SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用
阅读：420发布：2020-05-12
专利汇可以提供SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用包含siRNAs的储存/ 再灌注 溶液对器官、组织和细胞进行调节，所述siRNAs特异性针对其表达与存活 力 丧失或细胞损伤有关的基因。在储存/再灌注溶液中存在siRNAs最小化和/或防止了器官、组织和细胞的损伤，从而使得器官、组织和细胞可以用于体内移植。本发明也一般性涉及了使用储存/再灌注溶液将器官、组织和细胞维持在存活状态的方法。，下面是SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用专利的具体信息内容。
1.在离体储存过程中和体内再灌注过程中将细胞、组织和/或器官 维持在存活状态的组合物，所述组合物包含特异性针对其表达与离体 组织或器官的存活力丧失或细胞损伤有关的基因的siRNA。
2.权利要求1中的组合物，其中所述基因选自凋亡基因、免疫炎 性基因、补体基因及其组合。
3.权利要求2中的组合物，其中所述凋亡基因选自Caspase 3、 caspase 8、fas及其组合。
4.权利要求2中的组合物，其中所述免疫炎性基因选自TNF-α、 RelB及其组合。
5.权利要求2中的组合物，其中所述补体基因选自C3、C5aR及 其组合。
6.权利要求2-5任一项的组合物，其中所述组合物包含特异性针 对Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、TNFα和RelB的siRNA。
7.权利要求2-5任一项的组合物，其中所述组合物包含特异性针 对caspase 3、caspase 8和Fas的siRNA。
8.权利要求2-5任一项的组合物，其中所述组合物包含特异性针 对TNFα和RelB的siRNA。
9.权利要求2-5任一项的组合物，其中所述组合物包含特异性针 对C3和C5aR的siRNA。
10.权利要求1中的组合物，其中所述组合物以大约4℃直到大约 37℃的温度提供。
11.权利要求10中的组合物，其中所述组合物以37℃提供。
12.权利要求1到11任一项的组合物，其中所述组合物还包含可 商购的器官储存溶液。
13.权利要求1到12任一项的组合物，其中所述组合物还包含添 加剂，所述添加剂选自自由基清除剂、21-氨基类固醇、抗凋亡剂、钙 通道阻滞剂、分子间粘附分子-1抑制剂、己酮可可碱及其组合。
14.权利要求1到13任一项的组合物，其中所述siRNA的提供量 多达大约100μg/ml。
15.在移植前维持离体组织、细胞或器官的存活力的方法，所述 方法包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表达与离体组织、细胞 或器官的存活力丧失或细胞损伤有关的基因的至少一种siRNA相接 触，其中所述接触在高于大约4℃的温度下进行。
16.保护哺乳动物的组织、细胞或器官免于缺血和/或再灌注损伤 的方法，包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表达与缺血和/或再 灌注损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。
17.权利要求15或16中的方法，其中siRNA特异性针对选自凋 亡基因、免疫炎性基因、补体基因及其组合的基因。
18.权利要求17中的方法，其中所述凋亡基因选自caspase-3、 caspase-8、fas及其组合。
19.权利要求17中的方法，其中所述免疫炎性基因选自TNF-α、 RelB及其组合。
20.权利要求17中的方法，其中所述补体基因选自C3、C5aR及 其组合。
21.权利要求18到20任一项的方法，其中所用的siRNA基因是 Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、TNF-α和RelB。
22.权利要求17到21任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对caspase 3、caspase 8和Fas的siRNA。
23.权利要求17到21任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对TNFα和RelB的siRNA。
24.权利要求17到21任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对C3和C5aR的siRNA。
25.权利要求15到24任一项的方法，其中所述siRNA的提供量 为每种所述siRNA多达大约100μg/ml。
26.将细胞、组织或器官储存在存活状态的方法，所述方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与包含特异性针对其表达与存活 力丧失或细胞损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触；以及
ii)在从大约低于环境直到大约37℃的温度下维持所述细胞、组织 或器官与溶液的接触。
27.权利要求26中的方法，其中使用siRNA的组合。
28.权利要求26或27中的方法，其中所述基因选自凋亡基因、 免疫炎性基因、补体基因及其组合。
29.权利要求28中的方法，其中所述凋亡基因选自caspase-3、 caspase-8、fas及其组合。
30.权利要求28中的方法，其中所述免疫炎性基因选自TNF-α、 RelB及其组合。
31.权利要求28中的方法，其中所述补体基因选自C3、C5aR及 其组合。
32.权利要求28到31任一项的方法，其中所用的siRNA基因是 Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、TNF-α和RelB。
33.权利要求28到32任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对caspase 3、caspase 8和Fas的siRNA。
34.权利要求28到32任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对TNFα和RelB的siRNA。
35.权利要求28到32任一项的方法，其中所述组合物包含特异 性针对C3和C5aR的siRNA。
36.权利要求15到35任一项的方法，其中所述siRNA的提供量 为每种所述siRNA多达大约100μg/ml。
37.权利要求15到36任一项的方法，其中所述方法在高达大约 37℃的温度下进行。
38.权利要求15到37任一项的方法，其中所述组合物还包含可 商购的器官储存溶液。
39.权利要求15到38任一项的方法，其中所述组合物还包含添 加剂，所述添加剂选自自由基清除剂、21-氨基类固醇、抗凋亡剂、钙 通道阻滞剂、分子间粘附分子-1抑制剂、己酮可可碱及其组合。
40.使用权利要求1中的组合物制备的离体改变的细胞、组织或 器官，其中所述改变的细胞、组织或器官包含被靶向以沉默一种或多 种凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因的表达的siRNA的组合。
41.权利要求40中的细胞、组织和/或器官，其中所述凋亡基因选 自caspase-3、caspase-8、fas及其组合。
42.权利要求40中的细胞、组织和/或器官，其中所述免疫炎性基 因选自TNF-α、RelB及其组合。
43.权利要求40中的细胞、组织和/或器官，其中所述补体基因选 自C3、C5aR及其组合。
44.权利要求40中的细胞、组织和/或器官，其中所述siRNA基 因是Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、TNF-α和RelB。
45.权利要求40到44任一项的细胞、组织和/或器官，其中所述 基因包含特异性针对caspase 3、caspase 8和Fas的siRNA。
46.权利要求40到44任一项的细胞、组织和/或器官，其中所述 基因包含特异性针对TNFα和RelB的siRNA。
47.权利要求40到44任一项的细胞、组织和/或器官，其中所述 基因包含特异性针对C3和C5aR的siRNA。
48.权利要求15、16或26中的方法，其中所述器官选自心脏、 肺脏、肾脏、肝脏和胰脏。
49.权利要求48中的方法，其中所述器官是肾脏。
50.权利要求1中的组合物，其中所述细胞、组织和/或器官选自 心脏、肺脏、肾脏、肝脏和胰脏。
发明领域
本发明涉及在储存、再灌注和运输过程中对器官、组织和细胞的 保存。更具体来说，本发明涉及使用储存/再灌注溶液对器官、组织和 细胞进行调节，该溶液能够最小化和/或防止器官、组织和细胞的损伤， 从而使器官、组织或细胞可以用于体内移植。总的来说，本发明也涉 及了将器官、组织和细胞维持在存活状态的方法。
发明背景
树突状细胞(DC)是免疫功能的关键控制物，因为它们既能诱导 免疫刺激又能诱导免疫抑制。决定DC将是刺激性的还是抑制性的关键 因素是可溶性的和膜结合的信号的表达。例如，CD80、CD86和IL-12 对DC的抑制赋予它们抑制免疫系统活化的能力。另一方面，对DC抑 制性信号例如PD-IL的抑制使得DC变成T细胞反应的更有力的激活 剂。已经通过抗体阻断(Goldberg等，Transpl Int，1994.7Suppl 1：p. S252-4)、反义寡聚核苷酸(Liang等，Transplant Proc，2001.33(1-2)： p.235)和化学免疫抑制剂(Lagaraine等，2003.75(9Supplm)：p. 37S-42S)进行了对这些DC衍生信号的操纵。不幸的是，所有这些方 法都具有明显的缺陷，限制了它们进入临床。
最近，已经开发了小干扰RNA(siRNA)，与其它已知的基因抑 制方法相比，它提供了更为有力、特异和持续时间长的基因抑制(Scherr 等，Curr Med Chem，2003.10(3)：p.245-56)。已经证实低浓度的siRNA 可以用于沉默DC细胞因子的生产，并调节DC活化T细胞的能力。本 申请人的PCT CA03/00867描述了通过使用siRNA对免疫细胞、包括 DC的操纵，以及使用siRNA沉默的DC修饰T细胞反应的方法。
组织和器官的移植需要提供活的组织和器官。自体和异体移植受 到组织或器官在移植之前该组织或器官可以维持存活的时间的限制。 供体器官在低温条件下(4℃)在特别配制的灌注溶液中进行冲洗和储 存，以便洗掉碎片并减小在运输过程中的损伤。这些溶液根据它们模 拟的生理环境可以被广义上区分为“细胞外的”和“细胞内的”。所 述溶液含有活性成分，所述活性成分在再灌注过程中能够最小化由低 温引起的细胞膨胀、抑制由缺血导致的酸中毒、最小化细胞外膨胀、 最小化自由基损伤并提供ATP再生的底物。美国专利No.5,110,722以 及美国专利申请序号2003/0109433和2005/0100876描述了用来得到更 好的移植功能的器官储存溶液。也可以通过加入自由基保护剂、胱天 蛋白酶(caspase)抑制剂和血管紧张肽转换酶抑制剂来调节器官储存 溶液(Baker等，J Surg Res，1999.86(1)：p.145-9；McAnulty等， Cryobiology，1996，33(2)：P.217-25；Natori等，Liver Transpl，2003.9(3)： p.278-84；Randsbaek等，Scand Cardiovasc J，2000192(1)：p.31-40)。
已经尝试了通过使用抑制供体辅助刺激分子并增加移植存活率的 灌注溶液来尝试免疫调制(Wekerle等，Curr Opin Immunol，2002.14(5)： p.592-600)。已经证实了使用裸反义DNA灌注肾脏移植物能够抑制 细胞内粘附分子-1的表达(Chen等，Transplantation，1999.68(6)：p. 880-7)。类似地，通过在器官储存溶液中添加诱骗寡核苷酸，在心脏 同种异体移植物中进行了NF-κB活性的抑制(Vos等，Faseb J，2000. 14(5)：p.592-600)。但是，这两种方法都需要高浓度的寡核苷酸用于 诱导，这导致了边缘性的疗效。
美国专利申请公布No.2006/0073127描述了使用选定的RNAi剂 来制备用于移植的组织。但是，该方法使用短灌注时间，并且组织的 储存被维持在通常4℃的冷藏温度下。此外，使用裸siRNA显示出导 致组织中扩散差，因此是无效的。Bradley等(Transplantation Proceedings， 37，233-236，2005)简单地证明了使用siRNA进行胰岛细胞的成像。
因此，非常希望能够提供改进的器官储存/再灌注溶液以及使用它 们的方法，从而有效调节器官、组织和细胞降低免疫识别，进而引起 存活率和受体接受程度的改进。
发明简述
本发明涉及一种组合物，用于在离体储存、再灌注和运输过程中 保存器官、组织和/或细胞的存活性，使得器官、组织和/或细胞可以成 功用于体内移植。移植可以是自体或异体的。本发明还涉及了使用这 样的组合物以将器官、组织和/或细胞离体维持在可用于移植的存活状 态的方法。本发明还涉及被调节的器官、组织和/或细胞自身。本发明 的组合物包含了siRNA，它们被特异性定靶/定向，以使负责器官、组 织和/或细胞中存活力丧失和/或细胞损伤或与之有关的基因表达被沉 默。在本发明的一些方面中，被定靶的基因是参与凋亡、免疫炎性反 应和补体活化的基因。
本发明的一个方面是用于将细胞、组织和/或器官维持在存活状态 的组合物。在离体储存过程和体内再灌注过程中，细胞、组织和/或器 官被维持在存活状态。所述组合物含有一种或多种siRNA，所述siRNA 特异性针对其表达与离体组织或器官中存活力丧失或细胞损伤相关的 基因。因此，siRNA靶向这些基因的表达。这样的基因可以包括一种 或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因，以及这些不同基因的各 种组合。
本发明的一个方面是用于在离体储存过程和体内再灌注过程中将 细胞、组织和/或器官维持在存活状态的组合物，该组合物含有siRNA， 所述siRNA特异性针对其表达与离体组织或器官中存活力丧失或细胞 损伤相关的基因。
在本发明的一些方面中，所述组合物是储存溶液，其允许细胞、 组织和/或器官在室温或冷藏温度下储存的时间段比使用现有的临床接 受的溶液所能达到的更长。在本发明的一些方面中，组合物被提供为 大约37℃，并含有靶向一种或多种凋亡基因、一种或多种免疫炎性基 因和一种或多种补体基因、以及它们的各种组合的siRNA的组合。
根据本发明，提供了一种组合物，用于细胞、组织和/或器官在再 灌注和离体期间维持存活力，使得细胞、组织和/或器官能够存活用于 移植，该组合物含有靶向一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体 基因表达的一种或多种siRNA。在本发明的一些方面中，所述组合物 还可以含有已知能够帮助细胞、组织和/或器官离体存活的其它试剂， 如后文所述。
本发明的另一方面，是在移植前储存或运输细胞、组织和/或器官 并同时将它们维持在存活状态的方法。
本发明的另一方面，是延迟缺血对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的另一方面，是延迟凋亡对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的另一方面，是延迟炎症对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的还另一方面，是维持器官、组织和/或细胞在从哺乳动物 宿主中切除之前的再灌注过程中的存活力的方法。
本发明的还另一方面，是改变细胞、组织和/或器官，致使细胞、 组织和/或器官在移植前以及移植过程中的储存和再灌注过程中存活的 方法。
本发明的另一方面，是在移植前维持组织或器官保持离体存活的 方法，包括将组织或器官与特异性针对其表达与离体组织或器官的存 活力的丧失或细胞损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。这样的 基因可以包括一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因、补体基因及其组 合。
本发明的另一方面，是保护哺乳动物的组织或器官免于缺血和/或 再灌注损伤的方法，包括将组织或器官与特异性针对其表达与缺血和/ 或再灌注损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。在一些方面，所 述siRNA被提供为组合物。在其它方面，siRNA组合物在高于4℃的 温度下提供，在还有的其它方面，则是在大约37℃的温度下。
本发明的一个方面，是在移植前维持组织、细胞或器官离体维持 的存活力的方法，该方法包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表 达与离体组织、细胞或器官的存活力的丧失或细胞损伤有关的基因的 至少一种siRNA相接触，其中所述接触在高于大约4℃的温度下进行。
本发明的另一方面是保护哺乳动物的组织、细胞或器官免于缺血 和/或再灌注损伤的方法，包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表 达与缺血和/或再灌注损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与含有siRNA的溶液相接触； 以及
ii)在非冷冻状态下低于环境的温度下维持细胞、组织或器官与 溶液的接触。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与含有siRNA的溶液相接触； 以及
ii)在大约37℃的温度下维持细胞、组织或器官与溶液的接触。
本发明的还另一方面是改变的细胞、组织或器官，其中所述改变 的细胞、组织或器官含有被靶向以沉默一种或多种凋亡基因、免疫炎 性基因和补体基因的表达的siRNA。在一些方面，细胞、组织和/或器 官被离体提供并维持。在其它方面，细胞、组织和/或器官被提供在体 内，即移植到适合的哺乳动物受体中。
本发明的还另一方面是制备用于移植的组织的方法，该方法包括：
-将该组织暴露于含有siRNA的组合物，所述siRNA被靶向以沉 默一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因的表达，
-将所述暴露维持足以下调所述一种或多种凋亡基因、免疫炎性基 因和补体基因的时间。
在一些方面，暴露在大约4℃到大约37℃的温度下进行。在其它 方面，所述组织是肾脏。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与组合物相接触，所述组合物含 有至少一种特异性针对其表达与存活力损失或细胞损伤有关的基因的 siRNA；以及
ii)在从大约低于环境的温度直到大约37℃的温度下维持细胞、组 织或器官与溶液的接触。
在阅读了下面的描述后，本发明的其它方面和优点将会清晰。
从下面的详细描述中，本发明的其它特点和优点将变得明显。但 是，应该理解的是，详细描述和用于表明本发明的实施方案的具体实 施例的给出仅仅是为了举例说明，因为根据详细描述，对于本领域的 专业技术人员来说，在本发明的精神和范围之内进行的各种改变和修 饰将变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图对本发明的优选实施方案进行更全面的描述：
