可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用
阅读：887发布：2023-03-03
专利汇可以提供可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医药和 生物材料 领域，具体涉及可 控释 放血 管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用，其包含巯基化的去细胞瓣膜和连接于所述巯基化的去细胞瓣膜上的可控释放血管内皮生长因子的 纳米材料 ，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成： 马 来酰亚胺‑聚乙二醇‑聚己内酯，聚己内酯和血管内皮生长因子；所述血管内皮生长因子包括VEGF165。本发明所述去细胞瓣膜将外源性生物 信号 血管内皮生长因子引入到去细胞瓣 支架 材料上，可 加速 去细胞瓣的 内皮化 ，从而改善瓣膜支架材料的相关生物学性能，具有广阔的应用前景。，下面是可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用专利的具体信息内容。
1.一种可控释放血管内皮生长因子的纳米材料，其中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺--聚乙二醇-聚己内酯4-10重量份，聚己内酯20-40重量份，磷脂
5-10重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.01重量份，所述纳米材料通过包含下述步骤的方法制备得到：
(1) 将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子-磷脂复合物；
(2) 将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料；
其中，所述超声处理后得到水包油乳剂，在所述超声处理后还包括下述步骤：
将所得水包油乳剂中有机溶剂挥发得到所述纳米材料；
所述水性聚合物为聚乙烯醇。
2.根据权利要求1所述的纳米材料，其中，马来酰亚胺--聚乙二醇-聚己内酯为4-6重量份，聚己内酯为20-30重量份，磷脂为5-8重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.005 重量份。
3.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中，所述血管内皮生长因子包含VEGF165。
4.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇1-5重量份和ε-己内酯0.4-2重量份。
5.根据权利要求3所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇1-5重量份和ε-己内酯0.4-2重量份。
6.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇为1-2重量份和ε-己内酯为0.4-1.5重量份。
7.根据权利要求3所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇为1-2重量份和ε-己内酯为0.4-1.5重量份。
8.根据权利要求1或2所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯通过包括下述步骤的方法制备得到： (1)将马来酰亚胺-聚乙二醇、ε-己内酯和催化剂混合，在65-70℃温度下发生开环聚合，合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯初产物； (2)将步骤(1)所述初产物溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂使其沉淀，得到所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯。
9.根据权利要求3所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯通过包括下述步骤的方法制备得到： (1)将马来酰亚胺-聚乙二醇、ε-己内酯和催化剂混合，在65-
70℃温度下发生开环聚合，合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯初产物； (2)将步骤(1)所述初产物溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂使其沉淀，得到所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯。
10.根据权利要求4所述的纳米材料，其中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯通过包括下述步骤的方法制备得到： (1)将马来酰亚胺-聚乙二醇、ε-己内酯和催化剂混合，在
65-70℃温度 下发生开环聚合，合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯初产物； (2)将步骤(1)所述初产物溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂使其沉淀，得到所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯。
11.一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，其特征在于，包括巯 基化的去细胞瓣膜和连接于所述巯基化的去细胞瓣膜上的权利要求1-10任一项所述的纳米材料。
12.权利要求1-10任一项所述纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
(1) 将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子-磷脂复合物；
(2) 将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料；
其中，所述超声处理后得到水包油乳剂，在所述超声处理后还包括下述步骤：
将所得水包油乳剂中有机溶剂挥发得到所述纳米材料；
所述水性聚合物为聚乙烯醇。
13.权利要求11所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜的制备方法，包括下述步骤：
(1) 去细胞瓣膜和巯基化试剂N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯发生巯基化反应后，用盐酸羟胺对所生成的乙酰化巯基进行保护，得到巯基化的去细胞瓣膜；
(2) 将步骤(1)所述巯基化的去细胞瓣膜与权利要求1-10任一项所述的纳米材料混合，反应后得到所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜。
14.权利要求1-10任一项所述纳米材料或权利要求11所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜在制备心脏瓣膜器材中的应用。
可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 心脏瓣膜病是一种严重危害人类健康的世界性公共问题，发病率约2.5％。心脏瓣膜置换是治疗瓣膜病的有效方法，到2050年，需行瓣膜置换手术病人估计将会超过85万。临床上常用的心脏瓣膜替换物多为机械瓣膜与生物瓣膜，但它们均有严重缺陷。机械瓣膜的血流流场紊乱常导致血液有形成分破坏，可能发生与凝血系统有关的出血及血栓形成的并发症，术后需终生服用抗凝药物治疗。生物瓣膜大多为经戊二醛交联的猪心脏瓣膜或牛心包瓣，但因细胞毒性、钙化位点暴露、缺少内皮细胞屏障等，瓣膜组织会发生退行性变、钙化，最终导致瓣膜裂解、衰坏而至功能障碍，使患者约10-15年后面临再次手术的可能，且以上两种瓣膜均无法随患者生长而重构。因此进一步改进或研制一种能够克服上述缺陷的理想瓣膜替代物成为心脏外科医生的追求目标。
[0003] 组织工程心脏瓣膜是一种新颖的瓣膜假体，利用组织工程技术将种子细胞种植于支架材料上，并于特定的条件下构建组织工程心脏瓣膜，使之在植入体内替换病变瓣膜后仍然具有生长、重建、修复能力，术后无需抗凝治疗，其生物学性能、机械性能与正常瓣膜相当。支架材料主要有去细胞的生物基质和合成的高分子聚合物。
