[0001] 本
发明涉及新的
水溶性纳米晶体及其制备方法。本发明还涉及此类纳米晶体的用途，包括但不限于多种分析和
生物医学应用，例如
生物材料或过程的检测和/或显色，例如在体外或体内的组织或细胞成像中。本发明还涉及包含此类纳米晶体的组合物和
试剂盒，其可用于分析物例如核酸、
蛋白质或其他生物分子的检测。
[0002] 因其在 发光设备(Colvin等 人，Nature370，354-357，1994；Tessler等 人，Science295，1506-1508，2002)、激光(Klimov等人，Science290，314-317，2000)、
太阳能电池(Huynh等人，Science295，2425-2427，2002)或生物化学研究领域例如细胞生物学的
荧光生物标记中的应用，
半导体纳米晶体(
量子点)已受到重要的
基础和技术方面的关注。见例如Bruchez等人，Science，第281卷，2013-2015页，2001；Chan&Nie，Science，281卷，2016-2018页，2001；美国
专利6,207,392，概述于Klarreich，Nature，第43卷，
450-452页，2001；另外见Mitchell，Nature Biotechnology；1013-1017页，2001，和美国专利6,423,551、6,306,610，和6,326,144。
[0003] 用于生物学测定的灵敏的非同位素检测系统的发展已对许多研究和诊断领域，例如在DNA测序、临床诊断试验及基础的细胞和分子生物学方案中产生了显著影响。目前的非同位素检测方法主要是基于经历
颜色变化的或荧光的、发光的有机报告分子。分子的荧
光标记是生物学中的标准技术。这些标记常常是有机染料，它们引起宽
光谱特征、短寿命、
光漂白和对细胞的潜在毒性等常见问题。最近出现的量子点技术为利用无机
复合体或粒子进行荧光标记的开发开创了新的时代。这些材料提供了超越有机染料的实质优势，包括大的Stocks改变、较长的发射
半衰期、窄的发射峰和最小的光漂白(参照上述引用的参考文献)。
[0004] 在过去的十年中，在多种半导体纳米晶体的合成和表征方面已取得很大进步。近期的进展已经引起了相对单分散性量子点的大规模制备(Murray等人，J.Am.Chem.Soc，115，8706-15，1993；Bowen Katari 等 人，J.Phys.Chem.98，4109-17，1994；Hines 等 人，J.Phys.Chem.100，468-71，1996；Dabbousi等人，J.Phys.Chem.101，9463-9475，1997)。
[0005] 发光量子点技术的进一步发展促使了量子点的荧光效率和
稳定性的提高。量子点的显著发光特性是由量子大小限制引起的，当金属和半导体核心粒子小于它们的激发波尔半径(大约1至5nm)时会产生该特性(Alivisatos，Science，271，933-37，1996；Alivistos，J.Phys.Chem.100，13226-39，1996；Brus，Appl Phys.，A53，465-74，1991；
Wilson等人，Science，262，1242-46，1993)。最近的工作表明，通过用较高带隙的无机材料
外壳封端大小可调的较小带隙的核心粒子可以获得改良的发光。例如，用ZnS层
钝化的CdSe量子点在室温下强烈发光，且通过改变粒度可将其发射
波长从蓝
色调整至红色。而且，ZnS封端层使表面非
辐射性重组位点钝化并导致了量子点更高的稳定性(Dabbousi等人，J.Phys.Chem.B101，9463-75，1997.Kortan等人，J.Am.Chem.Soc.112，1327-1332，1990)。
[0006] 尽管发光量子点技术取得了进步，但是常规封端的发光量子点因其为非水溶性而并不适于生物学应用。
[0007] 为克服此问题，利用水溶性的部分取代了量子点的有机
钝化层。然而，由于电荷载体隧道，所获得的衍生量子点与原始的量子点相比发光要弱一些。(见，例如，Zhong等人，J.Am.Chem.Soc.125，8589，2003)。短链硫醇例如2-巯基
乙醇、1-硫代-甘油也已在水溶性CdTe纳米晶体的制备中用作稳定剂(Rogach等人，Ber.Bunsenges.Phys.Chem.100，1772，1996；Rajh等人，J.Phys.Chem.97，11999，1993)。在另一方法中描述了将脱
氧核糖核酸(DNA)用作水溶性封端化合物(Coffer等人，Nanotechnology3，69，1992)。在所有这些系统中，包被的纳米晶体并不稳定且
光致发光特性随时间降低。
[0008] 在进一步的研究中，Spanhel等人公开了Cd(OH)2-封端的CdS溶胶(Spanhel等人，J.Am.Chem.Soc.109，5649，1987)。然而，胶体纳米晶体只能在非常窄的pH范围内(pH8-10)进行制备且只能在pH高于10时才能显示出窄的荧光带。此类pH依赖性大大地限制了材料的有用性，特别是，此类纳米晶体不适合在生物系统中使用。
[0009] 国际专利
申请WO 00/17656中公开了核心外壳纳米晶体，该纳米晶体分别由式SH(CH2)n-COOH和SH(CH2)n-SO3H的
羧酸或磺
酸化合物封端，从而赋予纳米晶体水溶性。类似地，PCT申请WO 00/29617和英国专利申请GB 2342651描述，为赋予其水溶性并适用于结合生物分子例如蛋白质或核酸，将
