泛细胞表面受体特异的治疗剂
阅读：252发布：2021-10-02
专利汇可以提供泛细胞表面受体特异的治疗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了泛细胞表面受体特异的 治疗 剂、用于制备它们的方法和使用它们进行治疗的方法。在泛细胞表面受体特异的治疗剂中，有与至少2种不同的HER受体配体相互作用和/或与两种或多种HER细胞表面受体二聚化或相互作用的泛HER特异的治疗剂。借助这些特性，所述治疗剂调节至少两种细胞表面受体的活性并且用于治疗目的。，下面是泛细胞表面受体特异的治疗剂专利的具体信息内容。
1.多聚体，其包含：
a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽选自：
i)嵌合多肽，所述嵌合多肽含有直接地或经接头间接地与多聚化结构 域连接的来自HER1受体的全长胞外结构域(ECD)，或
ii)嵌合多肽，所述嵌合多肽含有直接地或经接头间接地与多聚化结构 域连接的HER1、HER2、HER3或HER4受体的小于全长的ECD，其中 所述ECD至少含有亚结构域I和/或III的足够部分以与所述受体的配体结 合，以及ECD的与细胞表面受体二聚化的足够部分，所述ECD的与细胞 表面受体二聚化的足够部分在此嵌合多肽中的ECD不是来自HER2受体 时包括亚结构域II的足够部分，在此嵌合多肽中的ECD来自HER2受体 时，则ECD还含有结构域IV的全部或部分，包括亚结构域IV的模块2-5 的足够部分或全部，以实现与细胞表面受体的二聚化；和
b)直接地或经接头间接地与多聚化结构域连接的第二嵌合多肽，并且 至少含有细胞表面蛋白的ECD的足够部分以与该细胞表面蛋白的配体结 合和/或与细胞表面受体二聚化，其中在第一和第二嵌合多肽中的多聚化结 构域是互补的或相同的，条件是如果第一嵌合多肽是全长HER1 ECD，则 第二嵌合多肽不含来自HER2的ECD；或者如果第二嵌合多肽含有来自 HER2的ECD，则所述HER2 ECD是小于全长的并且用于受体二聚化的 足够部分包括结构域IV的足够部分以实现二聚化，从而：
所述的嵌合多肽形成多聚体；并且
所得的多聚体结合至与第一嵌合多肽或第一嵌合多肽的同二聚体相比 较而言的额外配体和/或与较第一嵌合多肽或第一嵌合多肽的同二聚体多 的细胞表面受体二聚化。
2.权利要求1所述的多聚体，其中第一和第二嵌合多肽之一者或这二 者的ECD是杂合ECD，所述杂合ECD含有来自至少2种不同细胞表面受 体ECD的亚结构域。
3.权利要求1所述的多聚体，其中第一嵌合多肽含有HER2、HER3 或HER4的小于全长的ECD。
4.权利要求1所述的多聚体，其中第一嵌合多肽含有HER3或HER4 的小于全长的ECD。
5.权利要求1所述的多聚体，其是异多聚体，其中第二嵌合多肽的 ECD部分是来自不同于HER1的细胞表面受体。
6.权利要求5所述的多聚体，其中在第二嵌合多肽中的ECD来自 HER3或HER4。
7.权利要求1-6中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌合多肽的ECD 结构域含有全长ECD。
8.权利要求1-6中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌合多肽的ECD 结构域至少含有亚结构域I、II和III的足够部分以与其配体结合并与细胞 表面受体二聚化。
9.权利要求1-6中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌合多肽含有小 于全长的ECD，并且包括结构域I和III的足够部分以与其配体结合。
10.权利要求1-8中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌合多肽含有小 于全长的ECD，并且包括该ECD的足够部分以与细胞表面受体二聚化。
11.权利要求1-10中任意一项所述的多聚体，其中多聚化结构域选自 免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相 容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的 游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空 穴。
12权利要求1-10中任意一项所述的多聚体，其中多聚化结构域是实 现多聚化的Fc结构域或其变体。
13.权利要求12所述的多聚体，其中所述的Fc结构域来自IgG、IgM 或IgE。
14.权利要求1-13中任意一项所述的多聚体，其中细胞表面受体是针 对所述多聚体的ECD或该ECD的亚结构域的关联受体。
15.权利要求1-13和117-126中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌 合多肽的ECD选自HER2、HER3、HER4、IGF1-R、VEGFR、FGFR、 TNFR、PDGFR、MET、Tie、RAGE、EPH受体和T细胞受体。
16.权利要求15所述的多聚体，其中第二嵌合多肽的ECD选自 VEGFR1、FGFR2、FGFR4、IGF1-R和Tie1。
17.权利要求2-16中任意一项所述的多聚体，其中第二嵌合多肽的 ECD是与多聚化结构域连接的内含子融合蛋白。
18.权利要求2-16中任意一项所述的多聚体，其中所述第二ECD是 用于与细胞表面受体的受体二聚化和/或用于与细胞表面受体的配体结合 的全长HER2、HER3或HER4或其足够部分。
19.权利要求2-17中任意一项所述的多聚体，其中所述第二ECD来 自除HER1之外的受体酪氨酸激酶。
20.权利要求2-19、105、106和117-126中任意一项所述的多聚体， 其与至少三、四、五、六或七种不同配体结合。
21.权利要求20所述的多聚体，其中所述配体选自EGF、TGF-α、双 调蛋白、HB-EGF、β-动物纤维素、表皮调节素和与除HER1之外的细胞 表面受体的ECD结合的其它配体。
22.权利要求21所述的多聚体，其中所述的其它配体选自神经调节蛋 白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3和神经调节蛋白-4。
23.权利要求1所述的多聚体，其中：
第一嵌合多肽含有足以与配体结合和/或二聚化的i)来自HER1的全长 ECD或ii)其部分；并且