[0004] 去细胞基质由于其良好的生物相容性，并可为种子细胞黏附、增殖、分化等提供类似于体内的基质微环境，在组织工程学中得以广泛应用。目前去细胞基质支架材料多为猪心脏瓣膜和牛心包，但去细胞基质表面无完整的内皮细胞覆盖,不能控制血浆成分的渗入,可能是引起组织钙化和衰败的先行条件。另外，由于去细胞基质表面胶原纤维的暴露，在体内可能激活血小板而导致血栓的形成。最终，手术置换的瓣膜会裂解、衰坏而至功能障碍和产生一系列与血栓相关的并发症，所以去细胞基质的内皮化非常重要。
[0005] 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有促进内皮细胞增殖、生长、移行的功能，常用来修饰生物材料，使生物材料功能化。其与细胞膜上特异性受体结合，通过VEGF/VEGFR-2信号通路促进细胞的增殖和材料内皮化、血管形成等。其中VEGF 165在各种细胞中分泌最多，也是VEGF发挥作用的主要形式。血管内皮祖细胞表面高表达VEGFR-2，可与 VEGF165特异性结合，利于促进血管内皮祖细胞动员、迁移和在局部的定植、生长、分化。
[0006] 纳米载药控释系统可作为一种新颖的药物载体，能够携带多种药物且能够通过改变纳米材料的分子量和投料量严格控制药物的释放速度和释放周期，在局部可达到预定的药物浓度，从而提高药物的生物利用度。纳米载药控释系统以合适的方法将蛋白类药物包封后，既不影响蛋白活性，又能对其有效地保护，使其避免体内蛋白酶的降解而过快清除。
[0007] 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链段以重复乙二醇氧化乙烯为基础结构，具有高度亲水性、无毒、无抗原性和免疫原性及良好组织相容性等优点。聚己内酯(polycaprolactone，PCL)具有优良的药物透过性、优异的生物可降解性和生物相容性。PEG与疏水性PCL链段结合后的PEG-PCL共聚物，与PCL 一样，均可作为优良的药物运输骨架材料，在医药、食品等领域得到广泛应用。 PCL和PEG均已被美国FDA组织批准在人体内使用，且PEG-PCL经国际认证无毒害，无免疫原性，具有良好的生物降解性和相容性。
发明内容
[0008] 本发明解决的技术问题是：去细胞基质表面如果没有被内皮细胞完整覆盖，将不能控制血浆成分的渗入，可能会引起瓣膜组织的钙化和激活血小板，但目前去细胞基质的内皮化技术还不成熟，其内皮化速度和效果还有待提高，瓣膜支架材料的相关生物学性能还有待改善。
[0009] 本发明的目的在于提供一种可控释放血管内皮生长因子的新型去细胞瓣膜的制备方法。借鉴纳米载药控释系统原理，利用MAL-PEG-PCL共聚物修饰的PCL纳米粒包封生物信号分子VEGF165，形成可控释放的载VEGF165 的PCL纳米粒，再通过MAL-PEG末端马来酰亚胺中不饱和的碳碳双键与引入到去细胞瓣胶原蛋白上的巯基发生迈克尔加成反应，从而制备可控释放 VEGF165功能的去细胞瓣膜。该纳米载体以合适的方法将VEGF165包封后，既不影响生物信号分子活性，又能对其有效地保护，使其免遭化学和酶降解以及体内高速血流剪切力的破坏，最终保持生物信号分子的生物活性。通过调整 PCL的分子量和投料量控制VEGF165的释放速度和释放周期，从而使去细胞瓣处维持一定浓度的VEGF165。
[0010] 去细胞瓣膜上的VEGF165对内皮祖细胞具有强烈的招募作用，使内皮祖细胞在去细胞瓣膜局部定植、生长、分化，最终实现去细胞基质支架材料的内皮化，使去细胞基质与血浆成分相隔开，从而防止钙化位点和胶原纤维的暴露，进而防止或延缓瓣膜支架材料的钙化和血小板的激活。将纳米载药控释系统应用于组织工程，制备了可控释放VEGF165的新型去细胞瓣膜，为组织工程心脏瓣膜的改性修饰研究提供一种新方法。
[0011] 具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
[0012] 本发明提供一种可控释放血管内皮生长因子的纳米材料，其特征在于，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯，聚己内酯和血管内皮生长因子。
[0013] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺--聚乙二醇-聚己内酯4-10重量份，聚己内酯20-40重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.01重量份。
[0014] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯4-6重量份，聚己内酯20-30重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.005重量份。
[0015] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯，聚己内酯，磷脂和血管内皮生长因子。
[0016] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成：马来酰亚胺--聚乙二醇-聚己内酯4-10重量份，优选为4-6重量份，聚己内酯 20-40重量份，优选为20-30重量份，磷脂5-10重量份，优选为5-8重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.01重量份，优选为0.001-0.005重量份。
[0017] 优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子包含VEGF165。
[0018] 优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子占所述纳米材料的质量分数为0.003％-0.04％，优选为0.03％-0.02％。
[0019] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料中血管内皮生长因子的包封率为 75％-85％。
[0020] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料的平均粒径为80-220nm。
[0021] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料中血管内皮生长因子在48h的释放率为50-60％。
[0022] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料通过包含下述步骤的方法制备得到：
[0024] 优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料通过包含下述步骤的方法制备得到：
[0025] (1)将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子- 磷脂复合物；
[0026] (2)将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0027] 优选的，上述纳米材料中，所述超声处理后还包括下述步骤：
[0028] 将步骤超声处理后所得水包油乳剂中所述有机溶剂挥发，得到所述纳米材料。
[0029] 优选的，上述纳米材料中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述水溶性聚合物选自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或乙烯 -乙烯醇共聚物，优选为聚乙烯醇。
[0030] 优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子和磷脂的重量比为 1:1000～1:5000。
[0031] 优选的，上述纳米材料中，所述油相与水相的体积比为1:6～1:8。
[0032] 优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇1-5重量份，和ε-己内酯0.4-2重量份。
[0033] 优选的，上述纳米材料中，马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成：马来酰亚胺-聚乙二醇1-2重量份，和ε-己内酯0.4-1.5重量份。
[0034] 优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯的平均分子量为4000-7000。
[0035] 优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯通过包括下述步骤的方法制备得到：
[0036] (1)将马来酰亚胺-聚乙二醇、ε-己内酯和催化剂混合，在65-70℃温度下发生开环聚合，合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯初产物；
[0037] (2)将步骤(1)所述初产物溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂使其沉淀，得到所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯。