有机酸例如巯基乙酸或巯基十一酸附着于纳米晶体的表面。GB专利申请2342651还描述了使用三辛基膦作为封端材料，期望该材料能够赋予纳米晶体水溶性。
[0010] 国际专利申请WO 00/27365报告了使用二
氨基羧酸或氨基酸作为水溶解试剂。国际专利申请WO 00/17655公开了通过使用具有亲水部分和疏水部分的增溶(封端)试剂使得水溶性的纳米晶体。封端试剂通过疏水基团附着于纳米晶体上，而亲水基团例如羧酸或异丁烯酸基团提供水溶性。在另外的国际专利申请(WO 02/073155)中描述了水溶性半导体纳米晶体，其使用异羟肟酸、异羟肟酸的衍生物或多齿的络合剂例如乙二胺作为水增
溶剂。最后，国际专利申请PCT WO 00/58731公开了用于血细胞群体分析的纳米晶体，其中氨基衍生的多糖连接于纳米晶体上，所述多糖具有大约3000至大约3,000,000的分子量。
[0011] 然而，尽管有这些发展，仍需要可用于生物测定中检测目的的发光纳米晶体。在此方面，具有下述纳米晶体是有帮助的，该晶体以能够保持生物分子的生物活性的方式附着于生物分子上。此外，具有水溶性的半导体纳米晶体将是所希望的，所述晶体能够以谁信介质中稳定的、稳固的悬液或溶液形式制备和保存。最后，这些水溶性纳米晶体量子点应当能够进行高
量子效率的
能量发射，并具有窄的粒度。
[0012] 因此，本发明的目的即为提供满足上述需要的纳米晶体。
[0013] 此目的通过纳米晶体和生产纳米晶体的方法来实现，所述纳米晶体和方法具有各自独立
权利要求的特征。
[0014] 在一个实施方案中，此类纳米晶体是具有核心的水溶性纳米晶体，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中Ib副族、IIb副族、IIIb副族、IVb副族、Vb副族、VIb副族、VIIb副族、VIIIb副族、II主族、III主族或IV主族元素的金属M1，其中封端试剂附着于纳米晶体核心的表面，且其中封端试剂与水溶性主体分子形成主宾络合物。因此，在此实施方案中，本发明涉及一类新的具有纯金属核心的水溶性纳米晶体。
[0015] 在另一实施方案中，本发明的纳米晶体是具有核心的水溶性纳米晶体，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中Ib副族、IIb副族、IVb副族、Vb副族、VIb副族、VIIb副族、VIIIb IIB-VIB、IIIB-VB或IVB副族、II主族、III主族或IV主族元素的金属M1，至少一种选自元素周期系中V或VI主族元素的元素A，其中封端试剂附着于纳米晶体核心的表面，且其中封端试剂与水溶性主体分子形成主宾络合物。
[0016] 在本发明的另一实施方案中，此纳米晶体是具有核心的水溶性纳米晶体，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中IIB-VIB、IIIB-VB或IVB副族、II主族或III主族元素的金属M1，和至少一种选自元素周期系中V或VI主族元素的元素，并且，其中封端试剂附着于纳米晶体核心的表面，且其中封端试剂共价连接到水溶性主体分子上，且其中主体分子选自糖类、环状多胺、环状二肽、杯芳
烃和树状聚体。
[0017] 在另一实施方案中，纳米晶体是具有核心的水溶性纳米晶体，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中IIb、IIB-VIB、IIIB-VB或IVB副族、II主族或III主族元素的金属M1，和至少一种选自元素周期系中V或VI主族元素的元素A，并且，其中疏水性封端试剂附着于纳米晶体核心的表面，且其中疏水性封端试剂共价连接于冠醚上，且其中疏水试剂具有式(I)
[0018] HaX-Y-Z，
[0019] 其中
[0020] X是选自S、N、P或O＝P的端基，
[0021] A是0至3的整数，
[0023] Z是疏水性端基。
[0024] 因此，本发明是基于下述发现，即主体分子能够用于修饰(半导体)纳米晶体的表面属性，使得纳米晶体容易溶解于水中，且仍保持在水性介质中高的物理和化学稳定性。另外，在此已发现此类主体分子，例如但不限于，树状聚体、杯芳烃或糖类例如环糊精，一般具有相当大的疏水内部空腔(尽管本发明所用的主体分子也能具有相当的疏水空腔)，该空腔使主体分子能够接受宽范围的有机分子作为客体。因此，具有疏水(或亲水)空腔的主体分子适合与用于量子点表面修饰的疏水(或亲水)试剂形成主宾络合物。而且，此类主体分子还能与通常用于生物学探针连接的众多化合物(连接试剂)形成主宾络合物，从而为适用于多种生物学应用的发光纳米晶体的生物分子结合提供新颖巧妙的途径。另外，主体分子可以含有多种暴露于溶剂的可活化基团例如羟基或羧基。这些可活化基团也使目的生物分子与纳米晶体的共价结合变得容易，其中所述纳米晶体已与主体分子形成了主宾络合物。
[0025] 每种已知的纳米晶体均可用于本发明中。在元素A不存在的实施方案中，纳米晶体仅由金属例如金、
银、
铜(Ib副族)、
钛(IVb副族)、铽(IIIb副族)、钴、铂、铑、钌(VIIIb副族)、铅(IV主族)或其
