使用糖聚乙二醇化G-CSF的治疗方法
阅读：465发布：2020-05-12
专利汇可以提供使用糖聚乙二醇化G-CSF的治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供具有 治疗 活性的糖 聚乙二醇化 G-CSF，其与未经糖聚乙二醇化的相同或非常相似的G-CSF肽相比，具有改进的药代动 力 学参数和性质。此外，本发明提供动员受试者，尤其是已接受或将接受放射疗法或化学疗法的受试者中造血作用的方法。本发明的方法和组合物还可用于 预防 、减轻和治疗这些疗法的骨髓抑制作用。，下面是使用糖聚乙二醇化G-CSF的治疗方法专利的具体信息内容。
1.肽缀合物在制备增加供体中干细胞产生的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
2.权利要求1的用途，其中所述聚合的修饰基团具有基本均匀分散的分子量分布。
3.肽缀合物在制备增加受试者中粒细胞数目的药物中的用途，其中所述受试者适合进行骨髓移植，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇，其中所述G-CSF肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数。
4.肽缀合物在制备增加受试者中干细胞产生的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述肽缀合物的结构在以下通式中显示：
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；和
Sia—PEG具有根据以下通式的结构：
其中n是400-500的整数，
其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
5.肽缀合物在制备预防、治疗和减轻癌症治疗引起的骨髓抑制的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
6.权利要求5的用途，其中所述癌症治疗包括选自放射疗法和化学疗法的成员。
7.肽缀合物在制备治疗需进行该治疗的受试者中疾病的药物中的用途，所述疾病特征在于所述受试者中白细胞产生减弱，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述药物的量有效改善所述受试者的所述疾病，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
8.权利要求7的用途，其中所述白细胞产生减弱是化学疗法、放射疗法或原发性血小板减少性紫癜的结果。
9.肽缀合物在制备治疗哺乳动物中嗜中性白细胞减少症的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
10.肽缀合物在制备治疗哺乳动物中血小板减少症的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
11.扩增培养物中造血干细胞的方法，所述方法包括对所述干细胞施用有效量的肽缀合物的步骤，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列，并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
12.肽缀合物在制备增加受试者中造血作用的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
13.肽缀合物在制备增加受试者中造血祖细胞数目的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
14.权利要求13的用途，其中所述造血祖细胞是CD34+细胞。
15.肽缀合物在制备增加供体中干细胞产生的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
16.肽缀合物在制备用于提供骨髓的稳定植入的方法的药物中的用途，所述方法包括：
(a)对所述骨髓的供体施用肽缀合物，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽；
(2)从所述供体分离所述骨髓；并
(3)将所述骨髓输入受体，
其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
17.权利要求16的用途，其中所述供体与所述受体是同一个体。
18.权利要求17的用途，其中所述供体与所述受体是不同个体。
19.肽缀合物在制备用于增加受试者中造血祖细胞数目的方法的组合物中的用途，所述方法包括对所述受试者施用：
(a)第一种组合物，其包含式(1)1,1'-[1,4-亚苯基-双-(亚甲基)-双-1,4,8,11-四氮杂环十四烷(AMD3100)的化合物；
(b)第二种组合物，其包含缀合物肽，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，
其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
20.权利要求19的用途，其中所述第一种组合物和所述第二种组合物以任一顺序顺序施用。
21.权利要求19的用途，其中所述第一种组合物和所述第二种组合物同时施用。
22.权利要求19的用途，其中所述造血祖细胞是CD34+细胞。
23.包含以下成分的口服剂型：
(a)肽缀合物，所述肽缀合物是G-CSF肽和水溶性聚合物间的共价缀合物，其中所述水溶性聚合物通过完整的糖基连接基团，在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽；
(b)表面活性剂；
(c)脂肪酸；和
(d)肠溶物质，
其中所述成分(a)、(b)和(c)混合于液相，并冻干后与成分(d)组合，
其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
24.肽缀合物在制备增加供体中干细胞产生的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，并且其中所述肽缀合物的量在1mg至20mg的范围内，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
25.肽缀合物在制备增加供体中干细胞产生的药物中的用途，所述肽缀合物是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物，其中所述聚合的修饰基团通过糖基连接基团在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至所述G-CSF肽，其中所述肽缀合物的量是选自25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg的单位剂型，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列并且所述肽缀合物的结构在以下通式中显示
其中
代表G-CSF肽，
q是0或1；
Sia-PEG具有根据通式
的结构，其中n是从400到500的整数，所述聚合的修饰基团是聚乙二醇。
使用糖聚乙二醇化G-CSF的治疗方法
[0001] 相关申请的交互引用
[0002] 本申请要求2007年4月3日提交的美国临时申请号60/909,917、2007年4月13日提交的美国临时申请号60/911,788和2007年11月7日提交的美国临时申请号60/986,240的优
先权，所述所有申请为了所有目的在此以其整体引入。
先权，所述所有申请为了所有目的在此以其整体引入。
[0003] 发明背景
[0004] 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞祖细胞和成熟嗜中性粒细胞存活、增殖、分化和功能的糖蛋白。临床使用的两种形式的重组人G-CSF是嗜中性粒细胞的粒细胞生成的有效刺激剂，并在预防一些嗜中性白细胞减少症的感染性并发症中表现出有效
性。它们可用来加快嗜中性粒细胞从骨髓抑制治疗中恢复。
性。它们可用来加快嗜中性粒细胞从骨髓抑制治疗中恢复。
[0005] G-CSF通过降低发热性嗜中性白细胞减少症的发病率、骨髓移植支持的高剂量化学疗法的死亡率和严重慢性嗜中性白细胞减少症病人感染的发病率和持续时间来减少癌
症化学疗法的死亡率。此外，已显示在心肌梗塞起始后施用时，G-CSF具有疗效。
症化学疗法的死亡率。此外，已显示在心肌梗塞起始后施用时，G-CSF具有疗效。
[0006] 作为细胞毒性化学疗法的结果，急性骨髓抑制是公认的癌症治疗中的剂量限定因素。虽然其他正常组织也可能受不利影响，但骨髓对如化学疗法和放射疗法的增殖特异性
治疗尤其敏感。对一些癌症病人，造血毒性常限制了化学疗法剂量增加的可能性。反复的或高剂量的化学疗法周期可导致造血干细胞及其后代的干细胞衰竭。
治疗尤其敏感。对一些癌症病人，造血毒性常限制了化学疗法剂量增加的可能性。反复的或高剂量的化学疗法周期可导致造血干细胞及其后代的干细胞衰竭。
[0007] 预防和防止化学疗法和放射疗法的副作用对癌症病人大有裨益。已显示G-CSF和其他生长因子通过增加正常关键靶细胞(尤其是造血祖细胞)的数目来减轻此类副作用。
[0008] 来自日本和美国的小组于1986年克隆了人形式的G-CSF(见如Nagata等人，Nature 319：415-418，1986)。这种天然人类糖蛋白以两种形式存在，一种具有175个氨基酸，另一种具有178个氨基酸。丰度更高和活性更高的175个氨基酸形式已用于通过重组DNA技术开发
药物产品。
药物产品。
[0009] 大肠杆菌(E.coli)表达系统中合成的重组人G-CSF称为非格司亭。非格司亭的结构与天然糖蛋白略有不同。重组人G-CSF的另一种形式称为来格司亭，是在中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞中合成的。
(CHO)细胞中合成的。
[0010] hG-CSF是单体蛋白质，其通过形成2个G-CSF分子和2个受体分子的2∶2复合体二聚化G-CSF受体(Horan等人，Biochemistry，35(15)：4886-96(1996))。已通过X射线晶体衍射研究将以下hG-CSF残基鉴定为受体结合界面的部分：G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、L15、K16、E19、Q20、L108、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123和L124(见如Aritomi等人，(1999)Nature 401：713)。
[0011] 市售rhG-CSF形式具有短期药理学作用，必须在白细胞减少状态期间多于每天一次地经常施用。具有更长循环半衰期的分子可减少减轻白细胞减少和预防后续感染必要的
给药次数。目前可用的rG-CSF产品的另一问题是剂量依赖性骨痛的发生。由于骨痛作为rG-CSF治疗的明显副作用为病人所体验，因此希望提供一种不引起骨痛的rG-CSF产品，或借助于本身不具这种作用的产品，或借助于在不引起骨痛的足够小的剂量下有效的产品。因此，明显存在对改进型重组G-CSF分子的需要。
给药次数。目前可用的rG-CSF产品的另一问题是剂量依赖性骨痛的发生。由于骨痛作为rG-CSF治疗的明显副作用为病人所体验，因此希望提供一种不引起骨痛的rG-CSF产品，或借助于本身不具这种作用的产品，或借助于在不引起骨痛的足够小的剂量下有效的产品。因此，明显存在对改进型重组G-CSF分子的需要。
[0012] 已报道了hG-CSF的蛋白质工程变体(美国专利号5,581,476，美国5,214,132，美国5,362,853，美国4,904,584和Riedhaar-Olson等人，Biochemistry 35：9034-9041，1996)。
还报道了与天然多肽相比引入了至少一条附加糖链的hG-CSF和其他多肽的修饰(美国专利
号5,218,092)。此外，已报道和研究了天然hG-CSF的聚合物修饰(包含连接PEG基团)(见如
Satake-Ishikawa等人，(1992)Cell Structure and Function 17：157；Bowen等人(1999)Experimental Hematology 27：425；美国专利号5,824,778、美国5,824,784、WO 96/11953、WO 95/21629和WO 94/20069)。
还报道了与天然多肽相比引入了至少一条附加糖链的hG-CSF和其他多肽的修饰(美国专利
号5,218,092)。此外，已报道和研究了天然hG-CSF的聚合物修饰(包含连接PEG基团)(见如
Satake-Ishikawa等人，(1992)Cell Structure and Function 17：157；Bowen等人(1999)Experimental Hematology 27：425；美国专利号5,824,778、美国5,824,784、WO 96/11953、WO 95/21629和WO 94/20069)。
[0013] 在改进糖蛋白药物的药代动力学性质的尝试中，将合成聚合物连接至肽主链为本领域公知。聚乙二醇(“PEG”)是已结合至肽的示例性聚合物。已表明用PEG衍生肽治疗剂可降低肽的免疫原性。例如，美国专利号4,179,337(Davis等人)公开了非免疫原性多肽，如偶联至聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的酶和肽类激素。除降低免疫原性外，由于所述多肽的PEG
缀合物尺寸增加，还延长了循环清除时间。
缀合物尺寸增加，还延长了循环清除时间。
[0014] 将PEG(及其衍生物)连接至肽的一种方式是通过肽氨基酸残基的非特异性结合(见如美国专利号4,088,538、美国专利号4,496,689、美国专利号4,414,147、美国专利号4,
055,635和PCT WO 87/00056)。将PEG连接至肽的另一方式是通过糖肽上糖残基的非特异性
氧化(见如WO94/05332)。
055,635和PCT WO 87/00056)。将PEG连接至肽的另一方式是通过糖肽上糖残基的非特异性
氧化(见如WO94/05332)。
[0015] 在这些非特异性方法中，聚乙二醇以随机、非特异的方式加至肽主链的反应性残基。当然，PEG分子的随机加入具有其缺点，包括终产物缺乏同质性和降低肽的生物活性或酶活性的可能性。因此，对治疗肽的生产，导致形成特异性标记、易于鉴定、基本同质的产物的衍生策略较为优越。已经开发了这样的方法。
[0016] 可通过酶的作用在体外生产特异性标记的同质肽类治疗剂。与将合成聚合物或其他标签连接至肽的一般非特异性方法不同，基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的
优点。用于标签肽合成的两类主要的酶是糖基转移酶(如唾液酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶)和糖苷酶。这些酶可用于糖的特异性连接，随后可对糖进行修饰，使其包含治疗部分。备选地，可用糖基转移酶和经修饰的糖苷酶直接将经修饰的糖转移至肽主
链(见如美国专利6,399,336及美国专利申请公开20030040037、20040132640、
20040137557、20040126838和20040142856，所述每一专利在此引用作为参考)。还已知将化学和酶合成元件联用的方法(见如Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和美国专利申请公开20040137557，其在此引用作为参考)。
优点。用于标签肽合成的两类主要的酶是糖基转移酶(如唾液酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶)和糖苷酶。这些酶可用于糖的特异性连接，随后可对糖进行修饰，使其包含治疗部分。备选地，可用糖基转移酶和经修饰的糖苷酶直接将经修饰的糖转移至肽主
链(见如美国专利6,399,336及美国专利申请公开20030040037、20040132640、
20040137557、20040126838和20040142856，所述每一专利在此引用作为参考)。还已知将化学和酶合成元件联用的方法(见如Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和美国专利申请公开20040137557，其在此引用作为参考)。
[0017] 响应对改进型治疗性G-CSF的需要，本发明提供一种具有治疗活性的糖聚乙二醇化G-CSF，其与未经糖聚乙二醇化的相同或非常相似的G-CSF肽相比，具有改进的药代动力
学参数和性质。此外，本发明还提供增加受试者(尤其是已接受或将接受放射疗法或化学疗法的患者)中造血作用的方法。
学参数和性质。此外，本发明还提供增加受试者(尤其是已接受或将接受放射疗法或化学疗法的患者)中造血作用的方法。
[0018] 发明概述
[0019] 相应地，一方面，本发明提供动员骨髓移植受体干细胞产生的方法和组合物。这些方法和组合物包括对骨髓移植受体施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。一方面，聚合的修饰基团通过完整的糖基连接基团，在肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至该肽。
[0020] 另一方面，本发明提供增加受试者粒细胞数目的方法和组合物。该方法包括对所述受试者施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。一方面，G-CSF肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，聚合的修饰基团在从126位甘氨酸延伸至
143位丝氨酸的氨基酸序列区域内共价连接至G-CSF肽。
143位丝氨酸的氨基酸序列区域内共价连接至G-CSF肽。
[0021] 另一方面，本发明提供增加受试者干细胞产生的方法和组合物。该方法包括对受试者施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。另一方面，G-CSF肽包含以下通式的结构：
[0022]
[0023] 其中
[0024] q为0或1；且
[0025] Sia-PEG具有以下通式的结构：
[0026]
[0027] 其中n为1至2000的整数。
[0028] 一方面，本发明提供预防、治疗和减轻骨髓抑制(尤其是癌症化学疗法引起的骨髓抑制)的方法。一方面，此方法包括对受体施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至该G-CSF肽。
[0029] 另一方面，本发明提供治疗受试者疾病的方法，其中所述疾病以受试者中白细胞产生减弱为特征。一方面，治疗此疾病的方法包括对受试者施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整
的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。对受试者施用的
肽的量对改善受试者疾病是有效的。
的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。对受试者施用的
肽的量对改善受试者疾病是有效的。
[0030] 另一方面，本发明提供治疗哺乳动物嗜中性白细胞减少症的方法。这些方法包括施用药学有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共
价连接至G-CSF肽。
价连接至G-CSF肽。
[0031] 另一方面，本发明提供治疗哺乳动物血小板减少症的方法。这些方法包括施用药学有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接
至G-CSF肽。
至G-CSF肽。
[0032] 一方面，本发明提供扩大造血干细胞培养物的方法。这些方法包括对干细胞施用有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至
G-CSF肽。
G-CSF肽。
[0033] 另一方面，本发明提供刺激受试者造血作用的方法。这些方法包括对受试者施用有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至
G-CSF肽。
G-CSF肽。
[0034] 另一方面，本发明提供增加受试者造血祖细胞数目的方法。这些方法包括对受试者施用有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价
连接至G-CSF肽。
连接至G-CSF肽。
[0035] 一方面，本发明提供动员供体干细胞产生的方法。这些方法包括对供体施用有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF
肽。
肽。
[0036] 另一方面，本发明提供增强提供给受体的骨髓的长期植入的方法。这些方法包括对骨髓受体施用肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。共价缀合物的聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价
连接至G-CSF肽。
连接至G-CSF肽。
[0037] 另一方面，本发明提供动员受试者造血祖细胞的方法。这些方法包括对受试者施用第一种组合物(包含式1，1′-[1，4-亚苯基-双-(亚甲基)-双-1，4，8，11-四氮杂环十四烷(AMD3100)的化合物)和第二种组合物(包含肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共
价缀合物)的步骤。聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基
酸残基处共价连接至G-CSF肽。第一种和第二种组合物可按任一顺序顺序地或同时对受试
者施用。
价缀合物)的步骤。聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基
酸残基处共价连接至G-CSF肽。第一种和第二种组合物可按任一顺序顺序地或同时对受试
者施用。
[0038] 一方面，本发明提供一种口服剂型。此口服剂型可包含成分：(a)肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。聚合的修饰基团可通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽；(b)表面活性剂；(c)脂肪酸；(d)肠溶物质。一方面，成分(a)、(b)和(c)混合于液相，并在与成分(d)组合前冻干。
[0039] 另一方面，本发明提供增加供体干细胞产生的方法，其中该方法包括对供体施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。另一方面，聚合的修饰基团通过糖基连接基团，在肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至该肽。另一方面，对供体施用的肽的量在从约1mg至约20mg的范围内。
[0040] 另一方面，本发明提供增加供体干细胞产生的方法，其中该方法包括对供体施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。另一方面，聚合的修饰基团通过糖基连接基团，在肽的糖基或氨基酸残基处连接至该肽。另一方面，对供体施用的肽的量为单位剂型。在一个实施方案中，单位剂量选自25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg。
[0042] 图1表示与响应XM22(25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg)和Neulasta(100μg/kg)的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)相关的数据。
[0043] 图2表示与响应XM22(25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg)和Neulasta(100μg/kg)的CD34+细胞计数相关的数据。
[0044] 图3是与四个不同测试组的药代动力学参数相关的数据表。
[0045] 图4表示与响应XM22(6mg)和Neulasta(6mg)的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)相关的数据。
[0046] 图5表示与响应XM22(6mg)和Neulasta(6mg)的CD34+细胞计数相关的数据。
[0047] 图6表示短尾猴中与响应G-CSF、糖聚乙二醇化G-CSF、Neulasta和对照组合物的嗜中性粒细胞计数相关的药效数据。
[0048] 图7表示短尾猴中与所示化合物的血浆浓度相关的药效数据。
[0049] 图8是糖聚乙二醇化GCSF及其受体结构的示意模型。
[0050] 图9表示与施用三种不同剂量的XM22和100μg/kg的Neulasta后XM22和Neulasta的血清浓度相关的数据。
[0051] 图10表示与施用6mg XM22和6mg Neulasta后XM22和Neulasta的血清浓度相关的数据。
[0052] 发明详述和优选实施方案
[0053] 缩写词
[0054] PEG，聚乙二醇；PPG，聚丙二醇；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基(N-乙酰神经氨酰基)；M6P，甘露糖-6-磷酸；Sia，唾液酸、N-乙酰神经氨酸基及其衍生物和类似物。
[0055] “G-CSF”指粒细胞集落刺激因子。
[0056] 定义
[0057] 除非另作定义，本文使用的所有技术和科学术语一般与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同意义。一般来说，本文所用命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学的实验室操作为本领域公知和通常使用的。用标准技术进行核酸和肽合
成。技术和操作一般按本文全文给出的本领域的常规方法和几种一般参考文献(一般见
Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold
SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其在此引用作为参考)进
行。本文所用命名法和下述分析化学、有机合成的实验室操作是本领域公知和通常采用的。
用标准技术或其修改进行化学合成和化学分析。
成。技术和操作一般按本文全文给出的本领域的常规方法和几种一般参考文献(一般见
Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold
SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其在此引用作为参考)进
行。本文所用命名法和下述分析化学、有机合成的实验室操作是本领域公知和通常采用的。
用标准技术或其修改进行化学合成和化学分析。
[0058] 本文所述所有寡糖用非还原糖的名称或缩写描述(即Gal)，后跟糖苷键的构型(α或β)、环键(1或2)、参与成键的还原糖的环位置(2、3、4、6或8)，随后是还原糖的名称或缩写(即GlcNAc)。每种糖优选为吡喃糖。标准的糖生物学命名法综述见Essentials of
Glycobiology，Varki等人编辑，CSHL Press(1999)。
Glycobiology，Varki等人编辑，CSHL Press(1999)。
[0059] 无论还原端的糖实际上是否是还原糖，都认为寡糖具有还原端和非还原端。按照公认的命名法，本文将寡糖描述为非还原端在左边，还原端在右边。
[0060] 术语“唾液酸”指九碳羧化糖家族的任一成员。唾液酸家族最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-1-onic acid(常缩写为Neu5Ac，NeuAc或NANA))。此家族的第二个成员是N-羟乙酰基-神经氨酸
(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱
氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等人(1986)，J.Biol.Chem.261：11550-11557；
Kanamori等人，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包含诸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac样的9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-
Neu5Ac的9-取代的唾液酸。唾液酸家族的综述见如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；
Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer编辑(Springer-Verlag，纽约(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化操作中的合成和用途公开于1992年10月1日发表的
国际申请WO 92/16640。
(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱
氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等人(1986)，J.Biol.Chem.261：11550-11557；
Kanamori等人，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包含诸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac样的9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-
Neu5Ac的9-取代的唾液酸。唾液酸家族的综述见如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；
Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer编辑(Springer-Verlag，纽约(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化操作中的合成和用途公开于1992年10月1日发表的
国际申请WO 92/16640。
[0061] “肽”指聚合物，其中单体是氨基酸，通过酰胺键连接在一起，备选地称为多肽。此外，还包含非天然氨基酸，如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本发明中还可使用非基因编码的氨基酸。此外，本发明还可使用修饰为包含反应基团、糖基化位点、聚合物、治疗部分、活性分子等的氨基酸。本发明使用的所有氨基酸可为D-或L-异构体。一般优选L-异构体。此外，其他肽模拟物在本发明中也是有用的。如本文所用，“肽”指糖基化和非糖基化的肽。还包含通过表达该肽的系统不完全糖基化的肽。一般综述见Spatola，A.F.，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids中，Peptides and Proteins，B.Weinstein编辑，
Marcel Dekker，纽约，267页(1983)。
Marcel Dekker，纽约，267页(1983)。
[0062] 若二者间存在一定程度的序列同一性，则肽的氨基酸或核苷酸序列与另一序列“同源”。优选地，同源序列与参考序列具有至少约85％的序列同一性，优选与参考氨基酸或核苷酸序列至少具有约90％至100％序列同一性，更优选具有至少约91％的序列同一性，具有至少约92％的序列同一性，具有至少约93％的序列同一性，具有至少约94％的序列同一
