本发明涉及一种化合物，具体地说涉及胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物，还涉及含有它们的药物组合物及用途。

胸腺生成素(Thymopoietin)是由胸腺上皮细胞分泌的一种含有49个氨基酸残基的多肽激素，胸腺五肽(Thymopentin，TP5)是胸腺生成素的32-36氨基酸片段。TP5是胸腺生成素的活性部位，其功能与胸腺生成素相同，它是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，能促进T细胞的成熟和分化，并促使成熟的T细胞分泌多种淋巴因子(如白介素-2和γ-干扰素等)，还能促进白介素-2受体的生成。在免疫平衡受损的动物模型中，TP5具有使之平衡的特点。无论是免疫反应过高或过低，TP5均能实现平衡调节，使它在免疫平衡失调相关的人类疾病治疗中很有前途。TP5分子量为679.9，其氨基酸序列如下：Arg-Lys-Asp-Val-Tyr胸腺五肽能诱导前胸腺细胞和活化外围T细胞，具有显著的临床相关免疫调节活性。临床研究表明胸腺五肽在治疗类风湿性关节炎、变应性皮炎、某些病毒感染和肉状瘤都有效。它能降低严重复发性单纯疱疹病毒感染的病人的复发率及复发时间。它对抗肿瘤放化疗及预防大手术后感染有明显的临床效果。能预防长期糖尿病患者的并发症并促进其康复。对早期获得性免疫缺损综合症的病人，胸腺五肽最大的益处是能增加病人的免疫能力。它安全性很好，大量的研究已证实无明显的毒副作用。
TP5为肽类药物，易被胃酸降解，必须胃肠外给药。TP5在人血浆中很快由蛋白酶和氨肽酶降为氨基酸，半衰期约为30秒。用药剂量较大、周期长。因此，对TP5进行修饰，延长其在体内作用时间有较好的应用前景。
研究表明，某些蛋白类药物经聚乙二醇(PEG)修饰后能保持较好的生物活性，并能显著延长生物体内的半衰期。聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶于1991年经FDA批准上市，2001年聚乙二醇修饰的干扰素经FDA批准上市。肽类药物与蛋白类药物在结构与性质上有许多相似之处，肽类药物的聚乙二醇化修饰研究晚于蛋白类药物的聚乙二醇化修饰，目前已取得了较好的效果，因此聚乙二醇化修饰的肽类药物有很好的应用前景，目前尚无聚乙二醇化修饰的胸腺五肽的报道。

本发明的目的之一是提供胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物，该衍生物的结构为在胸腺五肽的N-端氨基、C-端羧基或侧链的氨基或羧基偶联有引入氨基或羧基的聚乙二醇或偶联有聚乙二醇化修饰的氨基酸；或在胸腺五肽的N端或C端引入半胱氨酸，偶联有马来酰胺基聚乙二醇、乙烯基聚乙二醇或碘代乙酰基聚乙二醇。
本发明的聚乙二醇化衍生物为具有式(I)结构的化合物，包括TP5中任意位点的氨基经PEG共价修饰的化合物，其中所述氨基包括N-端氨基和赖氨酸侧链氨基：[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-TP5  (I)其中PEG表示：RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-2。
本发明的聚乙二醇化衍生物，还为具有式(II)结构的化合物，包括TP5中任意位点的羧基经PEG共价修饰的化合物，其中所述羧基包括C-端羧基和天冬氨酸的侧链羧基：TP5-[CO-Y-PEG]z         (II)其中PEG定义同上；Y＝O或NH；z＝1-2。
本发明的聚乙二醇化衍生物，也为具有式(III)结构的化合物，即TP5的N-端引入半胱氨酸后经PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修饰的化合物：PEG-M-Cys-TP5           (III)
其中或 或 PEG定义同上；Cys为半胱氨酸，通过侧链硫原子与M基团共价相连。
本发明的聚乙二醇化衍生物，也为具有式(IV)结构的化合物，即TP5的C-端引入半胱氨酸后经PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修饰的化合物TP5-Cys-M-PEG              (IV)其中PEG，Cys，M定义同上。
本发明的另一目的是提供聚乙二醇化衍生物的制备方法。
本发明所用的PEG-OH结构为：RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，R＝H或CH3，n＝5-1000。平均分子量由几百到几万的PEG-OH可作为商品化试剂购买到，PEG-NH2可以购买或通过以下反应得到先将其转化为PEG-NH2，再与琥珀酸酐反应得到PEG-NHCOCH2CH2COOH，然后将此化合物可作为羧基组分，可在固相上将其偶联到多肽的N-端，最后经三氟乙酸裂解和反相高效液相色谱纯化得产物。
在PEG的一端先引入氨基、羧基或制备PEG化修饰的氨基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH2-PEG)-OH、Fmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶联到肽序列中去，可实现对多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys侧链氨基、Asp或Glu侧链羧基的修饰。将PEG-NH2分别与马来酸酐、乙烯基氯化亚砜、碘代乙酸酐反应得马来酰胺基聚乙二醇(PEG-MAL)、乙烯基聚乙二醇(PEG-VS)或碘代乙酰基聚乙二醇(PEG-IODO)。
