本发明涉及哺乳动物细胞无载体固定化培养方法，更具体地说是利用贴壁依赖性生长 细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团的倾向，不借助细胞固定化介质而实施哺乳 动物细胞无载体固定化培养的工艺方法，属于细胞工程技术领域。 背景技术
动物细胞的固定化培养（animal cell immobilization culture)是指在无菌条件下将动物 细胞接种于特定的支持物表面或限制在特定的液相空间，模拟机体内生理状态下的基本生 存条件，使其在特定的支持物表面或限制在特定的液相空间中生长、增殖的体外培养技术。 相对于动物细胞悬浮培养而言，动物细胞固定化培养的技术特征主要表现为：1.易于灌 注技术的实施和优化控制细胞培养环境；2.减少或消除高灌注速率下的细胞流失；3.培 养体系中的细胞生长密度高；4.单位反应器体积细胞表达产物的产率高。因而，动物细 胞固定化培养能有效地实施动物细胞的高密度长期连续灌注培养，提高动物细胞表达产品 的生产效率。
根据所采用细胞固定化介质材料和固定化方式的不同，动物细胞固定化培养的方法主 要包括微载体培养（microcamer culture)、巨载体培养（macrocarrier culture)、中空纤维培 养（hollow fiber culture)和微囊化培养（microencapsulation)。上述动物细胞固定化培养方 法中，巨载体培养需在流化床生物反应器或填充床生物反应器中进行，细胞培养规模不易 放大，载体内部可能存在明显的传质限制；中空纤维培养易在反应器内形成培养基成分和 代谢产物的浓度梯度，培养规模放大困难；微囊化培养的微囊制备过程繁复、规模放大困 难。除此之外，以上三种动物细胞固定化培养均存在细胞采样、观察不便的弊端。
相对于其他形式的动物细胞固定化培养而言，微载体和多孔微载体培养融合细胞悬浮 培养和贴壁培养的优点，便于细胞采样、观察，培养规模放大容易，是动物细胞大规模培 养中的一项重要的、技术相对成熟的固定化培养技术。由于动物细胞固定化介质增加了细 胞培养的成本。因此，无需借助固定化介质而直接利用生物反应器中形成的细胞团实现细 胞固定化的无载体固定化培养（carrier-free immobilization culture)被看作降低动物细胞 表达产品生产成本的 一种技术途径。
贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向。利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向，通过控 制细胞团的粒径分布，可以起到类似于微载体和多孔微载体固定化培养的目的，实施动物 细胞的无载体固定化培养，并结合动物细胞培养过程的动态监测和优化控制，实现动物细 胞的高密度长期培养及其表达产品的高效生产。与动物细胞的多孔微载体固定化培养相 比，无载体固定化不仅节省了购买多孔微载体的动物细胞培养成本，还可通过对培养过程 中细胞团的形成和解聚的控制使细胞培养规模的放大更易实施。此外，动物细胞无载体固 定也易于监测培养过程中的细胞生长。
由于细胞团中的细胞密度近似于组织中的细胞密度，存在于细胞团内的物质扩散限制 可能影响细胞活力。因而，实施无载体固定化培养的基本前提是通过控制细胞团的粒径分 布，提高悬浮细胞团中的细胞活力。虽然，Tolbert等在1980年曾提出了利用贴壁依赖性 生长细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团的倾向，将动物细胞以细胞团的形式悬 浮培养的设想。但迄今为止，细胞团悬浮培养均未能解决细胞团粒径分布、细胞团的解聚 和游离细胞再聚集成团的有效控制的问题。细胞团悬浮培养基本上停滞在用搅拌式细胞瓶 进行分批式或半连续式操作的实验研究阶段。 发明内容
本发明提供了一种利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团 的倾向，通过控制细胞团的形成、细胞团的粒径分布和细胞团的解聚、游离细胞的再集聚 成团，起到类似于多孔微载体固定化培养的目的，实施哺乳动物细胞的无载体固定化培养 的方法。
