所述病症一般是体内活性Mpl配体缺乏(暂时性或永久性)的 结果。血小板缺乏的一般术语是血小板减少症，因此本发明的方法和 组合物一般用于治疗血小板减少症。

血小板减少症(血小板缺乏)可以因各种原因而存在，包括化疗 和用各种药物的治疗、辐射治疗、外科手术、偶然失血以及其它的特 别疾病。与血小板减少症有关并且可以根据本发明进行治疗的举例性 的具体疾病是：再生障碍性贫血、突发性血小板减少症、导致血小板 减少症的转移瘤、全身的红斑狼疮、脾大、Fanconi氏综合症、维生 素B12缺乏症、叶酸缺乏症、May-Hegglin异常、Wiskott-Aldrich 综合症和阵发性夜间血红蛋白尿。爱滋病的某些治疗也会导致血小板 缺乏症(例如，AZT)。某些伤口愈合紊乱也会因血小板数的增加而 受益。

对于预期的血小板减少症，例如，由于未来的手术，可以在需要 血小板的数天或数小时前施用本发明的Mpl配体。对于紧急情况，例 如偶然并且大量的失血，可以与血液或纯化的血小板一起施用Mpl配 体。

如果发现某些细胞类型表达Mpl受体，则本发明的Mpl配体在刺激 某些细胞类型而不是巨核细胞方面也会有用。本发明也包括与表达 Mpl受体的所述细胞有关的病症，所述病症对Mpl配体的刺激敏感。

在本文所列的活性检测中本身没有活性的MGDF分子可以作为体外 或体内Mpl受体的调节剂(例如抑制剂或刺激剂)。

在治疗上述疾病时，可以将本发明的多肽单独使用或与其它细胞 因子、可溶的Mpl受体、造血因子、白细胞介素、生长因子或抗体结 合使用。

因此，本发明的另一方面是用于治疗上述病症的治疗组合物。所 述的组合物含有治疗有效量的Mpl配体多肽或其治疗有效量的其片段 以及药物学可接受的载体。载体物质可以是用于注射的水，优选的用 溶液剂中常用的其它物质补充以施用于哺乳动物。典型的，以组合物 的形式进行Mpl配体治疗，所述的组合物含有纯化的蛋白质和一种或 多种药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。中性的缓冲盐或与血清 白蛋白混合的盐是适宜的载体实例。优选的，用适宜的赋形剂(例如， 蔗糖)将产物配制成冻干产品。按需要也可以包括其它的标准载体， 稀释剂和赋形剂。其它的举例性组合物是Tris缓冲液(pH8.0)和乙 酸盐缓冲液(pH5.0)，在每种情况下还可以包括山梨醇。

可以不经肠道全身施用本发明组合物。另外，可以经静脉内或皮 下施用该组合物。当全身施用时，本发明所用的治疗组合物可以是无 热源的，非肠道可接受的水溶液。适当考虑pH、等渗性、稳定性的所 述药物学可接受的蛋白质溶液的制备方法包括在现有技术之内。

在治疗所述疾病时涉及的剂量范围由主治医生考虑改变药物作用 的各种情况(例如，患者的年龄，病症，体重，性别和饮食，感染的 严重性，给药的时间和其它临床因素)来确定。通常，每天的范围应 在每公斤体重0.1-1000μg Mpl配体蛋白质或其片段。

在治疗除了血小板缺乏外，还以其症状为特征的疾病时，可以将 本发明的治疗方法，组合物和多肽单独使用或与其它细胞因子、可溶 的Mpl受体、造血因子、白细胞介素、生长因子或抗体结合使用。预 期Mpl配体分子与一般的造血刺激剂(例如IL-3或GM-CSF)结合， 在治疗某些形式的血小板减少症时是有用的。其它巨核细胞刺激因子 (即meg-CSF)、干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、制 瘤素M(OSM)或有巨核细胞刺激活性的其它分子也可以与Mpl配体一 起使用。用于所述共施用的举例性细胞因子或造血因子包括IL-1α、 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激 因子(CSF-1)、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、 α-干扰素(IFN-α)、IFN-β或IFN-γ。还可以同时或依次施 用有效量的可溶的哺乳动物Mpl受体，一旦巨核细胞达到成熟形式， 所述的受体似乎可以使巨核细胞断裂成血小板。因此，预期施用Mpl 配体(以增加成熟巨核细胞的数目)，然后施用可溶的Mpl受体(以使 配体失活，然后使成熟的巨核细胞生产血小板)是刺激血小板生成特 别有效的方法。可以调整上述的剂量以补偿治疗组合物中的所述其 它组分。用常规方法可以监测接受治疗患者的改善情况。

这些新多肽的其它用途是研制通过标准方法产生的抗体。因此， 也考虑了与本发明Mpl配体反应的抗体以及所述抗体的反应性片段。 抗体可以是多克隆的、单克隆的、重组的、嵌合的、单链和/或双特 异性的等。抗体片段可以是对本发明Mpl配体有反应性的任何片段， 例如，Fab、Fab′等。本发明还提供了杂交瘤，即通过已知技术，将 Mpl配体或其片段作为抗原提供给所选的哺乳动物，然后将动物细胞 (例如，脾细胞)与某些癌细胞融合以产生不死的细胞系，这些产生 杂交瘤。本发明还包括用于产生所述细胞系的方法以及抗全部或部分 人Mpl配体多肽的抗体。

抗体可用于治疗，例如抑制Mpl配体与其受体的结合。还可以将 所述抗体用于体内和体外诊断目的，例如用标记形式检测体液中的 Mpl配体。

用下列实施例更详细地说明本发明。另外，这些实施例提供了本 发明优选的实施方案，但不限定其范围，除非特别说明。在下列实施 例中所述许多过程中的标准方法或适宜的改变的方法在许多熟知的分 子生物学手册中均有，例如，Sambrook et al.， Molecular Cloning， Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987) 和Ausubel et al.，(Eds)， Current Protocols in Molecular Biology，Greene associates/Wiley Interscience，New York (1990)。

                      实施例1

                  营养不良的犬血浆

按下列文献，除给受试对象使用450拉德的全体辐射外，制备肝 素化营养不良的犬血浆(“APK9”)或正常犬血浆(“NK9”)： 1 Mazur，E.and South，K. Exp.Hematol.13：1164-1172(1985). 2 Arriaga，M.，South，K.，Cohen，J.L.，and Mazur，E.M。 Blood   69：486-492(1987)。 3 Mazur，E.，Basilico，D.，Newton，J.L.Cohen，J.L.，Charland，C.   Sohl，P.A.，and Narendran，A. Blood 76：1771-1782(1990).

                      实施例2

                   人巨核细胞试验

试验APK9和分离的APK9刺激来自CD34+祖代细胞之人巨核细胞发 育的能力。按所述方法(Hokom，M.H.，Choi，E.，Nichol，J.L.， Hornnkohl，A.，Arakawa，T，and Hunt，P. Molecular Biology of Haematopoiesis 3：15-31，1994)从外周血细胞中分离CD34-选择 的细胞，然后在下列培养基中培养：用1％谷氨酰胺Pen-strep (Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和10％肝素化的贫血小板， 人AB血浆补充的Isocove′s改性的Dulbecco′s培养基(IMDM；GIBCO， Grand Island，NY)。该培养基还包括2-巯基乙醇(10-4M)、丙 酮酸(110μg/ml)、胆固醇(7.8μg/ml)、腺苷、鸟苷、胞苷、 尿苷、胸苷、2-脱氧胞苷、2-脱氧腺苷、2-脱氧鸟苷(各10 μg/ml，Sigma)；人重组胰岛素(10μg/ml)、人转铁蛋白(300 μg/ml)大豆脂类(1％，Boehringer Mannheim，Indianapolis， IN)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(2ng/ml，Genzyme，Cambrdge， MA)；人重组表皮生长因子(15ng/ml)，血小板衍生的生长因子 (10ng/ml，Amgen，Inc.，Thousnd Oaks，CA)。将CD34-选择的 细胞以2×105/ml培养基，终体积为15μl，放在Terasaki-型微滴 定板(Vanguard，Inc.，Neprune，NJ)中。将细胞在保湿箱的5％ 二氧化碳气中于37℃培养8天，用1％戊二醛直接固定在培养孔中， 与单克隆抗体混合物(抗-GPIb，抗-GPIIb，(Biodesign)和抗- GPIb(Dako，Carpinteria，CA))一起温育。用链霉抗生物素蛋白- β-半乳糖苷酶检测系统(HistoMark，Kirkegaard and Perry)使 免疫反应显色。为蓝色的巨核细胞以100X用反相显微镜计数。结果表 示为每孔的巨核细胞数平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。在 某种情况下，用“巨核细胞单位/ml”表示数据，将待测样品诱导巨 核细胞发育的程度表示为该实验的阳性APK 9对照。一个单位定义为 与1μl APK 9标准产生相同数目巨核细胞的物质的量。如果可用 5-10ug/ml MPL-X(可溶的Mpl受体)阻断Mpl配体，那么活性 被认可。

已经表明APK9含有在该系统中刺激人巨核细胞发育的因子。与 10％NK9温育8天的CD34-选择细胞只有可忽略数量的蓝色巨核细胞， 而与10％ APK9温育3天的CD34-选择细胞有大量蓝色的巨核细胞。

图2表明将浓度逐渐增加的MPl-X加到人巨核细胞培养系统中后， 对巨核细胞发育的阻断逐渐增加。Mpl-X浓度大于5μg/ml时，完 全抑制。在该实验中，用5％ APK9刺激CD34-选择细胞。这表明与 Mpl-X(假设的Mpl配体)相互作用的活性对于人巨核细胞发育是必 需的，而且意味着在APK9中存在Mpl配体。

本文还进一步指出，在APK9中存在对于人巨核细胞发育必需的 Mpl配体活性。将APK9(135ml)在Iscove′s培养基中稀释6倍，然后 用于Mpl-X亲和柱。收集未结合的物质(流出)，在检测前，浓缩到 原体积。用10ml 1M的NaCl洗脱结合的物质，透滤20％的收集物，浓 缩4倍用于检测。单独在培养基中培养的CD34-选择细胞并未发育成 巨核细胞。在5％APK9(与用于柱的收集物相同)中温育的细胞发育 成每孔48+/-8巨核细胞。与10％未结合物质温育的细胞未发育成巨核 细胞。与10％洗脱收集物温育的细胞发育成每孔120+/-44巨核细胞。 在检测中，用5μg/ml Mpl-X基本上完全抑制柱载样和洗脱收集 物的活性。

