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三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯共轭化合物及其制备方法与应用

阅读：1033发布：2020-06-15

专利汇可以提供三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯共轭化合物及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E 琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物及其制备方法与应用。该化合物的结构式如式I所示。该共轭化合物的制备方法，包括如下步骤：（1）三苯基膦与6-溴己酸进行反应得到式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦；（2）式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦与聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯进行酯化反应即得到式Ⅰ所示共轭化合物。本发明还提供了一种包括该共轭化合物的线粒体靶向性紫杉醇脂质体。经药效试验证明，线粒体靶向性紫杉醇脂质体在人肺腺癌A549细胞及其耐药A549/cDDP细胞的体外细胞实验及体内移植瘤模型中都具有很强的细胞毒作用，可提高紫杉醇对耐药性A549/cDDP细胞的抗肿瘤效果。，下面是三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯共轭化合物及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯共轭化合物，其结构式如式Ⅰ所示，
式Ⅰ中，n为23。
2.式Ⅰ所示共轭化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）三苯基膦与6-溴己酸进行反应得到式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦；
（2）式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦与聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯进行酯化反应即得到式Ⅰ所示共轭化合物；
式Ⅰ中，n为23。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述反应的温度为80～
85℃，时间为14～17小时，溶剂为乙腈；
步骤（2）中所述酯化反应的温度为20～25℃，时间为18～24小时，溶剂为DMSO 或二氯甲烷。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述酯化反应的缩合剂为二环己基碳二亚胺，催化剂为4-二甲氨基吡啶。
5.一种线粒体靶向性紫杉醇脂质体，其由紫杉醇、脂材和靶向性材料组成；
所述脂材由蛋黄卵磷脂和胆固醇组成；
所述靶向性材料为式Ⅰ所示共轭化合物；
所述蛋黄卵磷脂、胆固醇与靶向性材料的摩尔份数比为（85-90）：（2.5-10）：（3-8.5），所述紫杉醇与脂材的质量份数比为1：（20-40）；
式Ⅰ中，n为23。
6.权利要求5所述线粒体靶向性紫杉醇脂质体的制备方法，包括如下步骤：
将所述紫杉醇、脂材和靶向性材料溶于有机溶剂中，蒸除所述有机溶剂后得到脂膜；
将所述脂膜用PBS缓冲液水化得到悬液，所述悬液经匀质处理后再由微孔滤膜过滤即得到所述线粒体靶向性紫杉醇脂质体。
7.权利要求5所述线粒体靶向性紫杉醇脂质体在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌，所述癌为肺癌。
9.权利要求5所述线粒体靶向性紫杉醇脂质体在制备真核生物肿瘤细胞增殖的抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肺癌细胞。

说明书全文

三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯共轭化合物及

其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物及其制备方法与应用，具体涉及该共轭化合物在构建紫杉醇脂质体中的应用。

背景技术

[0002] 功能性材料修饰的药物运输系统为难治性癌症提供了一种潜在策略。肿瘤的难治性除了涉及患者的病生理状态，还与药物运输有关。化疗药通常以注射游离药物的形式进行给药，而这种给药方式会导致药物在肿瘤病灶部位积累量较少及药学在全身组织器官的非靶向分布。

[0003] 此外，肿瘤的多药耐药性是化疗失败的主要原因，可导致肿瘤细胞对治疗的耐药、复发及转移，尤其是内源性的多药耐药。肿瘤细胞可通过改变前凋亡及凋亡基因编码的蛋白质（如Bcl-2家族蛋白、凋亡信号通路中的Caspase蛋白等）的功能来引起遗传及表观遗传的改变，从而造成内源性的多药耐药。

[0004] 癌症的化疗主要采取两种基本方式来消除肿瘤细胞：一是通过将化疗药直接作用于肿瘤细胞将其杀死，例如通过造成DNA结构损伤杀死细胞；二是诱导细胞的自杀，即凋亡。凋亡是一种通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。这两种方式都与线粒体有关。

[0005] 凋亡的内源性通路起始于线粒体，可由三种因素介导：Caspase直接活化因子，如细胞色素C（cytochrome C）、Caspase间接活化因子，如Smac/Diablo，以及Caspase非依赖性细胞程序性死亡影响因子，如AIF。抗癌药物通过与死亡受体的配体交联，从而激活上游的Caspase，并通过触发各种形式的细胞应激，释放凋亡因子。