HEK293、 CHO、 BHK和Vero等贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞在搅拌培养体系中 悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向。HEK293、 CHO、 BHK和Vero等哺乳动物细胞 在悬浮培养体系中形成细胞团的粒径分布影响着细胞培养的具体操作工艺和细胞的生长 代谢。细胞团粒径过小不利于细胞截流和灌注培养的实施；细胞团粒经径过大可能造成细 胞团内传质效率受限，影响细胞的生长代谢。对悬浮培养过程中细胞团的形成、粒径分布 和解聚的有效控制，是本发明的技术核心，也是利用动物细胞在悬浮培养中相互聚集、形 成细胞团的生长特征，实施哺乳动物细胞无载体固定化培养技术的基本前提。
本发明依次包括以下步骤：
以搅拌式细胞培养瓶和装备有内置式旋转滤器的搅拌罐式生物反应器为实施哺乳动 物细胞无载体固定化培养的悬浮培养体系；
用0.25% (v/v)胰蛋白酶消化于T形组织培养瓶或转瓶中培养的HEK293、CHO、BHK和Vero等哺乳动物细胞；
用Ca2+浓度为500~2000 nMt、小牛血清浓度为1~5% (v/v)的DMEM/F12培养基 (DMEM:F12 (1:1， v/v))悬浮HEK293、 CHO、 BHK禾n Vero细胞，调整细胞浓度为 2~6xl05cells/ml;
将细胞悬液移入搅拌式细胞培养瓶中，37°C、 5%(:02培养条件下悬浮培养。在开始 培养的第1~3天，搅拌速度设置为25~50 r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形的细 胞团；自培养的第3~4天起，设置搅拌速度为50〜100r/min，细胞团的形状在逐渐加大的 流体动力作用下形成较规则的球体，细胞团的平均粒径控制在小于300 pm的范围内。
自培养的第2〜3天起，每天取出将搅拌式细胞培养瓶、于洁净工作台内静置1〜3分 钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95%培养体积更换新鲜培养基；
自培养的第2〜3天起，每天取样测量细胞团的粒径、计数细胞密度。当细胞团的平均 粒径大于300 nm和/或细胞密度达到4~7xl06cells/ml时，按80-95%培养体积更换含500 〜750IU/ml肝素、l%(v/v)小牛血清的无Ca^DMEM培养基，在搅拌速度设置为50~100 r/min的条件下培养12~36小时，使细胞团解聚。
取5~10% (v/v)的细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按10~20倍细胞悬液体积加 入Ca2+浓度为500~2000 ^M、小牛血清浓度为l~5%(v/v)的DMEM/F12培养基，按步骤 4-6重复实施搅拌式细胞培养瓶中的哺乳动物细胞无载体固定化培养；或将细胞悬液转入 搅拌罐式生物反应器中，按10〜20倍细胞悬液体积加入&2+浓度为500~2000 pM、小牛 血清浓度为1~5% (v/v)的DMEM/F12培养基，培养温度设置为37°C、溶解氧浓度控制在 30~50%、 pH控制在7.1〜7.2。搅拌速度先设置为25〜50 r/min，使来自细胞团解聚的游离 细胞重新形成球形的细胞团，随后在50〜120r/min的范围内逐步提高搅拌速度，使细胞团 的平均粒径控制在小于300 pm范围内。
自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2〜3天起,每天取样测定细胞团的粒 径和培养基的葡萄糖浓度、计数细胞密度，利用生物反应器中微孔径为75 )im的内置式 旋转过滤器截流细胞团，启动生物反应器的培养基灌注系统，根据活细胞密度和葡萄糖浓 度将灌注速率调整为0.15~1.5 volume/day，实施搅拌罐式生物反应器中的哺乳动物细胞无 载体固定化培养。
本发明与现有技术相比具有以下优点：①哺乳动物细胞在悬浮培养体系中所形成细胞 团的形状规则、大小较均一，细胞团的平均粒径控制在小于300pm的范围内。②细胞团 解聚、游离细胞再集聚成团的条件温和、可控。③按照本发明的哺乳动物细胞无载体固定化培养的工艺，哺乳动物细胞培养的活细胞密度21xl0、lls/ml、细胞活力》90%。 ©可节 省购买多孔微载体的动物细胞培养成本。⑤便于监测培养过程中的细胞生长，细胞培养规 模放大容易。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 附图说明