[0038] 优选的，上述纳米材料中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述沉淀剂选自乙醚、甲醇、正己烷或环己烷中的一种或两种以上，优选为乙醚或甲醇的一种或两种。
[0039] 优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子-磷脂复合物通过包括下述步骤的方法制备得到：
[0040] 将磷脂加入叔丁醇中，配制成磷脂/叔丁醇溶液，将磷脂/叔丁醇溶液与血管内皮生长因子水溶液混合，在-50～-60℃条件下冷冻，得到所述血管内皮生长因子-磷脂复合物。
[0041] 优选的，上述磷脂/叔丁醇溶液的浓度为5-10mg/ml，所述血管内皮生长因子水溶液的浓度为1-10μg/ml，优选为1-5μg/ml。
[0042] 本发明还提供一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，其特征在于，包括巯基化的去细胞瓣膜和连接于所述巯基化的去细胞瓣膜上的上述任一种纳米材料。
[0043] 优选的，上述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，其通过包括下述步骤的方法制备得到：
[0045] (2)将步骤(1)所述巯基化的去细胞瓣膜与上述任一纳米材料混合，反应后得到所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜。
[0046] 本发明还提供上述任一种纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
[0047] 将血管内皮生长因子、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0048] 优选的，上述制备方法中，包括下述步骤：
[0049] (1)将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子- 磷脂复合物；
[0050] (2)将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0051] 优选的，上述制备方法中，还包括下述步骤：
[0052] 将超声处理后所得水包油乳剂中所述有机溶剂挥发，得到所述纳米材料。
[0053] 优选的，上述制备方法中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述水溶性聚合物选自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素，优选为聚乙烯醇。
[0054] 优选的，上述制备方法中，还包括下述步骤：
[0055] 加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破坏未包封的血管内皮生长因子-磷脂复合物。
[0056] 优选的，上述制备方法其中，所述血管内皮生长因子和磷脂的重量比为 1:1000～1:5000。
[0057] 优选的，上述制备方法中，所述油相与水相的体积比为1：6～1：8。
[0058] 优选的，上述制备方法中，所述超声处理的条件为：功率30-60W，每隔 5-10s关闭5-10s，共处理1-2min。
[0059] 优选的，上述制备方法，其中聚乙烯醇的浓度为2-4％(w/v)。
[0060] 本发明还提供上述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜的制备方法，包括下述步骤：
[0061] (1)去细胞瓣膜和巯基化试剂N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯发生巯基化反应后，用盐酸羟胺对所生成的乙酰化巯基进行保护，得到巯基化的去细胞瓣膜；
[0062] (2)将步骤(1)所述巯基化的去细胞瓣膜与任一上述纳米材料混合，反应后得到所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜。
[0063] 优选的，上述制备方法中，所述巯基化反应的温度为35-40℃，所述步骤 (2)的反应温度为35-40℃。
[0064] 本发明还提供上述任一纳米材料或任一可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜在心脏瓣膜器材中的应用。
[0065] 本发明所取得的有益效果：
[0066] (1)本发明所制备的新型可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，将外源性生物信号VEGF引入到去细胞瓣支架材料上，可加速去细胞瓣的内皮化，从而改善瓣膜支架材料的相关生物学性能，有望能克服当前生物瓣膜的一些不足。
[0067] (2)利用VEGF对内皮祖细胞具有强烈的招募作用，使内皮祖细胞在去细胞瓣膜局部定植、生长、分化，加速去细胞瓣的内皮化，使去细胞基质与血浆成分相隔开，防止钙化位点和胶原纤维的暴露，最终防止或延缓瓣膜支架材料的钙化和血小板的激活。
[0068] (3)所制备载血管内皮生长因子的纳米粒，属于纳米控释系统，该系统对VEGF165的包封率高，所制备的纳米粒呈球形，表面光滑，形态规整，粒径分布均匀，稳定性好。体外累计释放速度较缓慢，未见明显的突释效应，达到了缓慢控制释放的效果。细胞毒性实验提示纳米粒对脐静脉内皮细胞无毒性作用。
[0069] (4)本纳米控释系统将VEGF165包封在纳米材料中，既不影响生物信号分子活性，又能对其有效地保护，使其免遭化学和酶降解以及体内高速血流剪切力的破坏。且该纳米控释系统能通过控制PCL的分子量及投料量很好的控制VEGF165的释放速度和释放周期，从而使去细胞瓣处维持一定浓度的 VEGF。
[0070] (5)构成载体材料的MAL-PEG-PCL和PCL均为可降解材料，可在体内生物酶的作用下完全降解，且降解产物及其代谢产物对人体无毒害，具有良好的生物降解性和相容性，在医药、食品等领域得到广泛应用。
[0071] (6)利用MAL-PEG-PCL共聚物修饰的PCL纳米粒包封生物信号分子 VEGF165，形成可控释的载VEGF165的PCL纳米粒，再通过MAL-PEG末端马来酰亚胺中不饱和的碳碳双键与引入到去细胞瓣胶原蛋白上的巯基发生迈克尔加成反应，最终将纳米粒连接到去细胞瓣膜上。本发明通过扫描电子显微镜观察、红外光谱检测及荧光分子替代实验均显示纳米粒子共价结合到巯基化的去细胞瓣膜上，成功制备出具有可控释放VEGF的新型去细胞瓣膜。
[0073] 图1为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子的纳米材料的制备过程示意图。
[0074] 图2为实施例一所述MAL-PEG和MAL-PEG-PCL共聚物的红外光谱图，其中，A为MAL-PEG的红外光谱图，B为MAL-PEG-PCL共聚物的红外光谱图。
[0075] 图3为实施例一所述为MAL-PEG-PCL共聚物的核磁共振氢谱图，其中， a处质子峰δ＝1.38，b处δ＝1.65，c处δ＝2.31，d处δ＝3.64，e处δ＝4.06，f处δ＝6.74， g处δ＝4.23，h处δ＝3.84。
[0076] 图4为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料透射电子显微镜图。
[0077] 图5为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料的粒径分布图。
[0078] 图6为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料的Zeta电位图。
[0079] 图7为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料体外累计释放曲线。
[0080] 图8为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料在不同浓度硫酸钠溶液中的吸光度。
[0081] 图9-a和图9-b分别为实施例一所述可控释放血管内皮生长因子去细胞瓣膜和单纯去细胞瓣的扫描电子显微镜图。
[0082] 图10为实施例一所述各瓣膜的红外光谱图，其中，A为单纯去细胞瓣的红外光谱图，B为未载血管内皮生长因子复合瓣膜的红外光谱图，C为载血管内皮生长因子复合瓣膜的红外光谱图。
[0083] 图11-a为对比例中经MAL-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的复合瓣膜荧光显微镜图。
[0084] 图11-b为对比例中经M-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的复合瓣膜荧光显微镜图。