图1显示了在再灌注后缺血肾脏中RelB基因的表达增加。使用热 局部/再灌注模型使CDl小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。RelB的表达通过 RT-PCR测定。
图2显示了在再灌注后缺血的肾脏中Fas基因的表达增加。使用 热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左侧肾 脏的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的 夹住时间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Fas的表达 通过RT-PCR测定。
图3显示了在再灌注后缺血的肾脏中caspase 8基因的表达增加。 使用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左 肾的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的 夹住时间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Caspase 8 的表达通过RT-PCR测定。
图4显示了在再灌注后缺血的肾脏中caspase 3基因的表达增加。 使用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏局部缺血损伤。在37℃下 将左肾的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指 定的夹住时间点后，从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Caspase 3的表达通过RT-PCR测定。
图5显示了在再灌注后缺血的肾脏中C3基因的表达增加。使用热 缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。C3的表达通过 RT-PCR测定。
图6显示了在再灌注后缺血的肾脏中C5aR基因的表达增加。使 用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。C5aR的表达通过 RT-PCR测定。
图7显示了在体外使用siRNA对caspase-3基因的沉默。将Caspase 3-siRNA表达载体转染到表达Caspase 3的巨噬细胞系中。在基因沉默 48小时后，提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。
图8显示了在体外使用siRNA对caspase-8基因的沉默。将Caspase 8-siRNA表达载体转染到表达Caspase 8的巨噬细胞系中。在基因沉默 48小时后，提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。
图9显示了在体外使用siRNA对RelB基因的沉默。将RelB cDNA 和RelB-siRNA共转染到巨噬细胞系中。在基因转染和沉默48小时后， 提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。证实了合成的siRNA和 siRNA表达载体都有力地沉默RelB的表达增加。
图10显示了在体外使用siRNA对Fas基因的沉默。将Fas-siRNA 表达载体转染到表达Fas的巨噬细胞系中。在基因沉默48小时后，提 取蛋白，通过Western印迹测定Fas的表达。
图11显示了肾脏中caspase 3基因的沉默。对CD1小鼠静脉内注 射50μg特异性针对caspase 3基因的siRNA。在37℃下将肾静脉和动 脉夹住25分钟。在基因沉默48小时后，从肾脏提取总RNA，通过 RT-PCR测定Caspase的表达。
图12显示了肾脏中Fas基因的沉默。对CD1小鼠静脉内注射50μg 特异性针对Fas基因的siRNA。在37℃下将肾静脉和动脉夹住25分钟。 在基因沉默48小时后，从肾脏提取总RNA，通过RT-PCR测定Fas的 表达。
图13A和13B证实了通过免疫炎性基因的沉默防止肾脏中的缺血 再灌注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对单独或组合的 TNFα和RelB基因的siRNA。在基因沉默后，在37℃下将肾静脉和动 脉夹住25分钟。通过在再灌注后24小时检测血肌酐(A)和BUN(B) 水平来测定肾功能。
图14A和14B证实了通过凋亡基因的沉默防止肾脏中的缺血再灌 注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对单独或组合的Caspase 3、Caspase 8和Fas基因的siRNA。在基因沉默后，在37℃下将肾静 脉和动脉夹住25分钟。通过在再灌注后24小时检测血肌酐(A)和 BUN(B)水平来测定肾功能。
图15A和15B证实了通过组合的基因沉默防止肾脏中的缺血再灌 注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对下列组的siRNA： 第一组，caspase 3、caspase 8和Fas基因；第二组，TNFα和RelB基因； 第三组，C3和C5aR基因；第四组，所有上述基因(S-mix)。在基因 沉默后，在37℃下将肾静脉和动脉夹住25分钟。通过在再灌注后24 小时检测血肌酐(A)和BUN(B)水平来测定肾功能。
图16证实了基因沉默防止缺血再灌注损伤后小鼠的死亡。对CD1 小鼠静脉内注射50μg特异性针对Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、 TNFα和RelB基因的siRNA混合物的混合物。在基因沉默后，在37℃ 下将肾静脉和动脉夹住35分钟。
图17A-D证实了C3和Caspase 3基因的体外基因沉默。(C3-17A &17B)L929细胞株使用lipofectamine 2000用C3cDNA载体转染，并 与C3siRNA、空载体或无siRNA(对照)共转染。在转染后24小时， 收获细胞，提取总RNA。使用RT-PCR(17A)和定量PCR(17B)测 定C3和GAPDH的转录本。(Caspase 3-17C&17D)为了沉默Caspase 3基因，将L929细胞用Caspase 3siRNA、空载体或无siRNA(对照) 转染。在转染后24小时，使用RT-PCR(17C)和定量PCR(17D)测 定Caspase 3的表达。
图18A-B证实了C3的体内沉默。(18A)I/R损伤后肾脏中C3 和Caspase 3基因的表达上调。如实施例部分所述将左肾夹住25分钟。 在夹住后指定的时间点获取肾脏。通过RT-PCR检测C3和Caspase 3 的表达。(18B)将小鼠用50μg C3siRNA和Caspase 3siRNA或空载 体预处理48小时，然后进行I/R实验。在I/R后24小时获取肾脏，使 用RT-PCR检测C3和Caspase 3基因的表达。
图19A-D显示了I/R损伤的肾脏中的组织学变化。按照图18B中 的描述将小鼠用siRNA处理并进行I/R损伤实验。I/R后24小时获取 肾脏组织并切片，然后用H&E染色。(19A)正常的未钳夹肾脏；(19B) PBS处理的I/R肾脏；(19C)空载体处理的I/R肾脏；(19D)C3siRNA 和Caspase 3siRNA处理的I/R肾脏。
图20显示了使用Caspase 3和C3，siRNA保护肾脏免于I/R损伤。 a)在I/R损伤实验之前48小时，静脉内50mg siRNA或空载体处理小鼠。 在I/R后24小时，采集血液测定BUN和血清肌酐的水平。数据被显示 为平均值±SEM。p值使用Student′s t检验与PBS处理的对照组相比较。 在I/R损伤实验之前48小时，静脉内50mg siRNA或空载体处理小鼠。 小鼠的存活率被观察到I/R损伤后第八天。
图21A-B显示了肾脏IRI中caspase-3/8的表达增加。(21A)通过 RT-PCR检测的Caspase-3的表达。如材料与方法中所述，将左肾钳住 25分钟。钳住后24小时，获取肾脏，提取总RNA。使用特异性针对 caspase-3(21A)和caspase-8(21B)以及GAPDH基因的引物扩增转录。 显示的数据代表了对每组5只动物进行的实验。
图22A-D显示了体内对caspase-3/8的沉默。50μg pRNAT U6.1 载体含有caspase-3siRNA或caspase-8siRNA。对照包括空白载体(无 siRNA)处理和PBS处理组。基因沉默后48小时，将肾脏钳住25分 钟。夹住后24小时，获取肾脏，提取总RNA。通过RT-PCR(22A&22B) 以及定量实时PCR(22C&22D)测定caspase-3(22A&22C)和caspase-8 (22B&22D)以及GAPDH的转录本。
图23A-B显示了在IRI中siRNA保护了肾功能。将肾蒂钳住25 分钟。在钳住前(0h)和再灌注后24小时(24h)收集血液以测定BUN (23A)和血清肌酐(23B)水平。数据被显示为平均值±SEM(*p＜0.05， caspase-3/8-siRNA处理的小鼠对比未处理的和钳住的小鼠)。
图24显示了siRNA防护致命的肾脏缺血。将小鼠用50μg caspase-3和8-siRNA载体或空白载体或PBS静脉处理，然后钳住35 分钟。siRNA处理的(n＝10)和对照载体处理的(n＝10)或PBS对照 小鼠的存活率被观察8天(p＜0.05，caspase-3/8siRNA处理的小鼠对 比未处理的和钳住的小鼠)。
图25显示了RelB siRNA在体外沉默RelB基因的表达。在用 RPMI、转染试剂、空载体、混合的siRNA和RelB siRNA处理的L929 细胞株中，通过RelB和GAPDH表达的RT-PCR分析了RelB mRNA 的沉默。显示了代表性的样品。
图26A-B显示了在体内缺血再灌注后RelB表达的上调，通过RelB 和GAPDH表达的RT-PCR测试了来自未处理的小鼠或被夹住25分钟 的小鼠在24小时点时的肾脏组织匀浆液中的RelB沉默效率(26A、B)。 siRNA对RelB下调的基因表达。动物按照实施例部分中的描述进行处 理。组织来自未处理的动物、用RelB siRNA处理24小时和48小时的 动物。RelB基因表达按照方法中的描述通过RT-PCR评估。结果也表 示为与GAPDH相比的变化倍数的平均值+/-SD。
图27A-B显示了在RelB siRNA沉默后肾功能的改善。按照实施 例部分中的描述，小鼠在2天前接受溶于PBS的siRNA(实心条)或 仅仅是PBS(斑点条)的单剂流体力学注射。按照指示，在夹住后24 小时获取样品。(27A)BUN在阳性对照动物(PBS)中增加，但是在 siRNA处理的小鼠中减少。(27B)肌酐水平在用PBS注射的小鼠中身 高，但在用siRNA处理的组中不高。
图28A-B显示了siRNA对肾脏缺血损伤的保护。小鼠肾脏经过缺 血25分钟，然后进行24小时的再灌注。肾脏组织在10％中性缓冲的 福尔马林中固定48小时，然后包埋在石蜡中。(28A)缺血再灌注导 致了严重的嗜中性白细胞浸润管状空泡形成和管型形成。(28B)RelB siRNA降低了缺血再灌注的损伤。
图29显示了RelB siRNA的流体动力学注射保护了小鼠免于致命 的肾脏缺血再灌注损伤：在35分钟的肾脏缺血和灌注后的存活率。
图30显示了从小鼠获得并保存在本发明的含有针对RelB、Fas、 caspase-3、caspase-8、TNFα、C5aR和C3的siRNA的siRNA组合物 中的心脏，可以被移植到受体小鼠中并且心脏存活了，而在相比较的 对照组中心脏死亡了。心脏从BALB/c小鼠获得，在本发明的含有UW 溶液的siRNA组合物中于4℃保存48小时。体外保存的器官在心脏移 植中用作供体。受体是同源种系的BALB/c小鼠。每天监测心跳。对 照仅仅保存在UW溶液中。对照器官在使用UW溶液保存48小时后死 亡。siRNA处理的心脏一直跳动到试验结束时(40天)。照片显示了 移植后40天的心脏器官。
最近，已经开发了小干扰RNA(siRNA)，与其它已知的基因抑 制方法相比，它提供了更为有力、特异和持续时间长的基因抑制(Scherr 等，Curr Med Chem，2003.10(3)：p.245-56)。已经证实低浓度的siRNA 可以用于沉默DC细胞因子的生产，并调节DC活化T细胞的能力。本 申请人的PCT CA03/00867描述了通过使用siRNA对免疫细胞、包括 DC的操纵，以及使用siRNA沉默的DC修饰T细胞反应的方法。
组织和器官的移植需要提供活的组织和器官。自体和异体移植受 到组织或器官在移植之前该组织或器官可以维持存活的时间的限制。 供体器官在低温条件下(4℃)在特别配制的灌注溶液中进行冲洗和储 存，以便洗掉碎片并减小在运输过程中的损伤。这些溶液根据它们模 拟的生理环境可以被广义上区分为“细胞外的”和“细胞内的”。所 述溶液含有活性成分，所述活性成分在再灌注过程中能够最小化由低 温引起的细胞膨胀、抑制由缺血导致的酸中毒、最小化细胞外膨胀、 最小化自由基损伤并提供ATP再生的底物。美国专利No.5,110,722以 及美国专利申请序号2003/0109433和2005/0100876描述了用来得到更 好的移植功能的器官储存溶液。也可以通过加入自由基保护剂、胱天 蛋白酶(caspase)抑制剂和血管紧张肽转换酶抑制剂来调节器官储存 溶液(Baker等，J Surg Res，1999.86(1)：p.145-9；McAnulty等， Cryobiology，1996，33(2)：P.217-25；Natori等，Liver Transpl，2003.9(3)： p.278-84；Randsbaek等，Scand Cardiovasc J，2000192(1)：p.31-40)。
已经尝试了通过使用抑制供体辅助刺激分子并增加移植存活率的 灌注溶液来尝试免疫调制(Wekerle等，Curr Opin Immunol，2002.14(5)： p.592-600)。已经证实了使用裸反义DNA灌注肾脏移植物能够抑制 细胞内粘附分子-1的表达(Chen等，Transplantation，1999.68(6)：p. 880-7)。类似地，通过在器官储存溶液中添加诱骗寡核苷酸，在心脏 同种异体移植物中进行了NF-κB活性的抑制(Vos等，Faseb J，2000. 14(5)：p.592-600)。但是，这两种方法都需要高浓度的寡核苷酸用于 诱导，这导致了边缘性的疗效。
美国专利申请公布No.2006/0073127描述了使用选定的RNAi剂 来制备用于移植的组织。但是，该方法使用短灌注时间，并且组织的 储存被维持在通常4℃的冷藏温度下。此外，使用裸siRNA显示出导 致组织中扩散差，因此是无效的。Bradley等(Transplantation Proceedings， 37，233-236，2005)简单地证明了使用siRNA进行胰岛细胞的成像。
因此，非常希望能够提供改进的器官储存/再灌注溶液以及使用它 们的方法，从而有效调节器官、组织和细胞降低免疫识别，进而引起 存活率和受体接受程度的改进。
发明简述
本发明涉及一种组合物，用于在离体储存、再灌注和运输过程中 保存器官、组织和/或细胞的存活性，使得器官、组织和/或细胞可以成 功用于体内移植。移植可以是自体或异体的。本发明还涉及了使用这 样的组合物以将器官、组织和/或细胞离体维持在可用于移植的存活状 态的方法。本发明还涉及被调节的器官、组织和/或细胞自身。本发明 的组合物包含了siRNA，它们被特异性定靶/定向，以使负责器官、组 织和/或细胞中存活力丧失和/或细胞损伤或与之有关的基因表达被沉 默。在本发明的一些方面中，被定靶的基因是参与凋亡、免疫炎性反 应和补体活化的基因。
本发明的一个方面是用于将细胞、组织和/或器官维持在存活状态 的组合物。在离体储存过程和体内再灌注过程中，细胞、组织和/或器 官被维持在存活状态。所述组合物含有一种或多种siRNA，所述siRNA 特异性针对其表达与离体组织或器官中存活力丧失或细胞损伤相关的 基因。因此，siRNA靶向这些基因的表达。这样的基因可以包括一种 或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因，以及这些不同基因的各 种组合。
本发明的一个方面是用于在离体储存过程和体内再灌注过程中将 细胞、组织和/或器官维持在存活状态的组合物，该组合物含有siRNA， 所述siRNA特异性针对其表达与离体组织或器官中存活力丧失或细胞 损伤相关的基因。
在本发明的一些方面中，所述组合物是储存溶液，其允许细胞、 组织和/或器官在室温或冷藏温度下储存的时间段比使用现有的临床接 受的溶液所能达到的更长。在本发明的一些方面中，组合物被提供为 大约37℃，并含有靶向一种或多种凋亡基因、一种或多种免疫炎性基 因和一种或多种补体基因、以及它们的各种组合的siRNA的组合。
根据本发明，提供了一种组合物，用于细胞、组织和/或器官在再 灌注和离体期间维持存活力，使得细胞、组织和/或器官能够存活用于 移植，该组合物含有靶向一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体 基因表达的一种或多种siRNA。在本发明的一些方面中，所述组合物 还可以含有已知能够帮助细胞、组织和/或器官离体存活的其它试剂， 如后文所述。
本发明的另一方面，是在移植前储存或运输细胞、组织和/或器官 并同时将它们维持在存活状态的方法。
本发明的另一方面，是延迟缺血对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的另一方面，是延迟凋亡对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的另一方面，是延迟炎症对器官、组织和/或细胞存活力的 有害影响的方法，以及适合于用在这样的方法中的储存溶液。
本发明的还另一方面，是维持器官、组织和/或细胞在从哺乳动物 宿主中切除之前的再灌注过程中的存活力的方法。
本发明的还另一方面，是改变细胞、组织和/或器官，致使细胞、 组织和/或器官在移植前以及移植过程中的储存和再灌注过程中存活的 方法。
本发明的另一方面，是在移植前维持组织或器官保持离体存活的 方法，包括将组织或器官与特异性针对其表达与离体组织或器官的存 活力的丧失或细胞损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。这样的 基因可以包括一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因、补体基因及其组 合。
本发明的另一方面，是保护哺乳动物的组织或器官免于缺血和/或 再灌注损伤的方法，包括将组织或器官与特异性针对其表达与缺血和/ 或再灌注损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。在一些方面，所 述siRNA被提供为组合物。在其它方面，siRNA组合物在高于4℃的 温度下提供，在还有的其它方面，则是在大约37℃的温度下。
本发明的一个方面，是在移植前维持组织、细胞或器官离体维持 的存活力的方法，该方法包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表 达与离体组织、细胞或器官的存活力的丧失或细胞损伤有关的基因的 至少一种siRNA相接触，其中所述接触在高于大约4℃的温度下进行。