性，更优选具有约95％至99％的序列同一性，优选具有至少约96％的序列同一性，具有至少约97％的序列同一性，具有至少约98％的序列同一性，更优选具有至少约99％的序列同一
性和约100％的序列同一性。
性，更优选具有约95％至99％的序列同一性，优选具有至少约96％的序列同一性，具有至少约97％的序列同一性，具有至少约98％的序列同一性，更优选具有至少约99％的序列同一
性和约100％的序列同一性。
[0063] 术语“肽缀合物”指本发明的类型，其中肽与本文所述的经修饰的糖缀合。
[0064] 术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及那些随后经修饰的氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即α碳与氢、羧基、氨基和R基结合，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基(如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持了与天然存在的氨基酸一样的基本化学结构。
氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸
的方式起作用的化合物。
氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸
的方式起作用的化合物。
[0065] 本文所用术语“经修饰的糖”指天然或非天然存在的碳水化合物，在本发明的方法中将其酶促附加至肽的氨基酸或糖残基上。经修饰的糖选自酶底物，其包含但不限于糖核苷酸(单、二和三磷酸)、活性糖(如糖基卤化物、糖基甲磺酸酯)及既无活性又非核苷酸的
糖。“经修饰的糖”用“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包含但不限于PEG部分、治疗部分、诊断部分、生物分子等。修饰基团优选为非天然存在的或未经修饰的碳水化合物。选择用修饰基团官能化的部位，使得其不妨碍“经修饰的糖”通过酶促加入肽。
糖。“经修饰的糖”用“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包含但不限于PEG部分、治疗部分、诊断部分、生物分子等。修饰基团优选为非天然存在的或未经修饰的碳水化合物。选择用修饰基团官能化的部位，使得其不妨碍“经修饰的糖”通过酶促加入肽。
[0066] 术语“水溶性的”指在水中具有某种可检测程度的溶解度的部分。检测和/或定量水溶解度的方法为本领域公知。示例性水溶性聚合物包含肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有由单个氨基酸组成的混合序列，如聚赖氨酸。示例性多糖是聚唾液酸。示例性聚醚是聚乙二醇。聚乙烯亚胺是示例性聚胺，聚丙烯酸是代表性的聚羧酸。
[0067] 水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚乙二醇(即PEG)。但是，应理解其他相关聚合物也适用于本发明的实施，在这一方面，术语PEG或聚乙二醇的使用旨在包含而非排除。术语PEG包含任一形式的聚乙二醇，包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、叉状PEG、分支PEG、悬挂PEG(即有一个或多个官能团悬挂至聚合物主链的PEG或相关聚合物)或其中具有可降
解连接的PEG。
解连接的PEG。
[0068] 聚合物主链可以是线性的或分支的。分支聚合物主链一般为本领域公知。通常，分支聚合物具有一个中央分支核心部分，多条线性聚合物链连接至中央分支核心。通常使用PEG的分支形式，其可通过将环氧乙烷加入不同多元醇制备，如丙三醇、季戊四醇和山梨醇。
中央分支部分也可从几种氨基酸衍生，如赖氨酸。分支聚乙二醇可用通式R(-PEG-OH)m表
示，其中R表示核心部分，如丙三醇或季戊四醇，m表示臂的数目。如美国专利号5,932,462(在此以其整体引入作为参考)中所述的多臂PEG分子也可用作聚合物主链。
中央分支部分也可从几种氨基酸衍生，如赖氨酸。分支聚乙二醇可用通式R(-PEG-OH)m表
示，其中R表示核心部分，如丙三醇或季戊四醇，m表示臂的数目。如美国专利号5,932,462(在此以其整体引入作为参考)中所述的多臂PEG分子也可用作聚合物主链。
[0069] 许多其他聚合物也适用于本发明。具有2至约300个末端的非肽且水溶性聚合物主链在本发明中尤其有用。适合的聚合物实例包含但不限于其他聚亚烷基二醇(如聚丙二醇
(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等)、美国专利号5,629,384(在此以其整体引入作为参考)中所述的聚(氧乙基化多元醇)、聚烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚α-羟酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及其共聚物、三聚物和混合物。虽然聚合物主链每一条链的分子量可能不同，但其一般在从约100Da至约100,000Da的范围内，通
常从约6,000Da至约80,000Da。
(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等)、美国专利号5,629,384(在此以其整体引入作为参考)中所述的聚(氧乙基化多元醇)、聚烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚α-羟酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及其共聚物、三聚物和混合物。虽然聚合物主链每一条链的分子量可能不同，但其一般在从约100Da至约100,000Da的范围内，通
常从约6,000Da至约80,000Da。
[0070] 本文在对患者施用肽药物的上下文中所用的“曲线下面积”或“AUC”的定义是曲线下总面积，所述曲线描述了作为从0至无穷的时间的函数的患者体循环中的药物浓度。
[0071] 如本文在对患者施用肽类药物的内容中所用，术语“半衰期”或“t1/2”定义为患者的药物血浆浓度降低一半所需的时间。依据多种清除机制、重新分布及其他本领域公知的机制，与肽类药物相关的半衰期可能不止一个。通常这样定义α和β半衰期，α期与重新分布相关，β期与清除相关。但是，对其大部分限制于血流中的蛋白质药物，至少可能有两个清除半衰期。对一些糖基化的肽，可能通过巨噬细胞或内皮细胞上识别末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或岩藻糖的受体介导快速的β期清除。较慢的β期清除可通过对有效半径小于2nm(大约68kD)的分子的肾小球滤过作用和/或组织内的特异性或非特异性
吸收和代谢发生。糖聚乙二醇化可封闭末端糖(如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)，从而阻断通
过识别这些糖的受体的快速α期清除。可能还赋以更大的有效半径，从而降低分布容量和组织吸收，从而延长随后的β期。因此，如本领域公知，糖聚乙二醇化对α期和β期半衰期的精确影响可依据尺寸、糖基化状态及其他参数而不同。“半衰期”的进一步解释见于
Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar编辑，Harwood出版
社，阿姆斯特丹，101页-120页)。
吸收和代谢发生。糖聚乙二醇化可封闭末端糖(如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)，从而阻断通
过识别这些糖的受体的快速α期清除。可能还赋以更大的有效半径，从而降低分布容量和组织吸收，从而延长随后的β期。因此，如本领域公知，糖聚乙二醇化对α期和β期半衰期的精确影响可依据尺寸、糖基化状态及其他参数而不同。“半衰期”的进一步解释见于
Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar编辑，Harwood出版
社，阿姆斯特丹，101页-120页)。
[0072] 本文所用术语“糖结合”指酶介导的经修饰的糖种类与多肽(如本发明的G-CSF肽)的氨基酸或糖残基的结合。“糖聚乙二醇化”是“糖结合”的亚类，其中经修饰的糖的修饰基团是聚乙二醇及其烷基衍生物(如m-PEG)或反应性衍生物(如H2N-PEG、HOOC-PEG)。
[0073] 术语“大规模”和“工业规模”可互换使用，指的是一个反应周期完成时，生产至少大约250mg、优选至少大约500mg、更优选至少大约1克糖结合物的反应周期。
[0074] 本文所用术语“糖基连接基团”指修饰基团(如PEG部分、治疗部分、生物分子)共价连接的糖残基；糖基连接基团将修饰基团加入缀合物的剩余部分。在本发明的方法中，“糖基连接基团”共价连接至糖基化或非糖基化的肽，从而将试剂连接至肽的氨基酸和/或糖残基上。“糖基连接基团”一般通过酶连接“经修饰的糖”至肽的氨基酸和/或糖残基而衍生自“经修饰的糖”。糖基连接基团可以是在修饰基团-经修饰的糖盒形成中降解(如氧化→席夫碱形成→还原)的糖衍生的结构，或者糖基连接基团可以是完整的。“完整的糖基连接基团”指衍生自糖基部分的连接基团，其中连接修饰基团至缀合物剩余部分的糖单体未被降解，如氧化，如通过偏高碘酸钠氧化。本发明的“完整的糖基连接基团”可通过加入糖基单位或从亲本糖结构中去除一个或多个糖基单位而衍生自天然存在的寡糖。
[0075] 本文所用术语“靶向部分”指选择性地定位至身体特定组织或区域的种类。定位由分子决定簇的特异识别、靶向试剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等介导。将试剂靶向特定组织或区域的其他机制为本领域技术人员公知。示例性靶向部分包含抗体、抗体片段、转铁蛋白、HS糖蛋白、凝血因子、血清蛋白质、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。
[0076] 本文所用“治疗部分”指对治疗有用的任一试剂，包含但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性试剂。“治疗部分”包含生物活性剂前体药物、有一个以上治疗部分结合至载体的构建体，如多价试剂。治疗部分还包含蛋白质和包含蛋白质的构建体。示例性蛋白质包括但不限于粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(如干扰素-α、-β、-γ)、白细胞介素(如白细胞介素II)、血清蛋白质(如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和抗体融合蛋白质(如肿瘤坏死因子受体(TNFR)/Fc结构域融合蛋白质)。
[0077] 本文所用“药物可接受的载体”包含与缀合物组合时保持缀合物的活性且不与受试者的免疫系统反应的任一物质。实例包含但不限于任一标准药物载体，如磷酸缓冲盐溶
液、水、乳剂(如油/水乳剂)和各种类型的湿润剂。其他载体还可包括无菌溶液、片剂(包括包衣片剂)和胶囊。这些载体一般包含赋形剂，如淀粉、奶、糖、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂或油、树胶、二元醇或其他已知赋形剂。这些载体可以也包括味道和颜色添加剂或其他成分。通过众所周知的常规方法配制包含这些载体的组
合物。
液、水、乳剂(如油/水乳剂)和各种类型的湿润剂。其他载体还可包括无菌溶液、片剂(包括包衣片剂)和胶囊。这些载体一般包含赋形剂，如淀粉、奶、糖、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂或油、树胶、二元醇或其他已知赋形剂。这些载体可以也包括味道和颜色添加剂或其他成分。通过众所周知的常规方法配制包含这些载体的组
合物。
[0078] 本文所用“给药”指对受试者口服给药；作为栓剂给药；局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或皮下给药；或植入缓释装置，如微型渗透泵。通过包括胃肠外和经粘膜(如口腔、鼻腔、阴道或经皮肤)的任一途径给药。胃肠外给药包括如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。此外，为治疗肿瘤而进行注射时(如诱导凋亡)，可直接对肿瘤和/或肿瘤周围的组织给药。其他递送方式包含但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。
[0079] 术语“改善”或“减轻”指病理或疾病治疗中任一成功的标记，包括任一客观或主观参数，如症状的减轻、缓和或缩小，或患者身体或精神健康的改善。症状改善可以基于客观或主观参数，包括体检和/或精神评估的结果。
[0080] 术语“治疗”指疾病的“治疗”，包括预防疾病发生于可能易感此疾病但尚未经历或显示出此疾病症状的动物(预防性治疗)、抑制疾病(减慢或阻止其发展)、提供从此疾病的症状或副作用中缓解(包括治标疗法)和减轻疾病(引起疾病消退)。
[0081] 术语“有效量”或“对...有效的量”或“治疗有效量”或任一语法相当的术语指对动物施用以治疗疾病时足够有效治疗该疾病的量。
[0082] 术语“分离的”指一种物质，其实质上或基本上没有用于生产该物质的成分。对本发明的肽缀合物，术语“分离的”指一种物质，其实质上或基本上没有用于生产肽缀合物的混合物中通常伴随该物质的成分。“分离的”和“纯化的”可互换使用。通常，本发明的分离的肽缀合物具有优选表示为一个范围的纯度水平。纯度范围的下端为约60％、约70％或约80％，纯度范围的上端为约70％、约80％、约90％或高于约90％。
[0083] 肽缀合物高于约90％纯时，其纯度也优选表示为一个范围。纯度范围的下端为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上端为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。
[0085] 本文所用术语“群体的基本上每一成员”描述本发明的肽缀合物群体的特征，其中加入肽的选定百分比的经修饰的糖加入至该肽的多个相同的受体位点。“群体的基本上每一成员”表达了缀合到经修饰的糖的肽上位点的“同质性”，并且指本发明的缀合物，其为至少约80％、优选至少约90％及更优选至少约95％同质。“同质性”指经修饰的糖结合的受体部分群体中的结构一致性。因此，在本发明的肽缀合物中，当每一经修饰的糖部分结合至受体位点，该受体位点与其他每一经修饰的糖结合的受体位点具有相同的结构时，称肽缀合
物约100％同质。同质性一般表示为一个范围。肽缀合物同质性范围的下端为约60％、约
70％或约80％，纯度范围的上端为约70％、约80％、约90％或高于约90％。
物约100％同质。同质性一般表示为一个范围。肽缀合物同质性范围的下端为约60％、约
70％或约80％，纯度范围的上端为约70％、约80％、约90％或高于约90％。
[0086] 当肽缀合物高于或等于约90％同质时，其同质性也优选表示为一个范围。同质性范围的下端为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上端为约93％、约
94％、约96％、约98％或约100％同质性。一般通过一种或多种本领域技术人员公知的方法测定肽缀合物的纯度，如液相色谱-质谱(LC-MS)、基质辅助激光解吸质量飞行时间质谱
(MALDITOF)、毛细管电泳等。
94％、约96％、约98％或约100％同质性。一般通过一种或多种本领域技术人员公知的方法测定肽缀合物的纯度，如液相色谱-质谱(LC-MS)、基质辅助激光解吸质量飞行时间质谱
(MALDITOF)、毛细管电泳等。
[0087] 当提及糖肽种类时，“基本均一的糖形”或“基本均一的糖基化模式”指被目的糖基转移酶(如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体部分的百分比。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况下，若基本所有(按下文定义)本发明的肽缀合物中的Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化类似物均被岩藻糖基化，则存在基本均一的岩藻糖基化模式。本文所述的岩藻糖基化结构中，Fuc-GlcNAc连接一般为α1，6或α1，3，一般优选α1，6。本领域技术人员应理解，原料中可能包含糖基化的受体部分(如岩藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算的糖基化百分数应包含通过本发明的方法糖基化的受体部分以及原料中已经糖基化的那些受体部
分。
分。
[0088] 上一定义“基本均一”中的术语“基本”一般指特定糖基转移酶的受体部分至少约40％、至少约70％、至少约80％或更优选至少约90％和更优选至少约95％被糖基化。
[0090] 除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的部分指具有指定数目的碳原子(即C1-C10指1至10个碳原子)的直链、支链或环状烃基或其组合，其可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的，并且可包含二价和多价基。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、环己基甲基、环丙基甲基的基团；(如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括下文更详细定义的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基称为“纯烷基”。
[0091] 术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的部分指衍生自烷烃的二价基，以-CH2CH2CH2CH2-为示例但不限于其，还包含下述“杂亚烷基”基团。通常，烷基(或亚烷基)具有
1-24个碳原子，本发明中优选具有10个或以下碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，一般具有8个或以下的碳原子。
1-24个碳原子，本发明中优选具有10个或以下碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，一般具有8个或以下的碳原子。
[0092] 术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，指那些分别通过氧原子、氨基或硫原子连接至分子的剩余部分的烷基。
[0093] 除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合指由所述数目的碳原子和至少一种选自O、N、Si和S的原子组成的稳定的直链、支链或环状烃基或其组合，其中氮和硫原子可任选地被氧化，氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N、S和Si可位于杂烷基的任一内部位置，或位于烷基连接至分子剩余部分的位置。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。两个以上的杂原子可以是连续的，如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的部分指衍生自杂烷基的二价基，以-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-为示例但不限于其。对杂亚烷基，杂原子也可占据链末端的任一个或两个(如亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷氨基、亚烷二氨基等)。此外，对亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团通式的书写方向不隐含连接基团的方向。例如，通式-C(O)2R’-代表了-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
[0094] 除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状类型。此外，对杂环烷基，杂原子可占据杂环连接至分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
[0095] 除非另有说明，术语“卤”或“卤素”本身或作为另一取代基的部分指氟、氯、溴或碘原子。此外，如“卤烷基”的术语意在包含单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0096] 除非另有说明，术语“芳基”指多不饱和的芳族取代基，其可以是单环或多环(优选1至3环)，多环稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”指包含1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接至分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、
2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹噁啉基、5-喹噁啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氢苯并[1，4]二噁烯-6-基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上述每一芳基或杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基组。
2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹噁啉基、5-喹噁啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氢苯并[1，4]二噁烯-6-基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上述每一芳基或杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基组。
[0097] 为简化，术语“芳基”与其他术语(如芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)组合使用时包括以上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括其中芳基连接至烷基的那些基团(如苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亚甲基)被(如)氧原子取代的烷基(如苯氧基甲基、2-吡咯氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
[0098] 上述每一术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括所示基团的取代及非取代形式。下文给出了每种基团的优选取代基。
[0099] 烷基和杂烷基的取代基(包括常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)一般称为“烷基取代基”，其可以是选自以下多个组但不限于这些组的一种或多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR””、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数目从0至2m’+1，其中m’是这种基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各优选独立地指氢；取代的或非取代的杂烷基；取代的或非取代的芳基(如1-3个卤素取代的芳基)；取代的或非取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，每一个R基团都独立地选择，如存在一个以上这些基团时，每一个R’、R”、R”’和R””基团一样。当R’和R”连接至同一个氮原子时，其可与氮原子组合形成五元、六元或七元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基”意在包括包含结合至氢基团外基团的碳原子的基团，如卤烷基(如-CF3和-CH2CF3)和酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
[0100] 与关于烷基取代基所述的类似，芳基和杂芳基的取代基一般称为“芳基取代基”。取代基选自如卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)
2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’，-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目从0至芳环系统上打开的化合价的总数，其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、取代的或非取代的烷基、取代的或非取代的杂烷基、取代的或非取代的芳基和取代或非取代杂芳基。例如，当本发明的化合物包含一个以上R基时，每一个R基都独立地选择，如同与存在一个以上这些
基团时每一个R’、R”、R”’和R””基团一样。在后面的图示中，符号X代表上述“R”。
2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’，-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目从0至芳环系统上打开的化合价的总数，其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、取代的或非取代的烷基、取代的或非取代的杂烷基、取代的或非取代的芳基和取代或非取代杂芳基。例如，当本发明的化合物包含一个以上R基时，每一个R基都独立地选择，如同与存在一个以上这些
基团时每一个R’、R”、R”’和R””基团一样。在后面的图示中，符号X代表上述“R”。
[0101] 芳基或杂芳基环相邻原子上的取代基之二可以任选地用通式-T-C(O)-(CRR’)u-U-的取代基取代，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，u为0-3的整数。备选地，芳基或杂芳基环相邻原子上的取代基之二可以任选地用通式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，r为0-4的整数。这样形成的新环的单键之一可以任选地用双键取代。备选地，芳基或杂芳基环相邻原子上的
取代基之二可以任选地用通式-(CRR’)z-X-(CR”R”’)d-的取代基取代，其中z和d独立地为0-
3的整数，X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或取代或非取代(C1-C6)烷基。
取代基之二可以任选地用通式-(CRR’)z-X-(CR”R”’)d-的取代基取代，其中z和d独立地为0-
3的整数，X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或取代或非取代(C1-C6)烷基。
[0103] “干细胞”指“一般的”或未分化的细胞，其可无限地产生自身的拷贝，可成为专门化的体内各种组织。干细胞可生成正常血液成分，包括红细胞、白细胞和血小板。干细胞正常定位于骨髓内和血液内，可收集用于移植。
[0104] 术语“造血细胞”指与血细胞形成相关的细胞。此术语可与以上定义的术语“干细胞”互换使用。
[0105] 本文所用术语“动员干细胞产生”意在包括在体内或体外增加干细胞数目的所有方法。干细胞数目的增加可以是祖细胞数目增加的结果。此术语还包括将干细胞输入和输
出骨髓的方法。
出骨髓的方法。
[0106] 类似地，术语“动员造血细胞产生”意在包括在体内或体外增加造血细胞数目的所有方法。造血细胞数目的增加可以是祖细胞数目增加、多能干细胞成熟为造血细胞的速率增加和其某种组合的结果。此术语还包括将造血细胞输入和输出骨髓的方法。
[0107] 术语“粒细胞”指以细胞质中存在颗粒为特征的白细胞。
[0108] 引言
[0109] 本发明包括施用糖聚乙二醇化G-CSF以预防、减轻和治疗造血缺陷相关病症和疾病的方法，所述造血缺陷常由化学疗法、放射疗法和血小板减少引起。G-CSF主要作用于骨髓来增加炎症白细胞的产生，并进一步作为内分泌激素起始炎症功能中消耗的嗜中性粒细
胞的补充。G-CSF还在化学疗法后的骨髓替换中具有临床应用。
胞的补充。G-CSF还在化学疗法后的骨髓替换中具有临床应用。
[0110] 本发明提供包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的缀合物。本发明还包括包含具有粒细胞集落刺激活性的糖基化和非糖基化肽的缀合物。缀合物可以通过进一步与如治疗部
分、诊断部分、靶向部分等的多种种类结合而额外地修饰。对本文所述G-CSF缀合物而言，聚合的修饰基团可在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽，优选通过糖基连接
基团。在示例性实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合物。在进一步优选的实施方案
中，水溶性聚合物为聚乙二醇。
分、诊断部分、靶向部分等的多种种类结合而额外地修饰。对本文所述G-CSF缀合物而言，聚合的修饰基团可在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽，优选通过糖基连接
基团。在示例性实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合物。在进一步优选的实施方案
中，水溶性聚合物为聚乙二醇。
[0111] 在示例性实施方案中，为了预防经历放射疗法、化学疗法和骨髓移植的癌症患者感染，可以对患者施用本发明的G-CSF肽，以在外周血祖细胞移植中动员祖细胞进行收集，进行严重的慢性或相对白细胞减少症(不考虑病因)治疗和支持患急性髓细胞样白血病的
患者的治疗。此外，本发明的多肽缀合物或组合物可以用于艾滋病或其他免疫缺陷疾病，以及细菌感染、心脏病和甲型、乙型及丙型肝炎的治疗。
患者的治疗。此外，本发明的多肽缀合物或组合物可以用于艾滋病或其他免疫缺陷疾病，以及细菌感染、心脏病和甲型、乙型及丙型肝炎的治疗。
[0112] 在一个实施方案中，可以对受试者施用本发明的G-CSF肽缀合物，以增加造血作用。造血作用是祖细胞发育为成熟血细胞(包含红细胞、白细胞和血小板)的过程。正常的造血作用通过包括如集落刺激因子的糖蛋白的多种调节物协调。这些调节物调节祖细胞和前
体细胞的存活、增殖和分化，以及成熟细胞的活性状态。造血作用减弱时，结果是血细胞和血小板产生减少，导致免疫力减弱，不能从创伤和感染痊愈。
体细胞的存活、增殖和分化，以及成熟细胞的活性状态。造血作用减弱时，结果是血细胞和血小板产生减少，导致免疫力减弱，不能从创伤和感染痊愈。
[0113] 本发明提供刺激受试者造血作用的方法和组合物。本发明的方法包括对受试者施用有效量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。
[0114] 一方面，刺激造血作用包括增加受试者造血祖细胞的数目，结果使成熟造血细胞(血细胞)的数目也增加。造血祖细胞移动至并保留于骨髓内，其可在此成熟为红细胞和白
细胞。本发明刺激造血祖细胞数目的方法包括对受试者施用有效量的肽的步骤，所述肽是
G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。在一个实施方案中，通过肽的应用所增加的造血祖细胞为CD34+细胞。
细胞。本发明刺激造血祖细胞数目的方法包括对受试者施用有效量的肽的步骤，所述肽是
