本发明涉及聚乙二醇化的T20多肽化合物，还涉及使用和制备此类化 合物的方法，例如在药物组合物中使用和制备此类化合物的方法，并且还 涉及进行治疗的治疗性方法。

一些病毒，尤其是HIV，必须经过一个称为融合的复杂过程以进入宿 主细胞和繁殖。在融合过程中，病毒的外膜与宿主细胞的细胞膜融合。在 HIV的情况下，HIV病毒的外膜与繁殖期间的CD4+T细胞的细胞膜融合。

T20是一类新的抑制病毒/细胞膜融合的抗病毒剂中的一员。在为HIV 的情况下，其提供两方面有益的作用：阻断HIV的繁殖并且不会发生由 此引起的CD4+T细胞死亡。

来自两个大型国际性III期临床试验的数据表明在治疗中联合使用 T-20与未接受T-20的联合治疗相比，前者能将至少两倍百分比患者血液 中的HIV降低到不可检测的水平，并且在24周时提供了提高的免疫反应。 此外，那些接受T-20的人在24周期间较不可能出现病毒学上的失败或者 复发。

在北美和巴西进行的首次III期临床试验中，与优化的基础方案结合 使用T-20治疗时，37％的患者在24周时血液中HIV以不可检测水平存在 (低于400个拷贝/毫升)，与只接受基础方案中只有16％形成对比(p＜ 0.0001)。与T-20的联合治疗在20％的患者中进一步将HIV病毒载量降低 到低于50个拷贝/毫升，而只进行联合治疗的患者中只有7％(p＝0.0002)。

此研究的最初功效终点，在此研究中两个组间HIV的降低幅度的平均 差异是0.934log10拷贝/毫升(p＜0.0001)。作为联合方案的一部分接受T20 而进行治疗的患者HIV水平能降低1.697log10拷贝/毫升，而对照组中的 降低为0.763log10拷贝/毫升。此外，52％接受T-20的患者HIV水平降低 1.0log10或更多，而未接受T-20的患者中29％如此(p＜0.0001)。T20组 中的患者CD4+细胞平均上升76个细胞/立方毫米，而对照组中为32个细 胞/立方毫米(p＜0.0001)。

在欧洲和澳大利亚进行的第二个三期临床试验的结果与最初研究的发 现一致。使用T-20联合优化基础方案治疗的患者中，28％的患者在24周 时血液中HIV为不可检测水平(低于400个拷贝/毫升)，而仅接受优化基础 方案治疗的患者14％如此(p＜0.0001)。与T-20的联合治疗进一步将12％ 患者的HIV病毒载量降低到低于50个拷贝/毫升，而仅接受联合治疗的患 者5％如此(p＝0.0099)。

24周时两个组间HIV降低幅度的平均差异是0.78log10拷贝/毫升(p＜ 0.0001)。接受T-20作为联合方案一部分治疗的患者HIV水平能平均降低 1.43log10拷贝/毫升，与对照组中患者平均降低0.65log10拷贝/毫升形成对 比。此外，43％接受T-20的患者HIV水平降低1.0log10或更多，而未接 受T-20的患者中21％如此(p＜0.0001)。T-20组中的患者CD4+细胞平均上 升65个细胞/立方毫米，而对照组中为38个细胞/立方毫米(p＝0.023)。

最开始，基于治疗史和对逆转录病毒抗性的测试，为每一患者选择优 化的基础方案(由3到5种药物组成，如果合适的话包括最多两种新批准的 或新研究的药物)。选择完方案后，患者被随机分成2∶1两组，接受与T-20 联合的治疗方案或仅接受基础方案治疗。随机分到T-20组的患者每天两次 自己皮下注射90mg T-20。

在目前的HIV临床治疗手段中，对新近批准的抗HIV药物产生病毒 抗性是一个突出问题。随着时间的推移，开始联合使用新近批准的抗逆转 录病毒药物治疗的许多患者都会对这些药物中的一种或更多种产生抗性。 但是，研究表明，T-20不受对任一目前批准的抗逆转录病毒类药物所产生 的抗性的影响。(所述数据在2001年6月4-8日于亚利桑那州斯科茨代尔 举行的第5届国际药物抗性和治疗策略的会议上给出)。其他实验表明T20 的体外活性不受与反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性相关的突变的影 响。

