一种人α1－胸腺肽的复合物及其制备方法
专利汇可以提供一种人α1－胸腺肽的复合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种人α1-胸腺肽的复合物及其制备方法，属肽或 蛋白质 的修饰复合物及其制备的技术领域。该复合物由人α1-胸腺肽和单甲 氧 基聚乙二醇组成，通过人α1-胸腺肽中赖 氨 酸的ε-NH2或N末端的α-NH2分别和单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键或 醛 基形成稳定的酰胺键或次级胺键连接在一起。将在人α1-胸腺肽蛋白质表面的游离氨基和带有经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇或含醛基的单甲氧基聚乙二醇进行反应，两者连结成单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物，即mPEG-Tα1。本 发明 的制备方法操作简便，原料易得。本发明制备的复合物 生物 稳定性 高，体内 半衰期 长，有助于提高人α1-胸腺肽的生物利用度。，下面是一种人α1－胸腺肽的复合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种人α1-胸腺肽的复合物，其特征在于，该复合物由人α1-胸腺肽和 单甲氧基聚乙二醇组成，通过人α1-胸腺肽中赖氨酸的ε-NH2或N末端的 α-NH2分别和单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键或醛基形成稳定的酰胺键或次 级胺键连接在一起。
2.权利要求1所述的人α1-胸腺肽的复合物的制备方法，其特征在于，具 体操作步骤如下：
第一步，称取1份重量的人α1-胸腺肽溶解于500份重量的100mM，pH7.4 磷酸盐缓冲液中，使之溶解，并与500份重量的pH6.0-9.0的200mM磷酸盐 缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入1.7-133.0份重量的PEG修饰剂，混和均匀， 混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶1～10， 所述的聚乙二醇修饰剂为SPA-mPEG、NHS-mPEG、ALD-mPEG，其分子量为 5KD～40KD；
第三步，将上一步混和均匀的反应液置于4℃～40℃下反应0.5～24小时；
第四步，反应结束后，置-20℃终止反应，取20ul反应液进行SDS-PAGE 电泳检查修饰程度；
第五步，取修饰反应混和物用pH3.2的20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释 10倍，上Sepharose FF CM层析柱，用含0～1MNaCl的pH3.2的20mM柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，用280nm处紫外吸收检测 吸收峰值；
第六步，收集各吸收峰洗脱溶液，SDS-PAGE电泳检查聚乙二醇修饰人α1- 胸腺肽复合物的多态性；
第七步，将收集到的单点吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.2份重量-2.1份重量单点修饰的 单甲氧基聚乙二醇-人α1-胸腺肽复合物的样品，其分子量介于 8.108KD-43.108KD。
技术领域
本发明涉及一种人α1-胸腺肽的复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰 复合物及其制备的技术领域。
背景技术
人α1-胸腺肽(α1-thymosin，Tα1)在体内由111个氨基酸组成的前体α1- 胸腺肽原(prothymosin)经酶解加工产生。成熟的人α1胸腺肽由28个氨基酸 组成，分子量为3.108KD，等电点为pH4.2。人α1-胸腺肽体内主要存在于胸腺 细胞、T-淋巴细胞以及胸腺组织中，在肝、肾、心、肺、脾等器官也有分布，在 人体血清中的正常浓度大约为540-670pg/mL，其主要生理功能为调节机体的免 疫活性，包括刺激多能干细胞分化为胸腺细胞，促进T-细胞的分化和成熟，增强 T细胞的功能，并使CD3+和CD4+等细胞的数量升高。人α1-胸腺肽可促进白介 素α(IL-1α)、白介素2(IL-2)、白介素(IL-3)，干扰素α及γ(IFN-α，IFN- γ)以及迁移抑制因子(migratory inhibitory factor)的表达。淋巴细胞在受有丝 分裂原或抗原刺激后，人α1-胸腺肽可使其产生的IL-2高亲和力受体数量增加。 此外人α1-胸腺肽还与细胞周期的调控，血管生长，细胞迁移，组织修复以及精 子的穿透能力等相关。
人α1-胸腺肽作为一种广谱免疫调节剂，临床结果显示其对乙型肝炎和丙型 肝炎有显著疗效，对肿瘤和艾滋病也有一定疗效。此外，人α1-胸腺肽还可用作 免疫辅助药剂，以增强免疫机能衰弱的患者对疫苗的应答能力，其应用前景极为 广泛。
但人α1-胸腺肽是一种生物活性小肽，在体内很容易降解而造成生物稳定性 差，体内半衰期短。临床数据表明，用人α1-胸腺肽治疗乙型肝炎的患者，每 周需两次皮下注射1.6mg，一个疗程持续6个月，长期的注射给患者带来痛苦或 使患者不愿意接受。因此迫切需要研制生物半衰期长的人α1-胸腺肽药品。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种人α1-胸腺肽的复合物，该复合 物由人α1-胸腺肽和单甲氧基聚乙二醇组成，通过人α1-胸腺肽中赖氨酸的 ε-NH2或N末端的α-NH2分别和单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键或醛基形 成稳定的酰胺键或次级胺键连接在一起。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种人α1-胸腺肽的复合物的制备 方法。本发明通过以下技术方案使上述问题得到解决。将在蛋白质表面具有游离 氨基的人α1-胸腺肽和带有经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇或 含醛基的单甲氧基聚乙二醇的进行反应，两者连结成单甲氧基聚乙二醇-人α1- 胸腺肽复合物，即mPEG-Tα1。