                      实施例3

           将鼠或人Mpl受体转染到鼠细胞系中 A    鼠Mpl受体

将全长鼠Mpl受体cDNA亚克隆到含有转录启动子的表达载体中， 所述的启动子得自Moloney鼠肉瘤病毒的LTR。将5μg的该构建体和 1μg的选择标记质粒pWLNeo(Stratagene)共电穿孔(co-electroporated) 到IL-3依赖的鼠细胞系中(32D，克隆23；Greenberger et al.， PNAS 80：2931-2936(1983))。将细胞培养5天以从过程中回收， 然后在含800ug/ml遗传霉素(G418，Sigma)和1ng/ml鼠IL-3的 选择培养基中培养。将存活的细胞分成2×105细胞的池，然后培养 直到长出可用于进一步分析的群体。用多克隆兔抗肽血清通过FACS分 析检测6个群体Mpl受体的表面表达。选一个群体用与上述相同的抗 肽血清进行FACS分类。通过在10％APK9和遗传霉素中生长，筛选一个 母本细胞系克隆。在APK9中筛选35天后，将细胞保持于1ng/ml鼠IL -3中。用一个亚克隆进行该部分的工作。 B    人Mpl受体

将全长人Mpl受体序列(Vigon，I.，et al.， PNAS 89：5640- 5644(1992))亚克隆到含有Moloney鼠肉瘤病毒启动子的表达载体 (与鼠受体的载体相同)中。用CaPO4哺乳动物转染盒(Stratagene) 将6μg该构建体和6μg的两性反转录病毒包装构建体(Landau，N. R.，Littman，D.R.， J.Virology 66：5110-5113(1992))转染 到3×106 293细胞中。2天后，再转染相同的细胞，4天后再转染。 最后一次转染后的第二天，将293细胞与IL-3依赖的鼠细胞系(32D， 克隆23；Greenberger et al.， PNAS 80：2931-2936(1983))共培 养。24小时后，取出32D细胞，并在BSA梯度(Path-o-cyte；Miles Inc.)上分带。用1ng/ml鼠IL-3扩展细胞，然后在20％APK9中选 择生长。通过使用多克隆兔抗肽血清的FACS根据细胞表面表达的受体 将细胞分类。然后将这些细胞用于检测。

                      实施例4

                  Mpl配体的1A6.1试验

冲洗1A6.1细胞除去培养物中的IL-3，然后重铺(1000细胞/ 15μl总体积/孔)在Terasaki型微滴定盘的αMEM(Gibco)中，所 述的αMEM用10％胎牛血清(FCS)，遗传霉素(800μg/ml)和1％ 青霉素/链霉素(Gibco)以试验样品的1∶1系列稀释液补充。48小 时后，经显微镜确定每孔的活细胞数。将1单位活性定义为可以使每 孔产生200个活细胞的活性量。活性被定义为由Mpl配体产生的结果， 如果它能被试验中包含的5-10μg/ml Mpl-X完全阻断。APK9中 Mpl配体活性平均为4400+/-539单位/ml发育不良血清。除非有 其它说明，Mpl配体活性单位由1A6.1试验确定。

基本上按用1A6.1细胞相同的方法进行用人Mpl受体基因(实施 例3B)转染的细胞的试验。

                      实施例5

   证明Mpl配体存在于小鼠，狗，猪和人源的发育不良的血浆

   或血清中

Mpl配体存在于小鼠，狗，猪和人源的发育不良的血浆或血清中 (表2)。从预辐射和辐射12天后(500拉德)的BDF小鼠中收集血浆。 用1A6.1试验测试血浆，试验表现出2000单位/ml活性，该活性基本 上可以由Mpl-X(10μg/ml)完全抑制。辐射后的小鼠血浆在人巨 核细胞检测中也是阳性的，其活性为1833单位/ml。从预辐射和辐射 (450拉德)10天后的狗收集血浆。用1A6.1式验和人巨核细胞试 验测试血浆。在这两个试验中均检测到活性且由Mpl-X(10μg/ml) 完全抑制。从预辐射和辐射(450拉德)10天后的猪收集血浆。用 1A6.1试验和人巨核细胞试验测试血浆。与在发育不良犬血浆中所见 到的相比，在这两个试验中均有Mpl配体活性(用10μg/ml Mpl-X 可抑制)。获得了发育不良的人的血清。从骨髓移植患者收集该物质。 用1A6.1试验检测6个患者中获得的血清，试验表现出903单位/ml活 性，其中88％是由Mpl配体产生的(用10μg/ml Mpl-X可抑制)。 再用人巨核细胞试验测试14个发育不良患者的血清。作为一组，它们 有用 0μg/ml Mpl-X可完全抑制的基本活性，941巨核细胞单位/ml， 包括鼠IL-3资料以说明1A6.1检测的特异性。尽管重组细胞因子诱导 细胞系的生长，但不会被10μg/ml Mpl-X抑制。

                         表2 种             1A6.1细胞试验(单位/ml)     人巨核细胞试验

                                        (巨核细胞单位/ml)

           介质        +Mpl-X     介质         +Mpl-X 正常小鼠       0+/-0       0+/-0      0+/-0        0+/-0 发育不良小鼠   2000        0          1833         未做 正常犬         0+/-0       0+/-0      0+/-0        0+/-0 发育不良犬     4400+/-539  0+/-0      792+/-128    0+/-0 正常猪         0+/-0       0+/-0      0+/-0        0+/-1 发育不良猪     3866+/-1136 0+/-0      1284+/-182   10+/-10 正常人         0+/-0       0+/-0      0+/-0        0+/-0 发育不良人     903+/-64    114+/-33   941+/-178    0+/-0 鼠IL3          6000+/-565  6000+/-565 未做         未做

                      实施例6

      Mpl配体刺激1A6.1细胞生长和人巨核细胞发育

Mpl配体(外源凝集素和亲和层析后富集至少约100,000倍；见 实施例7)以剂量依赖方式刺激1A6.1细胞系的生长和人巨核细胞的 发育，所述的巨核细胞来自CD34选择的外周血细胞。由于在这两个试 验中Mpl-X完全阻断活性，如图2和3所示，活性归因于Mpl配体。

本发明人已经表明，在Mp l配体(在这种情况下，100单位/ml， 9天)中培养时，FACS纯化的外周血细胞CD34+细胞可以发育成表型 正常的成熟巨核细胞。这证实纯化的Mpl配体对巨核细胞具有和对天 然APK9相同的作用。而且，本实验使用与CD34-选择的细胞(一般仅 含30-50％CD34+)不同的纯化的CD34+细胞(100％CD34+)。

                      实施例7

                    纯化犬Mpl配体 I.概述：

纯化对Mpl受体表现出预测之配体活性的蛋白质(25kd和31kd)。 用小麦精凝集素(WGA)亲和层析，Mpl受体亲和层析，阴离子交换层 析，凝胶过滤层析和C4反相HPLC，从被辐射狗的血浆中纯化所述蛋白 质。见图4有关该纯化过程的图示。已将25kd和31kd Mpl配体高 度纯化达到明显的均质性，而且已确定其含有本文公开的氨基酸序列。 II. 方法：

A. 澄清血清

于4℃将来自被辐射狗(见实施例1)的冻血浆(共20升)过 夜解冻；在置于冷室之前，将较大的瓶子在室温解冻数小时。以 11,000xg离心6小时，除去不溶的物质。用含0.01％叠氮化钠的磷酸 盐缓冲盐水，pH7.3(PBS/叠氮化物)稀释血浆，然后通过1.2μm 滤器过滤。澄清过程主要是使起始物质稀释约2倍。

B. 小麦精凝集素亲和层析

所有的操作均于4℃完成。将澄清的血浆(分两批)用于用PBS/ 叠氮化物平衡的固定的小麦精凝集素柱(1升，10×12cm，EY Laboratories)。上样后，用PBS/叠氮化物从柱上洗掉未结合的物 质，然后，用20mM Tris-HCl(pH8)中的0.5M NaCl洗涤。用0.35M N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8 洗脱由WGA柱结合的Mpl配体活性物。在洗出物或洗涤组分中检测不到 Mpl配体活性。

C.Mpl 受体亲和层析

使用可溶的鼠Mpl受体(Mpl-X)，它相当于Mpl受体的全部细胞 外区减去位置483上的Trp(见Vigon，et al，8：2607-2615(1993))。 为了优化Mpl配体与Mpl-X受体亲和柱的结合，用膜超滤器(10,000 分子量截断，YM-10，Amicon)和由随后的稀释液调整到0.2M的NaCl浓缩WGA洗脱池。将浓缩的WGA池以0.9ml/分的洗速用于20ml m-Mpl -X(鼠Mpl可溶受体)/CNBr活化的琼脂糖凝胶柱(2.6×4.2cm， 1.5mg m-Mpl-X/ml树脂)。用40ml PBS/叠氮化物以1.5ml/分 洗涤该柱，然后用10mM Tris-HCl，1M NaCl，1mM CHAPS，pH8.0 进行高盐洗涤(405ml)。然后用20mM CAPS，1M NaCl，5mM CHAPS， pH10.5洗脱该柱。收集适宜的组分，将Tris加至各组分中以中和pH。

Mpl-X受体亲和柱洗脱图的SDS-PAGE和在280nm的吸收值表明， 较早的蛋白质峰在组分1-4，而在组分5后洗脱出主要的Mpl配体 活性。

D. 单-O阴离子交换层析

将来自数个Mpl-X受体亲和柱的纯度最高的组分收集在一起，将 其浓缩，然后对20mM Tris-HCl，5mM CHAPS，pH8.7透滤以达到 58.5ml的终体积。用在280nm的吸收值估测该池的蛋白质浓度为 0.12mg/ml(共约7mg蛋白质)。将该池以0.5ml/分上样于用20mM Tris-HCl，5mM CHAPS，pH8.7平衡的Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia)。 用在27分钟内使在相同缓冲液中的NaCl达0.36M的线性梯度洗脱该 柱。然后用6分钟达0.54M NaCl的梯度洗涤该柱，最后用0.9M NaCl洗涤。收集1ml组分。