图1为在250ml搅拌式细胞培养瓶中实施HEK293细胞无载体固定化培养的活细胞 密度和细胞团平均粒径变化。活细胞密度(A);细胞团平均粒径（o)。图中各点代表至少 3次培养结果的平均值和标准差。
图2A和图2B分别为倒置显微镜下观察到的HEK293细胞团（图2A)和扫描电镜下 观察到的HEK293细胞团（图2B)。
图3A-3C分别反映在细胞团解聚条件下12h、 24h和36h的293细胞团解聚；图3D 为在细胞团形成条件下，自HEK293细胞团解聚的游离细胞再集聚形成细胞团。
图4为5L搅拌罐式生物反应器中无载体固定化培养HEK293细胞的细胞生长和细胞 团粒径分布。
图5A-5C分别为倒置显微镜下观察到的rCHO细胞团(图5A)、BHK细胞团（图5B)和 Vero细胞团（图5C)。 具体实施方式
实施例l、 HEK293细胞的无载体固定化培养
(1) HEK293细胞无载体固定化培养的种子细胞准备：
将连续传代培养的HEK293细胞（购自美国Invitrogen公司）接种于100ml的组织培 养瓶中，加入10 ml含5% (v/v)小牛血清、4 mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置37 t:培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25% (w/v) 的胰蛋白酶进行消化，作为实施HEK293细胞无载体固定化培养的种子细胞。
(2) HEK293细胞在搅拌式细胞培养瓶中的细胞团形成和细胞团粒径分布控制：
用Ca^浓度为1000 pM、小牛血清浓度为1% (v/v)的DMEM/F12培养基悬浮HEK293 细胞，调整细胞悬液浓度为2~4xl05cells/ml，按100~500 ml/瓶接种工作体积为100~500ml 的搅拌式细胞培养瓶，37°C、 5%(:02培养条件下悬浮培养。
在培养的第1~3天搅拌速度设置为25~50 r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形 的细胞团。自培养的第2〜3天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1~2分 钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95%培养体积更换新鲜培养基。
6在对培养物作培养基更换处理的同时，用大口吸管吸取均匀悬浮的HEK293细胞团悬 液2~3 ml。取其中的1 ml用0.25% (w/v)胰蛋白酶消化液分散细胞团，用细胞密度和活 力自动分析系统（Cedex A20， Innovatis)计数活细胞密度。用剪除尖端的移液器吸头吸取 50-100 ^样品加入96孔细胞培养板中，在Nikon Eclipse TE300倒置显微镜的4x平场物 镜下观察细胞团并用彩色数码摄像头（Pro-15犯S， Pkem)摄取图像，用Simple PCI图像 分析软件（SimplePCI 5.1， Compix， Inc)中的图像处理和分析模块处理图像，测量HEK293 细胞团的粒径、分析HEK293细胞团的粒径分布。
自培养的第4天起，设置搅拌速度为50〜100r/min.。养8天后，HEK293的活细胞密 度由接种时的3.1xl05cells/ml增加到的5.1xl06cdls/ml (图1)。 HEK293细胞团的形状在逐 渐加大的流体动力作用下形成如图2所示的球状细胞团。HEK293细胞团的平均粒径控制 在小于300 ^un的范围内。
(3) HEK293细胞团的解聚：
当活细胞密度达到5xl06cells/ml和/或细胞团的平均粒径大于300 pm时，按卯％培养 体积更换含500 IU/ml肝素、l%(v/v)小牛血清的无Ca^DMEM培养基，设置搅拌速度 为60r/min， 37°C、 5% 0)2培养条件下悬浮培养12~36小时，使细胞团松散、解聚（图 3A-3C)。
(4) HEK293细胞在搅拌罐式生物反应器中的无载体固定化培养：