[0006] 线粒体是一种绝大多数真核细胞中都存在的膜封闭的细胞器，是细胞的能量工厂。线粒体除了可以供应细胞能量，也是细胞命运的调控中心，参与细胞分化、细胞死亡，控制着细胞的周期和生长。由于其在细胞死亡过程中的重要性，线粒体被认为是一种肿瘤靶向性药物运输的有效靶点。

[0007] 三苯基膦是一种具有跨越线粒体膜并在线粒体内部积累功能的阳性小分子。三苯基膦含有三个苯环结构，导致了高度疏水性及磷原子上正电荷在三个苯环集团上的电子离域效应。这种分子表面的电荷分布已被报道可以降低三苯基膦跨越脂质膜所需的能量。

[0008] 紫杉醇（paclitaxel）是从红豆杉属植物中提取和纯化得到的一种具有高效抗肿瘤活性的天然物质，对许多类型的癌症具有显著的疗效。但是，由于紫杉醇的水溶性低，其游离药在肿瘤治疗中的疗效被大大降低。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物及其制备方法与应用。

[0010] 本发明提供的三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物，其结构式如式Ⅰ所示，

[0011]

[0012] 式Ⅰ

[0013] 式Ⅰ中，n为23。

[0014] 本发明提供了式Ⅰ所示共轭化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0015] （1）三苯基膦与6-溴己酸进行反应得到式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦；

[0016]

[0017] 式IV

[0018] 三苯基膦的结构式如式Ⅱ所示，6-溴己酸的结构式如式Ⅲ所示；

[0019]

[0020] 式Ⅱ 式Ⅲ

[0021] （2）式IV所示5-羧戊基三苯基溴化膦与聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯进行酯化反应即得到式Ⅰ所示共轭化合物；

[0022] 其中，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的结构式如式V所示，式中，n为23，[0023]

[0024] 上述的制备方法中，步骤（1）中所述反应的温度可为80~85℃，如81℃，时间可为14~17小时，如16小时，溶剂可为乙腈。

[0025] 步骤（2）中所述酯化反应的温度可为20~25℃，如20℃，时间可为18~24小时，如18小时，溶剂可为DMSO或二氯甲烷。

[0026] 上述的制备方法中，步骤（2）中所述酯化反应的缩合剂可为二环己基碳二亚胺，催化剂可为4-二甲氨基吡啶。

[0027] 本发明的再一个目的是提供一种线粒体靶向性紫杉醇脂质体及其制备方法。

[0028] 本发明所提供的线粒体靶向性紫杉醇脂质体，其由紫杉醇、脂材和靶向性材料组成；

[0029] 所述脂材由蛋黄卵磷脂和胆固醇组成；

[0030] 所述靶向性材料为式Ⅰ所示共轭化合物；

[0031] 所述蛋黄卵磷脂、胆固醇与靶向性材料的摩尔份数比为（85-90）：（2.5-10）：（3-8.5），如88：3.5：8.5，所述紫杉醇与脂材的质量份数比为1：（20~40），如1：35。

[0032] 本发明所提供的线粒体靶向性紫杉醇脂质体的制备方法，包括如下步骤：

[0033] 将所述紫杉醇、脂材和靶向性材料溶于有机溶剂中，蒸除所述有机溶剂后得到脂膜；

[0034] 将所述脂膜用PBS缓冲液水化得到悬液，所述悬液经匀质处理后再由微孔滤膜过滤即得到所述述线粒体靶向性紫杉醇脂质体。

[0035] 上述的制备方法中，所述有机溶剂可为甲醇或甲醇与氯仿的混合物（两者体积比可为1：3）；可通过超声或高压进线匀质处理。

[0036] 本发明另一个目的是提供上述线粒体靶向性紫杉醇脂质体的应用。

[0037] 本发明提供的线粒体靶向性紫杉醇脂质体可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤可为癌，所述癌优选为肺癌，更优选为内源性耐药肺癌。

[0038] 本发明提供的线粒体靶向性紫杉醇脂质体可用于制备真核生物肿瘤细胞增殖的抑制剂，所述真核生物可为哺乳动物；所述肿瘤细胞可为癌细胞；所述癌细胞可为肺癌细胞，优选人肺腺癌A549细胞或多药耐药肺癌A549/cDDP细胞。