PEG-MAL通过以下反应得到：TP5可用固相或液相多肽合成法合成，在合成过程中很容易在N-端或C-端引入一个Cys。将含Cys的肽链溶于水中，用碳酸氢钠调pH7-8，加入3倍当量的PEG-MAL或PEG-VS或PEG-IODO，室温搅拌反应，用反相高效液相色谱纯化得PEG修饰的TP5的衍生物。PEG-MAL修饰Cys-TP5的反应如下：本发明涉及的Wang树脂、Rink树脂、DCC、HOBT、HBTU、NMM、TMBS、TFA和普通Fmoc-氨基酸通过购买获得。
上述各英文缩写的含义如下：PEG-聚乙二醇，mPEG-单甲氧基聚乙二醇，Arg-精氨酸，Asp-天冬氨酸，Cys-半胱氨酸，Lys-赖氨酸，Tyr-酪氨酸，Val-缬氨酸，Boc-叔丁氧羰基，Fmoc-芴甲氧羰基，DCC-二环己基碳二亚胺，HOBT-1-羟基苯并三唑，HBTU-2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，NMM-N-甲基吗啡啉，TFA-三氟乙酸，TMBS-三甲基溴硅烷，Ts-Cl-对甲苯磺酰氯，RP-HPLC-反相高效液相色谱。
在本发明中，所有氨基酸均为L-型氨基酸。
根据本发明，胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物中下列化合物为优选：mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-TP5mPEG5000-NHCOCH2CH2CO-TP5Cys(mPEG2000-MAL)-TP5Cys(mPEG5000-MAL)-TP5TP5-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2
TP5-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2本发明的另一目的是提供含有TP5的聚乙二醇化衍生物的药物组合物，该组合物包含TP5的聚乙二醇化衍生物以及药用敷料。
本发明的另一目的是公开了TP5的聚乙二醇化衍生物及包含它们的药物组合物的用途。本发明的发明人通过活性评价观察到部分化合物具有较好的体外促小鼠淋巴细胞增殖和诱导小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的生物活性。含它们的药物组合物可用于免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病的治疗或预防。TP5的聚乙二醇化衍生物与一种或多种赋形剂结合制成适用于人的剂型，如用甘露醇作赋形剂制成注射剂，经皮下给药治疗免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病。与免疫缺陷或免疫功能低下有关的疾病有类风湿性关节炎、变应性皮炎、肿瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等。
本发明的TP5的聚乙二醇化衍生物具有化学结构新颖，生物活性稳定，生物体内的半衰期长等特点，具有很好的应用前景。

下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。实施例所用固相合成载体Wang树脂为ACT产品，DCC、HOBT、HBTU、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品，TFA为ACROS产品，TMBS为Fluka产品，平均分子量为2000和5000的mPEG-OH为Sigma产品。
实施例1  mPEG5000-NHCOCH2CH2CO-TP5的合成称取mPEG2000-OH 40.0g(20mmol)置于250ml反应瓶中，加入100mlCH2Cl2，固体溶解后再加入15mlEt3N(100mmmol)和19.0g Ts-Cl(100mmol)，室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加100ml无水乙醚沉淀出固体，得28.5gmPEG2000-OTs，收率71％将18.0gmPEG2000-OTs(9mmol)溶于50ml DMF，加入5.0g(27mmol)邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，加入13.5ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2，用无水乙醚沉淀出固体，再以无水乙醇-乙醚重结晶，得14.2gmPEG2000-NH2，收率78％。
将5.0gmPEG2000-NH2溶于10mlDMF中，加入0.38g琥珀酸酐，40℃反应0.5小时，减压蒸去溶剂，加无水乙醚沉淀出固体，得4.8gmPEG2000-NHCOCH2CH2COOH，收率96％。
100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Arg(Mtr)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据TP5的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂，加入mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH(0.1mmol)，HBTU(0.1mmol)，NMM(0.15mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体40mg。RP-HPLC纯化得目标产物12.4mg。
mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-TP5经MALDI-TOF-MS分析，在2731附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.04(1)；Val，0.88(1)；Lys，1.01(1)；Tyr，0.95(1)；Arg，1.00(1)。
实施2  mPEG5000-NHCOCH2CH2CO-TP5的合成称取mPEG2000-OH 50.0g(10mmol)置于250ml反应瓶中，加入50mlCH2Cl2，固体溶解后再加入7.5ml Et3N(50mmmol)和9.5g Ts-Cl(50mmol)，室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加100ml无水乙醚沉淀出固体，得33.5gmPEG5000-OTs，收率67％将30.0g mPEG5000-OTs(6mmol)溶于30ml DME，加入3.33g(18mmol)邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，加入4.0ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2，用无水乙醚沉淀出固体，再以无水乙醇-乙醚重结晶，得22.5gmPEG2000-NH2，收率75％。
将10.0gmPEG2000-NH2溶于20ml DMF中，加入0.3g琥珀酸酐，40℃反应0.5小时，减压蒸去溶剂，加无水乙醚沉淀出固体，得9.8gmPEG5000-NHCOCH2CH2COOH，收率96％。
100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Arg(Mtr)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据TP5的氨基酸序列，按标准的固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂，加入mPEG5000-NHCOCH2CH2COOH(0.1mmol)，HBTU(0.1mmol)，NMM(0.15mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体65mg。RP-HPLC纯化得目标产物23.7mg。
mPEG5000-NHCOCH2CH2CO-TP5经MALDI-TOF-MS分析，在5595附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.07(1)；Val，0.96(1)；Lys，1.06(1)；Tyr，0.85(1)；Arg，0.84(1)。
实施3 Cys(mPEG2000-MAL)-TP5的合成将5.0gmPEG2000-NH2溶于10ml二氧六环，加入马来酸酐2.0g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，滤集固体，干燥后得4.9g。将所得固体溶于15ml乙酸酐，加入5.0g乙酸钠，100℃搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用二氯甲烷溶解，滤去不溶物，向滤液中加入适量活性炭，放置30min，滤除活性炭，将滤液浓缩至干，加入无水乙醚，沉淀出固体，滤集、干燥后得浅黄色固体2.5gmPEG2000-MAL，收率50％。
以100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Arg(Mtr)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据TP5的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Cys(Trt)-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂。以EDT-间甲酚-TMBS-TFA作裂解液，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出白色固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色干粉38mg。
将经RP-HPLC纯化后的Cys-TP5溶于水中，以碳酸氢钠调pH至7-8，加入3当量的mPEG2000-MAL，室温反应，用RP-HPLC监测反应进程和分离产物。
Cys(mPEG2000-MAL)-TP5经MALDI-TOF-MS分析，在2832附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.06(1)；Val，0.91(1)；Lys，1.03(1)；Tyr，0.89(1)；Arg，1.01(1)。