现详细说明本发明的技术方案。一种人α1-胸腺肽的复合物的制备方法，其 特征在于，具体操作步骤如下：
第一步，称取1份重量的人α1-胸腺肽溶解于500份重量的100mM，pH7.4 磷酸盐缓冲液中，使之溶解，并与500份重量的pH6.0-9.0的200mM磷酸盐 缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入1.7-133.0份重量的PEG修饰剂，混和均匀， 混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和聚乙二醇修饰剂的摩尔比为1∶1～10， 所述的聚乙二醇修饰剂为SPA-mPEG、NHS-mPEG、ALD-mPEG，其分子量为 5KD～40KD；
第三步，将上一步混和均匀的反应液置于4℃～40℃下反应0.5～24小时；
第四步，反应结束后，置-20℃终止反应，取20ul反应液进行SDS-PAGE 电泳检查修饰程度；
第五步，取修饰反应混和物用pH3.2的20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释 10倍，上Sepharose FFCM层析柱，用含0～1MNaCl的pH3.2的20mM柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，用280nm处紫外吸收检测 吸收峰值；
第六步，收集各吸收峰洗脱溶液，SDS-PAGE电泳检查聚乙二醇修饰人α1- 胸腺肽复合物的多态性；
第七步，将收集到的单点吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.2份重量-2.1份重量单点修饰的 单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物的样品，其分子量介于 8.108KD-43.108KD。
第七步所述样品具有本发明提出的结构，即由人α1-胸腺肽和单甲氧基聚乙 二醇组成，通过人α1-胸腺肽中赖氨酸的ε-NH2或N末端的α-NH2分别和单甲 氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯键或醛基形成稳定的酰胺键或次级胺键连接在一 起。
上述制备过程中的人α1-胸腺肽有化学合成或基因工程制备之分，前者可购 自于任何小肽合成公司，后者见本发明人的申请号和名称分别为200410018543.2 和题为“高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建和应用”的发明申请。用 于修饰人α1-胸腺肽的聚乙二醇，即PEG，为经过活化的单甲氧基PEG(mPEG)， 可以从SHEARWATER公司购买。这些mPEG为单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀 酰亚胺酯(SPA-mPEG)、分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(NHS- mPEG)、丙醛单甲氧基聚乙二醇(ALD-mPEG)，分子量介于5KD～40KD。
本发明的优点是利用人α1-胸腺肽表面存在的游离氨基即赖氨酸的ε-氨基 或N末端的α-NH2与单甲氧基聚乙二醇的活化琥珀酰亚胺酯键或醛基在较温和 的生理状态下进行反应，形成酰胺键或次级胺键，从而使得到的单甲氧基聚乙二 醇—人α1-胸腺肽复合物的性质十分稳定，不易被水解分离；由于使用的修饰剂 mPEG为高亲水性的线性无毒的高分子化合物，当其与人α1-胸腺肽稳定结合后 能在人α1-胸腺肽分子表面形成一种屏障，使得人α1-胸腺肽不易被体内的蛋白 酶降解，从而提高其生物稳定性；同时由于经PEG修饰的人α1-胸腺肽在体内的 半衰期延长，因而提高了人α1-胸腺肽的生物利用度。用本方法生产人α1-胸腺 肽的复合物，方法简便，原料易得，相对生产成本较低。
具体实施方式
实施例1 PEG修饰人α1-胸腺肽复合物的制备方法之一。在本实施例中， 用于修饰的PEG修饰剂为PEG的衍生物—SPA-mPEG，其分子量为5KD。
第一步，称取1.0mg人α1-胸腺肽溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐缓 冲液中，使之溶解，并与0.5ml的pH6.0-9.0的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸- 硼砂缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入1.7mg分子量为5KD的单甲氧基聚乙二醇衍 生物(SPA-mPEG)，混和均匀，使混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和聚乙 二醇衍生物的摩尔比为1∶1；
第三步，将第二步所得的混和物置于4℃～40℃下反应0.5～24h；
第四步，反应结束后，置-20℃终止反应，取20ul反应液进行SDS-PAGE 电泳检查修饰程度。
第五步，取修饰反应混和物用pH3.2的20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释 10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1MNaCl的pH3.2的20mM柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，用280nm处紫外吸收检测 吸收峰值；