第二嵌合多肽含有足以与配体结合和/或二聚化的HER3或HER4的 ECD的全部或部分。
24.权利要求1-23、105、106和117-126中任意一项所述的多聚体， 其中在每一嵌合多肽中的多聚化结构域选自免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨 酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结 构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯基、和形成稳定多聚体 的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴，从而所述嵌合多肽以背靠 背式构型相互作用，由此这两个嵌合多肽的ECD能够用于与细胞表面受 体二聚化。
25.权利要求23或权利要求24所述的多聚体，其中所述的多聚化结 构域是Fc结构域。
26.权利要求所述25的多聚体，其中所述的Fc结构域来自IgG、IgM 或IgE。
27.权利要求1、7-14、106和117-122中任意一项所述的多聚体，其 包含至少两种嵌合多肽，其中：
第一嵌合多肽含有HER1的ECD的全部或部分；和
第二嵌合多肽含有HER3或HER4的ECD的全部或部分。
28.权利要求1-27、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中组 分嵌合多肽是融合多肽。
29.权利要求1-27、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中嵌 合多肽a)和b)是融合多肽。
30.权利要求1-27、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中组 分嵌合多肽通过化学缀合作用形成。
31.权利要求1-27、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中嵌 合多肽a)和b)通过化学缀合作用形成。
32.权利要求1-31、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中至 少一种嵌合多肽的多聚化结构域直接与ECD连接。
33.权利要求1-31、106和117-126中任意一项所述的多聚体，其中至 少一种嵌合多肽的多聚化结构域经接头与ECD连接。
34.权利要求32所述的多聚体，其中全部组分嵌合多肽肽的多聚化结 构域直接与每一分别的ECD连接。
35.权利要求33所述的多聚体，其中全部组分嵌合多肽肽的多聚化结 构域经接头与每一分别的ECD连接。
36.权利要求33或权利要求35所述的多聚体，其中所述接头是化学 接头或多肽接头。
37.权利要求1-36、105、106和117-126中任意一项所述的多聚体， 其是异二聚体。
38.权利要求1-37、105、106和117-126中任意一项所述的多聚体， 其是含有处于背靠背式构型的组分嵌合多肽的异二聚体，从而在每一嵌合 多肽中的ECD能够用于与细胞表面受体的二聚化。
39.异多聚体，其包含：
来自一种HER受体的胞外结构域(ECD)；和
来自第二受体的ECD，其中：
所述ECD中至少之一是HER ECD并且含有亚结构域I、II和III以 及亚结构域IV的部分，但不含亚结构域IV的全部；
亚结构域IV至少包括模块1；并且
所述ECD是不同的。
40.权利要求39和127-134中任意一项所述的异多聚体，其中第二 ECD来自细胞表面受体。
41.权利要求39和127-134中任意一项所述的异多聚体，其中一种 HER是HER1而另一种HER是HER3或HER4。
42.权利要求39-41、104和127-134中任意一项所述的异多聚体，其 中所述异多聚体中的至少一个ECD的二聚化结构域能够用于与细胞表面 受体的二聚化。
43.权利要求39-42和127-134中任意一项所述的异多聚体，其中每一 ECD直接或经接头与多聚化结构域连接，从而至少两个ECD的多聚化结 构域相互作用以形成异多聚体。
44.权利要求43所述的异多聚体，其中所述的多聚化结构域选自免疫 球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性 蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离 巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴。
45.权利要求43或权利要求44所述的异多聚体，其中多聚化结构域 是Fc结构域。
46.权利要求45所述的多聚体，其中Fc结构域来自IgG、IgM或IgE。
47.权利要求40和42-46中任意一项所述的异多聚体，其中细胞表面 受体是所述异多聚体的ECD的关联受体或该ECD亚结构域的关联受体。
48.权利要求38-47中任意一项所述的异多聚体，其中第二ECD来自 选自HER2、HER3、HER4、IGF1-R、VEGFR、FGFR、TNFR、PDGFR、 MET、Tie、RAGE、EPH受体和T细胞受体的受体。
49.权利要求48所述的异多聚体，其中ECD选自VEGFR1、FGFR2、 FGFR4、IGFR1和Tie1。
50.杂合胞外结构域(ECD)，其包含：
一种或多种细胞表面受体的ECD的至少结构域I、II和III的全部或 部分，其中：
所述结构域中至少两个结构域是来自不同细胞表面受体的ECD；
该杂合ECD含有来自细胞表面受体的一个或多个ECD的结构域I或 III的足够部分以结合配体，并含有细胞表面受体的ECD的足够部分，包 括结构域II的足够部分，以在所述杂合ECD连接至多聚化结构域时与细 胞表面受体二聚化。
51.权利要求50所述的杂合ECD，其中所述细胞表面受体是HER家 族的成员。
52.权利要求50所述的杂合ECD，其中结构域I来自HER1，结构域 II来自HER2，并且结构域III来自HER3。
53.嵌合多肽，包含直接地或经接头间接地与多聚化结构域连接的权利 要求50-52和135-142中任意一项所述的杂合ECD。
54.权利要求53所述的嵌合多肽，其中多聚化结构域选自免疫球蛋白 恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋白质- 蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯基、 和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴。
