新型抗体及其用途
阅读：151发布：2021-10-22
专利汇可以提供新型抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了对于人白细胞介素‑1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的 抗体 或其 抗原 结合 片段 ，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制人IL1RAP的结构域3。本发明还提供了这种抗体或抗原结合片段在 治疗 和/或诊断癌症例如白血病和黑素瘤中的用途。，下面是新型抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种对于人白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)的结构域3具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含完整抗体或由完整抗体组成。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下述的抗原结合片段或由选自下述的抗原结合片段组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单VH可变结构域或VL可变结构域)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制参考抗体‘CAN01’与人IL1RAP的结合，
其中所述参考抗体‘CAN01’是完整的IgG，其包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的轻链可变区。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的一种或多种：
a)对于人IL1RAP 2nM或更大的结合亲和力(KD)；
b)与来自食蟹猕猴的IL1RAP的交叉反应性；
c)在一种或多种癌细胞系中诱导ADCC的能力；和/或
d)在结合一种或多种癌细胞系后内在化的能力。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的全部：
a)对于人IL1RAP 2nM或更大的结合亲和力(KD)；
b)与来自食蟹猕猴的IL1RAP的交叉反应性；
c)在一种或多种癌细胞系中诱导ADCC的能力；和
d)在结合一种或多种癌细胞系后内在化的能力。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够结合IL1RAP的细胞外结构域上的表位，所述表位与IL1RAP上抗体CAN01能够与之结合的表位至少部分重叠。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位位于
IL1RAP的氨基酸235至367处/内。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的重链可变区：
a)G Y T V S S Y[SEQ ID NO:3]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、
80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)L P G S A I[SEQ ID NO:4]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)G D Y F D S T F V Y Y[SEQ ID NO:5]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 3、4和5的CDR的重链可变区。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的重链可变区：
a)G Y T V S S Y W I D[SEQ ID NO:6]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)E I L P G S A I N N Y N E K F K G[SEQ ID NO:7]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)G D Y F D S T F V Y Y[SEQ ID NO:5]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 6、7和5的CDR的重链可变区。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述或由下述组成的重链可变区：SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的轻链可变区：
a)R S S Q S I V H S N G N T Y L E[SEQ ID NO:11]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)K V S N R F S[SEQ ID NO:12]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、
80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)F Q G S H V P R T[SEQ ID NO:13]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 11、12和13的CDR的轻链可变区。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述或由下述组成的轻链可变区：SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列组成。
21.根据权利要求13或18所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区。
22.根据权利要求14或19所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列组成。
23.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链可变区；
b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链可变区；
c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变
区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链可变区；
d)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链可变区；
e)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链可变区；
f)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变
区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链可变区；
g)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链可变区；
h)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链可变区；
i)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变
区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链可变区；
j)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链可变区；
k)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链可变区；
l)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变
区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链可变区；
m)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链可变区；
n)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链可变区；
或
o)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变
区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链可变区。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制参考抗体‘CAN03’与人IL1RAP的结合，
其中所述参考抗体‘CAN03’是完整的IgG，其包含由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的轻链可变区。
25.根据权利要求24所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的一种或多种：
a)对于人IL1RAP 500pM或更大的结合亲和力(KD)；
b)与来自食蟹猕猴的IL1RAP的交叉反应性；
c)对IL-1信号传导的抑制作用；
d)在一种或多种癌细胞系中诱导ADCC的能力；和/或
e)在结合一种或多种癌细胞系后内在化的能力。
26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的全部：
a)对于人IL1RAP 500pM或更大的结合亲和力(KD)；
b)与来自食蟹猕猴的IL1RAP的交叉反应性；
c)对IL-1信号传导的抑制作用；
d)在一种或多种癌细胞系(例如CML、AML和/或黑素瘤细胞系)中诱导ADCC的能力；和e)在结合一种或多种癌细胞系(例如CML、AML和/或黑素瘤细胞系)后内在化的能力。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够结合IL1RAP的细胞外结构域上的表位，所述表位与IL1RAP上抗体CAN03能够与之结合的表位至少部分重叠。
28.根据权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位位于IL1RAP的氨基酸235至367处/内。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的重链可变区：
a)G F T F S I Y[SEQ ID NO:21]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、
80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)S I G G S Y[SEQ ID NO:22]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、
80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)E V D G S Y A M D Y[SEQ ID NO:23]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 21、22和23的CDR的重链可变区。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的重链可变区：
a)G F T F S I Y T M S[SEQ ID NO:24]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)T I S I G G S Y I N Y P D S V K G[SEQ ID NO:25]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)E V D G S Y A M D Y[SEQ ID NO:23]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 24、25和23的CDR的重链可变区。
33.根据权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区。
34.根据权利要求24至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含人源化重链可变区。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有下述CDR的轻链可变区：
a)R A S Q S I G T S I H[SEQ ID NO:26]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
b)S A S E S I S[SEQ ID NO:27]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、
80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
c)Q Q S N S W P T T[SEQ ID NO:28]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少
70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO 26、27和28的CDR的轻链可变区。
37.根据权利要求36所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。
38.根据权利要求24至36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含人源化轻链可变区。
39.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
40.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不能诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
41.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制IL-1信号传导和/或IL-33信号传导和/或IL-36信号传导。
42.根据权利要求1至40中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不能抑制IL-1信号传导，不能抑制IL-33信号传导和/或不能抑制IL-36信号传导。
43.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区或其部分。
44.根据权利要求43所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区是选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的免疫球蛋白亚型。
45.根据权利要求44所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区是免疫球蛋白亚型IgG1。
46.根据权利要求45所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成。
47.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链恒定区或其部分。
48.根据权利要求47所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区是κ或λ轻链。
49.根据权利要求48所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区是κ轻链。
50.根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。
51.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区。
52.根据权利要求51所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区是非天然存在的。
53.根据权利要求52所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区包含表1中鉴定的突变中的一个或多个。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在所述Fc区缺少岩藻糖残基或岩藻糖残基很少。
55.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含用于增加所述试剂的体内半衰期的部分。
56.根据权利要求55所述的抗体或其抗原结合片段，其中用于增加体内半衰期的所述部分选自聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖酐。
57.根据权利要求56所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是PEG化的。
58.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含细胞毒性部分。
59.根据权利要求58所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
60.根据权利要求59所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体和低光子能量发射体。
61.根据权利要求59或60所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素具有在所述试剂的附近产生高剂量吸光度的局部吸收能量的发射模式。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自长程β发射体，例如90Y、32P、186Re/186Re；166Ho、76As/77As、153Sm；中程β发射体，例如
131I、177Lu、67Cu、161Tb；低能β发射体，例如45Ca、35S或14C；转换或俄歇发射体，例如51Cr、67Ga、
99Tcm、111In、123I、125I、201Tl；以及α发射体，例如212Bi、213Bi、223Ac和221At。
63.根据权利要求62所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素是177Lu。
64.根据权利要求58所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分包含细胞毒性药物或由细胞毒性药物组成。
65.根据权利要求64所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性药物选自细胞抑制药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼加成物；
细胞因子；毒胡萝卜素内酯及其代谢产物；毒素(例如皂草素或加利车霉素)；化学治疗剂(例如抗代谢药)；或可用于治疗肿瘤性病症的任何其他细胞毒性药物。
66.根据权利要求65所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性药物适用于激活疗法，例如光子激活疗法、中子激活疗法、中子诱导的俄歇电子疗法、同步辐射疗法或低能量X射线光子激活疗法。
67.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体多肽还包含可检测部分。
68.根据权利要求67所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
69.根据权利要求68所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
89
70.根据权利要求69所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素是 Zr。
71.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体多肽包含一对可检测和细胞毒性的放射性核素，例如86Y/90Y或124I/211At。
72.根据权利要求71所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素能够同时作为可检测部分以及作为细胞毒性部分以多模态方式起作用。
73.根据权利要求72所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分包含顺磁同位素或由顺磁同位素组成。
74.根据权利要求73所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述顺磁同位素选自157Gd、
55 162 52 56
Mn、 Dy、Cr和 Fe。
75.根据权利要求67至74中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分可通过成像技术例如SPECT、PET、MRI、光学成像或超声成像检测。
76.根据权利要求58至75中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分和/或可检测部分经由连接部分间接连接至所述抗体或其抗原结合片段。
77.根据权利要求76所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述连接部分是螯合剂。
78.根据权利要求77所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述螯合剂选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物、以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
79.一种分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或其组分多肽链。
80.根据权利要求79所述的核酸分子，其中所述分子是cDNA分子。
81.根据权利要求79或80所述的核酸分子，其编码抗体重链或其可变区。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的核酸分子，其编码抗体轻链或其可变区。
83.一种载体，其包含根据权利要求79至82中任一项所述的核酸分子。
84.根据权利要求83所述的载体，其中所述载体是表达载体。
85.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求55至58中任一项所述的核酸分子或根据权利要求83或84所述的载体。
86.根据权利要求85所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
87.根据权利要求86所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
88.根据权利要求87所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
89.一种用于产生根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许编码的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如权利要求86至88中任一项限定的宿主细胞。
90.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
91.根据权利要求90所述的药物组合物，其适合于肠胃外递送。
92.根据权利要求91所述的药物组合物，其适合于静脉内递送。
93.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于医学中。
94.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于诱导受试者中与肿瘤性病症相关的病理性细胞或者其干细胞或祖细胞的细胞死亡和/或抑制所述病理性细胞或者其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中所述细胞表达IL1RAP。
95.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗受试者中的肿瘤性病症，其中所述肿瘤性病症与表达IL1RAP的细胞相关。
96.根据权利要求95所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
97.根据权利要求96所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症选自慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
98.根据权利要求97所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症是CML。
99.根据权利要求97所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症是MPD。
100.根据权利要求97所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症是MDS。
101.根据权利要求97所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症是ALL。
102.根据权利要求97所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性血液学病症是AML。
103.根据权利要求95所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤性病症与所述受试者体内的实体瘤形成相关。
104.根据权利要求103所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述实体瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
105.根据权利要求104所述的用于治疗肿瘤性病症的抗体或其抗原结合片段，其中所述实体瘤是黑素瘤。
106.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或诊断受试者中的肿瘤性病症的药物中的用途，其中所述肿瘤性病症与表达IL1RAP的细胞相关。
107.根据权利要求106所述的用途，其中所述肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
108.根据权利要求107所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症选自慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
109.根据权利要求108所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症是CML。
110.根据权利要求108所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症是MPD。
111.根据权利要求108所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症是MDS。
112.根据权利要求108所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症是ALL。
113.根据权利要求108所述的用途，其中所述肿瘤性血液学病症是AML。
114.根据权利要求106所述的用途，其中所述肿瘤性病症与所述受试者体内的实体瘤形成相关。
115.根据权利要求114所述的用途，其中所述实体瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
116.根据权利要求115所述的用途，其中所述实体瘤是黑素瘤。