G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。在一个实施方案中，通过肽的应用所增加的造血祖细胞为CD34+细胞。
[0115] 骨髓抑制
[0116] 骨髓抑制是血细胞产生的减少。正常血液包含大量细胞，包括携氧的红细胞和对抗感染的白细胞。正常血液还包含血小板，其是起始血液凝固的微小的细胞碎片。这些细胞和碎片在骨髓内生成，骨髓是见于一些骨骼中央的物质。健康骨髓每天生成大量的红细胞、白细胞和血小板。在骨髓抑制下，骨髓生成的这些细胞太少。本发明提供治疗、减轻和预防骨髓抑制的方法和组合物。
[0117] 骨髓抑制的一个特征是受试者白细胞产生减弱。这种白细胞产生减弱可以由某种治疗引起，尤其是癌症治疗，如化学疗法和放射疗法。白细胞产生减弱还可以是疾病的结
果，如原发性血小板减少性紫癜。一方面，本发明的缀合物用来治疗和改善以白细胞产生减弱为特征的疾病。
果，如原发性血小板减少性紫癜。一方面，本发明的缀合物用来治疗和改善以白细胞产生减弱为特征的疾病。
[0118] 骨髓抑制引起的疾病包括嗜中性白细胞减少症(包括发热性嗜中性白细胞减少症)和血小板减少症。嗜中性白细胞减少症是以血液中嗜中性粒细胞(最常见的白细胞类
型)数目的异常减少为特征的疾病。减少可以是相对的或绝对的。一方面，本发明提供治疗哺乳动物嗜中性白细胞减少症的方法。这些方法包括施用药学有效量的本发明的G-CSF缀
合物的步骤。已显示G-CSF影响成年癌症患者的发热性嗜中性粒细胞减少和死亡率
(Kuderer等人，J.Clin.Onc.(2007)，25(21)：3158-67)。
型)数目的异常减少为特征的疾病。减少可以是相对的或绝对的。一方面，本发明提供治疗哺乳动物嗜中性白细胞减少症的方法。这些方法包括施用药学有效量的本发明的G-CSF缀
合物的步骤。已显示G-CSF影响成年癌症患者的发热性嗜中性粒细胞减少和死亡率
(Kuderer等人，J.Clin.Onc.(2007)，25(21)：3158-67)。
[0119] 血小板减少症是血液中血小板数目异常地低并通常伴随着异常出血的疾病。本发明的方法包括治疗哺乳动物血小板减少症。这些方法包括施用药学有效量的本发明的G-
CSF缀合物的步骤。如本文所用，术语血小板减少症包括病因已知的疾病及原发性血小板减少症。本文也将血小板减少症和原发性血小板减少症称为“血小板减少性紫癜”和“原发性血小板减少性紫癜”。
CSF缀合物的步骤。如本文所用，术语血小板减少症包括病因已知的疾病及原发性血小板减少症。本文也将血小板减少症和原发性血小板减少症称为“血小板减少性紫癜”和“原发性血小板减少性紫癜”。
[0120] 干细胞动员
[0121] 对抗骨髓抑制的一种途径是动员干细胞产生。动员干细胞产生包括增加干细胞的数目，包括造血祖细胞的数目和粒细胞(包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的数目。动员
干细胞产生还包括增加干细胞从骨髓向外周血的输送。这种动员的目的是从供体收集干细
胞，因为外周血比骨髓更易于接近。一方面，本发明提供动员受试者干细胞产生的方法。
干细胞产生还包括增加干细胞从骨髓向外周血的输送。这种动员的目的是从供体收集干细
胞，因为外周血比骨髓更易于接近。一方面，本发明提供动员受试者干细胞产生的方法。
[0122] 另一方面，通过动员受试者造血祖细胞，使用本发明的方法和组合物预防、减轻和治疗骨髓抑制。动员造血祖细胞包括增加造血祖细胞的数目及增加细胞至骨髓和从骨髓向外的输送。
[0123] 造血祖细胞(如CD34+细胞)成熟和分化为血液成分，即红细胞和白细胞。本发明提供动员受试者中造血祖细胞的方法，其包括对受试者施用以下组合物的步骤：(i)包含式
(1)1，1′-[1，4-亚苯基-双-(亚甲基)-双-1，4，8，11-四氮杂环十四烷(AMD3100)的化合物的第一种组合物，和(2)包含肽的第二种组合物，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共
价缀合物。在一个实施方案中，按任一顺序顺序地对受试者施用第一种组合物和第二种组
合物。在另一实施方案中，第一种组合物和第二种组合物同时施用。在一个实施方案中，两种组合物均经皮下对受试者施用。
(1)1，1′-[1，4-亚苯基-双-(亚甲基)-双-1，4，8，11-四氮杂环十四烷(AMD3100)的化合物的第一种组合物，和(2)包含肽的第二种组合物，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共
价缀合物。在一个实施方案中，按任一顺序顺序地对受试者施用第一种组合物和第二种组
合物。在另一实施方案中，第一种组合物和第二种组合物同时施用。在一个实施方案中，两种组合物均经皮下对受试者施用。
[0124] AMD3100是bicyclam衍生物，已显示其在正常受试者和癌症患者中均可动员巨大数目的CD34+细胞进入循环(Liles等人，Blood，(2003)，102：2728-30；Devine等人，
J.Clin.Oncol.，(2004)，22：1095-1102)。研究显示，AMD3100与G-CSF的非糖基化形式组合可比单独施用G-CSF动员更高数目的CD34+细胞进入循环(Flomenberg等人，Blood，(2005)，
106(5)：1867-1874)。
J.Clin.Oncol.，(2004)，22：1095-1102)。研究显示，AMD3100与G-CSF的非糖基化形式组合可比单独施用G-CSF动员更高数目的CD34+细胞进入循环(Flomenberg等人，Blood，(2005)，
106(5)：1867-1874)。
[0125] 在一个实施方案中，动员即将作为骨髓或造血细胞供体的受试者的干细胞产生。按以上所述将肽缀合物提供给供体。供体的干细胞数目增加，并被动员从骨髓移动至外周
血。然后易于通过本领域公知的方法从供体分离这些细胞。这种实施方案中的供体可以与
骨髓或造血细胞的受体相同(自体供体)，或者供体可以是非受体受试者(异体供体)。
血。然后易于通过本领域公知的方法从供体分离这些细胞。这种实施方案中的供体可以与
骨髓或造血细胞的受体相同(自体供体)，或者供体可以是非受体受试者(异体供体)。
[0126] 另一方面，本发明的肽缀合物与至少一种化疗剂组合提供。
[0127] 骨髓移植
[0128] 在一些方面，本发明提供动员骨髓移植受体中干细胞产生的方法和组合物。这些方法包括对受体施用一定量的肽的步骤，所述肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀
合物。在一个实施方案中，聚合的修饰基团是水溶性聚合物，其可优选通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。可以在骨髓移植前、骨髓移植后或移植的同时对受体施用肽。
合物。在一个实施方案中，聚合的修饰基团是水溶性聚合物，其可优选通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。可以在骨髓移植前、骨髓移植后或移植的同时对受体施用肽。
[0129] 长期植入对成功的移植很重要。术语“植入”指输入或移植入的供体干细胞归巢至受体的骨髓并产生所有类型的血细胞的过程。干细胞移植后，新的白细胞、红细胞和血小板开始在受体的血液中出现时植入首次明显。长期植入指输入或植入的供体细胞不受受体免疫系统排斥，长期保留于受体骨髓内并产生血细胞的过程。在移植物中包含中期和晚期的
祖细胞可加速供体来源的成熟细胞的产生和支持植入过程。
祖细胞可加速供体来源的成熟细胞的产生和支持植入过程。
[0130] 相应地，本发明提供增强提供给受体的骨髓的长期植入的方法和组合物。在一示例性实施方案中，在骨髓移植前对供体施用本发明的肽。肽增加了供体的造血作用，尤其是增加了祖细胞的数目，其在骨髓和/或造血细胞植入受体时增加了植入的成功率和寿命。移植的骨髓可以是受体自身的骨髓(自体)，或者骨髓可以从相同物种的供体移植(异体)。
[0131] 在另一实施方案中，对骨髓移植受体施用本发明的肽，以增强供给的骨髓(不论骨髓来自受体自身或来自另一个体)的长期植入。对受体应用肽可增加受体的造血作用，从而通过刺激供给的骨髓增加造血祖细胞的产生来增强植入。
[0132] 造血细胞移植
[0133] 造血细胞移植是多种遗传或恶性疾病共同的治疗方法。一些移植操作利用整个骨髓群体，而另一些操作利用更确定的群体富集干细胞。除骨髓外，这种细胞可从其他来源获得，如外周血和新生儿脐带血。使用外周血干细胞的一个优点是，这些细胞在外周血中比在骨髓中易于接近。但是，外周血干细胞移植的限制因素是循环多能干/祖细胞数量少。因此，需要离体扩大干细胞以用于移植。
[0134] 因此，本发明提供扩大造血细胞培养物的方法。这种方法包括在示例性实施方案中对造血细胞培养物施用有效量的本发明的肽。这种肽将在示例性实施方案中是G-CSF肽
和聚合的修饰基团间的缀合物。在一个实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合物，其可优选通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。在
一个实施方案中，本发明提供了方法，该方法提供扩大的干细胞及祖细胞群体(其可用于移植)。这些方法包括对干细胞培养物施用有效量的本发明的肽的步骤。
和聚合的修饰基团间的缀合物。在一个实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合物，其可优选通过完整的糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。在
一个实施方案中，本发明提供了方法，该方法提供扩大的干细胞及祖细胞群体(其可用于移植)。这些方法包括对干细胞培养物施用有效量的本发明的肽的步骤。
[0135] 器官移植
[0136] 与骨髓移植类似，实体器官移植(如肝脏、肾脏、心脏和肺)可引起受体的许多免疫反应。这种免疫反应可导致这些移植物的急性排斥。G-CSF及其他造血生长因子可用于治疗这种反应(美国专利号5,718,893)。相应地，本发明的方法和组合物可用于预防或减少患者中器官移植急性排斥的发生。
[0137] 心脏病
[0138] 在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于减轻心脏病和改善心脏功能。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于刺激血管形成干细胞的释放。G-CSF治疗可减少心脏病患者的心绞痛，所述患者包括已经历多次手术和使用最大剂量的常规药物的患
者(见如Medical NewsToday，2007年6月4日，“Severe Heart Disease Patients Offered NewHope”)。其他研究显示，即使心肌已为心脏病所损伤，G-CSF也可挽救和保护心肌，防止这些肌肉死亡(见如Sunday Telegraph News，2007年8月5日，“Our World-first hearts that Repair Themselves”)。G-CSF单独或与来自患者的成体干细胞组合可以作为一种疗
法来修复心脏的坏死组织和产生新的血管。
者(见如Medical NewsToday，2007年6月4日，“Severe Heart Disease Patients Offered NewHope”)。其他研究显示，即使心肌已为心脏病所损伤，G-CSF也可挽救和保护心肌，防止这些肌肉死亡(见如Sunday Telegraph News，2007年8月5日，“Our World-first hearts that Repair Themselves”)。G-CSF单独或与来自患者的成体干细胞组合可以作为一种疗
法来修复心脏的坏死组织和产生新的血管。
[0139] 神经疾病
[0140] 在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗神经疾病，包括但不限于阿尔茨海默氏病及其他退化性脑功能障碍。阿尔茨海默氏病的小鼠模型中的研究显示，G-
CSF可逆转这些模型中的阿尔茨海默样症状(见Tsai等人，(2007)，J.Exp.Med.204(6)：
1273-80)。这些研究表明，向血流中注射G-CSF可促进造血干细胞从骨髓释放。这些干细胞从血流进入脑，附着至脑中的损伤位点并分化为新细胞。G-CSF的应用引起新细胞在神经元损伤最严重的部位生长。
CSF可逆转这些模型中的阿尔茨海默样症状(见Tsai等人，(2007)，J.Exp.Med.204(6)：
1273-80)。这些研究表明，向血流中注射G-CSF可促进造血干细胞从骨髓释放。这些干细胞从血流进入脑，附着至脑中的损伤位点并分化为新细胞。G-CSF的应用引起新细胞在神经元损伤最严重的部位生长。
[0141] G-CSF缀合物
[0142] 根据上述任一方法，肽是G-CSF肽和聚合的修饰基团间的共价缀合物。聚合的修饰基团可优选通过糖基连接基团，在G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽。在
一个实施方案中，糖基连接基团是完整的糖基连接基团。在优选实施方案中，聚合的修饰基团和糖基连接基团通过连接体连接。在示例性实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合
物，如聚乙二醇。
一个实施方案中，糖基连接基团是完整的糖基连接基团。在优选实施方案中，聚合的修饰基团和糖基连接基团通过连接体连接。在示例性实施方案中，聚合的修饰基团为水溶性聚合
物，如聚乙二醇。
[0143] G-CSF已被克隆和测序。在示例性实施方案中，G-CSF具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列。技术人员可容易地理解，本发明不限于本文所描述的序列。
[0144] 本发明还包含本领域公知的G-CSF变体。作为实例，但不以任何方式意在限制本发明，美国专利号6,166,183中描述了G-CSF变体，其中描述了包含赖氨酸残基的天然补充并
进一步连接至一个或两个聚乙二醇分子的G-CSF。此外，美国专利号6,004,548，5,580,755，
5,582,823和5,676,941描述了G-CSF变体，其中17、36、42、64和74位的半胱氨酸残基中的一个或多个为丙氨酸或备选地为丝氨酸所取代。美国专利号5,416,195描述了G-CSF分子，其
中17位的半胱氨酸、27位的天冬氨酸、65位和66位的丝氨酸分别为丝氨酸、丝氨酸、脯氨酸和脯氨酸所取代。其他变体为本领域公知，并描述于(如)美国专利号5,399,345。其他变体具有选自SEQ IDNo：3-11的氨基酸。
进一步连接至一个或两个聚乙二醇分子的G-CSF。此外，美国专利号6,004,548，5,580,755，
5,582,823和5,676,941描述了G-CSF变体，其中17、36、42、64和74位的半胱氨酸残基中的一个或多个为丙氨酸或备选地为丝氨酸所取代。美国专利号5,416,195描述了G-CSF分子，其
中17位的半胱氨酸、27位的天冬氨酸、65位和66位的丝氨酸分别为丝氨酸、丝氨酸、脯氨酸和脯氨酸所取代。其他变体为本领域公知，并描述于(如)美国专利号5,399,345。其他变体具有选自SEQ IDNo：3-11的氨基酸。
[0145] 本发明的经修饰的G-CSF分子的表达和活性可用本领域公知和描述于(如)美国专利号4,810,643中的方法测定。作为实例，活性可用放射标记的胸苷吸收测定法测定。简言之，用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)对来自健康供体的人骨髓进行密度分离，低密度细胞悬浮于含10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Iscove培养基
4
(GIBCO，La Jolla，CA)。将2×10个人骨髓细胞与对照培养基或本发明的G-CSF置于96孔平
底板中，于37℃、空气中含5％CO2的条件下孵育大约2天。然后用0.5μCi/孔的3H-胸苷(New England Nuclear，Boston，Mass.)脉冲培养物约4小时，按(如)Ventua等人(1983，Blood
61：781)中所述测定吸收。与用对照化合物处理的骨髓细胞相比，掺入人骨髓细胞中的3H-胸苷的增加表明是有活性和可行的G-CSF化合物。
4
(GIBCO，La Jolla，CA)。将2×10个人骨髓细胞与对照培养基或本发明的G-CSF置于96孔平
底板中，于37℃、空气中含5％CO2的条件下孵育大约2天。然后用0.5μCi/孔的3H-胸苷(New England Nuclear，Boston，Mass.)脉冲培养物约4小时，按(如)Ventua等人(1983，Blood
61：781)中所述测定吸收。与用对照化合物处理的骨髓细胞相比，掺入人骨髓细胞中的3H-胸苷的增加表明是有活性和可行的G-CSF化合物。
[0146] 本发明的缀合物是通过酶连接经修饰的糖至糖基化或非糖基化的G-CSF肽形成的。当嵌入G-CSF肽和糖上的修饰基团间时，经修饰的糖成为在本文中可称为的(如)“完整的糖基连接基团”。通过如糖基转移酶的酶的精密的选择性，本发明提供在一个或多个特异性位置处具有想要的基团的肽。因此，根据本发明，经修饰的糖直接连接至G-CSF肽链上的选定部位或，备选地，经修饰的糖附加至糖蛋白的糖部分。这样的肽也在本发明的范围内，其中经修饰的糖同时结合至糖肽碳水化合物并直接结合至G-CSF肽主链的氨基酸残基上。
[0147] 与已知的化学和酶学肽加工策略不同，用本发明的方法可能组装具有基本同质的衍生模式的肽和糖肽；本发明使用的酶一般对G-CSF肽的特定氨基酸残基或氨基酸残基组
合有选择性。这种方法也可用于经修饰的肽和糖肽的大规模生产。因此，本发明的方法为具有预先选定的一致衍生模式的糖肽的大规模制备提供了实际的手段。此方法尤其适用于治
疗性肽的修饰，所述肽包括但不限于在培养细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物生产中被不完全糖基化的糖肽。
合有选择性。这种方法也可用于经修饰的肽和糖肽的大规模生产。因此，本发明的方法为具有预先选定的一致衍生模式的糖肽的大规模制备提供了实际的手段。此方法尤其适用于治
疗性肽的修饰，所述肽包括但不限于在培养细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物生产中被不完全糖基化的糖肽。
[0148] 本发明还提供糖基化和非糖基化G-CSF肽的缀合物，由于(如)清除率降低或免疫或网状内皮系统(RES)吸收率降低，所述缀合物的治疗半衰期增加。此外，本发明的方法提供掩蔽肽上的抗原决定簇、从而降低或消除宿主针对该肽的宿主免疫反应的手段。靶向试
剂的选择性连接还可将肽靶向对特定靶向试剂有特异性的特定组织或细胞表面受体。
剂的选择性连接还可将肽靶向对特定靶向试剂有特异性的特定组织或细胞表面受体。
[0149] 在一个实施方案中，本发明提供选定修饰基团和G-CSF肽间的缀合物。肽和修饰部分间的连接包括嵌入肽和选定部分间的糖基连接基团。如本文所讨论，选定的修饰部分基
本上是可连接至糖单位导致形成可被适当的转移酶识别的“经修饰的糖”的任一种类，所述转移酶将经修饰的糖附加至肽或将糖基残基连接至肽。当嵌入肽和选定部分间时，经修饰
的糖的糖成分成为“糖基连接基团”，如“完整的糖基连接基团”。糖基连接基团形成自任一单糖或寡糖，经修饰基团修饰后，其是酶的底物，所述酶将经修饰的糖加入肽的氨基酸或糖残基。
本上是可连接至糖单位导致形成可被适当的转移酶识别的“经修饰的糖”的任一种类，所述转移酶将经修饰的糖附加至肽或将糖基残基连接至肽。当嵌入肽和选定部分间时，经修饰
的糖的糖成分成为“糖基连接基团”，如“完整的糖基连接基团”。糖基连接基团形成自任一单糖或寡糖，经修饰基团修饰后，其是酶的底物，所述酶将经修饰的糖加入肽的氨基酸或糖残基。
[0150] 糖基连接基团可以是(或可包括)在修饰基团加入前或加入中经降解性修饰的糖部分。例如，糖基连接基团可衍生自糖残基，所述糖残基是氧化降解完整的糖成为对应的醛(如通过偏高碘酸的作用)、随后转化为具有适当胺的席夫碱(其随后还原为对应的胺)产生
的。
的。
[0151] 本发明的缀合物通常对应于一般结构：
[0152]
[0153] 其中符号a、b、c、d和S代表正的非0整数；t为0或正整数。“试剂”一般为水溶性部分，如PEG部分。连接体可以是一系列连接基团中的任一种(下文)。备选地，连接体可以是单键或“零级连接体”。
[0154] 如本文所进一步讨论，修饰基团可以包括可连接至糖单位的任一种类。这种基团包括聚合物(包括水溶性和非水溶性聚合物)，还可包括治疗部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分等。在示例性实施方案中，选定的修饰基团为水溶性聚合物，如m-PEG。水溶性聚合物通过糖基连接基团共价连接至G-CSF肽，所述糖基连接基团共价连接至G-CSF肽的氨基酸残
基或糖残基。本发明还提供用糖基连接基团对其中的氨基酸残基和糖残基进行了修饰的缀
合物。
基或糖残基。本发明还提供用糖基连接基团对其中的氨基酸残基和糖残基进行了修饰的缀
合物。
[0155] 本发明的肽包含至少一个N-或O-连接的糖基化位点。除提供通过酶加入糖基连接基团形成的缀合物外，本发明还提供取代模式中高度同质的缀合物。使用本发明的方法，可能形成肽缀合物，其中本发明的缀合物群体的基本所有经修饰的糖部分都连接至结构一致
的氨基酸或糖残基的多个拷贝。因此，一方面，本发明提供具有水溶性聚合物部分的群体的肽缀合物，所述水溶性聚合物部分通过完整的糖基连接基团共价连接至G-CSF肽。在本发明的缀合物的示例性实施方案中，水溶性聚合物部分群体的基本每一成员都通过糖基连接基
团连接至G-CSF肽的糖残基，糖基连接基团连接的G-CSF肽的每一糖残基都具有相同的结
构。
的氨基酸或糖残基的多个拷贝。因此，一方面，本发明提供具有水溶性聚合物部分的群体的肽缀合物，所述水溶性聚合物部分通过完整的糖基连接基团共价连接至G-CSF肽。在本发明的缀合物的示例性实施方案中，水溶性聚合物部分群体的基本每一成员都通过糖基连接基
团连接至G-CSF肽的糖残基，糖基连接基团连接的G-CSF肽的每一糖残基都具有相同的结
构。
[0156] 还提供肽缀合物，其具有通过糖基连接基团共价连接至肽的水溶性聚合物部分的群体。在一个实施方案中，水溶性聚合物部分群体的基本每一成员都通过糖基连接基团结
合至G-CSF肽的氨基酸残基，糖基连接基团连接的每一氨基酸残基都具有相同的结构。
合至G-CSF肽的氨基酸残基，糖基连接基团连接的每一氨基酸残基都具有相同的结构。
[0157] 本发明还提供类似于上述缀合物的缀合物，其中G-CSF肽通过完整的糖基连接基团缀合治疗部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分等。上述部分的每一个可以是小分子、天然聚合物(如多肽)或合成聚合物。
[0158] 经修饰的糖
[0159] 本发明提供经修饰的糖、经修饰的糖核苷酸和经修饰的糖的缀合物。在本发明的经修饰的糖化合物中，糖部分优选为糖、脱氧糖、氨基糖或N-酰基糖。术语“糖”及其同等词、“糖基”、“糖”指单体、二聚体、寡聚体和多聚体。糖部分也用修饰基团官能化。修饰基团一般通过与糖上的的胺、巯基或羟基(如伯羟基)部分缀合而缀合至糖部分。在示例性实施方案
中，修饰基团通过糖上的胺部分连接，如通过胺与修饰基团的反应性衍生物反应形成的酰
胺、氨基甲酸乙酯或尿素。
中，修饰基团通过糖上的胺部分连接，如通过胺与修饰基团的反应性衍生物反应形成的酰
胺、氨基甲酸乙酯或尿素。
[0160] 任一糖均可用作本发明缀合物的糖核心。在形成本发明的组合物中有用的示例性糖核心包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖，如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等。糖核心可以是天然结构，或其可经修饰以提供结合修饰基团的位点。例如，在一个实施方案中，本发明提供包含唾液酸衍生物的肽缀合物，所述唾液酸衍生物中的9-羟基部分被胺取代。用选定修饰基团的活化类似物
易于衍生胺。
易于衍生胺。
[0161] 糖基连接基团
[0162] 根据上述任一方法的肽缀合物，肽缀合物的一些实施方案包含糖基连接基团，其是唾液酸残基。
[0163] G-CSF肽和选定部分(如水溶性聚合物)间的连接包括插入肽和选定部分间的完整的糖基连接基团。如本文讨论，选定部分基本上是可连接至糖单位形成可被适当转移酶(其将经修饰的糖附加至G-CSF肽)识别的“经修饰的糖”的任一类型。当插入G-CSF肽和选定部分间时，经修饰的糖的糖成分成为“完整的糖基连接基团”。糖基连接基团形成自任一单糖或寡糖，其经选定部分修饰后是适当转移酶的底物。
[0164] 在一个实施方案中，糖基连接基团为具有以下通式结构的唾液酸残基：
[0165]
[0166] 其中R为水溶性聚合物，水溶性聚合物通过所述连接体连接至唾液酸残基
[0167] 在另一实施方案中，糖基连接基团是具有以下通式的唾液酸残基：
[0168]
[0169] 其中n为1-2000的整数。
[0170] 在另一实施方案中，糖基连接基团包含具有以下通式的经修饰的唾液酸残基：
[0171]
[0172] 其中
[0173] R2为H、CH2OR7、COOR7或OR7
[0174] 其中
[0175] R7代表H、取代或未取代烷基、或取代或未取代杂烷基；
[0176] R3和R4为独立地选自H、取代或未取代烷基、OR8、NHC(O)R9的成员
[0177] 其中
[0178] R8和R9独立地选自H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基或唾液酸；
[0179] La为选自键、取代或未取代烷基和取代或未取代杂烷基的连接体；
[0180] R16和R17为独立选择的聚合物臂；
[0181] X2和X4为独立地选择的连接聚合物部分R16和R17至C的连接片段；
[0182] X5为非反应性基团。
[0183] 在另一实施方案中，氨基酸残基是选自丝氨酸或苏氨酸的成员。在另一实施方案中，氨基酸残基是SEQ.ID.NO：1的133位苏氨酸。
[0184] 在一个实施方案中，糖基连接基团包含选自以下的结构：
[0185]
[0186] 其中
[0187] R15为经修饰的唾液酸残基；和
[0188] p为1-10的整数。
[0189] 在另一实施方案中，糖基连接基团具有选自以下的通式：
[0190]
[0191] 其中
[0192] AA为所述肽的氨基酸残基；
[0193] t为等于0或1的整数；
[0194] p为1-10的整数；和
[0195] R15’为选自H、OH、唾液酸、所述经修饰的唾液酸残基和Sia-Siap的成员
[0196] 其中
[0197] Siap为所述经修饰的唾液酸残基，
[0198] 其中至少一个R15’选自所述经修饰的唾液酸残基和Sia-Siap。在一个实施方案中，氨基酸残基为天冬酰胺残基。
[0199] 在另一实施方案中，所述G-CSF肽包含以下通式的结构：
[0200]
[0201] 其中q为0或1；Sia-PEG具有以下通式的结构：
[0202]
[0203] 其中n为1-2000的整数。在另一实施方案中，n为400-500的整数。在另一实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0204] 在随后的讨论中，通过参考选定的唾液酸衍生物的使用来说明本发明。本领域技术人员应认可，讨论的中心是为了说明的明晰性，所述结构和组合物一般适用于各种糖基、经修饰的糖基、活化的经修饰糖基和经修饰糖基的缀合物。
[0205] 在示例性实施方案中，本发明提供包含经修饰的糖胺的肽缀合物，所述糖胺具有通式：
[0206]
[0207] 其中G为糖基部分，L为键或连接体，R1为修饰基团。示例性键为糖基部分的NH2和修1 1 1
饰基团上具有互补反应性的基团间形成的键。因此，示例性键包括但不限于NHR 、OR 、SR等。例如，当R1包含羧酸部分时，此部分可被激活并与糖残基上的NH2部分偶联，提供具有NHC(O)R1结构的键。类似地，OH和SH基团可分别转化为对应的醚或硫醚衍生物。
饰基团上具有互补反应性的基团间形成的键。因此，示例性键包括但不限于NHR 、OR 、SR等。例如，当R1包含羧酸部分时，此部分可被激活并与糖残基上的NH2部分偶联，提供具有NHC(O)R1结构的键。类似地，OH和SH基团可分别转化为对应的醚或硫醚衍生物。
[0208] 示例性连接体包括烷基和杂烷基部分。连接体包括连接基团，例如基于酰基的连接基团，如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团是本发明的种类的成分间形成的键，如糖基部分和连接体(L)间、或连接体和修饰基团(R1)间。其他连接基团为醚、硫醚和胺。例如，在一个实施方案中，连接体为氨基酸残基，如甘氨酸残基。甘氨酸的羧酸部分通过与糖残基上的胺反应转化为对应的酰胺，甘氨酸的胺通过与活化的羧酸或修饰基团的碳酸根反应转化为
对应的酰胺或氨基甲酸乙酯。
对应的酰胺或氨基甲酸乙酯。
[0209] 另一示例性连接体为PEG部分或用氨基酸残基官能化的PEG部分。PEG在一个PEG末端通过氨基酸残基结合至糖基，通过另一PEG末端结合至R1。备选地，氨基酸残基结合至R1，未连接至氨基酸的PEG末端结合至糖基。
[0210] NH-L-R1的示例性种类具有通式-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中指数s和t独立地为0或1。指数a、b和d独立地为0-20的整数，c为1-2500的整数。其他类似的连接体基于这样的种类，其中-NH部分被如-S、-O和-CH2取代。
[0211] 更具体地，本发明提供包含化合物的肽缀合物，所述化合物中NH-L-R1为：NHC(O)1 1
(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在这些通式中，指数a、b和d为独立地选自0-20的整数，优选1-5。
指数c为1-2500的整数。
(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在这些通式中，指数a、b和d为独立地选自0-20的整数，优选1-5。
指数c为1-2500的整数。
[0212] 在说明性实施方案中，G为唾液酸，本发明的选定化合物具有通式：
[0213]
[0214] 如本领域技术人员所理解，上述示例性化合物的唾液酸部分可用任一其他氨基糖取代，其包括但不限于葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺及它们的N-乙酰衍生物等。
[0215] 在另一说明性实施方案中，糖的伯羟基部分用修饰基团官能化。例如，唾液酸的9-羟基可转化为对应的胺并官能化以提供本发明的化合物。此实施方案的通式包括：
[0216]
[0217] 在另一示例性实施方案中，本发明提供了包含经修饰的糖的肽缀合物，所述经修饰的糖中的6-羟基位置转化为对应的胺部分，其具有连接体-修饰基团盒，如上述的那些。
可用作这些经修饰的糖的核心的示例性糖基包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。此实施方案的代表性经修饰的糖具有通式：
可用作这些经修饰的糖的核心的示例性糖基包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。此实施方案的代表性经修饰的糖具有通式：
[0218]
[0219] 其中R3-R5和R7为独立地选自H、OH、C(O)CH3、NH和NH C(O)CH3的成员。R6为上述OR1、NHR1或NH-L-R1。
[0220] 本发明的选定缀合物基于甘露糖、半乳糖或葡萄糖、或具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立体结构的种类。这些缀合物的通式为：
[0221]
[0222] 在另一示例性实施方案中，本发明提供活化为对应的核苷酸糖的上述化合物。在本发明中以其经修饰的形式使用的示例性糖核苷酸包括核苷酸单磷酸、二磷酸或三磷酸或
其类似物。在一个实施方案中，经修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更优选地，经修饰的糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示例性实施方案中，核苷酸磷酸连接至C-1。