[0039] 本发明合成了一种三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物，并将其作为线粒体导向性分子修饰到线粒体靶向性紫杉醇脂质体表面来克服肿瘤细胞的耐药性。利用人肺腺癌A549细胞及其耐药A549/cDDP细胞、A549及A549/cDDP肿瘤球、耐药性A549/cDDP细胞裸鼠移植瘤模型进行药效实验。线粒体靶向性紫杉醇脂质体粒径约为80nm。线粒体靶向性脂质体显著提高了细胞对药物的摄取，并将药物选择性的蓄积在线粒体中。线粒体靶向性紫杉醇脂质体可通过诱导线粒体释放细胞色素C及激活Caspase 3和Caspase 9以及调节Bcl-2蛋白家族的表达诱导敏感及耐药性癌细胞凋亡。线粒体靶向性紫杉醇脂质体在两种细胞系的体外细胞实验及耐药细胞系体内移植瘤模型中都具有很强的细胞毒作用。
附图说明

[0040] 图1为本发明TPGS1000-TPP共轭化合物的合成路线。

[0041] 图2为TPGS1000和实施例1制备的TPGS1000-TPP的MALDI-TOF-MS图谱，其中，图2（A）和图2（B）分别为TPGS1000和TPGS1000-TPP图谱。

[0042] 图3为5-羧戊基三苯基溴化膦、TPGS1000和实施例1制备的TPGS1000-TPP的1HNMR图谱；阴影所示的质子峰即为相同颜色的箭头所指示的质子（或连在箭头所示的碳原子上的质子）的信号，分别为TPP分子上的芳香氢和TPGS1000-TPP分子上的聚乙二醇。

[0043] 图4为紫杉醇脂质体的电镜透射电镜照片和原子力显微镜照片，其中，图4（A）和图4（B）分别为电镜透射电镜照片和原子力显微镜照片。

[0044] 图5为紫杉醇脂质体中药物的累计释放量（%），释放介质为含有10%胎牛血清的pH7.4PBS溶液。

[0045] 图6为给药后48hA549细胞及A549/cDDP细胞的存活率（%），其中，图6（A）和图6（B）分别为A549细胞和A549/cDDP细胞的存活率。

[0046] 图7为给药后24hA549细胞及A549/cDDP细胞的凋亡诱导率（%）。

[0047] 图8为A549细胞和A549/cDDP细胞给药处理后细胞摄取和线粒体摄取的结果，其中图8（A）和图8（B）分别为细胞摄取和线粒体摄取的结果，图中纵坐标的荧光强度代表用流式细胞仪测定的药物含量。

[0048] 图9为A549细胞（图9（A））和A549/cDDP细胞（图9（B））中药物与细胞中线粒体的共定位，其中细胞的线粒体用线粒体红荧光探针标记；以及A549细胞（图9（C））和A549/cDDP细胞（图9（D））提取的线粒体片段中药物与线粒体的共定位。

[0049] 图10为各紫杉醇制剂组对A549/cDDP细胞细胞色素C释放的影响。

[0050] 图11为各紫杉醇制剂组给药后对移植瘤模型的治疗效果（图11（A））和给药期间荷瘤裸鼠的体重变化（图11（B））。

具体实施方式

[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0052] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0053] 实施例所用的材料如下：

[0054] 聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000）购自美国Sigma公司，产品目录号为57668。

[0055] 三苯基膦（TPP）购自J&K公司，产品批号为110246。

[0056] 6-溴己酸购自美国Sigma公司，产品货号为150452

[0057] 二环己基碳二亚胺（DCC）购自美国Sigma公司，产品货号为D80002。

[0058] 4-二甲氨基吡啶（DMAP）购自美国Sigma公司，产品货号为522805。

[0059] 紫杉醇干粉购自南京天尊泽众化学试剂公司，产品批号为080315。

[0060] 泰素注射剂购自海口市制药厂，批准文号为国药准字H20043045。

[0061] 蛋黄卵磷脂（EPC）购自日本油脂株式会社，产品目录号为108057-3。

[0062] 胆固醇购自北京市海淀区微生物培养基制品厂，批号20020106。

[0063] 紫杉醇的分子式为C47H51NO14，分子结构式：

[0064]

[0065] 实施例1、三苯基膦-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS1000-TPP）共轭化合物的合成与表征

[0066] 合成路线图如图1所示。

[0067] 将5mmol TPP与5.25mmol 6-溴己酸混合于5ml无水乙腈中，在氮气保护下加热回流16小时。将混合产物重结晶得到白色固体粉末5-羧戊基三苯基溴化膦。