具体实施方式
[0085] 鉴于现有技术中所用去细胞基质表面没有完整的内皮细胞覆盖，可能会引起组织钙化和衰败，且由于去细胞基质表面胶原纤维的暴露，在体内可能激活血小板而导致血栓等问题，本发明提供了一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制备方法。
[0086] 一种优选的实施方式中，本发明所述去细胞瓣膜的制备方法包括下述步骤：
[0087] (1)MAL-PEG-PCL的合成
[0088] 采用开环聚合法，分别称取一定量经干燥处理的MAL-PEG和ε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，以辛酸亚锡为催化剂，甲苯为反应溶剂，反复抽真空充氮气5次，使反应在氮气环境中进行。68℃油浴加热磁力搅拌下，开环聚合合成MAL-PEG-PCL。经72小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到MAL-PEG-PCL粗产物。68℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入一定量二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后用乙醚对其进行沉淀，4℃静置，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。将其再次溶于二氯甲烷，乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于-20℃保存，备用。
[0089] (2)VEGF165-磷脂复合物的制备
[0090] 先精确称取一定量的大豆磷脂于干燥的西林瓶中，再加入一定量的叔丁醇，充分吹打混匀，使磷脂完全溶解。将VEGF165溶于三蒸水中，最后将磷脂/叔丁醇溶液与VEGF165水溶液混合，充分吹打混匀，在冷冻干燥机-56℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，封口密封于-20℃保存。
[0091] 此外，本发明不限制VEGF165-磷脂复合物的来源，商购得到的VEGF165- 磷脂复合物也适用于本发明。
[0092] (3)可控释VEGF165的PCL纳米粒的制备
[0093] 参照复合纳米粒的制备路线(见图1)，采用乳化溶剂挥发法制备经 MAL-PEG-PCL修饰的载VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米粒。首先制备O/W 型乳剂，油相为含上述冻干的VEGF165-磷脂复合物、PCL、MAL-PEG-PCL、二氯甲烷的溶液，而水相为聚乙烯醇(PVA)水溶液。将油相加入水相后立即超声处理一定时间。然后于常温下低速磁力搅拌4.5小时以挥去二氯甲烷，滴加1％Triton X-100溶液，再搅拌30分钟以破坏未被载入PCL纳米粒的磷脂胶团。最终制得纳米粒混悬液。
[0094] (4)去细胞瓣的制备及巯基化
[0095] 猪主动脉瓣的获取：清洁条件下获取猪心脏，4℃生理盐水冲洗心脏以去除血污，暴露主动脉根部，剪断附近的心肌、腱索等并取出含瓣叶的主动脉根部，4℃生理盐水反复冲洗，置于4℃含抗生素的生理盐水中带回实验室。在实验室环境下裁剪主动脉瓣叶，磷酸盐缓冲液反复冲洗，置于4℃含抗生素的高糖DMEM培养基中培养。
[0096] 去细胞瓣的制备(参考文献：董念国等,组织工程瓣膜天然支架去细胞方法的比较.中华实验外科杂志,2005.22(3):第377页.)：将获取的瓣膜置于 37℃含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸盐缓冲液中12小时，再置于4℃含1％Triton X-100的去细胞液中48小时，磷酸盐缓冲液冲洗后，置于37℃含核酸酶(脱氧核糖核酸酶200mg/L、核糖核酸酶20mg/L)的磷酸盐缓冲液处理1小时，最后用磷酸盐缓冲液清洗,去细胞瓣完成制备。
[0097] 巯基化去细胞瓣的制备：将制备好的去细胞瓣与巯基化试剂N-丁二酸-S- 乙酰基巯基乙二醇酯于一定温度下反应2小时，磷酸盐缓冲液洗脱终止反应后，用盐酸羟胺对乙酰化巯基去保护，磷酸盐缓冲液洗去残余盐酸羟胺，制得巯基化的去细胞瓣。
[0098] (5)可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜的制备
[0099] 将巯基化的去细胞瓣浸没于稀释一定比例的经MAL-PEG-PCL修饰的载 VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米粒混悬液中，在37℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡8小时，反应在避光条件下进行，之后用磷酸盐缓冲液洗去未结合到瓣膜上的纳米粒，共3次，每次5分钟，最终制得可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜。
[0100] 另一种优选的实施方式中，本发明所述的可控释放血管内皮生长因子纳米材料的合成路线如图1所示：取含羟基末端的MAL-PEG与ε-CL在催化剂辛酸亚锡作用下，于68℃反应72小时，利用开环聚合法制备得到MAL-PEG-PCL 聚合物；以MAL-PEG-PCL、PCL、VEGF-磷脂混合和二氯甲烷为油相，以PVA 溶液为水相，在常温超声作用下，制备所述可控释放血管内皮生长因子纳米材料。
[0101] 下面通过具体实施例来进一步说明本发明所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制备方法。
[0102] 在下面的实施例中，所用的各试剂和设备信息如下：
[0103] 1.试剂信息
[0104] 马来酰亚胺-聚乙二醇:MAL-PEG购于北京键凯科技有限公司；
[0105] 甲氧基聚乙二醇：M-PEG购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号202509；
[0106] ε-己内酯：ε-CL购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号704067；
[0107] 辛酸亚锡购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号S3252；
[0108] 叔丁醇购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号471712；
[0109] 聚己内酯：PCL购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号440752；
[0110] 聚乙二醇辛基苯基醚：Triton X-100购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号X-100；
[0111] N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号 A9043；
[0112] 香豆素-6：购于美国Sigma-Aldrich公司，产品编号442631；
[0113] 血管内皮生长因子(VEGF165)购于美国PEPROTECH公司；编号为 100-20，氨基酸序列为：
[0114] APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP
[0115] DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI
[0116] MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDR ARQENPCGPC
[0117] SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC
[0118] DKPRR
[0119] 大豆磷脂购于上海太伟药业有限公司；
[0120] 聚乙烯醇(PVA)购于阿拉丁试剂(中国)有限公司，产品编号P105128；
[0121] RPMI 1640培养基购于美国Hyclone公司；
[0122] 高糖DMEM培养基：改良Eagle’s细胞培养液，美国Hyclone公司；
[0123] 胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司；
[0124] TransDetectTM Cell Counting Kit购于北京全式金生物技术有限公司；
[0125] 磷酸盐缓冲液，PBS购于北京全式金生物技术有限公司；
[0126] 血管内皮生长因子ELISA试剂盒购于武汉优尔生科技股份有限公司；
[0128] 头孢唑林钠购于山东瑞阳制药有限公司；