Mono Q柱的洗脱图表明，在洗出物和洗涤组分中，没有检测到 Mpl配体，但有可忽略不计的蛋白质。大部分Mpl配体活性在组分 5-7中，处于NaCl梯度的开始阶段。在组分8-10观察到“肩部” 活性，然后在组分11-15中又观察到第二个主峰。

在活性组分中，用SDS-PAGE(非还原)观察到明显的25kd带。 该带的密度直接与组分中的Mpl配体活性相对应。在组分3和4中没 有该带(没有活性)。在组分5和6中明显(1A6.1活性峰)。而在 组分11-14有相似的、厚染色带(1A6.1活性峰)。在组分15和16的 池中，该带很淡，这与在组分16中活性明显很低相一致。

E. 凝胶洗脱实验

用Mono Q组分5和6或Mono Q组分13和14的等分样品进行凝胶 洗脱实验。为了完成这些实验，制成组分5和6(各6μl)或13和 14(各7.5μl)的池，与SDS-PAGE样品缓冲液(非还原的)混合， 然后用于12％SDS凝胶。完成电泳后，切下所需的带(1mm)，然后 用剃刀锋将切下的带切成小片。将小片转移到1.5ml含0.5ml PBS/ 5mM CHAPS的微离心管中，于4℃缓慢搅拌过夜。第二天离心试管， 取出一份，将样品对用BSA为载体蛋白补充的Iscove′s培养基透滤。 用透滤的样品进行检测。

结果表明：可以观察到Mpl配体活性的两个峰。一个峰相当于凝 胶的25kd区，而第二个Mpl配体活性峰在31kd区。

F. Superdex 200凝胶过滤

将来自Mono Q阴离子交换柱组分13-16和来自第二个Mono Q分 级分离的两个等同组分混合在一起，然后用膜超滤装置(Centricon -10，Amicon)浓缩。加入SDS达到0.1％的终浓度，将样品注射到 Superdex 200 HR 10/30(Pharmacia)柱上。用50mM Tris-HCl， 0.1％ SDS，pH 7.5以0.3ml/分的流速平衡该柱，然后于室温下操作。 1分钟收集一次组分。结果表明：样品中的大多数蛋白质洗脱到组分 32-40中，而Mpl配体活性是在组分42-46中检测到的。分析组分 SDS-PAGE表明，在活性组分中有明显的25kd带。

G. C4反相HPLC

用一膜超滤器(Microcon-10，Amicon)浓缩合在一起的Superdex 200组分43-46或仅仅组分42。将浓缩的池分别用于1×100mm C4反 相微孔柱(SynChropak RP-4)。用0.04％TFA水溶液(A缓冲液) 平衡该柱；B缓冲液是在80％乙腈中的0.035％TFA。注射样品后，在 4分钟内完成到45％的线性梯度，然后在40分钟完成到75％的线性梯 度。流速是75μl/分。在图5中列出了组分42的纯化结果。在组分 21-23中有明显的Mpl配体活性。在非还原和还原条件下，在14％聚 丙烯酰胺凝胶上分析这些组分。组分21含有一个31kd带；组分23含 有一个宽25kd带；而组分22在25kd和31kd区均含带。值得注意的 是较早的凝胶洗脱实验已表明这些区均有Mpl配体活性。在非还原凝 胶的所有组分中，均有一个小的高分子量带，但在还原凝胶中没有。

H. 25kd和31kd Mpl配体的N-末端序列分析

对含有活性的C4-HPLC组分完成N-末端序列分析。上述报道了 确定的这些蛋白质的序列。除相当于25kd带的主要序列(至少占总 样品的90％)外，定序检测两个小序列(与上述部分G中描述的小污 染带有关)。与已知序列的比较表明：小序列是犬Ig重链和kappa链。 如果需要，用另一纯化步骤，例如优选的另一凝胶过滤步骤进一步大 量还原这些微小杂质。

I. 比较在C4纯化组分中的Mpl配体活性

图6表示的数据说明在来自C4 RP-HPLC层析步骤的组分22和23 中的活性基本上是相同的。组分22含有25和31kd带的混合物，而组 分23只含有25kd带。将每一组分的等分样品稀释1∶45000。稀释的 组分对1A6.1细胞生长的刺激作用基本相同(组分22,5400细胞/孔； 组分23,6000细胞/孔)。将稀释的组分与浓度逐渐增加Mpl-X温育。 所述的组分对Mpl-X抑制的敏感性基本相同，并且用7-1.4μg/ml 均可完全抑制。这表明在各组分中的活性蛋白质是具有相同生物活性 的Mpl配体。

                      实施例8

     比较Mpl配体与其它因子对巨核细胞发育的作用

已报道许多重组因子或有机化合物如佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA) 都能影响巨核细胞生长或发育。因此，要研究这些因子对CD34-选择 外周血细胞的作用。按说明将人重组白细胞介素3(IL-3，1- 2ng/ml)、干细胞因子(SCF，50ng/ml)、白细胞介素6(IL- 6.25ng/ml)、促红细胞生成素(EPO，1单位/ml)、白血病抑 制因子(LIF，10ng/ml)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM- CSF，25ng/ml，Amgen，Inc.)、白细胞介素11(IL-11，25ng/ml， R+D Systems.Minneapolis，MN)；佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA， 10-10M，Sigma)加到培养基中。所用的Mpl配体为275单位/ml， APK9为5％(相当于220单位/ml)。合起来检测时所用因子的浓度 与单个检测时所用的相同。培养8天后，将细胞直接固定在孔中，对 巨核细胞染色(每种条件下，n＝6孔)，或计数总细胞数(每种条 件下，n＝3孔)。数据以平均值+/-SEM表示。

图7表示APK9和Mpl配体导致每孔达到最大的巨核细胞数。IL-3 也会影响巨核细胞发育，特别是与SCF合用时。IL-6、IL-11或EPO 单独或与IL-3合用时，对巨核细胞数没什么影响。PMA、LIF和GM- CSF也没什么影响。图8中的数据来自相同的实验，表明每孔中所发 现的总细胞数(“细胞构成”)。APK9和Mpl配体对细胞构成没什么 影响，而IL-3和SCF影响适中。SCF与IL-3合用时影响最大。用图 7和8中所列的数据计算每孔中巨核细胞的百分比，如图9所列。显 然，使每培养孔中巨核细胞百分比最大的因子是Mpl配体，APK9中的 活性成分。这说明了Mpl配体对巨核细胞的特异性。

                      实施例9

       Mpl配体的巨核细胞促进活性与人IL-3无关

当用作实施例2所述培养基的补充物时，Mpl配体刺激人巨核细 胞的发育。尽管IL-3不是培养基的组分，但在培养基中的正常人血 浆中，它以不可检测的低水平存在。然而，即使存在，IL-3也与 Mpl配体-诱导的巨核细胞生成无关。图10对此作了说明。在14,900 巨核细胞单位/ml的人巨核细胞检测中，2ng/ml的IL-3有活性。 用抗-IL-3(3.3μg/ml；Genzyme，Cambridge，MA)抑制了97％ 的该活性。用抗-IL-3不能抑制8203meg单位/ml的Mpl配体。

                      实施例10

                    分析猪Mpl配体 I. 概述：

用WGA亲和层析、Mpl受体亲和层析、离子交换层析和C4反相 HPLC表征来自辐射猪血浆之有Mpl配体活性的蛋白质。通过从SDS- 聚丙烯酰胺凝胶切片中洗脱，也可以表征该活性。

   层析柱                            评注

 WGA亲和柱                      用4.4×106单位

                                回收3.4×106单位

 Mpl受体柱                      用2.7×106单位

                                回收2.4×106单位

 Mono S离子交换                 用2.4×106单位

 pH6.0                          回收4.4×106单位

 C4反相HPLC                     回收组分23-25的活性

凝胶洗脱实验                     两种活性明显不同，一种在约18kd，

                                 另一种在约28kd。

                      实施例l1

             克隆人Mpl-配体，人MGDF

下面列举了两种方法：

I. 第一种克隆方法

A. 产生人MGDF探针

以犬蛋白质的氨基末端序列为基础，设计多种简并PCR引物。 用不同的引物对以扩增来自人基因组DNA的MGDF基因。使用意义引物 5′GCN CCN CCN GCN TGY GA 3′(SEQ ID NO：4)(编码犬蛋白质 (SEQ ID N0：1)的前5个氨基酸)和反义引物：5′GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3′(SEQ ID N0：5)(编码SEQ ID NO：1的16 -21氨基酸)扩增40个循环后，使PCR产物在TBE缓冲液的2.0％琼脂 糖上展开。

从琼脂糖凝胶上切下63 bp带，用相同的引物再扩增。将PCR产物 克隆在PCR II载体(Invitrogen，San Diego)中。用DNA定序筛选不 同的菌落。以编码与犬MGDF蛋白质相似之肽的质粒DNA用作产生放射 性探针以筛选cDNA文库的源。由基因片数编码的AA序列如下： Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu- Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His(SEQ ID NO：6)

用含人MGDF的琼脂糖带经热PCR产生探针。100μl典型的PCR反 应含下列组成；

模板DNA                              2-3μl

5′引物(SEQ ID NO：4)                1μl，20Pmoles

3′引物(SEQ ID NO：5)                1μl，20pmoles

10×缓冲液                   10μl

dATP(0.1mM)                  2μl

dGTP(10mM)                   2μl

dCTP(0.1mM)                  2μl

dCTP，p32(10uc/μl)         5μl

dATP，p32(10uc/μl)         5μl

Taq DNA聚合酶                0.5μl，2.5单位

水                           77μl

总体积                      100μl

扩增条件如下：

开始加热                   94℃  2分

退火                       53℃  30秒

延伸                       72℃  30秒

变性                       94℃  30秒

用Perkin Elmer GeneAmp System 9600扩增40个循环。

通过推进柱(push column)(Stratagene，San Diego)纯化 产物。用闪烁计数器计数1μl探针。将含1-3百万计数/ml的探 针加到杂交混合物中。 B. 构建胎肝文库

从Clontech实验室购买人胎肝polyA+RNA。用约4μg的RNA进行 cDNA合成，其中用随机六聚物5′GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3′ (SEQ ID NO：7)引发，该六聚物与一含Xba I位点的寡聚物相连。