117.一种用于治疗或诊断受试者中的肿瘤性病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的步骤，其中所述肿瘤性病症与表达IL1RAP的细胞相关。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症选自慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症是CML。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症是MPD。
122.根据权利要求119所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症是MDS。
123.根据权利要求119所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症是ALL。
124.根据权利要求119所述的方法，其中所述肿瘤性血液学病症是AML。
125.根据权利要求117所述的方法，其中所述肿瘤性病症与所述受试者体内的实体瘤形成相关。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述实体瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述实体瘤是黑素瘤。
128.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗对用IL-
1信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或状况。
129.根据权利要求128所述的抗体或其抗原结合片段，其中对用IL-1信号传导抑制剂的治疗敏感的所述疾病或状况选自类风湿性关节炎、所有类型的青少年关节炎包括全身性发作性青少年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性冷自身炎症性综合征(FCAS)、穆韦二氏病、新生儿发作性多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成人斯蒂尔病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、斯威特病、狼疮关节炎、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、哮喘、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、丙型肝炎、局部缺血再灌注损伤、多发性硬化、奈瑟氏菌脑膜炎或肺炎球菌性脑膜炎、肺结核、白塞氏综合征、败血性休克、移植物抗宿主病、哮喘、I型糖尿病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗死、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪性肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、中风和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎和痛风。
130.根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗对用IL-1信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或状况的药物中的用途。
131.根据权利要求130所述的抗体或其抗原结合片段的用途，其中对用IL-1信号传导抑制剂的治疗敏感的所述疾病或状况选自类风湿性关节炎、所有类型的青少年关节炎包括全身性发作性青少年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性冷自身炎症性综合征(FCAS)、穆韦二氏病、新生儿发作性多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成人斯蒂尔病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、斯威特病、狼疮关节炎、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、哮喘、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、丙型肝炎、局部缺血再灌注损伤、多发性硬化、奈瑟氏菌脑膜炎或肺炎球菌性脑膜炎、肺结核、白塞氏综合征、败血性休克、移植物抗宿主病、哮喘、I型糖尿病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗死、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪性肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、中风和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎和痛风。
132.一种用于治疗受试者中对用IL-1信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或状况的方
法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的步骤。
133.根据权利要求132所述的方法，其中对用IL-1信号传导抑制剂的治疗敏感的所述疾病或状况选自类风湿性关节炎、所有类型的青少年关节炎包括全身性发作性青少年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性冷自身炎症性综合征(FCAS)、穆韦二氏病、新生儿发作性多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成人斯蒂尔病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、斯威特病、狼疮关节炎、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、哮喘、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、丙型肝炎、局部缺血再灌注损伤、多发性硬化、奈瑟氏菌脑膜炎或肺炎球菌性脑膜炎、肺结核、白塞氏综合征、败血性休克、移植物抗宿主病、哮喘、I型糖尿病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗死、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪性肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、中风和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎和痛风。
134.一种用于检测受试者中的癌细胞的体外方法，所述方法包括：
(a)提供来自待测试的受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)；
(b)任选地，提取和/或纯化所述样品中存在的细胞；
(c)使根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与所述样品中存在
的细胞接触；
(d)测定所述抗体或其抗原结合片段是否结合所述细胞，
其中所述抗体或其抗原结合片段与所述细胞的结合指示所述受试者组织中癌细胞的
存在。
135.一种用于鉴定将受益于用根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者的体外方法，所述方法包括：
(a)提供来自待测试的患者的癌细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)；
(b)任选地，提取和/或纯化所述样品中存在的细胞；
(c)使根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与所述样品中存在
的细胞接触；
(d)测定所述抗体或其抗原结合片段是否结合所述细胞，
其中所述抗体或其抗原结合片段与所述癌细胞的结合指示将受益于用根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的治疗的患者。
136.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括将有效治疗所述癌症的治疗剂施用于使用根据权利要求134或135所述的方法鉴定为患有癌症的受试者。
137.根据权利要求136所述的用于治疗患有癌症的患者的方法，其中所述治疗剂是根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
138.根据权利要求136或137所述的用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：
(a)布置来自受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)，所述受试者使用根据权利要求134所述的方法测试表达阈值标准以上的IL1RAP的癌细胞的存在；
(b)选择其在步骤(a)中测试的细胞样品含有IL1RAP表达在阈值标准以上的癌细胞的
受试者用于治疗；和
(c)给在步骤(b)中选择的所述受试者施用有效治疗所述癌症的治疗剂。
139.根据权利要求138所述的用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：
(a)获得来自受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)，
(b)使用根据权利要求134所述的方法，就表达阈值标准以上的IL1RAP的癌细胞的存在测试所述细胞；
(c)选择其在步骤(b)中测试的细胞样品含有IL1RAP表达在阈值标准以上的癌细胞的
受试者用于治疗；和
(d)给在步骤(c)中选择的所述受试者施用有效治疗所述癌症的治疗剂。
140.一种用于鉴定将受益于用根据权利要求1至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者的体外诊断方法，所述方法包括下述步骤：
(c)使来自待测试的受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)与能够
特异性结合IL1RAP多肽或IL1RAP多核苷酸转录物的分子探针体外接触，所述探针与能够发射光子的部分共价结合；和
(d)检测由所述部分发射的光子并形成所述样品的图像，
其中来自所述部分的光子的局部发射指示所述受试者是将受益于用根据权利要求1至
78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者。
141.基本上如本文中参考说明书描述的抗体或其抗原结合片段或者所述抗体或其抗
原结合片段的用途。
新型抗体及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及用于治疗和诊断与IL-1生物标记物(特别是IL1RAP)相关和/或响应IL-1信号传导抑制的疾病和状况的基于抗体的试剂。特别地，本发明提供了用于治疗和诊
断癌症的基于抗体的试剂，所述癌症包括但不限于白血病(例如慢性髓样白血病、急性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、骨髓增生性病症和骨髓增生异常综合征)和与实体瘤形成相关的癌症(例如黑素瘤、肺癌和乳腺癌)。
断癌症的基于抗体的试剂，所述癌症包括但不限于白血病(例如慢性髓样白血病、急性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、骨髓增生性病症和骨髓增生异常综合征)和与实体瘤形成相关的癌症(例如黑素瘤、肺癌和乳腺癌)。
背景技术
[0002] 白细胞介素-1生物学
[0003] 白细胞介素-1(IL-1)是有力的促炎细胞因子，其可通过不同细胞类型包括单核吞噬细胞响应感染和炎症而产生。IL-1家族由七种激动剂包括IL-1α和IL-1β以及三种天然存在的受体拮抗剂包括IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)组成(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):
2095-147)。两种IL-1受体，IL-1R I型和IL-1R II型已得到鉴定。两种受体均可与所有三种形式的IL-1家族分子相互作用。IL-1RI负责介导IL-1诱导的细胞活化。然而，IL-1/IL-1RI复合物本身不能发信号，而是依赖与第二受体链IL-1R辅助蛋白(IL1RAP)的结合
(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。与IL-1RI相反，IL-1RII在与IL-1结合后不诱导细胞活化，并且因此IL-1RII作为调节性诱饵受体起作用，导致可用于结合IL-1RI的
IL-1的净减少。
2095-147)。两种IL-1受体，IL-1R I型和IL-1R II型已得到鉴定。两种受体均可与所有三种形式的IL-1家族分子相互作用。IL-1RI负责介导IL-1诱导的细胞活化。然而，IL-1/IL-1RI复合物本身不能发信号，而是依赖与第二受体链IL-1R辅助蛋白(IL1RAP)的结合
(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。与IL-1RI相反，IL-1RII在与IL-1结合后不诱导细胞活化，并且因此IL-1RII作为调节性诱饵受体起作用，导致可用于结合IL-1RI的
IL-1的净减少。
[0004] 除IL1信号传导之外，IL1RAP对于通过ST2/IL1RAP复合物介导IL-33的作用和通过IL1Rrp2/IL1RAP复合物介导IL36的作用是关键的(Garlanda等人，Immunity.2013Dec 12；
39(6):1003-18)。
39(6):1003-18)。
[0005] IL-1是有力的促炎细胞因子，其在局部感染或炎症的部位诱导并涉及不同生理和细胞事件的调节(在Dinarello CA,CHEST,2000,118:503-508和Dinarello,CA,Clin Exp
Rheumatol,2002,20(5Suppl 27):S1-13中概述)。它能够激活几种细胞类型，包括白细胞和内皮细胞。IL-1通过促进粘附分子、细胞因子、趋化因子和其他炎症介质例如前列腺素E2和一氧化氮(NO)的产生和表达来诱导且扩增免疫应答。因此，局部炎症被放大且持续。另外，IL-1诱导的炎症介质的产生导致发烧、头痛、低血压和重量减轻。此外，IL-1是造血生长因子，并且已显示在骨髓移植期间降低患者中的白细胞和血小板的最低值。IL-1也已显示通
过诱导血管内皮生长因子的产生来促进血管生成，由此促进风湿症关节中的血管翳形成和
血液供应。最后，IL-1已显示促进风湿性疾病中的骨和软骨降解。
Rheumatol,2002,20(5Suppl 27):S1-13中概述)。它能够激活几种细胞类型，包括白细胞和内皮细胞。IL-1通过促进粘附分子、细胞因子、趋化因子和其他炎症介质例如前列腺素E2和一氧化氮(NO)的产生和表达来诱导且扩增免疫应答。因此，局部炎症被放大且持续。另外，IL-1诱导的炎症介质的产生导致发烧、头痛、低血压和重量减轻。此外，IL-1是造血生长因子，并且已显示在骨髓移植期间降低患者中的白细胞和血小板的最低值。IL-1也已显示通
过诱导血管内皮生长因子的产生来促进血管生成，由此促进风湿症关节中的血管翳形成和
血液供应。最后，IL-1已显示促进风湿性疾病中的骨和软骨降解。
[0006] IL-1在疾病中的作用
[0007] IL-1牵涉范围从痛风到癌症的广泛范围的疾病和状况(关于综述参见Dinarello等人，2012,Nature Reviews 11:633-652和Dinarello,2014,Mol.Med.20(suppl.1):S43-
S58；其公开内容以引用的方式并入本文)，包括：
S58；其公开内容以引用的方式并入本文)，包括：
[0008] ·关节、骨和肌肉疾病，例如类风湿性关节炎和骨关节炎；
[0009] ·遗传性系统性自身免疫性疾病，例如家族性地中海热；
[0010] ·系统性自身炎症性疾病，例如全身性青少年特发性关节炎和成人斯蒂尔病；
[0011] ·常见的炎性疾病，例如痛风和2型糖尿病；
[0012] ·急性缺血性疾病，例如心肌梗死；和
[0013] ·癌症。
[0014] 许多用于阻断IL-1活性的疗法被批准并处于开发中。靶向IL-1在1993年伴随引入阿那白滞素开始(Kineret；Amgen)，所述阿那白滞素是天然存在的IL-1受体拮抗剂(IL-Ra)的重组形式，其阻断IL-1α和IL-1β两者的活性；这种治疗剂自那以后已用于证明IL-1在众多疾病中的作用(参见上文)。由于其良好的安全性记录、短半衰期和多重施用途径，阿那白滞素目前主导IL-1治疗剂领域。用抗体或可溶性受体中和IL-1也已被证明是有效的，并且
可溶性诱饵受体利纳西普(Arcalyst；Regeneron)和抗IL-1β中和单克隆抗体卡那津单抗
(Ilaris；Novartis)目前已被批准用于某些罕见遗传状况，例如冷卟啉相关周期性综合征
(CAPS)。其他治疗方法，包括IL-1α中和、靶向IL-1β的治疗性疫苗和嵌合IL-1Ra，处于早期临床试验中。另外，IL-1产生的口服活性小分子抑制剂，例如半胱天冬酶1抑制剂已得到开发并正在测试。
可溶性诱饵受体利纳西普(Arcalyst；Regeneron)和抗IL-1β中和单克隆抗体卡那津单抗
(Ilaris；Novartis)目前已被批准用于某些罕见遗传状况，例如冷卟啉相关周期性综合征
(CAPS)。其他治疗方法，包括IL-1α中和、靶向IL-1β的治疗性疫苗和嵌合IL-1Ra，处于早期临床试验中。另外，IL-1产生的口服活性小分子抑制剂，例如半胱天冬酶1抑制剂已得到开发并正在测试。
[0015] 白细胞介素-33(IL-33)是IL-1家族的核相关细胞因子。IL-33经由受体IL-33R(ST2)发信号，并且在过敏、哮喘、感染、炎症和促进癌症生长中起重要作用(参见Cayrol&Girard(2014)Curr Opin Immunol.31:31-7和Maywald等人(2015)PNAS 112(19):E2487-
2496)。IL1RAP是通过IL-33传递信号的IL-33R(ST2)受体复合物的关键部分(参见
Chackerian等人(2007)J Immunol.179(4):2551-2555)。
2496)。IL1RAP是通过IL-33传递信号的IL-33R(ST2)受体复合物的关键部分(参见
Chackerian等人(2007)J Immunol.179(4):2551-2555)。
[0016] IL1RAP作为用于肿瘤性病症的生物标记物
[0017] 肿瘤生物标记物是内源性蛋白质或代谢产物，其量或修饰指示肿瘤状态、进展特征和对疗法的应答。它们存在于肿瘤组织或体液中，并且涵盖广泛多样的分子，包括转录因子、细胞表面受体和分泌蛋白质。有效的肿瘤标记物是非常需要的，因为它们具有通过促进在早期阶段的癌症诊断并通过帮助个体化治疗而降低癌症死亡率的潜力。在过去十年期
间，对癌发生和肿瘤进展的改善理解已揭示了大量潜在的肿瘤标记物。预测通过应用当前
技术例如组织微阵列、抗体阵列和质谱法，在不久的将来将发现甚至更多的肿瘤标记物。
间，对癌发生和肿瘤进展的改善理解已揭示了大量潜在的肿瘤标记物。预测通过应用当前
技术例如组织微阵列、抗体阵列和质谱法，在不久的将来将发现甚至更多的肿瘤标记物。
[0018] 白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)先前已被鉴定为与血液学肿瘤性病症例如慢性髓样白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)相关的细胞表
面生物标记物(例如，参见给予Cantargia AB的WO 2011/021014， 等人，2010,Proc
Natl Acad Sci USA 107(37):16280-5，Askmyr等人，2013,Blood.121(18):3709-13和
Barreyro等人，2012,Blood 120(6):1290-8，其公开内容以引用的方式并入本文)。最近以来，IL1RAP作为实体瘤例如黑素瘤的诊断和治疗生物标记物的有用性也已被揭示(参见给
予Cantargia AB的WO 2012/098407，其公开内容以引用的方式并入本文)。
面生物标记物(例如，参见给予Cantargia AB的WO 2011/021014， 等人，2010,Proc
Natl Acad Sci USA 107(37):16280-5，Askmyr等人，2013,Blood.121(18):3709-13和
Barreyro等人，2012,Blood 120(6):1290-8，其公开内容以引用的方式并入本文)。最近以来，IL1RAP作为实体瘤例如黑素瘤的诊断和治疗生物标记物的有用性也已被揭示(参见给
予Cantargia AB的WO 2012/098407，其公开内容以引用的方式并入本文)。
发明内容
[0019] 本发明人已开发了具有改善性质的新的抗IL1RAP抗体，使得它们适合于诊断和治疗与IL1RAP生物标记物相关和/或响应IL-1信号传导、IL-33信号传导和/或IL-36信号传导
抑制的疾病和状况。
抑制的疾病和状况。
[0021] “白细胞介素-1受体辅助蛋白”、“IL1RAP”和“IL1-RAP”具体包括人IL1RAP蛋白，例如如GenBank登录号AAB84059、NCBI参考序列：NP_002173.1和UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NPH3-1中所述(还参见Huang等人，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94(24),12829-
12832，其公开内容以引用的方式并入本文)。IL1RAP在科学文献中也称为IL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP和EG3556。
12832，其公开内容以引用的方式并入本文)。IL1RAP在科学文献中也称为IL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP和EG3556。
[0022] 根据UniProtKB/Swiss-Prot的登录号Q9NPH3中使用的编号，IL1RAP的“结构域3”包括由IL1RAP的氨基酸235至369定义的结构区(还参见Wang等人，2010,Nature
Immunology,11:905-912，其公开内容以引用的方式并入本文)。例如，抗体或抗原结合片段与之结合的表位可位于IL1RAP的氨基酸235至239、240至249、250至259、260至269、270至
279、280至289、290至299、300至309、310至319、320至329、330至229、240至349、350至359内或氨基酸360至369之间。
Immunology,11:905-912，其公开内容以引用的方式并入本文)。例如，抗体或抗原结合片段与之结合的表位可位于IL1RAP的氨基酸235至239、240至249、250至259、260至269、270至
279、280至289、290至299、300至309、310至319、320至329、330至229、240至349、350至359内或氨基酸360至369之间。
[0023] 因此，本发明的抗体多肽对IL1RAP具有特异性。“特异性”意指抗体多肽能够在体内即在IL1RAP存在于人体内的生理条件下结合IL1RAP。优选地，抗体多肽在体内不与任何其他蛋白质结合。可通过本领域众所周知的方法，例如ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质印迹和使用表达IL1RAP的转染细胞的流式细胞术来测定这种结合特异性。有利地，抗
体多肽能够选择性结合IL1RAP，即与任何其他蛋白质相比较，它至少10倍强地结合IL1RAP。
体多肽能够选择性结合IL1RAP，即与任何其他蛋白质相比较，它至少10倍强地结合IL1RAP。
[0024] “抗体或其抗原结合片段”包括基本上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。合适的抗原结合片段和衍生物包括Fv片段(例如单链Fv和二硫键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)、单可变结构域(例如VH和VL结构域)和结构域抗体(dAb，包括单和双形式[即dAb-接头-dAb])。使用抗体片段而不是完整抗体的潜在优点是几倍。片段的较小尺寸可导致改善的药理性质，
例如更好地渗透固体组织。此外，抗原结合片段例如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可在大肠杆菌中表达且由大肠杆菌分泌，因此允许容易地产生大量的所述片段。
例如更好地渗透固体组织。此外，抗原结合片段例如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可在大肠杆菌中表达且由大肠杆菌分泌，因此允许容易地产生大量的所述片段。
[0025] 因此，在一个实施例中，本发明的抗体多肽包含完整抗体(例如IgG1抗体)或由完整抗体(例如IgG1抗体)组成。
[0026] 在一个替代实施例中，本发明的抗体多肽包含选自下述的抗原结合片段或由选自下述的抗原结合片段组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片
段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单VH可变结构域或VL可变结构域)。
段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单VH可变结构域或VL可变结构域)。
[0027] 短语“抗体或其抗原结合片段”还预期涵盖抗体模拟物(例如，具有高度稳定性仍允许在某些位置处引入可变性的非抗体支架结构)。如在Gebauer&Skerra,2009,Curr Opin Chem Biol 13(3):245-255(其公开内容以引用的方式并入本文)中所讨论的，生物化学领
域的技术人员将熟悉许多这样的分子。示例性抗体模拟物包括：亲和体(也称为三连接素；
Nygren,2008,FEBS J,275,2668-2676)；CTLD(也称为四连接素；Innovations
Pharmac.Technol.(2006),27-30)；连接素(也称为单抗体；Meth.Mol.Biol.,352(2007),
95-109)；抗转运蛋白(anticalin)(Drug Discovery Today(2005),10,23-33)；DARPin(锚
蛋白；Nat.Biotechnol.(2004),22,575-582)；高亲和性多聚体(Nat.Biotechnol.(2005),
23,1556-1561)；微体(FEBS J,(2007),274,86-95)；肽适体(Expert.Opin.Biol.Ther.
(2005),5,783-797)；Kunitz结构域(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318,803-809)；
affilin(Trends.Biotechnol.(2005),23,514-522)；affimer(Avacta Life Sciences,
Wetherby,UK)。
域的技术人员将熟悉许多这样的分子。示例性抗体模拟物包括：亲和体(也称为三连接素；
Nygren,2008,FEBS J,275,2668-2676)；CTLD(也称为四连接素；Innovations
Pharmac.Technol.(2006),27-30)；连接素(也称为单抗体；Meth.Mol.Biol.,352(2007),
95-109)；抗转运蛋白(anticalin)(Drug Discovery Today(2005),10,23-33)；DARPin(锚
蛋白；Nat.Biotechnol.(2004),22,575-582)；高亲和性多聚体(Nat.Biotechnol.(2005),
23,1556-1561)；微体(FEBS J,(2007),274,86-95)；肽适体(Expert.Opin.Biol.Ther.
(2005),5,783-797)；Kunitz结构域(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318,803-809)；
affilin(Trends.Biotechnol.(2005),23,514-522)；affimer(Avacta Life Sciences,
Wetherby,UK)。
[0028] 还包括在本发明范围内的是嵌合T细胞受体(也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和嵌合抗原受体或CAR)(参见Pule等人，2003,Cytotherapy 5(3):211-26，其公开内容以引用的方式并入本文)。这些是经改造的受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常，CAR用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；其中通过逆转录病毒载体促进其编码