55.权利要求53或权利要求54所述的嵌合多肽，其中所述的多聚化 结构域是Fc结构域。
56.权利要求55所述的嵌合多肽，其中所述的Fc结构域来自IgG、 IgM或IgE。
57.多聚体，其包含权利要求50-56和147-142中任意一项所述的至少 两个嵌合多肽。
58.异多聚体，其包含：
来自HER1受体的胞外结构域(ECD)的全部或部分；和
来自HER3或HER4受体的ECD的全部或部分，其中：
所述的部分至少包括亚结构域I、II和III。
59.核酸分子，包含核酸的序列，其中所述的核酸编码权利要求1-49、 50-53、58、96、102-106和143-150中任意一项所述的异多聚体中的至少 一种嵌合多肽、权利要求95、97、98、99、101、127-134、151和152中 任意一项所述的嵌合多肽、或含有此种嵌合多肽的异多聚体，或编码权利 要求50-52和137-142中任意一项所述的杂合ECD。
60.载体，其包含权利要求59所述的核酸。
61.分离的细胞，其包含权利要求59所述的核酸分子或权利要求60 所述的载体。
62.药物组合物，其包含权利要求1-58、95-99、101、102、104、105、 106和117-152中任意一项所述的多聚体、异多聚体嵌合多肽或多肽或权利 要求59所述的核酸分子或权利要求61所述的细胞。
63.权利要求59所述的药物组合物，其制剂为用于单剂量施用。
64.药物组合物，其制剂为用于局限施用、局部施用或全身施用。
65.治疗癌症、炎性疾病、血管生成病或过度增生疾病的方法，包括 施用治疗有效量的权利要求62-64中任意一项所述的药物组合物。
66.权利要求65所述的方法，其中所述的癌症是胰癌、胃癌、头颈癌、 宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌、 子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌、肾癌或乳腺癌。
67.权利要求65所述的方法，其中所述的疾病是增生疾病。
68.权利要求67所述的方法，其中所述的增生疾病包括平滑肌细胞的 增殖和/或移行，或是前眼疾病，或是糖尿病性视网膜病变或银屑病。
69.权利要求65所述的方法，其中所述的疾病是再狭窄、眼病、狭窄、 动脉粥样硬化、因血管增厚所致的高血压、膀胱病和阻塞性呼吸道疾病。
70.用于治疗癌症的方法，包括：
施用权利要求62-64中任意一项所述的药物组合物和另一种抗癌剂。
71.权利要求70所述的方法，其中所述的抗癌剂是放射疗法和/或化疗 药。
72.权利要求70所述的方法，其中所述的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂 或抗体。
73.权利要求72所述的方法，其中所述的抗癌剂是喹唑啉激酶抑制剂、 反义或siRNA或其它双链RNA分子，或与HER受体相互作用的抗体、 与放射性核素或细胞毒素缀合的抗体。
74.权利要求73所述的方法，其中所述的抗癌剂是吉非替尼、拉帕替 尼、帕尼单抗、埃罗替尼、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、伊马替尼、铂配合 物或核苷类似物。
75.治疗HER受体介导的疾病的方法，包括：
测试患有所述疾病的受试者，以鉴定哪些HER受体被表达或过量表 达；和
基于所述结果，选择靶向至少两个HER受体的多聚体。
76.权利要求75所述的方法，其中所述的疾病是癌症。
77.权利要求76所述的方法，其中所述的癌症是胰癌、胃癌、头颈癌、 宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌、 子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌或乳腺癌。
78.多肽，其选自
CSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVT CFGPEADQCVACAHYKDPPF(SEQ ID NO.405)；
和
和SEQ ID NO.54-61，是用于配体结合的靶多肽。
79.用于鉴定与HER受体相互作用的候选分子的方法；
a)使试验分子或其集合与基于结构域II和IV或者I和III中参与二聚 化、配体结合和/或束缚作用中任一种作用的区域的至少约6个氨基酸或6 个氨基酸至约50个氨基酸或50个氨基酸的多肽接触；和
b)鉴定并选择与一个或多个所述多肽相互作用的任何试验分子。
80.权利要求79所述的方法，其中所述的多肽包含这样的文库，所述 文库是基于HER受体的多肽组合文库。
81.权利要求79所述的方法，其中所述的多肽包含选自以下的一种或 多种多肽：
CSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPF(SEQ ID NO.405)和包含SEQ ID NO.405的6、8、10、12、14、15、18、20、25、30、35、40、45或50 个或更多个氨基酸残基的部分；
在SEQ ID NO.54-61中所示的多肽；和包含其4、5、6、8、10、12个或 更多个氨基酸残基的任一多肽部分。
82.权利要求79所述的方法，其中所述的试验分子包含分子的文库。
83.权利要求82所述的方法，其中所述的分子是小分子有机化合物或 多肽。
84.权利要求80所述的方法，其中所述的文库包含展示在固体支持物 上或在病毒表面的多肽。
85.权利要求84所述的方法，其中所述的多肽包含噬菌体展示文库。
86.权利要求79-85中任意一项所述的方法，其中选择与结构域I和/ 或III，或者与结构域II或与结构域IV结合的试验分子。
87.权利要求86所述的方法，还包括：形成包含两种或多种多肽的异 二聚体，其中一种多肽与结构域II结合并且另一种多肽与结构域IV结合。
88.权利要求79所述的方法，其中所述的试验分子包含噬菌体展示文 库。
89.分离的抗体，其特异性地与权利要求78所述的多肽相互作用。
90.分离的多克隆抗体，其特异性地与权利要求78所述的两种或多种 多肽相互作用。
91.权利要求89或权利要求90所述的分离抗体，其是包含两种不同 多肽的合成性抗体，其中所述的每种多肽与多聚化结构域连接。