其类似物。在一个实施方案中，经修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更优选地，经修饰的糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示例性实施方案中，核苷酸磷酸连接至C-1。
[0223] 因此，在糖基部分为唾液酸的说明性实施方案中，本发明提供用具有以下通式的化合物形成的肽缀合物：
[0224]
[0225] 其中L-R1如上文讨论，L1-R1代表连接至修饰基团的连接体。与L一样，L1的示例性连接体种类包括键、烷基或杂烷基部分。
[0226] 在另一示例性实施方案中，本发明提供本发明的经修饰的糖和底物(如肽、脂类、糖苷配基等)间形成的缀合物，更具体地为经修饰的糖和糖肽或糖脂的糖残基间形成的缀
合物。在此实施方案中，经修饰的糖的糖部分成为插入底物和修饰基团间的糖基连接基团。
示例性糖基连接基团为完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的糖基部分未被化学(如
偏高碘酸钠)或酶学方法(如氧化酶)降解。本发明的选定缀合物包含连接至氨基糖(如甘露
糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修饰基团。根据此基序的示例性修饰基团-完整的糖基连接基团盒基于唾液酸结构，如具有以下通式的结构：
合物。在此实施方案中，经修饰的糖的糖部分成为插入底物和修饰基团间的糖基连接基团。
示例性糖基连接基团为完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的糖基部分未被化学(如
偏高碘酸钠)或酶学方法(如氧化酶)降解。本发明的选定缀合物包含连接至氨基糖(如甘露
糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修饰基团。根据此基序的示例性修饰基团-完整的糖基连接基团盒基于唾液酸结构，如具有以下通式的结构：
[0227]
[0228] R1、L1和L2如上文所述。
[0229] 在另一示例性实施方案中，缀合物形成于底物和糖基部分的1-位之间，修饰基团通过连接体在糖基部分的6-碳位置连接至糖基部分。因此，此实施方案的说明性缀合物具
有通式：
有通式：
[0230]
[0231] 其中基团如上文所述。技术人员应理解，上述经修饰的糖部分也可结合至底物的2、3、4或5位碳原子处。
[0232] 此实施方案的说明性化合物包括具有以下通式的化合物：
[0233]
[0234] 其中的R基团和指数如上文所述。
[0235] 本发明还提供在6-碳位置用L-R1修饰的糖核苷酸。此实施方案的示例性种类包括：
[0236]
[0237] 其中R基和L代表上文讨论的部分。指数“y”为0、1或2。
[0238] 本发明的另一示例性核苷酸糖基于具有GDP甘露糖立体结构的种类。此实施方案的示例性种类具有结构：
[0239]
[0240] 在另一示例性实施方案中，本发明提供基于UDP半乳糖立体结构的缀合物。此实施方案的示例性化合物具有结构：
[0241]
[0242] 在另一示例性实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立体结构。此实施方案的示例性种类具有通式：
[0243]
[0244]
[0245] 修饰基团R1是多种种类中的一种，所述种类包括但不限于水溶性聚合物、非水溶性聚合物、治疗剂、诊断剂等。下文详细讨论了示例性修饰基团的性质。
[0246] 水溶性聚合物
[0247] 在一些实施方案中，本发明的G-CSF缀合物的聚合的修饰基团为水溶性聚合物。这些水溶性聚合物可为线性或分支聚合物。在一个实施方案中，水溶性聚合物具有基本均匀
分散的分子量分布。
分散的分子量分布。
[0248] 在一些实施方案中，本发明的缀合物包含水溶性聚合物，所述水溶性聚合物为聚乙二醇，如甲氧基-聚乙二醇。本发明所用的聚乙二醇不限于任一特定形式或分子量范围。
对非分支聚乙二醇分子，分子量优选在500-100,000之间。优选使用2,000-60,000的分子
量，更优选约5,000-约30,000。
对非分支聚乙二醇分子，分子量优选在500-100,000之间。优选使用2,000-60,000的分子
量，更优选约5,000-约30,000。
[0249] 在另一实施方案中，聚乙二醇为有一个以上连接的PEG部分的分支PEG。分支PEG的实例描述于美国专利号5,932,462、美国专利号5,342,940、美国专利号5,643,575、美国专利号5,919,455、美国专利号6,113,906、美国专利号5,183,660、WO 02/09766、Kodera Y.，BioconjugateChemistry 5：283-288(1994)和Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，52：2125-
2127，1998。本文公开了其他有用的分支PEG结构。
2127，1998。本文公开了其他有用的分支PEG结构。
[0250] 在示例性实施方案中，分支PEG中每一聚乙二醇的分子量等于或大于约2,000，5,000、10,000、15,000、20,000、40,000或60,000道尔顿。
[0251] 许多水溶性聚合物为本领域技术人员公知，并且在实施本发明中有用。术语水溶性聚合物包含以下种类：糖，如葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚唾液酸、类肝素、肝素等；聚氨基酸，如聚天冬氨酸和聚谷氨酸；核酸；合成聚合物，如聚丙烯酸、聚醚(如聚乙二醇)；肽、蛋白质等。可用任一水溶性聚合物实施本发明，唯一的限制是聚合物必须包含供缀合物剩
余部分连接的点。
余部分连接的点。
[0252] 聚合物激活的方法可见于WO 94/17039、美国专利号5,324,844、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利号5,219,564、美国专利号5,122,614、WO 90/13540、美国专利号5,281,
698和WO 93/15189，以及活化聚合物和肽，如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO
94/09027)、携氧分子(美国专利号4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))之间的缀合。
698和WO 93/15189，以及活化聚合物和肽，如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO
94/09027)、携氧分子(美国专利号4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))之间的缀合。
[0253] 在本发明的一个实施方案中，所用水溶性聚合物为这样的聚合物，其中聚合物样品中的大部分聚合物分子具有大致相同的分子量，这种聚合物为“均匀分散”。
[0254] 通过参考聚乙二醇缀合物来进一步说明本发明。可获得有关PEG的功能化和缀合的几篇综述和专题文章。见如Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874
(1992)；Delgado等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-
304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；Bhadra等人，Pharmazie，57：
5-29(2002)。制备反应性PEG分子和用反应性分子形成缀合物的方法为本领域公知。例如，美国专利号5,672,662公开了选自线性或分支的聚环氧烷、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇和聚丙烯吗啉的聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的缀合物。
(1992)；Delgado等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-
304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；Bhadra等人，Pharmazie，57：
5-29(2002)。制备反应性PEG分子和用反应性分子形成缀合物的方法为本领域公知。例如，美国专利号5,672,662公开了选自线性或分支的聚环氧烷、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇和聚丙烯吗啉的聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的缀合物。
[0255] 美国专利号6,376,604中描述了通过聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑基)碳酸酯在有机溶剂中反应，制备水溶性非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性
酯用于形成带有生物活性剂(如蛋白质或肽)的缀合物。
酯用于形成带有生物活性剂(如蛋白质或肽)的缀合物。
[0256] WO 99/45964描述了包含生物活性剂和活化的水溶性聚合物的缀合物，所述水溶性聚合物包含聚合物主链，其具有通过稳定连接连接至聚合物主链的至少一个末端，其中
所述至少一个末端包含分支部分，其具有连接至分支部分的邻近反应基团，其中生物活性
剂连接至至少一个邻近反应基团。其他分支聚乙二醇描述于WO 96/21469，美国专利号5,
932,462描述了用分支PEG分子形成的缀合物，所述分支PEG分子包含分支末端，分支末端包含反应性官能团。可获得自由反应性基团与如蛋白质或肽的生物活性种类反应，形成聚乙
二醇和生物活性种类间的缀合物。美国专利号5,446,090描述了双功能PEG连接体及其形成
在每一PEG连接体末端具有肽的缀合物中的用途。
所述至少一个末端包含分支部分，其具有连接至分支部分的邻近反应基团，其中生物活性
剂连接至至少一个邻近反应基团。其他分支聚乙二醇描述于WO 96/21469，美国专利号5,
932,462描述了用分支PEG分子形成的缀合物，所述分支PEG分子包含分支末端，分支末端包含反应性官能团。可获得自由反应性基团与如蛋白质或肽的生物活性种类反应，形成聚乙
二醇和生物活性种类间的缀合物。美国专利号5,446,090描述了双功能PEG连接体及其形成
在每一PEG连接体末端具有肽的缀合物中的用途。
[0257] 包含可降解PEG连接的缀合物描述于WO 99/34833和WO 99/14259，以及美国专利号6,348,558。这种可降解连接适用于本发明。
[0258] 上述聚合物激活的本领域公知的方法在本发明的背景下形成本文所述分支聚合物中有用，对这些分支聚合物与其他种类(如糖、糖核苷酸等)的结合也有用。
[0259] 在本发明中有用的示例性聚乙二醇分子包括但不限于具有以下通式的分子：
[0260]
[0261] 其中R8为H、OH、NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂烷基，如乙缩醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q或-(CH2)qC(Y)Z1。指数“e”代表1-2500的整数。指数b、d和q独立地代表0-20的整1
数。符号Z和Z 独立地代表OH、NH2、离去基团，如咪唑、对-硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R9、活化酯的醇部分、-(CH2)pC(Y1)V或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符号Y代表H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符号X、Y、Y1、A1和U独立地代表O、S、N-R11部分。符号V代表OH、NH2、卤素、S-R12、活化酯的醇部分、活化酰胺的胺成分、糖核苷酸和蛋白质。指数p、q、s和v为独立地选自0-20的成员。
9 10 11 12
符号R、R 、R 和R 独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烷基和取代或未取代的杂芳基。
数。符号Z和Z 独立地代表OH、NH2、离去基团，如咪唑、对-硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R9、活化酯的醇部分、-(CH2)pC(Y1)V或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符号Y代表H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符号X、Y、Y1、A1和U独立地代表O、S、N-R11部分。符号V代表OH、NH2、卤素、S-R12、活化酯的醇部分、活化酰胺的胺成分、糖核苷酸和蛋白质。指数p、q、s和v为独立地选自0-20的成员。
9 10 11 12
符号R、R 、R 和R 独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烷基和取代或未取代的杂芳基。
[0262] 在其他示例性实施方案中，聚乙二醇分子选自以下：
[0263]
[0264] 在形成本发明的缀合物中有用的聚乙二醇为线性的或分支的。适合在本发明中使用的分支聚乙二醇分子包括但不限于以下通式描述的分子：
[0265]
[0266] 其中R8和R8’为独立地选自以上为R8定义的基团的成员。A1和A2为独立地选自以上为A1定义的基团的成员。指数e、f、o和q如上文所述。Z和Y如上文所述。X1和X1’为独立地选自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH的成员。
[0267] 在另一示例性实施方案中，分支PEG基于半胱氨酸、丝氨酸或双赖氨酸核心。因此，示例性分支PEG包括：
[0268]
[0269] 在另一实施方案中，分支PEG部分基于三赖氨酸肽。三赖氨酸可为单、双、三或四聚乙二醇化的。根据此实施方案的示例性种类具有通式：
[0270]
[0271] 其中e、f和f’为独立地选自1-2500的整数；q、q’和q”为独立地选自1-20的整数。
[0272] 在本发明的示例性实施方案中，PEG为m-PEG(5kD、10kD或20kD)。示例性分支PEG为丝氨酸-m-PEG或半胱氨酸-m-PEG，其中m-PEG为20kD的m-PEG。
[0273] 如技术人员所知，在本发明中有用的分支聚合物包括上述主题的变型。例如，上述二-赖氨酸-PEG缀合物可包括三个聚合的亚单位，第三个亚单位结合至上述结构中显示为未经修饰的α-胺。类似地，用三个或四个聚合的亚单位官能化的三-赖氨酸的用途也在本发明的范围之内。
[0274] 根据本发明的特定实施方案包括：
[0275]
[0276] 及这些种类的碳酸酯和活性酯，如：
[0277]
[0278] 适于激活在制备本文所述化合物中有用的线性PEG的其他激活(或离去)基团包括但不限于以下种类：
[0279]
[0280] WO 04/083259中描述了用这些和其他种类激活的PEG分子及制备活化PEG的方法。
[0281] 本领域技术人员应理解，分支聚合物的m-PEG臂中的一个或多个可为具有不同末端(如OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等)的PEG部分所取代。此外，上述结构易于通过在α-碳原子和侧链的官能团之间插入烷基连接体(或移去碳原子)进行修饰。因此，“均匀”衍生物和高级同系物以及低级同系物都包含于在本发明中所用的分支PEG的核心的范围内。
[0282] 本文所述分支PEG类型易于通过如以下图示的方法制备：
[0283]
[0284] 其中Xa为O或S，r为1-5的整数。指数e和f为独立地选自1-2500的整数。
[0285] 因此，根据此图示，天然或非天然氨基酸与活化的m-PEG衍生物接触，这种情况下，甲苯磺酸通过烷化侧链的杂原子Xa形成1。将单官能化m-PEG氨基酸进行使用反应性m-PEG衍生物的N-酰化条件，从而组装分支m-PEG 2。如技术人员将理解，甲苯磺酸离去基团可用任一适合的离去基团取代，如卤素、甲磺酸、三氟甲磺酸等。类似地，用来酰化胺的反应性碳酸酯可用活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺等取代，或者可用如二环己基碳二亚胺、羧基二咪唑等的脱水剂原位激活所述酸。
[0286] 在示例性实施方案中，修饰基团为PEG部分，但是，任一修饰基团(如水溶性聚合物、非水溶性聚合物、治疗部分等)均可通过适当的连接掺入糖基部分。通过酶方法、化学方法或两种方法联用形成经修饰的糖，从而产生经修饰的糖。在示例性实施方案中，用活性胺在任一位置取代糖，该位置容许修饰部分的连接，还容许糖作为能将经修饰的糖偶联至G-
CSF肽的酶的底物起作用。在示例性实施方案中，当半乳糖胺为经修饰的糖时，胺部分在6-位连接至C原子。
CSF肽的酶的底物起作用。在示例性实施方案中，当半乳糖胺为经修饰的糖时，胺部分在6-位连接至C原子。
[0287] 还可用如聚乙二醇(PEG)的PEG部分增强治疗性糖肽的体内半衰期。例如，用PEG对蛋白质进行的化学修饰(PEG化)增大了其分子大小，降低了其表面和官能团的可及性，二者均依赖于连接至蛋白质的PEG的大小。这导致了血浆半衰期和蛋白水解稳定性的改进，和免疫原性和肝摄取的降低(Chaffee等人J.Clin.Invest.89：1643-1651(1992)；Pyatak等人
Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29：113-127(1980))。已报道白细胞介素-2的聚乙二醇化增加了其在体内的抗肿瘤功效(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：1487-1491
(1987)，并且衍生自单克隆抗体A7的F(ab’)2的聚乙二醇化改进了其肿瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，在另一实施方案中，与非衍生肽的体内半衰期相比，通过本发明的方法用PEG部分衍生的肽的体内半衰期增加了。
Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29：113-127(1980))。已报道白细胞介素-2的聚乙二醇化增加了其在体内的抗肿瘤功效(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：1487-1491
(1987)，并且衍生自单克隆抗体A7的F(ab’)2的聚乙二醇化改进了其肿瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，在另一实施方案中，与非衍生肽的体内半衰期相比，通过本发明的方法用PEG部分衍生的肽的体内半衰期增加了。
[0288] 肽体内半衰期的增加最好表示为此数量百分数增加的范围。百分数增加范围的下端为约40％、约60％、约80％、约100％、约150％和约200％。范围的上端为约60％、约80％、约100％、约150％或高于约250％。
[0289] G-CSF肽
[0290] 基本任一具有任一序列的粒细胞集落刺激因子肽或试剂用作本发明缀合物的肽成分。粒细胞集落刺激因子已被克隆和测序。在示例性实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID
NO：1所示序列：
NO：1所示序列：
[0291] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYK
[0292] LCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL
[0293] FLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE
[0294] LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEV
[0295] SYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：1).。
[0296] 在另一示例性实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID NO：2所示序列：
[0297] TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKL
[0298] CHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLF
[0299] LYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEEL
[0300] GMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVS
[0301] YRVLRHLAQP(SEQ ID NO：2).。
[0302] 在另一示例性实施方案中，G-CSF肽具有以下SEQ ID NO：3-11所示序列：
[0303] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECA
[0304] TYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQL
[0305] HSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQ
[0306] QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQ
[0307] SFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：3)
[0308] MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSL
[0309] PQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLL
[0310] GHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQA
[0311] LEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQP
[0312] TQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLA
[0313] QP(SEQ ID NO：4)
[0314] MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSL
[0315] PQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEEL
[0316] VLLGHSLGIPWAPLS SCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGL
[0317] LQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPA
[0318] LQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLR
[0319] HLAQP(SEQ ID NO：5)
[0320] MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATY
[0321] KLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHS
[0322] GLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQM
[0323] EELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFL
[0324] EVSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：6)；
[0325] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYK
[0326] LCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL
[0327] FLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE
[0328] LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEV
[0329] SYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：7)；
[0330] MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATY
[0331] KLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSG
[0332] LFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQME
[0333] ELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLE
[0334] VSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：8)；
[0335] MQTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATY
[0336] KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHS
[0337] GLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQM
[0338] EELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFL
[0339] EVSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：9)；
[0340] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYK
[0341] LCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL
[0342] FLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE
[0343] LGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEV
[0344] SYRVLRHLAQPTQGAMP；(SEQ ID NO：10)和
[0345] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYK
[0346] LCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL
[0347] FLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEE
[0348] LGMAPTTTPTQTAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQ SFLEV
[0349] SYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：11)
[0350] 本发明不以任何方式限制于本文所述序列。
[0351] 在示例性实施方案中，本发明的G-CSF肽包含至少一个O-连接的糖基化位点，其被包含PEG部分的糖残基糖基化。PEG通过完整的糖基连接基团共价连接至G-CSF肽。糖基连接接团共价连接至G-CSF肽的氨基酸残基或糖残基。备选地，糖基连接基团连接至糖肽的一个或多个糖基单位。本发明还提供糖基连接基团连接至氨基酸残基和糖残基二者的缀合物。
[0352] PEG部分直接或通过非糖基连接体(如取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基)连接至完整的糖基连接体。
[0353] 在示例性实施方案中，G-CSF部分包含具有通式I的部分。
[0354] 通式I
[0355]
[0356] 其中D为选自-OH和R1-L-HN-的成员；G为选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1为包含选自直链或支链聚乙二醇残基的成员的部分；L为选自键、取代或未取代烷基和取代或未取代的杂烷基的成员的连接体，这样当D为OH时，G为R1-L-，当G为-C(O)(C1-C6)烷基时，D为R1-L-NH-。在本文所述经修饰的唾液酸结构中，COOH还代表COO-和/或其盐。
[0357] 在一个实施方案中，R1-L具有通式：
[0358]
[0359] 其中a为0-20的整数。
[0360] 在示例性实施方案中，R1具有选自以下成员的结构：
[0361]
[0362] 其中e和f为独立地选自1-2500的整数；q为选自1-20的整数。在其他实施方案中，R1具有选自以下成员的结构：
[0363]
[0364] 其中e和f为独立地选自1-2500的整数；q为1-20的整数。在其他实施方案中，R1具有选自以下成员的结构：
[0365]
[0366] 其中f和f’为独立地选自1-2500的整数；q和q’为独立地选自1-20的整数。
[0367] 在另一实施方案中，本发明提供G-CSF肽缀合物，其中R1具有选自以下成员的结构：
[0368]
[0369] 其中e、f和f’为独立地选自1-2500的整数；q、q’和q”为独立地选自1-20的整数。
[0370] 在其他实施方案中，R1具有选自以下成员的结构：
[0371]
[0372] 其中e和f为独立地选自1-2500的整数。
[0373] 在另一示例性实施方案中，本发明提供包含具有以下通式的部分的肽：
[0374]
[0375] Gal可连接至氨基酸，或连接至直接或间接地(如通过糖残基)连接至氨基酸的糖残基。
[0376] 在另一实施方案中，此部分具有通式：
[0377]
[0378] GalNAc可连接至氨基酸，或连接至直接或间接地(如通过糖残基)连接至氨基酸的糖残基。
[0379] 在另一示例性实施方案中，肽包含以下通式的部分：
[0380]
[0381] 其中AA为所述肽的氨基酸残基，在以上每一结构中，D和G如本文所述。
[0382] 可结合一个或多个上述种类的G-CSF肽的示例性氨基酸残基包括丝氨酸和苏氨酸，如SEQ.ID.NO.：1的133位苏氨酸。
[0383] 在另一示例性实施方案中，本发明提供G-CSF缀合物，其包括具有以下通式的糖残基：
[0384]
[0385] 其中a、b、c、d、i、r、s、t和u为独立地选自0和1的整数。指数q为1。指数e、f、g和h为独立地选自0-6的整数。指数j、k、l和m为独立地选自0-100的整数。指数v、w、x和y独立地选自0和1，且v、w、x和y中至少有一个为1。符号AA代表G-CSF肽的氨基酸残基。
[0386] 符号Sia-(R)代表具有以下通式的基团：
[0387]
[0388] 其中D选自-OH和R1-L-HN-。符号G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烷基。R1代表包含直链或分支聚乙二醇残基的部分。L为连接体，其是选自键、取代或未取代烷基和取代或未取代杂烷基的成员。一般，当D为OH时，G为R1-L-，当G为-C(O)(C1-C6)烷基时，D为R1-L-NH-。