序列的转移。这种分子的最常见形式是包含与CD3-ζ跨膜结构域和胞内域融合的来源于单
克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物。当T细胞表达这种融合分子时，它们识别并杀死表达转移的单克隆抗体特异性的靶细胞。
序列的转移。这种分子的最常见形式是包含与CD3-ζ跨膜结构域和胞内域融合的来源于单
克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物。当T细胞表达这种融合分子时，它们识别并杀死表达转移的单克隆抗体特异性的靶细胞。
[0030] 生成抗体和抗体片段的方法是本领域众所周知的。例如，可经由几种方法中的任何一种来生成抗体，所述方法采用诱导抗体分子的体内生产、筛选免疫球蛋白文库
(Orlandi等人，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837；Winter等人，1991,
Nature 349:293-299，其公开内容以引用的方式并入本文)或通过培养中的细胞系生成单
克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术(Kohler等人，1975.Nature 256:4950497；Kozbor等人，1985.J.Immunol.Methods 81:
31-42；Cote等人，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030；Cole等人，
1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120，其公开内容以引用的方式并入本文)。
(Orlandi等人，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837；Winter等人，1991,
Nature 349:293-299，其公开内容以引用的方式并入本文)或通过培养中的细胞系生成单
克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术(Kohler等人，1975.Nature 256:4950497；Kozbor等人，1985.J.Immunol.Methods 81:
31-42；Cote等人，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030；Cole等人，
1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0031] 用于生产单克隆抗体的合适方法也公开于“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press，1988，其公开内容以引用的方式并入本文)和
“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell
(CRC Press，1982，其公开内容以引用的方式并入本文)中。
“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell
(CRC Press，1982，其公开内容以引用的方式并入本文)中。
[0032] 同样，可使用本领域众所周知的方法获得抗体片段(参见例如Harlow&Lane,1988,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,New York，其公开内容以引用的方式并入本文)。例如，根据本发明的抗体片段可通过抗体的蛋白酶解水解或通过在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白质
表达系统)中表达编码片段的DNA进行制备。可替代地，可通过常规方法通过完整抗体的胃
蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。
表达系统)中表达编码片段的DNA进行制备。可替代地，可通过常规方法通过完整抗体的胃
蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。
[0034] (a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区：
[0035] Q V Q L Q Q S G T E L M K P G A S V K I S C K A T G Y T V S S Y W I D W V K Q T P G H G L E W I G E I L P G S A I N N Y N E K F K G K A T F T A D T
S S N T A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q G
T T L T V S S
S S N T A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q G
T T L T V S S
[0036] [SEQ ID NO:1]
[0037] 和
[0038] (b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区：
[0039] D V L M T Q T P L S L P V S L G D Q A S I S C R S S Q S I V H S N G N T Y L E W Y L Q K P G Q S P K L L I Y K V S N R F S G V P D R F S G S G S G T
D F T L K I S R V E A E D L G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K L E I K R
D F T L K I S R V E A E D L G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K L E I K R
[0040] [SEQ ID NO:2]
[0041] 如本文使用的，术语“氨基酸”包括标准的二十种遗传编码的氨基酸及其相应的以“D”形式的立体异构体(与天然的‘L’形式相比较)、ω-氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸(参见下文)。
[0042] 当氨基酸被具体列举时，例如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，该术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确说明。其他非常规氨基酸也可为用于本发明多肽的合适组分，只要所需的功能特性由多肽保留。对于所示的肽，在适当时，每个编码的氨基酸残基由单字母指定表示，对应于常规氨基酸的俗名。
[0043] 在一个实施例中，如本文定义的抗体多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
[0044] 本领域技术人员了解包含上述可变区的任何完整的IgG抗体均可用作参考抗体，以鉴定竞争性抑制CAN01与IL1RAP结合的本发明的抗体多肽。
[0045] 因此，在一个实施例中，用作测定竞争性结合的参考的CAN01抗体是完整的IgG抗体，其包括：
[0046] (a)包含移植到鼠IgG1或IgG2a恒定区上的SEQ ID NO:1的可变结构域的重链；和
[0047] (b)包含移植到鼠κ恒定区上的SEQ ID NO:2的可变结构域的轻链。
[0048] 可替代地，参考抗体可以是嵌合的完整IgG抗体，其包括：
[0049] (a)包含移植到人IgG1恒定区(例如SEQ ID NO:30；由pFUSEss-CHIg-hG1载体InvivoGen,San Diego,USA编码)上的SEQ ID NO:1的可变结构域的重链；和
[0050] (b)包含移植到人κ恒定区(例如SEQ ID NO:29；由pFUSE2ss-CLIg-hk载体InvivoGen,San Diego,USA编码)上的SEQ ID NO:2的可变结构域的轻链。
[0051] 用于测定给定测试抗体是否能够抑制参考抗体与抗原的结合的合适方法是本领域众所周知的。例如，为了测试所测试抗体是否能够抑制CAN01参考抗体与细胞表面抗原的结合，表达抗原的细胞可与测试抗体一起预温育20分钟，随后将细胞洗涤并与缀合至荧光
团的参考CAN01抗体一起温育，所述参考CAN01抗体可通过流式细胞术进行检测。如果与测
试抗体的预温育减少了流式细胞术中参考CAN01抗体的检测，则测试抗体抑制参考抗体与
细胞表面抗原的结合。
团的参考CAN01抗体一起温育，所述参考CAN01抗体可通过流式细胞术进行检测。如果与测
试抗体的预温育减少了流式细胞术中参考CAN01抗体的检测，则测试抗体抑制参考抗体与
细胞表面抗原的结合。
[0052] 这种竞争性结合抑制也可使用具有固定化IL1RAP的BIAcore芯片并与参考抗体(例如‘CAN01’)连同和不连同待测试的抗体多肽一起温育进行确定。可替代地，可使用成对作图方法，其中参考抗体固定至BIAcore芯片的表面，IL1RAP抗原结合固定的抗体，并且随后测试第二抗体的同时IL1RAP结合能力(参见‘BIAcore Assay Handbook’,GE Healthcare Life Sciences,29-0194-00 AA 05/2012；其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0053] 在一个进一步的替代方案中，可使用流式细胞术测定竞争性结合抑制。例如，为了测试所测试抗体是否能够抑制参考抗体与细胞表面抗原的结合，表达抗原的细胞可与测试抗体一起预温育20分钟，随后将细胞洗涤并与缀合至荧光团的参考抗体一起温育，所述参
考抗体可通过流式细胞术进行检测。如果与测试抗体的预温育减少了流式细胞术中参考抗
体的检测，则测试抗体抑制参考抗体与细胞表面抗原的结合。如果待测试的抗体显示出对
于IL1RAP的高亲和力，则可使用减少的预温育期(或甚至根本不预温育)。
考抗体可通过流式细胞术进行检测。如果与测试抗体的预温育减少了流式细胞术中参考抗
体的检测，则测试抗体抑制参考抗体与细胞表面抗原的结合。如果待测试的抗体显示出对
于IL1RAP的高亲和力，则可使用减少的预温育期(或甚至根本不预温育)。
[0054] 在一个进一步的替代方案中，可使用ELISA(例如，如实例N中所述)测定竞争性结合抑制。
[0055] 竞争性结合通常出现是因为测试抗体在参考抗体(在这种情况下，CAN01)与之结合的抗原上的表位处或至少非常接近所述表位而结合。然而，本领域技术人员将了解由于
空间干扰也可出现竞争性结合；因此，测试抗体可在与参考抗体与之结合的表位不同的表
位处结合，但仍可具有足够的大小或构型以阻碍参考抗体与抗原的结合。
空间干扰也可出现竞争性结合；因此，测试抗体可在与参考抗体与之结合的表位不同的表
位处结合，但仍可具有足够的大小或构型以阻碍参考抗体与抗原的结合。
[0056] 本发明的抗体和抗原结合片段在广泛筛选大量抗IL1RAP抗体后基于显示出的性质进行鉴定，所述性质使得其特别适合作为癌症的诊断和治疗剂。
[0057] 因此，在一个实施例中，抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的一种或多种：
[0058] (a)对于人IL1RAP 2nM或更大的结合亲和力(KD)，即KD≤2nM(例如，如使用实例A中的Biacore方法测定的)；
[0059] (b)与来自食蟹猕猴(Macaca fascicularis)的IL1RAP的交叉反应性(例如，如实例D中测定的)；
[0060] (c)对IL-1信号传导的抑制作用(例如，如实例E、L和M中测定的)；
[0061] (d)在一种或多种癌细胞系(例如CML、AML、ALL和/或黑素瘤细胞系、和/或下文鉴定的其他癌症类型中的一种或多种的细胞系模型)中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(ADCC)的能力(例如，如实例F和G中测定的)；和/或
(ADCC)的能力(例如，如实例F和G中测定的)；和/或
[0062] (e)在结合一种或多种癌细胞系(例如CML、AML、ALL和/或黑素瘤细胞系、和/或下文鉴定的其他癌症类型中的一种或多种的细胞系模型)后内在化的能力(例如，如实例H中
测定的)。
测定的)。
[0063] 有利地，抗体或抗原结合片段显示出上述性质中的全部。
[0064] 在一个实施例中，抗体或抗原结合片段还显示出对IL-33信号传导和/或IL-36信号传导的抑制作用(例如，如下文实例L和M中测定的)。
[0065] 任选地，抗体或抗原结合片段不显示出对IL-1信号传导、IL-33信号传导和IL-36信号传导中的一种或多种的抑制作用(例如，如实例E、L和M中测定的)。例如，抗体可以是CAN01，其缺乏对IL-1信号传导或IL-33信号传导的任何明显的抑制作用(参见下文的实例L
和M)。
和M)。
[0066] 在一个替代实施例中，抗体或抗原结合片段显示出上述性质(a)、(b)、(c)和(e)中的一种或多种，但不能诱导ADCC。
[0067] 在一个实施例中，抗体或抗原结合片段能够结合IL1RAP的细胞外结构域上的表位，所述表位与IL1RAP上参考抗体CAN01能够与之结合的表位至少部分重叠。因此，抗体或抗原结合片段可能能够结合位于IL1RAP的结构域3处/内的表位，所述结构域3即氨基酸235
至367(参见上文)。
至367(参见上文)。
[0068] 在一个优选实施例中，根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的重链可变区：
[0069] a)G Y T V S S Y[SEQ ID NO:3]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0070] b)L P G S A I[SEQ ID NO:4]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0071] c)G D Y F D S T F V Y Y[SEQ ID NO:5]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0072] 因此，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO 3、4和5的CDR的重链可变区。
[0073] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有CAN01参考抗体的相应区域的氨基酸序列，即SEQ ID NO:1的重链可变区。
[0074] 然而，应了解可容忍CDR序列内的低水平的突变(通常仅一个或两个氨基酸)，而不丧失抗体或抗原结合片段对于IL1RAP的特异性。
[0075] 同一性百分比可通过例如LEAIGN程序(Huang和Miller,Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357，其公开内容以引用的方式并入本文)在Expasy设施站点(http://
www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)进行测定，使用总体比对选项、评分矩
阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4作为参数。可替代地，可使用合适的计算机程序，例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序来测定两个多
肽之间的序列同一性百分比，并且应了解相对于其序列已进行最佳比对的多肽计算同一性
百分比。
www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)进行测定，使用总体比对选项、评分矩
阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4作为参数。可替代地，可使用合适的计算机程序，例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序来测定两个多
肽之间的序列同一性百分比，并且应了解相对于其序列已进行最佳比对的多肽计算同一性
百分比。
[0076] 可替代地可使用Clustal W程序(如Thompson等人，1994,Nucl.Acid Res.22:4673-4680中所述，所述参考文献以引用的方式并入本文)进行比对。所使用的参数可以如
下：
下：
[0077] -快速成对比对参数：K元组(字)大小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，顶部对角线数；5.评分方法：x百分比。
[0078] -多重比对参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。
[0079] -评分矩阵：BLOSUM。
[0080] 可替代地，BESTFIT程序可用于测定局部序列比对。
[0081] 在一个进一步优选的实施例中，根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的重链可变区：
[0082] a)G Y T V S S Y W I D[SEQ ID NO:6]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0083] b)E I L P G S A I N N Y N E K F K G[SEQ ID NO:7]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0084] c)G D Y F D S T F V Y Y[SEQ ID NO:5]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0085] 例如，抗体多肽可包含含有SEQ ID NO 6、7和5的CDR的重链可变区。
[0086] 如上所述，CAN01参考抗体是鼠抗体。然而，该抗体的组分重链和轻链可以是人源化的，以便产生更适合用于人的抗体多肽，例如由于其降低的免疫原性。例如，SEQ ID NO
3、4和5的CDR(或SEQ ID NO 6、7和5的CDR)可移植到人可变区构架内。
3、4和5的CDR(或SEQ ID NO 6、7和5的CDR)可移植到人可变区构架内。
[0087] 本领域技术人员应了解对于人治疗或诊断，优选使用人或人源化抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是遗传改造的嵌合抗体或具有优选来源于非人抗体的最小部分的抗
体片段。人源化抗体包括其中人抗体(受体抗体)的互补决定区替换为具有所需功能性的来
自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的互补决定区的残基的抗体。在一些情况下，人抗体的Fv构架残基替换为相应的非人残基。人源化抗体还可包含在受体抗体和引入的互
补决定区或构架序列中均未发现的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，且通常为两个可变结构域中的基本上全部，其中互补决定区的全部或基本上全部对应于非人抗体的
那些，并且构架区的全部或基本上全部对应于相关人共有序列的那些。人源化抗体最佳地
还包括通常来源于人抗体的抗体恒定区(例如Fc区)的至少一部分(参见例如Jones等人，
1986.Nature 321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-329；Presta,1992,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596，其公开内容以引用的方式并入本文)。
体片段。人源化抗体包括其中人抗体(受体抗体)的互补决定区替换为具有所需功能性的来
自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的互补决定区的残基的抗体。在一些情况下，人抗体的Fv构架残基替换为相应的非人残基。人源化抗体还可包含在受体抗体和引入的互
补决定区或构架序列中均未发现的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，且通常为两个可变结构域中的基本上全部，其中互补决定区的全部或基本上全部对应于非人抗体的
那些，并且构架区的全部或基本上全部对应于相关人共有序列的那些。人源化抗体最佳地
还包括通常来源于人抗体的抗体恒定区(例如Fc区)的至少一部分(参见例如Jones等人，
1986.Nature 321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-329；Presta,1992,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0088] 用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。一般地，人源化抗体具有从非人源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基(通常称为引入残基)通常取
自引入的可变结构域。通过用相应的啮齿动物互补决定区取代人互补决定区，人源化可基
本上如所述的执行(参见例如Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Reichmann等人，
1988.Nature 332:323-327；Verhoeyen等人，1988,Science 239:1534-1536l；US 4,816,
567，其公开内容以引用的方式并入本文)。相应地，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常
可以是人抗体，其中一些互补决定区残基和可能的一些构架残基被来自啮齿类动物抗体中
的类似位点的残基取代。
自引入的可变结构域。通过用相应的啮齿动物互补决定区取代人互补决定区，人源化可基
本上如所述的执行(参见例如Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Reichmann等人，
1988.Nature 332:323-327；Verhoeyen等人，1988,Science 239:1534-1536l；US 4,816,
567，其公开内容以引用的方式并入本文)。相应地，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常
可以是人抗体，其中一些互补决定区残基和可能的一些构架残基被来自啮齿类动物抗体中
的类似位点的残基取代。
[0089] 还可使用本领域已知的不同技术鉴定人抗体，包括噬菌体展示文库(参见例如Hoogenboom&Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581；
Cole等人，1985,In:Monoclonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77；
Boerner等人，1991.J.Immunol.147:86-95，其公开内容以引用的方式并入本文)。
Cole等人，1985,In:Monoclonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77；
Boerner等人，1991.J.Immunol.147:86-95，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0090] 因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，例如它可包含具有SEQ ID NO:8至10中任一个的下述氨基酸序列之一或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序
列的重链可变区：
列的重链可变区：
[0091] a)E V Q L V Q S G A E V K K P G A T V K I S C K A S G Y T V S S Y W I D W V R Q A P G Q G L E W M G E I L P G S A I N N Y A E K F Q G R V T F T A D
T S T D T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
T S T D T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
[0092] [SEQ ID NO:8]；
[0093] b)Q V Q L V Q S G A E V K K P G A T V K I S C K A S G Y T V S S Y W I D W V R Q A P G Q G L E W M G E I L P G S A I T N Y A E K F Q G R V T F T A D
T S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
T S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
[0094] [SEQ ID NO:9]；或
[0095] c)Q V Q L V Q S G A E V K K P G A T V K I S C K A D G Y T V S S Y W I D W V R Q A P G Q G L E W M G E I L P G S A I T N Y A E K F Q G R V T F T A D
T S T S T A Y M E L S S L R S E D T A T Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
T S T S T A Y M E L S S L R S E D T A T Y Y C A S G D Y F D S T F V Y Y W G Q
G T T V T V S S
[0096] [SEQ ID NO:10]。
[0097] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列的重链可变区。
[0098] 在一个相关的优选实施例中，抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的轻链可变区：
[0099] a)R S S Q S I V H S N G N T Y L E[SEQ ID NO:11]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0100] b)K V S N R F S[SEQ ID NO:12]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0101] c)F Q G S H V P R T[SEQ ID NO:13]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0102] 因此，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO 11、12和13的CDR的轻链可变区。
[0103] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有鼠CAN01参考抗体的相应区域的氨基酸序列，即SEQ ID NO:2的轻链可变区。
[0104] 如在上文详述的重链可变区的情况下，应了解本发明的抗体多肽的轻链可变区可以是人源化的，以便产生更适合用于人的试剂。例如，SEQ ID NO 11、12和13的CDR可移植到人可变区构架内。
[0105] 因此，抗体或其抗原结合片段可包含含有下述或由下述组成的轻链可变区：SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：
[0106] a)D I V M T Q S P L S L P V T P G E P A S I S C R S S Q S I V H S N G N T Y L E W Y L Q K P G Q S P Q L L I Y K V S N R F S G V P D R F S G S G S G
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
[0107] [SEQ ID NO:14]；
[0108] b)D I V M T Q S P L S L P V T P G Q P A S I S C R S S Q S I T H S N G N T Y L E W Y L Q K P G Q S P Q L L I Y K V S N R D S G V P D R F S G S G S G