[0129] 庆大霉素、两性霉素B购于河南天方药业有限公司；
[0130] 脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶购于美国Sigma-Aldrich公司；
[0131] 胰蛋白酶购于美国Gibco公司；
[0132] 人脐静脉内皮细胞：购于ATCC；
[0133] 猪心脏：购于江西程明食品有限公司；
[0135] 甲苯、二氯甲烷、乙醚、硫酸钠、二甲基亚砜等其他试剂购于西陇化工股份有限公司。
[0136] 2.设备信息
[0137] 恒温振荡器：SHA-BA，常州朗越仪器制造有限公司；
[0138] 冷冻干燥机：FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司；
[0139] 傅立叶红外光谱仪：Nicolet 5700，美国热电尼高力公司；
[0140] 核磁共振谱仪：AVANCEⅢ600MHz，瑞士布鲁克；
[0141] 透射电子显微镜：JEM-2100，日本电子株式会社；
[0142] 扫描电子显微镜：Quanta200F，美国FEI公司；
[0143] 荧光显微镜：日本奥林巴斯公司；
[0144] 电子天平：BSA124S，赛多利斯科学仪器有限公司；
[0145] 多功能酶标仪：VARIOSKAN，美国赛默飞世尔科技公司；
[0146] 集热式搅拌器：DF-101S，金坛市科析仪器有限公司；
[0147] 数显恒温磁力加热搅拌器：HJ-2A，江苏金坛晨阳电子仪器厂；
[0149] 超速离心机：OptimaTM L-100K Ultracentrifuge,美国贝克曼库尔特商贸公司；
[0150] 激光粒度测定仪及Zeta电位分析仪：PSA NANO2590，英国马尔文公司；
[0151] CO2细胞培养箱：HERACELL 150i，美国赛默飞世尔科技公司；
[0152] 紫外分光光度计：UV-9600，北京北分瑞利分析仪器有限公司；
[0154] 实施例一
[0155] 制备一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，步骤如下：
[0156] 1.马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(MAL-PEG-PCL)的合成和表征
[0157] 1.1合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(MAL-PEG-PCL)，步骤如下：
[0158] MAL-PEG-PCL的合成路线见图1。采用开环聚合法，分别称取经干燥处理的1g MAL-PEG和0.4mlε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，加入20 微升辛酸亚锡，溶于10ml甲苯中，反复抽真空充氮气5次后，使上述反应物在氮气环境中，于68℃油浴加热磁力搅拌下，发生开环聚合反应，经72小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到 MAL-PEG-PCL粗产物。将所述粗产物在68℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入2ml二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4℃下静置，使产物沉淀，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。重复上述操作：将其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于-20℃保存，备用。
[0159] 1.2对马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯进行下述表征
[0160] 1.2.1红外光谱表征
[0162] 1.2.2核磁共振氢谱表征
[0164] 2.制备VEGF165-磷脂复合物，步骤如下：
[0165] 称取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成5mg/ml的磷脂/ 叔丁醇溶液，充分吹打混匀，使磷脂完全溶解。将VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165浓度为1μg/ml。最后将1ml磷脂/叔丁醇溶液与1ml VEGF165水溶液混合，充分吹打混匀，在冷冻干燥机-56℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，封口密封于-20℃保存。
[0166] 按照上述VEGF165-磷脂复合物的制备方法制备空白磷脂复合物，区别仅在于：空白磷脂复合物不含VEGF165。
[0167] 3.可控释放生长因子VEGF165的纳米材料的制备和表征
[0168] 3.1制备可控释VEGF165的PCL纳米材料，步骤如下：
[0169] 复合纳米材料的制备路线如图1所示，采用乳化溶剂挥发法制备经 MAL-PEG-PCL修饰的载VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米材料。首先按下述步骤制备O/W型乳剂：取5mg上述冻干的VEGF165-磷脂复合物、20mg PCL、 4mg MAL-PEG-PCL、1ml二氯甲烷混合，配制成溶液，作为油相，取6ml 2 ％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作为水相，将油相加入水相后立即超声处理，超声功率为50W，时间1min(开5s，关5s)。然后于常温下，在700rpm 转速下磁力搅拌4.5小时以挥去二氯甲烷，滴加30微升1wt％的Triton X-100 溶液，再在相同转速下搅拌30分钟以破坏未被载入PCL纳米粒的磷脂胶团，最终制得纳米粒混悬液。
[0170] 按照上述相同的乳化溶剂挥发法制备未载VEGF165的PCL纳米粒(未载VEGF165组)，区别仅在于，用空白磷脂复合物替换所述VEGF165-磷脂复合物。
[0171] 3.2对可控释VEGF165的PCL纳米材料进行下述表征
[0172] 3.2.1透射电子显微镜观察
[0174] 3.2.2粒径及分布和Zeta电位
[0175] 取4ml纳米粒混悬液于激光粒度测定仪和Zeta电位分析仪上测粒径和 Zeta电位。
[0176] 3.2.3纳米粒的包封率
[0177] 将纳米粒溶于二甲基亚砜溶液中，破坏其结构，测定其中总的VEGF165 含量(m0)。另外，将纳米粒混悬液经低温超速离心(32000rpm，20min，4℃)，取上清液，测定游离VEGF165的含量(m1)。以包封VEGF165量占总VEGF165 量的百分率计算包封率。VEGF165的含量采用酶联免疫吸附(ELISA)法，用血管内皮生长因子165(VEGF165)试剂盒测定。
[0178] VEGF165包封率＝(m0-m1)/m0×100％
[0179] 3.2.4纳米粒的体外释放
[0180] 取6ml纳米粒混悬液经低温超速离心(32000rpm，20min，4℃)后，用5 ml磷酸盐缓冲液于试管中重新分散，封口后放置于37℃恒温水浴振荡器中，以75rpm匀速持续振荡，分别于6h、12h、24h、2d、3d、5d、7d等时间点将5ml含纳米粒的分散液超速离心(32000rpm，20min，4℃)，取尽上清液，再用5ml磷酸盐缓冲液重新分散纳米粒沉淀，封口后再放置于37℃恒温水浴振荡器以75rpm匀速持续振荡，再于下一时间点将5ml含纳米粒的分散液进行超速离心，取尽上清液，直至所有时间点取完，用酶联免疫吸附(ELISA) 法分别测定以上上清液中VEGF165的含量，计算VEGF165的累计释放百分数。
[0181] 3.2.5测定纳米材料混悬液的细胞毒性
[0182] 为观察复合纳米混悬液是否影响细胞的增殖能力，采用CCK-8法检测复合纳米溶液的细胞毒性，从而评价其作为药物载体的安全性。步骤如下：
[0183] 针对载VEGF165组与未载VEGF165组，各取1ml纳米粒混悬液，用5ml 磷酸盐缓冲液稀释，经孔径0.22μm无菌滤器除菌后备用，单纯磷酸盐缓冲液组为阴性对照。将生长旺盛的人脐静脉内皮细胞用含10％重量含量的胎牛血清(FBS)的RPMI1640细胞培养液制备成5×103/ml的细胞悬液备用；参照 TransDetectTM Cell Counting Kit说明书，在96孔细胞培养板上每孔种植100μl 上述细胞，每个实验条件设置6个复孔，将培养板置于37℃、5％CO2体积含量的培养箱内预培养，待12小时后细胞贴壁良好，向培养板相应孔中分别加入10μl的载VEGF165组纳米粒、未载VEGF165组纳米粒和对照组(磷酸盐缓冲液)；将培养板在培养箱孵育24小时，小心向每孔加入11μl CCK-8溶液，再将培养板在培养箱内孵育2h后，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光度值，计算细胞相对增值率(RGR)：