本发明的另一方面是保护哺乳动物的组织、细胞或器官免于缺血 和/或再灌注损伤的方法，包括将组织、细胞或器官与特异性针对其表 达与缺血和/或再灌注损伤有关的基因的至少一种siRNA相接触。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与含有siRNA的溶液相接触； 以及
ii)在非冷冻状态下低于环境的温度下维持细胞、组织或器官与 溶液的接触。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与含有siRNA的溶液相接触； 以及
ii)在大约37℃的温度下维持细胞、组织或器官与溶液的接触。
本发明的还另一方面是改变的细胞、组织或器官，其中所述改变 的细胞、组织或器官含有被靶向以沉默一种或多种凋亡基因、免疫炎 性基因和补体基因的表达的siRNA。在一些方面，细胞、组织和/或器 官被离体提供并维持。在其它方面，细胞、组织和/或器官被提供在体 内，即移植到适合的哺乳动物受体中。
本发明的还另一方面是制备用于移植的组织的方法，该方法包括：
-将该组织暴露于含有siRNA的组合物，所述siRNA被靶向以沉 默一种或多种凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因的表达，
-将所述暴露维持足以下调所述一种或多种凋亡基因、免疫炎性基 因和补体基因的时间。
在一些方面，暴露在大约4℃到大约37℃的温度下进行。在其它 方面，所述组织是肾脏。
本发明的另一方面是将细胞、组织或器官储存在存活状态下的方 法，该方法包括：
i)将要储存的细胞、组织或器官与组合物相接触，所述组合物含 有至少一种特异性针对其表达与存活力损失或细胞损伤有关的基因的 siRNA；以及
ii)在从大约低于环境的温度直到大约37℃的温度下维持细胞、组 织或器官与溶液的接触。
在阅读了下面的描述后，本发明的其它方面和优点将会清晰。
从下面的详细描述中，本发明的其它特点和优点将变得明显。但 是，应该理解的是，详细描述和用于表明本发明的实施方案的具体实 施例的给出仅仅是为了举例说明，因为根据详细描述，对于本领域的 专业技术人员来说，在本发明的精神和范围之内进行的各种改变和修 饰将变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图对本发明的优选实施方案进行更全面的描述：
图1显示了在再灌注后缺血肾脏中RelB基因的表达增加。使用热 局部/再灌注模型使CDl小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。RelB的表达通过 RT-PCR测定。
图2显示了在再灌注后缺血的肾脏中Fas基因的表达增加。使用 热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左侧肾 脏的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的 夹住时间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Fas的表达 通过RT-PCR测定。
图3显示了在再灌注后缺血的肾脏中caspase 8基因的表达增加。 使用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左 肾的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的 夹住时间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Caspase 8 的表达通过RT-PCR测定。
图4显示了在再灌注后缺血的肾脏中caspase 3基因的表达增加。 使用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏局部缺血损伤。在37℃下 将左肾的肾静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指 定的夹住时间点后，从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。Caspase 3的表达通过RT-PCR测定。
图5显示了在再灌注后缺血的肾脏中C3基因的表达增加。使用热 缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血损伤。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。C3的表达通过 RT-PCR测定。
图6显示了在再灌注后缺血的肾脏中C5aR基因的表达增加。使 用热缺血/再灌注模型使CD1小鼠经历肾脏缺血。在37℃下将左肾的肾 静脉和动脉夹住25分钟。然后取出右肾。在夹住实验后指定的夹住时 间点后从肾脏提取RNA。对照是正常小鼠的RNA。C5aR的表达通过 RT-PCR测定。
图7显示了在体外使用siRNA对caspase-3基因的沉默。将Caspase 3-siRNA表达载体转染到表达Caspase 3的巨噬细胞系中。在基因沉默 48小时后，提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。
图8显示了在体外使用siRNA对caspase-8基因的沉默。将Caspase 8-siRNA表达载体转染到表达Caspase 8的巨噬细胞系中。在基因沉默 48小时后，提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。
图9显示了在体外使用siRNA对RelB基因的沉默。将RelB cDNA 和RelB-siRNA共转染到巨噬细胞系中。在基因转染和沉默48小时后， 提取总RNA，通过RT-PCR测定基因的表达。证实了合成的siRNA和 siRNA表达载体都有力地沉默RelB的表达增加。
图10显示了在体外使用siRNA对Fas基因的沉默。将Fas-siRNA 表达载体转染到表达Fas的巨噬细胞系中。在基因沉默48小时后，提 取蛋白，通过Western印迹测定Fas的表达。
图11显示了肾脏中caspase 3基因的沉默。对CD1小鼠静脉内注 射50μg特异性针对caspase 3基因的siRNA。在37℃下将肾静脉和动 脉夹住25分钟。在基因沉默48小时后，从肾脏提取总RNA，通过 RT-PCR测定Caspase的表达。
图12显示了肾脏中Fas基因的沉默。对CD1小鼠静脉内注射50μg 特异性针对Fas基因的siRNA。在37℃下将肾静脉和动脉夹住25分钟。 在基因沉默48小时后，从肾脏提取总RNA，通过RT-PCR测定Fas的 表达。
图13A和13B证实了通过免疫炎性基因的沉默防止肾脏中的缺血 再灌注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对单独或组合的 TNFα和RelB基因的siRNA。在基因沉默后，在37℃下将肾静脉和动 脉夹住25分钟。通过在再灌注后24小时检测血肌酐(A)和BUN(B) 水平来测定肾功能。
图14A和14B证实了通过凋亡基因的沉默防止肾脏中的缺血再灌 注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对单独或组合的Caspase 3、Caspase 8和Fas基因的siRNA。在基因沉默后，在37℃下将肾静 脉和动脉夹住25分钟。通过在再灌注后24小时检测血肌酐(A)和 BUN(B)水平来测定肾功能。
图15A和15B证实了通过组合的基因沉默防止肾脏中的缺血再灌 注损伤。对CD1小鼠静脉内注射50μg特异性针对下列组的siRNA： 第一组，caspase 3、caspase 8和Fas基因；第二组，TNFα和RelB基因； 第三组，C3和C5aR基因；第四组，所有上述基因(S-mix)。在基因 沉默后，在37℃下将肾静脉和动脉夹住25分钟。通过在再灌注后24 小时检测血肌酐(A)和BUN(B)水平来测定肾功能。
图16证实了基因沉默防止缺血再灌注损伤后小鼠的死亡。对CD1 小鼠静脉内注射50μg特异性针对Caspase 3、Caspase 8、Fas、C3、C5aR、 TNFα和RelB基因的siRNA混合物的混合物。在基因沉默后，在37℃ 下将肾静脉和动脉夹住35分钟。
图17A-D证实了C3和Caspase 3基因的体外基因沉默。(C3-17A &17B)L929细胞株使用lipofectamine 2000用C3cDNA载体转染，并 与C3siRNA、空载体或无siRNA(对照)共转染。在转染后24小时， 收获细胞，提取总RNA。使用RT-PCR(17A)和定量PCR(17B)测 定C3和GAPDH的转录本。(Caspase 3-17C&17D)为了沉默Caspase 3基因，将L929细胞用Caspase 3siRNA、空载体或无siRNA(对照) 转染。在转染后24小时，使用RT-PCR(17C)和定量PCR(17D)测 定Caspase 3的表达。
图18A-B证实了C3的体内沉默。(18A)I/R损伤后肾脏中C3 和Caspase 3基因的表达上调。如实施例部分所述将左肾夹住25分钟。 在夹住后指定的时间点获取肾脏。通过RT-PCR检测C3和Caspase 3 的表达。(18B)将小鼠用50μg C3siRNA和Caspase 3siRNA或空载 体预处理48小时，然后进行I/R实验。在I/R后24小时获取肾脏，使 用RT-PCR检测C3和Caspase 3基因的表达。
图19A-D显示了I/R损伤的肾脏中的组织学变化。按照图18B中 的描述将小鼠用siRNA处理并进行I/R损伤实验。I/R后24小时获取 肾脏组织并切片，然后用H&E染色。(19A)正常的未钳夹肾脏；(19B) PBS处理的I/R肾脏；(19C)空载体处理的I/R肾脏；(19D)C3siRNA 和Caspase 3siRNA处理的I/R肾脏。
图20显示了使用Caspase 3和C3，siRNA保护肾脏免于I/R损伤。 a)在I/R损伤实验之前48小时，静脉内50mg siRNA或空载体处理小鼠。 在I/R后24小时，采集血液测定BUN和血清肌酐的水平。数据被显示 为平均值±SEM。p值使用Student′s t检验与PBS处理的对照组相比较。 在I/R损伤实验之前48小时，静脉内50mg siRNA或空载体处理小鼠。 小鼠的存活率被观察到I/R损伤后第八天。
图21A-B显示了肾脏IRI中caspase-3/8的表达增加。(21A)通过 RT-PCR检测的Caspase-3的表达。如材料与方法中所述，将左肾钳住 25分钟。钳住后24小时，获取肾脏，提取总RNA。使用特异性针对 caspase-3(21A)和caspase-8(21B)以及GAPDH基因的引物扩增转录。 显示的数据代表了对每组5只动物进行的实验。
图22A-D显示了体内对caspase-3/8的沉默。50μg pRNAT U6.1 载体含有caspase-3siRNA或caspase-8siRNA。对照包括空白载体(无 siRNA)处理和PBS处理组。基因沉默后48小时，将肾脏钳住25分 钟。夹住后24小时，获取肾脏，提取总RNA。通过RT-PCR(22A&22B) 以及定量实时PCR(22C&22D)测定caspase-3(22A&22C)和caspase-8 (22B&22D)以及GAPDH的转录本。
图23A-B显示了在IRI中siRNA保护了肾功能。将肾蒂钳住25 分钟。在钳住前(0h)和再灌注后24小时(24h)收集血液以测定BUN (23A)和血清肌酐(23B)水平。数据被显示为平均值±SEM(*p＜0.05， caspase-3/8-siRNA处理的小鼠对比未处理的和钳住的小鼠)。
图24显示了siRNA防护致命的肾脏缺血。将小鼠用50μg caspase-3和8-siRNA载体或空白载体或PBS静脉处理，然后钳住35 分钟。siRNA处理的(n＝10)和对照载体处理的(n＝10)或PBS对照 小鼠的存活率被观察8天(p＜0.05，caspase-3/8siRNA处理的小鼠对 比未处理的和钳住的小鼠)。
图25显示了RelB siRNA在体外沉默RelB基因的表达。在用 RPMI、转染试剂、空载体、混合的siRNA和RelB siRNA处理的L929 细胞株中，通过RelB和GAPDH表达的RT-PCR分析了RelB mRNA 的沉默。显示了代表性的样品。
图26A-B显示了在体内缺血再灌注后RelB表达的上调，通过RelB 和GAPDH表达的RT-PCR测试了来自未处理的小鼠或被夹住25分钟 的小鼠在24小时点时的肾脏组织匀浆液中的RelB沉默效率(26A、B)。 siRNA对RelB下调的基因表达。动物按照实施例部分中的描述进行处 理。组织来自未处理的动物、用RelB siRNA处理24小时和48小时的 动物。RelB基因表达按照方法中的描述通过RT-PCR评估。结果也表 示为与GAPDH相比的变化倍数的平均值+/-SD。
图27A-B显示了在RelB siRNA沉默后肾功能的改善。按照实施 例部分中的描述，小鼠在2天前接受溶于PBS的siRNA(实心条)或 仅仅是PBS(斑点条)的单剂流体力学注射。按照指示，在夹住后24 小时获取样品。(27A)BUN在阳性对照动物(PBS)中增加，但是在 siRNA处理的小鼠中减少。(27B)肌酐水平在用PBS注射的小鼠中身 高，但在用siRNA处理的组中不高。
图28A-B显示了siRNA对肾脏缺血损伤的保护。小鼠肾脏经过缺 血25分钟，然后进行24小时的再灌注。肾脏组织在10％中性缓冲的 福尔马林中固定48小时，然后包埋在石蜡中。(28A)缺血再灌注导 致了严重的嗜中性白细胞浸润管状空泡形成和管型形成。(28B)RelB siRNA降低了缺血再灌注的损伤。
图29显示了RelB siRNA的流体动力学注射保护了小鼠免于致命 的肾脏缺血再灌注损伤：在35分钟的肾脏缺血和灌注后的存活率。
图30显示了从小鼠获得并保存在本发明的含有针对RelB、Fas、 caspase-3、caspase-8、TNFα、C5aR和C3的siRNA的siRNA组合物 中的心脏，可以被移植到受体小鼠中并且心脏存活了，而在相比较的 对照组中心脏死亡了。心脏从BALB/c小鼠获得，在本发明的含有UW 溶液的siRNA组合物中于4℃保存48小时。体外保存的器官在心脏移 植中用作供体。受体是同源种系的BALB/c小鼠。每天监测心跳。对 照仅仅保存在UW溶液中。对照器官在使用UW溶液保存48小时后死 亡。siRNA处理的心脏一直跳动到试验结束时(40天)。照片显示了 移植后40天的心脏器官。
具体实施方式
本发明涉及能够维持细胞、组织和/或器官离体的存活力、使得它 们可以储存、运输并然后用于体内移植的组合物。该组合物含有一种 或多种siRNA，其特异性针对靶向选自凋亡基因、免疫炎性基因、补 体基因及其组合的基因。靶向siRNA有效地抑制(下调)细胞、组织 和器官中被靶向的基因的表达，导致了细胞、组织和器官的存活。本 发明还提供了使用这些组合物的方法。有利的是，siRNA是非病毒性 的改变基因表达的方法，因此对于被免疫抑制的移植病人来说是优选 的。
“存活”或“存活的”是指细胞、组织或器官能够保留原有的功 能。因此，细胞、组织或器官能够以基本上保留其功能的方式被灌注、 运输、然后移植到体内。
本文中使用的术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本技术领 域中也被称为“短干扰RNA”)是指含有大约10到50个之间的核苷 酸(或核苷酸类似物)、能够指导或介导RNA干扰的RNA(或RNA 类似物)。在一些方面，siRNA含有大约15到30个之间的核苷酸或 核苷酸类似物，在其它方面含有大约16到25个之间的核苷酸(或核 苷酸类似物)，在另外一些方面含有大约18到23个之间的核苷酸(或 核苷酸类似物)，在还有一些方面含有大约19到22个之间的核苷酸 或(核苷酸类似物)(例如19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似 物)。
本文中使用的术语siRNA或RNAi试剂的“反义链”是指与被靶 向沉默的基因的mRNA的大约10-50个核苷酸、例如大约15-30、16-25、 18-23或19-22个核苷酸的部分基本上互补的链。反义链具有与所需的 靶mRNA序列足够互补的序列以指导靶特异性的RNA干扰(RNAi)， 例如足以通过RNAi机制或过程触发所需的靶mRNA破坏的互补性。 术语siRNA或RNAi试剂的“有义链”是指与反义链互补的链。反义 和有义链也可以被称为第一或第二链，与靶序列具有互补性的第一或 第二链，以及与所述第一或第二链具有互补性的相应第二或第一链。 指导链则是指进入RISC复合物并指导靶mRNA的切割的RNAi试剂的 链，例如siRNA双链体的反义链。术语“指导链”在本技术领域中通 常与术语“反义链”互换使用。
“靶基因”是指其表达将被选择性抑制或“沉默”的基因。这种 沉默是通过RNAi途径或过程切割靶基因的mRNA来实现的。在本发 明中，靶基因是其表达与存活力的丧失或细胞损伤有关的基因。这样 的基因选自一种或多种凋亡基因、一种或多种补体基因、一种或多种 免疫炎性基因及其组合。
本文中使用的术语“灌注”是倾注或通过的行动，特别是指流体 通过特定器官的血管。在本发明的具体实施方案中，含有siRNA的流 体通过移植组织的脉管系统被灌注。
术语“凋亡”或“程序性细胞死亡”是指在发育和其它正常的生 物过程中将不想要的或无用的细胞消除的生理过程。凋亡是在正常的 生理条件下发生的细胞死亡的模式，细胞在其自身的死亡中是主动的 参与者(“细胞自杀”)。它在正常细胞的更新和组织动态平衡、胚 胎发生、免疫耐受的诱导和维持、神经系统的发育和内分泌依赖性组 织萎缩过程中最为常见。凋亡也可以由外部事件或刺激引发，例如在 本发明的某些优选实施方案的情况下的缺血损伤。经历凋亡的细胞显 示出特征性的形态和生化特点。
“基因表达的抑制”是指来自靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平 的缺乏(或可察觉的减少)。“特异性”是指抑制靶基因而不明显影响 细胞的其它基因的能力。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外 部性质或通过生物化学技术例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern 杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸 附分析(ELISA)、Western印迹、放射免疫分析(RIA)、其它免疫 分析和荧光激活的细胞分析(FACS)来证实。
正如本领域的专业技术人员所理解的那样，可以断言任何类型移 植所需和使用的细胞、组织或器官都可以用于本发明。器官的代表性 的例子是心脏、肝脏、肺、胰和肾脏，但不限于此。细胞(即胰岛细 胞)或其它组织(即血管)也包含在本发明的范围内。
简单来说，siRNA是一种在哺乳动物细胞中用于抑制基因表达的 RNA干扰方法(Bertrand等，2002.Biochem Biophys Res Commun 296(4)： 1000-1004)。SiRNA是短的双链RNA分子，大约21-25个碱基对长， 它们与细胞质蛋白相互作用形成细胞内RNAi诱导的沉默复合物 (RISC)。RISC使用siRNA的反义链结合和切割相关的mRNA序列， 然后被非特异性的RNA酶降解。SiRNA在细胞质中发挥作用，与反义 寡聚核苷酸相比，实现靶基因的敲除所需要的浓度更低。