[0389] 在另一示例性实施方案中，本发明的缀合物中经PEG修饰的唾液酸部分具有通式：
[0390]
[0391] 其中指数“s”代表0-20的整数，n为1-2500的整数。在一个实施方案中，s等于1；m-PEG部分具有约20kD的分子量。
[0392] 在更进一步的示例性实施方案中，经PEG修饰的唾液酸具有通式：
[0393]
[0394] 其中L为连接唾液酸部分和PEG部分的取代或未取代烷基或取代或未取代杂烷基连接部分。
[0395] 在一个实施方案中，上述天冬酰胺残基的至少两个、更优选地三个、更优选地四个用以上所示的N-连接聚糖链官能化。
[0396] 本发明的缀合物包含单价或多价(如触角结构)的完整的糖基连接基团。因此本发明的缀合物包含两类型，其中选定部分通过单价糖基连接基团和多价连接基团连接至肽。
本发明还包含其中有一个以上的选定部分通过多价连接基团连接至肽的缀合物。
本发明还包含其中有一个以上的选定部分通过多价连接基团连接至肽的缀合物。
[0397] 水不溶性聚合物
[0398] 在另一实施方案中，类似于上文所讨论，经修饰的糖包含水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物还可包含一个或多个水不溶性聚合物。通过将缀合物用作载体以受控的方式递送治疗性肽来说明本发明的此实施方案。聚合的药物递送系统为本领
域公知。见如Dunn等人编辑，Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACS
Symposium Series469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员应理解，基本任一已知药物递送系统均适用于本发明的缀合物。
域公知。见如Dunn等人编辑，Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACS
Symposium Series469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员应理解，基本任一已知药物递送系统均适用于本发明的缀合物。
[0399] 上述R1、L-R1、R15、R15’及其他基团的基序同等地适用于水不溶性聚合物，其可通过本领域技术人员易于利用的化学方法，无限制地掺入线性和分支结构。
[0400] 代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烯、聚对苯二酸亚乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯基苯酚和其共聚物。
[0401] 在本发明的缀合物中有用的经合成修饰的天然聚合物包括但不限于烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝酸纤维素。经合成修饰的天然聚合物大类的尤其优选的成员包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、醋酞纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐和丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯与藻酸的聚合物。
[0402] 本文讨论的这些及其他聚合物可容易地从商业来源获得，如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka
(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或通过标准技术合成自从这些供应商获得的单体。
(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或通过标准技术合成自从这些供应商获得的单体。
[0403] 在本发明的缀合物中有用的代表性生物可降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚对苯二酸亚乙酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己内酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。形成凝胶的组合物，如包含胶原、
pluronics等的组合物尤其有用。
pluronics等的组合物尤其有用。
[0404] 本发明中有用的聚合物包括含水不溶性材料的“杂合”聚合物，水不溶性材料在其结构的至少一部分内具有生物可再吸收分子。这种聚合物的实例是包括水不溶性共聚物的聚合物，其每一聚合物链均具有生物可再吸收区、亲水区和多个可交联的官能团。
[0405] 为本发明的目的，“水不溶性材料”包括在水或含水环境中基本不溶解的材料。因此，虽然共聚物的某些区域或片段可以是亲水的或甚至是水溶性的，但作为整体，聚合物分子不在任一实质的程度下溶于水。
[0406] 为本发明的目的，术语“生物可再吸收分子”包含一个区域，该区域可被身体代谢或降解，并被再吸收和/或通过正常排泄途径排出。优选这种代谢产物或降解产物基本对身体是无毒的。
[0407] 只要共聚物组合物作为整体不溶于水，生物可再吸收区域可以是疏水的或亲水的。因此，基于聚合物作为整体保持水不溶性的优先性来选择生物可再吸收区域。相应地，选择生物可再吸收区和亲水区所含的官能团的种类和相对比例，以确保有用的生物可再吸
收组合物保持水不溶性。
收组合物保持水不溶性。
[0408] 示例性可再吸收聚合物包含(如)聚(α-羟基-羧酸)/聚氧化烯的合成产生的可再吸收的嵌段共聚物(见Cohn等人，美国专利号4,826,945)。这些共聚物是未交联的，水溶性的，使得身体可排出降解的嵌段共聚物成分。见Younes等人，J Biomed.Mater.Res.21：
1301-1316(1987)；Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。
1301-1316(1987)；Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。
[0409] 目前优选的生物可再吸收聚合物包括选自聚酯、聚羟酸、聚内酯、聚酰胺、聚(酯-酰胺)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酯、聚硫酯、多糖和其混合物的一种或多种成分。更优选地，生物可再吸收的聚合物包括聚羟酸成分。在聚羟酸中，优选聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。
[0410] 除形成在体内被吸收(“生物再吸收”)的片段外，本发明方法中优选使用的聚合物包衣还可形成可排泄和/或可代谢的片段。
[0411] 高级共聚物也可用于本发明。例如，Casey等人的美国专利号4,438,253(1984年3月20日发行)公开了三嵌段共聚物，其产生自聚乙醇酸和以羟基结尾的聚亚烷基二醇的转
酯作用。公开这种组合物用作可再吸收的单纤维缝线。通过将芳族原碳酸酯(如原碳酸四对甲苯酯)掺入共聚物结构来控制这种组合物的弹性。
酯作用。公开这种组合物用作可再吸收的单纤维缝线。通过将芳族原碳酸酯(如原碳酸四对甲苯酯)掺入共聚物结构来控制这种组合物的弹性。
[0412] 还可利用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如，1993年4月13日公布的Spinu的美国专利号5,202,413公开了生物可降解多嵌段共聚物，其具有聚丙交酯和/或聚乙醇酸
交酯的连续有序的嵌段，其是通过将丙交酯和/或乙醇酸交酯开环聚合至低聚二醇或二胺
残基，然后用双功能化合物(如二异氰酸盐、二酰氯或二氯甲硅烷)进行链延伸而产生的。
交酯的连续有序的嵌段，其是通过将丙交酯和/或乙醇酸交酯开环聚合至低聚二醇或二胺
残基，然后用双功能化合物(如二异氰酸盐、二酰氯或二氯甲硅烷)进行链延伸而产生的。
[0413] 在本发明中有用的包衣的生物可再吸收区可设计为可水解和/或酶切割的。为本发明的目的，“可水解切割”指共聚物，特别是生物可再吸收区对在水或含水环境中的水解作用的敏感性。类似地，本文所用“可酶切割”指共聚物，特别是生物可再吸收区对内源或外源酶切割的敏感性。
[0414] 当置于体内时，亲水区可被加工为可排泄和/或可代谢的片段。因此，亲水区可包括，例如，聚醚、聚环氧烷、多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。此外，亲水区还可以是(如)聚环氧烷。这种聚环氧烷可包含(如)聚环氧乙烷、聚环氧丙烷及其混合物和共聚物。
[0415] 为水凝胶成分的聚合物在本发明中也有用。水凝胶是可吸收相对大量的水的聚合物材料。形成水凝胶的化合物实例包括但不限于聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明胶、角叉菜胶和其他多糖、羟乙基甲基丙烯酸(HEMA)、以及它们的衍生物等。
可制备稳定、生物可降解和生物可再吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可包含表现出一种或多种这些性质的亚单位。
可制备稳定、生物可降解和生物可再吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可包含表现出一种或多种这些性质的亚单位。
[0416] 可通过交联来控制其完整性的生物相容性水凝胶组合物是已知的并且当前在本发明方法中优选使用。例如，Hubbell等人的美国专利号5,410,016(1995年4月25日公布)和
5,529,914(1996年6月25日公布)公开了水溶性系统，其是交联的嵌段共聚物，具有水溶性
中央嵌段，该嵌段夹在两个对水解作用不稳定的延伸部分间。用可光可聚合的丙烯酸官能
性进一步对这种共聚物进行封端。这些系统交联时成为水凝胶。这种共聚物的水溶性中央
嵌段可包含聚乙二醇，而对水解作用不稳定的延伸部分可为聚α-羟酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。见Sawhney等人，Macromolecules 26：581-587(1993)。
5,529,914(1996年6月25日公布)公开了水溶性系统，其是交联的嵌段共聚物，具有水溶性
中央嵌段，该嵌段夹在两个对水解作用不稳定的延伸部分间。用可光可聚合的丙烯酸官能
性进一步对这种共聚物进行封端。这些系统交联时成为水凝胶。这种共聚物的水溶性中央
嵌段可包含聚乙二醇，而对水解作用不稳定的延伸部分可为聚α-羟酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。见Sawhney等人，Macromolecules 26：581-587(1993)。
[0417] 在另一优选实施方案中，凝胶为热可逆凝胶。目前优选包含如pluronics、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝胶、聚氨基甲酸酯-尿素水凝胶及其组合的成分的热可逆凝胶。
[0418] 在另一示例性实施方案中，本发明的缀合物包含脂质体成分。可按本领域技术人员公知的方法制备脂质体，例如，按Eppstein等人的美国专利号4,522,811中所述。例如，可按以下方法制备脂质体制剂：将适当的脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬酯酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂，然后蒸发干溶剂，在容器表面上留下干脂薄膜。往容器中加入活性化合物或其药学上可接受的盐的水溶液。然后用手涡旋容器，使脂质物质从容器边缘释放并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬液。
[0419] 上文所述微粒及制备微粒的方法以实例的方式给出，其并非旨在限定在本发明中所用的微粒的范围。本领域技术人员应理解，一系列通过不同方法制造的微粒在本发明中
是有用的。
是有用的。
[0420] 上文在水溶性聚合物的背景中讨论的直链和支链结构形式，一般也适用于水不溶性聚合物。因此，例如半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸分支核心可用两个水不溶性聚合物部分官能化。用来产生这些种类的方法一般非常类似于用来产生水溶性聚合物的方
法。
法。
[0421] 制备G-CSF缀合物的方法
[0422] 除上文讨论的缀合物外，本发明提供制备这些缀合物和其他缀合物的方法。因此，一方面，本发明提供在选定部分和G-CSF肽间形成共价缀合物的方法。此外，本发明提供将本发明的缀合物靶向身体特定组织或区域的方法。
[0423] 在示例性实施方案中，缀合物形成于PEG部分(或包含PEG部分的可酶促转移的糖基部分)和糖基化或非糖基化肽之间。PEG通过完整的糖基修饰基团结合至G-CSF肽，完整的糖基连接基团插入其间并共价连接至G-CSF肽和PEG部分二者，或连接至PEG-非糖基连接体
(如取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基)构建体。该方法包括将G-CSF肽与混合物接
触，所述混合物包含经修饰的糖和糖基转移酶，经修饰的糖是所述糖基转移酶的底物。反应在足以形成经修饰的糖和G-CSF肽间共价键的条件下进行。经修饰的糖的糖部分选自核苷
酸糖、活化糖和既非核苷酸又未活化的糖。
(如取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基)构建体。该方法包括将G-CSF肽与混合物接
触，所述混合物包含经修饰的糖和糖基转移酶，经修饰的糖是所述糖基转移酶的底物。反应在足以形成经修饰的糖和G-CSF肽间共价键的条件下进行。经修饰的糖的糖部分选自核苷
酸糖、活化糖和既非核苷酸又未活化的糖。
[0424] 受体肽(糖基化或非糖基化的)一般从头合成，或重组表达于原核细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞)。G-CSF肽可以是全长蛋白质或片段。此外，G-CSF肽可以是野生型的肽或突变的肽。在示例性实施方案中，G-CSF肽包含突变，该突变为肽序列增加了一个或多个N-或O-连接的糖基化位点。
[0425] 在示例性实施方案中，因子IX为O-糖基化的，并以下述方式用水溶性聚合物官能化。通过可用的氨基酸糖基化位点生产肽，或若该位点是糖基化的，则修剪糖基部分以暴露氨基酸。例如，丝氨酸或苏氨酸为α-1N-乙酰氨基半乳糖基化(GalNAc)的，通过ST6GalNAcT1用唾液酸-修饰基团盒将NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化。备选地，用Core-1-GalT-1将NAc-
半乳糖基化的肽半乳糖基化，产物通过ST3GalT1用唾液酸-修饰基团盒唾液酸化。此方法的示例性缀合物具有以下连接：Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia＊，其中Sia＊为唾液酸-修饰基团盒。
半乳糖基化的肽半乳糖基化，产物通过ST3GalT1用唾液酸-修饰基团盒唾液酸化。此方法的示例性缀合物具有以下连接：Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia＊，其中Sia＊为唾液酸-修饰基团盒。
[0426] 在本发明的使用多种酶和糖基供体的方法(如上文所述)中，单个糖基化步骤可分开进行或组合于“单罐”反应中。例如，在上述三种酶的反应中，GalNAc转移酶、GalT和SiaT及其供体可组合于单个容器。备选地，GalNAc反应可单独进行，GalT和SiaT和适当的糖基供体都作为单个步骤加入。进行反应的另一模式包含，连续地加入每一种酶和适当的供体，以“单罐”模式进行反应。上述每一方法的组合可用于制备本发明的化合物。
[0427] 在本发明的缀合物，尤其是糖聚乙二醇化的N-连接的聚糖中，Sia-修饰基团盒可以α-2，6或α-2，3键连接至Gal。
[0428] 本发明的方法还提供重组生产的不完全糖基化的肽的修饰。在本发明的方法中，通过经修饰的糖，可用如PEG部分、治疗剂等同时进一步糖基化和衍生G-CSF肽。经修饰的糖的糖部分可以是可正确结合至完全糖基化的肽中受体的残基，或具有所需性质的另一糖部
分。
分。
[0429] 经本发明方法修饰的G-CSF肽可以是合成的或野生型的肽，或其可以是通过本领域公知的方法(如位点定向诱变)产生的突变肽。肽的糖基化一般为N-连接或O-连接的。示
例性N-连接是经修饰的糖与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天
冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸外的任一氨基酸)是酶连接碳水化合物部分至天冬酰胺
侧链的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在将产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)连接至羟基氨基酸的羟基侧链，优选丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨
酸。
例性N-连接是经修饰的糖与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天
冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸外的任一氨基酸)是酶连接碳水化合物部分至天冬酰胺
侧链的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在将产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)连接至羟基氨基酸的羟基侧链，优选丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨
酸。
[0430] 在一示例性实施方案中，G-CSF肽表达于哺乳动物系统，通过唾液酸酶处理修饰以修剪末端唾液酸残基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供体聚乙二醇化。
[0431] 在另一示例性实施方案中，哺乳动物细胞表达的G-CSF先用唾液酸酶处理以修剪末端唾液酸残基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供体聚乙二醇化，再用ST3Gal3和唾液酸
供体唾液酸化。
供体唾液酸化。
[0432] 哺乳动物系统中表达的G-CSF还可用唾液酸酶和半乳糖苷酶处理削减其唾液酸和半乳糖残基，然后用半乳糖供体和半乳糖基转移酶半乳糖基化，再用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供体聚乙二醇化。
[0433] 在另一实施方案中，G-CSF不先用唾液酸酶处理，而用修饰基团-唾液酸盒和如ST3Gal3的酶通过唾液酸转移反应进行糖聚乙二醇化。
[0434] 在进一步的示例性实施方案中，G-CSF表达于昆虫细胞，并经以下步骤修饰：先用适当的N-乙酰葡糖胺供体和GnT-I、II、IV和V中的一种或几种将N-乙酰葡糖胺加入G-CSF，然后用PEG-半乳糖的供体和半乳糖基转移酶将G-CSF聚乙二醇化。
[0435] 酵母中生产的G-CSF也可糖聚乙二醇化。例如，G-CSF先经内切聚糖酶处理修剪糖基基团，用半乳糖供体和半乳糖基转移酶半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供体聚乙二醇化。
[0436] 通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个糖基化位点，可方便地实现在肽或其他结构中加入糖基化位点。也可通过在G-CSF肽的序列内掺入1个或多个提供-OH基团的种类
(优选丝氨酸或苏氨酸残基)进行加入(对O-连接的糖基化位点而言)。可通过G-CSF肽的突
变或全化学合成进行加入。优选通过DNA水平的改变来改变G-CSF肽的氨基酸序列，尤其是
在预先选定的碱基处突变编码肽的DNA，以产生将翻译为所需氨基酸的密码子。优选使用本领域公知的方法进行DNA突变。
(优选丝氨酸或苏氨酸残基)进行加入(对O-连接的糖基化位点而言)。可通过G-CSF肽的突
变或全化学合成进行加入。优选通过DNA水平的改变来改变G-CSF肽的氨基酸序列，尤其是
在预先选定的碱基处突变编码肽的DNA，以产生将翻译为所需氨基酸的密码子。优选使用本领域公知的方法进行DNA突变。
[0437] 在示例性实施方案中，通过改组多核苷酸加入糖基化位点。编码候选肽的多核苷酸可用DNA改组方案调节。DNA改组是递归重组和突变的方法，通过一群相关基因的随机片
段化，随后通过类似于聚合酶链式反应的方法将片段重新组装来进行。见如Stemmer，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；
美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
段化，随后通过类似于聚合酶链式反应的方法将片段重新组装来进行。见如Stemmer，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；
美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
[0438] 本发明还提供将一个或多个选定糖残基加入(或除去)肽的方法，其后将经修饰的糖结合至肽的至少一个选定糖残基。例如，当希望将经修饰的糖结合至在肽上不存在或不
以所希望的量存在的选定糖残基时，本实施方案是有用的。因此，在将经修饰的糖偶联至肽之前，通过酶法或化学偶联将选定糖残基结合至G-CSF肽。在另一实施方案中，通过从糖肽除去碳水化合物残基，在结合经修饰的糖之前改变糖肽的糖基化模式。见如WO98/31826。
以所希望的量存在的选定糖残基时，本实施方案是有用的。因此，在将经修饰的糖偶联至肽之前，通过酶法或化学偶联将选定糖残基结合至G-CSF肽。在另一实施方案中，通过从糖肽除去碳水化合物残基，在结合经修饰的糖之前改变糖肽的糖基化模式。见如WO98/31826。
[0439] 存在于糖肽上的任一碳水化合物部分的加入或去除可通过化学法或酶法实现。化学法去糖基化优选通过将多肽变体暴露于三氟甲磺酸化合物或同等化合物而发生。这一处
理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖被切割，而保持肽
完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人，
Anal.Biochem.118：131(1981)中描述了化学法去糖基化。多肽变体上碳水化合物部分的酶切割可按Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述，通过使用各种内切和外切糖苷酶实现。
理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖被切割，而保持肽
完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人，
Anal.Biochem.118：131(1981)中描述了化学法去糖基化。多肽变体上碳水化合物部分的酶切割可按Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述，通过使用各种内切和外切糖苷酶实现。
[0440] 糖基部分的化学法加入通过任一本领域公知的方法实现。糖部分的酶促加入优选通过本文所述方法的修改实现，用固有糖基单位取代本发明中使用的经修饰的糖。加入糖
部分的其他方法公开于美国专利号5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577。
部分的其他方法公开于美国专利号5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577。
[0441] 选定糖残基的示例性连接点包括但不限于：(a)N-和O-糖基化的共有位点；(b)末端糖基部分，其是糖基转移酶的受体；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)自由羧基；(e)自由巯基，如半胱氨酸的巯基；(f)自由羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(g)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；(h)谷氨酰胺的酰胺基。在本发明中有用的示例性方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC
Crit.Rev.Biochem.，259页-306页(1981)。
Crit.Rev.Biochem.，259页-306页(1981)。
[0442] 在示例性实施方案中，本发明提供制备包含以下部分的聚乙二醇化G-CSF的方法：
[0443]
[0444] 其中D为-OH或R1-L-HN-。符号G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烷基。R1为包含直链或支链聚乙二醇残基的部分。符号L代表选自键、取代或未取代烷基和取代或未取代杂烷基的连1 1
接体。一般，当D为OH时，G为R-L-，当G为-C(O)(C1-C6)烷基时，D为R-L-NH-。本发明的方法包括，(a)用PEG-唾液酸供体和酶接触底物G-CSF肽，所述酶能将PEG-唾液酸部分从供体转
移至底物G-CSF肽。
接体。一般，当D为OH时，G为R-L-，当G为-C(O)(C1-C6)烷基时，D为R-L-NH-。本发明的方法包括，(a)用PEG-唾液酸供体和酶接触底物G-CSF肽，所述酶能将PEG-唾液酸部分从供体转
移至底物G-CSF肽。
[0445] 示例性PEG-唾液酸供体是核苷酸糖，如具有以下通式的核苷酸糖：
[0446]
[0447] 和在适合转移的条件下将PEG-唾液酸转移至G-CSF肽的氨基酸或糖残基的酶。
[0448] 在一个实施方案中，在形成本发明的缀合物前，底物G-CSF肽表达于宿主细胞。示例性宿主细胞为哺乳动物细胞。在其他实施方案中，宿主细胞为昆虫细胞、植物细胞、细菌或真菌。
[0449] 本文所述方法适用于以上部分所述的每一G-CSF缀合物。
[0450] 经本发明方法修饰的G-CSF肽可以是合成的或野生型的肽，或它们可以是通过本领域公知的方法(如位点定向诱变)产生的突变肽。肽的糖基化一般为N-连接的或O-连接
的。示例性N-连接是经修饰的糖与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸外的任一氨基酸)是酶连接碳水化合物部分至天冬
酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)连接至羟基氨基酸的羟基侧链，所述羟基氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用不常见
或非天然的氨基酸如5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
的。示例性N-连接是经修饰的糖与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸外的任一氨基酸)是酶连接碳水化合物部分至天冬
酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)连接至羟基氨基酸的羟基侧链，所述羟基氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用不常见
或非天然的氨基酸如5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0451] 依照本发明，通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个糖基化位点，可实现往肽或其他结构中加入糖基化位点。糖基化位点的加入也可通过在肽序列内掺入1个或多个
提供-OH基团的种类(优选丝氨酸或苏氨酸残基)实现(对O-连接的糖基化位点而言)。可通
过肽的突变或全化学合成实现加入。在一些实施方案中，通过DNA水平的改变来改变肽的氨基酸序列，尤其是通过在预先选定的碱基处突变编码肽的DNA，以产生将翻译为所需氨基酸的密码子。用本领域公知的方法实现DNA突变。
提供-OH基团的种类(优选丝氨酸或苏氨酸残基)实现(对O-连接的糖基化位点而言)。可通
过肽的突变或全化学合成实现加入。在一些实施方案中，通过DNA水平的改变来改变肽的氨基酸序列，尤其是通过在预先选定的碱基处突变编码肽的DNA，以产生将翻译为所需氨基酸的密码子。用本领域公知的方法实现DNA突变。
[0452] 在示例性实施方案中，通过改组多核苷酸加入糖基化位点。编码候选肽的多核苷酸可用DNA改组方案调节。DNA改组是递归重组和突变的方法，通过一群相关基因的随机片
段化，随后通过类似于聚合酶链式反应的方法将片段重新组装来进行。见如Stemmer，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；
美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
段化，随后通过类似于聚合酶链式反应的方法将片段重新组装来进行。见如Stemmer，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；
美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
[0453] WO04/099231、WO03/031464及相关的美国和PCT申请中详述了加入或去除糖基化位点、及加入或去除糖基结构或亚结构的示例性方法。
[0454] 本发明还使用将一个或多个选定糖残基加入(或去除)G-CSF肽的方法，其后将经修饰的糖结合至肽的至少一个选定糖残基。例如，当希望将经修饰的糖结合至G-CSF肽上不存在或不以所希望的量存在的选定糖残基时，这些技术是有用的。因此，在将经修饰的糖偶联至肽之前，通过酶法或化学偶联将选定糖残基结合至G-CSF肽。在另一实施方案中，通过从糖肽中去除碳水化合物残基，在结合经修饰的糖之前改变糖肽的糖基化模式。见如WO
98/31826。
98/31826。
[0455] 选定糖残基的示例性连接点包括但不限于：(a)N-连接糖基化的共有位点和O-连接糖基化的共有位点；(b)末端糖基部分，其是糖基转移酶的受体；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)自由羧基；(e)自由巯基，如半胱氨酸的巯基；(f)自由羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(g)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；(h)谷氨酰胺的酰胺基。在本发明中有用的示例性方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330，以及
Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259页-306页(1981)。
Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259页-306页(1981)。
[0456] 依照本发明，用适合的酶介导结合，将经PEG修饰的糖结合至糖基化或非糖基化的肽。优选地，经修饰的供体糖、酶和受体肽的浓度如此选择，使糖基化进行至受体的修饰达到所希望的程度。应理解，下文在唾液酸转移酶的上下文中所讨论的考虑事项，一般适用于其他糖基转移酶反应。
[0457] 已知许多用糖基转移酶合成希望的寡糖结构的方法，其一般适用于本发明。示例性方法描述于(如)WO 96/32491；Ito等人，Pure Appl.Chem.65：753(1993)；美国专利号5,