用Gibco-BRL方法产生双链cDNA。将Eco RI-Bst XI衔接物 (Invitrogen，San Diego)与双链cDNA相连，然后用限制酶Xba I消 化。在S500 Sephacryl柱(Life Technologies，Inc.)上按大小选 择cDNA。将大于400 bp的cDNA与已用EcoRI和Xba I消化的哺乳动物 表达载体v19.8(Martin，F.， Cell 63：203-211)(1990))相连。 转化感受态细胞，将所得的cDNA文库分成7个各100,000 cDNA的池。 C. 筛选入文库

从Clontech购买在λgt 11中的人胎肾文库，滴定度为650百万 pfu/ml。用经PCR产生的探针(见上文)筛选约2百万噬菌斑。于 56℃在6×SSC，5×Denhardt，0.1％ SDS，100μg/ml单链鲑精 DNA中杂交，15小时。

筛选多轮。从单个噬菌斑扩增DNA，然后与编码SEQ ID NO：6氨 基酸7到13的内引物5′AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3′(SEQ ID NO：8)杂交以鉴定真阳性。 D. cDNA末端的3引物快速扩增

从Clontech购买来自人胎肾和胎肝的聚腺苷酸化的RNA。用寡核 苷酸5′TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3′(ESQ  ID NO：9)作为引物反转录1μg RNA。

用Gibco-BRL cDNA合成盒(Life Technologies.Ine.，Cat. #18267-013)得到第一条cDNA链。终体积为30μl。加入500mM EDTA达到10mM的终浓度，从而终止反应并保持于-20℃。

为了开始RCR，每个反应用0.5μl cDNA作为模板。用引物SEQ ID NO：9和竞争寡核苷酸5′TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3′(SEQ ID NO：10)作为反义引物，用编码SEQ ID NO：6之 氨基酸5到11的寡核苷酸5′TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3′(SEQ ID NO：11)作为意义引物。于94℃温育2分钟后，用下列过程扩增 40个循环：94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，用Perkin Elmer GeneAmp System 9600扩增。

用编码SEQ ID NO：6之氨基酸8到14的有义引物5′GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3′(SEQ ID NO：12)完成嵌套。而用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10作为反义引物。扩增40个循环，于65℃退火。 使PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上展开，然后在UV光下摄影。可看见 在0.8到1.2kb周围的带。

然后将PCR产物克隆在载体PCR II(Invitrogen)中。捡出单个 菌落，用Qiagen盒Cat # 12143和12145分离噬菌体。用载体引物进行 双链染料引发的定序。用各种类型的GCG软件分析序列。 E. 5′和3′引物延伸

为了分离全长MGDF基因序列，用不同的胎肝文库池作为模板进行 3′和5′引物延伸。为了扩增cDNA的5引物，用约20ng的各池cDNA 作模板。使用编码SEQ ID NO：6氨基酸12到17的MGDF特异性反义引 物5′GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3′(SEQ ID NO：13)和5′载体 v19.8有义引物5′CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3′(SEQ ID NO：14)。 扩增30个循环，于53℃退火。用编码SEQ ID NO：6之氨基酸1到6 的反义引物5′GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3′(SEQ ID NO：15)和 载体引物SEQ ID NO：14嵌套30个循环。

为了引物扩增MGDF cDNA的3′末端，使用反义载体引物5′GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3′(SEQ ID NO：16)和编码SEQ ID NO：6 之氨基酸1到6的MGDF特异性引物5′TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3′ (SEQ ID NO：17)。扩增30个循环，于58℃退火。

用NGDF引物SEQ ID NO：12和载体引物SEQ ID NO：16嵌套扩增 30个循环。在1、7和8号池中有特定的带，将克隆在PCR II载体中。 纯化并定序来自单个菌落的纯化质粒DNA。 F. 分离人MGDF的全长克隆

由于是用部分MGDF序列引发和嵌套，因此许多开始的克隆缺少氨 基末端部分的MGDF。用从上述5引物延伸实验得到的引物5′CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3′(SEQ ID NO：18)作有义引物。载体引物SEQ ID NO：16作反义引物。扩增35个循环，于58℃退火。用含Sal I位点 的MGDF特异性引物5′CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3′ (SEQ ID NO：19)和载体引物(SEQ ID NO：15)嵌套30个循环。将 PCR产物克隆在PCR II载体中并测序。 II. 第二种克隆方法 A. 克隆犬MGDF N-末端cDNA

以前述的犬MGDF  N-末端氨基酸序列为基础，设计简并的寡核 苷酸引物并用其在聚合酶链反应(PCR)  中作引物扩增MGDF-编码 cDNA序列。用Chomzynski和Sacchi的异硫氰酸胍法(Biochem.162： 156-159(1987))从犬肾样品制备总RNA。使用MOMULV反转录酶， 随机引物-衔接物5′GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3′(SEQ ID NO：20)制备第一条cDNA链，然后在随后的PCR中用其作模板。

对0.5μl，约50ng cDNA，用引物A 5′GCN CCN CCN GCN TGY GA 3′(SEQ ID NO：4)(编码SEQ ID NO：1之氨基酸1-6的有 义链引物)和引物B 5′GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3′(SEQ ID NO：5)或引物C 5′GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3′(SEQ ID NO：21)完成PCR，所述引物B或C是反义链引物，编码在5′末端 有3个额外核苷酸之SEQ ID NO：1的氨基酸16-21，所述的额外核 苷酸可提高退火的稳定性。用Taq聚合酶完成35到45个循环的PCR， 直到琼脂糖凝胶电泳分析上有明显的产物带。对于最初两个循环的 PCR，于37℃进行2分钟的再退火步骤：其余的循环是于50℃再退火 1分钟。在每个反应中均观察到多产物带。用巴斯德吸管的端部收集 含有约为预期大小(66bp)的凝胶部分，然后再用相同的引物对进行 扩增。按制造商的说明将DNA产物克隆到载体PCR II(Invitrogen) 中。对三个克隆进行测序，发现一个编码阅读框架，一个编码预期的 犬MGDF序列，一个是残基1-21。用该方法得到了唯一的犬MGDF cDNA序列，含有密码子6的第3个核苷酸到密码子15的第3个核苷酸 之区域。用这些克隆之一作模板制备标记的犬MGDF cDNA探针。 B. 从人胎肝构建cDNA文库

通过将组织溶解于5.5M硫氰酸胍，然后经CsTFA(Pharmacia)离 心纯化从人胎肝(International Institute for the Advancement of Medicine，Exton，PA)分离RNA。用寡核苷酸(dT)25 dynabeads (Dynal，按制造商的说明)筛选多腺苷酸的RNA。除使用不同的接头 衔接物：5′TTG GTG TGC ACT TGT G 3′(SEQ ID NO：22)和5′CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3′(SEQ ID NO：23)外，用于cDNA合成的 Superscript质粒系统(Life Technologies，Inc.)从该RNA生产双 链cDNA。按大小选择后，将该cDNA直接插入哺乳动物表达载体pBCB (pBCB得自质粒Rc/CMV，Invitrogen，含有puc 19骨架，CMV启动 子和BGH多腺苷酸位点)的Bst XI和Not I位点。将连接的DNA电穿 孔到电感受态细菌菌株10 B(Life Technologies，Inc.，)中。 C. 筛选MGDF的人胎肝cDNA文库

将人胎肝文库滤膜复制物与放射性标记的犬MGDF N-末端cDNA PCR产物于64℃杂交18小时(5x SSPE，2x Denhardt′s，0.05％焦磷 酸钠，0.5％ SDS，100μg/ml酵母tRNA溶解产物和100μg/ml变性 的鲑精DNA)。于64℃用5x SSPE，0.5％ SDS冲洗滤膜，然后暴露过 夜。分离与该探针杂交的两个不同的克隆，然后分析。 D. 表达人MGDF cDNA克隆

将从MGDF cDNA克隆纯化的DNA转染到293 EBNA细胞(Invitrogen) 中。在100μl无DMEM的血清中，将1.5μg DNA与7.5μl Lipofectamine (Life Technologies，Inc.，)混合。于室温温育20分钟后，将DNA -Lipofectamine混合物加到400μl DMEM，1％血清(Fetal Clone II)中的5×105细胞/孔(每平方Greiner盘24孔)中，然后于37℃ 温育6小时。将500μl DMEM，20％血清(Fetal Clone II)加到细 胞中。将培养基抽吸16小时后，加入500μl DMEM，1％血清(Fetal Clone II)。72小时后，收集条件培养基，通过0.22μm旋转滤器离 心。分析条件培养基的MGDF生物活性。 III. 人MGDF克隆的描述和活性

以上述的克隆策略为基础，得到图11(MGDF-1和MGDF-2； SEQ ID NO：24、25：和26、27)和图12(MGDF-3；SEQ ID NO： 28、29)中所示的人cDNA克隆。图中的每个序列均含有推测的信号序 列氨基酸1-21，因此，在每种情况下，成熟蛋白质均从氨基酸21  开始。

在下列表3和4列出了用MGDF1-3进行上述实施例4A的细胞 -为基础之试验而得出的活性试验的结果。在表3中，培养2天后， 收集用各构建体转染之293 EBNA细胞的条件培养基，然后对1A.61细 胞(32D/鼠-MPL+)+/-10μg/ml鼠-MPL-X进行试验。在表 4中，培养4天后，收集用各构建体转染之293 EBNA细胞的条件培养 基，然后对32D/鼠-MPL+细胞(实施例3A)和32/人-MPL+细胞 (实施例3B)进行检测。正如可以看到的，发现人MGDF-1和MGDF- 2，而不是MGDF-3对表达鼠和人Mpl形式的细胞有活性。表达人MPL 受体的细胞系对人MGDF-1和MGDF-2的反应比表达鼠Mpl受体的细 胞系更强烈。

                   表3

                           U/ml         U/ml   克隆                      (-鼠-MPL-X)  (+鼠-MPL-X)   培养基                         0            0   PBCO(对照质粒                  0            0   MGDF-1                       12,800        800   MGDF-1(重复)                 12,800        566   MGDF-2                       4525          400   MGDF-2(重复)                 12800         1131   MGDF-3                         0            0   MGDF-3(重复)                   0            0   APK9对照                     4400+/-400     0

                   表4

                            U/ml           U/ml   克隆                      32D/鼠-MPL+      32D/人-MPL+   MGDF-1                       1600           25,600   MGDF-2                       6400           50,000   MGDF-2(重复)                 6400       50,000-100,000