合金组成。在此方面，应注意，如果在后面，本发明仅对含有抗衡元素A的纳米晶体进行举例说明，应该清楚由纯金属或金属合金组成的纳米晶体也可用于所有这些实施方案中。本发明中所使用的纳米晶体可以是众所周知的核心-外壳纳米晶体(量子点)例如由金属例如Zn、Cd、Hg(IIb副族)、Mg(II主族)、Mn(VIIb主族)、Ga、In、Al(III主族)、Fe、Co、Ni(VIIIb副族)、Cu、Ag或Au(Ib副族)形成的二元纳米晶体。纳米晶体可以是任何II-VI族的半导体纳米晶体，其中核心和/或外壳包括CdS、CdSe、CdTe、MgTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、HgS、HgSe或HgTe。纳米晶体也可以是任何III-V族的半导体纳米晶体，其中核心和/或外壳包括GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb、AIN、AIP、AIAs、AISb。可用于本发明的核心外壳纳米晶体的特定实例包括但不限于具有ZnS外壳的(CdSe)-纳米晶体((CdSe)-ZnS纳米晶体)或(CdS)-ZnS-纳米晶体。
[0026] 然而，本发明决不仅限于上述核心外壳纳米晶体的使用。例如，在另一实施方案中，被赋予水溶性的纳米晶体可以是由均匀
三元合金组成的纳米晶体，所述合金具有组成M11-xM2xA，其中a)当A代表PSE的VI主族的元素时，M1和M2独立地选自元素周期系(PSE)中IIb副族、VIIa副族、VIIIa副族、Ib副族或II主族的元素，或者b)当A代表PSE的(V)主族的元素时，M1和M2均选自PSE的(III)主族的元素。
[0027] 在另一实施方案中，可使用由均匀四元合金组成的纳米晶体。此类型的四元合金可以具有组成M11-xM2xAyB1-y，其中a)当A和B均代表PSE的VI主族的元素时，M1和M2独立地选自元素周期系(PSE)中IIb副族、VIIa副族、VIIIa副族、Ib副族或II主族的元素，或者b)当A和B均代表PSE的(V)主族的元素时，M1和M2独立地选自PSE的(III)主族的元素。
[0028] 此类型的均匀三元或四元纳米晶体的例子在Zhong等人，J.Am.Chem.Soc，2003125，8598-8594，Zhong等人，J.Am.Chem.Soc，2003125，13559-13553，和
国际申请WO
2004/054923中已有所描述。
[0029] 此类三元纳米晶体可通过包括形成二元纳米晶体M1A的方法来获得，通过[0030] i)以适于产生纳米晶体的形式加热含有元素M1的反应混合物至合适的
温度T1，在此温度下以适于产生纳米晶体的形式加入元素A，在适于形成所述二元纳米晶体M1A的温度下将反应混合物加热足够长的一段时间，然后使反应混合物冷却，以及
[0031] ii)再次加热反应混合物至合适的温度T2，不沉淀或分离所形成的二元纳米晶体M1A，在此温度下以适于产生纳米晶体的形式向反应混合物中添加足够量的元素M2，然后在适于形成所述三元纳米晶体M11-xM2xA的温度下将反应混合物加热足够长的一段时间，然后使反应混合物冷却至室温，并分离三元纳米晶体M11-xM2xA，形成二元纳米晶体M1A。
[0032] 在这些三元纳米晶体中，指数x具有0.0010.0010.8之间。
[0033] 在一些II-VI三元纳米晶体的实施方案中，其中所包含的元素M1和M2优选独立地选自由Zn、Cd和Hg组成的组。在这些三元合金中，PSE中VI族的元素A优选地选自由S、Se和Te组成的组。因此，这些元素M1、M2和A的所有组合均在本发明的范围内。在一些目前优选的实施方案中，所使用的纳米晶体具有组成ZnxCd1-xSe、ZnxCd1-xS、ZnxCd1-xTe、HgxCd1-xSe、HgxCd1-xTe、HgxCd1-xS、ZnxHg1-xSe、ZnxHg1-xTe和ZnxHg1-xS。
[0034] 在此方面，应当注意，M1和M2的名称在本申请全文可互换使用，例如在包含Cd和Hg的合金中，任何一种均可称作M1或M2。同样，对PSE中V或VI族元素的名称A和B可互换使用；因此在本发明的四元合金中Se或Te均可称作A或B。
[0035] 在一些优选的实施方案中，此处使用的三元纳米晶体具有组成ZnxCd1-xSe。此类纳米晶体是优选的，其中x具有0.10
[0036] 对于本发明的III-IV纳米晶体，元素M1和M2优选独立地选自Ga和铟。元素A优选地选自P、As和Sb。
[0037] 根据上述描述，只要其表面能够与封端试剂起反应，每一种纳米晶体(量子点)均可用于本发明，所述封端试剂具有对核心纳米晶体(的表面)具有亲和
力的(末端)基团。因此，封端试剂一般与纳米晶体表面形成共价键。对于核心-外壳纳米晶体，共价键通常在封端试剂和纳米晶体的外壳之间形成。对于如WO 2004/054923中所述的使用均匀三元或四元纳米晶体，共价键形成于均匀核心的表面和封端试剂之间。封端试剂可具有基本上亲水的或基本上疏水的性质，取决于，例如，主体分子内部空腔的疏水性(或亲水性)。在此方面，值得注意的是在术语“(基本上)疏水的分子”的意义中也包括这样一种分子，其除了疏水部分还可包含亲水部分，只要这些亲水部分不干扰由分子的疏水部分(即封端试剂)与具有疏水内部空腔的主体分子之间形成主宾络合物。同样，术语“(基本上)亲水的分子”包括这样的分子，其除了亲水部分还可包含疏水部分，只要这些疏水部分不干扰由分子的亲水部分(即封端试剂)与具有亲水内部空腔的主体分子之间形成主宾络合物。
[0038] 在一个实施方案中，用于“表面封端”的封端试剂具有式(I)
[0039] HAX-Y-Z，
[0040] 其中X是选自S、N、P或O＝P的端基，A是0至3的整数，Y是具有至少三个主链原子的部分，且Z是能够与合适的主体分子形成主客体包含络合物的疏水端基。
[0041] 一般，封端试剂的Y部分包含3至50个主链原子。Y部分主要包含任何适合为该试剂提供主要疏水特性的部分。可用于Y中的合适部分的例子包含烷基部分例如CH2-基，环烷基部分例如环己基，醚部分例如OCH2CH2-基，或者芳族部分例如苯环或