352,670、5,374,541、5,545,553和共有的美国专利号6,399,336和6,440,703，其在此引用作为参考。
352,670、5,374,541、5,545,553和共有的美国专利号6,399,336和6,440,703，其在此引用作为参考。
[0458] 通过单个糖基转移酶或糖基转移酶的组合实施本发明。例如，可用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在使用一种以上酶的实施方案中，优选将酶和底物混合于起始
反应混合物，或者在第一个酶反应完成或接近完成时，加入第二个酶反应的酶和试剂。通过在单个容器中依次进行两个酶反应，总产量可超过分离中间种类的方法。此外，减少了过量溶剂和副产物的清除和处理。
反应混合物，或者在第一个酶反应完成或接近完成时，加入第二个酶反应的酶和试剂。通过在单个容器中依次进行两个酶反应，总产量可超过分离中间种类的方法。此外，减少了过量溶剂和副产物的清除和处理。
[0459] 在一个实施方案中，第一种和第二种酶均为糖基转移酶。在另一优选实施方案中，一种酶为内切糖苷酶。在另一实施方案中，使用了两种以上的酶来组装本发明的经修饰的糖蛋白。在经修饰的糖加入肽之前或之后，用酶改变G-CSF肽在任一点上的糖结构。
[0460] 在另一实施方案中，本发明的方法使用一种或多种外切或内切糖苷酶。糖苷酶可以是突变体和/或变体，其可形成或被设计成可形成糖苷键，而不是使糖苷键断裂。这种突变体聚糖酶一般包含用氨基酸残基取代活性位点的酸性氨基酸残基。例如，当内切聚糖酶
为endo-H时，被取代的活性位点残基通常为130位的Asp、132位的Glu或二者的组合。一般用丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺来取代氨基酸。
为endo-H时，被取代的活性位点残基通常为130位的Asp、132位的Glu或二者的组合。一般用丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺来取代氨基酸。
[0461] 这种突变体酶可通过类似于内切聚糖酶水解步骤的逆反应的合成步骤催化反应。在这种实施方案中，糖基供体分子(如想得到的寡聚糖或单糖结构)包含离去基团，随反应
进行，供体分子加入蛋白质的GlcNAc残基。例如，离去基团可以是卤素，如氟化物。在其他实施方案中，离去基团为Asn或Asn-肽部分。在另一实施方案中，糖基供体分子上的GlcNAc残基是经修饰的。例如，GlcNAc残基可以包含1，2噁唑啉部分。
进行，供体分子加入蛋白质的GlcNAc残基。例如，离去基团可以是卤素，如氟化物。在其他实施方案中，离去基团为Asn或Asn-肽部分。在另一实施方案中，糖基供体分子上的GlcNAc残基是经修饰的。例如，GlcNAc残基可以包含1，2噁唑啉部分。
[0462] 在一个实施方案中，用来生产本发明的缀合物的酶以催化量存在。特定酶的催化量依该酶底物的浓度及反应条件如温度、时间和pH值而不同。在预先选定的底物浓度和反
应条件下测定给定酶的催化量的方法为本领域技术人员公知。
应条件下测定给定酶的催化量的方法为本领域技术人员公知。
[0463] 本发明反应进行的温度可从略高于冰点至使大部分敏感酶变性的温度。优选温度范围为约0℃-约55℃，更优选约20℃-约37℃。在另一示例性实施方案中，用耐热酶在提高的温度下进行本方法的一个或多个成分。
[0464] 一方面，反应混合物维持足以使受体糖基化的一段时间，从而形成想得到的缀合物。几小时后常可检测到一些缀合物，通常在24小时或更短时间内获得可回收的量。本领域技术人员应理解，反应速度依赖于为选定系统优化的许多可变因素(如酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)。
[0465] 本发明还提供经修饰的肽的工业规模生产。如本文所用，“工业规模”一般指至少1克成品纯化缀合物的生产。
[0466] 在后续讨论中，本发明以经修饰的唾液酸部分与糖基化肽的缀合为例。示例性的经修饰的唾液酸用PEG标记。以下关于PEG-修饰的唾液酸和糖基化肽的讨论的中心是为了
说明的明晰性，并非旨在暗示本发明限制于这两个配偶体的缀合。技术人员理解，此讨论一般适用于除唾液酸外的经修饰的糖基部分的加入。此外，此讨论同等地适用于用除PEG外的试剂进行的糖基单位的修饰，所述试剂包括其他PEG部分、治疗部分和生物分子。
说明的明晰性，并非旨在暗示本发明限制于这两个配偶体的缀合。技术人员理解，此讨论一般适用于除唾液酸外的经修饰的糖基部分的加入。此外，此讨论同等地适用于用除PEG外的试剂进行的糖基单位的修饰，所述试剂包括其他PEG部分、治疗部分和生物分子。
[0467] 可用酶法选择地将聚乙二醇化或聚丙二醇化的碳水化合物引入肽或糖肽。此方法使用包含PEG、PPG或被掩蔽的反应性官能团的经修饰的糖，并与适当的糖基转移酶或糖合
酶组合。通过选择将形成想得到的碳水化合物连接的糖基转移酶，并利用经修饰的糖作为
供体底物，可直接将PEG或PPG引入G-CSF肽主链、糖肽上已有的糖残基或已加入肽的糖残基上。
酶组合。通过选择将形成想得到的碳水化合物连接的糖基转移酶，并利用经修饰的糖作为
供体底物，可直接将PEG或PPG引入G-CSF肽主链、糖肽上已有的糖残基或已加入肽的糖残基上。
[0468] 唾液酸转移酶的受体存在于待通过本发明的方法修饰的G-CSF肽上，作为天然存在的结构或通过重组法、酶法或化学法放置的结构。适合的受体包括(如)半乳糖基受体(如Galβ1、4GlcNAc、Galβ1、4GalNAc、Galβ1、3GalNAc、lacto-N-tetraose、Galβ1、3GlcNAc、Galβ
1、3Ara、Galβ1、6GlcNAc、Galβ1、4Glc(乳糖))和本领域技术人员公知的其他受体(见如Paulson等人，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。
1、3Ara、Galβ1、6GlcNAc、Galβ1、4Glc(乳糖))和本领域技术人员公知的其他受体(见如Paulson等人，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。
[0469] 在一个实施方案中，糖肽在体内合成后，唾液酸转移酶的受体存在于待修饰的糖肽上。这种糖肽可通过所要求保护的方法唾液酸化，无需先修改糖肽的糖基化模式。备选
地，本发明的方法可用于唾液酸化不含适合受体的肽；首先通过本领域技术人员公知的方
法修饰G-CSF肽，使其包含受体。在示例性实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用加入
GalNAc残基。
地，本发明的方法可用于唾液酸化不含适合受体的肽；首先通过本领域技术人员公知的方
法修饰G-CSF肽，使其包含受体。在示例性实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用加入
GalNAc残基。
[0470] 在示例性实施方案中，通过连接半乳糖残基至已连接G-CSF肽的适当受体(如GlcNAc)来组装半乳糖基受体。此方法包括将待修饰的G-CSF肽与包含适量半乳糖基转移酶
(如galβ1，3或galβ1，4)和适合的半乳糖基供体(如UDP-半乳糖)的反应混合物孵育。让反应进行至基本完成或，备选地，在加入预定量的半乳糖残基时终止反应。组装选定的糖受体的其他方法为本领域技术人员公知。
(如galβ1，3或galβ1，4)和适合的半乳糖基供体(如UDP-半乳糖)的反应混合物孵育。让反应进行至基本完成或，备选地，在加入预定量的半乳糖残基时终止反应。组装选定的糖受体的其他方法为本领域技术人员公知。
[0471] 在另一实施方案中，糖肽连接的寡糖先经完全或部分“修剪”，以暴露出唾液酸转移酶受体或可加入一个或多个适合残基以获得合适受体的部分。如糖基转移酶和内切糖苷酶的酶(见如美国专利号5,716,812)可用于连接和修剪反应。
[0472] 在下文的讨论中，本发明的方法以连接PEG部分的经修饰的糖的用途为例。讨论的中心是说明的明晰性。技术人员应理解，此讨论与其中经修饰的糖具有治疗部分、生物分子等的那些实施方案同等地相关。
[0473] 在本发明的示例性实施方案中，在加入经修饰的糖之前“修剪”碳水化合物残基，将高甘露糖削减至第一代双触角结构。具有PEG部分的经修饰的糖结合至通过“削减”暴露出的一个或多个糖残基。在一实例中，通过结合至PEG部分的GlcNAc部分加入PEG部分。经修饰的GlcNAc连接至双触角结构的一个或两个末端甘露糖残基。备选地，未经修饰的GlcNAc可加入至分支种类的一个或两个末端。
[0474] 在另一示例性实施方案中，PEG部分通过具有半乳糖残基的经修饰的糖(其结合至加入末端甘露糖残基的GlcNAc残基)加入双触角结构的一个或两个末端甘露糖残基。备选
地，未经修饰的Gal可加入一个或两个末端GlcNAc残基。
地，未经修饰的Gal可加入一个或两个末端GlcNAc残基。
[0475] 在进一步的实例中，用经修饰的唾液酸将PEG部分加至Gal残基。
[0476] 在另一示例性实施方案中，将高甘露糖结构“削减”至甘露糖，从其分支出双触角结构。在一实例中，通过用聚合物修饰的GlcNAc加入PEG部分。备选地，将未经修饰的GlcNAc加至甘露糖，后跟连接有PEG部分的Gal。在另一实施方案中，将未经修饰的GlcNAc和Gal残基依次加至甘露糖，后跟经PEG部分修饰的唾液酸部分。
[0477] 在进一步的示例性实施方案中，将高甘露糖“削减”至连接第一个甘露糖的GlcNAc。将GlcNAc结合至具有PEG部分的Gal残基。备选地，将未经修饰的Gal加至GlcNAc，然后加入用水溶性糖修饰的唾液酸。在进一步的实例中，末端GlcNAc与Gal结合，随后用具有PEG部分的经修饰的岩藻糖岩藻糖基化GlcNAc。
[0478] 高甘露糖也可削减至连接肽的Asn的第一个GlcNAc。在一实例中，GlcNAc-(Fuc)a残基的GlcNAc与具有水溶性聚合物的GlcNAc缀合。在另一实例中，GlcNAc-(Fuc)a残基的
GlcNAc经带有水溶性聚合物的Gal修饰。在进一步的实施方案中，GlcNAc经Gal修饰，然后结合至用PEG部分修饰的唾液酸的Gal。
GlcNAc经带有水溶性聚合物的Gal修饰。在进一步的实施方案中，GlcNAc经Gal修饰，然后结合至用PEG部分修饰的唾液酸的Gal。
[0479] 其他示例性实施方案描述于共有的美国专利申请公开20040132640、20040063911、20040137557；美国专利申请号10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/
410,945和PCT/US02/32263，其在此引用作为参考。
410,945和PCT/US02/32263，其在此引用作为参考。
[0480] 上述实例提供了对本文所述方法的功用的说明。使用本文所述方法，有可能“削减”和构建出具有基本任一想得到的结构的碳水化合物残基。经修饰的糖可按上文所述加
至碳水化合物部分的末端，或其可处于肽核心和碳水化合物末端之间。
至碳水化合物部分的末端，或其可处于肽核心和碳水化合物末端之间。
[0481] 在示例性实施方案中，用唾液酸酶从G-CSF糖肽上去除现有的唾液酸，从而暴露出所有或大部分的潜在甘露糖基残基。备选地，用半乳糖残基或以半乳糖单位结尾的寡糖残
基标记肽或糖肽。暴露或加入半乳糖残基后，用适当的唾液酸转移酶来加入经修饰的唾液
酸。图示1概述了本方法。
基标记肽或糖肽。暴露或加入半乳糖残基后，用适当的唾液酸转移酶来加入经修饰的唾液
酸。图示1概述了本方法。
[0482] 图解1
[0483]
[0484] 在概述于图示2的另一方法中，唾液酸上存在被掩蔽的反应官能性。被掩蔽的反应基团优选不受用于连接经修饰的唾液酸至G-CSF的条件影响。经修饰的唾液酸共价连接至
G-CSF肽后，去除掩蔽物，将G-CSF肽与如PEG的试剂缀合。试剂通过与经修饰的糖残基上未掩蔽的反应性基团反应，以特异的方式缀合至肽。
G-CSF肽后，去除掩蔽物，将G-CSF肽与如PEG的试剂缀合。试剂通过与经修饰的糖残基上未掩蔽的反应性基团反应，以特异的方式缀合至肽。
[0485] 图解2
[0486]
[0487] 依赖于糖肽寡糖侧链的末端糖，本文所述任一经修饰的糖均可与其适当的糖基转移酶一起使用(表1)。如上文讨论，需引入聚乙二醇化结构的糖肽的末端糖可以是表达中自然引入的，或其可在表达后用适当的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物
产生。
产生。
[0488] 表1
[0489]
[0490]
[0491] X＝O，NH，S，CH2，N-(R1-5)2.
Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.
Q＝H2，O，S，NH，N-R.
R，R1-4＝H，连接体-M，M.
M＝PEG，例如，m-PEG
Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.
Q＝H2，O，S，NH，N-R.
R，R1-4＝H，连接体-M，M.
M＝PEG，例如，m-PEG
[0492] 在进一步的示例性实施方案中，UDP-半乳糖-PEG与牛奶β1，4-半乳糖基转移酶反应，从而将经修饰的半乳糖转移至适当的末端N-乙酰葡糖胺结构。正如在如哺乳动物、昆
虫、植物或真菌的表达系统中可以发生的，糖肽上的末端GlcNAc残基可在表达中产生，但也可按需要通过用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。
虫、植物或真菌的表达系统中可以发生的，糖肽上的末端GlcNAc残基可在表达中产生，但也可按需要通过用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。
[0493] 在另一示例性实施方案中，利用GlcNAc转移酶(如GNT1-5)转移聚乙二醇化GlcN至糖肽上的末端甘露糖残基。在进一步的示例性实施方案中，从糖肽酶促去除N-和/或O-连接的聚糖结构，以暴露出氨基酸或末端糖基残基，其随后与经修饰的糖缀合。例如，用内切聚糖酶去除糖肽的N-连接结构，将末端GlcNAc暴露为糖肽上GlcNAc-连接的Asn。用UDP-Gal-
PEG和适当的半乳糖基转移酶将PEG-半乳糖官能性引入暴露的GlcNAc上。
PEG和适当的半乳糖基转移酶将PEG-半乳糖官能性引入暴露的GlcNAc上。
[0494] 在备选实施方案中，使用已知可转移糖残基至肽主链的糖基转移酶，直接将经修饰的糖加至G-CSF肽主链。图解3描述了此示例性实施方案。在实施本发明中有用的示例性
糖基转移酶包括但不限于GalNAc转移酶(GalNAc T1-4)、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、木糖基转移酶和甘露糖基转移酶等。用此方法可将经修饰的糖直接加至
不具有任一碳水化合物的肽上或者，备选地，加至已有糖肽上。在两种情况下，经修饰的糖的加入发生于如糖基转移酶的底物特异性确定的肽主链上的特异性位置，而不是以如化学
法修饰蛋白质肽主链时发生的随机方式加入。通过将适合的氨基酸序列工程化到多肽链
中，可将一系列试剂引入不具有糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中。
糖基转移酶包括但不限于GalNAc转移酶(GalNAc T1-4)、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、木糖基转移酶和甘露糖基转移酶等。用此方法可将经修饰的糖直接加至
不具有任一碳水化合物的肽上或者，备选地，加至已有糖肽上。在两种情况下，经修饰的糖的加入发生于如糖基转移酶的底物特异性确定的肽主链上的特异性位置，而不是以如化学
法修饰蛋白质肽主链时发生的随机方式加入。通过将适合的氨基酸序列工程化到多肽链
中，可将一系列试剂引入不具有糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中。
[0495] 图解3
[0496]
[0497] 在上述每一示例性实施方案中，经修饰的糖结合至肽后，可利用一个或多个附加的化学或酶修饰步骤。在示例性实施方案中，用酶(如岩藻糖基转移酶)将糖基单位(如岩藻糖)附加至连接G-CSF肽的末端经修饰的糖。在另一实例中，利用酶反应“封闭”经修饰的糖没有结合的位点。备选地，利用化学反应改变所结合的经修饰的糖的结构。例如，所结合的经修饰的糖与试剂反应反应，所述试剂稳定或去稳定化其与经修饰的糖所连接的肽成分之
间的连接。在另一实例中，在其结合至肽后，对经修饰的糖成分进行去保护。技术人员应理解，在经修饰的糖结合至G-CSF肽后的阶段，有一系列酶和化学操作可用于本发明的方法。
间的连接。在另一实例中，在其结合至肽后，对经修饰的糖成分进行去保护。技术人员应理解，在经修饰的糖结合至G-CSF肽后的阶段，有一系列酶和化学操作可用于本发明的方法。
[0498] 酶
[0499] 除上文在形成酰基连接缀合物的内容中讨论的酶外，可通过利用其他酶的方法对缀合物和起始底物(如肽、脂类)的糖基化模式进行加工、削减或修饰。2003年4月17日公开的DeFees的WO 03/031464A2中非常详细地讨论了用转移糖供体至受体的酶来重塑肽和脂
类结构的方法。下文简要概述了在本方法中所用的选定的酶。
类结构的方法。下文简要概述了在本方法中所用的选定的酶。
[0500] 糖基转移酶
[0501] 糖基转移酶催化活化糖(供体NDP-或NMP-糖)以逐步的方式加至蛋白质、糖肽、脂类或糖脂或生长中寡糖的非还原端。通过转移酶和脂类连接的寡糖供体Dol-PP-
NAG2Glc3Man9，在嵌段转移和随后的核心修剪中合成N-连接的糖肽。这种情况下，“核心”糖的性质与后续连接物略有不同。大量糖基转移酶为本领域公知。
NAG2Glc3Man9，在嵌段转移和随后的核心修剪中合成N-连接的糖肽。这种情况下，“核心”糖的性质与后续连接物略有不同。大量糖基转移酶为本领域公知。
[0502] 本发明中使用的糖基转移酶可以是任一种，只要其可将经修饰的糖用作糖供体。这种酶的实例包括Leloir途径糖基转移酶，如半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、木糖基转移酶、glucurononyltransferase等。
[0503] 对涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，糖基转移酶可克隆或分离自任一来源。已知许多已克隆的糖基转移酶及其核苷酸序列。见如“The WWWGuide To Cloned
Glycosyltransferases”(http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)。糖基转移酶氨基酸序列和编码糖基转移酶的核苷酸序列(可从其推断氨基酸序列)还见于公开可得的数据库，
包含GenBank、Swiss-Prot、EMBL等。
Glycosyltransferases”(http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)。糖基转移酶氨基酸序列和编码糖基转移酶的核苷酸序列(可从其推断氨基酸序列)还见于公开可得的数据库，
包含GenBank、Swiss-Prot、EMBL等。
[0504] 在本发明的方法中可用的糖基转移酶包括但不限于半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、葡糖苷酸基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖基转移酶。
适合的糖基转移酶包括从真核细胞及原核细胞获得的糖基转移酶。
适合的糖基转移酶包括从真核细胞及原核细胞获得的糖基转移酶。
[0505] 可通过化学合成、通过筛选源自适合细胞或细胞系培养物的mRNA的逆转录物、通过筛选源自适合细胞的基因组文库或通过这些方法的组合获得编码糖基转移酶的DNA。
mRNA或基因组DNA的筛选可用产生自糖基转移酶基因序列的寡核苷酸探针实现。按已知方
法用可检测基团(如荧光基团、放射性原子或化学发光基团)标记探针，并用于常规杂交分
析。备选地，可通过聚合酶链式反应(PCR)法获得糖基转移酶的基因序列，PCR寡核苷酸引物产生自糖基转移酶基因序列。见Mullis等人的美国专利号4,683,195和Mullis的美国专利
号4,683,202。
mRNA或基因组DNA的筛选可用产生自糖基转移酶基因序列的寡核苷酸探针实现。按已知方
法用可检测基团(如荧光基团、放射性原子或化学发光基团)标记探针，并用于常规杂交分
析。备选地，可通过聚合酶链式反应(PCR)法获得糖基转移酶的基因序列，PCR寡核苷酸引物产生自糖基转移酶基因序列。见Mullis等人的美国专利号4,683,195和Mullis的美国专利
号4,683,202。
[0506] 糖基转移酶可合成于用包含编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞。载体用来扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA
构建体，其中编码糖基转移酶的DNA可操作地连接至适当的调控序列，调控序列能实现糖基转移酶在适当宿主中的表达。对这种调控序列的需要将取决于所选宿主和所选转化方法而
不同。一般，调控序列包括转录启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达调控结构域。全
部所需的是在宿主中的复制的能力(通常由复制起点赋予)和便于识别转化子的选择基因。
构建体，其中编码糖基转移酶的DNA可操作地连接至适当的调控序列，调控序列能实现糖基转移酶在适当宿主中的表达。对这种调控序列的需要将取决于所选宿主和所选转化方法而
不同。一般，调控序列包括转录启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达调控结构域。全
部所需的是在宿主中的复制的能力(通常由复制起点赋予)和便于识别转化子的选择基因。
[0507] 在示例性实施方案中，本发明利用原核细胞的酶。这种糖基转移酶包括参与脂寡糖(LOS)合成的酶，脂寡糖为许多革兰氏阴性细菌所产生(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)：139-180(1996))。此类酶包括但不限于如大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等物种的rfa操纵子的蛋白质，其包括β1，6半乳糖基转移酶和β1，3半乳糖基转移酶(见如EMBL检索号M80599和M86935(大肠杆菌)；EMBL检索号S56361(鼠伤寒沙门氏菌))、葡糖基转移酶(Swiss-Prot检索号P25740(大肠杆菌))、β1，
2-葡糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot检索号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot检索号P19817
(鼠伤寒沙门氏菌))、β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶(rfaK)(EMBL检索号U00039(大肠杆
菌))。氨基酸序列已知的其他糖基转移酶包括如rfaB操纵子(已在一些物种中对其进行了
表征，如肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonellatyphimurium)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耶尔森氏菌
(Yersinia enterocolitica)和Mycobacterium leprosum)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa)rh1操纵子编码的糖基转移酶。
2-葡糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot检索号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot检索号P19817
(鼠伤寒沙门氏菌))、β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶(rfaK)(EMBL检索号U00039(大肠杆
菌))。氨基酸序列已知的其他糖基转移酶包括如rfaB操纵子(已在一些物种中对其进行了
表征，如肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonellatyphimurium)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耶尔森氏菌
(Yersinia enterocolitica)和Mycobacterium leprosum)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa)rh1操纵子编码的糖基转移酶。
[0508] 参与产生包含乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基-D-葡糖胺基-β-1，3-kD-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖、P 血型三糖序列、D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的结构的糖基转移酶也适用于本发明，已在粘膜病原体淋病奈瑟氏菌(Neisseria
gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的LOS中对其进行了鉴定(Scholten等
人，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。已从脑膜炎奈瑟氏菌免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟氏菌突变体F62(Gotshlich，
J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中鉴定出脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌中编码参与
这些结构生物合成的糖基转移酶的基因。在脑膜炎奈瑟氏菌中，由lgtA、lgtB和lgE三个基因组成的基因座编码将最后三个糖加入乳糖-N-新四糖链所需的糖基转移酶(Wakarchuk等
人，J.Biol.Chem.271：19166-73(1996))。最近表明了lgtB和lgtA基因产物的酶活性，为他们提出的糖基转移酶功能提供了第一个直接证据(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)：
28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏菌中还有另外两个基因：lgtD，其将β-D-GalNAc加至乳糖-N-新四糖结构末端半乳糖的3位；lgtC，其将末端α-D-Gal加至截短的LOS的乳糖成分，从而产生Pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)，supra.)。在脑膜炎奈瑟氏菌中，分离的免疫型L1也表达Pk血型抗原，已显示其具有lgtC基因(Jennings等人，(1995)，supra.)。美国专利号5,545,553(Gotschlich)中还描述了奈瑟氏菌属(Neisseria)糖基转移酶和相关基因。还
表征了幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶基因(Martin等人，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。空肠弯曲杆菌
(Campylobacter jejuni)的糖基转移酶在本发明中也有用(见如http://afmb.cnrs-
mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf 42.html)。
gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的LOS中对其进行了鉴定(Scholten等
人，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。已从脑膜炎奈瑟氏菌免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟氏菌突变体F62(Gotshlich，
J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中鉴定出脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌中编码参与
这些结构生物合成的糖基转移酶的基因。在脑膜炎奈瑟氏菌中，由lgtA、lgtB和lgE三个基因组成的基因座编码将最后三个糖加入乳糖-N-新四糖链所需的糖基转移酶(Wakarchuk等
人，J.Biol.Chem.271：19166-73(1996))。最近表明了lgtB和lgtA基因产物的酶活性，为他们提出的糖基转移酶功能提供了第一个直接证据(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)：
28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏菌中还有另外两个基因：lgtD，其将β-D-GalNAc加至乳糖-N-新四糖结构末端半乳糖的3位；lgtC，其将末端α-D-Gal加至截短的LOS的乳糖成分，从而产生Pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)，supra.)。在脑膜炎奈瑟氏菌中，分离的免疫型L1也表达Pk血型抗原，已显示其具有lgtC基因(Jennings等人，(1995)，supra.)。美国专利号5,545,553(Gotschlich)中还描述了奈瑟氏菌属(Neisseria)糖基转移酶和相关基因。还
表征了幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶基因(Martin等人，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。空肠弯曲杆菌
(Campylobacter jejuni)的糖基转移酶在本发明中也有用(见如http://afmb.cnrs-
mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf 42.html)。
[0509] 岩藻糖基转移酶
[0510] 在一些实施方案中，在本发明方法中使用的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶为本领域技术人员公知。示例性岩藻糖基转移酶包括从GDP-岩藻糖转移L-岩藻
糖至受体糖羟基位置的酶。转移非核苷酸糖至受体的岩藻糖基转移酶在本发明中也有用。
糖至受体糖羟基位置的酶。转移非核苷酸糖至受体的岩藻糖基转移酶在本发明中也有用。
[0511] 在一些实施方案中，受体糖是(例如)寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基团的GlcNAc。适合于此反应的岩藻糖基转移酶包括最先在人乳汁中表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)(见Palcic等人，Carbohydrate Res.190：1-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)；Nunez等人，Can.J.Chem.59：2086-2095(1981))和发现于人血清的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。还表征了唾液酸α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶(FTVII E.C.No.2.4.1.65)。还表征了重组形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(见Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1：425-428(1991)；Kukowska-Latallo等人，Genes andDevelopment 4：1288-1303(1990))。其他示例性岩藻糖基转移酶包括(例如)α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。可通过Mollicone等人，Eur.J.Biochem.191：169-176