下列表5表明可溶的人mpl受体(人-MPL-X)基本上完全抑制 人MGDF-1和MGDF-2对32D/人-MPL+细胞(实施例3B)的活性。 人-MPL-X以产生蛋白质之CH0细胞收集的条件培养基存在。将CH0 人-MPL-X条件培养基浓缩120倍，然后以6.6％加到培养基中。来 自对照CHO培养基的条件培养基对检测没有影响。除3天后估测活细 胞外，按实施例4B所述进行检测。

                      表5

                      U/ml             U/ml   克隆                (-人-MPL-X)      (+人-MPL-X)   MGDF-1                  530               0   MGDF-2                  270               0

                   人巨核细胞检测

MGDF-1和MGDF-2而不是MGDF-3诱导来自外周血CD34选择细 胞之巨核细胞的形成。除外周血细胞是CD34一选择的而不是分选的， 而且在7天后收集培养物外，基本按实施例2中所述完成表6中的实 验。以20％终体积+/-30μg/ml鼠-MPL-X使用来自各293 EBNA MGDF构建体的条件培养基，以6％终体积使用APK9对照。

                      表6

               巨核细胞/孔    巨核细胞/孔   克隆            (-鼠-MPL-X)    (+鼠-MPL-X)   载体                 0              0   对照   APK9              100+/-3           0   对照   MGDF-1            142+/-48        17+/-2   MGDF-2            100+/-3          6+/-2   MGDF-2            86+/-10           0   重复   MGDF-3            2+/-2             0

                      实施例12

下列实施例描述合成12种不同的聚乙二醇化的MGDF分子，PEG9 -PEG 12和PEG 14-PEG 21。在每种情况下，聚乙二醇化的HGDF分子 是E.coli衍生的MGDF-11(氨基酸22-184，从信号肽的开始编号或 氨基酸1-163，从成熟蛋白质的开始编号)。在下列表7-10中详 细总结了所有的聚乙二醇化种类。 12.1 通过用活化的MePEG衍生物使MGDF酰基化制备聚-MePEG-MGDF

共轭物

制备聚-MePEG(20 KDa)-MGDF共轭物(PEG 11)

将在0.1M BICINE缓冲液，pH8中的冷(4℃)MGDF(2.5mg/ml) 加到过量10倍摩尔的固体MePEG丙酸琥珀酰亚胺酯(succinimidyl propionate)(MW 20 KDa)(Shearwater Polymers，Inc.)中。 缓慢搅拌溶解聚合物，于室温进一步完成反应。

通过使用Superdex 200 HR 10/30柱(Phamacia Biotech)的 大小排阻(SEC)HPLC，用0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.9以0.7ml/分洗脱 来监测反应过程中蛋白质的修饰程度。

在30分钟时，由SEC HPLC分析反应混合物表明：在反应混合物 中，没有游离的蛋白质。此时，通过加入无菌水而使反应混合物中蛋 白质浓度降到1mg/ml，加入数滴0.5M乙酸使混合物的pH调整到4。

由使用SP Sepharose HP(Pharmacia，Biotech)离子交换树脂 的离子交换层析从过量的MePEG和其它反应副产品中分离MePEG-MGDF 共轭物。

将反应混合物上样(2.5mg/ml树脂)到柱上。用3倍柱体积的 起始缓冲液A(20mM磷酸钠，pH7.2，15％甘油)洗脱未反应的 MePEG。其后，用在10倍体积终止缓冲液B(在缓冲液A中的1M NaCl)中的D％到30％之线性梯度洗脱MePEG-MGDF共轭物。在 280nm监测洗脱物。收集含聚-MePEG-MGDF共轭物的组分，然后浓 缩并无菌过滤。

用依次结合的TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝胶过滤柱， 经HPLC分析纯化的聚-MePEG-MGDF共轭物。用280nm的UV吸收值检 测蛋白质。BIO-RAD凝胶过滤标准作为球蛋白分子量标记物。

正如图17A中所见到的，HPLC SEC表明在制备中两个主要组分 (约2：1)的洗脱位置分别相当于370.9KDa和155.0KDa球蛋白 的。见下列表8。

类似地，用MW＝6-50KDa MePEG的琥珀酰亚胺酯使MGDF酰基 化而制备共轭物PEG 9，PEG 10和PEG 12。表7归纳了在这些制备中 所用的主要反应参数。

表8列出了这些共轭物的HPLC SEC分析结果。 12.2 通过用MePEG醛使MGDF还原性烷基化而制备聚-MePEG-MGDF

共轭物

制备聚-MePEG(20KDa)-MGDF共轭物(PEG 20)

向含20mM NaCNBH3的100mM磷酸钠pH 5中冷(4℃)搅拌的 MGDF溶液(2ml，2.5mg/ml)中加入过量10倍摩尔的单甲氧基- 聚乙二醇醛(平均分子量20KDa)，于相同的温度下继续搅拌反应混 合物。

通过使用Superdex 200 HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)， 用0.1M磷酸钠缓冲液pH6.9以0.7ml/分洗脱的SEC HPLC来监测反应 过程中蛋白质的修饰程度。

16小时后，SEC HPLC分析表明，已被修饰的蛋白质占开始量的 90％以上，此时，用无菌水稀释反应混合物而使反应混合物中蛋白 质的浓度达1mg/ml，pH调整到4(0.5M乙酸)。

通过使用SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech)离子交换树 脂的离子交换层，从过量的MePEG和其它反应副产品中分离MePEG- MGDF共轭物。

将反应混合物上样(2.5mg/ml树脂)于柱上，然后用3倍体积 的起始缓冲液A(20mM，磷酸钠，pH7.2，15％甘油)洗脱未反应的 MePEG。此后，用在10倍柱体积之终止缓冲液B(在缓冲液A中的1M NaCl)中0％到30％的线性梯度洗脱MePEG-MGDF共轭物。于280nm 监测洗脱物。收集含聚-MePEG-MGDF的组分，然后将其浓缩并无菌 过滤。

使用依次结合之TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝胶过滤柱的 HPLC SEC分析纯化的聚-MePEG-MGDF共轭物。用280nm的UV吸收值 检测蛋白质。BIORAD凝胶过滤标准作球蛋白分子量标记物。

正如图17B中看到的，HPLC SEC表明在制备中，两个主要组分 (占总量的52％和47％)的洗脱位置分别相当于359.4KDa和159.3KDa 球蛋白的位置。见表8。

类似地，通过用MW＝6-25KDa的MePEG醛使MGDF还原性烷基化 而制备共轭物PEG 18、PEG 19和PEG 21。表7归纳了在这些制备中所 用的主要反应参数。

表8列出了这些共轭物之HPLC SEC分析结果。 12.3 制备在N-末端α-氨基残基带连接位点的单甲氧基-聚乙二

醇-MGDF共轭物

制备单-MePEG(20KDa)-MGDF共轭物(PEG 16)

向含20mM NaCNBH3的100mM磷酸钠pH5中的冷的(4℃)、搅 拌的MGDF溶液(2ml，2.5mg/ml)中加入过量5倍摩尔的甲氧基聚乙 二醇醛(MePEG)(平均分子量为20KDa)，于相同的温度下继续搅拌 反应混合物。

通过使用Superdex 200 HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)， 用0.1M磷酸钠缓冲液pH6.7，以0.7ml/分洗脱的SEC HPLC监测反应 过程中蛋白质的修饰程度。

16小时后，SEC HPLC分析表明，已被修饰的蛋白质占开始量的 90％以上。此时，用无菌水稀释反应混合物而使反应混合物中蛋白 质的浓度达1mg/ml，反应混合物的pH调整到4(0.5M乙酸)。

通过使用SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech)离子交换树 脂的离子交换层析，从过量的MePEG和其它反应副产品中分离单- MePEG(20KDa)-MGDF共轭物。

将反应混合物上样(2.5mg/ml树脂)于柱上，然后用3倍柱体 积的起始缓冲液A(20mM磷酸钠，pH7.2，15％甘油)洗脱未反应的 MePEG。此后，用在20倍柱体积中0％到25％终止缓冲液B(在缓冲 液A中的1M NaCl)线性梯度洗脱MePEG-MGDF共轭物。于280nm监 测洗脱物。收集含聚-MePEG-MGDF共轭物的组分，将其浓缩并无菌 过滤。

通过使用4-20％预制(precast)梯度凝胶(NOVEX)的SDS- PAGE确定单-MePEG-MGDF共轭物的均质性。有-个相应于46.9KDa蛋 白质位置的主要带。

通过依次使用TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL凝胶过滤柱的 HPLC SEC分析纯化的聚-MePEG-MGDF。用在280nm的UV吸收值监测 蛋白质。BIO-RAD凝胶过滤标准作球蛋白质分子量标记物。

正如图17C中所见，SEC HPLC表明在制备中的一个主要组分， 其洗脱位置相当于181.1KDa球蛋白的位置。见表9。

类似地，通过用MW＝6-25KDa的MePEG醛的MGDF还原性烷基化 而制备单一MePEG-MGDF共轭物PEG 14、PEG 15和PEG 17。在这些制 备中所用的主要反应参数总结于表7中。

表9列出了这些共轭物的HPLC SEC分析结果。

                        表7

              MGDF修饰反应参数的总结 代码         还原性MePEG          反应条件 

         类型  分子量  MGDF   pH   温度   时间  摩尔比

                       浓度         ℃    小时  MePEG/

                       mg/ml                    MGDF PEG 9         NHS  6kDa     2.5   8     r.t.  0.5    15

          酯 PEG 10        NHS  6kDa     2.5   8     r.t.  0.5    10 

          酯 PEG 11        NHS  20kDa    2.5   8     r.t.  0.5    10

          酯 PEG 12        NHS  50kDa    2.5   8     r.t.  0.5    5

          酯 PEG 14      ALDEHY 6kDa     2.5   5     4℃   16     5 

          DE PEG 15      ALDEHY 12kDa    2.5   5     4℃   16     5

          DE PEG 16      ALDEHY 20kDa    2.5   5     4℃   16     5

          DE PEG 17      ALDEHY 25kDa    2.5   5     4℃   16     10

          DE PEG 18      ALDEHY 6kDa      5    5     4℃   16     10

          DE PEG 19      ALDEHY 12kDa     5    5     4℃   16     10

          DE PEG 20      ALDEHY 20kDa     5    5     4℃   16     10

          DE PEG 21      ALDEHY 25kDa     5    5     4℃   16     10

          DE

                      表8

     由SEC HPLC总结聚-MePEG-MGDF特征 代码       反应性MePEG       由SEC确定的表观     组分量  

                         分子量                   ％ PEG 9       NHS    6kDa       87.9                75

        酯                52.7           25  (肩部) PEG 10      NHS    6kDa       69.2           14  (肩部)

