技术领域
[0001] 本
发明属于液相色谱柱材料领域，具体涉及一种含五氟苄基咪唑盐离子液体固定相的杂化整体柱的制备方法。
背景技术
[0002] 经过几十年的发展，多种液相色谱方法得到开发并走向成熟，其中反相色谱、亲
水作用色谱、离子交换色谱方法最为经典。但这些方法往往由于分离机理单一，对于一些复杂样品得不到良好的分离。在这种情况下，混合模式色谱因其多种分离机理同时存在，在某些复杂样品的分离分析中取得了良好的效果而受到了越来越多的关注。目前的混合模式色谱以离子交换同反相色谱或者亲水作用色谱的结合最为常见。这类混合模式色谱可以更加方便地调节分析物的保留和选择性，水溶液中
稳定性更好，对各种极性和带电化合物的分离往往优于单一模式的色谱方法。
[0003] 目前离子液体以其多样性和独特的性质在色谱柱材料领域得到了越来越多的应用。离子液体经过疏水官能团如辛基的修饰作为色谱固定相，即得到了反相阴离子交换混合模式色谱，离子液体经过亲水官能团的修饰作为色谱固定相，即得到了亲水阴离子交换混合模式色谱。目前多种咪唑盐离子液体制成的混合模式色谱固定相得到开发，并取得了良好的分离效果。但用于修饰咪唑盐离子液体的疏水官能团还较单一，主要是不同长度的
碳链。本发明首次合成了五氟苄基咪唑盐离子液体，与杂化交联剂聚合得到反相阴离子交换混合模式色谱。利用五氟苄基的疏水相互作用，π-π相互作用以及偶极-偶极作用，结合咪唑盐的离子交换作用，多种分离机理结合，对中性，极性以及带电化合物分子具有良好的保留性质。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种具有多种分离机理的混合模式杂化整体柱的制备方法。
[0005] 该发明所述的混合模式杂化整体柱的具体合成方法是：
[0006] 五氟苄基咪唑盐离子液体合成：在2mL离心管中加入乙烯基咪唑和五氟苄基溴，涡旋10分钟，反应液逐渐粘稠
固化。加入1毫升
甲苯，超声10分钟，橙色固体逐渐变成白色，即得到1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体。使用乙酸乙酯清洗三次，最后在
真空干燥箱中干燥12小时待用。乙烯基咪唑和五氟苄基溴的
质量比为2～4：3～10。
[0007] 整体柱材料的合成：首先将内径为100～530μm的
石英毛细管用0.5～1mol/L氢
氧化钠溶液冲洗1～6小时，用水冲洗至中性后用0.1～0.5mol/L
盐酸溶液冲洗2～5小时，在分别用水、甲醇冲洗0.5～2小时，之后在氮气条件下100～160℃干燥2～6小时。取异丙醇/3-(三甲氧基甲
硅基)甲基
丙烯酸丙酯(1:1，v/v),50℃条件保持15-25小时，再用甲醇冲洗1-2小时,氮气条件下40-60℃干燥1-2小时,两端封好待用。修饰好的石英毛细管内径为100～530微米，长度为2～10米。
[0008] 在离心管中加入一定量的甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，Pluronic F127，1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体，超声使其彻底溶解，再加入偶氮二异丁腈，超声5～10分钟，之后灌入已经截短的毛细管中，毛细管长度为5～80厘米。两端用硅胶密封，50-80℃反应8-12小时。整体柱使用前用乙腈冲洗2小时以上，以除去致孔剂和未反应的原料。其中甲基丙烯酰-POSS笼形混合物是由硅氧硅键形成笼形，笼形结构的
顶点硅
原子数为8,10,12三种的混合物，每个顶点硅原子连有一个甲基丙烯酰取代基。该混合物在sigma公司以及Hybrid Plastics公司均有出售。本实验采用的甲基丙烯酰-POSS笼形混合物购自sigma公司。其中甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，Pluronic F127，偶氮二异丁腈的质量比为100～150：10～50：200～300：100～200：25～55：1～6。