[0068] TPGS1000-TPP由5-羧戊基三苯基溴化膦上的羧基和TPGS1000上的羟基通过酯化缩合，用DCC作为反应缩合剂。将0.33mmol 5-羧戊基三苯基溴化膦、0.066mmolTPGS1000、0.40mmol DCC和0.006mmol DMAP溶解在3ml DMSO溶液中，将反应液混合物在室温氮气保护条件下，用磁力搅拌器轻轻搅拌18h得到粗产物，继而将粗产物过滤，将滤液转移到再生纤维素透析袋（截留分子量1000），在DMSO溶液中透析24h，再在去离子水中透析24h，除去未反应的5-羧戊基三苯基溴化膦、DMAP、DCC、和副产物DCU。接下来将反应液冻干，得到
1
干燥的产物混合物白色粉末，并使用核磁共振氢谱（H NMR）、激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行检测。

[0069] 图2为TPGS1000和TPGS1000-TPP的MALDI-TOF-MS图谱。图谱中显示，反应产物中TPGS1000-TPP的平均分子质量为1902.9（图2（B））；TPGS1000在质谱图中的信号表现为加Na+峰和加K+峰，平均分子质量的峰值分别为其分子质量为1565.8和1581.8（图2（A）），TPGS1000-TPP与TPGS1000之间的质量差与5-羧戊基三苯基溴化膦的分子质量相吻合。

[0070] 图3为5-羧戊基三苯基溴化膦、TPGS1000和TPGS1000-TPP分子的1H NMR谱图。如图5所示，5-羧戊基三苯基溴化膦及TPGS1000分子的特征峰都可在反应产物TPGS1000-TPP1
的 H NMR谱图中找到。酯化反应后，TPGS1000-TPP分子保留了TPP上的芳香氢信号（7.70~7.80ppm，用箭头标记）。

[0071] 实施例2、脂质体的制备与表征

[0072] 1）脂质体的制备：

[0073] 通过薄膜分散法和挤压过膜制备靶向性紫杉醇脂质体，此外，未载药的靶向性脂质体、普通紫杉醇脂质体、普通及靶向性香豆素脂质体分别作为对照、细胞毒制剂及荧光探针。

[0074] 脂质体由脂材（蛋黄卵磷脂（EPC）和胆固醇）以及靶向性材料TPGS1000-TPP构成，三者摩尔比为88：3.5：8.5。脂材和紫杉醇比例为脂材：紫杉醇=35：1（质量/质量），将脂材、靶向性材料和紫杉醇置于茄形瓶中用甲醇溶解后，旋转蒸发除去甲醇，脂膜用PBS缓冲液水化，探头超声10分钟（110W），挤压分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯膜三次，制得靶向性紫杉醇脂质体。

[0075] 普通紫杉醇脂质体通过相同方法制备，脂质体中的TPGS1000-TPP用TPGS1000代替。靶向性香豆素脂质体及香豆素脂质体的制备方法与上述方法相同，其中脂材与香豆素的比例为500：1（质量/质量）。

[0076] 2）脂质体的表征：

[0077] 将制备的靶向性紫杉醇脂质体、普通紫杉醇脂质体、靶向性香豆素脂质体以及普通香豆素脂质体分别过Sephadex G-50柱，分离游离的药物，流动相为PBS缓冲液。过柱前后的脂质体悬液分别用9倍甲醇破坏，紫杉醇用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率，香豆素用荧光检测器。紫杉醇的测定条件：ODS C18柱（Nucleodur100-5C18column,250×4.6mm,5.0μm）；25 °C；检测波长227nm；流速 1.0ml/min；
流动相乙腈/水(60/40,体积比)。香豆素的检测条件：ODS C18柱（Nucleodur
100-5C18column,250×4.6mm,5.0μm）；25°C；激发和发射波长分别为467nm和502nm；流速为1.0ml/min；流动相甲醇/水（95/5，体积比）。紫杉醇、香豆素的包封率（EE）按以下公式计算：EE=(Wi/Wtotal)×100%，其中，Wi是过Sephadex G-50柱后被甲醇破坏的脂质体中药物的质量。Wtotal是与过柱的脂质体体积相同的过柱前的经甲醇破坏的脂质体中的药物质量。

[0078] 脂质体的粒径和Zeta电位用Nano Series Zen 4003Zeta Sizer(Malvern instruments,Ltd,UK)测定。

[0079] 脂质体表面及形态使用透射电镜（TEM,Tecnai G220ST,FEI Co.,Japan）及原子力显微镜（AFM,SPI3800N series SPA-40,Japan）进行观察。