培养于500 ml搅拌式细胞培养瓶的HEK293细胞经细胞团解聚处理后，接种于工作 体积为5 L、装备有内置式旋转滤器的搅拌罐式生物反应器内，按IO倍细胞悬液体积补 充Ca^浓度为1000 iaM、小牛血清浓度为l%(v/v)的DMEM/F12培养基至生物反应器设 定的工作体积，培养温度设置为37'C、溶解氧浓度控制在30〜50%、 pH控制在7.1〜7.2。 在5 L拌罐式生物反应器中培养的第1~3天搅拌速度设置为35~50 r/min，使来自细胞团 解聚的游离细胞相互聚集、重新形成近似于球形的细胞团；从在5L拌罐式生物反应器中 培养的第4天起，根据HEK293细胞团的平均粒径变化，在50~120 r/min的范围内逐步提 高搅拌速度，使细胞团的平均粒径控制在小于300 pm范围内。
自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2~3天起，每天取样按上述方法测量 细胞团的粒径、计数活细胞密度；用YSI7100型多参数生物分析系统（YSI 7100, Yellow Springs Instruments)检测培养基中的葡萄糖、乳酸浓度。启动生物反应器的培养基灌注系 统，利用生物反应器中微孔径为75 pm的内置式旋转滤器截流细胞团，根据活细胞密度 和葡萄糖浓度将灌注速率调整为0.15~1.5 volume/day，实施搅拌罐式生物反应器中的HEK293细胞无载体固定化培养。
在5 L拌罐式生物反应器中培养的第17天，HEK293的活细胞密度由接种时的 4.2x105cells/ml增加到的13.7xl06cells/ml， HEK293细胞团的平均粒径控制在小于300 的范围内，HEK293细胞的活力在整个培养过程中保持在大于卯％的水平（图4)。
实施例2、 CHO细胞的无载体固定化培养
将表达含KGDW插入序列的尿激酶原（KGDW-pro-UK)的CHO工程细胞系G6-l (由军事医学科学院生物工程研究所采用基因重组技术构建，简称CHO细胞）接种于1000 ml的转瓶中，加入100 ml含1% (v/v)小牛血清、4 mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基， 置转速为2r/min的转瓶培养装置上、37'C培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基， 使细胞形成致密细胞层。
培养于1000 ml转瓶中的CHO细胞经0.25% (w/v)的胰蛋白酶进行消化处理后，用 Ca"浓度为1500 nM、小牛血清浓度为1% (v/v)的DMEM/F12培养基悬浮CHO细胞， 将细胞悬液注入工作体积为2 L的搅拌罐式生物反应器中，细胞接种浓度为 3.4xl05cells/ml。培养温度设置为37'C、溶解氧浓度控制在30~40%、 pH控制在7.0-7.1 。
在培养的第1~3天搅拌速度设置为35~50 r/min，使CHO细胞相互聚集、形成近似于 球形的细胞团。按前述方法计数活细胞密度、测量CHO细胞团的平均粒径；从培养的第 4天起，根据CHO细胞团平均粒径的变化，在50〜100r/min的范围内逐步提高搅拌速度， 使细胞团的平均粒径控制在小于300 pm范围内。
自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2~3天起，每天取样按上述方法检测 培养基中的葡萄糖和乳酸浓度，采用溶圈法测定培养基中CHO细胞表达产物 KGDW-pro-UK的浓度。同时，启动生物反应器的培养基灌注系统，利用生物反应器中微 孔径为75 pm的内置式旋转滤器截流细胞团，根据活细胞密度和葡萄糖浓度将灌注速率 调整为0.25〜1.0 volume/day,实施搅拌罐式生物反应器中的CHO细胞无载体固定化培养。
培养12天后，CHO细胞的活细胞密度达到5.9x106 cells/ml， KGDW-pro-UK的浓度 达到2984 IU/ml。扫描电镜观察，CHO细胞在搅拌罐式生物反应器中形成粒径分布相对 均匀、形状较规则的细胞团（图5A)。
实施例3、 BHK细胞的无载体固定化培养
将连续传代培养的BHK细胞（来自美国模式培养物保藏所）接种于1000 ml的转瓶 中，加入100 ml含5% (v/v)小牛血清、4 mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置转速为 2 r/min的转瓶培养装置上、37'C培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25M(w/v)的胰蛋白酶进行消化、作为实施BHK细胞无载体固 定化培养的种子细胞。