[0184] RGR(％)＝实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值
[0185] 3.2.6纳米粒的稳定性评价
[0186] 采用不同离子强度的硫酸钠溶液来评价纳米系统的稳定性，以模仿血液循环中纳米粒所处的电解质微环境。在37℃下，将100μl纳米粒混悬液(20mg/ml) 加入5ml不同浓度的硫酸钠溶液中，所述硫酸钠溶液的浓度分别为0.1mol/L、 0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L，静置10分钟后，用紫外分光光度计于560nm分别测定复合纳米粒溶液的吸光度，进而评价复合纳米粒溶液的稳定性。
[0187] 4.去细胞瓣的制备及巯基化
[0188] (1)获取猪主动脉瓣，步骤如下：
[0189] 清洁条件下获取猪心脏，4℃生理盐水冲洗心脏以去除血污，暴露主动脉根部，剪断附近的心肌、腱索等并取出含瓣叶的主动脉根部，4℃生理盐水反复冲洗，置于4℃含抗生素(头孢唑林钠1g/L，庆大霉素0.4g/L，两性霉素 B0.5g/L)的生理盐水中带回实验室。在实验室环境下裁剪主动脉瓣叶，再给予4℃磷酸盐缓冲液反复冲洗，置于4℃含抗生素(青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml))的高糖DMEM培养基中培养12小时。
[0190] (2)制备去细胞瓣，步骤如下：
[0191] 参照参考文献(董念国等,组织工程瓣膜天然支架去细胞方法的比较.中华实验外科杂志,2005.22(3):第377页.)中所述方法制备去细胞瓣，步骤如下：
[0192] 将获取的瓣膜置于37℃含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸盐缓冲液中12小时，再置于4℃含1％Triton X-100的去细胞液中48小时，磷酸盐缓冲液冲洗后，置于37℃含核酸酶(脱氧核糖核酸酶200mg/L、核糖核酸酶 20mg/L)的磷酸盐缓冲液处理1小时，最后用磷酸盐缓冲液清洗,去细胞瓣完成制备。
[0193] (3)制备巯基化去细胞瓣，步骤如下：
[0194] 将制备好的去细胞瓣与20ml巯基化试剂N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(2mg/ml，pH 7.4)于37℃下反应2小时，磷酸盐缓冲液洗脱终止反应后，加入20ml的0.5mol/L盐酸羟胺进行反应，对乙酰化巯基进行保护，用磷酸盐缓冲液洗去残余盐酸羟胺，制得巯基化的去细胞瓣。
[0195] 5.可控VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜的制备和表征
[0196] 5.1制备可控VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜，步骤如下：
[0197] 将巯基化的去细胞瓣浸没于稀释2倍的经MAL-PEG-PCL修饰的载 VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米粒混悬液中，在37℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡8小时，反应在避光条件下进行，之后用磷酸盐缓冲液洗去未结合到瓣膜上的纳米粒，共3次，每次5分钟，最终制得可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜(简称载VEGF165组复合瓣膜)。未载VEGF165的PCL 纳米粒修饰的复合瓣膜同样采取本方法制得(简称未载VEGF165组复合瓣膜)。
[0198] 5.2对可控释放VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜进行下述表征
[0199] 5.2.1扫描电子显微镜观察
[0201] 5.2.2红外光谱表征
[0202] 将载VEGF165组复合瓣膜、未载VEGF165组复合瓣膜和单纯去细胞瓣平铺于表面皿内，在冷冻干燥机-56℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时。制备出各组干燥的瓣膜。以溴化钾为分散剂，撕取各组干燥的瓣膜于室温干燥条件下研磨成粉末，取适量各组样品压片，于400-4000cm-1扫描，测定其红外吸收光谱。
[0203] 上述表征的结果如下：
[0204] 1.MAL-PEG-PCL的表征结果
[0205] 红外光谱如图2所示，图2中，A为原料MAL-PEG的红外光谱，其中 1710.31cm-1为MAL-PEG马来酰亚胺C＝O伸缩振动峰。图2中，B为合成的 MAL-PEG-PCL共聚物的红外光谱，与图2-A相比，C＝O伸缩振动峰位移至 1732.04cm-1，而且强度明显增大，其原因为合成产物MAL-PEG-PCL中C＝O 除马来酰亚胺的C＝O外，还增加了PCL中的C＝O。同时，图2-B中1111.65cm-1处为MAL-PEG链段C-O-C的伸缩振动峰，2800cm-1～3000cm-1处的C-H伸缩振动峰明显变宽，主要是因为合成产物MAL-PEG-PCL中PCL部分含有较多的亚甲基。证实合成的共聚物由MAL-PEG链段和PCL链段组成。
[0206] MAL-PEG-PCL的核磁共振氢谱如图3所示，MAL-PEG-PCL中PCL段亚甲基的质子峰(δ＝1.38、1.65、2.31和4.06ppm)以及MAL-PEG段亚甲基的质子峰(主要为δ＝3.64ppm)均出现，比较弱的4.23ppm峰与MAL-PEG和 PCL连接处的-OCH2CH2O-有关，6.74ppm峰为马来酰亚胺乙烯基的质子峰，表明合成的产物是MAL-PEG-PCL共聚物。其中PCL链段的平均分子量可由 PCL链段中δ2.31ppm和MAL-PEG链段中δ3.64ppm处质子峰的积分估算，从而估计所合成MAL-PEG-PCL共聚物的平均分子量为5000。
[0207] 综上所述，经红外光谱和核磁共振氢谱确证，用本发明所述方法合成的共聚物为MAL-PEG-PCL。
[0208] 2.可控释VEGF165的PCL纳米材料的表征
[0209] 2.1透射电子显微镜观察结果
[0210] 采用透射电子显微镜观察所制备的复合纳米粒，结果如图4所示，所制备的纳米粒呈球形，表面光滑，形态规整，未见明显的黏附和聚集现象，粒子大小分布均匀，粒径范围为50-100nm。
[0211] 2.2粒径及分布和Zeta电位
[0212] 用激光粒度测定仪，湿法进样，以数量为基准，测定所制备的复合纳米粒平均粒径为85.8nm，粒径多分散指数PDI为0.06，如图5所示，Zeta电位为 -10.5mV，如图6所示。
[0213] 2.3纳米粒的包封率
[0214] 以包封VEGF165量占总VEGF165量的百分率计算包封率。VEGF165的含量采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定。经测定得出所制备复合纳米粒的包封率达82％。
[0215] 2.4纳米粒的体外释放
[0216] 图7为复合纳米粒的体外累计释放曲线，在大约1周的时间内，纳米粒对 VEGF165释放速度较缓慢，未见明显的突释效应，达到了缓慢控制释放的效果，在48h时，释放率可达57％。
[0217] 2.5CCK-8法检测复合纳米溶液的细胞毒性：
[0218] 载VEGF165组纳米粒的相对增值率为112.59±8.73％，细胞毒性级别为0 级，未载VEGF165组纳米粒的相对增值率为97.44±5.69％，细胞毒性级别为 0级。由此证实，本发明所制备的纳米控释复合物对细胞无毒性作用。载 VEGF165组纳米粒，不但没有细胞毒性，反而可促进细胞的增殖，可能由于所包载VEGF165的释放，使得培养基中VEGF165的浓度升高，从而促进细胞的增殖。
[0219] 2.6纳米粒的稳定性评价
[0220] 纳米粒在血液循环中所处的微环境十分复杂，如有大量的血细胞、各种电解质等等，其中电解质的浓度直接影响纳米粒的稳定性。纳米粒的稳定性可通过其在不同电解质浓度下的絮凝程度来评价。本发明采用不同离子强度的硫酸钠溶液来评价纳米系统的稳定性，以模仿血液循环中纳米粒所处的电解质微环境。
[0221] 图8为纳米粒在不同浓度硫酸钠溶液中的吸光度，可以看出，纳米粒的临界絮凝点约为0.3mol/L，高于人体血液中的电解质浓度(主要成分为0.14 mol/L Na+和0.10mol/L Cl-)，推断纳米粒在血液环境中可以稳定存在。
[0222] 3.可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜的表征
[0223] 3.1扫描电子显微镜观察