        酯                42.9                86 PEG 11      NHS   20kDa       370.9               68

        酯                155.0               32 PEG 12      NHS   50kDa       865.6               53

        酯                368.0               47 PEG 18    ALDEHY   6kDa       84.6                60

        DE                41.5                40 PEG 19    ALDEHY  12kDa       218.4               59

        DE                106.7               41 PEG 20    ALDEHY  20kDa       359.4               52

        DE                159.3               47 PEG 21    ALDEHY  25kDa       450.5               54

        DE                218.4               46

                      表9

           单MePEG-MGDF共轭物的表观分子量 代码        反应性MePEG    由SEC确定的表观    由SDS PAGF确定的

                       分子量kDa         表观分子量kDa

       类型    分子量 PEG 14    ALDEHY    6kDa     44.5                  27.7  

        DE PEG 15    ALDEHY   12kDa     104.7                 38.3

        DE PEG 16    ALDEHY   20kDa     181.1                 46.9

        DE PEG 17    ALDEHY   25kDa     226.4                 55.5

        DE 12.4 通过与甲氧基聚(乙二醇)醛使MGDF还原性烷基化而制备

DiMePEG(12KDa)-MGDF共轭物(PEG 22)

用下列方法得到本文称为PEG 22的纯化分子。将5倍过量的甲氧 基聚乙二醇醛(MePEG，即OHC-(CH2)2O-(CH2-CH2O)n-CH3： 其中n＝使分子时约为12KDa的重复单元)(Shearwater Polymers) 于5℃加到100mM乙酸钠，pH 5.0的2.5mg/ml MGDF( E.Coli衍生 的1-163)溶液中。混合10分钟后，加入充足的氰基硼氢化钠 (Aldrich)以使其在反应混合物中达到20mM的浓度。

在约5℃，将该混合物搅拌16小时。搅拌结束时，加入充足的 纯化水、USP以使MGDF的浓度达1mg/ml。将该混合物通过0.2μm的 真空滤器。用该方法制备了90mg反应产物。将少量的1.0M一碱价磷酸 盐和1N的氢氧化钠溶液加到反应产物混合物中以得到10mM磷酸盐， pH6.8溶液。

在阳离子交换柱上纯化共轭物。制备40ml的SP-Sepharose高效 柱，床高7.5cm。用平衡缓冲液(10mM磷酸盐，pH6.8，含15％甘油) 平衡该柱。以2.2mg/ml树脂，0.15柱体积(CV)/分使柱上样。然 后用平衡缓冲液洗涤直到达到基线。用10倍柱体积从缓冲液A(20mM 磷酸盐，pH7.2，含15％甘油)到缓冲液B(缓冲液A加0.3M NaCl) 的线性梯度洗脱该柱。流速一直保持在0.15CV/分。在280nm监测洗 脱物。

使组分在SDS-PAGE凝胶上层析，收集含DiPEG共轭物的组分， 然后通过0.2μm装置过滤。

                      实施例13

           聚乙二醇化之MGDF分子的生物活性 A.PEG-9-PEG 12和PEG 14-PEG-21

测量用重组人MGDF处理之小鼠的血小板计数，结果列于图18。以 图上标明的浓度将CHO-衍生的22-353(空菱形)，非聚乙二醇化的 E.coli 22-184(空心圆)和聚乙二醇化的 E.coli 22-184(实心 圆)MGDF皮下注射给正常Balb/c小鼠，每天一次，共5天。最后一 次注射24小时后，收集切割尾静脉小截面的试验出血。用Sysmex电子 血细胞分析仪(Baxter Diagnostics，Inc.，Irvine，CA)进行血细 胞分析。数据表示为4只动物的平均值+/-SEM。其它血细胞参数， 如总白细胞计数或红细胞计数不受该处理的影响。

按上述检测其它形式的重组人MGDF。在下列表10中列出了以标明 形式之r-HuMGDF处理小鼠的血小板计数，剂量为50μg/kg/天或 10μg/kg/天。数据为4只动物的平均值，标准误差用斜体字。

                                表10        50μg/kg/天          10μg/kg/天   形式 平均值 (n＝4)   标准误差 平均值 (n＝4) 标准误差 CHO 22-353     4343     309     2571     80 E.coli 22-184     2021     29     1439     18 PEG 9     2728     56     2369     34 PEG 10     2431     291     1556     126 PEG 11     3778     59     1861     73 PEG 12     3885     156     1740     88 PEG 14     3567     80     2020     63 PEG 15     4402     57     2834     99 PEG 16     4511     239     3215     11 PEG 17     4140     188     3113     261 PEG 18     4586     59     2931     729 PEG 19     3980     330     4189     80 PEG 20     3942     285     3054     339 PEG 21     4195     145     4002     91 基线     939     25 表10的关键

在下列每种情况下，如上述实施例所述，聚乙二醇化的MGDF分子 是 E.coli衍生的MGDF-11(氨基酸22-184，从信号肽的开始编号或 氨基酸1-163，从成熟蛋白质的开始编号)。 名称       聚乙二醇化     PEG的平    用于合成的反应性

                      均分子量   反应性PEG分子 PEG  9    多聚乙二醇化的    6KDa     MePEG的NHS酯 PEG 10    多聚乙二醇化的    6KDa     MePEG的NHS酯 PEG 11    多聚乙二醇化的    20KDa    MePEG的NHS酯 PEG 12    多聚乙二醇化的    50KDa    MePEG的NHS酯 PEG 14    单聚乙二醇化的    6KDa     MePEG的醛 PEG 15    单聚乙二醇化的    12KDa    MePEG的醛 PEG 16    单聚乙二醇化的    20KDa    MePEG的醛 PEG 17    单聚乙二醇化的    25KDa    MePEG的醛 PEG 18    多聚乙二醇化的    6KDa     MePEG的醛 PEG 19    多聚乙二醇化的    12KDa    MePEG的醛 PEG 20    多聚乙二醇化的    20KDa    MePEG的醛 PEG 21    多聚乙二醇化的    25KDa    MePEG的醛

基线计数在正常动物中未施用任何物质。

清楚地表明，重组人MGDF的聚乙二醇化对该分子增加受体动物中 的血小板计数没有不利影响，而且事实上对 E.coli产物22-184活 性的增加与用CHO-衍生的22-353分子所见到的一样大或者大于后者。 B.PEG-22

图24中列出了使用PEG-22的结果。值得注意的是，用PEG-22的 血小板计数正常化比用全长CHO衍生的MGDF，PEG-16或PEG-17早数 天。

                        实施例14

               在E.coli中表达重组人MGDF(1-163)

为了在 E.coli中表达r-HuMGDF，用优选的 E.coli密码子化学 合成编码成熟蛋白质前163个氨基酸的序列。另外，将编码氨基酸 Met和Lys的DNA序列加到该基因的5′末端。因此，由该序列编码 的r-HuMGDF蛋白质从Met-Lys开始，有165个氨基酸长。该基因的 序列列于图25。

用数步合成r-HuMGDF(1-163)基因。首先用优选的 E.coli 密码子化学合成代表该基因连接片段的互补寡核苷酸(60-70bp长)。 在合成过程中，将氨基酸Met和Lys的密码子放在成熟基因的5′末端， 将终止密码子放在该基因的3′末端。另外，限制酶xba I和Hind III 的切割位点分别在该基因的5′和3′末端的顶端，合成的核糖体结 合位点在离起始Met适当距离的上游。第二步，将各基因片段的互补 寡核苷酸退火。第三，用聚合酶链反应扩增这些单个的合成基因片段。 第四，将扩增的片段亚克隆到适当的载体中。第五，确定亚克隆片段 的序列。第六，将单个片段连在一起，然后亚克隆到适当的载体中， 重构建金长r-HuMGDF(1-163)基团。最后，确定重构建基因的序 列。

分别位于5′和3′末端之xba I和Hind III限制位点侧翼的合成 r-HuMGDF基因片段含有核糖体结合位点，ATG起始密码子，编码成 熟Met-Lys r-HuMGDF蛋白质的序列和终止密码子。

将上述片段克隆到乳糖诱导表达载体pAMG 11的xba I和Hind III 位点。pAMG 11载体是一种有pR 100-衍生的复制原点的低拷贝数质 粒。用PCR重叠的寡核苷酸诱变进行一系列的定点碱基改变，从质粒 pCFM 1656(ATCC#69576，于1994年2.24保藏)可以得到表达质粒 pAMG 11。从紧接着质粒复制启动子PcopB 5′的Bgl II位点(质粒 bp#180)开始，进而到质粒复制基因，碱基对改变如下： pAMG 11bp#    在pCFM 1656的bp  改变成在pAMG 11中的bp #    204           T/A                 C/G #    428           A/T                 G/C #    501           G/C                 A/T #    617           --                  插入两个G/C bp #    679           G/C                 T/A #    980           T/A                 C/G #    994           G/C                 A/T #    1004          A/T                 C/G #    1007          C/G                 T/A #    1028          A/T                 T/A #    1047          C/G                 T/A #    1178          G/C                 T/A #    1466          G/C                 T/A #    2028          G/C                 bp缺失 #    2187          C/G                 T/A #    2480          A/T                 T/A #    2499-2502     AGTG               GTCA 

               TCAC                CAGT #    2642          TCCGAGC            bp缺失

               AGGCTCG #    3435          G/C                 A/T #    3446          G/C                 A/T #    3643          A/T                 T/A #    4489-4512     --                  插入bps   

                            GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG

                            CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SEQ ID NOS：30，31) 并用下列寡核苷酸取代特有Aat II和Cla I限制位点间的DNA序列：

AatII(#4358)

5′CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-

3′TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-

  -GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT    3′

  -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC  5′

                                       ClaI(#4438)

(SEQ ID NOS：32，33)