[0080] 体外脂质体释放实验在含血清的释放液（含10%胎牛血清的PH7.4的PBS）中进行。1ml脂质体与1ml去离子水密封在透析袋中，透析袋浸没在40ml释放液中，立即置于振荡器中，37°C，100次/分钟的条件下持续震荡24小时。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和
24小时取0.5ml释放液，并马上补加相同体积的新鲜释放液。释放液中紫杉醇浓度的测定方法同包封率的测定。释放率（RR,%）的计算公式：RR=(Wi/Wtotal)×100%，其中Wi是在i时间点取出的释放液中紫杉醇的质量，Wtotal是与透析体积相同的脂质体在透析前紫杉醇的质量。每项实验平行重复三次。

[0081] 3）结果

[0082] 表1脂质体的表征

[0083]

[0084] 表1所示为未载药普通脂质体、未载药靶向性脂质体、普通紫杉醇脂质体、靶向性紫杉醇脂质体、普通香豆素脂质体和靶向性香豆素脂质体的包封率、平均粒径、粒径的多分散指数和Zeta电位。结果显示，上述脂质体的平均粒径为80nm左右，分布均一。紫杉醇在靶向性脂质体及普通脂质体中的包封率均大于85%，香豆素在两种脂质体中包封率均大于90%。除靶向性紫杉醇脂质体带轻微的正电性外，其他所有脂质体都带有轻微的负电性。

[0085] 图4（A）为两种紫杉醇脂质体（普通紫杉醇脂质体和靶向性紫杉醇脂质体）的透射电镜图像，4（B）为两种紫杉醇脂质体（普通紫杉醇脂质体和靶向性紫杉醇脂质体）的原子力显微镜图像。从图中可以看出，两种紫杉醇脂质体粒径均为80~100nm左右，与粒径仪检测结果相符。由透射电镜可以看出靶向性紫杉醇脂质体表面比普通紫杉醇脂质体更加致密。

[0086] 图5为紫杉醇从脂质体中的释放率，在最初的2h内，释放率均低于30%，在第24小时，累积释放率均低于50%。

[0087] 实施例3、线粒体靶向性紫杉醇脂质体的药效实验

[0088] （一）细胞培养

[0089] 人肺腺癌A549细胞（购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所）用含10%胎牛血清及1%双抗（100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素）的RPMI-1640培养基培养；多药耐药肺癌A549/cDDP细胞（购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所）用含10%胎牛血清及1%双抗（100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）的RPMI-1640培养基培养，为了保持细胞耐药性，培养液中加入终浓度4μM的顺铂，并在实验前一周用不含顺铂的上述培养基培养。两种细胞的培养条件均为为5%CO2，37°C。

[0090] （二）细胞毒作用3

[0091] 将A549细胞或A549/cDDP细胞以5.0×10 个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板中，在5%CO2、37°C的条件下培养24h后，将培养液吸出，分别加入含有不同浓度梯度的未载药靶向性脂质体、泰素、普通紫杉醇脂质体或靶向性紫杉醇脂质体的新鲜培养基。紫杉醇的终浓度为0~10M，未载药靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同。用空白培养基培养作为对照组。给药孵育48h后，用乙酰罗丹明B染色法评价细胞毒作用，酶标仪的吸收波长为540nm，抑制率使用以下公式计算：抑制率%=100%-（加药组在540nm处的吸光度值/空白对照组在540nm处的吸光度值）×100%。每个实验重复三次，每个浓度设五个复孔，所得结果绘制药效曲线。

[0092] 图6为靶向性紫杉醇脂质体及其他对照制剂组对A549细胞和A549/cDDP细胞的抑制作用，其中，显著性差异a,p<0.05，vs未载药靶向性脂质体；b,p<0.05，vs泰素；c,p<0.05，vs普通紫杉醇脂质体，结果显示，在各个给药浓度为1、5and 10μM时，靶向性紫杉醇脂质体具有最强的抑制A549细胞和A549/cDDP细胞增殖的作用。此外，普通紫杉醇脂质体对A549细胞和A549/cDDP细胞的细胞毒作用大于泰素。未载药线粒体靶向性脂质体仅在浓度大于1μM时对于细胞具有一定的细胞毒作用，且浓度为10μM时，对细胞的杀伤率未超过30%。