当获取器官用于移植时，随后的缺氧时期，接着是器官的再灌注， 都伴随着显著的组织损伤，包括内皮细胞凋亡和器质性功能障碍。这 种局部缺血/再灌注(I/R)损伤可能参与部分由转录因子NF-κB及其亚 基RelB控制的炎性反应、凋亡途径通过例如caspase的活化、补体系 统的激活以及免疫炎性基因例如Fas和TNF-α基因的活化。
本发明是基于使用siRNA来靶向那些可以导致用于移植的细胞、 组织和/或器官不能存活和存活力降低的那些基因的表达。这些基因可 以包括例如凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因及其组合。本发明提 供了含有一种或多种凋亡基因、一种或多种免疫炎性基因、一种或多 种补体基因及其组合的组合物，以及使用这样的组合物的方法。以这 种方式，提供了更有效的方法，更有效地将组织/细胞维持在存活状态， 以提高移植的成功率。
在本发明的一些方面中，适合的凋亡基因可以包括但不限于 caspase 3基因、caspase 8基因和fas基因。适合的免疫炎性基因可以包 括但不限于TNF-α基因和RelB基因。适合的补体基因可以包括但不限 于C3和C5aR。本领域的专业技术人员也可以理解的是，如果需要， 可以使用siRNA靶向基因的组合。本领域的技术人员将会容易地理解 哪些参与凋亡、免疫炎性的其它基因和参与启动凝结的基因可以被用 于本发明的组合物中。本领域的技术人员也将会容易地理解能够用于 本发明的短基因序列，在本文的实施例部分中列举了其中的一些，仅 作为代表性的例子而不意味着限制。此外，用于本发明的凋亡基因的 代表性例子显示在表1中，用于本发明的补体基因的代表性例子显示 在表2中。本领域的技术人员可以获得这些基因的序列用于本发明组 合物以及方法中的siRNA。
现在，本发明在一个实施方案中，使用已接受的小鼠缺血/再灌注 (I/R)损伤系统模型，证实了用特异性靶向一种或多种上述与组织损 伤反应有关的基因的siRNA来灌注经受I/R损伤的器官，减少了这些 基因的表达，从而防止了组织损伤的状况并提高了器官的存活力。在 本发明的该实施方案中，尽管I/R损伤在对照组中产生了肾损伤，但在 siRNA处理过的肾脏中已经证实维持了良好的肾功能。这表明了本发 明的方法和组合物提供了改善的存活力。当经历缺血和再灌注的器官 被维持在37℃时，即比通常用于移植器官的条件(通常维持在低温下) 严酷得多的条件下，观察到了基因表达的抑制。
正如本领域的技术人员所了解的那样，本发明可以应用于细胞、 组织或器官。适合的器官可以是但不限于心脏、肝脏、肺脏、胰脏和 肾脏。在本发明的一些方面，siRNA的投送是在获取器官的过程中或 始终(例如通过所述器官的脉管系统用药)以及从器官分离可移植的 细胞的过程中或始终进行的。siRNA组合物和方法可用于器官获取过 程的几种情况中：1)获取前在死亡供体中通过静脉内灌注；2)在包装 以运输之前通过器官灌注；和/或3)在细胞培养中。
更具体来说，可以通过在供移植的获取之前或获取之后用选定的 siRNA进行处理，来保护组织或器官免于细胞损伤。例如，可以使用 本发明的siRNA组合物对组织或器官再灌注所需的时间；简单地将组 织或器官在本发明的siRNA组合物中浸泡和储存所需的时间；或者组 织或器官可以再灌注并浸泡和储存在本发明的siRNA组合物中。当然， 正如本领域的专业技术人员所了解的那样，这也适用于细胞。在本发 明的实施方案中，组织或器官在获取前用siRNA溶液灌注。所需器官 的灌注可以长达例如大约30或60分钟，如本领域的专业技术人员所 了解的那样。然后将获取的灌注过的组织或器官储存在siRNA溶液中， 根据组织或器官的类型，这种储存可以长达大约24小时或48小时， 正如本领域的专业技术人员所了解的那样。这样，本发明的siRNA可 以用于各种方法中以防止细胞的凋亡、延长组织和器官的寿命、防止 和/或最小化缺血损伤、以及帮助防止组织/器官的排斥，这是因为组织 /器官处于存活状态中从而提供了较少的有害自身免疫反应。本发明的 组合物可以用于各种温度，包括大约2-4℃的冷藏温度到大约37℃的体 温，这是本领域的专业技术人员早就了解的。本发明的组合物的使用 可以利用已知用于再灌注和浸泡并储存组织、细胞和器官的标准程序 来进行。
在本发明的特定方面，所述组合物和方法在超过4℃直到约37℃ 或更高的温度下有效，并且仍然能够有效抑制/防止/最小化对细胞、组 织和器官的缺血损伤。这是特别有利的，因为不需要担心将组织或器 官保持冷藏以用于移植。
本发明的siRNA组合物通过用含有siRNA的适合的生理溶液灌注 和/或浸泡离体组织、器官或细胞，来施用于器官或组织或细胞(Hamar， P.，等，Proc Natl Acad Sci 2004；101：41)。例如，可以使用可商购的 器官储存溶液，例如但不限于Collins溶液、(UW)-溶液、组氨酸- 色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液、ViaSpanTM(细胞内)和Celsior溶液 (细胞外)(Muhlbacher等，1999，Transplant Proc 31(5)：2069-2070)。 此外，其它已知的添加剂也可以与本发明的siRNA组合用于组合物中。 这样的添加剂可以包括例如但不限于超氧化物歧化酶和其它自由基清 除剂(Baker等，1999，J Surg Res 86(1)：145-149；McAnulty和Huang 1996，Cryobiology 33(2)：217-225；McLaren和Friend 2003，Transpl Int 16(10)：701-708)、21-氨基类固醇(lazaroids)、抗凋亡剂(El-Gibaly 等，2004，Hepatology 39(6)：1553-1562；Natori等，2003，Liver Transpl 9(3)：278-284)、钙通道阻断剂(Arnault等，2003，Transplantation 76(1)：77-83)、细胞间粘附分子-1抑制剂(Stepkowski等，1998， Transplantation 66(6)：699-707；Chen等，1999，Transplantation 68(6)：880-887)、己酮可可豆碱(Randsbaek等，2000，Scand Cardiovasc J 34(2)：201-208)以及它们的组合。
siRNA可以用于各种策略中来沉默选定的基因。例如，可以使用 下面的4种策略：1)使用商业上预先合成的“siRNA池”(Dharmacon Inc)，由21个碱基对的寡核苷酸组成，同时靶向靶基因的位点例如 RelB基因的4个位点(图1)，显示出大于75％的基因沉默效能；2)使 用带有pol III启动子的siRNA表达载体(pSilencerTM，Ambion Inc)， 其驱动发夹RNA表达以形成双链RNA，用作内源表达的siRNA。通过 克隆技术可以制备大量的沉默子-siRNA，用于体外(图2)和体内基因 沉默；3)使用siRNA表达盒(SEC)，它作为PCR产物被产生，由侧 翼带有启动子和终止子序列的发夹siRNA模板组成(图3)。一旦SEC 被转染到细胞中，发夹siRNA从PCR产物表达并导致基因沉默(图4)。 SEC的优点在于它极富时间效率的事实，能够在许多候选序列中快速 筛选出最有潜力的siRNA；4)使用SEC载体。由于SEC收率低，因 此有效的SEC随后必须被克隆到病毒或非病毒载体中(图5)。当然， 正如本领域的专业技术人员所悉知的那样，其它的策略也包含在本发 明的范围内。
根据具体的靶基因或基因组合以及投送的siRNA剂量，可以获得 靶基因功能的部分或完全丧失。例如靶细胞的基因表达可以减小或丧 失至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或以上。抑制基因 表达是指靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平的缺少(或可察觉的降 低)。特异性是指抑制靶基因而对细胞的其它基因没有明显影响的能 力。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外部性质(如下面实施 例中所述)或通过生物化学技术例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、 Northern杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联 免疫吸附分析(ELISA)、Western印迹、放射免疫分析(RIA)、其 它免疫分析和荧光激活的细胞分析(FACS)来证实。
siRNA可以以各种形式施用于组织或器官或细胞，例如(1)作为 裸siRNA寡核苷酸；(2)掺入到siRNA表达载体中，该表达载体驱动 发夹RNA表达以形成双链RNA，用作内源表达的siRNA。例如，可以 使用pSilencer 2.0-U6(Ambion Inc.Austin TX)构建siRNA表达载体。 特定的siRNA插入寡核苷酸应该按照用户说明书设计。寡聚核苷酸含 有19mer的特异性针对mRNA靶的发夹序列、将两个互补结构域分隔 开的环序列、两个3′-末端突出的核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷尾用于终 止转录、以及5′单链突出端用于以BamHl和Hind III连接到pSilencer 中。编码有义和反义发夹siRNA的寡核苷酸被退火，作为插入片段， 如在Shi，Y.，(2003)，Trends Genet.，v.19，pp.9-12中所述；(3)作为 siRNA表达盒(SEC)的形式，它作为PCR产物被产生，由两侧带有 启动子和终止子序列的发夹siRNA模板以及组成，如Castanotto等， (2002)，Rna，v.8，pp.1454-60中描述的那样。简单来说，SEC是使用沉 默子表达试剂盒(Ambion Inc，Austin TX)产生的。按照用户说明书设 计用于前体SEC的有义和反义发夹siRNA模板寡核苷酸。寡核苷酸含 有19-mer特异性针对mRNA靶的发夹序列、将两个互补结构域分隔开 的环、两个3′-末端突出的核苷酸。简单来说，进行了两个PCR反应， 使用启动子元件(小鼠U6)作为模板、启动子PCR引物和基因特异性 的有义和反义寡核苷酸产生前体SEC。第一个PCR产物被用作第二个 PCR的模板。进行了第三个PCR以在5′末端修饰核苷酸，并编码EcoR I和Hind III限制性位点(图1)。在PCR中使用Taq聚合酶(Invetregene Inc.)；以及(4)掺入到载体中的SEC。一旦鉴定到有效的SEC，将SEC 用Mun I(与EcoR I相容)和Hind III位点克隆到pVP22中，如同Paul (2003)，Mol.Ther，v.7，pp.237-247中描述的那样。
本文描述的任何上述形式的siRNA都可对哺乳动物应用使用并施 用，包括动物和人类。至于组合物中使用的siRNA的量，在动物例如 小鼠中可以每次注射使用大约1-50微克，这足以在体内使基因沉默。 溶液中每种不同的siRNA大约可达0.2到100μg/ml siRNA可以用于冲 洗和储存心脏和肾脏器官。这包括了其间的任何范围。剂量方案可以 按照本领域技术人员所了解的使用。剂量方案可以在数分钟、数小时 或数天的时期内完成，并可以使用各种剂量的siRNA。当然，用于组 合物的siRNA的量可以根据具体的组织或器官类型及其大小而变化， 这可以被本领域的技术人员容易地确定。因此，本文提供的范围是指 导，事实上可以更大。
siRNA可以被直接导入细胞(即细胞内)、组织、器官、同种异 体移植物或生物体；也可以细胞外导入到腔、间隙空间、生物体的循 环中，口服导入，或可以通过将细胞、组织、器官、同种异体移植物 或生物体浸泡在含有siRNA的溶液中来导入。胆汁或胆管系统、血管 或血管外循环、血液或淋巴系统、以及脑脊液是可以导入siRNA的位 点。在本发明的某些实施方案中，siRNA通过灌注被提供给移植组织 (例如器官)。
上面的公开内容对本发明进行了一般性描述。参考下面具体的实 施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例的目的仅仅是为了说明， 并不打算限制本发明的范围。形式变换和等同替换被视为情况可能提 示或赋予了方便。尽管在本文中使用了特定的术语，但这些术语的目 的是描述性的而不是为了限制。
表1
凋亡基因的例子
基因家族：
批准的词干符号 (stem symbol) 批准的基因家族名称 BAG# BCL-2相关的抗死亡基因# BCL2L# 类BCL-2#家族专用网页 BNIP# BCL-2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白# CASP# caspase#，与凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶 TNFRSF# 肿瘤坏死因子受体超家族，成员#家族专用网页 TNFSF# 肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员# TRAF# TNF受体相关因子#
基因符号：
批准的 符号 文献别名 Genbank ID 位置 引用PMID 批准的 基因名称 AATK AATYK， KIAA0641 AB014541 17q25.3 10083745； 9734811 与凋亡相关的酪氨酸激酶 APAF1 CED4 NM_001160 ？ 9267021 凋亡蛋白酶活化因子 BIRC2 hiap-2cIAP1 MIHB L49431 11q22 8548810 含杆状病毒IAP重复2 BIRC3 cIAP2hiap-1 MIHC L49432 11q22 8548810 含杆状病毒IAP重复3
BIRC4 Xiap，hILP U45880 Xq25 8654366 含杆状病毒IAP重复4 BIRC5 - U75285 17q25 8106347 含杆状病毒IAP重复5 (survivin) BIRC6 AF265555 2p22-p21 10544019 含杆状病毒IAP重复6 API5 AAC-11 U83857 ？ 9307294 凋亡抑制剂5 BAD - AF021792 ？ 8929532 细胞死亡的BCL2拮抗物 BAK1 CDN1 U23765 6 7715730 BCL2拮抗剂/杀伤物1 BAX - NM_004324 19q13.3-q13. 4 8358790 BCL2相关的X蛋白 BCL2 - M14745 18q21.3 2875799 B细胞CLL/淋巴瘤2 BCL10 mE10CIPER CARMEN AF082283 1p22 9989495 B细胞CLL/淋巴瘤10 BID - NM_001196 22q11.2 8918887 BH3相互作用结构域死亡 激动物 BIK NBK U34584 ？ 7478623 BCL2相互作用杀伤物(诱 导凋亡) BOK - AF027954 ？ 9356461 BCL2相关的卵巢杀伤物 CFLAR CLARP CASH Casper FLAME FLIP I-FLICE MRIT AF005774 2q33-q34 9208847 CASP8和类FADD的凋亡 调节物 CIDEA CIDE-A NM_001279 ？ 9564035 细胞死亡诱导的类DFFA 效应子a CRAD D RAIDD U84388 12q21.33-q2 3.1 9044836 含有CASP2和RIPK1结构 域的带有死亡结构域的适 配体 DAD1 - D15057 14 8413235 针对细胞死亡的防御子1 DAP DAP1 X76105 5p15.2 8530096 与死亡相关的蛋白
DAP3 - X83544 1q21 9284927；749926 8 与死亡相关的蛋白3 DAPK1 - X76104 9q34.1 8530096 与死亡相关的蛋白激酶1 DAPK3 - AB007144 19p13.3 9488481 与死亡相关的蛋白激酶3 DAXX DAP6 AF00604 6p213 9215629 与死亡相关的蛋白6 EIF4G2 DAP5 Natl X89713 11p15 9030685 真核翻译起始因子4γ，2 HRK DP5 U76376 ？ 9130713 harakiri，BCL2相互作用蛋 白(只含有BH3结构域) FADD MORT1 U24231 11q13.3 7536190 通过死亡结构域与 Fas(TNFRSF6)相关 BIRC1 - U19251 5q13.1 7813013 含杆状病毒IAP重复1 PDCD1 - L27440 2q37.3 7851902 程序化细胞死亡1 PDCD2 - NM_002598 6q27 7606924 程序化细胞死亡2 PDCD8 AIF AF100928 Xq25-q26 9989411 程序化细胞死亡8(凋亡诱 导因子) RIPK1 RIP U25994 ？ 7538908 受体(TNFRSF)相互作用 的丝氨酸-苏氨酸激酶1 RIPK2 RICK， RIP2 CARDIAK AF078530 8q21 9575181 受体相互作用的丝氨酸-苏 氨酸激酶2 RNF7 SAG ROC2 AF092878 3q22-q24 10230407 10082581 环指蛋白7 STK17 A DRAK1 AB011420 7p12-p14 9786912 丝氨酸/苏氨酸激酶17a(凋 亡诱导) STK17 B DRAK2 AB011421 ？ 9786912 丝氨酸/苏氨酸激酶17b(凋 亡诱导) TANK I-TRAF U59863 2q24-q31 8710854 TRAF家族成员相关的 NFKB激活物
TRADD - L41690 ？ 7758105 通过死亡结构域与 TNFRSF1A相关
没有被批准的符号的基因
文献别名 建议的符号 Genbank ID 位置 引用PMID Entrez基 因ID ALG-2 PDCD6 AF035606 5p 15.2-pter 8560270 10016 Alix AIP1 PDCD6IP AJ005074 ？ 10200558 10015 BimL BOD BCL2L11 AF032458 ？ 9430630 10018 ES18，HES18 PDCD7 AF083930 ？ 10037816 10081 FLASH，CED-4 CASP8AP2 AF132726 ？ ？ 9994 TFAR19 PDCD5 AF014944 ？ 9920759 9141 TFAR15 PDCD10 AF022385 ？ ？ 11235 TOSO CASP10AF1 AF057557 ？ 9586636 9214 Nod1CARD4 APAF4 AF126484 7p15-p14 10224040 10392 DEDD DEFT FLDED1 DEDD AF043733 AF083236 AJ010973 ？ 9832420 9774341 9191 MADD DENN KIAA0358 MADD AB002356 U44953 U77352 11p11.21- p11.22 8988362 9796103 9115275 8567 DIO1，KIAA0333 DATF1 AB002331 ？ 10393935 11083 RIP3 RIPK3 AF156884 ？ 10339433 11035 FAF1，CGI-03 FAF1 AF132938 1 10462485 11124
表2
补体基因的例子
成分(或亚基) 基因符号 染色体位置
C1q：α链 C1QA 1p34.1-p36.3
C1q：β链 C1QB 1p34.1-p36.3
C1q：γ链 C1QG 1p34.1-p36.3
C8：α链 C8A 1p32
C8：β链 C8B 1p32