象许多多肽治疗剂一样，T20通常通过注射的方法施用。目前的治疗 方法通常涉及多于一天一次的注射。

所以，提供具有较高性能和药物动力学特性的T20多肽及药物组合 物是有利的。能提供较低T20治疗剂量、较低施用频率、和/或具有作用持 续时间延长的T20是尤其有利的。

以下更详细地描述了本发明的这些和其他目的。

本发明提供了下式的化合物：

其中

R1为封端基团，

m为1-17，

n为10-1,000，

p从1-3，且

NHT20为通过其末端α-氨基共价连接的T20多肽。

在本发明化合物的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n为100-750， p为3。

还提供了一种药物组合物，其包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物， 其中R1、m、n、p和NHT20如上所述。

在本发明药物组合物的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n为 100-750，且p为3。

本发明还提供了抑制HIV感染的方法，其包括施用包含与可药用赋形 剂混合的公式(I)化合物的药物组合物，在式(I)化合物中R1、m、n、p 和NHT20如上所述。

在抑制HIV感染的方法的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n 为100-750，且p为3。

如果本发明涉及“制备…的方法”，是指“制备…的过程”。

还提供了制备聚乙二醇化T20多肽的方法，其包括使T20多肽与下式 的聚乙二醇醛反应：

其中R1、m、n、n和p如上所述，以产生式(I)中的化合物，其中聚乙 烯乙二醇醛分子与T20多肽的N末端氨基基团连接。

如果本发明涉及“包含一种化合物抑制HIV感染的方法，”其是指 “使用化合物制备抑制HIV的药物”。

本发明还提供了下式的化合物

CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT20(III)

其中n为10-1,000，NHT20是通过其末端α-氨基共价连接的T20多肽。

本发明还提供了这样的药物组合物，其包含与可药用赋形剂混合的式 (III)化合物，其中n为10-1000，NHT20为通过其末端α-氨基共价连接的 T20多肽。

还提供了抑制HIV感染的方法，其包括施用由包含与可药用赋形剂混 合的式(III)化合物的药物组合物，其中n为10-1000，NHT20为通过其末 端α-氨基共价连接的T20多肽。

如上所提到的，T20是“融合抑制剂”多肽。T20由36个氨基酸组成。 T20的多肽序列为：

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF[SEQ.ID.NO：1]

N末端(或者氨基端)氨基酸是酪氨酸(Y)，C末端(或者羧基端)氨基酸 是苯丙氨酸(F)。

如美国专利号5,464,933(SEQ ID：1)中图1所示，在此全部引用作为 参考，T20多肽序列可在其氨基端和羧基端之一端或两端封闭/衍生。如美 国专利号5,464,933中所述，酪氨酸氨基端可以用酰基封闭/衍生，苯丙氨 酸羧基端可以用氨基封闭/衍生(后者造成-COOH到-CONH2的变换)。

正如在此使用的，“T20”应被理解为[SEQ.ID.NO：1]在苯丙氨酸C末 端任选地用氨基封闭的意思。也就是说，当谈及“T20”时，苯丙氨酸C- 末端或者是-COOH或者是CONH2。

本发明提供了下式的聚乙二醇化T20化合物：

其中

R1为封端基团，

m为1-17，

n为10-1,000，

p为1-3，且

NHT20是通过其末端α-氨基共价连接的T20多肽。

正如在此使用的，R1“封端基团”可以是任一适当的化学基团，依赖 于优选，其通常为与其他化学成分反应或不反应。在上面的化合物中，聚 乙二醇与T20的α-氨基共价连接。选择R1封端基团是为了允许或阻止双 官能性，例如，与第二目的化学成分的共价连接。

在封端基团通常不与其他化学成分反应的情况下，R1具有相对的惰 性，因此不会与另一化学成分共价连接。通常适当的非反应性R1封端基团 包括：氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低 级环链烯基、芳基和杂芳基。

正如在此使用的，术语“低级烷基”是指取代的或未取代的直链或支 链烷基，其包含1-7个碳原子，优选的是1-4个碳原子，例如甲基、乙 基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚 基等等。

术语“低级烷氧基”是指如前面定义的通过氧原子连接的低级烷基， 低级烷氧基的例子有甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、 仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等等。