[0009] 得到的杂化整体柱用于常温微液相色谱分析，流动相采用水/乙腈混合物，水和乙腈的体积比为1～3:2～5，对2,3,4,5,6-五氟甲苯和五氟苄基溴这两种疏水性相近的卤化物具有良好的选择性。
[0010] 该整体柱采用含硅杂化交联剂以提供高机械强度并减少溶胀，同时使用新型五氟苄基咪唑盐离子液体为结合
单体，为该柱提供疏水相互作用，π-π相互作用，阴离子交换作用，氢键作用以及偶极-偶极作用的混合保留机理，对中性分子，极性及带电化合物分子都实现了良好的分离和保留。与商品化十八烷基反相柱和五氟苯基柱相比，该杂化整体对疏水性相近的卤化物体现出了最佳的选择性。另外还可根据模具的不同方便地合成不同内径和长度的整体柱，以适应各种分离需要。
[0011] 由于上述技术方案的采用，与
现有技术相比，本发明具有如下特点：
[0012] 1首次将1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体用于整体柱的合成。
[0013] 2以1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体为色谱柱官能团，为该柱提供疏水相互作用，π-π相互作用，阴离子交换作用，氢键作用以及偶极-偶极作用的混合保留机理，对中性、极性及带电化合物都实现了良好的分离。
[0014] 3使用甲基丙烯酰-POSS笼形混合物作为反应交联剂为柱材料提供有机无机杂化骨架，使整体柱机械强度高，低溶胀，同时反应条件易优化，重复性好。
[0015] 4本发明的整体柱对疏水性相近的卤化物有良好的选择性。
[0016] 由于刚性杂化交联剂与柔性有机单体的聚合赋予了该整体柱合适的硬度，使其具有机械强度高，低溶胀的特点，同时该材料制备简单，稳定性好且耐酸
碱能
力强。该方法得到的整体柱第一次将五氟苄基与咪唑盐结合作为液相色谱固定相，具有反相阴离子交换的混合分离机理，对中性、极性和带电化合物均有良好的保留和选择性，尤其对疏水性相近的卤化物体现了最佳的选择性，因而具有广泛的应用前景。
附图说明
[0017] 图1是本发明
实施例一五氟苄基咪唑盐整体柱的合成
流程图；
[0018] 图2是本发明实施例一中五氟苄基咪唑盐离子液体和整体柱材料的红外图；
[0019] 图3是本发明实施例一的整体柱的扫描电镜图；
[0020] 图4是本发明实施例二的整体柱用于苯系物分离的色谱图(a)及流动相比例对苯系物保留的影响图(b)。其中(a)图的洗脱峰依次为：1.硫脲；2.苯；3.甲苯；4.乙苯；5.丙苯；6.对异丙基苯。
[0021] 图5是本发明实施例二的整体柱对几种
有机酸(a)，碱(b)，两性小分子(c)化合物的保留因子随着流动相中pH值变化图。
[0022] 图6是本发明实施例三的整体柱在不同pH条件下对八种核苷的分离色谱图。1.1-甲基腺苷；2.胞苷；3，肌苷；4.脱氧肌苷；5.3-甲基
鸟苷；6.鸟苷；7.腺苷；8.脱氧腺苷。
[0023] 图7是本发明实施例三的整体柱用于卤化物分离的色谱图。其中洗脱峰依次为：1.硫脲；2.1,2,4,5-四氟苯；3.2,3,4,5,6-五氟甲苯；4.五氟苄基溴；5.七氟苄基碘。其中a柱为GL Inertsil ODS-SP5μm,4.6×150mm，b柱为Waters XSELECT CSHTM Fluoro-Phenyl3.5μm,2.1×50mm，c柱为自制五氟苄基咪唑盐杂化整体柱，100μm×18.5cm。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图对本发明的实施例作详细的说明。
[0025] 实施例1
[0026] 五氟苄基咪唑盐杂化整体柱的制备：
[0027] 五氟苄基咪唑盐离子液体合成：在2mL离心管中加入32μL乙烯基咪唑，60μL五氟苄基溴，涡旋10分钟，反应液逐渐粘稠固化。加入1mL甲苯，超声10分钟，橙色固体逐渐变成白色，即得到1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体。使用乙酸乙酯清洗三次，每次使用乙酸乙酯10mL，最后用真空干燥箱干燥12小时待用。