C4结合蛋白：α链 C4BPA 1q32(a)
C4结合蛋白：β链 C4BPB 1q32(a)
补体受体1(CD35) CR1 1q32(a)
补体受体2(CD21) CR2 1q32(a)
衰退加速因子(CD55) DAF 1q32(a)
膜辅助因子蛋白
(CD46) MCP 1q32(a)
因子H HF 1q32(a)
因子I IF 4q25
C6 C6 5p13(b)
C7 C7 5p13(b)
C9 C9 5p13(b)
C2 C2 6p21.3(c)
因子B BF 6p21.3(c)
C4A(同种型) C4A 6p21.3(c)
C4B(同种型) C4B 6p21.3(c)
C8：γ链 C8G 9q22.3-q32
C5 C5 9q33
结合甘露糖的凝集素 MBL 10q11.2-q21
穿孔素 PRF1 10q22
表面活性蛋A1和
SFTPA1，A2 10q22-q23
A2
表面活性蛋D SFTPD 10q22-q23
膜反应性溶解的抑制
CD59 11p13
物(MIRL，CD59)
C1抑制物 C1NH 11q11-q13.1
C1r C1R 12p13
C1s C1S 12p13
补体受体3：α链
＝α-M整合蛋白 ITGAM 16p11.2
(CR3A，CD11A)
玻连蛋白(S-蛋白) VTN 17q11
C3 C3 19p13.3-p13.2
C5a受体1 C5R1 19q13.3-q13.4
白细胞粘附分子：β链
＝β-2整合蛋白 ITGB2 21q22.3
(LCAMB，CD18)
备解素 PFC Xp11.4-p11.2
脚注：(a)补体活化调节物(RCA)基因簇
(b)膜攻击复合物(MAC)基因簇
(c)III类MHC补体基因簇
实施例
下面的实施例被用来举例说明本发明的各种实施方案，而并非旨 在限制发明的范围。
使用的一般性方法
缺血方案：
1)通过腹膜内施用氯胺酮结合吸入安氟醚使小鼠(25-30g)麻醉。
2)通过在动物底下放置暖垫(37℃)将小鼠的体温保持恒定。
3)使用腹中线切开，用无创伤血管钳将左肾蒂阻断长达35分钟。 阻断后，将0.8ml预热(37℃)的盐水放置在腹腔中，将腹部用浸湿 了无菌盐水的棉花盖住。
4)取下钳子后，观察肾脏1分钟以观察指示血液重新流动的颜色 变化。然后取下对侧肾脏，将伤口以两层封闭。对照小鼠进行同样的 手术操作，除了不使用血管钳。
5)在再灌注24小时后将小鼠处死；通过下腔静脉收集血液样品；
然后获取左肾以评估肾损伤。
siRNA注射：
1)对于全身性注射来说，合成的siRNA(在0.8-1ml PBS中)被 快速注射(在10秒内)到尾侧静脉或阴茎静脉之一中。为了使尾静脉 膨胀，在用乙醚麻醉5±1秒的情况下将尾部浸泡在温水中(50-55℃)。
2)对于局部注射来说，从中线剖腹术中可以看到左侧肾蒂。在主 动脉左侧进行肾血管上方的最小制备以插入阻断钳。夹住主动脉和腔 静脉，用30号针头刺入肾静脉，以注射0.1ml含有siRNA的PBS。将 针头在原地保持5秒钟，然后缓慢取出，同时用镊子夹住一点Avitene 压迫肾静脉30秒。然后将Avitene留在原地。在左肾蒂被阻断进行缺 血后立即取下主动脉和腔静脉钳。
用于灌注研究中沉默指定基因的siRNA：
Caspase 3基因：GATCTATCTGGACAGTAGT
Caspase 8基因：AAGCTCTTCTTCCCTCCCTAA
Fas基因：AAGTGCAAGTGCAAACCAGAC
TNF-α基因：AAGACAACCAACTAGTGGTGC
RelB基因：GGA ATC GAG AGC AAA CGA A
C3基因：CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA
C5aR基因：GCACACTGTATGTGGTATTAA
使用的一般性方法(图17-20)
C3和Caspase 3 siRNA的设计
选择靶序列5′-CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA-3′(特异性针对 C3)和5′-GGATCTATCTGGACAGTAGTT-3′(特异性针对Caspase 3)。 含有有义和反义靶序列和环序列的寡核苷酸被合成、退火、并构建到 pRNAT-U6.1/Neo siRNA表达载体中，该载体具有cGFP基因和驱动 siRNA表达的U6启动子(Genescript，Piscataway，NJ)。
C3和Caspase 3基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000(Invitrogen)将L929细胞用C3siRNA或 Caspase 3siRNA转染。单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作 阴性对照。简单来说，将细胞铺在12孔板中(每个孔2×105个细胞)， 使其生长过夜，达到90％汇合。将细胞用2μg C3siRNA、Caspase 3 siRNA或阴性对照siRNA质粒在减少血清的培养基中转染5小时，然 后在完全培养基中孵育24小时。在转染后24小时从被转染的细胞中 提取RNA。
肾脏I/R损伤模型
6-8周龄的CD1小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯 噻嗪(20mg/kg)进行麻醉，并置于加热的垫子上以便在手术中维持它 们的体温。在腹部切开之后，钝性分离肾蒂，将微血管钳(Roboz Surgical Instrument，Washington，DC)放置在左肾蒂上25分钟。在该过程中， 动物用温暖的盐水保持水分并在恒定的温度下(37℃)。在缺血25分 钟后取下钳子。将右肾切除。
肾功能的评估
在缺血后24小时，从下腔静脉获得血液样品。由伦敦卫生科学中 心(London Health Sciences Centre)的中心实验室测定血清肌酐水平和 血尿素氮(BUN)，以监测肾功能。
组织学检测
在缺血24小时后，从小鼠切下肾脏，将组织切片固定在10％福尔 马林中，然后使用标准技术进行处理，用于组织学检查。福尔马林组 织被包埋在石蜡中，用H&E对5μm的切片进行染色。这些切片由病 理学家以盲法模式进行检查。检查了皮质和髓质中的组织学变化。
通过逆转录(RT)-PCR和定量PCR测量肾脏C3和Caspase 3的 mRNA水平
使用Trizol(Invitrogen)从肾脏和细胞中提取总RNA。使用寡-dT 引物和逆转录酶(Invitrogen)对总RNA进行逆转录。用于扩增鼠的C3、 Caspase 3和GAPDH的引物如下：C3， 5′-CCCTgCCCCTTACCCCTTCATTC-3′(正向)和 5′-CGTACTTGTGCCCCTCCTTATCTG-3′(反向)；Caspase 3， 5′-CGGGGTACGGAGCTGGACTGT-3′(正向)和 5′-AATTCCGTTGCCACCTTCCTGTT-3′(反向)；以及GAPDH， 5′-tgatgacatcaagaag gtggtgaa-3′(正向)和5′-tgggatggaaattgtgagggagat-3′ (反向)。PCR反应在下述条件下进行：95℃30秒，58℃30秒，然 后72℃30秒(30个循环)。
实时PCR反应使用SYBR Green PCR Master混合物(Stratagene) 和100nM与RT-PCR序列相同的基因特异性的正向和反向引物进行。 PCR反应条件是95℃10分钟，95℃30秒，58℃1分钟和72℃30秒 (40个循环)。
统计学分析
数据被表示为平均值±SEM。组之间的统计学比较使用Student′s t 检验进行。统计学重要性被定义为p＜0.05。
使用的一般性方法(图21-24)
Caspase-3和caspase-8siRNA的设计
选择caspase-3基因和caspase-8基因的靶序列。合成含有特异性 针对caspase-3序列的寡核苷酸(有义 5′GATCCCAACTACTGTCCAGATAGATCCTTGATATCCGGGA TCTATCTGGACAGTAGTTTTTTTTCCAAA-3′，反义 5′-AGCTTTTGGAAAAAAA ACTACTGTCCAGATAGATCCTCTCTTGAAGGATCTATCTGGACAG TAGTTGG-3′)和caspase-8(5′- GATCCGACCTTTAAGGAGCTTCATTTCAAGAGAATGA AGCTCCTTAAAGGTCTTTTTTGGAAA-3′，反义5′- AGCTTTTCCAAAAAAG ACCTTTAAGGAGCTTCATTCTCTTGAAATGAAGCTCCTTAAAGGT CG-3′)，并进行退火。通过将退火的DNA寡核苷酸对插入到用BamH I和Hind III(Genescript，Piscataway，NJ)消化的pRNAT-U6.1/Neo siRNA表达载体中，构建在小鼠U6启动子和cGFP基因控制下表达发 夹siRNA的Caspase-3siRNA和caspase-8siRNA载体。
caspase-3和caspase-8基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000将L929细胞用caspase-3/8siRNA转染。 单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作阴性对照。简单来说， 将细胞铺在24孔板中(每个孔1×105个细胞)，使其生长过夜，达到 90％汇合。将细胞用2μg caspase-3/8siRNA或阴性对照siRNA质粒在 减少血清的培养基中转染5小时，然后在完全培养基中孵育24小时。 制备总RNA用于随后的分析。
RelB SiRNA的制备
RelB siRNA寡聚物由Welgen，Inc合成。通过限制性位点将siRNA 克隆到pQuiet载体中。
RelB基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000(Invitrogen)将L929细胞用RelB siRNA转 染。单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作阴性对照。简单来 说，在培养24小时后使用TRIzol提取RNA用于逆转录酶PCR (RT-PCR)。
用于体内研究的动物
CD1小鼠从The Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购买。将小鼠维 持在特定的无病原条件下。所有的小鼠都是雄性的，6到10周龄。所 有的试验都按照动物委员会指南的护理和使用指导(Guide for the Care and Use of on Animals Committee Guidelines)进行。
SiRNA注射
在肾脏IRI前48小时，将siRNAs(50μg溶于1ml PBS中)或1 ml PBS快速注射(在10秒钟内)到一条尾部静脉中。为了使尾静脉膨 胀，将尾巴浸泡在温水中或用灯加热。
肾脏IRI模型
称重25-27g的小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻 嗪(10mg/kg)进行麻醉，并置于加热的垫子上以在手术中维持它们的 体温。腹部切开之后，钝性分离肾蒂，将微血管钳(Roboz Surgical Instrument，Washington，DC)放置在左肾蒂上25分钟。在该过程中动 物用温暖的盐水良好保持水分并在恒定的温度下(37℃)。选择缺血 的时间为25分钟，以获得具有最小的血管血栓形成的可逆的缺血ARF 模型，以避免动物死亡。在取下钳子后，观察左肾1分钟以看到指示 血液重新流动的颜色变化，然后切下对侧肾脏。然后将切口缝合，使 动物恢复，允许自由进食和进水。在再灌注后24小时从下腔静脉收集 血液，并获取左肾用于分析。对于存活观察实验来说，按照同样的方 式进行手术，只是缺血(钳住)的时间是35分钟。
肾功能的评估
在(缺血前)和缺血后24小时后从下腔静脉获得血液样品。由伦 敦卫生科学中心(London Health Sciences Center)的中心实验室使用 SYNCHRON LX系统(Beckman Coulter，Inc.)测定血尿素氮(BUN) 和血清肌酐(Cr)水平。
通过定量实时PCR测量肾脏RelB mRNA水平
使用TRIzol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)从细胞或肾脏分 离总RNA。用于RelB RT-PCR的引物是：有义CCC CTA CAA TGC TGG CTC CCT GAA，反义CAC GGC CCG CTC TCC TTG TTG ATT。 使用eppendorf循环仪(Mastercycler gradient)进行RT-PCR。所有的 反应都是在50μl反应体积中按照制造商的说明进行的。PCR参数的 组成为：在42℃逆转录50分钟，然后进行30个循环的PCR：94℃30 秒，58℃30秒和72℃30秒。在100伏下运行凝胶电泳，然后在紫外 灯下观察结果。样品还进行基因表达的实时PCR。
肾脏形态学变化的评估
在缺血后24小时，从小鼠切下肾脏，将组织切片固定在10％福尔 马林中，并使用标准技术进行处理以用于组织学检查。福尔马林组织 被包埋在石蜡中，用H&E对5μm的切片进行染色。这些切片由病理 学家以盲法模式检查。使用设计用于评估梗死、管状空泡形成和管型 形成程度的半定量尺度，在根据涉及的伤口面积的5点尺度上，为皮 质和髓质中组织学变化的百分数打分，如下：0，正常肾脏；0.5，＜10％； 1，10-25％；2，25-50％；3，50-75％；和4，75-100％。病理学家通过 对5个视野中的每个高倍视野(x 400)中嗜中性细胞进行计数，然后 将嗜中性细胞的数量平均，来定量评估嗜中性细胞浸润。
统计学分析
统计学比较使用双侧Student′s t检验进行。存活率通过 Kaplan-Meier检验进行分析。
使用的一般性方法(图25-29)
动物
称重25-27g的6周龄的雄性CD1(Charles River)小鼠在使用前被 饲养在我们大学的实验室中。所有的步骤都按照动物委员会的护理和 使用指南(Guide for the Care and Use on Animal Committee)所设定的 准则进行。
细胞系
细胞系L929和巨噬细胞被用在我们的实验中，用于检测siRNA 的沉默效能。为了分析siRNA的沉默效能，我们通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将siRNA转染到L929细胞系中，然后用tTRIzol提取 RNA用于逆转录酶PCR(RT-PCR)。
SiRNA的制备和注射
TNFαsiRNA由公司(Invitrogen)合成。将该TNFαsiRNA构建 到pSilence载体或pRNAT U6.1载体中。对于流体动力学注射来说，将 siRNA(50μg溶于1ml PBS)或1ml PBS快速注射(在10秒钟内) 到一条尾部静脉中。为了使尾静脉膨胀，将尾巴浸泡在温水中或用灯 加热。
缺血方案
小鼠(25-27g)通过腹膜内施用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg和 10g/kg)进行麻醉。通过在动物的下面放置暖垫使其体温保持恒定。使 用腹中线切开术，使用微动脉瘤钳(International Fine Sciencce Tools，Inc. CA)将左肾脏动脉和静脉阻断25或35分钟，同时取下右肾。阻断后， 将0.5ml预温热(37℃)的盐水放置在腹腔中，将腹部关闭。在取下 钳子后，再观察肾脏1分钟以看到指示血液重新流动的颜色变化。缝 合后，将被切口的小鼠放回笼子中。假处理小鼠经过同样的手术程序， 只是不使用微动脉瘤钳。在24小时时将小鼠处死，通过下腔静脉收集 血液样品。对于存活实验来说，在所有存活的动物没有生病的迹象之 后对动物观察几天。
肾功能的评估
由我们的中心实验室使用SYNCHRON LX系统(Beckman Coulter， Inc.)测量血清中的血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。
RT-PCR
使用TRIzol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)从细胞或肾脏分 离总RNA。使用eppendorf循环仪(Mastercycler梯度)进行RT-PCR。 所有的反应都是在50μl反应体积中按照制造商的说明进行的。PCR 参数的组成为：在42℃的逆转录50分钟，然后进行30个循环的PCR： 94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒。在100伏下进行凝胶电泳，然 后在紫外灯下观察结果。
肾脏形态学变化的评估
从小鼠手术切下之后，肾脏被冠状切片，固定在10％甲醛中，并 包埋在石蜡中。用H&E对切片(5μm)进行染色。在显微镜下对一个 全深度的冠状切片进行检查。使用5点尺度对皮质髓质交界处损伤的 肾小管的百分数进行估计。
RelB免疫组织化学
在脱去石蜡并重新水化后，将肾脏的石蜡切片用3％的过氧化氢孵 育15分钟以猝灭内源的过氧化物酶活性。在微波20分钟后，将切片 在含有5％正常小鼠血清的清洗缓冲液中封闭30分钟。将切片与用 PBS1∶100稀释的仓鼠抗小鼠Fas mAb(BD Pharmingen)在室温孵育1 小时。在用PBS清洗后，将切片与生物素化的小鼠抗仓鼠Ig、然后与 结合了辣根过氧化物酶的链亲和素(LSAB检测试剂盒，DAKO)孵育。 在PBS中进一步清洗后，染色用二氨基联苯胺(DAB)显影，然后将 载玻片用苏木精轻微复染。对照玻片用仓鼠IgG代替第一抗体进行染 色。在单个肾小管中，Fas免疫染色出现在所有上皮细胞中或完全不出 现。盲法评价连续5个观察视野(放大x 200)中阳性肾小管的百分数。
组织学计分
在肾脏缺血后取出肾脏，在10％福尔马林中固定，用于组织学检 查。将组织包埋在石蜡中，用H&E对切片进行染色。从盲法分析计算 出平均值，使用分值0，无损伤；0.5，＜10％；1，10-25％；2，25-50％； 3，50-75％；以及4，75-100％。通过对5个视野(x 400)中嗜中性细 胞的数量进行计数来评估嗜中性细胞浸润。
统计学分析
统计学比较使用双侧Student′s t检验进行。存活率通过 Kaplan-Meier检验进行分析。
用于TNF-α的一般性方案
被relB siRNA沉默的TNF-α基因
为了观察体外基因沉默的结果，用载体relB siRNA转染L929细 胞。24小时后收集细胞并制备RNA。通过RT-PCR测定，relB mRNA 在L929中的表达降低了。接下来测定了在缺血再灌注损伤后，注射 TNF-αsiRNA是否能够沉默被上调的TNF-α表达。首先观察IRI后 TNF-α的表达。在IRI后24小时和48小时，TNF-α的表达增加了，在 肾脏中最高表达是在48小时时。然后通过单次流体动力学注射将载体 siRNA(50μg)投送到尾静脉中。在24小时和48小时后，取出肾脏 并制成匀浆液。制备RNA和cDNA，并进行RT-PCR。结果显示在用 siRNA处理后relB的表达降低了。
siRNA处理改善了肾功能
基因沉默的结果表明siRNA能够阻断NF-κB途径。证实了TNFα 能够防止肾脏在缺血后的损伤。BUN和肌酐由我们的中心实验室测量。 在夹住25分钟后，BUN和肌酐的水平与未处理的对照小鼠相比明显增 加了。如果与阳性对照组相比，BUN水平降低了30％。但是肌酐含量 显著降低了。
形态学变化