由合成的乳糖-诱导的启动子，如Ps4启动克隆在pAMG 11中之 r-HuMGDF的表达，所述启动子有下列序列：  

5′GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-

  -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT    3′

(SEQ ID NO：34) Ps4启动子由乳糖阻遏物(LacI)， E.coli LacI基因的产物抑制。

随后，将pAMG 11-r-HuMGDF质粒转化到含LacIq等位基因的 E.coli K-12菌株中。LacIq等位基因是在LacI启动子内的突变，可 以提高LacI的表达，并对Ps4启动子的蛋白质表达有更严格的控制。 因此，在该菌株中，没有乳糖时。LacI抑制了r-HuMGDF的表达。一 旦加入乳糖，与Ps4启动子上操纵子位点结合的LacI蛋白质被还原， 然后从Ps4开始转录r-HuMGDF。在本实施例中所用的E.coli宿主细 胞于1994年11月30日以ATCC #69717保藏号在ATCC保藏。

用pAMG 11-r-HuMGDF质粒转化 E.coli宿主ATCC #69717，然后 使其按下列发酵描述生长。将 E.coli菌株接种到Luria肉汤中，然后 于30℃培养约12小时。再将细胞无菌转移到含批量培养基(20g/L 酵母提取物；3.4g/L柠檬酸；15g/L K2HPO4；15ml Dow P2000； 5g/L葡萄糖；1g/L MgSO4·7H2O，5.5ml/L痕量金属，5.5ml/L 维生素)的发酵罐中。持续批量培养过程直到培养物在600nm的光密 度达到5.0±1.0。从第一补充培养基(700g/L葡萄糖；6.75g/L MgSO4·7H2O)开始补料过程。每一新过程每隔2小时调整补料速 度。当培养物在600nm的光密度达到20-25小时，开始加入第二补料 培养基(129g/L trypticase胨：258g/L酵母提取物)。第二补料 培养基保持在一恒定的流速，而同时继续调整第一补料培养基。整个 发酵过程中的温度保持在约30℃。必要时加入酸和碱以使培养物的pH 保持在7。通过调整发酵罐中的搅拌和空气-输入得氧气-输入率而 保持所需溶解的氧水平。当培养物在600nm的光密度达到57-63时， 开始加入第三补料培养基。以恒定的流速将第三补料培养基(300g/L 乳糖)加到发酵罐中；不再继续加入第一补料培养基，同时将第二补 料培养的流速数变到一新的恒定速度。开始加入第三补料培养基后， 发酵持续约10小时。在发酵结束时，将培养物急冷到15±5℃。离心 收集细胞。包装所得的膏状物并于＜-60℃贮存。

按如下方法纯化在上述 E.coli中生产的重组MGDF。将1800g细胞 膏悬于约18升的10mM EDTA中，然后以15,000psi通过一高压匀浆器。 离心破碎的细胞悬浮液，将颗粒重悬于10升10mM EDTA中。离心悬浮 液，将200g颗粒溶解于2升10mM Tris，8M盐酸胍，10mM DTT，5mM EDTA，pH8.7中。将该溶液缓慢稀释到200升10mM CAPS，3M脲， 30％甘油，3mM胱胺，1mM Cys，pH10.5中。

于室温将稀释溶解缓慢搅拌16小时，然后将pH调整到6.8。澄清 调整了pH的溶液，然后用于2升用10mM磷酸钠，1.5M脲，15％甘油， pH6.8平衡的CM Sepharose柱。上样后，用10mM磷酸钠，15％甘油， pH7.2洗涤该柱。用0到0.5M氯化钠，10mM磷酸钠，pH7.2洗脱MGDF。

浓缩CM洗脱物，用10,000分子量截断膜，10mM磷酸钠pH6.5替换 缓冲液。于室温用组织蛋白酶C(500∶1摩尔比)处理约2mg/ml的 浓缩溶液。

然后将溶液上样到用10mM磷酸钠、15％甘油，pH7.2平衡的SP高 效Sepharose柱上。上样后，用0.1到0.25M氯化钠，10mM磷酸钠， pH7.2梯度洗脱MGDF。

将硫酸铵加到来自SP高效柱的洗脱物中。将洗脱物上样到用10mM 磷酸钠，0.6M硫酸铵，pH7.2平衡的1.6升Phenyl Toyopearl柱上。 用0.6到DM到硫酸钠，10mM磷酸钠，pH7.2的梯度洗脱MGDF峰。

浓缩Phenyl Toyopearl洗脱物，用10,000分子量截断膜将缓冲 液换成10mM Tris，5％山梨醇，pH7.5。

                        实施例15

          r-HuMGDF(E.coli 1-163)的体内生物特性

在啮齿动物中评估如实施例14制备的r-HuMGDF(E.coli 1-163) 的生物效率。正常的，用增加剂量的r-HuMGDF皮下注射雌Balb/c 小鼠，连续5天。剂量范围在15μg/kg/天到1500μg/kg/天，最 后一次注射24小时后，用电子细胞计数器(Sysmex，Baxter)测量血 细胞计数。随细胞因子浓度的对数增加，血小板计数线性增加。在该 系统中，用1500μg/kg/天血小板计数增加到300％基线值。用该 处理不影响其它血细胞参数，如白或红血细胞计数或血细胞比容。

从皮下注射了6天300μg/kg/天r-HuMGDF(E.coli 1-163) 的大鼠中收集血小板，然后评估对ADP反应的聚集能力。数据表明： 来自被处理动物的血小板与来自对照动物的血小板对于血小板激动剂 ADP的敏感性相同。

再评估r-HuMGDF消除与化疗和/或辐射相关的血小板减少症的 能力。在这些研究中，使用引起极度血小板减少症的化疗剂，卡珀。 在开始研究时，用1.25mg卡珀皮下注射Balb/c小鼠。24小时后，用 100μg/kg/天r-HuMGDF(E.coli 1-163)或赋形剂每天注射小 鼠以进行剩下的研究。第9天末，在用r-HuMGDF处理的小鼠中，血 小板计数降到赋形剂处理之小鼠中正常值的约15％，但仍在基线(见 图20)。为了进行辐射研究，使小鼠经1个500拉德剂量的γ-辐射 (铯源)。这是一个亚致死量，在11天末，会使血小板计数减少90％。 直到21天，血小板计数都不能恢复到正常值。从第1天到20天，给辐 射小鼠每天(100μg/kg/天)施用一次r-HuMGDF(E.coli 1- 163)后，血小板计数降低的程度较低，而且比用赋形剂处理的小鼠 恢复到基线更快(图21)。为了在极端和延长的血小板减少症模式中 检测r-HuMGDF，将卡珀和辐射结合起来应用(图22)。在该情况下， 血小板计数降到极低的水平(正常值的3-5％)，在这种情况下， 大多数动物(7/8)不能存活。然而，以100μg/kg/天皮下每天 注射r-HuMGDF来处理这些动物以进行长期研究，血小板减少症明显 消除，计数恢复到基线的速度更快，而且所有r-HuMGDF处理的动物 (8/8)均存活。

再在恒河猴中评估r-HuMGDF。给正常恒河猴皮下注射2.5或 25μg/kg/天10天(0-9天)。在较低的剂量组中，在12天，血 小板计数增加了400％，而在较高剂量组，也在12天，增加了700％。 停止注射后，在25-30天，血小板计数恢复到正常。白细胞计数和红 细胞计数不受这种处理的影响。

在严重血小板减少症的灵长目模型中，检测r-HuMGDF( E.coli 1-163)(图23)。使动物经辐射(700拉德，Co源)，在15天，血 小板计数降低到正常值的1-2％。在35-40天，血小板计数恢复到 正常。相反，在用r-HuMGDF(25μg/kg/天)每天处理的辐射动 物中的血小板计数只降到正常值的10％，而且未降到20,000/μl (血小板减少患者中进行血小板输注的触发点)以下。在20天，用 r-HuMGDF处理的动物中恢复到计数也更快。

来自啮齿类和灵长类的这些体内数据完全支持r-HuMGDF( E.coli 1-163)是一种有效的治疗剂的概念，它有能力明显影响临床相关的 血小板减少症。

                          实施例16

              CHO细胞培养生产r-HuMGDF 1-332的方法

从转染的中国仓鼠卵巢细胞获得糖基化的r-HuMGDF，所述细胞 表达在适当启动子下并与编码可扩增之选择标记DHFR的基因相连的 MGDF 1-332之cDNA。在CHO细胞中用于表达MGDF的适当启动子是 SRα(见 Mol.Cell.Biol.8：466-472(1988)和WO 91/13160 (1991))。用于在CHO细胞中表达MGDF的适宜载体是pDSRα2。(见 WO 91/14363(1990))。在标准细胞培养基中，举证性CHO细胞系 可以产生10-20mg/L分泌的MGDF，但也可以提高到25到≥100mg/L。 为了用典型的细胞系产生MGDF，用含有等比例Dulbecco’s  改性的 Eagle′s培养基(DMEM)和Ham′s F12(DMEM/F12，Gibco)(用5 -10％胎牛血清(FBS)或透析的胎牛血清和氨甲蝶呤(MTX)补充) (如果需要，典型的MTX浓为200-600nM)的培养基，用粘附生长 模式在悬浮液或组织培养器中传代扩大培养以保持选择压力。该培养 基应用额外的非必需氨基酸(NEAA′s)和谷氨酰胺补充。在特定的分 裂密度，通过稀释成有起始细胞密度的较大体积而扩大培养的接种 (分裂)密度1-4×105细胞/ml和最大密度～1×106细胞/ml 之间，悬浮培养物容易增殖。