第六步，收集各吸收峰洗脱溶液，SDS-PAGE电泳检查PEG修饰人α1-胸腺 肽复合物的多态性；
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.2mg纯的分子量为8.108KD的 单点修饰的单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物。
上述第二步中，分子量为5KD的单甲氧基聚乙二醇衍生物(SPA-mPEG) 的加入量可分别为8.5mg和17mg，摩尔比分别为1∶5和1∶10；上述第七步中， 可分别得到0.6和0.4mg的分子量为8.108KD的单点修饰的单甲氧基聚乙二醇— 人α1-胸腺肽复合物。
实施例2 PEG修饰人α1-胸腺肽复合物的制备方法之二。在本实施例中， 用于修饰的PEG修饰剂为PEG的衍生物-NHS-mPEG，其分子量为10KD。
第一步，称取1.0mg人α1-胸腺肽溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐缓 冲液中，使之溶解，并与0.5ml的pH6.0-9.0的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸- 硼砂缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入3.3mg分子量为10KD的单甲氧基聚乙二醇 衍生物(NHS-mPEG)，混和均匀，使混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和 聚乙二醇衍生物的摩尔比为1∶1；
第三步至第六步按实施例一中相应操作步骤进行。
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.4mg纯的分子量为13.108KD的 单点修饰的单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物。
上述第二步中，分子量为10KD的单甲氧基聚乙二醇衍生物(NHS-mPEG) 的加入量可分别为16.5mg和33mg，摩尔比分别为1∶5和1∶10；上述第七步 中，可分别得到0.9和0.7mg的分子量为13.108KD的单点修饰的单甲氧基聚乙 二醇—人α1-胸腺肽复合物。
实施例3 PEG修饰人α1-胸腺肽复合物的制备方法之三。在本实施例中， 用于修饰的PEG修饰剂为PEG的衍生物—SPA-mPEG，其分子量为20KD。
第一步，称取1.0mg人α1-胸腺肽溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐 缓冲液中，使之溶解，并与0.5ml的pH8.4的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂 缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入6.8mg分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇 衍生物(SPA-mPEG)，混和均匀，使混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和 聚乙二醇衍生物的摩尔比为1∶1；
第三步至第六步按实施例一中相应操作步骤进行。
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.8mg纯的分子量为23.108KD的 单点修饰的单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物。
上述第二步中，分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇衍生物(SPA-mPEG) 的加入量可分别为34.0mg和68.0mg，摩尔比分别为1∶5和1∶10；上述第七步 中，可分别得到1.5和1.2mg的分子量为23.108KD的单点修饰的单甲氧基聚乙 二醇—人α1-胸腺肽复合物。
实施例4PEG修饰人α1-胸腺肽复合物的制备方法之四。在本实施例中， 用于修饰的PEG修饰剂为PEG的衍生物—ALD-mPEG，其分子量为40KD。
第一步，称取1.0mg人α1-胸腺肽溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐 缓冲液中，使之溶解，并与0.5ml的pH8.4的200mM磷酸盐缓冲液或硼酸-硼砂 缓冲液混和；
第二步，向第一步溶液中加入13.3mg分子量为40KD的单甲氧基聚乙二醇 衍生物(ALD-mPEG)，混和均匀，使混和后的溶液中待修饰的人α1-胸腺肽和 聚乙二醇衍生物的摩尔比为1∶1；
第三步至第六步按实施例一中相应操作步骤进行。
第七步，将收集到的吸收峰溶液用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到1.4mg纯的分子量为43.108KD的 单点修饰的单甲氧基聚乙二醇—人α1-胸腺肽复合物。
上述第二步中，分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇衍生物(SPA-mPEG) 的加入量可分别为66.5mg和133.0mg，摩尔比分别为1∶5和1∶10；上述第七 步中，可分别得到2.1和1.7mg的分子量为43.108KD的单点修饰的单甲氧基聚 乙二醇—人α1-胸腺肽复合物。
以上描述的具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形 式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各 种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。
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