术语“低级环烷基”是指取代的或未取代的含有3-7个优选4-6个 碳原子的环烷基，即环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。

正如在此使用的，术语“低级链烯基”是指取代的或未取代的含有2 -7个优选2-5个碳原子的直链或支链链烯基，例如乙烯基、丁烯基、戊 烯基、己烯基等等。

术语“低级环链烯基”是指取代的或未取代的含有4-7个碳原子的环 链烯基，例如，环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等等。

术语“芳基”是指这样的苯基或萘基，其未发生取代或任选地由卤素、 低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、羟基、羧酸、羧酸酯、硝基、氨基或 苯基单取代或多取代，特别是由卤素、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、 羟基、硝基、氨基和苯基单取代或多取代。

术语“杂芳基”是指含有选自N、S和O的一个或多个杂原子的5或 6元杂芳基，其还可能是苯并的和/或以如前所述“芳基”同样的方式发生 取代。

通常优选的非反应性R1封端基团包括甲氧基、羟基或苄氧基。特别优 选的R1封端基团是甲氧基。当R1为甲氧基时，聚乙二醇化的多肽化合物 有时在文中称为“mPEG”化合物，其中m代表甲氧基。

如果R1封端基团通常与其他化学成分反应，那么R1就是能与一些官 能团反应的官能团，如肽和/或蛋白质中的胺和/或巯基。在这种情况下， R1可为易于与其他分子上的亲电或亲核基团反应的官能团，与那些需要强 催化剂或苛刻的反应条件才能反应的基团形成对比。如果R1是相对活跃的， 聚乙二醇醛可以与另一化学成分共价连接。

通常适当的反应性R1封端基团的例子包括：卤素、环氧化物、马来 酰亚胺、二硫化邻吡啶(orthopyridyl disulfide)、甲苯磺酸酯、异氰酸酯、 水合肼、氰尿酰卤化物、N-琥珀酰亚胺基氧基、硫代-N-琥珀酰亚胺基氧基、 1-苯并三唑基氧基、1-咪唑基氧基、对硝基苯基氧基和

术语卤素是指氟、氯、溴或碘。通常优选的反应性R1封端基团是。

当此R1封端基团存在时，应当理解为在本发明的化合物中，式中第一个m、 n和/或p可以与第二个m、n和/或p相同或不同。然而优选的是两个m 具有相同的数值，两个n具有相同的数值，两个p具有相同的数值。

在本发明中，m为1-17。在优选的实施方案中，m为1-14。更优 选的m为1-7，甚至更优选的m为1-4，最优选的m为1。

在本发明中，n为10-1,000。在本发明优选的实施方案中n为20- 1,000。优选的n为50-1,000，甚至更优选的n为75-1,000，最优选的n 为100-1,000。

在本发明中，p为1-3。优选的p为3。

在优选的实施方案中p为3，R1为甲氧基，m为1，n为100-750； 或者p为2，R1为甲氧基，m为1，n为100-750；或者p为1，R1为甲氧 基，m为1，n为100-750。

本发明提供了式(I)的实施方案，其中R1是甲氧基，m为1，n为100 -750，p为3，NHT20是通过其末端α-氨基共价连接的T20多肽。

如上所提到的，本发明的聚乙二醇化T20化合物共价连接T20的α- 氨基到具特殊结构的聚乙二醇衍生物上。聚乙二醇化的化合物可以通过任 何需要的方式产生，但通常通过使T20与单独制备的聚乙二醇衍生物反应 制备。

T20多肽可以以任何合适的方式制备。例如，此化合物可以这样合成， 用常规的Merrifield固相合成技术，其涉及到使用Boc-氨基酸的固相方法 (Chem.Soc.，85，2149，1963)通过手工或自动化步骤合成，还有使用Fmoc- 氨基酸的固相方法(Sheppard，R.C.等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.， 165-166页(1985))，用从Advanced Chemtech.，Louisville，Ky.购买的200 型Advanced Chemtech，用从Millipore，Bedford Mass购买的Millipore 9050+或其他有用的仪器合成。

T20可以通过将编码本发明化合物的cDNA导入有功能的病毒或环状 质粒DNA载体来产生。载体或质粒可以用来转染或转化所选择的微生物。 转化或转染的微生物在有益于表达载体所带DNA条件下培养，然后就能 从生长培养基中分离需要的多肽(例如，见美国专利号5,955,422，在此全 部引用作为参考)。