用Ca^浓度为2000 pM、小牛血清浓度为5% (v/v)的DMEM/F12培养基悬浮BHK 细胞，调整细胞悬液浓度为5.2xl05ceUs/ml，按250 ml/瓶接种工作体积为250 ml的搅拌 式细胞培养瓶，37'C、 5%<302培养条件下悬浮培养。
在培养的第1~2天搅拌速度设置为25~50 r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形 的细胞团。自培养的第2~3天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1~2分 钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95%培养体积更换新鲜培养基。自培养的第3天起，设 置搅拌速度为50~100r/min.。
培养7天后，BHK细胞的活细胞达到的6.4xl0ecells/ml。 BHK细胞团的形状在逐渐 加大的流体动力作用下形成如图5B所示的球状细胞团。BHK细胞团的平均粒径控制在小 于300 pm的范围内。按90%培养体积更换含750 IU/ml肝素、1% (v/v)小牛血清的无Ca2+ DMEM培养基，设置搅拌速度为75 r/min， 37°C、 5% C02培养条件下悬浮培养24 h，使 BHK细胞团松散、解聚。
取5y。（v/v)的BHK细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按20倍细胞悬液体积加 入Ca"浓度为2000 pM、小牛血清浓度为5% (v/v)的DMEM/F12培养基，按上述方法实 施无载体固定化培养方式下的BHK细胞传代培养。
实施例4、 Vero细胞的无载体固定化培养
将连续传代培养的Vero细胞（来自美国模式培养物保藏所）接种于100 ml的组织培 养瓶中，加入10 ml含2% (v/v)小牛血清、4 mM谷氮酰胺的DMEM/F12培养基，置37 t:培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25y。(w/v) 的胰蛋白酶进行消化、作为实施Vera细胞无载体固定化培养的种子细胞。
用Ca2+浓度为500 ^M、小牛血清浓度为2% (v/v)的DMEM/F12培养基悬浮Vero细 胞，调整细胞悬液浓度为2.5x105cells/ml,按100 ml/瓶接种工作体积为100 ml的搅拌式 细胞培养瓶，37'C、 5%<:02培养条件下悬浮培养。
在培养的第1~3天搅拌速度设置为30〜50 r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形 的细胞团。自培养的第4天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1〜3分钟， 使细胞团沉降于瓶底，按50-95%培养体积更换新鲜培养基。自培养的第4天起，设置搅 拌速度为50~100r/min.。
培养9天后，Vero细胞的活细胞达到的4.8xl()Scells/ml。 Vero细胞团的形状在逐渐加大的流体动力作用下形成如图5B所示的球状细胞团。Vero细胞团的平均粒径控制在小 于300 pm的范围内。按卯％培养体积更换含500 IU/ml肝素、1% (v/v)小牛血清的无Ca2+ DMEM培养基，设置搅拌速度为85 r/min， 37°C、 5% <302培养条件下悬浮培养36 h,使 Vero细胞团松散、解聚。
取10% (v/v)的Vero细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按10倍细胞悬液体积加 入Ca^浓度为500 ^M、小牛血清浓度为2% (v/v)的DMEM/F12培养基，按上述方法实 施无载体固定化培养方式下的Vero细胞传代培养。
本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员 而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干步骤 和/或参数的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。