萘环，仅列举其中的少数。Y部分可为直链的、支链的，也可具有主链原子的取代。Z可以是-CH3基、苯基(-C6H5)、-SH基、羟基(OH)、酸性基团(例如，-SO3H、PO3H或者-COOH)、
碱性基团(例如，NH2或者NHR1，R＝CH3或-CH2-CH3)、卤素(-Cl、-Br、-I、-F)、-OH、-C≡CH、-CH＝CH2、三甲代甲
硅烷基(-Si(Me)3)、二茂
铁基、或金刚烷基，等等。
[0042] 在 一 些 实 施 方 案 中，化 合 物 例 如CH3(CH2)nCH2SH、CH3O(CH2CH2O)nCH2SH、HSCH2CH2CH2(SH)(CH2)nCH3、CH3(CH2)nCH2NH2、CH3O(CH2CH2O)nCH2NH2、P((CH2)nCH3)3、O＝P((CH2)nCH3)3用作封端试剂，其中n是30≥n≥6的整数。在其它实施方案中，n是30≥n≥8的整数。
[0043] 在这方面，应注意，那些提供更强的疏水性或基本的疏水特性的封端试剂的例子包括但不限于，1-巯基-6-苯基己烷(HS-(CH2)6-Ph)、1，16-二巯基-十六烷(HS-(CH2)16-SH)、18-巯基-十八胺(HS-(CH2)18-NH2)、三辛基膦、或6-巯基-己烷(HS-(CH2)5-CH3)。
[0044] 有代表性的提供更强疏水性或基本上亲水的特性的封端试剂包括但不限于，6-巯基-己酸(HS-(CH2)6-COOH)、16-巯基-十六酸(HS-(CH2)16-COOH)、18-巯基-十八胺(HS-(CH2)18-NH2)、6-巯基-己胺(HS-(CH2)6-NH2)或8-羟基-辛硫醇(HO-(CH2)8-SH)。
[0045] 任何主体分子均可用于本发明，只要其能够与封端试剂相作用并为封端的纳米晶体和主体分子之间所形成的络合物提供水溶性。一般，主体分子是水溶性化合物，其含有暴露于溶剂的极性基团例如羟基、羧基、磺酸基、
磷酸基、胺基、氨甲酰基等等。
[0046] 合适的主体分子的例子包括但不限于糖类、环状多胺、环肽、冠醚、树状聚体等等。
[0047] 可用作主体分子的环状多胺的例子包括四氮杂大环分子例如1，4，8，11-四氮杂环十四烷(也已知为cyclam)及其衍生物例如1，4，7，11-四氮杂环十四烷(isocyclam)、1-(2-氨基甲基)-1，4，8，11-四氮杂环十四烷(scorpiand)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-6，13-二羧酸，上述这些分子在Sroczynski和Grzej daziak，J.Incl.Phenom.Macrocyclic Chem.35，251-260，1999，或Bernhardt等人，J.Aus.Chem，56，679-684，2003中描述；六氮杂大环络合物(Hausmann，J.等人，Chemistry，A European Journal，2004，
10，1716；Piotrowski，T.等人，Electroanalysis，2000，12，1397)；八氮杂大环化合物(Kobayashi，K.等人，J.Am.Chem.Soc.1992，114，1105)。前面由Kobayashi K等人描述的八氮杂大环化合物也是适于容纳极性客体分子(例如，亲水性封端试剂)的化合物的例子。
也可以使用仅可在一定程度上是水溶性的环状多胺，例如5，5，7，12，14，14-六甲基-1，4，
8，11-四氮杂环十四烷(Me6cylcam)，并用提供极性基团例如羧酸基或磺酸基的取代基来修饰它。能够用作主体分子的大环状胺的其他例子是Odashima，K.在Journal of Inclusion phenomena and molecular recognition in chemistry，1998，32，165(见例如，其中化合物
24至26)中所描述的化合物。
[0048] 合适的杯芳烃的实例包括Dondoni等人在Chem.Eur.，J.3，1774，1997中所描述的4-叔-丁基杯[4]芳烃四乙酸四乙酯、四半乳糖基杯芳烃(Davis，AP.等人，Angew.Chem.Int.Edit.，1999，38，2979.)、八氨基酰胺间苯二酚[4]-芳烃(Kazakov，E.K.等人，Eur.J.Org.Chem.，2004，3323.)，4-磺酸杯[n]-芳烃(Yang，W.Z.，J.Pharm.Pharmacology，2004，56，703.)，磺化硫杂杯[4或6]芳烃(Kunsasgi-Mate S.，Tetrahedron Letters，
2004，45，1387)、Kobayashi等 人，J.Am.Chem.Soc.116，6081，1994和Yanagihara 等 人，J.Am.Chem.Soc.114，10307，1992中所描述的杯芳烃。
[0049] 本发明中可用作主体分子的环肽的例子包括但不限于Guo，W等人，Tetrahedron Letters，2002，43，5665或Peng Li等人，Current OrganicChemistry，2002，6中所述的具有杯芳烃的二环二肽。
[0050] 可用作主体分子的冠醚可具有任何环大小，例如，具有包含8、9、10、12、14、15、16、18或20原子的环系统，其中一些一般为杂原子例如O或S。此处所用的有代表性的冠醚包括但不限于，水溶性的8-冠-4化合物(其中4表示杂原子的数目)、9-冠-3化合物、