[0093] （三）诱导凋亡作用

[0094] 细胞的凋亡用Annexin V-FITC凋亡探针试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司，产5
品编号CX1001）染色，流式细胞仪进行检测。将A549细胞或A549/cDDP细胞以4×10 个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中，培养液体积为2ml，并在5%CO2at 37°C的条件下培养
24h。接下来，用泰素、普通紫杉醇脂质体、靶向性紫杉醇脂质体孵育细胞24h，紫杉醇终浓度为10μM，含血清培养基培养作为对照组。接下来将细胞收集，重悬在试剂盒中提供的缓冲液中，加入10μl Annexin V-FITC探针，混匀，室温下避光孵育15min，之后加入5μl PI，
4
立即用流式细胞仪分析，收集数为每个样品1×10 个细胞。每个实验重复三次。

[0095] 图7为各制剂组诱导A549细胞及A549/cDDP细胞凋亡的结果，其中，A549细胞中，显著性差异a,p<0.05，vs空白对照;b,p<0.05，vs泰素;c,p<0.05，vs普通紫杉醇脂质体；A549/cDDP细胞中，显著性差异d,p<0.05，vs空白对照；e,p<0.05，vs泰素;f，p<0.05，vs普通紫杉醇脂质体，结果显示，与泰素及普通紫杉醇脂质体相比，靶向性紫杉醇脂质体在两种细胞系中都具有最显著的凋亡诱导效应。

[0096] （四）细胞内摄取

[0097] 利用流式细胞仪测量A549细胞或A549/cDDP细胞对药物的摄取。将A549细胞或5
A549/cDDP细胞以4×10 个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中，培养液体积为2ml，并在
5%CO2，37°C的条件下培养24h。接下来，用游离香豆素、普通香豆素脂质体和靶向性香豆素脂质体孵育细胞0.5h，香豆素终浓度为1μM，用空白培养基培养作为对照组。给药孵育后，将细胞用0.25%胰蛋白酶收集，并用冷的PBS洗两次。细胞摄取量用流式细胞仪测定，
4
收集数为每个样品1×10 个细胞，荧光强度表示细胞摄取量的大小。每个实验重复三次。

[0098] 图8（A）为A549细胞及A549/cDDP细胞给药处理后细胞摄取的荧光强度结果，给药孵育0.5h后，空白对照组、游离香豆素、普通香豆素脂质体及靶向性香豆素脂质体在A549细胞中的几何平均荧光强度分别为5.59±0.12,173.38±1.26,792.72±5.55以及1273.27±14.42，相应对于A549/cDDP细胞分别为6.64±0.08,125.67±6.32,795.59±13.13及1208.27±48.32，其中，A549细胞中，显著性差异a,p<0.05,vs空白对照；
b,p<0.05,vs游离香豆素；c,p<0.05,vs普通香豆素脂质体；A549/cDDP细胞中，显著性差异d,p<0.05,vs空白对照;e,p<0.05,vs游离香豆素;f，p<0.05,vs普通香豆素脂质体。

[0099] （五）线粒体摄取

[0100] 用流式细胞仪进一步对线粒体内药物浓度进行定量。将A549细胞或A549/cDDP细胞用游离香豆素、香豆素脂质体和线粒体靶向性香豆素脂质体在5%CO2、37°C的条件下孵育24h，A549细胞中香豆素终浓度为1.0μM，A549/cDDP细胞中终浓度为2.5μM，用含血清的培养基培养作为对照组。接下来将细胞收集并用冷的PBS漂洗两次，提取线粒体，其步骤根据细胞线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术研究所，产品编号C3601）的说明书进行操作。将细胞加入线粒体提取试剂中反应15分钟，用玻璃匀浆器搅拌，得到的悬液用离心力600g离心10min，收集上清，再次以离心力11000g离心10min，其沉淀即为细胞线粒体。线
4
粒体的药物摄取量用流式细胞仪测定，收集数为每个样品1×10 个线粒体，荧光强度表示摄取量的大小。每个实验重复三次。

[0101] 图8（B）为流式细胞仪测定给药后A549细胞及A549/cDDP细胞提取的线粒体的荧光强度。给药孵育24h后，空白对照组、游离香豆素组、普通香豆素脂质体组及靶向性香豆素脂质体组A549细胞的几何平均荧光强度分别为8.90±1.94,165.79±36.52,121.94±24.18和388.09±70.92，相应对于A549/cDDP细胞分别为11.49±2.51,311.79±45.68和895.04±17.96。靶向性香豆素脂质体组的线粒体有最强的荧光强度。