92.权利要求91所述的抗体，其中所述的多聚化结构域是选自免疫球 蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋 白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯 基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴的多 肽。
93.权利要求91所述的抗体，其中所述的多聚化结构域是Fc结构域。
94.权利要求93所述的抗体，其中所述的Fc结构域来自IgG、IgM或 IgE。
95.嵌合多肽，其包含：
足够用于配体结合和/或受体二聚化的ECD或其部分；和
多聚化结构域，
其中所述的ECD或其部分选自HER2-530(SEQ ID No.14)、 HER2-595(SEQ ID No.16)、HER2-650(SEQ ID No.18)、HER3-500(SEQ ID No.20)、P85HER3(SEQ ID No.22)、HER3-519(SEQ ID No.24)、 HER3-621(SEQ ID No.26)、HER4-485(SEQ ID No.28)、HER4-522(SEQ ID No.30)、HER4-650(SEQ ID No.32)、如SEQ ID No.414的第25-645位氨基 酸所示的HER1ECE、在SEQ ID NO.32、34、127、141、146、148、159 和54-125的任一项中所示的多肽，以及任一前述ECD的等位变体和物种 变体。
96.异多聚体，包含两种或多种嵌合多肽，其中：
ECD选自足够用于配体结合和/或受体二聚化的在SEQ ID No.10中所 示的HER1-501和SEQ ID No.12中所示的HER1-621或其部分、权利要求 95所述的嵌合多肽、以及任一前述多肽的等位变体或物种变体；并且
每一种嵌合多肽均直接地或经接头间接地与多聚化结构域连接。
97.权利要求95所述的嵌合多肽或权利要求96所述的异多聚体，其 中所述的多聚化结构域是选自免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补 性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个 分子之间形成分子间二硫键的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似 大小的入空穴突起和补偿性空穴的多肽，由此所述嵌合多肽以背靠背式构 型相互作用，从而两种嵌合多肽的ECD可用于与细胞表面受体的二聚化。
98.权利要求97所述的嵌合多肽或异多聚体，其中所述的多聚化结构 域是Fc结构域。
99.权利要求98所述的嵌合多肽或异多聚体，其中所述的Fc结构域 来自IgG、IgM或IgE。
100.分离的多肽，包含如SEQ ID NO.127、141、146、148、153、155、 157、159、297和299中任一项所示的氨基酸残基。
101.嵌合多肽，包含权利要求100所述的多肽和权利要求151或权利 要求152所述的多聚化结构域或多肽。
102.异多聚体，其包含权利要求101所述的嵌合多肽。
103.权利要求102所述的异多聚体，其包含第二多肽，所述第二多肽 是足够用于配体结合和/或受体二聚化的HER ECD或其部分。
104.权利要求39所述的异多聚体，其中所述两种ECD均是HER ECD。
105.权利要求17所述的多聚体，其中所述的内含子融合蛋白是赫斯 达汀或其变体。
106.权利要求1-25中任意一项所述的多聚体，其包含至少两个嵌合多 肽。
107.嵌合多肽，包含与多聚化结构域连接的HER1受体的ECD或其部 分，其中：
所述ECD或其部分包含修饰，从而与未修饰的ECD或其部分相比较， 该ECD与额外的配体结合。
108.嵌合多肽，包含与多聚化结构域连接的SEQ ID No.114的第25-645 位氨基酸的全部或部分、或者与之具有至少约70、80、90、95％序列同一 性的序列，但是所述序列在对应于SEQ ID No.114第442位的位置处包含 Ser至Phe的突变。
109.权利要求107或108所述的嵌合多肽，其中所述的多聚化结构域 选自免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、 相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键 的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性 空穴。
110.利要求107-109中任意一项所述的嵌合多肽权，其中所述的多聚 化结构域是实现多聚化的Fc结构域或其变体。
111.权利要求110所述的嵌合多肽，其中所述的Fc结构域来自IgG、 IgM或IgE。
112.权利要求107-111中任意一项所述的嵌合多肽，其中所述的ECD 来自HER1受体。
113.权利要求107-112中任意一项所述的嵌合多肽，其中所述的修饰对 应于在HER受体的S442位置或相应位置处的修饰。
114.权利要求113所述的嵌合多肽，其中所述的修饰位于HER1受体 的ECD中，从而该HER1ECD与NRG-2β相互作用。
115.权利要求114所述的多聚体，其中所述的修饰是或对应于Seq.ID No.2中的S442F。
116.权利要求107-115中任意一项所述的嵌合多肽，其包含经修饰的 HER1的ECD的足够部分以与EGF和NRG-2β相互作用。
117.权利要求1-14中任意一项所述的多聚体，其中：
所述的ECD是经修饰的ECD；
与未修饰的ECD或全长受体相比较，所述的修饰改变该ECD或含有 此ECD的全长受体的配体结合作用或其它活性。
118.权利要求1-14中任意一项所述的多聚体，其中：
所述的ECD没有进行旨在改变配体结合作用或其它活性的修饰。
119.权利要求15所述的多聚体，其中所述的修饰改变配体结合作用。
120.权利要求119所述的多聚体，其中所述的修饰对应于HER受体 的S442位置或相应位置处的修饰。
121.权利要求120所述的多聚体，其中所述的修饰位于HER1受体的 ECD中，从而HER1ECD与NRG-2β相互作用。
122.权利要求121所述的多聚体，其中所述的修饰是或对应于Seq.ID No.2中的S442F。