[0028] 整体柱合成：首先将内径为100μm的石英毛细管用1mol/L的NaOH溶液冲洗5小时，用水冲洗至中性后，HCl(0.2mol/L)冲洗4小时，再分别用水、甲醇各冲洗0.5小时，在氮气条件下160℃干燥5小时，之后将毛细管中充满异丙醇/3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(1:1，v/v),50℃条件保持20小时，甲醇冲洗1小时,氮气条件下60℃干燥1小时,两端封好待用。
[0029] 在离心管中加入120mg甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，280μL四氢呋喃，120μL N，N-二甲基甲酰胺，20mg1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体，40mg Pluronic F127，超声使其彻底溶解，再加入3mg偶氮二异丁腈，超声后灌入毛细管中。两端用硅胶密封，60℃反应12小时。整体柱使用前用乙腈冲洗2小时，以除去未反应的原料。
[0030] 图1是五氟苄基咪唑盐杂化整体柱的反应流程图。图中用含有八个硅原子的甲基丙烯酰-POSS笼形物代替三种POSS笼形物的混合物。图2为五氟苄基咪唑盐离子液体以及杂化整体柱的红外谱图。在五氟苄基咪唑盐离子液体的红外图谱中，3014cm-1代表亚甲基的伸缩振动，3103cm-1代表咪唑环上的C-H伸缩振动，1509cm-1代表咪唑环骨架的振动，1207cm-1代表Ar-F的振动。在整体柱材料的红外图谱中，1724cm-1是酯中C＝O的伸缩振动，1127cm-1是Si-O伸缩振动，咪唑环和苯环的骨架振动峰在1500～1600cm-1处出现，Ar-F的吸收峰被高强度的Si-O键吸收峰所掩盖。图3为整体柱横截面的扫描电镜图。可以看到，整体柱呈均匀的聚集球状，骨架尺寸约为1.5微米，有利于高效快速传质。由于本柱材料是有机-无机杂化材料，硅氧硅键的引入增强了材料的机械性能，降低了溶胀作用。柔性单体的引入使材料具有一定的韧性，不易发生收缩断裂，稳定性更好，且耐酸碱性能较好。
[0031] 实施例2
[0032] 五氟苄基咪唑盐杂化整体柱的多种保留机理考查：
[0033] 整体柱材料的合成同实施例一。
[0034] 配制硫脲和苯系物的混合标样对该柱进行疏水相互作用保留机理评价。柱长17cm，以水/乙腈(2:3，v/v)为流动相，流速800nL/min，紫外可见检测器214nm
波长检测，进样2s(约26.7nL)。图4给出了五氟苄基咪唑盐杂化整体柱分离苯系物的色谱图以及随着流动相中乙腈含量的增加，苯系物的保留变化趋势。可以看到，苯系物的出峰顺序与常规ODS柱的出峰顺序相同。并且随着流动相中乙腈含量的增加，苯系物的保留逐渐减弱。说明苯系物与五氟苄基咪唑盐固定相之间具有典型的疏水相互作用。
[0035] 在离子交换和静电相互作用机理考察实验中，分别配制pH为3、4.5、6、7.5、9的20mM
磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为流动相的A相，用于考察流动相pH变化对酸，碱，两性化合物保留的影响，流动相B相为乙腈。流速800nL/min,紫外可见检测器220nm波长检测，进样2s.[0036] 图5给出了酸，碱，两性小分子化合物在五氟苄基咪唑盐杂化整体柱上的保留随着流动相pH变化趋势。可以看到，几种酸性物质的保留因子经历了先增加后降低的过程，碱性物质在pH从3增加到6时有一定的保留增强，之后趋于稳定。而两性化合物在pH从3增加到