接下来观察了肾脏的病理学变化。肾脏病理学通过H&E(苏木精) 染色来确定，其在缺血的肾脏中随着TNFα表达的沉默而明显降低了。
由于肾脏中TNFα的表达和缺血损伤被抑制的情况，小鼠的死亡率 得到了改善。接下来证明了TNFαsiRNA在小鼠中能够提供严重缺血 的保护，在严重缺血中左肾蒂被钳住35分钟，并且对侧肾脏被移除。 在钳住之前48小时，通过流体动力学尾静脉注射向小鼠注射了盐水、 载体siRNA和。11只通过流体动力学尾静脉注射接受盐 水的小鼠中的10只在5天内死于急性肾衰竭。但是，10只用 注射的小鼠中的8只存活了(对照空载体P＜0.01，对照盐水 P＜0.01)。
实施例(图1-16)
实施例1
如上所述，将CD1小鼠的左肾静脉和动脉在37℃钳住25分钟。 在再灌注24或48小时后取出被处理的肾脏。时间点是从钳住时计算 的。从用TRIzol试剂(Gibco BRL)按照制造商的说明分离的IDO-沉 默的、无义siRNA沉默的或假转染的B16F10细胞中提取总RNA。通 过RT-PCR测定RelB基因的表达。使用RNA PCR试剂盒(Gibco BRL)，用提供的寡d(T)16引物来合成第一链cDNA。1μmol逆转录 反应产物用于后面的PCR反应。用于RelB的引物位于RelB-siRNA靶 序列两侧，并使用了GAPDH(内部阴性对照)引物。使用的PCR条 件如下：94℃30秒，58℃30秒，以及72℃30秒(30个循环)。使 用凝胶电泳在1.5％琼脂糖凝胶中通过用溴化乙锭染色使PCR产物可见 (Hill，J.A.，Ichim，T.E.，Kusznieruk，K.P.，Li，M.，Huang，X.，Yan，X.， Zhong，R.，Cairns，E.，Bell，D.A.，和Min，W.P.2003.Immune modulation by silencing IL-12production in dendritic cells using small interfering RNA.(在树突状细胞中通过使用小干扰RNA沉默IL-12的产生来进 行免疫调节)J Immunol 171：691-696)。正如在图1中看到的那样，在 肾脏缺血后RelB的表达增加了。
实施例2
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注0、2、12 和24小时后，通过RT-PCR测定被处理的肾脏中Fas基因的表达。如 在图2中看到的那样，Fas的表达在缺血后增加了。
实施例3
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注0、2、12、 24或48小时后测定被处理的肾脏中caspase 8基因的表达。如在图3 中看到的那样，caspase 8的表达在缺血后增加了。
实施例4
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，并测定了caspase 3 和GAPDH基因的表达。图4显示了在再灌注后0、2和24小时时caspase 3∶GAPDH表达的比率。
实施例5
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注24和48 小时后测定被处理的肾脏中C3基因的表达。图5显示了C3基因的表 达在缺血后增加了。
实施例6
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注24和48 小时后测定被处理的肾脏中C5aR基因的表达。图6显示C5aR的表达 在缺血后增加了。
实施例7
图7显示了在巨噬细胞系中Caspase 3基因的体外沉默。简单来说， 将细胞铺在12孔板中(每个孔2×105个细胞)，使其在1或2ml不含 抗生素的完全培养基中生长过夜。将4μg含有Caspase 3-siRNA的质 粒与10μl Lipofectamine 2000试剂在250μl最适的减少血清的培养基 中(Invitrogen)在室温孵育20分钟。然后将混合物加到生长到90％-95％ 汇合的细胞培养物中。孵育4小时后加入等体积的补充有20％FCS的 RPMI 1640。24到48小时后，收获转染的细胞，通过RT-PCR检测 Caspase基因的表达。()
实施例8
将实施例7中的巨噬细胞按照实施例7中的描述用表达caspase 8-siRNA的载体转染。转染后48小时，提取总RNA，通过RT-PCR测 定caspase 8基因的表达。1、2、3和4代表了不同的siRNA。图8显 示了在处理过的细胞中caspase 8的表达降低了。
实施例9
将实施例7中的巨噬细胞按照实施例7中描述的方法用Rel B cDNA和Rel B-siRNA共转染。转染后48小时，提取总RNA，通过 RT-PCR测定Rel B基因的表达。siRNA池是几种靶向同样基因但是不 同位点的siRNA的混合物，并且siRNA载体是含有SEC序列或在本申 请中描述的发夹siRNA序列的载体。所有的泳道都是DC细胞。如在 图9中所见，Rel B的表达被siRNA池和siRNA载体降低了。
实施例10
如上所述用Fas-siRNA在表达Fas-siRNA的载体中转染表达Fas 的巨噬细胞。转染后48小时，提取蛋白，通过Western印迹测定Fas 的表达。如在图10中所见，在Fas-siRNA处理的细胞中蛋白的水平降 低了。siRNA 1、3、4和5是靶想Fas基因的不同siRNA序列。
实施例11
将50μg特异性针对caspase 3基因的siRNA静脉内注射到CD1 小鼠中。然后按照实施例1中的描述钳住左肾静脉和动脉。在注射 siRNA后48小时，获取左肾，提取总RNA，通过RT-PCR测定caspase 3的表达。
实施例12
按照实施例11中的描述处理CD1小鼠，除了注射特异性针对Fas 基因的siRNA外。图12显示了在siRNA处理后Fas基因的表达降低了。 从左到右为对照1-3和小鼠1-5。
实施例13
CD1小鼠静脉注射特异性针对TNFα和/或Rel B基因的siRNA(组 合中每种siRNA各50μg)，然后按照实施例1中的描述进行左肾缺血。 通过在再灌注后24小时测量血肌酐和BUN水平来确定肾功能。图13 显示，当使用同时针对TNFα和Rel B基因的siRNA时，缺血后的肾功 能被保护为接近正常。
实施例14
CD1小鼠静脉注射特异性针对凋亡基因caspase 3、caspase 8和Fas 的siRNA，或分别或组合，并按照实施例1中的描述进行左肾缺血。 在再灌注后24小时确定肾功能。如图14中所见，单独沉默caspase 3 或caspase 8保护了缺血后的肾功能。最有效的是使用靶向caspase 3、 caspase 8和Fas的siRNA的混合物。
实施例15
按照实施例13中的描述处理CD1小鼠，不同之处在于使用下列的 siRNA组合：
组合1：caspase 3、caspase 8和Fas；
组合2：TNFα和Rel B；
组合3：C3和C5aR；
组合4(S-mix)：所有的混合物1、2和3的siRNA。
图15显示了所有的siRNA组合对缺血后肾功能的良好保护。
实施例16
CD1小鼠静脉注射50μg特异性针对caspase 3、caspase 8、Fas、 C3、C5aR、TNFα和Rel B基因的siRNA混合物或盐水(对照)，并 通过在37℃下夹住肾静脉和动脉35分钟使左肾缺血。在再灌注后跟踪 小鼠的存活，结果显示在图16中。所有siRNA处理的小鼠在再灌注后 8天仍然存活，而所有的对照小鼠在再灌注后5天都死亡了。
尽管在这里已经详细描述了本发明的优选实施方案，但本领域的 专业技术人员将会了解到，可以对其进行改变而不背离本发明的精神 或随附的权利要求的范围。
“存活”或“存活的”是指细胞、组织或器官能够保留原有的功 能。因此，细胞、组织或器官能够以基本上保留其功能的方式被灌注、 运输、然后移植到体内。
本文中使用的术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本技术领 域中也被称为“短干扰RNA”)是指含有大约10到50个之间的核苷 酸(或核苷酸类似物)、能够指导或介导RNA干扰的RNA(或RNA 类似物)。在一些方面，siRNA含有大约15到30个之间的核苷酸或 核苷酸类似物，在其它方面含有大约16到25个之间的核苷酸(或核 苷酸类似物)，在另外一些方面含有大约18到23个之间的核苷酸(或 核苷酸类似物)，在还有一些方面含有大约19到22个之间的核苷酸 或(核苷酸类似物)(例如19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似 物)。
本文中使用的术语siRNA或RNAi试剂的“反义链”是指与被靶 向沉默的基因的mRNA的大约10-50个核苷酸、例如大约15-30、16-25、 18-23或19-22个核苷酸的部分基本上互补的链。反义链具有与所需的 靶mRNA序列足够互补的序列以指导靶特异性的RNA干扰(RNAi)， 例如足以通过RNAi机制或过程触发所需的靶mRNA破坏的互补性。 术语siRNA或RNAi试剂的“有义链”是指与反义链互补的链。反义 和有义链也可以被称为第一或第二链，与靶序列具有互补性的第一或 第二链，以及与所述第一或第二链具有互补性的相应第二或第一链。 指导链则是指进入RISC复合物并指导靶mRNA的切割的RNAi试剂的 链，例如siRNA双链体的反义链。术语“指导链”在本技术领域中通 常与术语“反义链”互换使用。
“靶基因”是指其表达将被选择性抑制或“沉默”的基因。这种 沉默是通过RNAi途径或过程切割靶基因的mRNA来实现的。在本发 明中，靶基因是其表达与存活力的丧失或细胞损伤有关的基因。这样 的基因选自一种或多种凋亡基因、一种或多种补体基因、一种或多种 免疫炎性基因及其组合。
本文中使用的术语“灌注”是倾注或通过的行动，特别是指流体 通过特定器官的血管。在本发明的具体实施方案中，含有siRNA的流 体通过移植组织的脉管系统被灌注。
术语“凋亡”或“程序性细胞死亡”是指在发育和其它正常的生 物过程中将不想要的或无用的细胞消除的生理过程。凋亡是在正常的 生理条件下发生的细胞死亡的模式，细胞在其自身的死亡中是主动的 参与者(“细胞自杀”)。它在正常细胞的更新和组织动态平衡、胚 胎发生、免疫耐受的诱导和维持、神经系统的发育和内分泌依赖性组 织萎缩过程中最为常见。凋亡也可以由外部事件或刺激引发，例如在 本发明的某些优选实施方案的情况下的缺血损伤。经历凋亡的细胞显 示出特征性的形态和生化特点。
“基因表达的抑制”是指来自靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平 的缺乏(或可察觉的减少)。“特异性”是指抑制靶基因而不明显影响 细胞的其它基因的能力。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外 部性质或通过生物化学技术例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern 杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸 附分析(ELISA)、Western印迹、放射免疫分析(RIA)、其它免疫 分析和荧光激活的细胞分析(FACS)来证实。
正如本领域的专业技术人员所理解的那样，可以断言任何类型移 植所需和使用的细胞、组织或器官都可以用于本发明。器官的代表性 的例子是心脏、肝脏、肺、胰和肾脏，但不限于此。细胞(即胰岛细 胞)或其它组织(即血管)也包含在本发明的范围内。
简单来说，siRNA是一种在哺乳动物细胞中用于抑制基因表达的 RNA干扰方法(Bertrand等，2002.Biochem Biophys Res Commun 296(4)： 1000-1004)。SiRNA是短的双链RNA分子，大约21-25个碱基对长， 它们与细胞质蛋白相互作用形成细胞内RNAi诱导的沉默复合物 (RISC)。RISC使用siRNA的反义链结合和切割相关的mRNA序列， 然后被非特异性的RNA酶降解。SiRNA在细胞质中发挥作用，与反义 寡聚核苷酸相比，实现靶基因的敲除所需要的浓度更低。
当获取器官用于移植时，随后的缺氧时期，接着是器官的再灌注， 都伴随着显著的组织损伤，包括内皮细胞凋亡和器质性功能障碍。这 种局部缺血/再灌注(I/R)损伤可能参与部分由转录因子NF-κB及其亚 基RelB控制的炎性反应、凋亡途径通过例如caspase的活化、补体系 统的激活以及免疫炎性基因例如Fas和TNF-α基因的活化。
本发明是基于使用siRNA来靶向那些可以导致用于移植的细胞、 组织和/或器官不能存活和存活力降低的那些基因的表达。这些基因可 以包括例如凋亡基因、免疫炎性基因和补体基因及其组合。本发明提 供了含有一种或多种凋亡基因、一种或多种免疫炎性基因、一种或多 种补体基因及其组合的组合物，以及使用这样的组合物的方法。以这 种方式，提供了更有效的方法，更有效地将组织/细胞维持在存活状态， 以提高移植的成功率。
在本发明的一些方面中，适合的凋亡基因可以包括但不限于 caspase 3基因、caspase 8基因和fas基因。适合的免疫炎性基因可以包 括但不限于TNF-α基因和RelB基因。适合的补体基因可以包括但不限 于C3和C5aR。本领域的专业技术人员也可以理解的是，如果需要， 可以使用siRNA靶向基因的组合。本领域的技术人员将会容易地理解 哪些参与凋亡、免疫炎性的其它基因和参与启动凝结的基因可以被用 于本发明的组合物中。本领域的技术人员也将会容易地理解能够用于 本发明的短基因序列，在本文的实施例部分中列举了其中的一些，仅 作为代表性的例子而不意味着限制。此外，用于本发明的凋亡基因的 代表性例子显示在表1中，用于本发明的补体基因的代表性例子显示 在表2中。本领域的技术人员可以获得这些基因的序列用于本发明组 合物以及方法中的siRNA。
现在，本发明在一个实施方案中，使用已接受的小鼠缺血/再灌注 (I/R)损伤系统模型，证实了用特异性靶向一种或多种上述与组织损 伤反应有关的基因的siRNA来灌注经受I/R损伤的器官，减少了这些 基因的表达，从而防止了组织损伤的状况并提高了器官的存活力。在 本发明的该实施方案中，尽管I/R损伤在对照组中产生了肾损伤，但在 siRNA处理过的肾脏中已经证实维持了良好的肾功能。这表明了本发 明的方法和组合物提供了改善的存活力。当经历缺血和再灌注的器官 被维持在37℃时，即比通常用于移植器官的条件(通常维持在低温下) 严酷得多的条件下，观察到了基因表达的抑制。
正如本领域的技术人员所了解的那样，本发明可以应用于细胞、 组织或器官。适合的器官可以是但不限于心脏、肝脏、肺脏、胰脏和 肾脏。在本发明的一些方面，siRNA的投送是在获取器官的过程中或 始终(例如通过所述器官的脉管系统用药)以及从器官分离可移植的 细胞的过程中或始终进行的。siRNA组合物和方法可用于器官获取过 程的几种情况中：1)获取前在死亡供体中通过静脉内灌注；2)在包装 以运输之前通过器官灌注；和/或3)在细胞培养中。
更具体来说，可以通过在供移植的获取之前或获取之后用选定的 siRNA进行处理，来保护组织或器官免于细胞损伤。例如，可以使用 本发明的siRNA组合物对组织或器官再灌注所需的时间；简单地将组 织或器官在本发明的siRNA组合物中浸泡和储存所需的时间；或者组 织或器官可以再灌注并浸泡和储存在本发明的siRNA组合物中。当然， 正如本领域的专业技术人员所了解的那样，这也适用于细胞。在本发 明的实施方案中，组织或器官在获取前用siRNA溶液灌注。所需器官 的灌注可以长达例如大约30或60分钟，如本领域的专业技术人员所 了解的那样。然后将获取的灌注过的组织或器官储存在siRNA溶液中， 根据组织或器官的类型，这种储存可以长达大约24小时或48小时， 正如本领域的专业技术人员所了解的那样。这样，本发明的siRNA可 以用于各种方法中以防止细胞的凋亡、延长组织和器官的寿命、防止 和/或最小化缺血损伤、以及帮助防止组织/器官的排斥，这是因为组织 /器官处于存活状态中从而提供了较少的有害自身免疫反应。本发明的 组合物可以用于各种温度，包括大约2-4℃的冷藏温度到大约37℃的体 温，这是本领域的专业技术人员早就了解的。本发明的组合物的使用 可以利用已知用于再灌注和浸泡并储存组织、细胞和器官的标准程序 来进行。
在本发明的特定方面，所述组合物和方法在超过4℃直到约37℃ 或更高的温度下有效，并且仍然能够有效抑制/防止/最小化对细胞、组 织和器官的缺血损伤。这是特别有利的，因为不需要担心将组织或器 官保持冷藏以用于移植。
本发明的siRNA组合物通过用含有siRNA的适合的生理溶液灌注 和/或浸泡离体组织、器官或细胞，来施用于器官或组织或细胞(Hamar， P.，等，Proc Natl Acad Sci 2004；101：41)。例如，可以使用可商购的 器官储存溶液，例如但不限于Collins溶液、(UW)-溶液、组氨酸- 色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液、ViaSpanTM(细胞内)和Celsior溶液 (细胞外)(Muhlbacher等，1999，Transplant Proc 31(5)：2069-2070)。 此外，其它已知的添加剂也可以与本发明的siRNA组合用于组合物中。 这样的添加剂可以包括例如但不限于超氧化物歧化酶和其它自由基清 除剂(Baker等，1999，J Surg Res 86(1)：145-149；McAnulty和Huang 1996，Cryobiology 33(2)：217-225；McLaren和Friend 2003，Transpl Int 16(10)：701-708)、21-氨基类固醇(lazaroids)、抗凋亡剂(El-Gibaly 等，2004，Hepatology 39(6)：1553-1562；Natori等，2003，Liver Transpl 9(3)：278-284)、钙通道阻断剂(Arnault等，2003，Transplantation 76(1)：77-83)、细胞间粘附分子-1抑制剂(Stepkowski等，1998， Transplantation 66(6)：699-707；Chen等，1999，Transplantation 68(6)：880-887)、己酮可可豆碱(Randsbaek等，2000，Scand Cardiovasc J 34(2)：201-208)以及它们的组合。
siRNA可以用于各种策略中来沉默选定的基因。例如，可以使用 下面的4种策略：1)使用商业上预先合成的“siRNA池”(Dharmacon Inc)，由21个碱基对的寡核苷酸组成，同时靶向靶基因的位点例如 RelB基因的4个位点(图1)，显示出大于75％的基因沉默效能；2)使 用带有pol III启动子的siRNA表达载体(pSilencerTM，Ambion Inc)， 其驱动发夹RNA表达以形成双链RNA，用作内源表达的siRNA。通过 克隆技术可以制备大量的沉默子-siRNA，用于体外(图2)和体内基因 沉默；3)使用siRNA表达盒(SEC)，它作为PCR产物被产生，由侧 翼带有启动子和终止子序列的发夹siRNA模板组成(图3)。一旦SEC 被转染到细胞中，发夹siRNA从PCR产物表达并导致基因沉默(图4)。 SEC的优点在于它极富时间效率的事实，能够在许多候选序列中快速 筛选出最有潜力的siRNA；4)使用SEC载体。由于SEC收率低，因 此有效的SEC随后必须被克隆到病毒或非病毒载体中(图5)。当然， 正如本领域的专业技术人员所悉知的那样，其它的策略也包含在本发 明的范围内。