123.权利要求117-122中任意一项所述的多聚体，其包含来自HER1 和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的多聚体与至少两种 HER受体的配体相互作用。
124.权利要求117-122中任意一项所述的多聚体，其包含来自HER1 和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的多聚体与至少三种 HER受体的配体相互作用。
125.权利要求117-124中任意一项所述的多聚体，其是二聚体。
126.权利要求117-125中任意一项所述的多聚体，其包含Fc多聚化 结构域。
127.权利要求39所述的异多聚体，其中来自ECD的结构域或其部分 在所述结构域中含有改变配体结合作用或特异性的突变；与未修饰的ECD 或全长受体相比较，所述突变改变该ECD或含有此ECD的全长受体的配 体结合作用或其它活性，从而该异多聚体显示改变的配体结合作用或特异 性。
128.权利要求127所述的异多聚体，其中所述的修饰改变配体结合作 用。
129.权利要求128所述的异多聚体，其中所述的修饰对应于HER受 体的S442位置或相应位置处的修饰。
130.权利要求129所述的异多聚体，其中所述的修饰位于HER1受体 的ECD中，从而该HER1ECD与NRG-2β相互作用。
131.权利要求130所述的异多聚体，其中所述的修饰是或对应于 S442F。
132.权利要求127-131中任意一项所述的异多聚体，其包含来自 HER1和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的ECD能够与 至少两种HER受体的配体相互作用。
133.权利要求127-132中任意一项所述的异多聚体，其包含来自HER1 和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的杂合体能够与至少 三种HER受体的配体相互作用。
134.权利要求127-133中任意一项所述的异多聚体，其包含Fc多聚 化结构域。
135.权利要求50所述的杂合ECD，包含来自ECD的结构域或其部 分，其中所述的ECD在所述结构域中含有改变配体结合作用或特异性的 突变；
与未修饰的ECD或全长受体相比较，所述突变改变该ECD或含有该 ECD的全长受体的配体结合作用或其它活性，其中该杂合ECD显示改变 的配体结合作用或特异性。
136.权利要求135所述的杂合ECD，其中所述的修饰改变配体结合 作用。
137.权利要求136所述的杂合ECD，其中所述的修饰对应于HER受 体的S442位置或相应位置处的修饰。
138.权利要求137所述的杂合ECD，其中所述的修饰位于HER1受 体的ECD中，从而该HER1ECD与NRG-2β相互作用。
139.权利要求138所述的杂合ECD，其中所述的修饰是或对应于 S442F。
140.权利要求135-139中任意一项所述的杂合ECD，其包含来自 HER1和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的ECD能够与 至少两种HER受体的配体相互作用。
141.权利要求135-139中任意一项所述的杂合ECD，其包含来自 HER1和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的杂合体能够 与至少三种HER受体的配体相互作用。
142.权利要求135-141中任意一项所述的杂合ECD，其包含Fc多聚 化结构域。
143.权利要求58所述的异多聚体，其中来自ECD的结构域或其部分 在该结构域中含有改变配体结合作用或特异性的突变；
与未修饰的ECD或全长受体相比较，所述突变改变该ECD或含有此 ECD的全长受体的配体结合作用或其它活性，从而该异多聚体显示改变的 配体结合作用或特异性。
144.权利要求143所述的异多聚体，其中所述的修饰改变配体结合作 用。
145.权利要求144所述的异多聚体，其中所述的修饰对应于HER受 体的S442位置或相应位置处的修饰。
146.权利要求145所述的异多聚体，其中所述的修饰位于HER1受体 的ECD中，从而该HER1ECD与NRG-2β相互作用。
147.权利要求146所述的异多聚体，其中所述的修饰是或对应于 S442F。
148.权利要求143-147中任意一项所述的异多聚体，包含来自HER1 和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的ECD能够与至少两 种HER受体的配体相互作用。
149.权利要求143-148中任意一项所述的异多聚体，包含来自HER1 和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的杂合体能够与至少 三种HER受体的配体相互作用。
150.权利要求143-149中任意一项所述的异多聚体，其包含Fc多聚 化结构域。
151.嵌合多肽，其包含多聚化结构域，该多聚化结构域直接地或经接 头间接地与如SEQ ID No.414的第25-645位氨基酸所示的多肽或其部分连 接，其中所述的多肽或其部分足以实现与至少2种不同配体的配体结合作 用。
152.权利要求151所述的多肽，其中所述的多聚化结构域选自免疫球 蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋 白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯 基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴，从 而所述嵌合多肽以背靠背式构型相互作用，从而两个嵌合多肽的ECD均 能够用于与细胞表面受体的二聚化。
153.组合物，包含异多聚体和同多聚体的混合物，其中所述的异多聚 体包含来自HER1的一种ECD或其部分和来自HER3的另一种ECD或其 部分，并且其中所述的同多聚体包含来自HER1的ECD或其部分，或者 来自HER3的ECD或其部分。
154.药物组合物，其包含制剂为用于局部、口服、全身或局限施用的 权利要求153所述的组合物。
155.用于治疗癌症、炎性疾病、血管生成病或过度增生疾病的方法， 包括施用治疗有效量的权利要求153或154所述的组合物。