12-冠-4化合物、15-冠-5化合物、18-冠-6化合物和20-冠-8化合物(也参照图2E)。此类合适的冠醚的例子包括(18-冠-6)-2，3，11，12四羧酸或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，
4，7，10四羧酸，仅列举少数。
[0051] 原则上，每种提供亲水性或疏水性空腔(取决于所使用的是疏水性的还是亲水性的封端试剂)的水溶性树状聚体能够至少部分容纳本发明所使用的封端试剂。合适类别的树状聚体包括但不限于，聚丙烯亚胺树状聚体、聚酰氨基胺树状聚体、聚芳醚树状聚体、聚赖氨酸树状聚体、糖类树状聚体和硅树状聚体(例如，在Boas和Heegard，Chem.Soc.Rev.33，43-63，2004中有所综述)。
[0052] 在一个实施方案中，本发明的纳米晶体包含作为主体分子的糖类。该糖类主体分子可以是，但不限于，寡糖、
淀粉或环糊精分子(参照Davis和Wareham，Angew.Chem.Int.Edit.38，2979-2996，1999)。
[0053] 在实施方案中，主体分子中是寡糖，此寡糖主链中可含有2个，例如6个，至20个之间的
单体单元。这些寡聚体可以是直链的或支链的。合适的寡糖的例子包括但不限于1，3-(二亚甲基)苯二基-6，6’-氧-(2，2’-氧基二乙基)-二-(2，3，4-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷)、1，3-(二亚甲基)苯二基-6，6’-氧-(2，2’-氧基二乙基)-二-(2，3，4-三-氧-甲基-β-D-吡喃半乳糖苷)(Shizuma等人，J.Org.Chem.2002，67，4795)，环三-(1，2，3，4，5，6)-[α-D-吡喃
葡萄糖基-(1，2，3，4)-α-D-吡喃葡萄糖](Cescutti等人，CarbohydrateResearch，2000，329，647)、乙炔糖(Burli等人，Angew.Chem.Int.Edit.1997，36，1852)或环状呋喃寡糖(Takai等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，
1993，53.)。
[0054] 如果将淀粉用作主体分子，淀粉可具有大约1000至大约6000Da的分子量Mw。在一些实施方案中，淀粉具有大约4000Da≥Mw≥大约2000Da的分子量Mw。可使用的淀粉还包括直链淀粉，例如α-直链淀粉或β-直链淀粉。
[0055] 适于用作主体分子的环糊精的例子包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、三甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精和三甲基-γ-环糊精。
[0056] 根据上述公开内容，本发明还在一个实施方案中涉及制备水溶性纳米晶体的方法，该方法包括将具有核心的纳米晶体与封端试剂相互反应，从而使封端试剂粘附于纳米晶体核心的表面，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中IIB-VIB、IIIB-VB或IVB副族、II主族或III主族元素的金属M1，且(在使用二元纳米晶体的例子中)至少一种选自元素周期系中V或VI主族元素的元素，然后将所获得的纳米晶体与主体分子相
接触从而在试剂和水溶性主体分子之间形成主宾络合物。(封端)试剂可为亲水的或疏水的性质。在使用如上所述的纯金属纳米晶体或均匀三元或四元纳米晶体的情况中，可进行相同的反应来制备本发明的纳米晶体。
[0057] 此反应通常以两个单独的步骤来进行，分离在其表面携带封端试剂的纳米晶体。例如，在将纳米晶体与主体分子进行反应之前，可将已经与试剂例如三辛基膦、三辛基氧化膦或巯基十一酸反应的纳米晶体分离出来并贮存于合适的
有机溶剂(例如，氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃，仅列举其中少数)中任何所希望的时间。
[0058] 封端的纳米晶体与主体分子之间的主宾络合物在多种反应条件下均可容易地形成。例如，络合物形成可通过将纳米晶体溶液与主体分子的水溶液例如环糊精溶液捏合在一起，或者将纳米晶体与各自的水溶液一起回流来形成。对于后一方法，可在回流后将存在于有机溶剂中的纳米晶体转移至水溶液中一段延长的时间(例如见
实施例2)。络合物形成的其他可以性包括，将纳米晶体悬液在
环境温度下在主体分子溶液例如环糊精溶液或其它主体分子溶液中搅拌或温育一段合适的时间。一般的温育时间可为大约1至10天，然而，更短或更长的温育时间当然也可以使用。
[0059] 本发明还涉及制备水溶性纳米晶体的进一步的方法。此方法包括将具有核心的纳米晶体与(封端)试剂相反应，所述核心包含至少一种选自元素周期系(PSE)中Ib、IIb、IIB-VIB、IIIB-VB或IVB副族，II主族或III主族元素的金属M1，和至少一种选自元素周期系中V或VI主族元素的元素A。在此方法中，试剂共价连接到水溶性主体分子上，所述主体分子选自糖类、环状多胺、环二肽、杯芳烃和树状聚体。
[0060] 而且在此方法中，任何其端基对纳米晶体核心具有亲和力的封端试剂均可使用。这意味着封端试剂可为亲水性的或疏水性的试剂。此种亲水性或疏水性的封端试剂经其端基与纳米晶体反应，一般与纳米晶体表面形成共价键(参照，Masihul等人，J.Am.Chem.Soc.2002，43，1132)。在核心-外壳纳米晶体的例子中，共价键通常由纳米晶体的外壳和封端试剂间形成。在使用如WO2004/054923中所述的均匀三元或四元纳米晶体的例子中，共价键将在均匀核心表面和封端试剂之间形成。