实施4 TP5-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2的合成以100mg Rink树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Arg(Mtr)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据TP5的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Rink树脂。以EDT-间甲酚-TMBS-TFA作裂解液，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出白色固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色干粉31mg。
将经RP-HPLC纯化后的TP5-Cys-NH2溶于水中，以碳酸氢钠调pH至7-8，加入3当量的mPEG2000-MAL，室温反应，用RP-HPLC监测反应进程和分离产物。
TP5-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2经MALDI-TOF-MS分析，在2831附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Asp，1.09(1)；Val，0.99(1)；Lys，1.08(1)；Tyr，0.84(1)；Arg，0.83(1)。
实施例5 TP5的聚乙二醇化衍生物的活性评价1、3H-TdR掺入法检测对小鼠脾淋巴细胞的增殖反应脾细胞悬液的制备：无菌取出小鼠脾脏，用毛玻璃片将脾脏磨碎，制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，洗涤三次，计数(活细胞在95％以上)。用含10％FBS(胎牛血清)RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为5×106细胞/ml。
于96孔板中加入100μl的细胞悬液，50μl的样品，50μlConA，对照加50μl含10％血清的培养液，总体积为200μl。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养，培养结束前12小时，每孔加入25μl3H-胸腺嘧啶核苷酸(2×104Bq)。继续培养至实验结束，然后将培养板冻存于-20℃冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBetaTrilux，PerkinElmer Life Sciences)上读取掺入细胞DNA的[3H]-胸腺嘧啶核苷量，以cpm值代表细胞增殖的情况。
表13H-TdR掺入法检测对小鼠脾淋巴细胞的增殖反应结果
2、诱导T淋巴细胞细产生IL-2和IFN-γ的测定(ELISA法)取小鼠脾细胞，调至5×106/ml，加入24孔板中，1ml/孔；各样品每个浓度分别加于24孔板，0.5ml/孔；加刺激物ConA(20μg/ml)0.5ml/孔。370℃，CO2培养箱中培养24小时，离心，收培养上清液。
抗体包被：用包被稀释液将抗体稀释，96孔酶标板加入稀释后的抗体(Capture Antibody)，50μl/孔。封板，于4℃过夜。
封闭：去抗体溶液，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入封闭液(PBS/10％FBS)，100μl/孔。室温1小时。
标准品和样品：去封闭液，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入标准品和样品，50μl/孔。室温2小时。
检测抗体和酶：去标准品和样品，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入稀释后的检测抗体(Detection Antibody)和酶(HRP)，50μl/孔，室温1小时。
底物显色：去检测抗体和酶，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入溶于柠檬酸，双氧水的底物(TMB)，50μl/孔。室温，避光，30分钟。显色后，加终止液(2N H2SO4)，25μl/孔。
OD值：置酶标仪中，于450nm、校正570nm处，测定OD值。
表2样品对ConA诱导T淋巴细胞细胞因子产生的影响结果
W01-W07代表的化合物结构分别为：W01：TP5W02：mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-TP5W03：mPEG5000-NHCOCH2CH2CO-TP5W04：Cys(mPEG2000-MAL)-TP5
W05；Cys(mPEG5000-MAL)-TP5W06：TP5-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2W07：TP5-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2结果表明：W01，W02，W03，W04，W05，W07对ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应的影响作用较弱，W06有较好的增强活性(表1)。在ConA激活诱导T细胞产生细胞因子实验中，W01，W02，W03，W04，W05，W06对T细胞IFN-γ的产生有一定促进作用；W01，W02，W03，W04，W05样品对T细胞产生的IL-2有一定促进作用(表2)。