T20也可以通过标准的重组DNA技术，使用本领域众所周知的技术来 制备。例如Sambrook等描述的方法，Molecular Cloning：A laboratory Manual，第二版，(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.) 或者Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和 Sons，New York(1995)，它们在此引用作为参考。

产生T20的特定方法于在此引用的美国专利号6,015,881中阐述。

T20在解离和去保护之后，可以通过任何适当的手段纯化。例如，离 子交换、凝胶过滤层析和/或反相柱/HPLC系统可以用来从其片段中纯化全 长T20。在最初制备的T20前体带有与N-端相连的封闭或保护基团(如酰 基)和/或与C-端相连的封闭或保护基团(如氨基)的情况下，能用已知的技术 去掉一个或两个这些基团。

T20的氨基酸序列可以用标准的氨基酸分析法和手动和自动化的 Edman降解法来确认和鉴别确定每一个氨基酸。也可以用HPLC分析法 和质谱法来确证T20的产生。

能与T20反应的聚乙二醇醛化合物也可以以任何需要的方式生产。然 而优选的是聚乙二醇可以根据2002年7月24日同时申请的美国专利申请 顺序号60/398,196中描述的方法生产，其标题为“聚乙二醇醛”，在此全 部引用作为参考。

通常，下式的聚乙二醇醛用于聚乙二醇化T20

其中R1、m、n和p如上所述。用于聚乙二醇化T20的聚乙二醇醛可以通 过任何合适的手段制备。一个优选的聚乙二醇醛如下所述得到制备：

                 mPEG10k-丁醛反应方案

不同大小的聚乙二醇醛(例如n值不同)可以按照以上的反应图解来制 备。

本发明聚乙二醇化的T20化合物可以通过任何适当的手段制备。本发 明还提供了使T20多肽聚乙二醇化的方法，其包括使T20多肽NHT20与 下式的聚乙二醇醛反应：

其中R1、m、n、p如上所述，以产生下式的化合物：

R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CH2-NHT20  (I)

其中聚乙二醇醛分子与T20多肽的N-端氨基连接。

聚乙二醇化的T20通过加入摩尔比从1∶1到1∶100的T20和聚乙二醇 试剂来制备。如上所讨论的，T20具有游离α-氨基(去掉所有酰基)以及游 离羧基或氨基保护的羧基。反应混合物在5.5-7.4pH值范围的硼酸盐、磷 酸盐或tri缓冲液中于室温或4℃放置约0.5到24小时。聚乙二醇试剂与肽 /蛋白质的摩尔比在1∶1到100∶1之间。肽/蛋白质的浓度为1-10毫克/毫升。 缓冲液的浓度通常为10-500mM。

聚乙二醇化的T20通过取出聚乙二醇化的T20反应混合物，然后用平 衡缓冲液(20mMTris，pH值7.5)稀释来纯化。将得到的混合物过Q-琼 脂糖柱。得到的混合物加入QA柱之后，用平衡缓冲液洗；75M NaCl洗 脱；200mMNaCl洗脱；1M NaCl洗脱；并用1M HOAC+1M NaCl和0.5 NaOH再生。

通过使用反相HPLC，可容易地从混合物中的其他副产物分离和离析 N-端单聚乙二醇化的产物。

在本发明聚乙二醇化T20多肽的优选实施方案中，p为3，R1为甲基， m为1，n为100-750；或者p为2，R1为甲氧基，m为1，n为100-750； 或者p为1，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。

本发明还提供了下式的聚乙二醇化T20多肽：

CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT20  (III)

其中n为10-1,000，NHT20为通过末端α-氨基共价连接的T20多肽。 在一个实施方案中n大约为225，例如227。

这种聚乙二醇化T20多肽可以用任何需要的方式产生，优选的是用 实施例3所述方法产生。

本发明的药物组合物包含与可药用赋形剂混合的式(I)的化合物，其 中R1、m、n、p和NHT20如上所述。

包含聚乙二醇化T20多肽或其盐的本发明药物组合物可以任何需要的 方式产生，例如，通过常规的混合、包封、溶解、粒化、乳化、包埋或者 冷冻干燥方法。这些药物制剂可以与治疗用惰性的、无机或有机的赋形剂 和载体制剂。适于注射的赋形剂包括水、醇类、多羟基化合物、甘油、植 物油、磷脂和表面活性剂。