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
[0109] [SEQ ID NO:15]；
[0110] c)D I V M T Q S P L S L P V T P G E P A S I S C R S S Q S I T H S N G Q T Y L E W Y L Q K P G Q S P Q L L I Y K V S N R A S G V P D R F S G S G S G
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
[0111] [SEQ ID NO:16]；
[0112] d)D I V M T Q S P L S L P V T P G E P A S I S C R S S Q S I T H S S G N T Y L E W Y L Q K P G Q S P Q L L I Y K V S N R A S G V P D R F S G S G S G
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
[0113] [SEQ ID NO:17]；或
[0114] e)D I V M T Q S P L S L P V T P G Q P A S I S C R S S Q S I T H S S G Q T Y L E W Y L Q K P G Q S P Q L L I Y K V S N R D S G V P D R F S G S G S G
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C F Q G S H V P R T F G G G T K V E I K
R
[0115] [SEQ ID NO:18]。
[0116] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有SEQ ID NO：14至18中任一个的氨基酸序列的轻链可变区。
[0117] 在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含鼠重链可变区和鼠轻链可变区，所述鼠重链可变区包含SEQ ID NO:1中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1中任一个的氨
基酸序列组成，所述鼠轻链可变区包含SEQ ID NO:2中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID
NO:2中任一个的氨基酸序列组成。
基酸序列组成，所述鼠轻链可变区包含SEQ ID NO:2中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID
NO:2中任一个的氨基酸序列组成。
[0118] 可替代地，抗体或其抗原结合片段可包含人源化重链可变区和人源化轻链可变区，所述人源化重链可变区包含SEQ ID NO:8至10中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8
至10中任一个的氨基酸序列组成，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO:14至18中任一个
的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列组成。
至10中任一个的氨基酸序列组成，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO:14至18中任一个
的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14至18中任一个的氨基酸序列组成。
[0119] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含：
[0120] a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0121] b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0122] c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链
可变区；
可变区；
[0123] b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0124] d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0125] e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链
可变区；
可变区；
[0126] c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0127] f)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0128] g)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链
可变区；
可变区；
[0129] d)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0130] h)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0131] i)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的轻链
可变区；
可变区；
[0132] e)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链可
变区；
变区；
[0133] j)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链可
变区；或
变区；或
[0134] k)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链
可变区。
可变区。
[0135] 在一个可替代实施例中，本发明的抗体多肽通过参考指定为‘CAN03’的鼠衍生的抗体的可变区来定义，所述‘CAN03’包含：
[0136] (a)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区：
[0137] D V K L V E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S I Y T M S W V R Q T P E K R L E W V A T I S I G G S Y I N Y P D S V K G R F T I S R D N
A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A I Y Y C S R E V D G S Y A M D Y W G Q G T
S V T V S S
A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A I Y Y C S R E V D G S Y A M D Y W G Q G T
S V T V S S
[0138] [SEQ ID NO:19]
[0139] 和
[0140] (b)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区：
[0141] D I L L T Q S P A I L S V S P G E R V S F S C R A S Q S I G T S I H W Y Q R R T N G S P R L L I K S A S E S I S G I P S R F S G S G S G T D F T L S
I N S V E S E D I A D Y Y C Q Q S N S W P T T F G A G T K L E L K R
I N S V E S E D I A D Y Y C Q Q S N S W P T T F G A G T K L E L K R
[0142] [SEQ ID NO:20]
[0143] 本领域技术人员了解包含上述可变区的任何完整的IgG抗体均可用作参考抗体，以鉴定竞争性抑制CAN03与IL1RAP结合的本发明的抗体多肽(如上文关于使用CAN01作为参
考抗体描述的)。
考抗体描述的)。
[0144] 因此，在一个实施例中，用作测定竞争性结合的参考的CAN03抗体是完整的IgG抗体，其包括：
[0145] (a)包含移植到鼠IgG1或IgG2a恒定区上的SEQ ID NO:19的可变结构域的重链；和
[0146] (b)包含移植到鼠κ恒定区上的SEQ ID NO:20的可变结构域的轻链。
[0147] 可替代地，参考抗体可以是嵌合的完整IgG抗体，其包括：
[0148] (a)包含移植到人IgG1恒定区(例如SEQ ID NO:30；由pFUSEss-CHIg-hG1载体InvivoGen,San Diego,USA编码)上的SEQ ID NO:19的可变结构域的重链；和
[0149] (b)包含移植到人κ恒定区(例如SEQ ID NO:29；由pFUSE2ss-CLIg-hk载体InvivoGen,San Diego,USA编码)上的SEQ ID NO:20的可变结构域的轻链。
[0150] 用于测定给定测试抗体是否能够抑制参考抗体与抗原的结合的合适方法是本领域众所周知的(参见上文)。
[0151] 在一个实施例中，竞争性抑制CAN03结合IL1RAP的抗体或抗原结合片段显示出下述性质中的一种或多种：
[0152] (a)对于人IL1RAP 500pM或更大的结合亲和力(KD)，即KD≤500pM(例如，如使用实例A中的Biacore方法测定的)；
[0153] (b)与来自食蟹猕猴的IL1RAP的交叉反应性(例如，如实例D中测定的)；
[0154] (c)对IL-1信号传导的抑制作用(例如，如实例E中测定的)；
[0155] (d)在一种或多种癌细胞系(例如CML、AML、ALL和/或黑素瘤细胞系、和/或下文鉴定的其他癌症类型中的一种或多种的细胞系模型)中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(ADCC)的能力(例如，如实例F和G中测定的)；和/或
(ADCC)的能力(例如，如实例F和G中测定的)；和/或
[0156] (e)在结合一种或多种癌细胞系(例如CML、AML、ALL和/或黑素瘤细胞系、和/或下文鉴定的其他癌症类型中的一种或多种的细胞系模型)后内在化的能力(例如，如实例H中
测定的)。
测定的)。
[0157] 有利地，抗体或抗原结合片段显示出上述性质中的全部。
[0158] 在一个实施例中，抗体或抗原结合片段还显示出对IL-33信号传导和/或IL-36信号传导的抑制作用(例如，如下文实例L和M中测定的)。
[0159] 在一个实施例中，抗体或抗原结合片段能够结合IL1RAP的细胞外结构域上的表位，所述表位与IL1RAP上参考抗体CAN03能够与之结合的表位至少部分重叠。因此，抗体或抗原结合片段可能能够结合位于IL1RAP的结构域3处/内的表位，所述结构域3即氨基酸235
至367(参见上文)。
至367(参见上文)。
[0160] 在一个优选实施例中，根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的重链可变区：
[0161] a)G F T F S I Y[SEQ ID NO:21]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0162] b)S I G G S Y[SEQ ID NO:22]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0163] c)E V D G S Y A M D Y[SEQ ID NO:23]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0164] 因此，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO 21、22和23的CDR的重链可变区。
[0165] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有CAN01参考抗体的相应区域的氨基酸序列，即SEQ ID NO:19的重链可变区。
[0166] 然而，应了解可容忍CDR序列内的低水平的突变(通常仅一个或两个氨基酸)，而不丧失抗体或抗原结合片段对于IL1RAP的特异性。
[0167] 在一个进一步的优选实施例中，根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的重链可变区：
[0168] a)G F T F S I Y T M S[SEQ ID NO:24]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0169] b)T I S I G G S Y I N Y P D S V K G[SEQ ID NO:25]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0170] c)E V D G S Y A M D Y[SEQ ID NO:23]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0171] 例如，抗体多肽可包含含有SEQ ID NO 24、25和23的CDR的重链可变区。
[0172] 如上所述，CAN03参考抗体是鼠抗体。然而，该抗体的组分重链和轻链可以是人源化的，以便产生更适合用于人的抗体多肽，例如由于其降低的免疫原性。例如，SEQ ID NO
21、22和23的CDR(或SEQ ID NO 24、25和23的CDR)可移植到人可变区构架内。
21、22和23的CDR(或SEQ ID NO 24、25和23的CDR)可移植到人可变区构架内。
[0173] 在一个相关的优选实施例中，抗体或其抗原结合片段包含含有下述CDR的轻链可变区：
[0174] a)R A S Q S I G T S I H[SEQ ID NO:26]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；
[0175] b)S A S E S I S[SEQ ID NO:27]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列；和
[0176] c)Q Q S N S W P T T[SEQ ID NO:28]，或与其具有至少60％序列同一性，例如至少70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列。
[0177] 因此，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO 26、27和28的CDR的轻链可变区。
[0178] 例如，抗体或其抗原结合片段可包含具有鼠CAN01参考抗体的相应区域的氨基酸序列，即SEQ ID NO:20的轻链可变区。
[0179] 如在上文详述的重链可变区的情况下，应了解本发明的抗体多肽的轻链可变区可以是人源化的，以便产生更适合用于人的试剂。例如，SEQ ID NO 26、27和28的CDR可移植到人可变区构架内。
[0180] 在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含鼠重链可变区和鼠轻链可变区，所述鼠重链可变区包含SEQ ID NO:19中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:19中任一个的
氨基酸序列组成，所述鼠轻链可变区包含SEQ ID NO:20中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20中任一个的氨基酸序列组成。
氨基酸序列组成，所述鼠轻链可变区包含SEQ ID NO:20中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20中任一个的氨基酸序列组成。
[0181] 可替代地，抗体或其抗原结合片段可包含人源化重链可变区和人源化轻链可变区，所述人源化重链可变区包含SEQ ID NO:21至23中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:
21至23中任一个的氨基酸序列组成，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO:26至28中任一
个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26至28中任一个的氨基酸序列组成。
21至23中任一个的氨基酸序列组成，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO:26至28中任一
个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26至28中任一个的氨基酸序列组成。
[0182] 本领域技术人员应了解本发明的上文定义的抗体或抗原结合片段还可包含重链恒定区或其部分。
[0183] 在一个实施例中，抗体多肽包含IgG重链(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链)的CH1、CH2和/或CH3区。因此，抗体多肽可包含来自IgG1重链的恒定区的部分或全部。例如，抗体多肽可以是包含CH1和CL恒定区的Fab片段，分别与上文定义的重链可变区和轻链可变区
中的任何组合。
中的任何组合。
[0184] 同样地，本发明的上文定义的抗体或抗原结合片段还可包含轻链恒定区或其部分。例如，抗体多肽可包含来自κ或λ轻链的CL区。
[0185] 例如，抗体多肽可包含下述恒定区：
[0186] (a)Igκ链C区(智人(Homo sapiens))(UnitProt登录号P01834)
[0187] TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC [SEQ ID NO:29]
[0188] (b)Igγ-1链C区(智人)(UniProt登录号P01857)
[0189] ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP
ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO:
30]
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP
ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO:
30]
[0190] 在一个替代实施例中，可利用上述恒定区的天然存在的变体(例如参见Jefferis&Lefranc,2009,MAbs 1(4):332-8，其公开内容以引用的方式并入本文)。例如，轻链恒定区可包含具有W40R和/或V83L突变的SEQ ID NO:29，或由具有W40R和/或V83L突变的SEQ ID
NO:29组成，和/或重链恒定区可包含具有K97R、D239E和/或L241M突变的SEQ ID NO:30，或由具有K97R、D239E和/或L241M突变的SEQ ID NO:30组成，或不含C端赖氨酸/K(其中氨基酸突变的位置使用与SEQ ID NO:29和30中的编号不同的Eu编号方案来定义；参见Edelman等
人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63:78-85，其公开内容以引用的方式并入本文)。
NO:29组成，和/或重链恒定区可包含具有K97R、D239E和/或L241M突变的SEQ ID NO:30，或由具有K97R、D239E和/或L241M突变的SEQ ID NO:30组成，或不含C端赖氨酸/K(其中氨基酸突变的位置使用与SEQ ID NO:29和30中的编号不同的Eu编号方案来定义；参见Edelman等
人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63:78-85，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0191] 因此，本发明的示例性抗体多肽包括：
[0192] CAN01及其人源化形式：
[0193] (a)包含SEQ ID NO:1(或其人源化形式，例如SEQ ID NO:8、9或10)的可变区连同SEQ ID NO:30的恒定区的重链；和
[0194] (b)包含SEQ ID NO:2(或其人源化形式，例如SEQ ID NO:14、15、16、17或18)的可变区连同SEQ ID NO:29的恒定区的轻链。
[0195] CAN03及其人源化形式：
[0196] (a)包含SEQ ID NO:19(或其人源化形式)的可变区连同SEQ ID NO:30的恒定区的重链；和
[0197] (b)包含SEQ ID NO:20(或其人源化形式)的可变区连同SEQ ID NO:29的恒定区的轻链。
[0198] 在一个相关实施例中，抗体多肽可包含抗体Fc区(例如IgG重链的CH2和CH3区)。本领域技术人员应了解Fc部分可来自IgG抗体，或来自不同类别的抗体(例如IgM、IgA、IgD或IgE)。在一个实施例中，Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
[0200] 如本领域充分证明的，抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应子功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
[0201] 改造治疗性单克隆抗体或Fc融合蛋白的Fc区允许生成更适合于其所需药理学活性的分子(Strohl,2009,Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91，其公开内容以引用的方式
并入本文)。
并入本文)。
[0202] (a)用于增加半衰期的经改造的Fc区
[0204] IgG的半衰期取决于其对新生儿受体FcRn的pH依赖性结合。在内皮细胞的表面上表达的FcRn以pH依赖性方式结合IgG，并使其免于降解。
[0205] 在pH 6.0而不是pH 7.4下选择性结合FcRn的一些抗体在各种动物模型中显示出较高的半衰期。
[0206] 位于CH2和CH3结构域之间的界面处的几个突变，例如T250Q/M428L(Hinton等人，2004,J Biol Chem.279(8):6213-6，其公开内容以引用的方式并入本文)和M252Y/S254T/
T256E+H433K/N434F(Vaccaro等人，2005,Nat.Biotechnol.23(10):1283-8，其公开内容以
引用的方式并入本文)，已显示增加与FcRn的结合亲和力和IgG1的体内半衰期。
T256E+H433K/N434F(Vaccaro等人，2005,Nat.Biotechnol.23(10):1283-8，其公开内容以
引用的方式并入本文)，已显示增加与FcRn的结合亲和力和IgG1的体内半衰期。
[0207] (b)用于改变效应子功能的经改造的Fc区
[0208] 根据治疗性抗体或Fc融合蛋白的应用，可能需要减少或增加效应子功能(例如ADCC)。
[0209] 对于靶向细胞表面分子(尤其是免疫细胞上的那些)的抗体，对于某些临床适应症可能需要消除效应子功能。
[0210] 相反，对于预期用于肿瘤学用途的抗体(例如在白血病和实体瘤的治疗中；参见下文)，增加效应子功能可改善治疗活性。
[0211] 四种人IgG同种型以不同的亲和力结合活化性Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)，抑制性FcγRIIb受体和补体的第一成分(C1q)，获得非常不同的效应子功能
(Bruhns等人，2009,Blood.113(16):3716-25，其公开内容以引用的方式并入本文)。
(Bruhns等人，2009,Blood.113(16):3716-25，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0212] IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对于FcγR和C1q结合是关键的，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。将在位置
233-236处的IgG2残基以及在位置327、330和331处的IgG4残基取代到人IgG1中显示极大降
低ADCC和CDC(Armor等人，1999,Eur J Immunol.29(8):2613-24；Shields等人，2001,J
Biol Chem.276(9):6591-604，其公开内容以引用的方式并入本文)。此外，Idusogie等人证明在不同位置包括K322处的丙氨酸取代显著减少补体活化(Idusogie等人，2000,J
Immunol.164(8):4178-84，其公开内容以引用的方式并入本文)。类似地，鼠IgG2A的CH2结构域中的突变显示减少与FcγRI和C1q的结合(Steurer.等人，1995.J Immunol.155(3):
1165-74，其公开内容以引用的方式并入本文)。
233-236处的IgG2残基以及在位置327、330和331处的IgG4残基取代到人IgG1中显示极大降
低ADCC和CDC(Armor等人，1999,Eur J Immunol.29(8):2613-24；Shields等人，2001,J
Biol Chem.276(9):6591-604，其公开内容以引用的方式并入本文)。此外，Idusogie等人证明在不同位置包括K322处的丙氨酸取代显著减少补体活化(Idusogie等人，2000,J
Immunol.164(8):4178-84，其公开内容以引用的方式并入本文)。类似地，鼠IgG2A的CH2结构域中的突变显示减少与FcγRI和C1q的结合(Steurer.等人，1995.J Immunol.155(3):
1165-74，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0213] 众多突变已在人IgG1的CH2结构域中得到制备，并且在体外测试其对ADCC和CDC的作用(参见上面引用的参考文献)。值得注意的是，在位置333处的丙氨酸取代据报道增加
ADCC和CDC两者(Shields等人，2001，同上；Steurer等人，1995，同上)。Lazar等人描述了对FcγRIIIa具有更高亲和力和对FcγRIIb具有更低亲和力的三重突变体(S239D/I332E/
A330L)，导致增强的ADCC(Lazar等人，2006,PNAS 103(11):4005-4010，其公开内容以引用的方式并入本文)。相同的突变用于生成具有增加的ADCC的抗体(Ryan等人，2007,
Mol.Cancer Ther.6:3009-3018，其公开内容以引用的方式并入本文)。Richards等人研究
了具有改善的FcγRIIIa亲和力和FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突变体
(S239D/I332E/G236A)，所述突变体介导通过巨噬细胞增强的靶细胞的吞噬作用(Richards
等人，2008.Mol Cancer Ther.7(8):2517-27，其公开内容以引用的方式并入本文)。
ADCC和CDC两者(Shields等人，2001，同上；Steurer等人，1995，同上)。Lazar等人描述了对FcγRIIIa具有更高亲和力和对FcγRIIb具有更低亲和力的三重突变体(S239D/I332E/
A330L)，导致增强的ADCC(Lazar等人，2006,PNAS 103(11):4005-4010，其公开内容以引用的方式并入本文)。相同的突变用于生成具有增加的ADCC的抗体(Ryan等人，2007,
Mol.Cancer Ther.6:3009-3018，其公开内容以引用的方式并入本文)。Richards等人研究
了具有改善的FcγRIIIa亲和力和FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突变体
(S239D/I332E/G236A)，所述突变体介导通过巨噬细胞增强的靶细胞的吞噬作用(Richards
等人，2008.Mol Cancer Ther.7(8):2517-27，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0214] 由于其缺乏效应子功能，IgG4抗体代表用于受体阻断而无细胞耗尽(即抑制IL-1信号传导)的优选IgG亚类。IgG4分子可在称为Fab臂交换的动态过程中交换半分子。这种现象也可在治疗性抗体和内源性IgG4之间在体内发生。