(1990)或美国专利号5,374,655中所述的方法实现酶促岩藻糖基化。用来生产岩藻糖基转
移酶的细胞还包括合成GDP-岩藻糖的酶系统。
(1990)或美国专利号5,374,655中所述的方法实现酶促岩藻糖基化。用来生产岩藻糖基转
移酶的细胞还包括合成GDP-岩藻糖的酶系统。
[0512] 半乳糖基转移酶
[0513] 在另一组实施方案中，糖基转移酶为半乳糖基转移酶。示例性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，见如Dabkowski等人，Transplant Proc.25：
2921(1993)；Yamamoto等人，Nature 345：229-233(1990)；牛(GenBank j04989；Joziasse等人，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989))；鼠(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989))；猪(GenBank L36152；Strahan等人，
Immunogenetics 41：101-105(1995)))。另一种适合的α1，3半乳糖基转移酶是参与血型B抗原合成的α1，3半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人类))。另一个示例性半乳糖基转移酶是核心Gal-T1。
2921(1993)；Yamamoto等人，Nature 345：229-233(1990)；牛(GenBank j04989；Joziasse等人，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989))；鼠(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989))；猪(GenBank L36152；Strahan等人，
Immunogenetics 41：101-105(1995)))。另一种适合的α1，3半乳糖基转移酶是参与血型B抗原合成的α1，3半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人类))。另一个示例性半乳糖基转移酶是核心Gal-T1。
[0514] β(1，4)半乳糖基转移酶也适用于本发明的方法，所述酶包括(例如)EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183：
211-217(1989))，人类(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))，鼠(Nakazawa等人，J.Biochem.104：165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994))。其他适合的半乳糖基转移酶包括(例如)α1，2半乳糖基转移酶(来自如栗酒裂殖酵母
(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。
211-217(1989))，人类(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))，鼠(Nakazawa等人，J.Biochem.104：165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994))。其他适合的半乳糖基转移酶包括(例如)α1，2半乳糖基转移酶(来自如栗酒裂殖酵母
(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。
[0515] 唾液酸转移酶
[0516] 唾液酸转移酶是在本发明的重组细胞和反应混合物中有用的另一类糖基转移酶。产生重组唾液酸转移酶的细胞还产生GMP-唾液酸，GMP-唾液酸是唾液酸转移酶的唾液酸供
体。适用于本发明的唾液酸转移酶实例包含ST3Gal III(如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3GalII、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(本文所用唾液酸转移酶命名法如Tsuji等人，Glycobiology6：v-xiv(1996)所述)。示例性α(2，3)唾液酸转移酶指转移唾液酸至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal的α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)。见Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：
3159(1981)；Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982)；Wen等人，J.Biol.Chem.267：
21011(1992)。另一示例性α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)转移唾液酸至二糖或糖苷非还原的末端Gal。见Rearick等人，J.Biol.Chem.254：4444(1979)；Gillespie等人，
J.Biol.Chem.267：21004(1992)。其他示例性酶包含Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(见Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
体。适用于本发明的唾液酸转移酶实例包含ST3Gal III(如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3GalII、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(本文所用唾液酸转移酶命名法如Tsuji等人，Glycobiology6：v-xiv(1996)所述)。示例性α(2，3)唾液酸转移酶指转移唾液酸至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal的α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)。见Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：
3159(1981)；Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982)；Wen等人，J.Biol.Chem.267：
21011(1992)。另一示例性α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)转移唾液酸至二糖或糖苷非还原的末端Gal。见Rearick等人，J.Biol.Chem.254：4444(1979)；Gillespie等人，
J.Biol.Chem.267：21004(1992)。其他示例性酶包含Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(见Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
[0517] 优选地，对糖肽碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶能转移唾液酸至序列Galβ1，4GlcNAc-，该序列是完全唾液酸化的碳水化合物结构上末端唾液酸之下的最常见的倒数第
二位序列(见表2)。
二位序列(见表2)。
[0518] 表2：用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾液酸转移酶。
[0519] 唾液酸转移酶 来源 所形成的序列 参考文献
ST6Gal I 哺乳动物 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNAc- 1
ST3Gal III 哺乳动物 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 1
NeuAc 2，3Galβ1，3GlCNAc-
ST3Gal IV 哺乳动物 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 1
NeuAc 2，3Galβ1，3GlCNAc-
ST6Gal II 哺乳动物 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNA
ST6Gal II 发光细菌 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNAc- 2
ST3Gal V 脑膜炎奈瑟氏菌 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 3
淋病奈瑟氏菌
ST6Gal I 哺乳动物 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNAc- 1
ST3Gal III 哺乳动物 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 1
NeuAc 2，3Galβ1，3GlCNAc-
ST3Gal IV 哺乳动物 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 1
NeuAc 2，3Galβ1，3GlCNAc-
ST6Gal II 哺乳动物 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNA
ST6Gal II 发光细菌 NeuAc 2，6Galβ1，4GlCNAc- 2
ST3Gal V 脑膜炎奈瑟氏菌 NeuAc 2，3Galβ1，4GlCNAc- 3
淋病奈瑟氏菌
[0520] 1)Goochee等人，Bio/Technology9：1347-1355(1991)
[0521] 2)Yamamoto等人，J.Biochem.120：104-110(1996)
[0522] 3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.271：28271-28276(1996)
[0523] 在所述方法中有用的唾液酸转移酶的实例是ST3Gal III，也将其称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。该酶催化唾液酸转移至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal(见如Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：3159(1991))，并负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。唾液酸连接至Gal，在两个糖间形成α-连接。糖间的结合(连接)位于NeuAc的2位和Gal的3位之间。这一特定的酶可从大鼠肝脏中分离(Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982))；现已知人类cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa和Paulson
(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271：
931-938)DNA序列，便于通过重组表达生产这种酶。在一个实施方案中，所述唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271：
931-938)DNA序列，便于通过重组表达生产这种酶。在一个实施方案中，所述唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
[0524] 在本发明中有用的其他示例性唾液酸转移酶包括从空肠弯曲杆菌中分离的唾液酸转移酶，其包括CST-I、CST-II和形成α(2，3)连接的唾液酸转移酶。见如WO99/49051。
[0525] 表2所列之外的唾液酸转移酶也可用于在商业上重要的糖肽的经济且高效的大规模唾液酸化方法。作为发现这些其他酶功用的简单测试，用不同量的每一种酶(1-100mU/mg蛋白质)与无唾液酸基-α1 AGP(1-10mg/ml)反应，以比较目的唾液酸转移酶和牛ST6Gal I、ST3Gal III或这两种唾液酸转移酶唾液酸化糖肽的能力。备选地，其他糖肽或糖肽，或从肽主链酶促释放的N-连接寡糖可用来取代无唾液酸基的-α1AGP用于此评估。具有比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-连接寡糖能力的唾液酸转移酶可用于肽唾液酸化的实际的大
规模方法中。
规模方法中。
[0526] GalNAc转移酶
[0527] N-乙酰半乳糖胺基转移酶在实施本发明中有用，尤其是对将GalNAc部分结合至肽的O-连接糖基化位点的氨基酸。适合的N-乙酰半乳糖胺基转移酶包括但不限于α(1，3)N-乙酰半乳糖胺基转移酶、β(1，4)N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.267：
12082-12089(1992)；Smith等人，J.Biol Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。
12082-12089(1992)；Smith等人，J.Biol Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。
[0528] 通过遗传工程从克隆的基因生产如GalN Ac TI-XX酶的蛋白质众所周知。见如美国专利号4,761,371。一种方法涉及收集足够样品，然后通过N端测序测定酶的氨基酸序列。然后用这一信息来分离编码全长(膜结合)转移酶的cDNA克隆，所述酶在昆虫细胞系Sf9中表
达时导致具有完全活性的酶的合成。然后通过对16种不同蛋白质中的已知糖基化位点附近
氨基酸的半定量分析，测定酶的受体特异性，随后进行合成肽的体外糖基化研究。这项工作表明，某些氨基酸在糖基化肽片段中被过多出现，并且糖基化丝氨酸和苏氨酸残基周围特
定位置中的残基可以比其他氨基酸部分对受体效率具有更显著的影响。
达时导致具有完全活性的酶的合成。然后通过对16种不同蛋白质中的已知糖基化位点附近
氨基酸的半定量分析，测定酶的受体特异性，随后进行合成肽的体外糖基化研究。这项工作表明，某些氨基酸在糖基化肽片段中被过多出现，并且糖基化丝氨酸和苏氨酸残基周围特
定位置中的残基可以比其他氨基酸部分对受体效率具有更显著的影响。
[0529] 细胞结合的糖基转移酶
[0530] 在另一个实施方案中，本发明方法使用的酶是细胞结合的糖基转移酶。虽然已知许多可溶性的糖基转移酶(见如美国专利号5,032,519)，但当与细胞结合时，糖基转移酶一般是膜结合的形式。迄今研究过的许多膜结合的酶被认为是内在性蛋白质，即它们不能通
过超声处理从膜释放，需用去污剂来溶解。已在脊椎动物和无脊椎动物细胞表面鉴定出表
面糖基转移酶，公认这些表面转移酶在生理条件下保持其催化活性。但是，细胞表面糖基转移酶更为公认的功能是用于细胞间识别(Roth，Molecular Approaches toSupracellular
Phenomena，1990)。
过超声处理从膜释放，需用去污剂来溶解。已在脊椎动物和无脊椎动物细胞表面鉴定出表
面糖基转移酶，公认这些表面转移酶在生理条件下保持其催化活性。但是，细胞表面糖基转移酶更为公认的功能是用于细胞间识别(Roth，Molecular Approaches toSupracellular
Phenomena，1990)。
[0531] 已开发了改变细胞表达的糖基转移酶的方法。例如，在Larsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989)中，报道了分离克隆的cDNA序列的遗传学
方法，所述序列决定细胞表面寡糖结构及其相关的糖基转移酶的表达。用产生自mRNA的
cDNA文库转染COS-1细胞，所述mRNA从已知其表达UDP-半乳糖：.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠细胞系分离。然后培养转染的细胞，测定1-
3半乳糖基转移酶活性。
方法，所述序列决定细胞表面寡糖结构及其相关的糖基转移酶的表达。用产生自mRNA的
cDNA文库转染COS-1细胞，所述mRNA从已知其表达UDP-半乳糖：.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠细胞系分离。然后培养转染的细胞，测定1-
3半乳糖基转移酶活性。
[0532] Francisco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992)公开了将β-内酰胺酶锚定至大肠杆菌外表面的方法。产生由(i)外膜蛋白质的信号序列、(ii)外膜蛋白质的跨膜区段和(iii)完整的成熟β-内酰胺酶序列组成的三部分融合物，形成有活性的膜结合β-内酰胺酶分子。但是，Francisco的方法仅限于原核细胞系统，如作者所承认，该方法需要完整的三部分融合以正确发挥功能。
[0533] 磺基转移酶
[0534] 本发明还提供生产包含硫酸化分子的肽的方法，硫酸化分子包括(例如)硫酸化多糖，如肝素、硫酸乙酰肝素、carragenen和相关化合物。适合的磺基转移酶包括(例如)软骨素-6-磺基转移酶(Fukuta等人，J.Biol.Chem.270：18575-18580(1995)所述鸡cDNA；
GenBank检索号D49915)、糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Dixon等人，
Genomics 26：239-241(1995)；UL18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶2(Orellana等人，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等人，
J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)所述鼠cDNA；GenBank检索号U2304所述人cDNA)。
GenBank检索号D49915)、糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Dixon等人，
Genomics 26：239-241(1995)；UL18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶2(Orellana等人，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等人，
J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)所述鼠cDNA；GenBank检索号U2304所述人cDNA)。
[0535] 糖苷酶
[0536] 本发明还包含野生型和突变体糖苷酶的用途。已表明突变体β-半乳糖苷酶通过将α-糖基氟化物偶联至半乳糖基受体分子催化二糖的形成(2001年9月4日公布的Withers的
美国专利号6,284,494)。在本发明中有用的其他糖苷酶包括(例如)β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰葡糖胺糖苷酶、β-N-乙酰半乳糖胺酶、β-木糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰葡糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖胺糖苷酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和神经氨酸酶/唾液酸酶。
美国专利号6,284,494)。在本发明中有用的其他糖苷酶包括(例如)β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰葡糖胺糖苷酶、β-N-乙酰半乳糖胺酶、β-木糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰葡糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖胺糖苷酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和神经氨酸酶/唾液酸酶。
[0537] 固定化酶
[0538] 本发明还提供固定在固相和/或可溶性支持体上的酶的用途。在示例性实施方案中，提供了通过本发明的完整的糖基连接体结合至PEG的糖基转移酶。PEG-连接体-酶缀合
物任选地连接至固相支持体。本发明方法中固定化酶的使用简化了反应混合物的建立和反
应产物的纯化，还可容易地回收酶。本发明的方法中使用糖基转移酶缀合物。酶和载体的其他组合为本领域技术人员公知。
物任选地连接至固相支持体。本发明方法中固定化酶的使用简化了反应混合物的建立和反
应产物的纯化，还可容易地回收酶。本发明的方法中使用糖基转移酶缀合物。酶和载体的其他组合为本领域技术人员公知。
[0539] 融合蛋白质
[0540] 在其他示例性实施方案中，本发明的方法使用融合蛋白质，其具有一种以上酶活性参与希望的糖肽缀合物的合成。融合多肽可由(例如)糖基转移酶的催化活性结构域组
成，所述酶连接附属酶的催化活性结构域组成。附属酶催化结构域可(例如)催化糖基转移
酶的供体——核苷酸糖形成中的一个步骤，或催化涉及糖基转移酶循环的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可符合读框地连接至编码参与核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。得到
的融合蛋白质不仅可催化核苷酸糖的合成，还可催化糖部分向受体分子的转移。融合蛋白
质可以是连接可表达核苷酸序列的两种或多种循环酶。在其他实施方案中，融合蛋白质包
括两种或多种糖基转移酶的催化活性结构域。见如5,641,668。利用多种适合的融合蛋白
质，可容易地设计和制造本发明的经修饰的糖肽(见如PCT专利申请PCT/CA98/01180，其于
1999年6月24日公布为WO 99/31224)。
成，所述酶连接附属酶的催化活性结构域组成。附属酶催化结构域可(例如)催化糖基转移
酶的供体——核苷酸糖形成中的一个步骤，或催化涉及糖基转移酶循环的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可符合读框地连接至编码参与核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。得到
的融合蛋白质不仅可催化核苷酸糖的合成，还可催化糖部分向受体分子的转移。融合蛋白
质可以是连接可表达核苷酸序列的两种或多种循环酶。在其他实施方案中，融合蛋白质包
括两种或多种糖基转移酶的催化活性结构域。见如5,641,668。利用多种适合的融合蛋白
质，可容易地设计和制造本发明的经修饰的糖肽(见如PCT专利申请PCT/CA98/01180，其于
1999年6月24日公布为WO 99/31224)。
[0541] 经修饰的糖的制备
[0542] 本发明的方法一般使用经修饰的糖。一方面，糖部分或糖部分-连接体盒和PEG或PEG-连接体盒基团通过反应性基团的使用连接在一起，反应性基团通常被连接方法转化成
新的有机官能团或非反应性种类。糖反应性官能团位于糖部分的任一位置。在实施本发明
中有用的反应性基团和反应种类一般是生物缀合物化学领域公知的。目前可用于反应性糖
部分的有利的反应种类是在相对温和的条件下进行的反应。其包括但不限于亲核取代(如
胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(如烯胺反应)和碳-碳及碳-杂原子重键的加成
(如迈克尔加成反应，第尔斯-阿尔德加成)。这些和其他有用的反应讨论于(例如)：March，Advanced Organic Chemistry，第三版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego，1996；Feeney等人，
Modificationof Proteins；Advances in Chemistry Series，卷198，American
ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982。
新的有机官能团或非反应性种类。糖反应性官能团位于糖部分的任一位置。在实施本发明
中有用的反应性基团和反应种类一般是生物缀合物化学领域公知的。目前可用于反应性糖
部分的有利的反应种类是在相对温和的条件下进行的反应。其包括但不限于亲核取代(如
胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(如烯胺反应)和碳-碳及碳-杂原子重键的加成
(如迈克尔加成反应，第尔斯-阿尔德加成)。这些和其他有用的反应讨论于(例如)：March，Advanced Organic Chemistry，第三版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego，1996；Feeney等人，
Modificationof Proteins；Advances in Chemistry Series，卷198，American
ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982。
[0543] 从糖核或修饰基团伸出的有用的反应性官能团包括但不限于：
[0544] (a)羧基及其各种衍生物，其包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基酯、烯基酯、炔基酯和芳族酯；
[0545] (b)羟基，其可转化为如酯、醚、醛等；
[0546] (c)卤烷基，其中卤素随后可被亲核基团(如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子)取代，从而导致在卤素原子官能团处新基团的共价连接；
[0548] (e)醛基或酮基，使得可以通过羰基衍生物的形成(如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)，或通过如格氏加成或烷基锂加成的机制衍生化；
[0549] (f)磺酰卤基团，其随后与胺反应(例如)形成氨磺酰；
[0550] (g)硫醇基，其可转化为(例如)二硫化物或与酰卤反应；
[0551] (h)胺或巯基，其可例如酰基化、烷基化或氧化；
[0552] (i)烯烃，其可进行(例如)环化加成、酰化、迈克尔加成等；
[0553] (j)环氧化物，其可与(例如)胺和羟基化合物反应。
[0554] 这样选择反应性官能团，使其不参加或干扰组装反应性糖核或修饰基团所必需的反应。备选地，通过保护基团的存在，可保护反应性官能团不参与反应。本领域技术人员了解如何保护特定官能团，使其不干扰所选择的一组反应条件。有用的保护基团的实例见如
Greene等人，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，
1991。
Greene等人，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，
1991。
[0555] 在下文的讨论中，给出了在实施本发明中有用的经修饰的糖的许多特定实例。在示例性实施方案中，将唾液酸衍生物用作连接修饰基团的糖核。关于唾液酸衍生物的讨论
的中心仅是为了说明的明晰性，不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员应理解，可以类似于以唾液酸为例所述的方式活化和衍生许多其他糖部分。例如，许多方法可用来修
饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖等以产生一些糖底物，所述糖底物易于通过本领域公知的方法修饰。见如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6：93(1999)；Schafer等人，
J.Org.Chem.65：24(2000)。
的中心仅是为了说明的明晰性，不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员应理解，可以类似于以唾液酸为例所述的方式活化和衍生许多其他糖部分。例如，许多方法可用来修
饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖等以产生一些糖底物，所述糖底物易于通过本领域公知的方法修饰。见如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6：93(1999)；Schafer等人，
J.Org.Chem.65：24(2000)。
[0556] 在示例性实施方案中，经本发明方法修饰的G-CSF肽是在哺乳动物细胞(如CHO细胞)或转基因动物中产生的糖肽，并从而包含不完全唾液酸化的N-和/或O-连接的寡糖链。
不具有唾液酸并且包含末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可被聚乙二醇化、聚丙二醇化或用
经修饰的唾液酸修饰。
不具有唾液酸并且包含末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可被聚乙二醇化、聚丙二醇化或用
经修饰的唾液酸修饰。
[0557] 在图解4中，用受保护的氨基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯处理氨基糖苷1，将糖胺残基转化为对应的受保护的氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理加合物，形成α-羟基羧化物2。化合物2通过CMP-SA合成酶的作用转化为对应的CMP衍生物，然后催化加氢CMP衍生物
生成化合物3。通过化合物3与活化的PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-对-硝
基苯基)反应，将通过甘氨酸加合物的形成引入的胺用作PEG连接的部位，分别生成如4或5
的种类。
生成化合物3。通过化合物3与活化的PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-对-硝
基苯基)反应，将通过甘氨酸加合物的形成引入的胺用作PEG连接的部位，分别生成如4或5
的种类。
[0558] 图解4
[0559]
[0560] 表3给出了用PEG部分衍生的糖单磷酸的代表性实例。表3中的某些化合物通过图解4的方法制备。其他衍生物通过本领域公知的方法制备。见如Keppler等人，Glycobiology
11：11R(2001)；Charter等人，Glycobiology10：1049(2000)。其他胺反应性PEG和PPG类似物可从商业渠道获得，或其可通过本领域技术人员易于获得的方法制备。