[0061] 在此方法的一些实施方案中，使用具有式(II)HIX-Y-B的封端试剂，其中[0062] X是选自S、N、P或O＝P的端基，
[0063] I是1至3的整数，
[0064] Y是具有至少三个主链原子的部分，且
[0065] B是共价连接到封端试剂上的水溶性主体分子。
[0066] 在此方面，应注意，封端试剂与主体分子之间形成的共价键可为任何共价键，例如，C-C键、醚键(-O-)、硫醚键(-S-)、酯键、酰胺键或二酰亚胺键，仅列举少数可能性。共价键的类型通常取决于连接主体分子和封端试剂所采用的方法。例如，如果封端试剂是卤代烷且主体分子具有自由的(或活化的)羟基或巯羟基，则形成醚或硫醚键(例如见实施例3和5)。另外，如果封端试剂可为共价偶联提供胺基，且主体分子具有活性的羧基，则形成酯键。因此，为主体分子与封端试剂的共价连接选择活性基团的适当组合，属于本领域技术人员的知识范围。
[0067] 在此方面，还应注意，在与纳米晶体反应之前，封端试剂与主体分子之间不一定形成共价键(获得式(II)HIX-Y-B的化合物)。相反，封端试剂首先与纳米晶体反应，然后再在封端试剂与主体分子间形成共价键，这也在本发明的范围之内。
[0068] 在此方法的一个实施方案中，所用的封端试剂具有式
[0069] HAX-Y-Z
[0070] 其中X是选自S、N、P或O＝P的端基，A是0至3的整数，Y是具有至少三个主链原子的部分。一般，(封端)试剂的Y部分含有3至50个主链原子。Y部分可主要包含任何可为此试剂提供大部分疏水特性的合适部分。可用于Y部分中的合适部分的例子包含烷基部分例如CH2-基团、环烷基部分例如环己基、醚部分例如-OCH2CH2-基团、或芳族部分例如苯环或萘环，仅列举其中少数。Y可为直链的、支链的，也可具有主链原子的取代。Z可为能够共价偶联到主体分子上的任何官能团，例如-SH基、羟基(OH)、酸性基团(例如，-SO3H、PO3H或-COOH)、碱性基团(例如，NH2或者NHR1，R＝CH3或-CH2-CH3)、或卤素(-Cl、-Br、-I、-F)，仅列举少数例子。
[0071] 本发明进一步涉及结合到具有对给定分析物的结合亲和力的分子上的如此处所公开的纳米晶体。通过结合到对给定分析物具有结合亲和力的分子上，形成标志化合物或探针。在此探针中，本发明的纳米晶体用作标志或标签，其发出辐射，例如在
电磁波频谱的可见光或
近红外范围中的辐射，可用于给定分析物的检测。
[0072] 原则上，如果存在特定结合配偶体，每种分析物均可得以检测，所述配偶体能够至少一定程度地特异地结合到分析物上。分析物可为化学化合物例如药物(例如，或Ribavirin)，或生化分子例如蛋白质(例如，对肌
钙蛋白或细胞表面蛋白质特异的
抗体)或核酸分子。当利用对目的分析物例如Ribavirin的结合亲和力偶联到合适的分子上时(也称作分析物结合配偶体)，所获得的探针可用于例如荧光
免疫测定中，用来监测病人
血浆中的药物水平。在肌钙蛋白的例子中，其为心脏肌肉破坏的标志蛋白，因而通常对于心脏病发作，含有抗肌钙蛋白抗体和本发明的纳米晶体的缀合物可用于心脏病发作的诊断。在本发明的纳米晶体与
肿瘤相关细胞表面蛋白质的特异性抗体形成缀合物的情况下，该缀合物可用于肿瘤诊断或成像。另一例子是纳米晶体与链霉抗生物素蛋白的缀合物(参照图
6)。
[0073] 分析物也可为复杂的生物结构，包括但不限于病毒颗粒、
染色体或整个细胞。例如，如果分析物结合配偶体是附着于细胞膜的脂类，包含连接到此脂类的本发明的纳米晶体的缀合物可用于检测和显示整个细胞。为了例如细胞染色或细胞成像，发出可见光的纳米晶体是优选使用的。根据此公开的内容，需通过使用标志化合物来检测的分析物优选地为生物分子，所述标志化合物包含本发明的纳米颗粒，其结合到分析物结合配偶体上。
[0074] 因此，在进一步优选的实施方案中，对分析物具有结合亲和力的分子是蛋白质、肽、具有免疫原性半
抗原特征的化合物、核酸、糖类或有机分子。用作分析物结合配偶体的蛋白质可为例如，抗体、抗体片断、配体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或酶。有机分子的例子有化合物例如生物素、洋地黄毒苷、serotronine、叶酸衍生物等等。核酸可选自但不限于，DNA、RNA或PNA分子，10-50bp的短的寡核苷酸以及更长的核酸。
[0075] 当用于生物分子检测时，可将本发明的纳米晶体经主体分子的表面暴露基团而结合至具有结合活性的分子上。为此，表面暴露的基团例如胺基、羟基或羧基可以与连接试剂反应。此处所用的连接试剂指能够将本发明纳米晶体连接至具有此类结合亲和力的分子上的任何化合物。可用于将纳米晶体连接至分析物结合配偶体上的连接试剂的种类的例子有，双功能连接试剂例如双-
马来酰亚胺交联试剂、二硫化物交换交联试剂、和双-N-羟基琥珀酰亚胺酯交联试剂。合适的连接试剂的例子有N，N’-1，4-亚苯基二马来酰亚胺、二(马来酰亚胺基)乙烷、二硫代二(马来酰亚胺基)乙烷、1，11-双-马来酰亚胺基四乙二醇、C-6双(二硫化物)、C-9双(二硫化物)、
戊二酸二(琥珀酰亚胺酯)、辛二酸二(琥珀酰亚胺酯)、双-(琥珀酰亚胺基
琥珀酸)乙二醇酯。然而，如果使用本发明的纳米晶体，该晶体包含共价连接至水溶性主体分子上的封端试剂，那么主体分子可与合适的连接试剂形成缀合物(这可在主宾络合物形成之前或之后)，所述连接试剂偶联至具有期望的结合亲和力的