156.权利要求155所述的方法，其中所述的癌症是胰癌、胃癌、头颈 癌、宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢 癌、子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌、肾癌或乳腺癌。
157.权利要求155所述的方法，其中所述的疾病是增生疾病。
158.权利要求157所述的方法，其中所述的增生疾病包括平滑肌细胞 的增殖和/或移行，或是前眼疾病，或是糖尿病性视网膜病变或银屑病。
159.权利要求155所述的方法，其中所述的疾病是再狭窄、眼病、狭 窄、动脉粥样硬化、因血管增厚所致的高血压、膀胱病和阻塞性呼吸道疾 病。
相关申请
[0001]本专利申请要求2006年6月12日提交的美国临时申请系列号 60/813,260、2006年9月29日提交的美国临时申请系列号60/848,542和 2007年1月5日提交的美国临时申请系列号60/848,941的优先权。
[0003]本发明提供了泛细胞表面受体(pan-cell surface receptor)特异 的治疗剂，包括泛HER(pan-HER)特异的治疗剂，以及制备和使用它们 的方法。
发明背景
[0004]细胞信号传导途径涉及相互作用以传递胞外、胞间及胞内信号 的分子(包括多肽和小分子)的网络。此类途径相互作用，将信号从信号传 导途径的一个成员传递至下一成员。对信号传导途径中一个成员的调节可 以通过信号转导途径加以传递，导致调节其它的途径成员的活性并产生这 样的信号转导的调节后果，如影响表型及细胞或机体对信号的应答。疾病 和病症可以涉及对信号转导途径调节作用的调节异常(misregulated)或改 变。药物开发的一个目的是靶向此类调节异常的途径以在信号转导途径中 恢复更正常的调节。
[0005]受体酪氨酸激酶(RTKs)是属于参与多种信号转导途径的多肽中 的细胞信号分子家族。RTKs在多种细胞过程中(包括胚胎发生、细胞分裂、 增殖、分化、移行和代谢)发挥作用。RTKs可以被配体激活。此类激活接 下来通常导致受体二聚化或寡聚化作为后续活化信号传导途径的条件。信 号传导途径的活化，诸如通过例如激活第二信使而引发自分泌细胞信号传 导途径或旁分泌细胞信号传导途径，导致特异性生物学效应。针对RTKs 的配体特异性结合至关联受体(cognate receptor)。
[0006]RTKs也参与众多疾病过程或在其中发挥作用，所述的疾病过程 包括癌症、自身免疫病和其它慢性病(见，例如，Hynes(2005)Nature Reviews Cancer 5：341-35)。其中RTKs已经牵连其中的癌症包括乳腺癌和 结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和中胚层衍生性肿瘤(mesodermal-derived tumor)。已经在几种癌症中注意到RTKs的调节异常。例如，乳腺癌可 能与p185-HER2的放大表达相关。RTKs也与眼部疾病相关，包括糖尿病 性视网膜病变和黄斑变性。RTKs也与参与血管生成(包括生理性血管形成 和肿瘤血管形成)的调节途径相关。RTKs还参与细胞增殖、移行和存活的 调节。
[0007]在与疾病相关的RTKs中，有HER(人EGFR家族，又称作ErbB 或EGFR)受体家族(见，例如，Hynes等(2005)Nature Reviews Cancer 5：341-354对其在癌症作用的讨论)。这些受体(称作I类受体)包括 HER1/EGFR、HER2、HER3和HER4。命名变化是：HER1也称作EGFR 和ERBB1；HER2也称作ERBB2和NEU；HER3也称为ERBB3；并且 HER4也称作ERBB4。这个家族的全部成员具有胞外配体结合区、单一的 跨膜区和含有胞质酪氨酸激酶的结构域。HERs表达在上皮、间充质和神 经元起源的多种组织中。
[0008]在正常生理条件下，HERs的激活受其配体的时空表达控制，其 中所述的配体是生长因子中的EGF家族成员。配体的结合诱导形成受体同 二聚体和异二聚体，这导致内在激酶结构域激活，造成在胞质尾中特定酪 氨酸残基上的磷酸化，这最终导致胞内信号传导途径激活。
[0009]已经证实这些受体中的每一种受体均在癌症中发挥作用(见，例 如，Slamon等人(1989)Science 244：707-712；Bazley等人(2005)Endocr. Relat.Cancer Jul12 Suppl.1：S17-S27)。例如，HER1(ErbB1)和 HER2(ErbB2)参与多种人类癌症的发展和病理学；并且这些受体中的改变 与蔓延更迅速的疾病和伴随不良临床后果的疾病相关。下表总结了HER 受体家族成员及其关联配体在某些癌中的作用。
＊Yarden等(2001)Mol.Cell.Biol.，2：127
＊Yarden等(2001)Mol.Cell.Biol.，2：127
[0010]因HER受体在癌及其它疾病中的作用，故HER受体成为治疗 靶。存在两类抗HER治疗剂：靶向在本文中称作ECD的胞外结构域(或 胞外域(ectodomain))的抗体；和小分子酪氨酸激酶抑制剂。抗HER药物 显示有限的效力和有限的应答持续时间。例如，赫赛(曲 妥珠单抗(Trastuzimab))是鼠单克隆抗体的人源化形式并且靶向HER2的 胞外结构域。有效性需要HER2的高表达(至少3倍至5倍过量表达)。因 此，低于25％的乳腺癌患者满足接受治疗的条件。在该群体中，庞大比例 的患者对治疗无应答(Piccart-Gebhart等2005；Romond等2005)。此外， 小分子酪氨酸激酶抑制剂往往缺乏特异性。因此，除了用赫赛汀联合化学 疗法治疗高度表达HER2的预选患者外，用单一靶向的抗HER剂、抗体 或小分子酪氨酸激酶抑制剂所观察到的效力是10-15％。
[0011]因为可用疗法的有限有效性，故仍需要开发用于对付这些靶的 备选策略。因此，属于本文目标的是提供用于靶向HER受体家族的备选 策略，包括提供比抗HER抗体和小分子更有效的治疗剂。发明简述
[0013]本文中提供治疗剂和候选治疗剂和用于鉴定或发现候选治疗剂 的方法。本发明提供使用此类治疗剂的治疗方法。所述治疗剂设计为泛细 胞表面受体治疗剂，因为它们特异性地靶向多于一种细胞表面受体，如通 过与针对一种或多种受体的配体结合和/或与一种或多种细胞表面受体相 互作用，只要多于一种细胞表面受体的活性受到调节。所述治疗剂包括靶 向多于一种HER受体的那些治疗剂和靶向一种或多种HER受体及其它受 体(如有助于或参与抗HER疗法耐药性发展的HER受体)的那些治疗剂。 在具体实施方案中，设计所述治疗剂和候选治疗剂旨在解决如此问题，包 括有限效力、发生耐药性与限制抗HER治疗剂有效性相关的问题。