11：11R(2001)；Charter等人，Glycobiology10：1049(2000)。其他胺反应性PEG和PPG类似物可从商业渠道获得，或其可通过本领域技术人员易于获得的方法制备。
[0561] 表3
[0562]
[0563] 除上述位置外，可在其他位置取代在实施本发明中有用的经修饰的糖磷酸。目前优选的唾液酸取代如以下通式所示：
[0564]
[0565] 其中X为连接基团，其优选选自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和N(R)2，其中每一个R为独立地选自R1-R5的成员。符号Y、Z、A和B各代表选自与上面对X的身份给出的基团的基团。X、Y、Z、1 2 3 4 5
A和B各自独立地选择，因此，它们可以相同或不同。符号R 、R、R 、R 和R代表H、PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分。备选地，这些符号代表结合PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分的连接体。
A和B各自独立地选择，因此，它们可以相同或不同。符号R 、R、R 、R 和R代表H、PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分。备选地，这些符号代表结合PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分的连接体。
[0566] 连接至本文所公开的缀合物的示例性部分包括但不限于PEG衍生物(如酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG、氨甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(如酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG、氨甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗部分、诊断部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、类肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基Lewis X、FGF、VFGF、蛋白质、软骨素、角质素、皮肤素、白蛋白、整联蛋白、触角寡糖、肽等。将各种修饰基团结合至糖部分的方法为本领域技术人员易于获得的方法(Poly(Ethylene Glycol Chemistry：Biotechnical
and BiomedicalApplications，J.Milton Harris编辑，Plenum Pub.Corp.，1992；Poly
(Ethylene Glycol)Chemical and Biological Applications，J.Milton Harris编辑，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；Dunn等人编辑，Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACSSymposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
and BiomedicalApplications，J.Milton Harris编辑，Plenum Pub.Corp.，1992；Poly
(Ethylene Glycol)Chemical and Biological Applications，J.Milton Harris编辑，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；Dunn等人编辑，Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACSSymposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
[0567] 连接体基团(交联基团)
[0568] 本发明方法中所用经修饰的糖的制备包括将PEG部分连接至糖残基和优选形成稳定加合物，其是糖基转移酶的底物。因此，常优选使用连接体，如通过PEG和糖部分与缀合PEG和糖的交联试剂反应形成的连接体。可用来将修饰基团连接至碳水化合物部分的示例
性双功能化合物包括但不限于双功能聚乙二醇、聚酰胺、聚醚、聚酯等。连接碳水化合物至其他分子的一般方法是文献中已知的。见如Lee等人，Biochemistry 28：1856(1989)；
Bhatia等人，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)；
Bednarski等人，WO 92/18135。在下文的讨论中，将反应性基团处理为对新生经修饰的糖的糖部分无危害。讨论的中心是为了说明的明晰性。本领域技术人员应理解，此讨论也与修饰基团上的反应性基团有关。
性双功能化合物包括但不限于双功能聚乙二醇、聚酰胺、聚醚、聚酯等。连接碳水化合物至其他分子的一般方法是文献中已知的。见如Lee等人，Biochemistry 28：1856(1989)；
Bhatia等人，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)；
Bednarski等人，WO 92/18135。在下文的讨论中，将反应性基团处理为对新生经修饰的糖的糖部分无危害。讨论的中心是为了说明的明晰性。本领域技术人员应理解，此讨论也与修饰基团上的反应性基团有关。
[0569] 多种试剂可用来修饰具有分子内化学交联的经修饰的糖的成分(交联试剂综述和交联方法综述见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，In：Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts编辑)395页-442页，Wiley，New York，
1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17：167-
183，1993，所述所有文献在此引用作为参考)。优选的交联试剂衍生自多种零长度、同双功能和杂双功能交联试剂。零长度交联试剂包括两个内在化学基团的直接缀合，不引入外在
物质。催化二硫键形成的试剂属于这一类别。另一实例是诱导羧基和伯氨基缩合形成酰胺
键的试剂(如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸盐)和羰基二咪唑)。除这些化学试剂外，可将转谷氨酰胺酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨酰基转移酶；
EC 2.3.2.13)用作零长度交联试剂。此酶在蛋白质结合的谷氨酰基残基的氨甲酰基处催化
酰基转移，通常以伯氨基为底物。优选的同双功能和杂双功能试剂分别包含两个相同的或
两个不同的位点，这些位点对氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团有反应性。
1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17：167-
183，1993，所述所有文献在此引用作为参考)。优选的交联试剂衍生自多种零长度、同双功能和杂双功能交联试剂。零长度交联试剂包括两个内在化学基团的直接缀合，不引入外在
物质。催化二硫键形成的试剂属于这一类别。另一实例是诱导羧基和伯氨基缩合形成酰胺
键的试剂(如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸盐)和羰基二咪唑)。除这些化学试剂外，可将转谷氨酰胺酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨酰基转移酶；
EC 2.3.2.13)用作零长度交联试剂。此酶在蛋白质结合的谷氨酰基残基的氨甲酰基处催化
酰基转移，通常以伯氨基为底物。优选的同双功能和杂双功能试剂分别包含两个相同的或
两个不同的位点，这些位点对氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团有反应性。
[0570] 重折叠不溶性G-CSF
[0571] 在细菌中表达的许多重组蛋白质表达为细菌包含体内不可溶的团聚体。包含体是见于细菌胞质和周质空间的蛋白质沉积物。(见如Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207
(2001))。重组G-CSF蛋白表达于细菌包含体，本文给出了重折叠这些蛋白质，生成活性G-
CSF蛋白质的方法。
(2001))。重组G-CSF蛋白表达于细菌包含体，本文给出了重折叠这些蛋白质，生成活性G-
CSF蛋白质的方法。
[0572] 重折叠活性G-CSF的条件
[0573] 为从细菌细胞中生产活性G-CSF蛋白质，将G-CSF蛋白质以细菌包含体表达，收集并破碎细菌，分离包含体并清洗。在一个实施方案中，进行了3次清洗：在pH 6.0-9.0的缓冲液(单价盐，如氯化钠；非离子型去污剂，如Triton X-100；离子型去污剂，如脱氧胆酸纳；和EDTA)中的第一次清洗。在无去污剂的缓冲液中的第二次清洗和在水中的第三次清洗。然后对包含体内的蛋白质进行溶解。可通过变性剂盐酸胍或尿素、极端pH或去污剂或这些的任
一组合进行溶解。在一个实施方案中，用5-6M的盐酸胍或尿素溶解GCSF。在另一实施方案
中，加入了DTT。
一组合进行溶解。在一个实施方案中，用5-6M的盐酸胍或尿素溶解GCSF。在另一实施方案
中，加入了DTT。
[0574] 溶解后，从GCSF蛋白质混合物中去除变性剂。可通过多种方法去除变性剂，包括稀释至重折叠缓冲液或缓冲液交换方法。缓冲液交换方法包括透析、渗滤、凝胶过滤和将蛋白质固定至固相支持体。(见如Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。可联用上述任一方法去除变性剂。
[0575] 通过加入包含氧化还原对的重折叠缓冲液促进GCSF蛋白质中二硫键的形成。氧化还原对包括还原型和氧化型谷胱甘肽(-JSF-I/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、
DTT/GSSG和DTE/GSSG。(见如Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。在一个实施方案中，氧化还原对是比例为10∶1的GSH/GSSG。
DTT/GSSG和DTE/GSSG。(见如Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。在一个实施方案中，氧化还原对是比例为10∶1的GSH/GSSG。
[0576] 重折叠可在pH(例如)6.0-10.0的缓冲液中进行。重折叠缓冲液可包含其他添加剂来增强重折叠，例如L-精氨酸(0.4-1M)、PEG、低浓度变性剂(如1-2M的尿素和0.5-1.5M的盐酸胍)和去污剂(如Chaps、SDS、CTAB、十二烷基麦芽苷、吐温-80和Triton X-100)。
[0577] 重折叠后，可透析GCSF蛋白质，去除氧化还原对或其他不需要的缓冲液成分。在一个实施方案中，用含有乙酸钠、甘油和非离子型去污剂(如吐温-80)的缓冲液进行透析。透析后，可进一步纯化GCSF蛋白质和/或通过离子交换层析浓缩。在一个实施方案中，使用了SP-琼脂糖阳离子交换树脂。
[0578] 技术人员公知当重折叠的蛋白质具有可检测到的生物活性时，蛋白质已正确地重折叠。对GCSF蛋白质，可通过多种方法测定生物活性。例如，生物活性GCSF蛋白质是描述于
2004年1月8日提交的美国专利申请60/535284、2004年2月12日提交的60/544411和2004年2
月20日提交的律师卷号019957-018820US(其为了所有目的在此引用作为参考)中的O-连接
的糖基化的底物。GCSF蛋白质的活性还可通过大鼠中的细胞增殖测定或白细胞(WBC)测定
来测量。(也描述于2004年1月8日提交的美国专利申请60/535284、2004年2月12日提交的
60/544411和2004年2月20日提交的律师卷号019957-018820US，其为了所有目的在此引用
作为参考。)增殖测定和WBC测定可在重折叠的GCSF蛋白质的O-连接糖基化之前或之后进
行。
2004年1月8日提交的美国专利申请60/535284、2004年2月12日提交的60/544411和2004年2
月20日提交的律师卷号019957-018820US(其为了所有目的在此引用作为参考)中的O-连接
的糖基化的底物。GCSF蛋白质的活性还可通过大鼠中的细胞增殖测定或白细胞(WBC)测定
来测量。(也描述于2004年1月8日提交的美国专利申请60/535284、2004年2月12日提交的
60/544411和2004年2月20日提交的律师卷号019957-018820US，其为了所有目的在此引用
作为参考。)增殖测定和WBC测定可在重折叠的GCSF蛋白质的O-连接糖基化之前或之后进
行。
[0579] 分离本发明的缀合物的方法
[0580] 备选地，通过上述方法生产的产物可不经纯化即使用。但是，通常优选回收产物。可用众所周知的标准技术进行糖基化糖的回收，如薄层或厚层层析、柱层析、离子交换层析或膜过滤。如下文和本文中引用的文献所讨论，优选使用膜过滤(更优选使用反渗透膜)或
一种或多种柱层析技术进行回收。例如，可用其中膜具有约3000-约10,000的分子量截断的膜过滤来去除蛋白质，如糖基转移酶。然后可用纳米过滤或反渗透去除盐和/或纯化产物糖(见如WO 98/15581)。纳米滤膜是一种反渗透膜，其可滤过单价盐，但是截留大于约100-约
2,000道尔顿的多价盐和不带电荷的溶质，这取决于所用的膜。因此，在典型应用中，通过本发明的方法制备的糖将被截留在膜中，而杂质盐将穿过。
一种或多种柱层析技术进行回收。例如，可用其中膜具有约3000-约10,000的分子量截断的膜过滤来去除蛋白质，如糖基转移酶。然后可用纳米过滤或反渗透去除盐和/或纯化产物糖(见如WO 98/15581)。纳米滤膜是一种反渗透膜，其可滤过单价盐，但是截留大于约100-约
2,000道尔顿的多价盐和不带电荷的溶质，这取决于所用的膜。因此，在典型应用中，通过本发明的方法制备的糖将被截留在膜中，而杂质盐将穿过。
[0581] 若经修饰的糖蛋白是在细胞内产生的，则第一步，通过(例如)离心或超滤去除微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)；任选地，可用市售蛋白质浓缩滤器浓缩蛋白质，然后通过一个或多个选自下列方法的步骤将多肽变体从其他杂质中分离出来：免疫亲和层析；离子交
换柱分级分离(如在二乙基氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基质上)；Blue-
Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-Sepharose、WGA-
Sepharose、Con A-Sepharose、Ether Toyopearl、butyl Toyopearl、phenyl Toyopearl或A蛋白-Sepharose层析；SDS-PAGE层析；硅胶层析；层析聚焦；反相HPLC(如附带脂肪族基团的硅胶)；使用(例如)Sephadex分子筛的凝胶过滤或大小排阻层析；选择性结合多肽的柱层
析；乙醇或硫酸铵沉淀。
换柱分级分离(如在二乙基氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基质上)；Blue-
Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-Sepharose、WGA-
Sepharose、Con A-Sepharose、Ether Toyopearl、butyl Toyopearl、phenyl Toyopearl或A蛋白-Sepharose层析；SDS-PAGE层析；硅胶层析；层析聚焦；反相HPLC(如附带脂肪族基团的硅胶)；使用(例如)Sephadex分子筛的凝胶过滤或大小排阻层析；选择性结合多肽的柱层
析；乙醇或硫酸铵沉淀。
[0582] 通常通过以下方法分离在培养物中产生的经修饰的糖肽：先从细胞、酶等中提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水相离子交换或大小排阻层析步骤。此外，可以通过亲和层析纯化经修饰的糖蛋白。最后，可以用HPLC进行最后的纯化步骤。
[0583] 上述任一步骤中可以包含蛋白酶抑制剂(如甲基磺酰氟化物(PMSF))来抑制蛋白质水解作用，可以包含抗生素以防止偶发的污染物的生长。
[0584] 在另一实施方案中，先用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)对来自生产本发明经修饰的糖肽的系统的上清进行浓缩。浓缩步骤之
后，可将浓缩物加至适合的纯化基质。例如，适合的亲和基质可以包含肽的配体、结合至适合支持体的凝集素或抗体分子。备选地，可以使用阴离子交换树脂，例如具有侧翼DEAE基团的基质或底物。适合的基质包含丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其他在蛋白质纯化中常用的类型。备选地，可以使用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包含多种含有磺丙基或羧甲基的不可溶基质。尤其优选磺丙基。
后，可将浓缩物加至适合的纯化基质。例如，适合的亲和基质可以包含肽的配体、结合至适合支持体的凝集素或抗体分子。备选地，可以使用阴离子交换树脂，例如具有侧翼DEAE基团的基质或底物。适合的基质包含丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其他在蛋白质纯化中常用的类型。备选地，可以使用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包含多种含有磺丙基或羧甲基的不可溶基质。尤其优选磺丙基。
[0585] 最后，可以使用一个或多个使用疏水RP-HPLC介质(如具有侧翼甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的RP-HPLC步骤进一步纯化多肽变体组合物。可以使用前述的纯化步骤的一些
或全部的各种组合，以提供同质的经修饰的糖蛋白。
或全部的各种组合，以提供同质的经修饰的糖蛋白。
[0586] 可以通过类似于Urdal等人，J.Chromatog.296：171(1984)中所公开的方法，纯化产生自大规模发酵的本发明的经修饰的糖肽。这篇参考文献描述了在制备性HPLC柱上纯化
重组人IL-2的两个连续的RP-HPLC步骤。备选地，可以用如亲和层析的技术来纯化经修饰的糖蛋白。
重组人IL-2的两个连续的RP-HPLC步骤。备选地，可以用如亲和层析的技术来纯化经修饰的糖蛋白。
[0587] 药物组合物
[0588] 另一方面，本发明提供药物组合物。药物组合物包含药学上可接受的稀释剂和非天然存在的PEG部分、治疗部分或生物分子与糖基化或非糖基化肽间的共价缀合物。聚合
物、治疗部分或生物分子通过完整的糖基连接基团结合至G-CSF肽，所述糖基连接基团插入G-CSF肽和聚合物、治疗部分或生物分子之间，并与二者共价连接。
物、治疗部分或生物分子通过完整的糖基连接基团结合至G-CSF肽，所述糖基连接基团插入G-CSF肽和聚合物、治疗部分或生物分子之间，并与二者共价连接。
[0589] 本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。适用于本发明的制剂见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)。药物递送方法的简要综述见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。
[0590] 药物组合物可配制用于任一种适合的给药方式，包含(例如)局部、口腔、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对肠胃外给药(如皮下注射)，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对口服给药，可使用上述任一载体或固相支持体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可用生物可降解的微球体(如聚乳酸、聚甘醇酸)作为本发明的药物组合物的载体。适合的生物可降解的微球体公开于(例如)美国专利号4,897,268和5,075,109。
[0591] 通常，药物组合物经肠胃外施用，如静脉内。因此，本发明提供肠胃外给药的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受载体(优选含水载体，如水、缓冲液、盐水、PBS等)的化合物。组合物可以包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力
调节剂、湿润剂、去污剂等。
调节剂、湿润剂、去污剂等。
[0592] 这些组合物可以经常规灭菌技术灭菌或过滤除菌。获得的水溶液以水溶液形式包装使用，或经冻干，在给药前将冻干制剂与无菌的水性载体混合。制剂的pH值一般在3-11之间，更优选在5-9之间，最优选在7-8之间。
[0593] 在一些实施方案中，本发明的糖肽可掺入形成自标准囊形成脂类的脂质体内。可获得制备脂质体的多种方法，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)、美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述。用多种靶向试剂(如本发明的唾液酸基
半乳糖苷)进行脂质体的靶向为本领域公知(见如美国专利号4,957,773和4,603,044)。
半乳糖苷)进行脂质体的靶向为本领域公知(见如美国专利号4,957,773和4,603,044)。
[0594] 可使用将靶向试剂偶联至脂质体的标准方法。这些方法一般涉及脂类成分如磷酯酰乙醇胺掺入脂质体，所述脂类成分活化后可连接靶向试剂或衍生的亲脂化合物，如本发
明中的脂类衍生的糖肽。
明中的脂类衍生的糖肽。
[0595] 靶向机制一般需将靶向试剂置于脂质体表面，通过这样的方式使得靶部分可与靶点(如细胞表面受体)相互作用。在脂质体形成前，可以通过本领域技术人员公知的方法(如分别用长链烷基卤或脂肪酸将碳水化合物上存在的羟基烷化或酰化)，将本发明的碳水化
合物连接至脂类分子。备选地，可以以在形成膜时先将连接体部分掺入膜内的方式制备脂
质体。连接体部分必须具有亲脂部分，其可稳固植入和锚定在膜内。连接体部分还必须具有反应性部分，其可在脂质体水相表面发生化学反应。选择反应性部分，使其适合通过化学反应与后来加入的靶向试剂或碳水化合物形成稳定化学键。一些情况下，可能直接将靶向试
剂连接至连接体分子，但大多数情况下，更适于使用第三个分子作为化学桥，从而将膜内的连接体分子连接至靶向试剂或碳水化合物，所述靶向试剂或碳水化合物在三维上伸出囊表
面。
合物连接至脂类分子。备选地，可以以在形成膜时先将连接体部分掺入膜内的方式制备脂
质体。连接体部分必须具有亲脂部分，其可稳固植入和锚定在膜内。连接体部分还必须具有反应性部分，其可在脂质体水相表面发生化学反应。选择反应性部分，使其适合通过化学反应与后来加入的靶向试剂或碳水化合物形成稳定化学键。一些情况下，可能直接将靶向试
剂连接至连接体分子，但大多数情况下，更适于使用第三个分子作为化学桥，从而将膜内的连接体分子连接至靶向试剂或碳水化合物，所述靶向试剂或碳水化合物在三维上伸出囊表
面。
[0596] 通过本发明方法制备的化合物还可用作诊断试剂。例如，在疑似炎症患者中，可用带标记的化合物来定位炎症或肿瘤转移的区域。对此用途，可用25I、14C或氚标记化合物。
[0597] 本发明的药物组合物中所用的活性成分是糖聚乙二醇化G-CSF及其衍生物，所述糖聚乙二醇化G-CSF及其衍生物具有促卵泡激素的生物学特性以增加(如)排卵。优选地，本发明的G-CSF组合物经肠胃外给药(如IV、IM、SC或IP)。预期有效剂量依所治疗的疾病和给药途径而有明显变化，但预期其处于约0.1(～7U)-100(～7000U)μg活性物质/kg体重的范
围内。治疗贫血的优选剂量为约50-约300U/kg，每周三次。因为本发明提供体内驻留时间增强的G-CSF，所以在施用本发明的组合物时，任选地降低所述剂量。
围内。治疗贫血的优选剂量为约50-约300U/kg，每周三次。因为本发明提供体内驻留时间增强的G-CSF，所以在施用本发明的组合物时，任选地降低所述剂量。
[0598] 剂型
[0599] 在优选的方面，根据上述任一方法，以口服剂型提供治疗与造血作用或骨髓抑制相关的疾病所用的肽缀合物。在优选实施方案中，这些口服剂型包含以下成分：(a)为G-CSF肽和水溶性聚合物间的共价缀合物的肽，其中水溶性聚合物通过完整的糖基连接基团，在
G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽；(b)一种或多种表面活性剂；(c)一种
或多种脂肪酸；(d)肠溶物质。在尤其优选的实施方案中，肽、表面活性剂和脂肪酸混合于液相，冻干后与肠溶物质组合。
G-CSF肽的糖基或氨基酸残基处共价连接至G-CSF肽；(b)一种或多种表面活性剂；(c)一种
或多种脂肪酸；(d)肠溶物质。在尤其优选的实施方案中，肽、表面活性剂和脂肪酸混合于液相，冻干后与肠溶物质组合。
[0600] 应理解，本文所述实例和实施方案仅是出于说明性的目的，根据这些实例和实施方案的各种修改或改变将向本领域技术人员暗示并且将包含于本申请的精神和范围及所
附权利要求的范围之内。本文引用的所用出版物、专利和专利申请都为了所有目的在此以
其整体引入作为参考。
附权利要求的范围之内。本文引用的所用出版物、专利和专利申请都为了所有目的在此以
其整体引入作为参考。
[0601] 提供以下实施例来说明本发明的组合物和方法，但不限制要求保护的发明。实施例
[0602] 实施例1：与响应本发明G-CSF缀合物肽的嗜中性粒细胞计数相关的药物动力学数据
[0603] 响应本发明G-CSF缀合物和市售G-CSF Neulasta的嗜中性粒细胞计数的药物动力学研究显示，在相同浓度下，本发明的组合物显示出与Neulasta相似的作用时序(图1)。嗜中性粒细胞计数具有剂量依赖性，增加本发明G-CSF缀合物(糖聚乙二醇化G-CSF)的浓度导
致活性时序峰值处的嗜中性粒细胞数目增加。糖聚乙二醇化G-CSF产生比Neulasta高约
30％的反应，表明在相当的剂量下，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60％。
致活性时序峰值处的嗜中性粒细胞数目增加。糖聚乙二醇化G-CSF产生比Neulasta高约
30％的反应，表明在相当的剂量下，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60％。
[0604] 此研究包含53名受试者。每一剂量组有20名受试者，随机选择15名受试者至糖聚乙二醇化G-CSF组，5名受试者至Neulasta组。糖聚乙二醇化G-CSF一般被很好地耐受，不良事件谱与Neulasta类似。未出现因不良事件而中止。也未出现任何严重不良事件。此外，未检测到针对糖聚乙二醇化G-CSF的抗体。
[0605] 表4列出了施用糖聚乙二醇化G-CSF后24小时至168小时内三种不同糖聚乙二醇化G-CSF浓度的一些代表性数据点。
[0606] 表4
[0607] 小时 糖聚乙二醇化 糖聚乙二醇化 糖聚乙二醇化
G-CSF(100μg) G-CSF(50μg) G-CSF(25μg)
24 26,0778 27,8917 25,825
72 35,222 31,5167 16,550
96 36,9222 23,7667 12,4625
144 24,2667 19,625 11,7625
168 22,9556 16,8167 12,3625
G-CSF(100μg) G-CSF(50μg) G-CSF(25μg)
24 26,0778 27,8917 25,825
72 35,222 31,5167 16,550
96 36,9222 23,7667 12,4625
144 24,2667 19,625 11,7625
168 22,9556 16,8167 12,3625
[0608] 实施例2：与响应本发明G-CSF缀合物肽的CD34+计数相关的药物动力学数据
[0609] 响应本发明G-CSF缀合物(Glyco-PEG G-CSF)和市售G-CSFNeulasta的CD34+计数的药物动力学研究显示，在相同浓度下，本发明的组合物具有与Neulasta相似的作用时序
(图2)。在相同浓度下，糖聚乙二醇化G-CSF在其活性峰值处显示出明显高于Neulasta的
CD34+计数。
(图2)。在相同浓度下，糖聚乙二醇化G-CSF在其活性峰值处显示出明显高于Neulasta的
CD34+计数。
[0610] 细胞计数具有剂量依赖性，增加糖聚乙二醇化G-CSF的浓度导致活性时序峰值处的嗜中性粒细胞数目增加。
[0611] 表5列出了施用糖聚乙二醇化G-CSF后72小时至168小时内三种不同糖聚乙二醇化G-CSF浓度的一些代表性数据点。
[0612] 表5
[0613] 小时 糖聚乙二醇化 糖聚乙二醇化 糖聚乙二醇化
G-CSF(100μg) G-CSF(50μg) G-CSF(25μg)
72 68,444 33 14
96 101 44,4167 20,125
120 76,222 43,5 18,5
144 43,667 33,9167 13,875
168 33 17,8333 10,375
G-CSF(100μg) G-CSF(50μg) G-CSF(25μg)
72 68,444 33 14
96 101 44,4167 20,125
120 76,222 43,5 18,5
144 43,667 33,9167 13,875
168 33 17,8333 10,375
[0614] 实施例3：与响应本发明G-CSF缀合物肽的嗜中性粒细胞计数相关的药物动力学数据：固定剂量研究
[0615] 响应本发明G-CSF缀合物(糖聚乙二醇化G-CSF)和市售G-CSFNeulasta的嗜中性粒细胞计数的固定剂量药物动力学研究显示，本发明的组合物显示出与Neulasta相似的作用
时序(图4)。糖聚乙二醇化G-CSF产生比Neulasta高约30％的反应，表明在此剂量下，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60％。
时序(图4)。糖聚乙二醇化G-CSF产生比Neulasta高约30％的反应，表明在此剂量下，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60％。
[0616] 此研究招募了36名健康受试者。糖聚乙二醇化G-CSF一般被很好地耐受，不良事件与Neulasta类似。未出现因不良事件而中止，也未出现任何严重不良事件。未检测到针对糖聚乙二醇化G-CSF的抗体。
[0617] 实施例4：与响应本发明G-CSF缀合物肽的CD34+计数相关的药物动力学数据：固定剂量研究
[0618] 响应本发明G-CSF缀合物(糖聚乙二醇化G-CSF)和市售G-CSFNeulasta的CD34+计数固定剂量药物动力学研究显示，本发明的组合物显示出与Neulasta相似的作用时序(图
5)。
5)。
[0619] 实施例5：同种异体/自体CD34+外周血祖细胞的动员
[0620] 用10-20μg/kg的糖聚乙二醇化GCSF(Glyco-PEG G-CSF)治疗骨髓移植供体5天，将CD34+细胞从静息水平(～2/μL)增加至约10/μL，该量足够在单次成分输血中提供2-4×
106CD34+细胞/kg。骨髓移植供体可以是同种异体(与受体相同)或自体(与受体不同)供体。
106CD34+细胞/kg。骨髓移植供体可以是同种异体(与受体相同)或自体(与受体不同)供体。
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