选定分子上。例如，如果将环糊精用作主体分子，那么连接试剂包括但不限于二茂铁衍生物、金刚烷化合物、聚氧乙烯化合物、芳族化合物，所有这些均具有合适的反应基团，用于与目的分子形成共价键(参照图6)。
[0076] 而且，本发明还涉及组合物，其含有至少一种如此处定义的水溶性纳米晶体。可将纳米晶体掺入塑料珠、
磁珠或乳胶珠中。而且，含有如此处所定义的纳米晶体的检测试剂盒也是本发明的一部分。
[0077] 通过下列非限制性实施例和
附图，进一步阐明本发明，其中：
[0078] 图1是本发明的水溶性纳米晶体的示意图，其中或者已将疏水试剂附着于纳米晶体核心的表面，该晶体与环糊精(CD)形成主宾络合物(图解a))，或者已附着了共价连接到水溶性主体分子上的疏水试剂(图解b))。
[0079] 图2显示了可在本发明中用作主体分子的代表性的环糊精(图2a)、环状多胺(图2b)、环(二)肽(图2c)、杯芳烃(图2d)、冠醚(图2e)、和树状聚体(图2f)结构的示意图。
[0080] 图3显示了TOP-封端的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体从氯仿(图3a)至水溶液中(图3b)的相转移，其是由γ-环糊精的加入引起的。
[0081] 图4显示了与γ-环糊精形成主宾络合物的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体的TEM显微照片。
[0082] 图5显示了本发明的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体的荧光强度，与形成主宾络合物之前的起始纳米晶体相比较。
[0083] 图6显示了pH对本发明CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体的光致发光的影响，所述晶体与γ-环糊精形成主宾络合物。
[0084] 图7显示了本发明的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体在50℃下的
热稳定性。
[0085] 图8显示了制备含有主宾络合物的本发明纳米晶体的示意图，其中主体分子具有自由的活性基团，可用于缀合物的制备(图8a)。图8还显示了配体的例子，其可与主体分子例如环糊精形成主宾络合物，以制备本发明的水溶性纳米基团的缀合物(图8b)，以及本发明的纳米晶体与链霉抗生物素蛋白的缀合物的示意图(图8c)。
[0086] 实施例1
[0087] TOPO封端的(CdSe)-ZnS纳米晶体(量子点，QD)的制备
[0088] 如下制备三辛基膦(TOP)/三辛基氧化膦(TOPO)封端的CdSe纳米晶体。将TOPO(30g)放入烧瓶中并在
真空下(～1Torr)180℃干燥1小时。然后将烧瓶充满氮气并加热至350℃。在惰性气氛干燥箱中制备下列注射溶液：CdMe2(200ml)、1M TOPSe溶液(4.0ml)和TOP(16ml)。将注射溶液彻底混和、装入
注射器、并从干燥箱中取出。
[0089] 除去反应中的热量，并以单次连续的注射，将反应混合物转移至剧烈搅拌的TOPO。对反应瓶进行加热并将温度逐渐升至260-280℃。在反应后，将反应瓶冷却至～60℃，并加入20ml丁醇以防止TOPO
凝固。大量过量甲醇的加入引起颗粒絮凝。通过离心将絮凝物从上清液中分离出来；所获得的粉末可在多种有机溶剂中分散从而产生光学上澄清的溶液。
[0090] 将含有5gTOPO的烧瓶在真空下加热几小时至190℃，然后冷却至60℃，其后加入0.5ml的三辛基膦(TOP)。将分散在己烷中的约0.1-0.4μmols的CdSe点经注射器转移入反应容器中，并将溶剂
泵出。将二乙基锌(ZnEt2)和六甲基二硅硫烷((TMS)2S)分别用作Zn和S前体。在惰性气氛
手套箱内将等摩尔量的前体溶解于2-4ml TOP中。将前体溶液装入注射器并转移至另外的连接于反应瓶的漏斗中。添加完毕后，将混合物冷却至90℃并搅拌几小时。向混合物中加入丁醇以防止TOPO在冷却至室温时凝固。
[0091] 实施例2
[0092] 通过与γ-环糊精形成主宾络合物制备水溶性纳米晶体
[0093] 将实施例1中所获得的具有TOP/TOPO疏水性封端的纳米晶体溶解于200μl的氯仿/己烷(1:1)混合物中。将大约0.5gγ-环糊精和纳米晶体溶液加入20ml去离子水的溶液中。将混合物回流8小时，直至形成混浊溶液。利用旋转式
蒸发器除去大部分水，然后通过离心分离所形成的主客体包含络合物。进一步用水洗涤所收集的固体以除去游离的环糊精分子。将这样所获得的纳米晶体以固体状态储存，所述纳米晶体已通过TOP/TOPO与环糊精形成主宾络合物。通过
超声波处理的方式将其溶解于水，可轻易地将它们转移至水中。受到主宾络合物保护的纳米晶体被发现可在固体状态稳定相对长的时间。
[0094] 通过形成主宾络合物而形成水溶性γ-CD修饰的量子点可进行光学追踪。当向含有TOP/TOPO封端的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体的氯仿溶液中加入γ-环糊精时，所形成的纳米晶体从有机氯仿相(图3a)迁移至水溶液中(图3b)。
[0095] γ-CD修饰的量子点的形成还通过1H-NMR、FT-IR光谱法和XRD测定(数据未显示)进行了确认。透射