根据具体的靶基因或基因组合以及投送的siRNA剂量，可以获得 靶基因功能的部分或完全丧失。例如靶细胞的基因表达可以减小或丧 失至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或以上。抑制基因 表达是指靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平的缺少(或可察觉的降 低)。特异性是指抑制靶基因而对细胞的其它基因没有明显影响的能 力。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外部性质(如下面实施 例中所述)或通过生物化学技术例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、 Northern杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联 免疫吸附分析(ELISA)、Western印迹、放射免疫分析(RIA)、其 它免疫分析和荧光激活的细胞分析(FACS)来证实。
siRNA可以以各种形式施用于组织或器官或细胞，例如(1)作为 裸siRNA寡核苷酸；(2)掺入到siRNA表达载体中，该表达载体驱动 发夹RNA表达以形成双链RNA，用作内源表达的siRNA。例如，可以 使用pSilencer 2.0-U6(Ambion Inc.Austin TX)构建siRNA表达载体。 特定的siRNA插入寡核苷酸应该按照用户说明书设计。寡聚核苷酸含 有19mer的特异性针对mRNA靶的发夹序列、将两个互补结构域分隔 开的环序列、两个3′-末端突出的核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷尾用于终 止转录、以及5′单链突出端用于以BamHl和Hind III连接到pSilencer 中。编码有义和反义发夹siRNA的寡核苷酸被退火，作为插入片段， 如在Shi，Y.，(2003)，Trends Genet.，v.19，pp.9-12中所述；(3)作为 siRNA表达盒(SEC)的形式，它作为PCR产物被产生，由两侧带有 启动子和终止子序列的发夹siRNA模板以及组成，如Castanotto等， (2002)，Rna，v.8，pp.1454-60中描述的那样。简单来说，SEC是使用沉 默子表达试剂盒(Ambion Inc，Austin TX)产生的。按照用户说明书设 计用于前体SEC的有义和反义发夹siRNA模板寡核苷酸。寡核苷酸含 有19-mer特异性针对mRNA靶的发夹序列、将两个互补结构域分隔开 的环、两个3′-末端突出的核苷酸。简单来说，进行了两个PCR反应， 使用启动子元件(小鼠U6)作为模板、启动子PCR引物和基因特异性 的有义和反义寡核苷酸产生前体SEC。第一个PCR产物被用作第二个 PCR的模板。进行了第三个PCR以在5′末端修饰核苷酸，并编码EcoR I和Hind III限制性位点(图1)。在PCR中使用Taq聚合酶(Invetregene Inc.)；以及(4)掺入到载体中的SEC。一旦鉴定到有效的SEC，将SEC 用Mun I(与EcoR I相容)和Hind III位点克隆到pVP22中，如同Paul (2003)，Mol.Ther，v.7，pp.237-247中描述的那样。
本文描述的任何上述形式的siRNA都可对哺乳动物应用使用并施 用，包括动物和人类。至于组合物中使用的siRNA的量，在动物例如 小鼠中可以每次注射使用大约1-50微克，这足以在体内使基因沉默。 溶液中每种不同的siRNA大约可达0.2到100μg/ml siRNA可以用于冲 洗和储存心脏和肾脏器官。这包括了其间的任何范围。剂量方案可以 按照本领域技术人员所了解的使用。剂量方案可以在数分钟、数小时 或数天的时期内完成，并可以使用各种剂量的siRNA。当然，用于组 合物的siRNA的量可以根据具体的组织或器官类型及其大小而变化， 这可以被本领域的技术人员容易地确定。因此，本文提供的范围是指 导，事实上可以更大。
siRNA可以被直接导入细胞(即细胞内)、组织、器官、同种异 体移植物或生物体；也可以细胞外导入到腔、间隙空间、生物体的循 环中，口服导入，或可以通过将细胞、组织、器官、同种异体移植物 或生物体浸泡在含有siRNA的溶液中来导入。胆汁或胆管系统、血管 或血管外循环、血液或淋巴系统、以及脑脊液是可以导入siRNA的位 点。在本发明的某些实施方案中，siRNA通过灌注被提供给移植组织 (例如器官)。
上面的公开内容对本发明进行了一般性描述。参考下面具体的实 施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例的目的仅仅是为了说明， 并不打算限制本发明的范围。形式变换和等同替换被视为情况可能提 示或赋予了方便。尽管在本文中使用了特定的术语，但这些术语的目 的是描述性的而不是为了限制。
表1
凋亡基因的例子
基因家族：
批准的词干符号 (stem symbol) 批准的基因家族名称 BAG# BCL-2相关的抗死亡基因# BCL2L# 类BCL-2#家族专用网页 BNIP# BCL-2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白# CASP# caspase#，与凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶 TNFRSF# 肿瘤坏死因子受体超家族，成员#家族专用网页 TNFSF# 肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员# TRAF# TNF受体相关因子#
基因符号：
批准的 符号 文献别名 Genbank ID 位置 引用PMID 批准的 基因名称 AATK AATYK， KIAA0641 AB014541 17q25.3 10083745； 9734811 与凋亡相关的酪氨酸激酶 APAF1 CED4 NM_001160 ？ 9267021 凋亡蛋白酶活化因子 BIRC2 hiap-2cIAP1 MIHB L49431 11q22 8548810 含杆状病毒IAP重复2 BIRC3 cIAP2hiap-1 MIHC L49432 11q22 8548810 含杆状病毒IAP重复3
BIRC4 Xiap，hILP U45880 Xq25 8654366 含杆状病毒IAP重复4 BIRC5 - U75285 17q25 8106347 含杆状病毒IAP重复5 (survivin) BIRC6 AF265555 2p22-p21 10544019 含杆状病毒IAP重复6 API5 AAC-11 U83857 ？ 9307294 凋亡抑制剂5 BAD - AF021792 ？ 8929532 细胞死亡的BCL2拮抗物 BAK1 CDN1 U23765 6 7715730 BCL2拮抗剂/杀伤物1 BAX - NM_004324 19q13.3-q13. 4 8358790 BCL2相关的X蛋白 BCL2 - M14745 18q21.3 2875799 B细胞CLL/淋巴瘤2 BCL10 mE10CIPER CARMEN AF082283 1p22 9989495 B细胞CLL/淋巴瘤10 BID - NM_001196 22q11.2 8918887 BH3相互作用结构域死亡 激动物 BIK NBK U34584 ？ 7478623 BCL2相互作用杀伤物(诱 导凋亡) BOK - AF027954 ？ 9356461 BCL2相关的卵巢杀伤物 CFLAR CLARP CASH Casper FLAME FLIP I-FLICE MRIT AF005774 2q33-q34 9208847 CASP8和类FADD的凋亡 调节物 CIDEA CIDE-A NM_001279 ？ 9564035 细胞死亡诱导的类DFFA 效应子a CRAD D RAIDD U84388 12q21.33-q2 3.1 9044836 含有CASP2和RIPK1结构 域的带有死亡结构域的适 配体 DAD1 - D15057 14 8413235 针对细胞死亡的防御子1 DAP DAP1 X76105 5p15.2 8530096 与死亡相关的蛋白
DAP3 - X83544 1q21 9284927；749926 8 与死亡相关的蛋白3 DAPK1 - X76104 9q34.1 8530096 与死亡相关的蛋白激酶1 DAPK3 - AB007144 19p13.3 9488481 与死亡相关的蛋白激酶3 DAXX DAP6 AF00604 6p213 9215629 与死亡相关的蛋白6 EIF4G2 DAP5 Natl X89713 11p15 9030685 真核翻译起始因子4γ，2 HRK DP5 U76376 ？ 9130713 harakiri，BCL2相互作用蛋 白(只含有BH3结构域) FADD MORT1 U24231 11q13.3 7536190 通过死亡结构域与 Fas(TNFRSF6)相关 BIRC1 - U19251 5q13.1 7813013 含杆状病毒IAP重复1 PDCD1 - L27440 2q37.3 7851902 程序化细胞死亡1 PDCD2 - NM_002598 6q27 7606924 程序化细胞死亡2 PDCD8 AIF AF100928 Xq25-q26 9989411 程序化细胞死亡8(凋亡诱 导因子) RIPK1 RIP U25994 ？ 7538908 受体(TNFRSF)相互作用 的丝氨酸-苏氨酸激酶1 RIPK2 RICK， RIP2 CARDIAK AF078530 8q21 9575181 受体相互作用的丝氨酸-苏 氨酸激酶2 RNF7 SAG ROC2 AF092878 3q22-q24 10230407 10082581 环指蛋白7 STK17 A DRAK1 AB011420 7p12-p14 9786912 丝氨酸/苏氨酸激酶17a(凋 亡诱导) STK17 B DRAK2 AB011421 ？ 9786912 丝氨酸/苏氨酸激酶17b(凋 亡诱导) TANK I-TRAF U59863 2q24-q31 8710854 TRAF家族成员相关的 NFKB激活物
TRADD - L41690 ？ 7758105 通过死亡结构域与 TNFRSF1A相关
没有被批准的符号的基因
文献别名 建议的符号 Genbank ID 位置 引用PMID Entrez基 因ID ALG-2 PDCD6 AF035606 5p 15.2-pter 8560270 10016 Alix AIP1 PDCD6IP AJ005074 ？ 10200558 10015 BimL BOD BCL2L11 AF032458 ？ 9430630 10018 ES18，HES18 PDCD7 AF083930 ？ 10037816 10081 FLASH，CED-4 CASP8AP2 AF132726 ？ ？ 9994 TFAR19 PDCD5 AF014944 ？ 9920759 9141 TFAR15 PDCD10 AF022385 ？ ？ 11235 TOSO CASP10AF1 AF057557 ？ 9586636 9214 Nod1CARD4 APAF4 AF126484 7p15-p14 10224040 10392 DEDD DEFT FLDED1 DEDD AF043733 AF083236 AJ010973 ？ 9832420 9774341 9191 MADD DENN KIAA0358 MADD AB002356 U44953 U77352 11p11.21- p11.22 8988362 9796103 9115275 8567 DIO1，KIAA0333 DATF1 AB002331 ？ 10393935 11083 RIP3 RIPK3 AF156884 ？ 10339433 11035 FAF1，CGI-03 FAF1 AF132938 1 10462485 11124
表2
补体基因的例子
成分(或亚基) 基因符号 染色体位置
C1q：α链 C1QA 1p34.1-p36.3
C1q：β链 C1QB 1p34.1-p36.3
C1q：γ链 C1QG 1p34.1-p36.3
C8：α链 C8A 1p32
C8：β链 C8B 1p32
C4结合蛋白：α链 C4BPA 1q32(a)
C4结合蛋白：β链 C4BPB 1q32(a)
补体受体1(CD35) CR1 1q32(a)
补体受体2(CD21) CR2 1q32(a)
衰退加速因子(CD55) DAF 1q32(a)
膜辅助因子蛋白
(CD46) MCP 1q32(a)
因子H HF 1q32(a)
因子I IF 4q25
C6 C6 5p13(b)
C7 C7 5p13(b)
C9 C9 5p13(b)
C2 C2 6p21.3(c)
因子B BF 6p21.3(c)
C4A(同种型) C4A 6p21.3(c)
C4B(同种型) C4B 6p21.3(c)
C8：γ链 C8G 9q22.3-q32
C5 C5 9q33
结合甘露糖的凝集素 MBL 10q11.2-q21
穿孔素 PRF1 10q22
表面活性蛋A1和
SFTPA1，A2 10q22-q23
A2
表面活性蛋D SFTPD 10q22-q23
膜反应性溶解的抑制
CD59 11p13
物(MIRL，CD59)
C1抑制物 C1NH 11q11-q13.1
C1r C1R 12p13
C1s C1S 12p13
补体受体3：α链
＝α-M整合蛋白 ITGAM 16p11.2
(CR3A，CD11A)
玻连蛋白(S-蛋白) VTN 17q11
C3 C3 19p13.3-p13.2
C5a受体1 C5R1 19q13.3-q13.4
白细胞粘附分子：β链
＝β-2整合蛋白 ITGB2 21q22.3
(LCAMB，CD18)
备解素 PFC Xp11.4-p11.2
脚注：(a)补体活化调节物(RCA)基因簇
(b)膜攻击复合物(MAC)基因簇
(c)III类MHC补体基因簇
实施例
下面的实施例被用来举例说明本发明的各种实施方案，而并非旨 在限制发明的范围。
使用的一般性方法
缺血方案：
1)通过腹膜内施用氯胺酮结合吸入安氟醚使小鼠(25-30g)麻醉。
2)通过在动物底下放置暖垫(37℃)将小鼠的体温保持恒定。
3)使用腹中线切开，用无创伤血管钳将左肾蒂阻断长达35分钟。 阻断后，将0.8ml预热(37℃)的盐水放置在腹腔中，将腹部用浸湿 了无菌盐水的棉花盖住。
4)取下钳子后，观察肾脏1分钟以观察指示血液重新流动的颜色 变化。然后取下对侧肾脏，将伤口以两层封闭。对照小鼠进行同样的 手术操作，除了不使用血管钳。
5)在再灌注24小时后将小鼠处死；通过下腔静脉收集血液样品；
然后获取左肾以评估肾损伤。
siRNA注射：
1)对于全身性注射来说，合成的siRNA(在0.8-1ml PBS中)被 快速注射(在10秒内)到尾侧静脉或阴茎静脉之一中。为了使尾静脉 膨胀，在用乙醚麻醉5±1秒的情况下将尾部浸泡在温水中(50-55℃)。
2)对于局部注射来说，从中线剖腹术中可以看到左侧肾蒂。在主 动脉左侧进行肾血管上方的最小制备以插入阻断钳。夹住主动脉和腔 静脉，用30号针头刺入肾静脉，以注射0.1ml含有siRNA的PBS。将 针头在原地保持5秒钟，然后缓慢取出，同时用镊子夹住一点Avitene 压迫肾静脉30秒。然后将Avitene留在原地。在左肾蒂被阻断进行缺 血后立即取下主动脉和腔静脉钳。
用于灌注研究中沉默指定基因的siRNA：
Caspase 3基因：GATCTATCTGGACAGTAGT
Caspase 8基因：AAGCTCTTCTTCCCTCCCTAA
Fas基因：AAGTGCAAGTGCAAACCAGAC
TNF-α基因：AAGACAACCAACTAGTGGTGC
RelB基因：GGA ATC GAG AGC AAA CGA A
C3基因：CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA
C5aR基因：GCACACTGTATGTGGTATTAA
使用的一般性方法(图17-20)
C3和Caspase 3 siRNA的设计
选择靶序列5′-CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA-3′(特异性针对 C3)和5′-GGATCTATCTGGACAGTAGTT-3′(特异性针对Caspase 3)。 含有有义和反义靶序列和环序列的寡核苷酸被合成、退火、并构建到 pRNAT-U6.1/Neo siRNA表达载体中，该载体具有cGFP基因和驱动 siRNA表达的U6启动子(Genescript，Piscataway，NJ)。
C3和Caspase 3基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000(Invitrogen)将L929细胞用C3siRNA或 Caspase 3siRNA转染。单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作 阴性对照。简单来说，将细胞铺在12孔板中(每个孔2×105个细胞)， 使其生长过夜，达到90％汇合。将细胞用2μg C3siRNA、Caspase 3 siRNA或阴性对照siRNA质粒在减少血清的培养基中转染5小时，然 后在完全培养基中孵育24小时。在转染后24小时从被转染的细胞中 提取RNA。
肾脏I/R损伤模型
6-8周龄的CD1小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯 噻嗪(20mg/kg)进行麻醉，并置于加热的垫子上以便在手术中维持它 们的体温。在腹部切开之后，钝性分离肾蒂，将微血管钳(Roboz Surgical Instrument，Washington，DC)放置在左肾蒂上25分钟。在该过程中， 动物用温暖的盐水保持水分并在恒定的温度下(37℃)。在缺血25分 钟后取下钳子。将右肾切除。
肾功能的评估
在缺血后24小时，从下腔静脉获得血液样品。由伦敦卫生科学中 心(London Health Sciences Centre)的中心实验室测定血清肌酐水平和 血尿素氮(BUN)，以监测肾功能。
组织学检测
在缺血24小时后，从小鼠切下肾脏，将组织切片固定在10％福尔 马林中，然后使用标准技术进行处理，用于组织学检查。福尔马林组 织被包埋在石蜡中，用H&E对5μm的切片进行染色。这些切片由病 理学家以盲法模式进行检查。检查了皮质和髓质中的组织学变化。
通过逆转录(RT)-PCR和定量PCR测量肾脏C3和Caspase 3的 mRNA水平
使用Trizol(Invitrogen)从肾脏和细胞中提取总RNA。使用寡-dT 引物和逆转录酶(Invitrogen)对总RNA进行逆转录。用于扩增鼠的C3、 Caspase 3和GAPDH的引物如下：C3， 5′-CCCTgCCCCTTACCCCTTCATTC-3′(正向)和 5′-CGTACTTGTGCCCCTCCTTATCTG-3′(反向)；Caspase 3， 5′-CGGGGTACGGAGCTGGACTGT-3′(正向)和 5′-AATTCCGTTGCCACCTTCCTGTT-3′(反向)；以及GAPDH， 5′-tgatgacatcaagaag gtggtgaa-3′(正向)和5′-tgggatggaaattgtgagggagat-3′ (反向)。PCR反应在下述条件下进行：95℃30秒，58℃30秒，然 后72℃30秒(30个循环)。
实时PCR反应使用SYBR Green PCR Master混合物(Stratagene) 和100nM与RT-PCR序列相同的基因特异性的正向和反向引物进行。 PCR反应条件是95℃10分钟，95℃30秒，58℃1分钟和72℃30秒 (40个循环)。
统计学分析