[0102] （六）线粒体靶向性

[0103] A、细胞内线粒体共定位

[0104] 利用激光共聚焦显微镜观察线粒体靶向性脂质体靶向线粒体的作用。将A5495
细胞或A549/cDDP细胞以1×10 个/孔的浓度接种到玻底皿中，培养液体积为2ml，并在
5%CO2、37°C的条件下培养24h。接下来，用游离香豆素、普通香豆素脂质体和靶向性香豆素脂质体孵育细胞24h，A549细胞中香豆素终浓度为1.0μM，A549/cDDP细胞中终浓度为
2.5μM，用含血清的培养基培养作为对照组。接下来将细胞用PBS漂洗，用线粒体红荧光探针标记细胞线粒体，在5%CO2、37°C的条件下孵育30min，A549细胞的线粒体红荧光探针浓度为0.25μM，A549/cDDP细胞的线粒体红荧光探针浓度为0.5μM，PBS漂洗后用激光共聚焦显微镜进行图像分析。

[0105] 细胞线粒体通过线粒体红荧光探针染成红色，绿色的香豆素作为各制剂组的荧光探针，显示其亚细胞定位，图9（A）（A549细胞）和图9（B）（A549/cDDP）中的黄色荧光为绿色和红色荧光的组合，表示制剂与线粒体的共定位。如图所示，线粒体靶向性香豆素脂质体具有特定的分布，选择性集中在线粒体上，具有最明显的黄色荧光。然而，游离香豆素组及普通香豆素脂质体组的细胞中没有显示黄色荧光。

[0106] B、线粒体片段内共定位

[0107] 利用激光共聚焦显微镜进一步观察线粒体靶向性脂质体靶向提取出的线粒体的作用。图9（C）和图9（D）分别为各制剂组在由A549细胞及A549/cDDP细胞提取出的线粒体中的激光共聚焦显微图像。如图所示，靶向性脂质体能够穿过线粒体膜在线粒体内部聚集，而不是仅仅在线粒体周围积累或表面吸附。相比之下，游离香豆素组及普通香豆素脂质体组的线粒体中没有显示共定位的黄色荧光。其结果与细胞内共定位图像相一致。

[0108] （七）诱导线粒体内细胞色素C释放效应

[0109] 细胞给药处理后线粒体及细胞质中细胞色素C的释放用链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫组化方法考察，采用SP免疫组化试剂盒进行试验（中5
杉金桥生物科技有限公司，产品编号SP9003）。将A549/cDDP细胞1×10 个/孔的浓度孵育24h，用泰素、普通紫杉醇脂质体和靶向性紫杉醇脂质体孵育细胞12h，紫杉醇终浓度为
10μM，含血清培养基培养作为对照组。给药结束后，将细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，后按顺序加入下列试剂：0.3%Tritonx-100，3%H2O2(v/v)和10%山羊血清。然后加入细胞色素C一抗（凯基生物科技有限公司，产品编号KG22230），4°C过夜。加入二抗及HRP-结合反应液与之反应。孵育、漂洗后，样品利用DAB试剂盒（中杉金桥生物科技有限公司，产品编号ZLI-9033）进行显色，光学显微镜观察。

[0110] 结果见图10。A1、A2、A3和A4分别表示A549/cDDP细胞给药处理后空白对照组、泰素组、普通紫杉醇脂质体组以及靶向性紫杉醇脂质体组细胞色素C释放情况。图内棕色区域代表细胞色素C的释放。如图所示，三种紫杉醇脂质体后，细胞质内细胞色素C释放增加，说明线粒体内的细胞色素C被药物诱导释放到了细胞质内。其中，靶向性紫杉醇脂质体组细胞色素C释放最为明显。泰素及普通紫杉醇脂质体同样可诱导细胞色素C的释放，诱导效应低于线粒体靶向性紫杉醇脂质体。

[0111] （八）Caspase活性检测

[0112] 给药后的Caspase 3和Caspase 9的活性通过经特异的蛋白酶（是试剂盒中的物质）裂解后释放荧光的蛋白底物试剂盒（凯基生物科技有限公司，产品编号KGA201、KGA401）进行测量。将A549/cDDP细胞孵育24h，用泰素、普通紫杉醇脂质体、和靶向性紫杉醇脂质体孵育细胞12h，紫杉醇终浓度为10μM，含血清培养基培养作为对照组。将细胞收集、裂解，细胞裂解液在4°C下10000转/分钟离心1min，保留上清液，分别用Caspase 3和Caspase 9的特异性底物孵育，再用酶标仪测定其在405nm下的吸光度值，即为Caspase 3和Caspase 9的浓度，并通过试剂盒中所示方法计算其活性比例。每个实验重复三次。