药物制剂也可包含防腐剂、促溶剂、稳定剂、着湿剂、乳化剂、甜味 剂、着色剂、调味剂、用以改变渗透压的盐类、缓冲剂、包衣剂或者抗氧 化剂。它们还可包含其他有治疗上有用的物质，包括额外的活性成分。

适宜肠胃外施用的制剂(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、气管内 和硬脑膜)可以方便地以单位剂量形式提供并可以通过常规的药学技术制 备。此类技术包括建立聚乙二醇化T20多肽和药物载体或赋形剂联系的步 骤。一般来说，制剂通过全面而密切地建立聚乙二醇化的T20多肽和液体 载体的联系来制备。适宜的肠胃外施用的制剂包括含水和非水溶无菌注射 溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目的接受者的血液 等渗的溶质；可能含有悬浮剂和增稠剂的含水和非含水无菌悬浮液。制剂 可以以单位剂量或多剂量容器形式提供，例如，密封安瓿和小瓶，并且制 剂可以在冷干(冷冻干燥)的条件下储存，只需在使用前立即加入无菌液 体载体例如注射用水。

优选的单位剂量制剂是那些包含如上所述的每日剂量或单位，每日亚 剂量，或者其施用成分的适当的一部分。

聚乙二醇化T20多肽优选地是单位剂量形式。正如在此使用的，“单 位剂量形式”意思是适于一次剂量的聚乙二醇化的T20多肽的量为预先 称量和/或预先包装形式。这允许方便地制备用于施用的聚乙二醇化T20多 肽，甚至允许患者的自我施用。单位剂量的量显然取决于待递送的聚乙二 醇化T20多肽的量和用药频率。

聚乙二醇化T20多肽也可以按单位剂量的量以冷冻干燥粉末形式提 供，其适于在施用之前与可药用赋形剂重建。

本发明的特定药物组合物包含与可药用赋形剂混合的式(I)的化合物， 其中R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3。

本发明的另一种药物组合物是包含与可药用赋形剂混合的式(III)的化 合物的药物组合物，其中n为10-1,000，且NHT20是通过末端α-氨基共 价连接的T20多肽。在一个实施方案中n约为225，例如227。

本发明还提供了抑制HIV感染的方法，其包括给患者施用包含与可药 用赋形剂混合的式(I)化合物的药物组合物，其中R1、m、n、p和NHT20 如上所述。

聚乙二醇化T20多肽一般以(非聚乙二醇化)T20多肽当前施用方式施 用。然而可作一些改进以利用聚乙二醇化T20多肽提高的药物动力学特性。

在本发明抑制HIV的方法中，药物组合物可以以任何适当的方式和途 径施用。在优选的方法中，聚乙二醇化的T20多肽以可注射的溶液或悬浮 液形式施用。优选地，可注射的溶液或悬浮液通过皮下注射或静脉内注射 施用。

在另一种优选的方法中，聚乙二醇化的T20多肽通过透皮递送设备例 如透皮贴片施用。

在本发明抑制HIV的方法中，药物组合物可以以任何适当的剂量和方 案施用。本发明的药物组合物可以以任何需要的形式，通过任何需要的途 径施用。然而本发明的聚乙二醇化T20多肽一般肠胃外施用，例如，以注 射液的形式施用。

治疗有效量的确定属于本领域的技术范畴，并且根据本发明的聚乙二 醇化T20多肽的治疗有效量或剂量可根据每一特别情况下个别需要改变和 调整。一般而言，在给体重大约70Kg的成人肠胃外施用的情况下，每天 大约5毫克到大约300毫克的剂量应该是合适的，优选的是大约50毫克 到大约200毫克，但在说明时上限可能过量。此剂量可以作为一次剂量、 分开的剂量或连续的灌输施用。可以每日施用，更优选地是每周施用。

本发明还提供抑制HIV感染的方法，其包括施用包含与可药用赋形剂 混合的式(I)化合物的药物组合物，其中R1为甲氧基，m为1，n为100- 750，p为3。

在本发明范畴之内还预期了抑制HIV感染的方法，其包括施用包含与 可药用赋形剂混合的式(III)化合物的药物组合物，其中n为10-1,000， NHT20为通过末端α-氨基共价连接的T20多肽。在一个实施方案中n大 约为225，例如227。