[0215] S228P突变已显示防止这种重组过程，允许设计较不可预测的治疗性IgG4抗体(Labrijn等人，2009,Nat Biotechnol.27(8):767-71，其公开内容以引用的方式并入本
文)。
文)。
[0216] 经改造的Fc区的例子显示在下表1中。
[0217] 表1
[0218] 经改造的Fc的例子
[0219]
[0220]
[0221] *Fc氨基酸突变的位置使用与上述SEQ ID NO:18和19中的编号不同的Eu编号方案来定义；参见Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63:78-85)
[0222] 表1的参考文献
[0223] 1.Hinton等人2004 J.Biol.Chem.279(8):6213-6)
[0224] 2.Vaccaro等人2005 Nat Biotechnol.23(10):1283-8)
[0225] 3.Zalevsky等人2010 Nat.Biotechnology 28(2):157-159
[0226] 4.Armour KL.等人，1999.Eur J Immunol.29(8):2613-24
[0227] 5.Shields RL.等人，2001.J Biol Chem.276(9):6591-604
[0228] 6.Masuda等人2007,Mol Immunol.44(12):3122-31
[0229] 7.Bushfield等人2014,Leukemia 28(11):2213-21
[0230] 8.Okazaki等人2004,J Mol Biol.；336(5):1239-49
[0231] 9.Idusogie等人，2000.J Immunol.164(8):4178-84
[0232] 10.Datta-Mannan A.等人，2007.Drug Metab.Dispos.35:86-94
[0233] 11.Steurer W.等人，1995.J Immunol.155(3):1165-74
[0234] 12.Richards等人2008 Mol Cancer There.7(8):2517-27
[0235] 13.US 7,960,512 B2
[0236] 14.EP 2 213 683
[0237] 15.Labrijn AF.等人，2009.Nat Biotechnol.27(8):767-71
[0238] 在一个进一步的实施例中，Fc区的效应子功能可通过其中CH2结构域内的碳水化合物部分的修饰而改变。
[0239] 例如，已知在Fc区中缺少岩藻糖残基或岩藻糖残基很少的治疗性抗体可在人中显示出增强的ADCC活性(例如，参见Peipp等人，2008,Blood 112(6):2390-9,Yamane-Ohnuki&Satoh,2009,MAbs 1(3):230-26,Iida等人，2009,BMC Cancer 9；58(其公开内容以引用的
方式并入本文)。低岩藻糖抗体多肽可通过在含有甘露糖苷酶抑制剂例如kinfunensine的
培养基中培养的细胞中表达而产生(参见下面的实例I)。
方式并入本文)。低岩藻糖抗体多肽可通过在含有甘露糖苷酶抑制剂例如kinfunensine的
培养基中培养的细胞中表达而产生(参见下面的实例I)。
[0240] 将抗体的糖基化修饰成低岩藻糖形式的其他方法包括在不能代谢鼠李糖的细胞中使用细菌酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(例如使用ProBioGen AG,Berlin，德国
的 技术)。
的 技术)。
[0241] 产生低岩藻糖抗体的另一种方法是通过抑制或耗尽在抗体生产细胞中的α-(1,6)-岩藻糖基转移酶(例如使用Lonza Ltd,Basel瑞士的 CHOK1SV技术)。
[0242] 如上文注明的，除任何Fc介导的效应子功能之外或在不存在任何Fc介导的效应子功能的情况下，本发明的抗体多肽可对IL-1信号传导发挥抑制作用(参见实例E、L和M)。
[0243] 在一个实施例中，本发明的抗体多肽可对IL-1超家族内的一种或多种另外的(或可替代的)细胞因子(包括但不限于IL-33和/或IL-36)发挥抑制作用。
[0244] 白细胞介素-33(IL-33)诱导辅助T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞产生2型细胞因子。这种细胞因子先前称为NF-HEV‘在高内皮微静脉(HEV)中的核因子
(NF)’，因为它最初在这些特化的细胞中被鉴定。IL-33通过与受体ST2(也称为IL1RL1)和
IL-1受体辅助蛋白(IL1RAP)相互作用来介导其生物效应，激活NF-κB和MAP激酶信号传导途径中的细胞内分子，所述细胞内分子驱动来自极化Th2细胞的2型细胞因子(例如IL-5和IL-
13)产生。认为在体内通过IL-33诱导2型细胞因子诱导在IL-33施用后在粘膜器官中观察到
的严重病理变化。
(NF)’，因为它最初在这些特化的细胞中被鉴定。IL-33通过与受体ST2(也称为IL1RL1)和
IL-1受体辅助蛋白(IL1RAP)相互作用来介导其生物效应，激活NF-κB和MAP激酶信号传导途径中的细胞内分子，所述细胞内分子驱动来自极化Th2细胞的2型细胞因子(例如IL-5和IL-
13)产生。认为在体内通过IL-33诱导2型细胞因子诱导在IL-33施用后在粘膜器官中观察到
的严重病理变化。
[0245] 白细胞介素-36(IL-36)是占优势地经由IL-36受体作用于幼稚CD4+T细胞的细胞因子。已知它激活NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶在皮肤病理学中起作用。还已发现它激活T细胞增殖和IL-2的释放。
[0246] 本领域技术人员应了解本发明的抗体多肽可完全或部分抑制IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导。例如，相对于不存在本发明的多肽的情况下的信号传导，信号传导可被抑制至少10％、20％、30％、50％、75％或更多。
[0247] 通过本发明的多肽的IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导的抑制程度可使用本领域众所周知的方法进行测定。
[0248] 例如，可如下文实例E、L和M中所述测量IL-1信号传导的抑制。
[0249] 同样，可如实例E、L和M中所述测量IL-33信号传导的抑制。
[0250] 可通过本领域已知的方法测量IL-36信号传导的抑制。例如，滑膜成纤维细胞的IL-36刺激导致NF-κB和MAP激酶活化。可替代地，IL-36-α、-β和-γ增加响应抗CD3/抗CD28刺激的T细胞增殖(参见Vigne等人，2012,Blood 120(17):3478-87，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0251] 在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段还可包含用于增加抗体或抗原结合片段的体内半衰期的部分，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖酐。这样的进一步部分可使用本领域众所周知的方法与结合部分缀合或以其他方式
组合。
组合。
[0252] 本领域技术人员将了解本发明的抗体多肽可包含已被修饰或衍生的一个或多个氨基酸或者由已被修饰或衍生的一个或多个氨基酸组成。
[0253] 一个或多个氨基酸的化学衍生物可通过与官能侧基反应来实现。这样的衍生化分子包括例如其中游离氨基已衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、羧基苯甲酰氧基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可衍生以形成盐、甲酯和乙酯或者其他类型的酯和酰肼。游离羟基可衍生以形成O-酰基或O-烷基衍生物。作为化学衍生物还包括的是
含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟脯氨酸可取代脯
氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸，并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要必需的
活性得到维持。其他包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)和类似的末端修饰。
含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟脯氨酸可取代脯
氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸，并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要必需的
活性得到维持。其他包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)和类似的末端修饰。
[0254] 本领域技术人员还了解拟肽化合物也可以是有用的。术语‘拟肽’指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和所需特征的化合物。
[0255] 例如，所述多肽不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括其中肽键逆转的分子。这样的逆反拟肽可使用本领域已知的方法进行制备，所述方法例如
在Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的那些，所述参考文献以引用的方
式并入本文。这种方法涉及制备含有涉及主链的改变而不是侧链的取向的假肽。含有NH-CO键代替CO-NH肽键的逆反肽对蛋白酶解抗性多得多。可替代地，所述多肽可以是拟肽化合
物，其中氨基酸残基中的一个或多个通过-y(CH2NH)-键代替常规的酰胺键进行连接。
在Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的那些，所述参考文献以引用的方
式并入本文。这种方法涉及制备含有涉及主链的改变而不是侧链的取向的假肽。含有NH-CO键代替CO-NH肽键的逆反肽对蛋白酶解抗性多得多。可替代地，所述多肽可以是拟肽化合
物，其中氨基酸残基中的一个或多个通过-y(CH2NH)-键代替常规的酰胺键进行连接。
[0257] 还将了解所述多肽可方便地在其N-或C-末端处被封闭，以便帮助降低对外切蛋白酶解消化的敏感性。
[0258] 各种未编码或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸也已用于修饰哺乳动物肽。另外，假定的生物活性构象可通过共价修饰例如环化或通过掺入内酰胺或其他类型的
桥得到稳定，例如参见Veber等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636和Thursell等
人，1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166，所述参考文献以引用的方式并入本文。
桥得到稳定，例如参见Veber等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636和Thursell等
人，1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166，所述参考文献以引用的方式并入本文。
[0259] 本发明的抗体多肽可用功能部分增强以促进其预期用途，例如作为诊断(例如体内成像)试剂或治疗剂。因此，在一个实施例中，抗体多肽直接或间接连接到治疗部分。
[0261] 可使用任何合适的治疗部分。合适的治疗部分是能够降低或抑制癌细胞(或相关干细胞或祖细胞)生长或特别是杀死癌细胞(或相关干细胞或祖细胞)的治疗部分。例如，治疗剂可以是细胞毒性部分。细胞毒性部分可包含一种或多种放射性同位素或者由一种或多
种放射性同位素组成。例如，一种或多种放射性同位素可各自独立地选自β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体和低光子能量发射体。可能期望一种或多种放射性同位素各自独立地具有在试剂的附近产生高吸收剂量的局部吸收能量的发射模式。示例性的放射
性同位素可包括长程β发射体，例如90Y、32P、186Re/188Re；166Ho、76As/77As、89Sr、153Sm；中程β发射体，例如131I、177Lu、67Cu、161Tb、105Rh；低能β发射体，例如45Ca或35S；转换或俄歇发射体，例如51Cr、67Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、125I、201Tl；以及α发射体，例如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、
212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。其他放射性核素是可用的，并且可能用于治疗。
种放射性同位素组成。例如，一种或多种放射性同位素可各自独立地选自β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体和低光子能量发射体。可能期望一种或多种放射性同位素各自独立地具有在试剂的附近产生高吸收剂量的局部吸收能量的发射模式。示例性的放射
性同位素可包括长程β发射体，例如90Y、32P、186Re/188Re；166Ho、76As/77As、89Sr、153Sm；中程β发射体，例如131I、177Lu、67Cu、161Tb、105Rh；低能β发射体，例如45Ca或35S；转换或俄歇发射体，例如51Cr、67Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、125I、201Tl；以及α发射体，例如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、
212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。其他放射性核素是可用的，并且可能用于治疗。
[0262] 在一个优选的实施例中，抗体多肽与放射性同位素177Lu连接(或以其他方式用其标记)。
[0263] 可替代地，治疗性部分可包含一种或多种治疗(例如细胞毒性)药物或者由一种或多种治疗(例如细胞毒性)药物组成，例如细胞抑制药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生
物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼加成物(addend)；细胞因子；毒胡萝卜素内酯及其代谢产物；毒素(例如皂草素或加利车霉素)；化学治疗剂(例如抗代谢药)；或可用于治疗癌症的任何其他治疗性或细胞毒性药物。
物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼加成物(addend)；细胞因子；毒胡萝卜素内酯及其代谢产物；毒素(例如皂草素或加利车霉素)；化学治疗剂(例如抗代谢药)；或可用于治疗癌症的任何其他治疗性或细胞毒性药物。
[0264] 示例性的治疗性/细胞毒性药物可例如包括：
[0265] ·细胞抑制剂，特别是具有剂量限制性副作用的那些，包括但不限于环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、busulphane、洛莫司汀、紫杉烷、磷酸雌莫司汀和其他氮芥、抗生素(包括多柔比星、加利车霉素和埃斯波霉素)、长春花生物碱、azaridine、含铂化合物、内皮抑素、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、酶、取代的脲、甲肼衍生物、柔红霉素、两性胺，
[0266] ·抗雄激素，例如氟他胺和比卡鲁胺及其代谢产物；
[0267] ·可的松及其衍生物；
[0268] ·膦酸盐，例如二磷酸盐和buphosphonate；
[0269] ·睾酮-5-α-还原酶抑制剂；
[0270] ·硼加成物；
[0271] ·细胞因子；
[0272] ·毒胡萝卜素内酯及其代谢产物；
[0273] ·细菌毒素或这些的经改造的变体；
[0274] ·免疫调节剂。
[0275] 可替代地，细胞毒性部分可包含适用于激活疗法的一种或多种部分或者由适用于激活疗法的一种或多种部分组成，所述激活疗法例如光子激活疗法、中子激活疗法、中子诱导的俄歇电子疗法、同步辐射疗法或低能量X射线光子激活疗法。
[0276] 例如，对于本发明的抗体多肽，存在使用同步辐射(或低能量X射线)来推进放射疗法的潜力，主要集中于所谓的光激活放射疗法(PAT)，其中通过与预施用的高Z肿瘤靶向剂
的相互作用，在癌组织中增强来自外部X射线照射的局部能量沉积。
的相互作用，在癌组织中增强来自外部X射线照射的局部能量沉积。
[0277] PAT治疗模式利用来自同步加速器源的单色X射线，例如由在Grenoble的欧洲同步加速器辐射设施(European Synchrotron Radiation Facility)(ESRF)处的ID17生物医学
束线提供的，并且如预期的在未来的其他设施处可用，例如新的瑞典同步加速器设施，Max-IV。
束线提供的，并且如预期的在未来的其他设施处可用，例如新的瑞典同步加速器设施，Max-IV。
[0278] 关于即将在Lund的欧洲散裂中子源(European Spallation Source)(ESS)进行的“诱导俄歇电子肿瘤疗法”的研究提供了进一步的潜在治疗模式。反应堆产生的热和半热中子长期以来一直用于硼中子捕获疗法，BNCT，用于临床前实验以及用给予高局部吸收能量
的诱导的α-粒子和反冲核(7L)治疗脑肿瘤两者。类似的方法是使用中子和由具有关于中子的高横截面的稳定核标记的合适的肿瘤靶向分子。抗体或肽可例如用稳定的钆(157Gd)标记并且充当被Gd-核捕获的中子的靶分子，所谓的钆中子捕获疗法(GdNCT)。通过Monte Carlo技术，当它起因于γ光子、中子、核反冲以及特征性x射线、来自钆或其他可能元素的内部转换和俄歇电子时，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布。
的诱导的α-粒子和反冲核(7L)治疗脑肿瘤两者。类似的方法是使用中子和由具有关于中子的高横截面的稳定核标记的合适的肿瘤靶向分子。抗体或肽可例如用稳定的钆(157Gd)标记并且充当被Gd-核捕获的中子的靶分子，所谓的钆中子捕获疗法(GdNCT)。通过Monte Carlo技术，当它起因于γ光子、中子、核反冲以及特征性x射线、来自钆或其他可能元素的内部转换和俄歇电子时，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布。
[0279] 任选地，本发明的抗体多肽还可包含可检测部分。例如，可检测部分可包含放射性同位素或由放射性同位素组成，例如选自99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl的放射性同位素。任选地，试剂可包含一对可检测和细胞毒性的放射性核素，例如86Y/90Y或124I/211At。可替代地，抗体多肽可包含能够同时作为可检测部分以及作为细胞毒性部分以多模态方式起作用以提供所谓的“多模态治疗”的放射性同位素。结合部分因此可与纳米颗粒偶联，所述纳米颗粒具有多重成像(例如，SPECT、PET、MRI、光学或超声)的能力，连同使用细胞毒性药物例如放射性核素或化学治疗剂的治疗能力一起。
[0280] 可替代地，可检测部分可包含顺磁同位素或由顺磁同位素组成，所述顺磁同位素例如选自157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe的顺磁同位素。
[0281] 在抗体多肽包含可检测部分的情况下，可检测部分可通过成像技术例如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像检测。
[0282] 治疗和/或可检测部分(例如放射性同位素、细胞毒性部分等等)可直接或间接连接至抗体或其片段。合适的接头是本领域已知的，包括例如辅基、非酚接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯的衍生物；十二硼酸盐(dodecaborate))、大环化合物和无环螯合剂两者的螯
合部分，例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,
7-三乙酸(NOTA)的衍生物、以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍
生物、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄
基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)的衍生物、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-
4,7,10-三(乙酸)(DO3A)的衍生物和其他螯合部分。
合部分，例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,
7-三乙酸(NOTA)的衍生物、以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍
生物、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄
基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)的衍生物、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-
4,7,10-三(乙酸)(DO3A)的衍生物和其他螯合部分。
[0283] 一个优选的接头是DTPA，例如如在177Lu-DTPA-[本发明的抗体多肽]中使用的。进一步优选的接头是去铁胺，DFO，例如如在89Zr-DFO-[本发明的抗体多肽]中使用的。
[0284] 如上所述，用于产生本发明的抗体多肽的方法是本领域众所周知的。
[0285] 方便地，抗体多肽是重组多肽或包含重组多肽。用于生产此类重组多肽的合适方法是本领域众所周知的，例如在原核或真核宿主细胞中表达(例如，参见Green&Sambrook,
2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第四版，Cold Spring Harbor,New
York，文件的相关公开内容以引用的方式在此并入)。
2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第四版，Cold Spring Harbor,New
York，文件的相关公开内容以引用的方式在此并入)。
[0286] 本发明的抗体多肽还可使用商购可得的体外翻译系统，例如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽裂解物(可得自Promega)产生。优选地，翻译系统是兔网织红细胞裂解物。方便地，翻译系统可偶联到转录系统，例如TNT转录-翻译系统(Promega)。该系统具有在与翻译相同的反应中由编码DNA多核苷酸产生合适的mRNA转录物的优点。
[0287] 本领域技术人员应了解本发明的抗体多肽可替代地可例如使用众所周知的液相或固相合成技术(例如t-Boc或Fmoc固相肽合成)人工合成。
[0288] 本发明的第二个方面提供了编码本发明第一个方面的抗体或抗原结合片段或其组分多肽链的分离的核酸分子。“核酸分子”包括可以是单链或双链的DNA(例如基因组DNA或互补DNA)和mRNA分子。“分离的”指核酸分子不位于细胞中或以其他方式提供在细胞内。
[0289] 在一个实施例中，核酸分子是cDNA分子。
[0290] 本领域技术人员应了解核酸分子可以是密码子最佳化的，用于在特定宿主细胞中表达抗体多肽，例如，用于在人细胞中表达(例如，参见Angov,2011,Biotechnol.J.6(6):
650-659，其公开内容以引用的方式并入本文)。
650-659，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0291] 在本发明的范围内还包括的是下述：
[0292] (a)本发明的第三个方面提供了包含根据本发明第二个方面的核酸分子的载体(例如表达载体)；
[0293] (b)本发明的第四个方面提供了包含根据本发明第二个方面的核酸分子或根据本发明第三个方面的载体的宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞或中国仓鼠卵巢细胞，例如CHOK1SV细胞)；和
[0294] (c)本发明的第五个方面提供了制备根据本发明第一个方面的抗体多肽的方法，其包括在其中表达所述多肽的条件下培养根据本发明第四个方面的宿主细胞群，以及从其
中分离多肽。
中分离多肽。
[0295] 本发明的第六个方面提供了药物组合物，其包含药学有效量的根据本发明第一个方面的抗体或抗原结合片段和药学可接受的稀释剂、载体、佐剂或赋形剂。
[0296] 本领域技术人员应了解在药物组合物中还可包括另外的化合物，包括螯合剂，例如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。
[0297] 药物组合物可以本领域已知的方式进行制备，所述药物组合物具有足够的贮存稳定性并且适合于施用于人和动物。例如，药物组合物可例如通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却或通过使用由超临界颗粒形成的颗粒形成而冻干。
[0298] “药学可接受的”意指不减少本发明的抗体多肽的IL1RAP结合活性的有效性的无毒材料。这种药学可接受的缓冲液、载体或赋形剂是本领域众所周知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R Gennaro，编辑，Mack Publishing Company(1990)和Pharmaceutical Excipients的手册，第3版，A.Kibbe，编辑，Pharmaceutical Press
(2000)，其公开内容以引用的方式并入本文)。
(2000)，其公开内容以引用的方式并入本文)。
[0299] 术语“缓冲剂”意指含有用于稳定pH目的的酸-碱混合物的水性溶液。缓冲剂的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
[0301] 术语“佐剂”意指加入制剂中以增加本发明的抗体多肽的生物效应的任何化合物。佐剂可以是具有不同阴离子的锌盐、铜盐或银盐中的一种或多种，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂还可以是阳离子聚合物，例如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物例如聚(乙烯基咪唑)、以及阳离子多肽例如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸和含有这些氨基酸的肽。
[0302] 赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和环糊精，所述碳水化合物被加入组合物中，例如用于促进冻干。聚合物的例子是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、以及所有不同分子量的聚乙烯吡咯烷酮，所述聚合物被加入组合物中，例如用于粘度控制、用于实现生物粘附、或用于使脂质免于化学和蛋白酶解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、全部具有不同的酰基链长度和饱和度的鞘脂和糖脂、卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，所述脂质由于类似于聚合物的那些原因被加入组合物中。矿物质的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，所述矿物质被加入组合物中以获得益处，例如液体积聚的降低或有利的颜料性质。
[0303] 本发明的抗体多肽可配制成本领域已知适合于其递送的任何类型的药物组合物。
[0304] 在一个实施例中，本发明的药物组合物可采取脂质体的形式，其中除其他药学可接受的的载体之外，抗体多肽与两亲试剂例如脂质组合，所述两亲试剂以聚集形式作为胶
束、不溶性单层和液晶存在。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二
酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。合适的脂质还包括在极性首基中由聚(乙二醇)修饰的上文脂质，用于延长血流循环时间。这种脂质体制剂的制备可在例如US4,235,
871中发现，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
束、不溶性单层和液晶存在。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二
酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。合适的脂质还包括在极性首基中由聚(乙二醇)修饰的上文脂质，用于延长血流循环时间。这种脂质体制剂的制备可在例如US4,235,
871中发现，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
[0305] 本发明的药物组合物也可以是可生物降解的微球体的形式。脂族聚酯例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)和聚酐已广泛
用作微球体生产中的可生物降解的聚合物。这种微球体的制备可在US 5,851,451和EP 0
213 303中找到，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
用作微球体生产中的可生物降解的聚合物。这种微球体的制备可在US 5,851,451和EP 0
213 303中找到，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
[0306] 在一个进一步的实施例中，本发明的药物组合物以聚合物凝胶的形式提供，其中聚合物例如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮用于增稠含有试剂的溶液。聚合物还可包含明胶或胶原。
[0307] 可替代地，抗体多肽可简单地溶解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或不同缓冲液。
[0308] 应了解本发明的药物组合物可包括离子和用于增强活性抗体多肽的作用的限定pH。另外，组合物可经历常规的药物操作，例如灭菌和/或可含有常规佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填料等。
[0309] 根据本发明的药物组合物可经由本领域技术人员已知的任何合适途径施用。因此，可能的施用途径包括肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、局部、眼、鼻、肺、经颊、经口、肠胃外、阴道和直肠。来自植入物的施用也是可能的。
[0310] 在一个优选的实施例中，药物组合物肠胃外例如静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下施用，或它们可通过输注技术施用。它们方便地以无菌水性溶液的形式使用，所述无菌水性溶液可含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使得溶液与血液等渗。需要时，水性溶液应当适当地缓冲(优选3至9的pH)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂通过本领域技术人员众所周知的标准药物技术容易地完成。
[0311] 适合于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小
瓶中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
瓶中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0312] 因此，本发明的药物组合物特别适合于肠胃外例如静脉内施用。
[0313] 可替代地，药物组合物可鼻内或通过吸入施用(例如，以来自加压容器、泵、喷雾器或雾化器的气溶胶喷雾呈现的形式，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀以递送计量的量来测定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有活性多肽的溶液或悬浮液，例如，使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可配制为含有本发明的化
合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0314] 药物组合物将以药学有效剂量施用于患者。如本文使用的，‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗有效的’指对给定状况和施用方案提供疗效的量。这是计算为与所需添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)结合产生所需疗效的预定数量的活性材料。此外，它意指足以减少和最优选预防宿主的活性、功能和应答中的临床显著缺陷的量。可替代地，治疗有效量足以引起宿主中临床显著状况的改善。如本领域技术人员了解的，化合物的量可取决于
其比活性而变。合适的剂量可包含计算为与所需稀释剂结合产生所需疗效的预定数量的活
性组合物。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。治疗有效量可由普通技术医务人员或兽医工作者基于患者特征如年龄、重量、性别、状况、并发症、其他疾病等进行测定，如本领域所众所周知的。药物有效剂量的施用可通过以单个剂量单位或者几个较小剂量单位形式的单次施用进行，并且还可通过以特定间隔的细分剂量的
多次施用进行。可替代地，剂量可作为经过延长时期的连续输注提供。
其比活性而变。合适的剂量可包含计算为与所需稀释剂结合产生所需疗效的预定数量的活
性组合物。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。治疗有效量可由普通技术医务人员或兽医工作者基于患者特征如年龄、重量、性别、状况、并发症、其他疾病等进行测定，如本领域所众所周知的。药物有效剂量的施用可通过以单个剂量单位或者几个较小剂量单位形式的单次施用进行，并且还可通过以特定间隔的细分剂量的
多次施用进行。可替代地，剂量可作为经过延长时期的连续输注提供。
[0315] 在本发明抗体多肽的诊断用途的上下文中，如本文使用的，‘药学有效量’或‘有效量’或‘诊断有效的’指提供用于诊断例如用于体内成像目的的可检测信号的量。
[0316] 抗体多肽可以不同浓度进行配制，取决于被使用的多肽的功效/毒性。例如，制剂可包含浓度为0.1μM至1mM，更优选1μM至500μM、500μM至1mM、300μM至700μM、1μM至100μM、
100μM至200μM、200μM至300μM、300μM至400μM、400μM至500μM、500μM至600μM、600μM至700μM、800μM至900μM或900μM至1mM的活性抗体多肽。通常，制剂包含浓度为300μM至700μM的活性抗体多肽。
100μM至200μM、200μM至300μM、300μM至400μM、400μM至500μM、500μM至600μM、600μM至700μM、800μM至900μM或900μM至1mM的活性抗体多肽。通常，制剂包含浓度为300μM至700μM的活性抗体多肽。
[0317] 通常，人患者中抗体多肽(具有或不具有治疗部分)的治疗剂量将在每次施用100μg至700mg的范围内(基于70kg的体重)。例如，最大限度治疗剂量可在每次施用0.1至10mg/
kg的范围内，例如，0.1至5mg/kg或1至5mg/kg或0.1至2mg/kg。应了解这样的剂量可以不同的间隔施用，如由肿瘤学家/医生确定的；例如，剂量可每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次进行施用。
kg的范围内，例如，0.1至5mg/kg或1至5mg/kg或0.1至2mg/kg。应了解这样的剂量可以不同的间隔施用，如由肿瘤学家/医生确定的；例如，剂量可每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次进行施用。
[0318] 本领域技术人员应了解本发明的药物组合物可单独施用或与用于治疗癌症的其他治疗剂组合施用，例如抗代谢药、烷基化剂、蒽环和其他细胞毒性抗生素、长春花生物碱、依托泊苷、铂化合物、紫杉烷、拓扑异构酶I抑制剂、其他细胞抑制药物、抗增殖性免疫抑制剂、皮质类固醇、性激素和激素拮抗剂、以及其他治疗性抗体(例如曲妥珠单抗)。
[0319] 本发明的第七个方面提供了用于医学的根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段。
[0320] 本发明的相关第八个方面提供了根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段，其用于诱导受试者中与肿瘤性病症相关的病理性细胞或者其干细胞或祖细胞的细胞死
亡和/或抑制所述病理性细胞或者其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中所述细胞表达
IL1RAP。
亡和/或抑制所述病理性细胞或者其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中所述细胞表达
IL1RAP。
[0321] 本发明的进一步的相关第九个方面提供了根据本发明第一个方面的抗体或抗原结合片段，其用于治疗和/或诊断受试者中的肿瘤性病症，其中所述肿瘤性病症与表达
IL1RAP的细胞相关。
IL1RAP的细胞相关。
[0322] ‘治疗’包括对患者的治疗性和预防性治疗两者。术语‘预防性’用于涵盖如本文所述的试剂或其制剂的用途，所述试剂或其制剂预防或降低患者或受试者中肿瘤性病症的可能性或者癌细胞的扩散、传播或转移。术语‘预防性’还涵盖如本文所述的试剂或其制剂预防先前已治疗肿瘤性病症的患者中的肿瘤性病症复发的用途。
[0323] “诊断”包括在体内(即在患者体内)或离体(即在从患者体内取出的组织或细胞样品内)的癌细胞检测。
[0324] “与表达IL1RAP的细胞相关的肿瘤性病症”包括这样的病症，其中直接或间接负责该病症的病理性细胞在细胞表面表达IL1RAP。应了解表达IL1RAP的细胞可以是癌细胞，例如肿瘤细胞本身。另外，这样的细胞包括直接或间接负责个体中肿瘤性病症发展的病理性
干细胞(即癌症干细胞或CSC)和祖细胞。CSC的例子公开于Visvader&Lindeman,2008,Nat
Rev Cancer 8:755-768中，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
干细胞(即癌症干细胞或CSC)和祖细胞。CSC的例子公开于Visvader&Lindeman,2008,Nat
Rev Cancer 8:755-768中，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
[0325] 可替代地或另外，表达IL1RAP的细胞可与肿瘤性病症间接相关，例如，它们可介导肿瘤性细胞存活所需的细胞过程。在这种情况下，本发明的抗体试剂可靶向肿瘤血液供应(血管生成)所必需的细胞、肿瘤基质或抑制针对恶性细胞的有益免疫应答的细胞(例如抑
制性巨噬细胞或T细胞)。
制性巨噬细胞或T细胞)。
[0326] 取决于是否在治疗上需要杀死表达IL1RAP的靶细胞，可使用根据本发明第一个方面的抗体或抗原结合片段，其能够诱导ADCC。例如，当靶细胞IL1RAP是癌细胞(例如CML、
AML、ALL、黑素瘤、肺癌细胞等)时，抗体或抗原结合片段能够诱导ADCC以便消除这样的细胞可以是有利的。然而，应了解使用缺乏ADCC活性的抗体或抗原结合片段也可实现治疗益处，例如通过抑制IL-1(或IL-33)信号传导，导致在肿瘤附近的血管生成减少。
AML、ALL、黑素瘤、肺癌细胞等)时，抗体或抗原结合片段能够诱导ADCC以便消除这样的细胞可以是有利的。然而，应了解使用缺乏ADCC活性的抗体或抗原结合片段也可实现治疗益处，例如通过抑制IL-1(或IL-33)信号传导，导致在肿瘤附近的血管生成减少。
[0327] 在一个实施例中，肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
[0328] 例如，抗体或其抗原结合片段可用于治疗和/或诊断选自下述的肿瘤性病症：慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
[0329] 在一个进一步的实施例中，抗体或其抗原结合片段用于治疗和/或诊断与受试者体内的实体瘤形成相关的肿瘤性病症。
[0330] 因此，抗体或其抗原结合片段可用于治疗选自下述的肿瘤性病症：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
[0331] 关于本发明的治疗和预防方面，本领域技术人员将了解抗体多肽与存在于与肿瘤性病症相关的细胞表面上的IL1RAP的结合可导致IL1RAP的生物活性的调节(即，增加或减
少)。然而，这种调节效应不是必需的；例如，本发明的抗体多肽可简单地通过结合与实体瘤相关的细胞表面上的IL1RAP来引发治疗和预防效应，这依次又可触发免疫系统来诱导细胞
死亡(例如通过ADCC和/或通过在试剂内的细胞毒性/放射性部分的存在)。
少)。然而，这种调节效应不是必需的；例如，本发明的抗体多肽可简单地通过结合与实体瘤相关的细胞表面上的IL1RAP来引发治疗和预防效应，这依次又可触发免疫系统来诱导细胞
死亡(例如通过ADCC和/或通过在试剂内的细胞毒性/放射性部分的存在)。
[0332] “IL1RAP的生物活性”包括涉及与肿瘤性病症相关的细胞上的IL1RAP的任何相互作用或信号传导事件。例如，在一个实施例中，抗体多肽能够阻断一种或多种共受体与
IL1RAP(例如IL1R1、ST2、C-KIT和/或IL1RL2)的结合。
IL1RAP(例如IL1R1、ST2、C-KIT和/或IL1RL2)的结合。
[0333] 本发明的抗体多肽对IL1RAP的生物活性的这种抑制可为整体或部分的。例如，与未暴露于抗体多肽的与肿瘤性病症相关的细胞中IL1RAP的生物活性相比较，试剂可将
IL1RAP的生物活性抑制至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或
90％，最优选100％。在一个优选的实施例中，与未暴露于抗体多肽的肿瘤性病症相关的细胞中IL1RAP的生物活性相比较，抗体多肽能够将IL1RAP的生物活性抑制50％或更多。
IL1RAP的生物活性抑制至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或
90％，最优选100％。在一个优选的实施例中，与未暴露于抗体多肽的肿瘤性病症相关的细胞中IL1RAP的生物活性相比较，抗体多肽能够将IL1RAP的生物活性抑制50％或更多。
[0334] 同样地，应了解与肿瘤性病症相关的细胞的生长和/或增殖的抑制可为整体或部分的。例如，与未暴露于抗体多肽的肿瘤性病症相关的细胞的生长和/或增殖相比较，抗体多肽可将与肿瘤性病症相关的细胞的生长和/或增殖抑制至少10％，优选至少20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％或90％，最优选100％。
40％、50％、60％、70％、80％或90％，最优选100％。
[0335] 本发明的第十个方面提供了根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者中的肿瘤性病症的药物中的用途，其中所述肿瘤性病症与表达IL1RAP
的细胞相关。
的细胞相关。
[0336] 在相关方面，本发明提供了根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断和/或预后受试者中的肿瘤性病症的试剂中的用途，其中所述肿瘤性病症与表
达IL1RAP的细胞相关。因此，本发明提供了用于检测与肿瘤性病症相关的细胞(表达
IL1RAP)的诊断和/或预后试剂。本发明还提供了根据本发明第一个方面的IL1RAP特异性抗
体或其抗原结合片段在制备用于诊断和/或预后受试者中的肿瘤性病症的试剂盒中的用
途。
达IL1RAP的细胞相关。因此，本发明提供了用于检测与肿瘤性病症相关的细胞(表达
IL1RAP)的诊断和/或预后试剂。本发明还提供了根据本发明第一个方面的IL1RAP特异性抗
体或其抗原结合片段在制备用于诊断和/或预后受试者中的肿瘤性病症的试剂盒中的用
途。
[0337] 在一个实施例中，肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
[0338] 例如，抗体或其抗原结合片段可用于治疗和/或诊断选自下述的肿瘤性病症：慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
[0339] 在一个进一步的实施例中，抗体或其抗原结合片段用于治疗和/或诊断与受试者体内的实体瘤形成相关的肿瘤性病症。
[0340] 因此，抗体或其抗原结合片段可用于治疗和/或诊断选自下述的肿瘤性病症：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
[0341] 本发明的第十一个方面提供了用于治疗或诊断受试者中的肿瘤性病症的方法，其包括给受试者施用有效量的根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的步骤，其中
所述肿瘤性病症与表达IL1RAP的细胞相关。
所述肿瘤性病症与表达IL1RAP的细胞相关。
[0342] 在一个实施例中，肿瘤性病症是肿瘤性血液学病症。
[0343] 例如，该方法可用于治疗和/或诊断选自下述的肿瘤性病症：慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
[0344] 在一个进一步的实施例中，该方法用于治疗和/或诊断与受试者体内的实体瘤形成相关的肿瘤性病症。
[0345] 因此，该方法可用于治疗选自下述的肿瘤性病症：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、子宫颈癌、食管癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
[0346] 在一个进一步的实施例中，本发明的抗体多肽和制剂可用于治疗患有疾病或状况或者处于患有疾病或状况的风险中的患者或受试者，所述疾病或状况对用IL-1(或IL-33)
信号传导抑制剂的治疗敏感。
信号传导抑制剂的治疗敏感。
[0347] 因此，本发明的第十二个方面提供了根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗对用IL-1(或IL_33)信号传导抑制剂敏感的疾病或状况。
[0348] 这样的状况或疾病状态是本领域众所周知的(参见Dinarello等人，2012,Nature Reviews 11:633-652和Dinarello,2014,Mol.Med.20(suppl.1):S43-S58)，并且包括但不
限于下述：
限于下述：
[0349] 类风湿性关节炎、所有类型的青少年关节炎包括全身性发作性青少年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性冷自身炎症性综合征(FCAS)、穆韦二氏病、新生儿发作性多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成人斯蒂尔病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、斯威特病、狼疮关节炎、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、哮喘、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、丙型肝炎、局部缺血再灌注损伤、多发性硬化、奈瑟氏菌脑膜炎或肺炎球菌性脑膜炎、肺结核、白塞氏综合征、败血性休克、移植物抗宿主病、哮喘、I型糖尿病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪性肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、中风和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎和痛风。
[0350] 还认为阻断IL-1信号传导在心肌梗塞治疗中是有益的。广泛的临床试验目前正寻求确认在心肌梗死后的IL1B抗体阻断(使用卡那津单抗)的功效(CANTOS踪迹；参见Ridker
等人，2011,Am Heart Journal 162(4):597-605)。
等人，2011,Am Heart Journal 162(4):597-605)。
[0351] 对于这种适应症，应了解使用缺乏ADCC活性的抗体或抗原结合片段，例如通过抑制与免疫细胞相关的IL-1(或IL-33)信号传导，也可实现治疗益处。
[0352] 本发明的第十三个方面提供了根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗对用IL-1(和/或IL-33和/或IL-36)信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或
状况的药物中的用途。
状况的药物中的用途。
[0353] 本发明的第十四个方面提供了用于治疗受试者中对用IL-1(和/或IL-33和/或IL-36)信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或状况的方法，其包括给受试者施用有效量的根据
本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的步骤。
[0354] 本发明的第十五个方面提供了用于ADCC介导的治疗或增强受试者中对用IL-1(和/或IL-33和/或IL-36)信号传导抑制剂的治疗敏感的疾病或状况的方法，其包括给受试
者施用有效量的能够诱导ADCC的根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的步骤。
者施用有效量的能够诱导ADCC的根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的步骤。
[0355] 本发明的第十六个方面提供了用于检测受试者中的癌细胞的体外方法，所述方法包括：
[0356] (a)提供来自待测试的受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)；
[0357] (b)任选地，提取和/或纯化样品中存在的细胞；
[0358] (c)使根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
[0359] (d)测定所述抗体多肽是否结合细胞，
[0360] 其中所述抗体多肽与细胞的结合指示受试者组织中癌细胞的存在。
[0361] 本发明的第十七个方面提供了用于鉴定将受益于用根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者的体外方法，所述方法包括：
[0362] (a)提供来自待测试的患者的癌细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)；
[0363] (b)任选地，提取和/或纯化样品中存在的细胞；
[0364] (c)使根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
[0365] (d)测定所述抗体多肽是否结合细胞，
[0366] 其中所述抗体多肽与癌细胞的结合指示将受益于用根据本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的治疗的患者。
[0367] 本领域技术人员将了解存在许多方式来执行这样的测定。例如，免疫测定可以是同质的，或更优选地是异质的。该测定也可以竞争性形式或更优选地以非竞争性形式执行。
[0368] 在一个实施例中，使用流式细胞术或免疫组织化学测量来自患者的血液样品(白血病)或活组织检查(实体瘤)上的IL1RAP表达，其中表达在阈值以上指示将受益于用根据
本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的治疗的患者。
本发明第一个方面的抗体或其抗原结合片段的治疗的患者。
[0369] 在上述体外方法的优选实施例中，步骤(d)通过流式细胞术或ELISA执行。然而，可使用适合于在体外检测抗体-抗原相互作用的任何测定。
[0370] 本发明的第十八个方面提供了用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括将有效治疗所述癌症的治疗剂施用于使用根据本发明第十六个或第十七个方面的方法鉴定
为患有癌症的受试者。在一个实施例中，示例治疗剂是根据本发明第一个方面的抗体多肽。
为患有癌症的受试者。在一个实施例中，示例治疗剂是根据本发明第一个方面的抗体多肽。
[0371] 在一个实施例中，该方法包括：
[0372] (a)布置来自受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)，所述受试者使用根据本发明第十六个或第十七个方面的方法测试表达在阈值标准以上的IL1RAP的
癌细胞的存在；
癌细胞的存在；
[0373] (b)选择其在步骤(a)中测试的细胞样品含有IL1RAP表达在阈值标准以上的癌细胞的受试者用于治疗；和
[0374] (c)给在步骤(b)中选择的受试者施用有效治疗所述癌症的治疗剂，例如根据本发明第一个方面的抗体多肽。
[0375] 本领域技术人员应了解可使用能够特异性结合下述中任一的探针来鉴定表达IL1RAP的癌细胞：
[0376] (a)IL1RAP多肽(例如根据本发明的抗体或其抗原结合片段)；或
[0377] (b)IL1RAP多核苷酸转录物/mRNA(例如使用在序列中与IL1RAP多核苷酸转录物/mRNA的区域互补的寡核苷酸探针)。
[0378] 用于执行这种测试的方法是本领域众所周知的。
[0379] 在相关实施例中，该方法包括：
[0380] (a)获得来自受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)，
[0381] (b)使用根据本发明第十六个或第十七个方面的方法，就表达在阈值标准以上的IL1RAP的癌细胞的存在测试所述细胞；
[0382] (c)选择其在步骤(b)中测试的细胞样品含有IL1RAP表达在阈值标准以上的癌细胞的受试者用于治疗；和
[0383] (d)给在步骤(c)中选择的受试者施用有效治疗所述癌症的治疗剂，例如根据本发明第一个方面的抗体多肽。
[0384] 任选地，可在第一治疗期之后(例如，一个月后)重复上述实施例的步骤(a)和(b)，以测定IL1RAP表达在阈值标准以上的癌细胞数目已降低。如果观察到不足的降低(例如没有降低)，则在所述癌症治疗中有效的治疗剂的剂量对于随后的治疗周期增加。如果没有检测到具有在阈值标准以上的IL1RAP表达的癌细胞，则可终止治疗。
[0385] 本发明的第十九个方面提供了用于鉴定将受益于用本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者的体外诊断方法，所述方法包括下述步骤：
[0386] (a)使来自待测试的受试者的细胞样品(例如白血干细胞/祖细胞或活检组织)与能够特异性结合IL1RAP多肽或IL1RAP多核苷酸转录物的分子探针体外接触，所述探针与能
够发射光子的部分共价结合；和
够发射光子的部分共价结合；和
[0387] (b)检测由所述部分发射的光子并形成所述样品的图像，
[0388] 其中来自所述部分的光子的局部发射指示所述受试者是将受益于用本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗的癌症患者。
[0389] 除非上下文另有说明，否则本发明的给定方面、特征或参数的偏好和选项应当被视为已与本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有偏好和选项结合得到公开。例
如，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗AML的完整的IgG1抗体，其包含具有SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区。
如，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗AML的完整的IgG1抗体，其包含具有SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区。
[0391] 当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，单词“一个”或“一种”的使用可意指“一个/一种”，但它也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或超过一个/一种或超过一种”的含义一致。
[0392] 当与上文描述和附图结合考虑时，本发明的这些和其他实施例将得到更好了解和理解。然而，应当理解上文描述虽然指示本发明的不同实施例及其许多具体细节，但通过举例说明性而非限制性的方式给出。可在本发明的范围内作出许多取代、修饰、添加和/或重新布置，而不脱离本发明的精神，并且本发明包括所有这样的取代、修饰、添加和/或重新布置。