7.5时保留缓慢增强，之后一个显著的保留增强发生在pH从7.5增加到9时。由于本实验中几种酸性化合物的pKa值在4到5之间，所以在pH＝3的条件下，所有酸性化合物处于不带电荷的分子状态，保留机理为较弱的疏水作用机理。随着流动相pH增加，酸性化合物逐渐变成离子状态，阴离子交换作用成为主要的保留作用力，所以保留显著变强。当流动相pH大于6且持续变大时，酸性物质基本解离完全，离子交换作用力趋于稳定，而流动相中的阴离子如OH-浓度增加，同酸性物质发生竞争，所以保留有所降低。但是对于含有酚羟基的有机酸，在碱性条件下会发生酚羟基的解离，增强离子交换作用，所以会出现一定程度的保留增强。对于碱性化合物，在pH＝3时呈阳离子状态，与固定相中的阳离子互相排斥，所以保留较弱。随着pH的增加，静电排斥作用逐渐减弱，疏水相互作用逐渐变成主要的保留机理，所以保留因子略有增加。对于两性化合物，pH＝3时呈阳离子状态，保留机理同碱性化合物，并且随着pH的增加，保留略有增强。但当流动相pH值大于等电点后，两性化合物变成阴离子状态，离子交换作用成为保留的主要作用力，所以保留明显增强。通过本次试验，证实了五氟苄基咪唑盐整体柱具有典型的阴离子交换及静电相互作用保留机理。通过调节流动相的pH，可以方便地调节极性以及带电化合物的保留以得到想要的分离结果。
[0037] 实施例3
[0038] 五氟苄基咪唑盐杂化整体柱用于多种小分子化合物的分离能力考察：
[0039] 整体柱的合成过程在实施例1的
基础上对原料配比有改动。其中甲基丙烯酰-POSS笼形混合物120mg，240μL四氢呋喃，160μL N，N-二甲基甲酰胺，40mg1-乙烯基-3-(五氟苄基)咪唑溴盐离子液体，37mg Pluronic F127，其他条件不变。
[0040] 由于核苷类小分子在
生物及医学研究中的重要意义，本发明的整体柱对八种核苷进行分离能力考察。柱长21cm，以20mM磷酸盐水溶液/乙腈/甲醇(94:3：3，v/v/v)为流动相，流速1μL/min，紫外可见检测器254nm波长检测，进样2s。图6给出了三种不同流动相pH对核苷的分离影响。可以看到，流动相pH的改变显著改变了核苷的保留强度和出峰顺序，其中pH为4.7时八种核苷得到了最好的分离。在三种不同的pH条件下，核苷的电荷状态不同，导致固定相和核苷分子的疏水相互作用和静电相互作用的变化较大，对保留时间和分离度产生了较大的影响。根据五氟苄基咪唑盐固定相的混合模式分离机理，极性较强的化合物的保留强度和分离度可以方便的通过改变流动相的pH来调节，中性的化合物则可以通过改变流动相的极性来优化保留，从而实现了多种中性，极性以及带电荷的化合物的良好分离。
[0041] 由于近年来卤化物污染物受到越来越多的重视，本发明的整体柱对四种卤化物也进行了分离能力考察，并与常规的商品化十八烷基反相柱和五氟苯基柱进行了对比。分离实验在室温环境中进行，整体柱分析的流动相为水/乙腈(40/60,v/v)，1μL/min；十八烷基反相柱分析的流动相为水/乙腈(35/65,v/v)，1mL/min；五氟苯基柱分析的流动相为水/乙腈(60/40,v/v)，0.2mL/min。从图7中可以看到，2,3,4,5,6-五氟甲苯和五氟苄基溴在十八烷基反相柱中没有得到分离，五氟苯基柱和五氟苄基咪唑盐整体柱对这两种化合物分离较好。这说明二者的疏水性十分相近，十八烷基反相柱无法依靠疏水相互作用将其良好的分开，而五氟苯基结构提供的偶极-偶极作用为其提供了分离能力。但是只有五氟苄基咪唑盐整体柱实现了最短时间内五种化合物的基线分离，说明除了偶极-偶极作用，咪唑盐提供的静电相互作用进一步增强了卤化物的分离度。本实验证明了五氟苄基咪唑盐整体柱对卤化物的分离能力，尤其是疏水性相近的卤化物具有最佳的选择性。
[0042] 本发明得到的整体柱具有机械强度高，低溶胀，制备简单，稳定性好，耐酸碱能力强等优点，五氟苄基咪唑盐固定相为该柱提供了反相阴离子交换的混合分离机理，在对核苷和卤化物的分离测试中体现了良好的保留和选择性，尤其是对疏水性相近的卤化物的选择性优于传统的十八烷基反相柱和五氟苯基柱。综上所述，五氟苄基咪唑盐杂化整体柱优良的杂化骨架和独特的选择性使其具有广泛的应用范围和良好的应用前景。