提供以下实施例是为了进一步阐述本发明的化合物、组合物和方法。 这些实施例子只作为例证，并非意在以任何方式限制本发明的范围。

                    实施例1

               PEG10K-丁醛的制备

240毫升甲苯中的分子量为10,000的mPEG(30.0克，3毫摩尔)通过 回流2小时共沸干燥，然后除去120毫升甲苯。得到的溶液冷却到室温， 然后向PEG溶液中加入叔丁醇钾(0.68克，6毫摩尔)在20毫升无水叔丁 醇和20毫升甲苯中的溶液。得到的混合物于氩环境下在室温搅拌两小时。 反应中通过注射器加入溴乙酸叔丁酯(1.00毫升，6.75毫摩尔)然后反应于 氩环境下在室温搅拌过夜。然后旋转蒸发浓缩反应溶液。加入二乙醚沉淀 残留物。沉淀下来的mPEG10k叔丁基羧甲基酯产物过滤分离和真空干燥。 产量：28克。NMR(d6-DMSO)：1.40ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm (s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.96ppm(s，2H，-O-CH2-COO-)。

然后将mPEG10k叔丁基羧甲基酯(26.5克)溶于350毫升1N氢氧化 钠中，然后此溶液室温搅拌过夜。加入6N盐酸调整混合物的pH值到2.5， 然后用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后沉 淀到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集m-PEG10k-羧甲基酸产物。产量： 24克。NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)； 3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH)。

然后将m-PEG10k-羧甲基酸(6克，0.6毫摩尔)溶于无水二氯甲烷(30 毫升)中，然后加入4-氨基丁醛二乙基缩醛(140毫升，0.9毫摩尔)，1-羟 基苯并三唑(80毫克，0.6毫摩尔)和二环己基碳二亚胺(160毫克，0.78 毫摩尔)。在氩环境下室温搅拌混合物过夜。过滤、浓缩反应混合物，并用 2-丙醇和二乙醚(1∶1)混合物沉淀。将mPEG10k-丁缩醛产物真空干燥过 夜。产量：5.4克。NMR(d6-DMSO)：1.07-1.12ppm(t，6H，(-O-CH2-CH3)2)； 1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q， 2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5 ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1 H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。

然后将mPEG10k-丁缩醛(2克，0.2毫摩尔)溶于20毫升80％ CF3COOH中，将溶液室温搅拌过夜。加入1N NaOH溶液调整混合物的 pH值到6.0，加入氯化钠(10wt％)然后加入1N NaOH调整溶液的pH值 到7.0。用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并沉淀 到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集mPEG10k-丁醛产物。产量：1.7克。 NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85 ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。

                          实施例2

                  用PEG10k-丁醛聚乙二醇化T20

3.0毫升含15毫克T20(纯度93.7％)的缓冲液(50毫摩尔磷酸钾，pH 6.5)中，按每一摩尔T20使用5摩尔试剂的摩尔比加入PEG(10kDa)的 丁醛(见实施例1)。T20多肽在α-氨基端去酰基，但在羧基端受-NH2保护。 向反应混合物中加入10％(V/V)0.5M氰基氢硼化钠水溶液并在室温下搅拌 4小时。用离子交换层析(QA)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的T20。增 加的盐浓度即20mMTris(pH 7.5)中150mM到1摩尔/升NaCl的线性梯 度用来分离聚乙二醇化的T20和未受修饰的T20。

                           实施例3

                  用mPEG10K丙醛聚乙二醇化T20

使用具有如下结构的PEG(10kDa)化丙醛

CH3-O-(CH2-CH2-O)227-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CHO

3.0毫升含15毫克T20(纯度93.7％)的缓冲液(50毫摩尔磷酸钾，pH 6.5)中，按每一摩尔T20使用5摩尔试剂的摩尔比加入150毫克mPEG10k- 丙醛。T1249多肽在α-氨基端去酰基，但在羧基端受-NH2保护。

反应混合物中加入10％(V/V)的0.5M氰基氢硼化钠水溶液并在室温 下搅拌4小时。用离子交换层析(QA)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的 T20。聚乙二醇化的T20多肽结构如下：

CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT20  (III)