[0393] 下述附图构成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施例的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，本发明可得
到更好理解。
到更好理解。
附图说明
[0394] 图1.间接ELISA中的示例性抗体CAN01和CAN03与人IL-1RAP的结合。
[0395] 图2.本发明的示例性抗体(CAN01和CAN03)与人CML细胞的结合。该图显示了用浓度为0.1μg/mL的IL1RAP靶向单克隆抗体染色的KU812细胞的MFI值。
[0396] 图3.示例性抗体CAN03阻断IL-1b信号传导的能力。
[0397] 图4.体外ADCC测定显示示例性抗体CAN01和CAN03诱导CML细胞的特异性细胞杀死。(A)通过加入10μg/mL CAN01特异性杀死KU812、LAMA84和BV173细胞。(B)由示例性抗体CAN01和CAN03介导的细胞杀死是剂量依赖性的，如对BV173靶细胞所示。(C)通过1μg/mL
CAN01诱导来自两个CML原始危急患者的原代细胞的细胞杀死。(D)来自携带T315I突变的第
三个CML原始细胞危象患者的细胞对由CAN01介导的ADCC效应敏感。每个实验用来自不同供
体的NK细胞执行至少两次，并且所呈现的数据显示了来自各自的一个代表性实验。
CAN01诱导来自两个CML原始危急患者的原代细胞的细胞杀死。(D)来自携带T315I突变的第
三个CML原始细胞危象患者的细胞对由CAN01介导的ADCC效应敏感。每个实验用来自不同供
体的NK细胞执行至少两次，并且所呈现的数据显示了来自各自的一个代表性实验。
[0398] 图5.体外ADCC测定显示示例性抗体CAN01和CAN03在诱导黑素瘤细胞(SKMEL5细胞系)的特异性细胞杀死中是有效的。在1μg/mL时，CAN01和CAN03已显示高特异性靶细胞杀
死。实验用来自不同供体的NK细胞执行至少两次，并且所呈现的数据显示了一个代表性实
验。
死。实验用来自不同供体的NK细胞执行至少两次，并且所呈现的数据显示了一个代表性实
验。
[0399] 图6.(A)共焦图像(一个光学切片，约0.9μm厚)，显示LAMA细胞与CAN01-AF488缀合的抗体一起在冰上或在37℃下温育2小时，或与CAN01-AF488缀合的抗体一起在37℃下温育16小时。在冰上温育2小时(“冰2小时”)后，可观察到与大多数细胞的细胞膜结合的清楚限定的抗体。在与CAN01-AF488缀合的抗体在37℃下温育2小时后，除膜结合之外，抗体已开始进入细胞(内在化)，并且目前也定位在细胞溶质中。在37℃下温育16小时后，细胞膜结合仍然存在，并且抗体内在化在大多数细胞中已产生CAN01-AF488抗体的积累。比例尺(右图)在所有图像中代表20μm。(B)共焦图像(一个光学切片，约0.9μm厚)，显示LAMA细胞与CAN03-AF488缀合的抗体一起在冰上或在37℃下温育2小时，或与CAN03-AF488缀合的抗体一起在
37℃下温育16小时。在冰上温育2小时(“冰2小时”)后，可观察到与大多数细胞的细胞膜结合的清楚限定的抗体。在与CAN03-AF488缀合的抗体在37℃下温育2小时后，除膜结合之外，抗体已开始进入细胞(内在化)，并且目前也定位在细胞溶质中。在37℃下温育16小时后，细胞膜结合仍然存在，并且抗体内在化在大多数细胞中已产生CAN03-AF488抗体的积累。比例尺(右图)在所有图像中代表20μm。(C)关于CAN03特异性结合和内在化的对照：共焦图像(一个光学切片，约0.9μm厚)显示与AF488缀合的同种型对照抗体一起在冰上或在37℃下温育2小时或者在37℃下温育16小时的LAMA细胞。同种型对照抗体在这些条件的任何下均未显示
特异性结合。注意到与细胞碎片和坏死细胞的轻微结合。比例尺(右图)在所有图像中代表
20μm。
37℃下温育16小时。在冰上温育2小时(“冰2小时”)后，可观察到与大多数细胞的细胞膜结合的清楚限定的抗体。在与CAN03-AF488缀合的抗体在37℃下温育2小时后，除膜结合之外，抗体已开始进入细胞(内在化)，并且目前也定位在细胞溶质中。在37℃下温育16小时后，细胞膜结合仍然存在，并且抗体内在化在大多数细胞中已产生CAN03-AF488抗体的积累。比例尺(右图)在所有图像中代表20μm。(C)关于CAN03特异性结合和内在化的对照：共焦图像(一个光学切片，约0.9μm厚)显示与AF488缀合的同种型对照抗体一起在冰上或在37℃下温育2小时或者在37℃下温育16小时的LAMA细胞。同种型对照抗体在这些条件的任何下均未显示
特异性结合。注意到与细胞碎片和坏死细胞的轻微结合。比例尺(右图)在所有图像中代表
20μm。
[0400] 图7.用CAN01治疗显著减少白血病负荷。(A)在移植后第36天时，与同种型对照相比较，外周血中的白血病细胞的频率在用示例性抗体CAN01处理的小鼠中较低(0.10％相对
于0.69％，p<0.0043)。(B)血小板(PLT)计数对于同种型低于CAN01(p＝0.015)。(C)在第62天时，外周血中的白血病细胞的平均频率在同种型处理的小鼠中为46.5％，但对于CAN01仅为3.8％。(D)在处死时，脾中的白血病细胞的频率用CAN01得到降低(17.2％相对于49.7％；
p＝0.0052)。(E)与同种型对照相比较，骨髓中的白血病细胞的频率在用CAN01处理的小鼠
中较低(5.0％相对于59.5％；p＝0.0001)。
于0.69％，p<0.0043)。(B)血小板(PLT)计数对于同种型低于CAN01(p＝0.015)。(C)在第62天时，外周血中的白血病细胞的平均频率在同种型处理的小鼠中为46.5％，但对于CAN01仅为3.8％。(D)在处死时，脾中的白血病细胞的频率用CAN01得到降低(17.2％相对于49.7％；
p＝0.0052)。(E)与同种型对照相比较，骨髓中的白血病细胞的频率在用CAN01处理的小鼠
中较低(5.0％相对于59.5％；p＝0.0001)。
[0401] 图8.用CAN01处理延长存活并降低白血病负荷。(A)同种型处理的小鼠的中值存活为37天，并且用CAN01处理的小鼠为58天(p<0.0001)。(B)在处死时，用CAN01降低骨髓中的白血病细胞的频率(29.2％相对于55.9％；p＝0.020)。(C)与同种型对照相比较，白血病细胞的平均频率在用CAN01处理的小鼠中较低(31.7％相对于43.1％)。(D)用CAN01处理的小
鼠具有比给予同种型对照的小鼠明显更小的脾(60mg相对于97mg；p＝0.032)。
鼠具有比给予同种型对照的小鼠明显更小的脾(60mg相对于97mg；p＝0.032)。
[0402] 图9.用CAN01处理显著降低用原代人AML细胞移植的小鼠中的白血病负荷。骨髓中的白血病细胞的平均频率在用CAN01处理的小鼠中为0.001％，并且在给予对照抗体的小鼠
中为0.126％。
中为0.126％。
[0403] 图10.CAN01、CAN03和同种型对照对用(A)人IL-1α、(B)人IL-1β和(C)人IL-33刺激的HEK-Blue IL-33/IL 1β细胞的作用。用一式两份样品执行两个实验，并且表示为个别值加上作为三个个别数据点的平均值。
[0404] 图11.CAN01、CAN03和同种型对照对用(A)鼠IL-1α、(B)鼠IL-1β和(C)鼠IL-33刺激的HEK-Blue IL-33/IL1β细胞的作用。用一式两份样品执行两个实验，并且表示为个别值加上作为三个个别数据点的平均值。
具体实施方式
[0405] 实例
[0406] A.本发明的示例性抗体对于IL1RAP蛋白质的结合亲和力
[0407] (i)Biacore研究-鼠来源的抗IL1RAP抗体
[0408] 材料与方法
[0409] 根据捕获试剂盒的技术手册和BIAcore T200(Biacore Life Sciences,GE Healthcare Europe GmbH,Uppsala，瑞典)的标准操作原理，将山羊抗小鼠IgG固定在CM5芯片上。
[0410] 结合分析循环由三个步骤组成：(i)通过固定的抗小鼠抗体捕获芯片表面上的配体；(ii)分析物与捕获的配体的结合；和(iii)结合的分析物的解离。
[0411] 捕获分子表面在每个结合循环后使用制造商推荐的条件再生。
[0412] 所有结合循环均在25℃下运行。
[0413] 在5个启动循环后，在循环开始时以30μl/分钟的流速注射每种抗体(100nM)120秒；随后以30μl/分钟的流速注射分析物(100nM)120秒，随后监测解离相300秒。
[0414] 测试了本发明的两种示例性抗体(CAN01和CAN03)。
[0415] 结果与结论
[0416] 结果显示于下表2中：
[0417] 表2
[0418] Kon、Koff和KD的测量
[0419]
[0420] (ii)ELISA研究-鼠起源的抗IL1RAP抗体
[0421] 材料与方法
[0422] 执行间接ELISA测定。所有样品均一式两份进行分析。Nunc-MaxiSorp 96 Micro WellTM板用在0.01M PBS，pH 7.4中稀释的100ng重组hIL1RAP 21-367(100μl/孔)包被，并在
4℃下温育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS,0.05％Tween 20,pH 7.4)洗涤平板，随后为使用150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween 20,pH 7.4)的封闭步骤。
在室温(RT)下伴随搅动的1小时温育后，使用ELISA洗涤缓冲液再次洗涤板。将样品在ELISA封闭溶液中以三倍连续稀释(范围为1000ng/ml至0.5ng/ml)进行稀释，随后以100μl/孔转
移至ELISA板。将板在RT下伴随搅动温育1小时，并且随后用ELISA洗涤溶液洗涤。加入100μl/孔与碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(DAKO,1:1000)，并在室温下伴随搅动温育1小时。洗涤板，随后加入100μl/孔的底物(4-硝基苯基磷酸酶二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/ml)。其后将板在RT下伴随搅动进行温育，并连续测量在405nm处的吸光度30分钟。在0分钟时的吸光
度视为本底信号。
4℃下温育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS,0.05％Tween 20,pH 7.4)洗涤平板，随后为使用150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween 20,pH 7.4)的封闭步骤。
在室温(RT)下伴随搅动的1小时温育后，使用ELISA洗涤缓冲液再次洗涤板。将样品在ELISA封闭溶液中以三倍连续稀释(范围为1000ng/ml至0.5ng/ml)进行稀释，随后以100μl/孔转
移至ELISA板。将板在RT下伴随搅动温育1小时，并且随后用ELISA洗涤溶液洗涤。加入100μl/孔与碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(DAKO,1:1000)，并在室温下伴随搅动温育1小时。洗涤板，随后加入100μl/孔的底物(4-硝基苯基磷酸酶二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/ml)。其后将板在RT下伴随搅动进行温育，并连续测量在405nm处的吸光度30分钟。在0分钟时的吸光
度视为本底信号。
[0423] 结果与结论
[0424] 结果显示于图1中。
[0425] 发现本发明的示例性抗体CAN01和CAN03两者均具有对于人IL1RAP的高结合信号。
[0426] B.本发明的示例性抗体与IL1RAP表达细胞的结合的流式细胞术研究
[0427] 材料与方法
[0428] 用针对IL1RAP产生的抗体或相关同种型对照染色慢性髓样白血病(CML)细胞系KU812细胞。为了检测，使用第二抗mIg-APC。
[0429] 本发明的两种示例性抗体(CAN01和CAN03)连同五种比较抗IL1RAP抗体(CAN02、CAN05、CAN07、CAN08和CAN09)一起测试。还包括同种型阴性对照抗体。
[0430] 结果与结论
[0431] 表达IL1RAP的KU812白血病细胞的染色揭示与同种型对照和靶向IL1RAP的其他比较抗体相比较，关于CAN01和CAN03的更高的平均荧光强度(MFI)(图2)。
[0432] C.本发明的示例性抗体的表位/结构域作图
[0433] 材料与方法
[0434] 为了理解不同抗体克隆是否在IL1RAP上结合，执行蛋白质的结构分析，揭示受体的细胞外部分可分成三个不同的结构域，下文称为结构域1、2和3(D1、D2、D3)(参见Wang等人，2010,Nature Immunology,11:905-912，其公开内容以引用的方式并入本文)。为了测定关于不同抗体克隆的结构域结合模式，生成一系列受体构建体，并在ELISA测定中测试与这些的结合。
[0435] 执行间接ELISA测定。所有样品均一式两份进行分析。Nunc-MaxiSorp 96 Micro WellTM板用在0.01M PBS，pH 7.4中稀释的100ng Rec hIL1RAP结构域123(aa21-367)(阳性
对照)、Rec hIL1RAP结构域12(aa21-234)、结构域1(aa21-134)或Rec hIL1RAP结构域3
(aa235-367)(100μl/孔)包被，并在4℃下温育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS,
0.05％Tween 20,pH 7.4)洗涤平板，随后为使用150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS,0.5％
BSA,0.05％Tween 20,pH 7.4)的封闭步骤。在室温(RT)下伴随搅动的1小时温育后，使用
ELISA洗涤缓冲液再次洗涤板。将CAN01、CAN03、CAN05、CAN07、CAN08和KMT-1(阳性对照)在ELISA封闭溶液中以三倍连续稀释(范围为1000ng/ml至0.5ng/ml)进行稀释，随后以100μl/孔转移至ELISA板。将板在RT下伴随搅动温育1小时，并且随后用ELISA洗涤溶液洗涤。加入
100μl/孔与碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(DAKO,1:1000)，并在室温下伴随搅动温育1小
时。洗涤板，随后加入100μl/孔的底物(4-硝基苯基磷酸酶二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/ml)。其后将板在RT下伴随搅动进行温育，并连续测量在405nm处的吸光度30分钟。在0分钟时的吸光度视为本底信号。
对照)、Rec hIL1RAP结构域12(aa21-234)、结构域1(aa21-134)或Rec hIL1RAP结构域3
(aa235-367)(100μl/孔)包被，并在4℃下温育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS,
0.05％Tween 20,pH 7.4)洗涤平板，随后为使用150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS,0.5％
BSA,0.05％Tween 20,pH 7.4)的封闭步骤。在室温(RT)下伴随搅动的1小时温育后，使用
ELISA洗涤缓冲液再次洗涤板。将CAN01、CAN03、CAN05、CAN07、CAN08和KMT-1(阳性对照)在ELISA封闭溶液中以三倍连续稀释(范围为1000ng/ml至0.5ng/ml)进行稀释，随后以100μl/孔转移至ELISA板。将板在RT下伴随搅动温育1小时，并且随后用ELISA洗涤溶液洗涤。加入
100μl/孔与碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(DAKO,1:1000)，并在室温下伴随搅动温育1小
时。洗涤板，随后加入100μl/孔的底物(4-硝基苯基磷酸酶二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/ml)。其后将板在RT下伴随搅动进行温育，并连续测量在405nm处的吸光度30分钟。在0分钟时的吸光度视为本底信号。
[0436] 本发明的两种抗体(CAN01和CAN03)连同五种比较抗IL1RAP单克隆抗体(CAN02、CAN05、CAN07、CAN08连同多克隆抗IL1RAP抗体(KMT-1)作为阳性对照)一起测试。
[0437] 结果与结论
[0438] 发现本发明的示例性抗体CAN01和CAN03在IL1RAP的结构域3内结合。
[0439] 结构域作图数据可在下表3中概括。
[0440] 表3
[0441] 示例性抗IL1RAP抗体克隆的表位作图。
[0442]
[0443] nd*＝未测定，因为表位作图数据不能清楚地鉴定这些构建体的特异性结构域，这可能归于结合含有来自超过一个结构域的序列元件的结构表位，例如D2-D3连接。
[0444] D.本发明的示例性抗体的特异性/交叉反应性
[0445] 材料与方法
[0446] 良好前导候选抗体的重要特征是其以相等或接近相等的效力与相关毒理学物种中的同源蛋白质交叉反应。根据一般的管理指南，与一个啮齿类动物和一个非啮齿动物结
合将是优选情况，但对于抗体，这是罕见情况，并且相反，许多实验室努力鉴定除了灵长类动物之外的任何相关的毒理学物种。
合将是优选情况，但对于抗体，这是罕见情况，并且相反，许多实验室努力鉴定除了灵长类动物之外的任何相关的毒理学物种。
[0447] 对于本研究，预期与非人灵长类动物如恒河猴(Macaca mulatta)(猕猴)或食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(猕猴(cynomolgus))的交叉反应性，因为这些物种中的IL1RAP
蛋白与人IL1RAP蛋白共有99％的同源性。
蛋白与人IL1RAP蛋白共有99％的同源性。
[0448] 选择许多潜在的前导抗体，并在ELISA测定中测试其与重组食蟹猕猴IL1RAP(aa21-367)的结合。
[0449] 本发明的两种抗体(CAN01和CAN03)连同六种比较抗IL1RAP单克隆抗体(CAN02、CAN07、CAN08、CAN09、来自R&D的Mab676以及多克隆抗IL1RAP抗体(KMT-1))一起测试。
[0450] 结果与结论
[0451] 令人惊讶的是，发现测试的几种比较抗IL1RAP抗体不与猕猴(cynomolgus)IL1RAP交叉反应，在其中有来自R&D的商业参考抗体mAb676，表4。
[0452] 表4
[0453] 与猕猴IL1RAP的结合
[0454] (以粗体显示的值指示鉴定为与来自食蟹猕猴的IL1RAP交叉反应的克隆)
[0455]
[0456] E.通过本发明的示例性抗体抑制IL-1信号传导
[0457] (i)在HEK-Blue细胞系中的效应
[0458] 材料与方法
[0459] 因为IL1RAP是IL-1受体复合物的功能部分，所以结合IL1RAP的抗体也可抑制IL-1信号传导。因为许多肿瘤细胞类型已显示使用IL-1作为生长因子，所以这可能是介导抗肿
瘤效应的重要的附加机制。
瘤效应的重要的附加机制。
[0460] 为了测试潜在前导候选抗体阻断IL-1信号传导的能力，建立了IL-1依赖性报道基因测定。HEK-Blue细胞(InvivoGen)通过碱性磷酸酶的释放响应IL-1信号传导，所述碱性磷酸酶可通过比色测定法进行定量。为了测试前导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以50
000个细胞/孔铺平板，并在用IL-1β刺激之前与测试抗体一起温育30分钟。随后将细胞在37℃o/n下温育，然后测量释放的碱性磷酸酶的量。还通过在不存在额外刺激的情况下在高浓度抗体(10mg/ml)的存在下温育细胞来测试抗体的潜在激动效应。任何IL-1R激动效应因此
将被记录为碱性磷酸酶的释放。
000个细胞/孔铺平板，并在用IL-1β刺激之前与测试抗体一起温育30分钟。随后将细胞在37℃o/n下温育，然后测量释放的碱性磷酸酶的量。还通过在不存在额外刺激的情况下在高浓度抗体(10mg/ml)的存在下温育细胞来测试抗体的潜在激动效应。任何IL-1R激动效应因此
将被记录为碱性磷酸酶的释放。
[0461] 本发明的一种抗体(CAN03)连同同种型阴性对照抗体一起测试。
[0462] 结果与结论
[0463] 如图3中所示，示例性抗体CAN03诱导IL-1信号传导的显著抑制。测试的候选物显示无激动效应。
[0464] F.本发明的示例性抗体在慢性髓样白血病(CML)细胞系中的ADCC效应
[0465] 材料与方法
[0466] 在体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中，使用慢性髓样白血病(CML)细胞系KU812、LAMA84和BV173或来自三个患有处于原始细胞危象的CML的患者的原代细胞作为靶
细胞。简言之，根据制造商的说明书，用PKH26(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)标记靶细胞，并以5,000-10,000个细胞/孔的密度种植到96孔板内。随后，将本发明的示例性抗体CAN01
或同种型对照抗体以不同浓度加入孔中，并温育30分钟，然后将100,000个NK效应细胞加入每个孔中。在知情同意后，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)，通过使用NK细胞阴性细胞分离试剂盒从健康志愿者中提取NK细胞。在实验中使用非特异性人IgG1抗体作为同种型阴性对照(Eureka Therapeutics,Emeryville,CA)。通过使
用FACS CANTO流式细胞仪(BD)检测7-AAD阳性细胞来评价细胞死亡的程度。每个实验用来
自不同供体的NK细胞执行至少两次。
细胞。简言之，根据制造商的说明书，用PKH26(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)标记靶细胞，并以5,000-10,000个细胞/孔的密度种植到96孔板内。随后，将本发明的示例性抗体CAN01
或同种型对照抗体以不同浓度加入孔中，并温育30分钟，然后将100,000个NK效应细胞加入每个孔中。在知情同意后，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)，通过使用NK细胞阴性细胞分离试剂盒从健康志愿者中提取NK细胞。在实验中使用非特异性人IgG1抗体作为同种型阴性对照(Eureka Therapeutics,Emeryville,CA)。通过使
用FACS CANTO流式细胞仪(BD)检测7-AAD阳性细胞来评价细胞死亡的程度。每个实验用来
自不同供体的NK细胞执行至少两次。
[0467] 结果与结论
[0468] 体外ADCC测定显示本发明的示例性抗体CAN01指导NK细胞以比同种型对照更高的程度杀死CML细胞系KU812、LAMA84和BV173(图4A)。使用BV173靶细胞的CAN01和CAN03的剂
量滴定显示，对细胞杀死的作用是剂量依赖性的，随着浓度增加，细胞杀死的程度更高(图
4B)。已进展为原始细胞危象的慢性髓样白血病仅展示对用酪氨酸激酶抑制剂的治疗的瞬
时作用，并且因此造成了主要的治疗问题。用来自两个个别CML原始细胞危象患者的原代细胞的ADCC测定显示这些细胞对通过CAN01和NK细胞诱导的细胞毒性敏感(图4C)。另外，来自具有T315I突变(所述T315I突变引起对几种酪氨酸激酶抑制剂的抗性)的第三个CML原始细
胞危象患者的原代细胞展示相似的敏感性(图4D)。总之，实验显示，CAN01具有指导NK细胞对CML细胞系以及原代原始细胞危象CML细胞的特异性细胞杀死的能力，并且由CAN01诱导
的细胞毒性效应是剂量依赖性的。
量滴定显示，对细胞杀死的作用是剂量依赖性的，随着浓度增加，细胞杀死的程度更高(图
4B)。已进展为原始细胞危象的慢性髓样白血病仅展示对用酪氨酸激酶抑制剂的治疗的瞬
时作用，并且因此造成了主要的治疗问题。用来自两个个别CML原始细胞危象患者的原代细胞的ADCC测定显示这些细胞对通过CAN01和NK细胞诱导的细胞毒性敏感(图4C)。另外，来自具有T315I突变(所述T315I突变引起对几种酪氨酸激酶抑制剂的抗性)的第三个CML原始细
胞危象患者的原代细胞展示相似的敏感性(图4D)。总之，实验显示，CAN01具有指导NK细胞对CML细胞系以及原代原始细胞危象CML细胞的特异性细胞杀死的能力，并且由CAN01诱导
的细胞毒性效应是剂量依赖性的。
[0469] G.本发明的示例性抗体在黑素瘤细胞系中的ADCC效应
[0470] 材料与方法
[0471] 恶性黑素瘤细胞系SKMEL-5用作体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定的靶。简言之，根据制造商的说明书，用PKH26(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)标记靶细胞，并以5,000-
10,000个细胞/孔的密度种植到96孔板内。随后，将测试抗体或同种型对照抗体以不同浓度加入孔中，并温育30分钟，然后将100,000个NK效应细胞加入每个孔中。在知情同意后，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)，通过使用NK细胞阴性细胞分离试剂盒从健康志愿者中提取NK细胞。在实验中使用非特异性人IgG1抗体作为对照
(Eureka Therapeutics,Emeryville,CA)。通过使用FACS CANTO流式细胞仪(BD)检测PKH26
阳性细胞内的7-AAD阳性来评价细胞死亡的程度。每个实验用来自不同供体的NK细胞执行
至少两次。
10,000个细胞/孔的密度种植到96孔板内。随后，将测试抗体或同种型对照抗体以不同浓度加入孔中，并温育30分钟，然后将100,000个NK效应细胞加入每个孔中。在知情同意后，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)，通过使用NK细胞阴性细胞分离试剂盒从健康志愿者中提取NK细胞。在实验中使用非特异性人IgG1抗体作为对照
(Eureka Therapeutics,Emeryville,CA)。通过使用FACS CANTO流式细胞仪(BD)检测PKH26
阳性细胞内的7-AAD阳性来评价细胞死亡的程度。每个实验用来自不同供体的NK细胞执行
至少两次。
[0472] 结果与结论
[0473] 体外ADCC测定显示CAN01和CAN03指导NK细胞杀死SKMEL-5细胞系至比匹配的同种型对照高得多的程度(图5)。
[0474] H.本发明的示例性抗体的内在化
[0475] 材料与方法
[0476] 细胞和培养条件：从DSMZ(Braunschweig，德国)获得LAMA-84细胞，其是由患有处于原始细胞危象的慢性髓样白血病的患者建立的细胞系，并根据供应商的推荐进行培养。
简言之，细胞在具有10％FBS、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中在5％CO2,
37℃下培养。每2-3天将细胞培养物分成0.5x106个细胞/ml的密度。在从DSMZ收到细胞后，将细胞使用最多12代。
简言之，细胞在具有10％FBS、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中在5％CO2,
37℃下培养。每2-3天将细胞培养物分成0.5x106个细胞/ml的密度。在从DSMZ收到细胞后，将细胞使用最多12代。
[0477] 将来自悬浮细胞系LAMA-84的细胞在补充有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤一次，并且重悬浮于补充有来自Sigma的5％人AB+血清的PBS-BSA中，且在室温(RT)下温育5分钟。加入AlexaFluor488(AF488)标记的IL-1RAP选择性抗体CAN01、
CAN03或同种型匹配的对照抗体至10μg/ml的终浓度。将细胞在冰上或37℃下放置(温育)2
或16小时。
CAN03或同种型匹配的对照抗体至10μg/ml的终浓度。将细胞在冰上或37℃下放置(温育)2
或16小时。
[0478] 对于使用共焦显微镜检查(LSM 510 Meta Zeiss共焦显微镜)的图像分析，将细胞在PBS-1％BSA中洗涤两次，短暂向下旋转，随后在3％多聚甲醛(在PBS中)重悬浮固定20分
钟(在4℃下)。随后将细胞向下旋转，重悬浮于含有0.001％Triton X-100(PBS-TX)和核标
记物(DAPI)的PBS中，并在RT下温育5分钟。在短暂离心后，将细胞重悬浮于PBS-TX中并置于玻璃底显微镜孔中。随后使细胞贴壁1小时。经由细胞的共焦扫描收集图像数据，提供通过细胞中心(通过核标记物描绘)在薄光学切片中的AlexaFluor488荧光的高分辨率图像。经
由软件图像分析(Zeiss Zen2010)执行抗体与细胞膜结合和/或内在化抗体的进一步分析。
钟(在4℃下)。随后将细胞向下旋转，重悬浮于含有0.001％Triton X-100(PBS-TX)和核标