[0224] 扫描电子显微镜观察复合瓣膜表面纳米粒的修饰情况，如图9-a和9-b所示。图9-a为经纳米粒修饰的复合瓣膜表面情况，可知，延瓣膜纤维走形方向，纤维表面连接一层纳米粒颗粒，排列整齐。图9-b为正常的去细胞瓣，在扫描电子显微镜下仅见瓣膜纤维走形，纤维上未见有附着物。说明纳米粒确实连接到去细胞瓣上。
[0225] 3.2红外光谱表征
[0226] 图10为载VEGF165组复合瓣膜(图C)、未载VEGF165组复合瓣膜(图 B)和单纯去细胞瓣(图A)的红外吸收光谱图。从图中可以看出，三者大部分伸缩振动峰是一致的，但在图10-C和图10-B中出现1731.15cm-1的峰，推断为纳米粒组成成分中的C＝O伸缩振动峰，而在图10-A中未出现，说明复合瓣膜表面有接有纳米粒的材料，间接说明纳米粒连接到了去细胞瓣上。
[0227] 实施例二
[0228] 制备一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，步骤如下：
[0229] 1.合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(MAL-PEG-PCL)，步骤如下：
[0230] MAL-PEG-PCL的合成路线见图1。采用开环聚合法，分别称取经干燥处理的1g MAL-PEG和0.8mlε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，加入20 微升辛酸亚锡，溶于10ml甲苯中，反复抽真空充氮气5次后，使上述反应物在氮气环境中，于68℃油浴加热磁力搅拌下，发生开环聚合反应，经72小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到 MAL-PEG-PCL粗产物。将所述粗产物在68℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入2ml二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4℃下静置，使产物沉淀，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。反复上述操作：将其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于-20℃保存，备用。
[0231] 2.制备VEGF165-磷脂复合物，步骤如下：
[0232] 称取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成6mg/ml的磷脂/ 叔丁醇溶液，充分吹打混匀，使磷脂完全溶解。将VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165浓度为3μg/ml。最后将1ml磷脂/叔丁醇溶液与1ml VEGF165水溶液混合，充分吹打混匀，在冷冻干燥机-50℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，封口密封于-20℃保存。
[0233] 3.制备可控释放VEGF165的PCL纳米材料，步骤如下：
[0234] 采用乳化溶剂挥发法制备经MAL-PEG-PCL修饰的载VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米材料。首先按下述步骤制备O/W型乳剂：取6mg上述冻干的 VEGF165-磷脂复合物、25mg PCL、4mg MAL-PEG-PCL、1ml二氯甲烷混合，配制成溶液，作为油相，取8ml 4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作为水相，将油相加入水相后立即超声处理，超声功率为50W，时间1min(开5s，关5s)。然后于常温下，在700rpm转速下磁力搅拌4.5小时以挥去二氯甲烷，滴加30微升1wt％的Triton X-100溶液，再在相同转速下搅拌30分钟以破坏未被载入PCL纳米粒的磷脂胶团，最终制得纳米粒混悬液。
[0235] 4.按照实施例一相同的方法制备可控释放VEGF165的PCL纳米材料修饰的复合瓣膜。
[0236] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的MAL-PEG-PCL进行核磁共振氢谱表征可得，本实施例制备得到的MAL-PEG-PCL的平均分子量为 7000。
[0237] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料进行粒径分布表征可得，可控释放VEGF165的PCL纳米材料的平均粒径为90nm。
[0238] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料的包封率为76％。
[0239] 用实施例一相同的对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL纳米材料进行体外释放的表征可得，在大约1周内，纳米材料对VEGF165的释放速度较缓慢，未见明显的突释效应。在48h后，释放率可达52％。
[0240] 实施例三
[0241] 制备一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，步骤如下：
[0242] 1.合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(MAL-PEG-PCL)，步骤如下：
[0243] MAL-PEG-PCL的合成路线见图1。采用开环聚合法，分别称取经干燥处理的2g MAL-PEG和1.5mlε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，加入20 微升辛酸亚锡，溶于10ml甲苯中，反复抽真空充氮气5次后，使上述反应物在氮气环境中，于65℃油浴加热磁力搅拌下，发生开环聚合反应，经72小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到 MAL-PEG-PCL粗产物。将所述粗产物在65℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入2ml二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4℃下静置，使产物沉淀，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。反复上述操作：将其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于-20℃保存，备用。
[0244] 2.制备VEGF165-磷脂复合物，步骤如下：
[0245] 称取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成10mg/ml的磷脂/ 叔丁醇溶液，充分吹打混匀，使磷脂完全溶解。将VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165浓度为5μg/ml。最后将1ml磷脂/叔丁醇溶液与1ml VEGF165水溶液混合，充分吹打混匀，在冷冻干燥机-60℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，封口密封于-20℃保存。
[0246] 3.制备可控释放VEGF165的PCL纳米材料，步骤如下：
[0247] 采用乳化溶剂挥发法制备经MAL-PEG-PCL修饰的载VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米材料。首先按下述步骤制备O/W型乳剂：取10mg上述冻干的 VEGF165-磷脂复合物、30mg PCL、6mg MAL-PEG-PCL、1ml二氯甲烷混合，配制成溶液，作为油相，取6ml 2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作为水相，将油相加入水相后立即超声处理，超声功率为50W，时间2min(开10s，关10s)。然后于常温下，在700rpm转速下磁力搅拌4.5小时以挥去二氯甲烷，滴加30微升1wt％的Triton X-100溶液，再在相同转速下搅拌30分钟以破坏未被载入PCL纳米粒的磷脂胶团，最终制得纳米粒混悬液。
[0248] 4.按照实施例一相同的方法制备巯基化去细胞瓣。
[0249] 5.制备可控VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜，步骤如下：