20mMTris(pH 7.5)中150mM到1摩尔/升不断上升的NaCl线性浓 度梯度用来分离聚乙二醇化的T20和未受修饰的T20。

                           实施例4

                   聚乙二醇化T20的抑制剂浓度

表型易感性通常根据IC50或IC90定量化，即分别测量抑制50％或 90％病毒生长所需的药物浓度。

用PEG10K-丙醛聚乙二醇化的T20(实施例3)和用mPEG10k-丁醛聚乙 二醇化的T20(实施例2)的IC50和IC90结果在下面表1中展现： IC50(微克/毫升) IC90(微克/毫升) 聚乙二醇化的T20 用PEG10K-丙醛 聚乙二醇化的T20(实施例3) 0.261 3.074 用mPEG10k-丁醇醛 聚乙二醇化的T20(实施例2) 0.266 2.536

表1：抑制剂浓度50和抑制剂浓度90结果。

IC50和IC90值根据实施例5确定。

                           实施例5

                     cMAGI/MAGI抗病毒分析

这些分析使用指示细胞系MAGI(半乳糖苷酶指示剂的多核活化)或 者CCR5-表达衍生细胞系cMAGI评价感染性病毒滴度的降低。MAGI细 胞系通过用双嗜性逆转录病毒载体引入CD4基因和HIV-1 LTR-控制的b- 半乳糖苷酶报告基因，从亲代HeLa细胞衍生而来(Kimpton J，Emerman M，J Virol 66：2232-9，1992)。cMAGI细胞系通过用双嗜性逆转录病毒载体 PA317引入CCR5基因，从MAGI细胞系衍生而来(Chackerian B，Long EM，Luciw PA，Overbaugh J，J Virol 71：3932-9，1997)。cMAGI 细胞支持原代NSI(R5)分离株和实验室适应株X4病毒的复制，而MAGI 细胞只支持X4病毒的复制。两个细胞系都借助HIV-1 tat的能力反式激活 受HIV-LTR控制的b-半乳糖苷酶报告基因的表达。b-半乳糖苷酶报告基 因已被修饰以定位于细胞核，在感染的几天之内，可以强烈的细胞核着色 形式用X-gal底物检测到。这样，如果着色前只有一个感染周期，着色细 胞核的数量可以认为等于攻击接种中感染性病毒粒子的数量。

感染后24小时加入感染和细胞-细胞融合的抑制剂，例如，T20或 T1249(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 9：1051-3，1993)，这样是为了允许确定代表了一个感染周期。受感染的 细胞使用CCD-成像仪计数，原代分离株和实验室适应的分离株都显示病 毒数量和通过成像仪观察到的受感染细胞数量之间的有线性关系。在 MAGI和cMAGI分析中，感染滴度降低50％(Vn/Vo＝0.5)有意义并且提 供了评价抗病毒活性的主要截断值。感染滴度降低90％(Vn/Vo)用作评价 抗病毒活性的附加截断值。

每一种检测化合物的稀释物一式两份地通过对病毒接种物的抗性来检 测，在48孔微量滴定板上将病毒接种物调整为大约1500-2000个受感染细 胞/孔。将检测化合物加入cMAGI或MAGI细胞，然后加入病毒接种物， 24小时后加入感染和细胞-细胞融合的抑制剂(Wild C，Greenwell T， Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 9：1051-3，1993)以阻止第 二轮感染和细胞间病毒扩散。细胞再培养2天，固定，用X-半乳糖苷酶底 物染色以检测受感染细胞。每一个对照和检测化合物稀释物的受感染细胞 的数量用CCD-成像仪确定。IC50定义为造成感染性病毒滴度降低50％ 的检测化合物的稀释物。IC90定义为造成感染性病毒滴度降低90％的稀 释物。

本发明如此描述，显然，其同样可以以多种方式变化。并不认为这样 的变化是偏离本发明的精神和范围，并且所有此类修改意在包括在以下权 利要求书的范围内。

                          序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>聚乙二醇化的T20多肽

<130>21328US

<150>US 60/398,195

<151>2002-07-24

<160>1

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽序列为合成来源的

<220>

<221>MOD_RES

<222>(36)..(36)

<223>36位残基任选地用氨基修饰

<400>1

Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln

1               5                   10                  15

Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu

            20                  25                  30

Trp Asn Trp Phe

        35