为了在旋转瓶中产生MGDF，必须用置于控制环境中(37℃±1℃) 的磁搅拌旋转器或一种安装的被控制的搅拌生物反应器系统得到适宜 体积和细胞密度的悬浮培养物。应以1.5-3×107细胞/瓶的起始密 度接种旋转瓶(如850cm3 Falcon旋转瓶)并以在3-4天得到汇合 单层的适宜量用其它生长培养基(含5-10％ FBS，1×NEAA和1×L -Gln的DMEM/F12)。应用NaHCO3将生长培养基适当地将pH从6.9 缓冲到7.2，用60到90mmHg的分压以CO2平衡。瓶子应用10％CO2/ 空气充气并于37±1℃在旋转器(～1rpm)上培养3-4天。在汇合 时，通过倾倒或抽吸生长培养基，用等渗缓冲液如Dulbecco′s磷酸 缓冲盐(D-PBS)，50-100ml/瓶洗涤各瓶，然后加入适当体积用 NEAA′s和L-Gln和硫酸铜补充的碳酸氢盐-缓冲的无血清DMEM/F12 (1∶1)(200-300ml/瓶)而将旋转瓶移到无血清生产培养基中 以便共价聚集最小(1-20μM)。瓶子应用10％ CO2/空气充气并 于37±1℃在旋转器(～rpm)上培养6±1天，或者直到代谢活性 使葡萄糖水平降到0.5g/L以下和/或pH水平低于6.6。通过从瓶中倾 倒或抽吸来收集条件培养基，按上述用新鲜的无血清生产培养基替换 以进行其他收集。这可以直到细胞不再保持无血清生产并且从旋转瓶 上脱落。通过0.45μm和/或0.2μm滤器(Sartorius Sartobran pH或Pall)进行一端堵死的微过滤而纯化收集的条件培养基。应将过 滤的条件培养基冷却到4℃，然后或者于4℃暂时贮存或者立刻用横 向交叉的超滤系统(即Filtron YM-50)浓缩并透析到低离子强度。 应在4℃进行超滤和透滤以使蛋白质的降解作用最小。进行层析纯化 前，应用缓冲的水溶液(即10mM K3PO4，pH6.8)透析条件培养基。

最好用可以揭示样品中聚集的，单体和蛋白水解的MGDF相对数量 的非还原SDS-PAGE Western印迹监测条件培养基中产物的质量。

从CHO细胞生产MGDF的另一种方法是使用将MGDF表达到无血清培 养基如Gibco S-SFM II的细胞系。通过在含最小或无血清补充物的 培养基中连续传代而使用细胞。如果发现细胞系可保持生长在生产足 够量分泌之MGDF的培养基中，在逐渐增加的培养体积中经连续传代而 按比例扩大接种培养，然后接种适宜的生产容器(一种装有仪器的、 控制的搅拌箱生物反应器)并在最佳生长条件(pH、营养、温度、氧、 切变物)下使培养物增殖到其最大可存活密度。在最佳生产点(经实 验测量产物数量的质量而确定的)从生物反应器中收集培养物，通过 微米规模的深度过滤或亚微米的横向交叉微滤而从条件培养基中除去 细胞。如果用深度过滤，在按上述浓缩和透析前，应用亚微米-端堵 死的过滤将培养基进一步澄清。

已一般性并以优选的实施方案描述了本发明，应理解参照上述描 述，本领域专业人员可以有所改变。因此，本发明的权利要求覆盖了 所有的改变。它们均在本发明权利要求范围内。

另外，为说明本发明背景，而引述的文献和其他资料，特别是提 供了与其实施有关的其他详细内容的文献均引入本文作为参考。

                          序列表 (1)一般资料：

(i)：申请人：Bartley，Timothy D.

             Bogenberger，Jakob M.

             Bosse lman，Robert A.

             Hunt，Pamela

             Kinstler，Olaf B.

             Samal，Babru B.

(ii) 发明名称：刺激巨核细胞生长和分化的组合物及方法

(iii)序列数：34

(iv)通讯地址：

    (A)收件人：Amgen Inc.

    (B)街道：1840 Dehavilland Drive

    (C)城市：Thousand Oaks

    (D)州：  California

    (E)国家：USA

    (F)邮编：91320-1789

(v) 计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release # 1.0，Verion # 1.25

(vi)当前申请的资料：

    (A)申请号：

    (B)申清日：

    (C)分类号：   (viii)代理人/代理机构资料：

    (A)姓名：Cook，Robert R.

    (C)查询/提要号：A-290-C (2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：31氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1 Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1               5                   10                  15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gln Xaa Pro Asp Ile Tyr

        20                  25                  30 (2)SEQ ID NO：2的资料

(i)序列特征：

     (A)长度：21氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2 Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1               5                   10                  15 Ser His Val Leu His

        20 (2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

     (A)长度：17氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3 Thr Gln Lys Glu Gln Thr Lys Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1               5                   10                  15 Leu (2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：17个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4 GCNCCNCCNG  CNTGYGA                                                 17 (2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5 GCARTGYAAC ACRTGNGART C                                      21 (2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6 Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 1               5                   10                  15 Ser His Val Leu His

        20 (2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7 GTACGCGTTC TAGANNNNNN T                                             21 (2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8 AGTTTACTGA GGACTCGGAG G                                            21 (2)SEQ ID NO：9的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9 TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT                                   30 (2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：29个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10 TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT                                   29 (2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11 TGCGACCTCC GAGTCCTCAG                                             20 (2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：23个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12 GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT                                         23 (2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13 GGAGTCACGA AGCAGTTTAC                                             20 (2)SEQ ID NO：14的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14 CCTTTACTTC TAGGCCTG                                               13 (2)SEQ ID NO：15的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：19个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15 GAGGTCACAA GCAGGAGGA                                              19 (2)SEQ ID NO：16的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：19个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16 GGCATAGTCC GGGACGTCG                                              19 (2)SEQ ID NO：17的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：19个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17 TCCTCCTGCT TGTGACCTC                                              19 (2)SEQ ID NO：18的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：19个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18 CCAGGAAGGA TTCAGGGGA                                              19 (2)SEQ ID NO：19的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19 CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG                                  30 (2)SEQ ID NO：20的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20 GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT                                        24 (2)SEQ ID NO：21的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21 GCARTGYAAN ACRTGNGART C                                           21 (2)SEQ ID NO：22的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：16个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22 TTGGTGTGCA CTTGTG                                                 16 (2)SEQ ID NO：23的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23 CACAAGTGCA CACCAACCCC                                             20 (2)SEQ ID NO：24的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：1342个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：99..1094

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24 CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG     60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT        113

                                      Ser Pro Ala Pro Pro

                                        1               5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC      161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val

             10                  15                  20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA      209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

         25                  30                  35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC      257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

     40                  45                  50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT      305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu

 55                  60                  65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC      353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys  70                  75                  80                  85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT      401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu

             90                  95                 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG      449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg

        105                 110                 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC      497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His

    120                 125                 130 CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC       545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

135                 140                 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC       593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150                 155                 160                 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG       641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu

            170                 175                 180 TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT       689 Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu

        185                 190                 195 CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC       737 Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn

    200                 205                 210 CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA       785 Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile

215                 220                 225 CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC       833 His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg 230                 235                 240                 245 AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC       881 Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly

            250                 255                 260 TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT       929 Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His

        265                 270                 275 CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC       977 Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro

    280                 285                 290 ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA      1025 Thr Pro Val Val Gln Lau His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro

295                 300                 305 ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC      1073 Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser 310                 315                 320                 325 CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA         1124 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            330 TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT    1184 TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA    1244 ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA    1304 CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA                            1342 (2)SEQ ID NO：25的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：332氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Lau Ser Lys Leu Leu   1               5                  10                  15 Arg Asp Ser His Val Lau His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

         20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

     35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

 50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln  65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

             85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110     Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    1l5                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145                 150                 155                 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

            165                 170                 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

        180                 185                 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile

    195                 200                 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly

210                 215                 220 Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225                 230                 235                 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly

            245                 250                 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser

        260                 265                 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

    275                 280                 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro

290                 295                 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305                 310                 315                 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            325                 330 (2)SEQ ID NO：26的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：1342个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(8)位置：99..621

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26 CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG    60 TGGTCATGCT TCTCCCAACT GCAAGGCTAA CGCTGCCC AGC CCG GCT CCT CCT       113

                                      Ser Pro Ala Pro Pro

                                        1               5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC     161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val

             10                  15                  20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA     209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

         25                  30                  35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC     257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

     40                  45                  50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT     305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu

 55                  60                  65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC     353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys  70                  75                  80                  85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT     401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu

             90                  95                 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG     449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg

        105                 110                 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC     497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His

    120                 125                 130 TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC      545 Leu  Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

 135                 140                 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC     593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150                 155                 160                 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG         641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu

            170 TTGGAGAGAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG   701 CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA   761 ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT   821 GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC   881 TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA   941 CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC  1001 CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC  1061 TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA    1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG    1181 ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG    1241 GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA    1301 ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A                        1342 (2)SEQ ID NO：27的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：174氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu   1               5                  10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

         20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

     35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

 50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln  65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

             85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Tnr Thr Ala 145                 150                 155                 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu

            165                 170 (2)SEQ ID NO：28的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：1164个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：97..894

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28 AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG     60 GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT      114

                                    Ser Pro Ala Pro Pro Ala

                                      1               5 TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT      162 Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu

         10                  15                  20 CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT      210 His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro

     25                  30                  35 GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG      258 Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln

 40                  45                  50 ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG      306 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu  55                  60                  65                  70 CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC     354 Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu

             75                  80                  85 TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG     402 Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly

         90                  95                 100 GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC     450 Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr

    105                 110                 115 ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG     498 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu

120                 125                 130 CTC CGA GGA AGG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC     546 Leu Arg Gly lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 135                 140                 145                 150 AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG     594 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln

            155                 160                 165 AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA     642 Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro

        l70                 175                 180 AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG     690 Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser

    185                 190                 195 TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT     738 Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His

200                 205                 210 TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC     786 Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro Ala 215                 220                 225                 230 TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT     834 Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala

            235                 240                 245 CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC     882 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro

        250                 255                 260 CCT GC  TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT             931 Pro Ala Ser

    265 CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA   991 CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA    1051 CAACTGGACA AGATTTCCCA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC    1111 AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA           1164 (2)SEQ ID NO：29的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：265个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu   1               5                  10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

         20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

     35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp I1e Leu

 50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln  65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

             85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly

130                 L35                 140 Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu 145                 150                 155                 160 Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn

            165                 170                 175 Leu Gln Val Pro Gly Pro Ash Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg

        180                 185                 190 Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp

    195                 200                 205 Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Lau Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro

210                 215                 220 Ala Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 225                 230                 235                 240 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro

            245                 250                 255 Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser

        260                 265 (2)SEQ ID NO：30的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30 GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG                                               24 (2)SEQ ID NO：31的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31 CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC                                           24 (2)SEQ ID NO：32的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：80个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32 CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT     60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT                                                 80 (2)SEQ ID NO：33的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：86个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33 CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA    60 TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT                                         86 (2)SEQ ID NO：34的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：89个碱基对    

   (B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：34 GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC    60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT                                      89