[0014]本文中提供两种细胞表面受体的胞外结构域(ECD)或其部分的 多聚体。该多聚体的组分包括第一ECD多肽和第二ECD多肽，其中第一 和第二多肽直接地或经接头间接地分别与多聚化结构域连接。在文中提供 的多聚体中，第一嵌合多肽可以是HER1的全长ECD；或第一嵌合多肽可 以含有HER1、HER2、HER3或HER4的小于全长的ECD，其中该ECD 部分至少含有亚结构域I和III的足够部分以与HER受体的配体结合，以 及ECD与细胞表面受体二聚化的足够部分，其包括亚结构域II的足够部 分，如果ECD的全部或部分不是来自HER2的话，在ECD的全部或部分 来自HER2的这种情况下，结构域IV的至少部分，通常结构域IV的模块 (modules)2-5的足够部分必须存在以实现HER2ECD的二聚化。所述 多肽的第二组分是第二嵌合多肽，其至少含有细胞表面受体(CSR)的ECD 的足够部分以与配体结合和/或与细胞表面受体二聚化。第二嵌合多肽的 CSR可以是任何ECD或其部分或是想要的CSR。然而，若第一嵌合多肽 是全长HER1ECD，则第二嵌合多肽不能是全长HER2，尽管全长HER1 可以与截短的HER2组合，只要所述截短的HER2含有结构域IV的足够 部分以实现二聚化即可。第一和第二嵌合ECD多肽通过它们的多聚化结 构域的相互作用而形成多聚体。与第一嵌合多肽或其同二聚体相比时，本 文提供的所得多聚体与额外的配体结合和/或与除第一嵌合多肽或其同二 聚体之外还与更多种细胞表面受体二聚化。
[0015]在其它多聚体中，ECD结构域或其部分的至少之一者包括突变， 其中与缺少该突变的形式相比，所述的突变改变配体结合作用或其它活性。 在此类多聚体中，第二ECD部分可以是相同的ECD结构域、野生型或突 变形式，或可以是来自任何其它细胞表面受体的ECD。如上文，每一单体 的ECD或其部分直接或经接头地与多聚化结构域连接或与第二ECD或其 部分连接。此类多聚体的示例是含有至少一种HER1ECD的多聚体，其中 所述的HER1ECD在亚结构域III中含有这样的突变，其增加对除EGF 之外的配体的亲和力。亲和力的这种增加是至少10倍，一般100、1000、 104、105、106或更多倍。
[0016]尤其，也提供含有修饰的ECD(如其配体结合亲和力被改变的一 个ECD或多个ECD)的多聚体。例如，受EGF激活而通常不受NRG-2β 刺激的EGFR1已经经过如此修饰，从而这两种配体与EGFR ECD相互作 用以促进受体二聚化/受体信号作用(见，Gilmore等(2006)Biochem J. 396：79-88，该作者证实NRG2β是比野生型更有力的EFGR突变体的刺激 物)。示例性修饰的EGFR(即EGFR-S442F)的序列在SEQ ID No.414中描 述，其中ECD在第25位氨基酸处开始。可以在本文所提供的多聚体中以 及在本文所提供的嵌合体和其它泛细胞表面治疗剂中使用这样的 ECD(SEQ ID No.414的25-645；当谈及包括最初25个氨基酸信号序列的 ECD序列时，所述修饰的位置在基因座442处；并且当谈及成熟形式时， 所述修饰的位置在基因座418处)或其部分或其等位变体或物种变体的相应 部分，其含有结构域I-III的至少足够部分以与EGFR1和NRG-2β结合(或 修饰的结构域III的至少足够部分以与NRG-2β结合)。可以修饰本文所提 供的或本领域技术人员已知的ECD以改变配体结合特异性，如具有与所 例举的修饰相应的修饰。来自EGFR-S442F及来自其它ECD中的ECD， 尤其当与多聚化结构域(如Fc结构域)连接时，可以用作泛细胞表面受体治 疗剂，其中所述的其它ECD为经修饰的与对不同ECD特异的配体相互作 用的ECD。这些修饰的ECD可以在本文中所述的全部实施方案中使用。 因此，本文中提供与至少两种配体相互作用的、受体的经修饰ECD的同 多聚体(homo-multimer)，其中每种配体与不同的野生型ECD相互作用。
[0017]本文提供的多聚体可以是这样一种多聚体，其中第一和第二嵌 合多肽之一者或这二者的ECD是这样的杂合ECD，其含有来自至少2种 不同细胞表面受体ECD的亚结构域。本文中还包括这样的多聚体，其中 第一嵌合多肽可以含有HER2、HER3或HER4的小于全长的ECD。最经 常地，第一嵌合多肽含有HER3或HER4的小于全长的ECD。
[0018]此外，本文所提供多聚体中的第二多肽的ECD部分包括那些 ECD部分，其中所述第二多肽的ECD部分不是HER1，但含有另一种CSR 的ECD的全部或部分。在一些情况下，其它ECD部分包括其中第二嵌合 多肽的ECD结构域来自HER3或HER4的那些ECD部分。
[0019]在本文提供的ECD多聚体中也包括那些ECD多聚体，其中第 二嵌合多肽包括作为全长ECD的ECD多肽。或者，第二嵌合多肽的ECD 结构域是截短的并且至少含有亚结构域I、II和III的足够部分以与其配体 结合和与细胞表面受体二聚化。在一些情况下，第二嵌合多肽的截短ECD 结构域包括结构域I和III的足够部分以结合配体。在其它情况下，第二嵌 合多肽的截短ECD结构域包括该ECD的足够部分以与细胞表面受体二聚 化。
[0020]还包括含有这样的ECD结构域的多聚体，其中与未修饰的ECD 或全长受体相比较，修饰了所述的ECD结构域以改变该ECD或含有该 ECD的全长受体的配体结合作用或其它活性。改变包括消除或添加配体结 合作用。例如，与未修饰ECD相比，可以修饰该ECD以与额外的配体结 合。这种修饰包括修饰S442(例如，SEQ ID.No.2)或HER受体的相应位置， 从而该ECD结合至HER3的配体(如NRG-2β)以及HER1的配体(如EGF)。
[0021]这些多聚体可以包括来自HER1和来自HER3或HER4的ECD 或其部分，从而所得的多聚体与至少两种、三种、四种、五种、六种或七 种HER受体的配体相互作用。所述多聚体中包括二聚体。多聚化结构域 包括本领域技术人员已知的任何多聚化结构域，包括上文或下文列出的任 何多聚化结构域，如Fc结构域或其变体。