电子显微术(TEM)(图4)和荧光图像(例如参照图5)显示，已与γ-环糊精形成主宾络合物的量子点形成高单分散性颗粒。图5另外显示，本发明的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体在形成主宾络合物之后(在水中测定)比未修饰的TOP/TOPO封端的核心外壳纳米晶体(在CHCl3中测量)具有更强的荧光强度，而发射最大量的波长仍保持不变。图6的光致发光测定显示已与γ-环糊精形成主宾络合物的CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体在pH7.4的PBS缓冲液中是非常稳定的(空心圆形)(即在生理状态下)，并且甚至分别在pH5.0(指向上的三
角形)和pH3.0(指向下的三角形)的水溶液中显示令人满意的稳定性。最后，图7说明在与γ-环糊精形成主宾络合物后，当加热至50℃时，CdSe/ZnS核心外壳纳米晶体显示出在水溶液中良好的热稳定性。
[0096] 实施例3
[0097] β-环糊精单烷基硫醇(辛硫醇)的制备
[0098] 将LiH(5mmol)加入在无水THF(50ml)中的无水叔丁基二甲代甲硅烷基(TBDMS)保护的环糊精(TBDMSCD)(2.2mmol)溶液中，并回流大约3小时。然后加入三苯基甲醇保护的8-溴-1-辛硫醇(4mmol)并回流过夜。将溶剂移至真空并将残留物溶解于氯仿中。用稀释的HCl溶液洗涤溶液，然后盐水洗涤，并干燥。通过
二氧化硅上的柱层析法来进行纯化(200-400目)。所获得的固体溶解于TFA(10ml)中。当溶液变成无色时，在减压下的剩余微量的酸和原始的反应产物被溶解于水中。为进行纯化，利用二乙醚洗涤环糊精辛硫醇以除1
去未反应的起始材料。在
冷冻干燥之后，以21％的产率获得了粉末形式的产物。HNMR(D2O，δ，ppm)：5.1，3.9-3.2，2.4，1.5-1.0。
[0099] 实施例4
[0100] 通过与环糊精单烷基硫醇的配体交换制备水溶性量子点
[0101] 如Zhong等人，J.Am.Chem.Soc.125，8589，2003所述通过溶解量子点于氯仿并从丙
酮和甲醇沉淀出来，进行TOP/TOPO封端的量子点的纯化。将所获得的量子点溶解于无水氯仿中以形成澄清的溶液。在搅拌下，逐份加入过量的实施例3中所制备的环糊精单烷基硫醇。每次，加入环糊精单烷基硫醇(辛硫醇)直至溶液变澄清。在添加完毕后，在室温下将反应混合物持续搅拌过夜。将溶剂移至真空并用二乙醚洗涤所获得的固体以除去游离的环糊精单烷基硫醇。收集所获得的粉末并通过离心从纯水溶液中进一步纯化。在冷冻干燥之1 1
后，收集产物并通过 HNMR表征。HNMR(D2O，δ，ppm)：5.1，4.1-3.2，2.3，1.5-1.0，0.9-0.8。
[0102] 实施例5
[0103] 6-硫代-β-环糊精的制备
[0104] 将过-6-碘-β-环糊精(1g)溶解于DMF(10ml)中；然后加入硫脲(0.301g)并在氮气下将反应化合物加热至70℃。19小时后，在减压下除去DMF以产生黄色油，将其溶解于水中(50ml)。加入氢氧化钠(0.26g)并在氮气下将反应化合物加热至温和回流。1小时后，用KHSO4水溶液将所获得的悬液酸化并过滤除去沉淀物，用蒸馏水彻底洗涤，然后干燥。为除去最后微量的DMF，将产物悬浮于水中(50ml)并加入最少量的氢氧化
钾以产生澄清的溶液；然后通过利用KHSO4水溶液进行酸化将产物重新沉淀出来。小心地将所获得的细小沉淀物过滤出来并在真空下P2O5之上进行干燥，从而
收获乳白色粉末形式的过-6-硫代-β-环1
糊精(65％)。HNMR(DMSO，δ，ppm)2.16，2.79.3.21，3.36-3.40，3.60，3.68，4.95，5.83，
5.97。
[0105] 实施例6
[0106] 6-硫代-β-环糊精封端的水溶性量子点的制备
[0107] TOP/TOPO封端的量子点的纯化与实施例2和4中所描述的程序是类似的。将所获得的量子点溶解于无水吡啶中，以形成澄清的溶液。搅拌下，加入6-硫代-β-环糊精。10分钟后，反应物变得澄清。在室温下持续搅拌过夜。除去大部分溶剂，然后加入50ml二
1
乙醚。收集白色沉淀物并再用二乙醚进行漂洗。将所得的粉末过滤出来并进行干燥。H NMR(DMSO，δ，ppm)：5.8，5.1，4.1-3.2，2.6，2.2，1.5-1.0。
[0108] 实施例7
[0109] 包含本发明纳米晶体的缀合物的制备
[0110] 图8a显示了制备本发明的纳米晶体的反应图解，所述纳米晶体包含封端试剂与合适的主体分子形成的主宾络合物。
[0111] 如上面所解释的，连接到纳米晶体外表面的合适的封端试剂可为具有长的烷基链或聚氧烷基链的硫醇化合物。此类封端的纳米晶体可与主体分子例如环糊精反应，产生高度稳定的水溶性纳米晶体。为制备可用作诊断工具的纳米晶体的缀合物，可将此类主体分子缀合目的配体，例如生物素、洋地黄毒苷、小分子药物或蛋白质例如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或抗体，仅列举少数例子。
[0112] 缀合物可通过将自由的反应基例如暴露于溶剂的亲水性基团(例如，-OH、COOH或NH2基团)与目的配体相反应来制备(参照图8a)。缀合物也可通过在客体分子和合适的主体分子之间形成另一主宾络合物来制备，所述主体分子连接至目的配体上。可用于与例如环糊精化合物形成此类(第二种)主宾络合物的有代表性的主体分子显示于图8b中。在此方面应当注意，为所选定的主体分子选择合适的客体是属于本领域一般技术人员的知识范围之内的。经主宾络合物来形成本发明纳米晶体的缀合物的方法，通过图8c中显示的链霉抗生物素蛋白缀合物阐明。