数据被表示为平均值±SEM。组之间的统计学比较使用Student′s t 检验进行。统计学重要性被定义为p＜0.05。
使用的一般性方法(图21-24)
Caspase-3和caspase-8siRNA的设计
选择caspase-3基因和caspase-8基因的靶序列。合成含有特异性 针对caspase-3序列的寡核苷酸(有义 5′GATCCCAACTACTGTCCAGATAGATCCTTGATATCCGGGA TCTATCTGGACAGTAGTTTTTTTTCCAAA-3′，反义 5′-AGCTTTTGGAAAAAAA ACTACTGTCCAGATAGATCCTCTCTTGAAGGATCTATCTGGACAG TAGTTGG-3′)和caspase-8(5′- GATCCGACCTTTAAGGAGCTTCATTTCAAGAGAATGA AGCTCCTTAAAGGTCTTTTTTGGAAA-3′，反义5′- AGCTTTTCCAAAAAAG ACCTTTAAGGAGCTTCATTCTCTTGAAATGAAGCTCCTTAAAGGT CG-3′)，并进行退火。通过将退火的DNA寡核苷酸对插入到用BamH I和Hind III(Genescript，Piscataway，NJ)消化的pRNAT-U6.1/Neo siRNA表达载体中，构建在小鼠U6启动子和cGFP基因控制下表达发 夹siRNA的Caspase-3siRNA和caspase-8siRNA载体。
caspase-3和caspase-8基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000将L929细胞用caspase-3/8siRNA转染。 单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作阴性对照。简单来说， 将细胞铺在24孔板中(每个孔1×105个细胞)，使其生长过夜，达到 90％汇合。将细胞用2μg caspase-3/8siRNA或阴性对照siRNA质粒在 减少血清的培养基中转染5小时，然后在完全培养基中孵育24小时。 制备总RNA用于随后的分析。
RelB SiRNA的制备
RelB siRNA寡聚物由Welgen，Inc合成。通过限制性位点将siRNA 克隆到pQuiet载体中。
RelB基因的体外沉默
使用lipofectamine 2000(Invitrogen)将L929细胞用RelB siRNA转 染。单独的载体和混杂的(无义的)siRNA被用作阴性对照。简单来 说，在培养24小时后使用TRIzol提取RNA用于逆转录酶PCR (RT-PCR)。
用于体内研究的动物
CD1小鼠从The Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购买。将小鼠维 持在特定的无病原条件下。所有的小鼠都是雄性的，6到10周龄。所 有的试验都按照动物委员会指南的护理和使用指导(Guide for the Care and Use of on Animals Committee Guidelines)进行。
SiRNA注射
在肾脏IRI前48小时，将siRNAs(50μg溶于1ml PBS中)或1 ml PBS快速注射(在10秒钟内)到一条尾部静脉中。为了使尾静脉膨 胀，将尾巴浸泡在温水中或用灯加热。
肾脏IRI模型
称重25-27g的小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻 嗪(10mg/kg)进行麻醉，并置于加热的垫子上以在手术中维持它们的 体温。腹部切开之后，钝性分离肾蒂，将微血管钳(Roboz Surgical Instrument，Washington，DC)放置在左肾蒂上25分钟。在该过程中动 物用温暖的盐水良好保持水分并在恒定的温度下(37℃)。选择缺血 的时间为25分钟，以获得具有最小的血管血栓形成的可逆的缺血ARF 模型，以避免动物死亡。在取下钳子后，观察左肾1分钟以看到指示 血液重新流动的颜色变化，然后切下对侧肾脏。然后将切口缝合，使 动物恢复，允许自由进食和进水。在再灌注后24小时从下腔静脉收集 血液，并获取左肾用于分析。对于存活观察实验来说，按照同样的方 式进行手术，只是缺血(钳住)的时间是35分钟。
肾功能的评估
在(缺血前)和缺血后24小时后从下腔静脉获得血液样品。由伦 敦卫生科学中心(London Health Sciences Center)的中心实验室使用 SYNCHRON LX系统(Beckman Coulter，Inc.)测定血尿素氮(BUN) 和血清肌酐(Cr)水平。
通过定量实时PCR测量肾脏RelB mRNA水平
使用TRIzol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)从细胞或肾脏分 离总RNA。用于RelB RT-PCR的引物是：有义CCC CTA CAA TGC TGG CTC CCT GAA，反义CAC GGC CCG CTC TCC TTG TTG ATT。 使用eppendorf循环仪(Mastercycler gradient)进行RT-PCR。所有的 反应都是在50μl反应体积中按照制造商的说明进行的。PCR参数的 组成为：在42℃逆转录50分钟，然后进行30个循环的PCR：94℃30 秒，58℃30秒和72℃30秒。在100伏下运行凝胶电泳，然后在紫外 灯下观察结果。样品还进行基因表达的实时PCR。
肾脏形态学变化的评估
在缺血后24小时，从小鼠切下肾脏，将组织切片固定在10％福尔 马林中，并使用标准技术进行处理以用于组织学检查。福尔马林组织 被包埋在石蜡中，用H&E对5μm的切片进行染色。这些切片由病理 学家以盲法模式检查。使用设计用于评估梗死、管状空泡形成和管型 形成程度的半定量尺度，在根据涉及的伤口面积的5点尺度上，为皮 质和髓质中组织学变化的百分数打分，如下：0，正常肾脏；0.5，＜10％； 1，10-25％；2，25-50％；3，50-75％；和4，75-100％。病理学家通过 对5个视野中的每个高倍视野(x 400)中嗜中性细胞进行计数，然后 将嗜中性细胞的数量平均，来定量评估嗜中性细胞浸润。
统计学分析
统计学比较使用双侧Student′s t检验进行。存活率通过 Kaplan-Meier检验进行分析。
使用的一般性方法(图25-29)
动物
称重25-27g的6周龄的雄性CD1(Charles River)小鼠在使用前被 饲养在我们大学的实验室中。所有的步骤都按照动物委员会的护理和 使用指南(Guide for the Care and Use on Animal Committee)所设定的 准则进行。
细胞系
细胞系L929和巨噬细胞被用在我们的实验中，用于检测siRNA 的沉默效能。为了分析siRNA的沉默效能，我们通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将siRNA转染到L929细胞系中，然后用tTRIzol提取 RNA用于逆转录酶PCR(RT-PCR)。
SiRNA的制备和注射
TNFαsiRNA由公司(Invitrogen)合成。将该TNFαsiRNA构建 到pSilence载体或pRNAT U6.1载体中。对于流体动力学注射来说，将 siRNA(50μg溶于1ml PBS)或1ml PBS快速注射(在10秒钟内) 到一条尾部静脉中。为了使尾静脉膨胀，将尾巴浸泡在温水中或用灯 加热。
缺血方案
小鼠(25-27g)通过腹膜内施用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg和 10g/kg)进行麻醉。通过在动物的下面放置暖垫使其体温保持恒定。使 用腹中线切开术，使用微动脉瘤钳(International Fine Sciencce Tools，Inc. CA)将左肾脏动脉和静脉阻断25或35分钟，同时取下右肾。阻断后， 将0.5ml预温热(37℃)的盐水放置在腹腔中，将腹部关闭。在取下 钳子后，再观察肾脏1分钟以看到指示血液重新流动的颜色变化。缝 合后，将被切口的小鼠放回笼子中。假处理小鼠经过同样的手术程序， 只是不使用微动脉瘤钳。在24小时时将小鼠处死，通过下腔静脉收集 血液样品。对于存活实验来说，在所有存活的动物没有生病的迹象之 后对动物观察几天。
肾功能的评估
由我们的中心实验室使用SYNCHRON LX系统(Beckman Coulter， Inc.)测量血清中的血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。
RT-PCR
使用TRIzol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)从细胞或肾脏分 离总RNA。使用eppendorf循环仪(Mastercycler梯度)进行RT-PCR。 所有的反应都是在50μl反应体积中按照制造商的说明进行的。PCR 参数的组成为：在42℃的逆转录50分钟，然后进行30个循环的PCR： 94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒。在100伏下进行凝胶电泳，然 后在紫外灯下观察结果。
肾脏形态学变化的评估
从小鼠手术切下之后，肾脏被冠状切片，固定在10％甲醛中，并 包埋在石蜡中。用H&E对切片(5μm)进行染色。在显微镜下对一个 全深度的冠状切片进行检查。使用5点尺度对皮质髓质交界处损伤的 肾小管的百分数进行估计。
RelB免疫组织化学
在脱去石蜡并重新水化后，将肾脏的石蜡切片用3％的过氧化氢孵 育15分钟以猝灭内源的过氧化物酶活性。在微波20分钟后，将切片 在含有5％正常小鼠血清的清洗缓冲液中封闭30分钟。将切片与用 PBS1∶100稀释的仓鼠抗小鼠Fas mAb(BD Pharmingen)在室温孵育1 小时。在用PBS清洗后，将切片与生物素化的小鼠抗仓鼠Ig、然后与 结合了辣根过氧化物酶的链亲和素(LSAB检测试剂盒，DAKO)孵育。 在PBS中进一步清洗后，染色用二氨基联苯胺(DAB)显影，然后将 载玻片用苏木精轻微复染。对照玻片用仓鼠IgG代替第一抗体进行染 色。在单个肾小管中，Fas免疫染色出现在所有上皮细胞中或完全不出 现。盲法评价连续5个观察视野(放大x 200)中阳性肾小管的百分数。
组织学计分
在肾脏缺血后取出肾脏，在10％福尔马林中固定，用于组织学检 查。将组织包埋在石蜡中，用H&E对切片进行染色。从盲法分析计算 出平均值，使用分值0，无损伤；0.5，＜10％；1，10-25％；2，25-50％； 3，50-75％；以及4，75-100％。通过对5个视野(x 400)中嗜中性细 胞的数量进行计数来评估嗜中性细胞浸润。
统计学分析
统计学比较使用双侧Student′s t检验进行。存活率通过 Kaplan-Meier检验进行分析。
用于TNF-α的一般性方案
被relB siRNA沉默的TNF-α基因
为了观察体外基因沉默的结果，用载体relB siRNA转染L929细 胞。24小时后收集细胞并制备RNA。通过RT-PCR测定，relB mRNA 在L929中的表达降低了。接下来测定了在缺血再灌注损伤后，注射 TNF-αsiRNA是否能够沉默被上调的TNF-α表达。首先观察IRI后 TNF-α的表达。在IRI后24小时和48小时，TNF-α的表达增加了，在 肾脏中最高表达是在48小时时。然后通过单次流体动力学注射将载体 siRNA(50μg)投送到尾静脉中。在24小时和48小时后，取出肾脏 并制成匀浆液。制备RNA和cDNA，并进行RT-PCR。结果显示在用 siRNA处理后relB的表达降低了。
siRNA处理改善了肾功能
基因沉默的结果表明siRNA能够阻断NF-κB途径。证实了TNFα 能够防止肾脏在缺血后的损伤。BUN和肌酐由我们的中心实验室测量。 在夹住25分钟后，BUN和肌酐的水平与未处理的对照小鼠相比明显增 加了。如果与阳性对照组相比，BUN水平降低了30％。但是肌酐含量 显著降低了。
形态学变化
接下来观察了肾脏的病理学变化。肾脏病理学通过H&E(苏木精) 染色来确定，其在缺血的肾脏中随着TNFα表达的沉默而明显降低了。
由于肾脏中TNFα的表达和缺血损伤被抑制的情况，小鼠的死亡率 得到了改善。接下来证明了TNFαsiRNA在小鼠中能够提供严重缺血 的保护，在严重缺血中左肾蒂被钳住35分钟，并且对侧肾脏被移除。 在钳住之前48小时，通过流体动力学尾静脉注射向小鼠注射了盐水、 载体siRNA和。11只通过流体动力学尾静脉注射接受盐 水的小鼠中的10只在5天内死于急性肾衰竭。但是，10只用 注射的小鼠中的8只存活了(对照空载体P＜0.01，对照盐水 P＜0.01)。
实施例(图1-16)
实施例1
如上所述，将CD1小鼠的左肾静脉和动脉在37℃钳住25分钟。 在再灌注24或48小时后取出被处理的肾脏。时间点是从钳住时计算 的。从用TRIzol试剂(Gibco BRL)按照制造商的说明分离的IDO-沉 默的、无义siRNA沉默的或假转染的B16F10细胞中提取总RNA。通 过RT-PCR测定RelB基因的表达。使用RNA PCR试剂盒(Gibco BRL)，用提供的寡d(T)16引物来合成第一链cDNA。1μmol逆转录 反应产物用于后面的PCR反应。用于RelB的引物位于RelB-siRNA靶 序列两侧，并使用了GAPDH(内部阴性对照)引物。使用的PCR条 件如下：94℃30秒，58℃30秒，以及72℃30秒(30个循环)。使 用凝胶电泳在1.5％琼脂糖凝胶中通过用溴化乙锭染色使PCR产物可见 (Hill，J.A.，Ichim，T.E.，Kusznieruk，K.P.，Li，M.，Huang，X.，Yan，X.， Zhong，R.，Cairns，E.，Bell，D.A.，和Min，W.P.2003.Immune modulation by silencing IL-12production in dendritic cells using small interfering RNA.(在树突状细胞中通过使用小干扰RNA沉默IL-12的产生来进 行免疫调节)J Immunol 171：691-696)。正如在图1中看到的那样，在 肾脏缺血后RelB的表达增加了。
实施例2
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注0、2、12 和24小时后，通过RT-PCR测定被处理的肾脏中Fas基因的表达。如 在图2中看到的那样，Fas的表达在缺血后增加了。
实施例3
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注0、2、12、 24或48小时后测定被处理的肾脏中caspase 8基因的表达。如在图3 中看到的那样，caspase 8的表达在缺血后增加了。
实施例4
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，并测定了caspase 3 和GAPDH基因的表达。图4显示了在再灌注后0、2和24小时时caspase 3∶GAPDH表达的比率。
实施例5
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注24和48 小时后测定被处理的肾脏中C3基因的表达。图5显示了C3基因的表 达在缺血后增加了。
实施例6
按照实施例1中的描述对CD1小鼠进行处理，在再灌注24和48 小时后测定被处理的肾脏中C5aR基因的表达。图6显示C5aR的表达 在缺血后增加了。
实施例7
图7显示了在巨噬细胞系中Caspase 3基因的体外沉默。简单来说， 将细胞铺在12孔板中(每个孔2×105个细胞)，使其在1或2ml不含 抗生素的完全培养基中生长过夜。将4μg含有Caspase 3-siRNA的质 粒与10μl Lipofectamine 2000试剂在250μl最适的减少血清的培养基 中(Invitrogen)在室温孵育20分钟。然后将混合物加到生长到90％-95％ 汇合的细胞培养物中。孵育4小时后加入等体积的补充有20％FCS的 RPMI 1640。24到48小时后，收获转染的细胞，通过RT-PCR检测 Caspase基因的表达。()
实施例8
将实施例7中的巨噬细胞按照实施例7中的描述用表达caspase 8-siRNA的载体转染。转染后48小时，提取总RNA，通过RT-PCR测 定caspase 8基因的表达。1、2、3和4代表了不同的siRNA。图8显 示了在处理过的细胞中caspase 8的表达降低了。
实施例9
将实施例7中的巨噬细胞按照实施例7中描述的方法用Rel B cDNA和Rel B-siRNA共转染。转染后48小时，提取总RNA，通过 RT-PCR测定Rel B基因的表达。siRNA池是几种靶向同样基因但是不 同位点的siRNA的混合物，并且siRNA载体是含有SEC序列或在本申 请中描述的发夹siRNA序列的载体。所有的泳道都是DC细胞。如在 图9中所见，Rel B的表达被siRNA池和siRNA载体降低了。
实施例10
如上所述用Fas-siRNA在表达Fas-siRNA的载体中转染表达Fas 的巨噬细胞。转染后48小时，提取蛋白，通过Western印迹测定Fas 的表达。如在图10中所见，在Fas-siRNA处理的细胞中蛋白的水平降 低了。siRNA 1、3、4和5是靶想Fas基因的不同siRNA序列。
实施例11
将50μg特异性针对caspase 3基因的siRNA静脉内注射到CD1 小鼠中。然后按照实施例1中的描述钳住左肾静脉和动脉。在注射 siRNA后48小时，获取左肾，提取总RNA，通过RT-PCR测定caspase 3的表达。
实施例12
按照实施例11中的描述处理CD1小鼠，除了注射特异性针对Fas 基因的siRNA外。图12显示了在siRNA处理后Fas基因的表达降低了。 从左到右为对照1-3和小鼠1-5。
实施例13
CD1小鼠静脉注射特异性针对TNFα和/或Rel B基因的siRNA(组 合中每种siRNA各50μg)，然后按照实施例1中的描述进行左肾缺血。 通过在再灌注后24小时测量血肌酐和BUN水平来确定肾功能。图13 显示，当使用同时针对TNFα和Rel B基因的siRNA时，缺血后的肾功 能被保护为接近正常。
实施例14
CD1小鼠静脉注射特异性针对凋亡基因caspase 3、caspase 8和Fas 的siRNA，或分别或组合，并按照实施例1中的描述进行左肾缺血。 在再灌注后24小时确定肾功能。如图14中所见，单独沉默caspase 3 或caspase 8保护了缺血后的肾功能。最有效的是使用靶向caspase 3、 caspase 8和Fas的siRNA的混合物。
实施例15
按照实施例13中的描述处理CD1小鼠，不同之处在于使用下列的 siRNA组合：
组合1：caspase 3、caspase 8和Fas；
组合2：TNFα和Rel B；
组合3：C3和C5aR；
组合4(S-mix)：所有的混合物1、2和3的siRNA。
图15显示了所有的siRNA组合对缺血后肾功能的良好保护。
实施例16
CD1小鼠静脉注射50μg特异性针对caspase 3、caspase 8、Fas、 C3、C5aR、TNFα和Rel B基因的siRNA混合物或盐水(对照)，并 通过在37℃下夹住肾静脉和动脉35分钟使左肾缺血。在再灌注后跟踪 小鼠的存活，结果显示在图16中。所有siRNA处理的小鼠在再灌注后 8天仍然存活，而所有的对照小鼠在再灌注后5天都死亡了。
尽管在这里已经详细描述了本发明的优选实施方案，但本领域的 专业技术人员将会了解到，可以对其进行改变而不背离本发明的精神 或随附的权利要求的范围。
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