[0250] 将巯基化的去细胞瓣浸没于稀释2倍的经MAL-PEG-PCL修饰的载 VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米粒混悬液中，在40℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡8小时,反应在避光条件下进行，之后用磷酸盐缓冲液洗去未结合到瓣膜上的纳米粒，共3次，每次5分钟，最终制得可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜。
[0251] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料进行粒径分布表征可得，可控释放VEGF165的PCL纳米材料的平均粒径为100nm。
[0252] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料的包封率为83％。
[0253] 用实施例一相同的对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL纳米材料进行体外释放的表征可得，在大约1周内，纳米材料对VEGF165的释放速度较缓慢，未见明显的突释效应。在48h后，释放率可达50％。
[0254] 实施例四
[0255] 制备一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，步骤如下：
[0256] 1.合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(MAL-PEG-PCL)，步骤如下：
[0257] MAL-PEG-PCL的合成路线见图1。采用开环聚合法，分别称取经干燥处理的5g MAL-PEG和2mlε-CL置于干燥的25ml三口圆底烧瓶中，加入20微升辛酸亚锡，溶于10ml甲苯中，反复抽真空充氮气5次后，使上述反应物在氮气环境中，于70℃油浴加热磁力搅拌下，发生开环聚合反应，经72小时反应后，关闭油浴锅电源，待反应系统冷却至室温关闭氮气，得到MAL-PEG-PCL 粗产物。将所述粗产物在68℃条件下减压旋转蒸发2小时以除去产物中剩余的甲苯，冷却至室温后，加入2ml二氯甲烷使反应产物完全溶解，之后加入 40ml乙醚，在4℃下静置，使产物沉淀，之后在减压条件下抽滤，得白色沉淀物。反复上述操作：将其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚对其进行沉淀，4℃静置，减压条件下抽滤，得到白色产物，于-20℃保存，备用。
[0258] 2.制备VEGF165-磷脂复合物，步骤如下：
[0259] 称取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成10mg/ml的磷脂/ 叔丁醇溶液，充分吹打混匀，使磷脂完全溶解。将VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165浓度为10μg/ml。最后将1ml磷脂/叔丁醇溶液与1ml VEGF165 水溶液混合，充分吹打混匀，在冷冻干燥机-60℃条件下预冻3小时，再经真空干燥20小时，封口密封于-20℃保存。
[0260] 3.制备可控释放VEGF165的PCL纳米材料，步骤如下：
[0261] 采用乳化溶剂挥发法制备经MAL-PEG-PCL修饰的载VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米材料。首先按下述步骤制备O/W型乳剂：取10mg上述冻干的 VEGF165-磷脂复合物、40mg PCL、10mg MAL-PEG-PCL、2ml二氯甲烷混合，配制成溶液，作为油相，取12ml 2％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作为水相，将油相加入水相后立即超声处理，超声功率为30W，时间1min(开 5s，关5s)。然后于常温下，在700rpm转速下磁力搅拌4.5小时以挥去二氯甲烷，滴加30微升1wt％的Triton X-100溶液，再在相同转速下搅拌30分钟以破坏未被载入PCL纳米粒的磷脂胶团，最终制得纳米粒混悬液。
[0262] 4.按照实施例一相同的步骤制得巯基化的去细胞瓣。
[0263] 5.制备可控VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜，步骤如下：
[0264] 将巯基化的去细胞瓣浸没于稀释2倍的经MAL-PEG-PCL修饰的载 VEGF165-磷脂复合物的PCL纳米粒混悬液中，在35℃、75rpm恒温振荡器上持续振荡8小时，反应在避光条件下进行，之后用磷酸盐缓冲液洗去未结合到瓣膜上的纳米粒，共3次，每次5分钟，最终制得可控释VEGF165的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜。
[0265] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料进行粒径分布表征可得，可控释放VEGF165的PCL纳米材料的平均粒径为220nm。
[0266] 用实施例一相同的方法对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL 纳米材料的包封率为85％。
[0267] 用实施例一相同的对本实施例制备得到的可控释放VEGF165的PCL纳米材料进行体外释放的表征可得，在大约1周内，纳米材料对VEGF165的释放速度较缓慢，未见明显的突释效应。在48h后，释放率可达51％。
[0268] 对比例载香豆素-6的PCL纳米粒修饰的复合瓣膜的制备和表征
[0269] 为了从不同的角度验证本发明制备方法的可行性，应用荧光分子香豆素-6 代替VEGF165-磷脂复合物，以同样的方法制备载香豆素-6的经MAL-PEG-PCL修饰的PCL纳米粒，并通过MAL-PEG-PCL末端马来酰亚胺 中不饱和的碳碳双键与巯基化的去细胞瓣发生迈克尔加成反应，从而将纳米粒 连接到去细胞瓣上。最后通过荧光显微镜观察纳米粒是否连接到去细胞瓣上。
[0270] 荧光分子香豆素-6，几乎不溶于水，亲油性强，可代替VEGF165-磷脂复合物，以从光学角度证实本方法的可行性。
[0271] 为了证实纳米粒是通过MAL-PEG末端马来酰亚胺中不饱和的碳碳双键与去细胞瓣上的巯基发生迈克尔加成反应，而连接到去细胞瓣上，特设置对照组：将制备复合瓣膜的MAL-PEG-PCL换为M-PEG-PCL。M-PEG-PCL上PEG 端的基团为甲氧基，不是马来酰亚胺基团。甲氧基不具有碳碳双键，不会与巯基发生迈克尔加成反应。
[0272] 1.M-PEG-PCL的合成
[0273] M-PEG-PCL的合成同实施例一中MAL-PEG-PCL的合成，将原料 MAL-PEG换成M-PEG。
[0274] 2.载香豆素-6的PCL纳米粒的制备
[0275] 采用乳化溶剂挥发法分别制备经MAL-PEG-PCL和M-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的PCL纳米粒，具体的制备方法同实施例一中载VEGF165-磷脂复合物纳米粒的制备。
[0276] 3.载香豆素-6的纳米粒共价修饰去细胞瓣膜的制备和表征
[0277] 分别将巯基化的去细胞瓣浸没于稀释2倍的经MAL-PEG-PCL和 M-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的PCL纳米粒混悬液中，余下具体的方法同实施例一中复合瓣膜的制备。制备结束后分别将2组复合瓣膜做冰冻切片，甘油缓冲液封片后，于荧光显微镜下观察纳米粒共价修饰去细胞瓣的情况，以确定纳米粒是否成功连接到去细胞瓣上。
[0278] 最终荧光显微镜下所见如图11-a和图11-b所示。图中，图11-a为经 MAL-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的复合瓣膜荧光显微镜图，可见瓣膜表面有非常明亮的绿色荧光，瓣膜内部的荧光为非特异性的吸附，图中，图11-b为无马来酰亚胺基团的M-PEG-PCL修饰的载香豆素-6的复合瓣膜荧光显微镜图，瓣膜表面未见相对于内部更为明显的荧光。表明经MAL-PEG-PCL修饰的纳米粒可以通过迈克尔加成反应连接到去细胞瓣，而无马来酰亚胺基团的M-PEG-PCL修饰的纳米粒不能连接到去细胞瓣的表面。
[0279] 综上所述，本发明通过扫描电子显微镜观察、红外光谱检测及荧光分子替代实验均显示纳米粒子共价结合到巯基化的去细胞瓣膜上，成功制备出具有可控释放VEGF的新型去细胞瓣膜。由此可知，本发明所制备的载血管内皮生长因子的纳米材料对VEGF165包封率高，粒径均匀，稳定性好。本发明所制备的可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，可将外源性生物信号VEGF 引入到去细胞瓣支架材料上，加速去细胞瓣的内皮化，从而改善瓣膜支架材料的生物学性能，具有广阔的应用前景。
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