[0113] 结果见表2。表2中A行和B行分别为给药后A549/cDDP细胞中caspase 3和caspase 9的活性与空白对照组的比例。对于A549/cDDP细胞，给予泰素、普通紫杉醇脂质体、和靶向性紫杉醇脂质体后，细胞内caspase 3的活性比分别为1.00±0.02、1.32±0.30、1.37±0.40和2.48±0.85，caspase 9 的活性比分别为1.00±0.03、
1.19±0.07、1.16±0.11和2.51±0.64。由结果可知，靶向性紫杉醇脂质体具有最显著的诱导caspase 9和caspase 3活化的效果。

[0114] （九）Bcl-2凋亡蛋白家族的表达

[0115] Bax、Bid、Bcl-2和Bcl-xl蛋白活性采用elisa试剂盒检测(Bax和Bcl-2试剂盒购自武汉华美生物科技公司；Bid&Bcl-xl试剂盒购自美国R&D公司北京代理)。将A549/cDDP细胞孵育24h，用泰素、普通紫杉醇脂质体和靶向性紫杉醇脂质体孵育细胞24h，紫杉醇终浓度为10μM，含血清培养基培养作为对照组。将细胞收集、裂解，用试剂盒中抗体孵育30分钟。用缓冲液（试剂盒中提供）冲洗后，加入HRP-结合反应液孵育30分钟。按照试剂盒中说明书进行显色，再用酶标仪测定其在405nm下的吸光度值，即为Bcl-2凋亡蛋白的浓度，再计算其活性比例。

[0116] 结果见表2。表2中C行至F行分别为给药后A549/cDDP细胞中Bax、Bid、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的活性与空白对照组的比例。对于A549/cDDP细胞，给予泰素、普通紫杉醇脂质体、和靶向性紫杉醇脂质体后，细胞内Bax的活性比分别为1.00±0.08、1.12±0.36、0.64±0.28和1.42±0.23，Bid的活性比分别为1.00±0.02、0.96±0.09、1.17±0.27和
1.37±0.39，Bcl-2的活性比分别为1.00±0.08、0.26±0.09、0.21±0.09和0.23±0.12，Bcl-xl的活性比分别为1.00±0.02、0.99±0.12、0.99±0.13和0.78±0.20。

[0117] （十）体内抗耐药性肺癌移植瘤效应

[0118] 雌性BALB/c裸鼠（体重18-20g）购自北京大学医学部实验动物中心，动物在无菌7
条件下饲养，无菌条件下操作。将1×10A549/cDDP细胞混悬于200μl无血清培养基中，皮下注射到裸鼠腋下。每天观察裸鼠的腋下肿瘤生长情况，并记录肿瘤的体积。当肿瘤体
3
积达到210~230mm 时，将裸鼠随机分成4组，每组5只进行给药治疗。在给裸鼠接种A549/cDDP细胞后的第15、18、20、22和24天，分别通过尾静脉注射生理盐水、泰素、普通紫杉醇脂质体和靶向性紫杉醇脂质体，其中紫杉醇剂量为10mg/kg，生理盐水组为空白对照组。每
2 3
天测量肿瘤的大小。肿瘤体积（V）用下面公式计算：V=长×宽 /2（mm）。各处理组的荷瘤裸鼠在肿瘤接种后第26天后处死，测量肿瘤的长和宽，采用下式计算给药后的肿瘤抑制率：肿瘤抑制率（%）=100%-（给药组肿瘤体积/空白组肿瘤体积）×100%。

[0119] 图11（A）为药物的体内抗耐药性肺癌A549/cDDP移植瘤效应，显著性差异a,p<0.05,vs生理盐水组；b,p<0.05,vs泰素;c,p<0.05,vs普通紫杉醇脂质体；结果显示，与泰素及普通紫杉醇脂质体相比，靶向性紫杉醇脂质体具有最为显著的体内抗肿瘤效果，在接种后第26天，肿瘤体积抑制率分别为36.35±21.93%、54.76±13.33%及73.14±5.89%。给药期间荷瘤裸鼠的体重变化如图11（B）所示。三给药组裸鼠的体重均低于空白对照组，但没有显著性差异。说明靶向性紫杉醇脂质体可能存在一定的由化疗药紫杉醇造成的毒性，但在裸鼠体内毒性较低。

[0120] 表2各制剂组对A549/cDDP细胞的Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bid、Bcl-2和Bcl-xl蛋白活性的作用

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