记物(DAPI)的PBS中，并在RT下温育5分钟。在短暂离心后，将细胞重悬浮于PBS-TX中并置于玻璃底显微镜孔中。随后使细胞贴壁1小时。经由细胞的共焦扫描收集图像数据，提供通过细胞中心(通过核标记物描绘)在薄光学切片中的AlexaFluor488荧光的高分辨率图像。经
由软件图像分析(Zeiss Zen2010)执行抗体与细胞膜结合和/或内在化抗体的进一步分析。
[0479] 结果与结论
[0480] 通过借助于共焦激光扫描显微镜检查记录的高分辨率成像数据以及通过该数据的图像分析，证明了CAN01和CAN03与细胞膜结合的结构关系及其进入细胞(“内在化”)的能力。
[0481] 图像数据表示如图6中所示。
[0482] I.本发明的示例性抗体的体内治疗功效
[0483] 材料与方法
[0484] 用致死剂量的MA9Ras细胞移植未条件化的NOD/SCID小鼠，所述MA9Ras细胞先前通过经由指导MLL/AF9融合物和活化的NRAS基因表达的cDNA的逆转录病毒整合转化人脐带血
CD34+细胞来生成。白血病小鼠用靶向IL1RAP的示例性CAN01抗体或相应的同种型对照抗体
进行处理。在实验自始至终通过每周两次的腹膜内注射施用抗体，其中第一次处理在移植
后第三天给予。抗体的每个剂量是500μg，除了作为1000μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。基于如通过驼背、不整洁的皮毛和活动性减少判断的严重疾病的体征或由于实体瘤而
处死小鼠。
CD34+细胞来生成。白血病小鼠用靶向IL1RAP的示例性CAN01抗体或相应的同种型对照抗体
进行处理。在实验自始至终通过每周两次的腹膜内注射施用抗体，其中第一次处理在移植
后第三天给予。抗体的每个剂量是500μg，除了作为1000μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。基于如通过驼背、不整洁的皮毛和活动性减少判断的严重疾病的体征或由于实体瘤而
处死小鼠。
[0485] 结果与结论
[0486] 免疫缺陷小鼠用人白血病细胞进行移植，并且用CAN01(靶向IL1RAP的单克隆抗体)进行处理。外周血中的白血病细胞的频率在移植后第35天时显著降低，并且与同种型对照抗体相比较，给予CAN01的小鼠中的血小板计数保持正常，指示更具功能的血细胞生成
(图7A-B)。在移植后62天时，同种型处理的小鼠具有在外周血中的高频率的白血病细胞(图
7C)。CAN01处理导致在脾和骨髓中的白血病细胞的显著降低(图7D-E)。我们得出结论抗
IL1RAP免疫疗法降低在MA9Ras异种移植物模型中的外周血、骨髓和脾中的人类白血病。结
果支持抗IL1RAP免疫疗法作为用于AML的新的有希望的治疗策略。
(图7A-B)。在移植后62天时，同种型处理的小鼠具有在外周血中的高频率的白血病细胞(图
7C)。CAN01处理导致在脾和骨髓中的白血病细胞的显著降低(图7D-E)。我们得出结论抗
IL1RAP免疫疗法降低在MA9Ras异种移植物模型中的外周血、骨髓和脾中的人类白血病。结
果支持抗IL1RAP免疫疗法作为用于AML的新的有希望的治疗策略。
[0487] J.本发明的示例性抗体的体内治疗功效
[0488] 材料与方法
[0489] 用BV173 CML细胞移植未条件化的NOD/SCID小鼠，所述BV173 CML细胞具有BCR/ABL融合基因。白血病小鼠用靶向IL1RAP的示例性CAN01抗体或相应的同种型对照抗体进行
处理。每周两次通过腹膜内注射施用抗体最多13个剂量，其中第一次处理在移植后第二天
和最后一天第45天给予。抗体的每个剂量是500μg，除了作为1000μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。基于如通过驼背、重量减轻和活动性减少判断的严重疾病的体征而处死小鼠。
处理。每周两次通过腹膜内注射施用抗体最多13个剂量，其中第一次处理在移植后第二天
和最后一天第45天给予。抗体的每个剂量是500μg，除了作为1000μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。基于如通过驼背、重量减轻和活动性减少判断的严重疾病的体征而处死小鼠。
[0490] 结果与结论
[0491] 免疫缺陷小鼠用人CML细胞进行移植，并且用CAN01(靶向IL1RAP的单克隆抗体)进行处理。给予同种型对照的小鼠具有37天的中值存活(范围33-38天)，而用CAN01处理的小
鼠存活显著更久(中值51天)，尽管最后一次治疗在第45天时施用(图8A)。两只CAN01处理的小鼠在移植后第101天处死时仍存活并且外观健康。CAN01处理导致骨髓中的白血病细胞的
显著降低(图8B)。在脾中，存在对于CAN01朝向降低白血病频率的趋势(图8C)。用CAN01处理的小鼠具有比同种型处理的小鼠显著更小的脾(图9D)。我们得出结论抗IL1RAP免疫疗法延
长存活且降低BV173异种移植物模型中的人类白血病。结果支持抗IL1RAP免疫疗法作为用
于CML的新的有希望的治疗策略。
鼠存活显著更久(中值51天)，尽管最后一次治疗在第45天时施用(图8A)。两只CAN01处理的小鼠在移植后第101天处死时仍存活并且外观健康。CAN01处理导致骨髓中的白血病细胞的
显著降低(图8B)。在脾中，存在对于CAN01朝向降低白血病频率的趋势(图8C)。用CAN01处理的小鼠具有比同种型处理的小鼠显著更小的脾(图9D)。我们得出结论抗IL1RAP免疫疗法延
长存活且降低BV173异种移植物模型中的人类白血病。结果支持抗IL1RAP免疫疗法作为用
于CML的新的有希望的治疗策略。
[0492] K.本发明的示例性抗体的体内治疗功效
[0493] 材料与方法
[0494] 从诊断时取自AML患者的骨髓抽吸物中分离单核细胞。通过静脉内注射将细胞移植到未条件化的NOD/SCID小鼠内。在移植后三天开始，用抗IL1RAP CAN01或相应的mIgG2a
同种型对照抗体处理小鼠。在实验自始至终通过每周两次的腹膜内注射施用抗体。抗体的
每个剂量是100μg，除了作为500μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。移植后28天处死小鼠，并如通过流式细胞术中的CD45和CD33的表达检测的，分析骨髓的人白血病细胞的频率。
同种型对照抗体处理小鼠。在实验自始至终通过每周两次的腹膜内注射施用抗体。抗体的
每个剂量是100μg，除了作为500μg的大丸剂给予的第一个剂量之外。移植后28天处死小鼠，并如通过流式细胞术中的CD45和CD33的表达检测的，分析骨髓的人白血病细胞的频率。
[0495] 结果与结论
[0496] 免疫缺陷小鼠用原代人AML细胞进行移植，并且用CAN01(靶向IL1RAP的单克隆抗体)进行处理。在移植后28天处死时，与同种型对照相比较，骨髓中的白血病细胞的频率对于CAN01显著降低(0.001％相对于0.126％，p<0.0001；图9)。我们得出结论抗IL1RAP免疫疗法降低用原代人AML细胞移植的小鼠中的骨髓中的白血病。结果增加了抗IL1RAP免疫疗法
作为用于AML的新的有希望的治疗策略的强度。
作为用于AML的新的有希望的治疗策略的强度。
[0497] L.体外IL1RAP依赖性阻断HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞中的人IL-1α-、IL-1β-和IL-33-介导的信号传导。抗体CAN01和CAN03的效力。
[0498] 执行下述实验以测定本发明的两种示例性抗体(CAN01和CAN03)在使用HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞的报道基因测定中是否能够抑制IL-1α和β依赖性信号传导。
[0499] 材料
[0500] 抗体的制备
[0501] 本发明的示例性抗体(CAN01和CAN03)连同同种型对照(mIgG2a)一起由Innovagen AB(Lund，瑞典)提供。
[0502] 所有抗体均在PBS中稀释用于测试。用于报道基因测定的工作溶液，HEK-Blue IL-33/IL-1β在PBS中制备为最终测定浓度的20倍。最终测定体积为200μl(含有10μl抗体或稀释剂(PBS)+180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：100至0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。
[0503] 人配体(IL-1α、IL-1β和IL-33)的制备
[0504] 将人配体，IL-1α、IL-1β和IL-33在PBS中稀释至10μg/mL的储备浓度。将10μg/mL的储备浓度的配体以等分试样贮存于-80℃下直至使用时。对于报道基因测定，配体以0.3ng/mL的终浓度使用，所述0.3ng/mL的终浓度是如预测试实验中测定的在测定中给予最大效应的70-80％的浓度。
[0505] 配体稀释至最终测定浓度
[0506] ·配体原液10μg/mL 1:100稀释(2μl+198μl选择培养基，参见下文)＝100ng/mL。
[0507] ·100ng/mL 1:16.67稀释(150μl+2350.5μl选择培养基，参见下文)＝6ng/mL。
[0508] ·6ng/mL在测定中1:20稀释；10μl LPS 6ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，以获得0.3ng/mL的终浓度。
[0509] 细胞系
[0510] 通过用IL1RL1稳定转染HEK-BlueTM IL-1β细胞生成的HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞用作IL-33/IL-1β传感细胞(目录号hkb-IL-33,InvivoGen,San Diego,US)。
[0511] 方法
[0512] 研究设计
[0513] 在PBS中制备CAN01、CAN03和同种型对照的储备溶液。用于报道基因测定的工作溶液，HEK-Blue IL-33/IL-1β在PBS中制备为最终测定浓度的20倍。最终测定体积为200μl(含有10μl抗体或稀释剂(PBS)+180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：100至
0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。在对照孔(刺激/未刺激的细胞)中，抗体替换为
10μl PBS。
0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。在对照孔(刺激/未刺激的细胞)中，抗体替换为
10μl PBS。
[0514] HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞的培养和刺激
[0515] 因为IL1RAP是IL-1受体复合物的功能部分，所以结合IL1RAP的抗体具有抑制IL-1信号传导的潜力。因为肿瘤细胞据报道使用IL1RAP依赖性配体如IL-1α、IL-1β和IL-33作为生长因子，所以阻断这种信号可提供用于介导抗肿瘤效应的重要机制(分开或与ADCC效应
组合)。为了测试抗体阻断IL-1信号传导的能力，建立了IL-1依赖性报道基因测定。HEK-
Blue IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过碱性磷酸酶的释放响应IL-1信号传导，所述碱性
磷酸酶可通过比色测定法进行定量。为了测试前导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以
50 000个细胞/孔铺平板，并在用IL-1α、IL-1β和IL-33以对于每种配体0.3ng/ml的终浓度刺激之前，与测试抗体一起温育45分钟。抗体的最终测定浓度为100nM-0.01nM。在对照孔
中，抗体替换为PBS。在测量通过用于检测和定量碱性磷酸酶的QUANTI-Blue-Medium释放的碱性磷酸酶的量之前，使细胞在37℃o/n下温育。
组合)。为了测试抗体阻断IL-1信号传导的能力，建立了IL-1依赖性报道基因测定。HEK-
Blue IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过碱性磷酸酶的释放响应IL-1信号传导，所述碱性
磷酸酶可通过比色测定法进行定量。为了测试前导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以
50 000个细胞/孔铺平板，并在用IL-1α、IL-1β和IL-33以对于每种配体0.3ng/ml的终浓度刺激之前，与测试抗体一起温育45分钟。抗体的最终测定浓度为100nM-0.01nM。在对照孔
中，抗体替换为PBS。在测量通过用于检测和定量碱性磷酸酶的QUANTI-Blue-Medium释放的碱性磷酸酶的量之前，使细胞在37℃o/n下温育。
[0516] 将HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞解冻，并在DMEM、10％FCS(HI)和PEST和Normocin中培养两代。两次传代后，在实验前以及在实验期间将细胞与加入上述培养基中的选择抗生素(Zeocin、HygroGold和杀稻瘟菌素)一起培养至少一代。需要HygroGold以维持对细胞系
的IL-1β特异性，并且需要杀稻瘟菌素和Zeocin以分别维持编码IL1RL1和SEAP的质粒。实验在70％汇合的细胞上运行。细胞分开2-3次/周，或当它们已达到80-90％汇合时分开。
的IL-1β特异性，并且需要杀稻瘟菌素和Zeocin以分别维持编码IL1RL1和SEAP的质粒。实验在70％汇合的细胞上运行。细胞分开2-3次/周，或当它们已达到80-90％汇合时分开。
[0517] 配体以30ng/ml至0.001ng/ml的剂量范围进行滴定。为了生成用于测试抗体影响IL-1信号传导(刺激或抑制碱性磷酸酶释放的量)的能力的良好测定，在剂量-应答曲线的
线性斜率上导致稳健信号的浓度是优选的。对于该系统，选择每种配体0.3ng/ml的浓度。用抗体的个别稀释系列执行两个单独实验。对于每个实验还分别稀释配体，并且使用来自不
同代的细胞。
线性斜率上导致稳健信号的浓度是优选的。对于该系统，选择每种配体0.3ng/ml的浓度。用抗体的个别稀释系列执行两个单独实验。对于每个实验还分别稀释配体，并且使用来自不
同代的细胞。
[0518] 结果评估
[0519] 使用方程1将原始数据转化为％抑制：
[0520] ％抑制＝(1-(A-B)/(C-B))x100
[0521] 其中：
[0522] A＝具有加入的溶解于PBS中的化合物的配体活性
[0523] B＝阴性对照，无配体，仅PBS(媒介物)
[0524] C＝阳性对照，具有PBS(媒介物)的配体，
[0525] IC50代表获得最大应答的50％抑制的浓度。
[0526] EC50代表获得抑制的浓度，所述抑制代表就曲线的顶部和底部的计算值而言的50％抑制。
[0527] 结果与结论
[0528] 建立实验阐明两种测试抗体(CAN03和CAN01)在HEK-Blue IL-33/IL-β细胞的报道基因测试系统中的效应，所述HEK-Blue IL-33/IL-β细胞用三种不同配体(hIL-1α、hIL-1β和hIL-1β)进行刺激，以释放碱性磷酸酶。作为比较和参考，使用同种型对照。使用由两次单独传代制备的细胞。使用一式两份培养物执行所有实验。
[0529] 在第一个实验中，评估三种不同配体对HEK-Blue IL-33/IL-β细胞的作用，以产生相关的测试系统。配体从30ng/ml滴定到0.001ng/ml，并且对于测试系统中的所有配体选择0.3ng/ml作为适当浓度。由两个不同的传代制备HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞。在0.3ng/ml配体存在下刺激细胞16小时，并且收集并评价上清液用于测量释放的碱性磷酸酶的量。
[0530] 如图10中证明的，在两个实验中，CAN03通过抑制碱性磷酸酶由所有配体的释放而证明对IL1RAP信号传导的抑制作用。CAN03能够完全抑制IL-1α介导的和IL-1β介导的信号传导。IL-33诱导的信号传导被CAN03阻断至少95％。相比之下，CAN 01和同种型对照未显示任何抑制作用。
[0531] 下表5概括了所有测试的抗体候选物的效力。
[0532] 表5
[0533] CAN03、CAN01和同种型对照对HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞和三种不同配体(n＝2)的作用的IC50/EC50(nM)平均值
[0534]
[0535] M.体外IL1RAP依赖性阻断HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞中的鼠IL-1α-、IL-1β-和IL-33-介导的信号传导。抗体CAN01和CAN03的效力。
[0536] 执行下述实验(i)以确认鼠配体可刺激通过人受体复合物的信号传导，和(ii)测定两种示例性抗体(CAN01和CAN03)是否能够抑制这种信号。
[0537] 材料
[0538] 抗体的制备
[0539] 本发明的示例性抗体(CAN01和CAN03)连同两种同种型对照(mIgG2a和hIgG1/κ)一起由Innovagen AB(Lund，瑞典)提供。
[0540] 所有抗体均在PBS中稀释用于测试。用于报道基因测定的工作溶液，HEK-Blue IL-33/IL-1β在PBS中制备为最终测定浓度的20倍。最终测定体积为200μl(含有10μl抗体或稀释剂(PBS)+180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：100至0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。
[0541] 人配体(IL-1α、IL-1β和IL-33)的制备
[0542] 将鼠配体，IL-1α、IL-1β和IL-33在PBS中稀释至10μg/mL的储备浓度。将10μg/mL的储备浓度的配体以等分试样贮存于-80℃下直至使用时。对于报道基因测定，配体以对于mIL-1α10ng/mL，对于mIL-1β100ng/mL并且对于mIL-332ng/mL的终浓度使用；这些浓度如预测试实验中测定的在测定中给予最大效应的70-80％。
[0543] 配体稀释至最终测定浓度
[0544] (a)mIL-1α，10ng/mL
[0545] ·配体原液10μg/mL 1:50稀释(20μl+980μl选择培养基，参见下文)＝200ng/mL
[0546] ·200ng/mL在测定中1:20稀释；10μl LPS 200ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，以获得10ng/mL的终浓度
[0547] (b)mIL-1β，100ng/mL
[0548] ·配体原液10μg/mL 1:5稀释(200μl+800μl选择培养基，参见下文)＝2000ng/mL
[0549] ·2000ng/mL在测定中1:20稀释；10μl LPS 2000ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，以获得100ng/mL的终浓度
[0550] (c)mIL-33，2ng/mL
[0551] ·配体原液10μg/mL 1:250稀释(10μl+2490μl选择培养基，参见下文)＝40ng/mL
[0552] ·40ng/mL在测定中1:20稀释；10μl LPS 200ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，以获得2ng/mL的终浓度
[0553] 细胞系
[0554] 通过用IL1RL1稳定转染HEK-BlueTM IL-1β细胞生成的HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞用作IL-33/IL-1β传感细胞(目录号hkb-IL-33,InvivoGen,San Diego,US)。
[0555] 方法
[0556] 研究设计
[0557] 在PBS中制备CAN01、CAN03和两种同种型对照的储备溶液。用于报道基因测定的工作溶液，HEK-Blue IL-33/IL-1β在PBS中制备为最终测定浓度的20倍。最终测定体积为200μl(含有10μl抗体或稀释剂(PBS)+180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：100至
0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。在对照孔(刺激/未刺激的细胞)中，抗体替换为
10μl PBS。
0.01nM(通过3倍稀释步骤中的连续稀释)。在对照孔(刺激/未刺激的细胞)中，抗体替换为
10μl PBS。
[0558] HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞的培养和刺激
[0559] 因为IL1RAP是IL-1受体复合物的功能部分，所以结合IL1RAP的抗体具有抑制IL-1信号传导的潜力。因为肿瘤细胞据报道使用IL1RAP依赖性配体如IL-1α、IL-1β和IL-33作为生长因子，所以阻断这种信号可提供用于介导抗肿瘤效应的重要机制(分开或与ADCC效应
组合)。为了测试抗体阻断IL-1信号传导的能力，建立了IL-1依赖性报道基因测定。HEK-
Blue IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过碱性磷酸酶的释放响应IL-1信号传导，所述碱性
磷酸酶可通过比色测定法进行定量。为了测试前导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以
50 000个细胞/孔铺平板，并在用鼠IL-1α、IL-1β和IL-33以终浓度刺激之前，与测试抗体一起温育45分钟，以得到最优刺激。抗体的最终测定浓度为100nM-0.01nM。在对照孔中，抗体替换为PBS。在测量通过用于检测和定量碱性磷酸酶的QUANTI-Blue-Medium释放的碱性磷
酸酶的量之前，使细胞在37℃o/n下温育。
组合)。为了测试抗体阻断IL-1信号传导的能力，建立了IL-1依赖性报道基因测定。HEK-
Blue IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过碱性磷酸酶的释放响应IL-1信号传导，所述碱性
磷酸酶可通过比色测定法进行定量。为了测试前导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以
50 000个细胞/孔铺平板，并在用鼠IL-1α、IL-1β和IL-33以终浓度刺激之前，与测试抗体一起温育45分钟，以得到最优刺激。抗体的最终测定浓度为100nM-0.01nM。在对照孔中，抗体替换为PBS。在测量通过用于检测和定量碱性磷酸酶的QUANTI-Blue-Medium释放的碱性磷
酸酶的量之前，使细胞在37℃o/n下温育。
[0560] 将HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞解冻，并在DMEM、10％FCS(HI)和PEST和Normocin中培养两代。两次传代后，在实验前以及在实验期间将细胞与加入上述培养基中的选择抗生素(Zeocin、HygroGold和杀稻瘟菌素)一起培养至少一代。需要HygroGold以维持对细胞系
的IL-1β特异性，并且需要杀稻瘟菌素和Zeocin以分别维持编码IL1RL1和SEAP的质粒。实验在70％汇合的细胞上运行。细胞分开2-3次/周，或当它们已达到80-90％汇合时分开。
的IL-1β特异性，并且需要杀稻瘟菌素和Zeocin以分别维持编码IL1RL1和SEAP的质粒。实验在70％汇合的细胞上运行。细胞分开2-3次/周，或当它们已达到80-90％汇合时分开。
[0561] 配体以300ng/ml至0.01ng/ml的剂量范围进行滴定。为了生成用于测试抗体影响IL-1信号传导(刺激或抑制碱性磷酸酶释放的量)的能力的良好测定，在剂量-应答曲线的
线性斜率上导致稳健信号的浓度是优选的。对于该系统，选择对于mIL-1α10ng/mL，对于
mIL-1β100ng/mL并且对于mIL-332ng/mL的浓度。
线性斜率上导致稳健信号的浓度是优选的。对于该系统，选择对于mIL-1α10ng/mL，对于
mIL-1β100ng/mL并且对于mIL-332ng/mL的浓度。
[0562] 结果评估
[0563] 使用方程1将原始数据转化为％抑制：
[0564] ％抑制＝(1-(A-B)/(C-B))x100
[0565] 其中：
[0566] A＝具有加入的溶解于PBS中的化合物的配体活性
[0567] B＝阴性对照，无配体，仅PBS(媒介物)
[0568] C＝阳性对照，具有PBS(媒介物)的配体，
[0569] IC50代表获得最大应答的50％抑制的浓度。
[0570] EC50代表获得抑制的浓度，所述抑制代表就曲线的顶部和底部的计算值而言的50％抑制。
[0571] 结果与结论
[0572] 建立实验阐明了鼠配体针对人受体的IL1RAP信号传导的交叉反应性。
[0573] 在第一组实验中，测试了三种鼠配体IL-1α、IL-1β和IL-33刺激HEK Blue IL-33/IL-1β的能力。所有三种鼠配体均能够刺激碱性磷酸酶的释放，尽管与其人等同物相比较具有显著降低的效应。
[0574] 在这种第一个实验中，还评估了三种不同配体对HEK-Blue IL-33/IL-β细胞的作用，以产生相关的测试系统。将配体从100ng/ml滴定到0.001ng/ml，并且对于mIL-1α选择
10ng/mL，对于mIL-1β选择100ng/mL，并且对于mIL-33选择2ng/mL。功效下降对于IL-1β为最大(约300倍)，并且对于IL-33为最小(约8倍)。
10ng/mL，对于mIL-1β选择100ng/mL，并且对于mIL-33选择2ng/mL。功效下降对于IL-1β为最大(约300倍)，并且对于IL-33为最小(约8倍)。
[0575] 随后测试所测试抗体抑制通过鼠配体诱导的信号的作用(参见图11)。作为比较和参考，使用两种同种型对照抗体(人IgG1和鼠IgG2a)。制备HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞。在配体的存在下刺激细胞16小时，并且收集并评价上清液用于测量释放的碱性磷酸酶的量。
使用由两次单独传代制备的细胞。使用一式两份培养物进行所有实验。
使用由两次单独传代制备的细胞。使用一式两份培养物进行所有实验。
[0576] CAN03抑制通过所有三种鼠配体介导的IL1RAP依赖性信号传导，如通过碱性磷酸酶的释放测定的。CAN01对IL1RAP依赖性信号传导仅具有有限的抑制作用。同种型对照无一显示任何抑制作用。由于在配体IL-1β和IL-33的曲线顶部缺乏平台，对于CAN01无法计算
IC50和EC50值。
IC50和EC50值。
[0577] 下表6概括了所有测试的抗体候选物的效力。
[0578] 表6
[0579] CAN01、CAN03、小鼠IgG2a(同种型对照)和人IgG1/κ(同种型对照)(n＝1)的效应的IC50/EC50(nM)平均值
[0580]
[0581] 实例N-通过ELISA分析竞争性结合
[0582] 方案
[0583] ·所有样品应当一式两份进行分析。
[0584] ·用100ul/孔在0.01M PBS，pH 7.4中稀释的重组hIL1RAP 21-367(1ug/ml)包被Nunc-MaxiSorp 96 Micro WellTM板。
[0585] ·使板在4℃下温育过夜。
[0586] ·用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS,0.05％Tween 20,pH 7.4)洗涤板。
[0587] ·加入150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween 20,pH 7.4)。
[0588] ·使板在室温(RT)下在搅动下温育1小时。
[0589] ·用ELISA洗涤缓冲液洗涤板。
[0590] ·将测试项(例如mAb 1、mAb 2)的样品加入孔(100ul/孔，10ug/ml)中
[0591] ·使板在RT下温育1小时。
[0592] ·用ELISA洗涤溶液洗涤板。
[0593] ·将参考抗体例如CAN01或CAN03的溶液(100ul/孔，1ug/ml)加入所有孔中。
[0594] ·使板在RT下温育1小时。
[0595] ·用ELISA洗涤缓冲液洗涤板。
[0596] ·加入100μl/孔的与缀合至碱性磷酸酶的碱性兔抗小鼠IgG缀合的合适第二抗体(如果测试项是人抗体，则合适的第二抗体是山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)-碱性磷酸酶抗体，SIGMA，A1418)
[0597] ·使板在RT下在搅动下温育1小时。
[0598] ·用洗涤缓冲液洗涤板。
[0599] ·加入100μl pNPP底物/孔。(4-硝基苯基磷酸酶二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/ml)。
[0600] ·使板在RT下在搅动下温育，并连续测量在405nm处的吸光度30分钟。在0分钟时的吸光度应当视为本底信号。
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