[0022]本文提供的多聚体中的第一和第二多肽的多聚化结构域包括来 自免疫球蛋白恒定结构域(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水 区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二 硫键的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起 (proturberance-into-cavity)和补偿性空穴(compensatory cavity)当中 的任何多聚化结构域。在一些实施方案中，所述多聚化结构域是实现多聚 化的Fc结构域或其变体。Fc结构域可以来自任何免疫球蛋白分子，包括 来自IgG、IgM或IgE。
[0023]通常，对于本文提供的多聚体，由其衍生第二嵌合多肽和/或由 其二聚化产生多聚体的细胞表面受体(CSR)或细胞表面蛋白是针对该多聚 体的ECD或其部分的关联受体。CSR的实例包括HER2、HER3、HER4、 IGF1-R、VEGFR、FGFR、TNFR、PDGFR、MET、Tie(即Tie-1或 TEK(Tie-2))、RAGE、Eph受体和T细胞受体。在一些实施方案中，第二 嵌合多肽的ECD来自VEGFR1、FGFR2、FGFR4、IGF1-R或Tie1。在 其它情况下，第二嵌合多肽的ECD或其部分是直接地或经接头间接地与 多聚化结构域连接的内含子融合蛋白(intron fusion protein)。在一些情况 下，该内含子融合蛋白是赫斯达汀(Herstain)。在一个方面，本文提供的多 聚体与至少7个不同配体结合。在一些实施方案中，本文所提供多聚体的 第二嵌合多肽是另一种受体酪氨酸激酶(RTK)，其不是HER1的ECD的 全部或部分。
[0024]此种ECD多聚体可以与任意HER配体即EGF、TGF-α、双调 蛋白、HB-EGF、β-动物纤维素、表皮调节素和与除HER1之外的细胞表 面受体的ECD结合的任一其它配体相互作用。例如，所述的其它配体可 以包括神经调节蛋白，如神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋 白-3和神经调节蛋白-4中的任一种。
[0025]在一些实例中，本文提供的多聚体包括如此多肽作为第一嵌合 多肽，该多肽含有i)来自HER1受体的全长ECD，或ii)其部分，所述的全 长ECD或其部分足以结合配体和/或二聚化，并包括HER3或HER4的 ECD的全部或部分作为第二嵌合多肽，所述ECD的全部或部分足以与配 体结合和/或二聚化。
[0026]本文中提供的任意多聚体包括与多聚化结构域连接的组分嵌合 多肽，其中所述的多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定结构域(Fc)、亮氨 酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结 构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯基、和形成稳定多聚体 的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴中的任一种。此类多聚体通 过它们的多聚化结构域的相互作用，以背靠背式构型(back-to-back configuration)取向，在所述的构型中两种嵌合多肽的ECD可用于与细胞 表面受体二聚化。在一个实例中，该多聚化结构域是Fc结构域。Fc结构 域可以来自任何免疫球蛋白分子，如来自IgG、IgM或IgE。
[0027]在本文提供的多聚体当中包括具有至少两种嵌合多肽的那些多 聚体。在一个实例中，多聚体包括具有至少两种嵌合多肽的多聚体，其中 第一嵌合多肽含有HER1的全部或部分并且第二嵌合多肽含有HER3或 HER4的全部或部分。
[0028]在本文提供的多聚体当中也包括其中组分嵌合多肽(constituent chimeric polypeptides)之一是融合多肽的那些多聚体。在一些实施方案中， 第一嵌合多肽和第二嵌合多肽均是融合多肽。在其它实例中，组分嵌合多 肽肽通过化学缀合作用形成。在一个实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌 合多肽这两者均通过化学缀合作用形成。在其它实例中，所述嵌合多肽中 至少之一的多聚化结构域直接与ECD连接。或者，所述嵌合多肽之一的 多聚化结构域经接头与ECD多肽连接。在这种情况的一些实施方案中， 第一和第二嵌合多肽中的每一多肽的多聚化结构域经接头与每一分别的 ECD连接。所述接头可以是化学接头或多肽接头。
[0029]本文提供的多聚体可以是异二聚体。该异二聚体可以是这样的 异二聚体，其中组分嵌合多肽处于背靠背式构型，从而在每种嵌合多肽中 的ECD可用于与细胞表面受体二聚化。
[0030]本文中提供这样的异多聚体，其包括来自一种HER受体(即 HER1、HER2、HER3或HER4)的胞外结构域(ECD)和来自第二受体的 ECD，从而所述ECD中至少之一者是HER ECD并含有ECD的亚结构域 I、II和III及其部分(至少包括模块1)，但不含有亚结构域IV的全部。在 这种异多聚体中，第一和第二受体的ECD是不同的。在一些情况下，第 一和第二受体的ECD均是HER ECD。因此，本文提供的异多聚体包括其 中一种HER是HER1而其余HER是HER3或HER4的异多聚体。在其 它情况下，第二受体的ECD来自细胞表面受体。在所述异多聚体中的第 一或第二受体的ECD的二聚化臂可用于与细胞表面受体的二聚化。
[0031]本文中提供的异多聚体当中包括这些异多聚体，其中每个ECD 直接地或经接头间接地与多聚化结构域连接，从而至少两个ECD的多聚 化结构域相互作用以形成异多聚体。在此异多聚体中的每个ECD的多聚 化结构域包括免疫球蛋白恒定结构域(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、 互补性亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形 成分子间二硫键的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空 穴突起和补偿性空穴中的任一种。在一些实施方案中，所述多聚化结构域 是Fc结构域。该Fc结构域可以来自任何免疫球蛋白分子，包括来自IgG、 IgM或IgE。
[0032]本文提供的异多聚体的第二受体的细胞表面受体(CSR)是针对 作为异多聚体中组分的ECD或其部分的关联受体。CSR的实例包括 HER2、HER3、HER4、IGF1-R、VEGFR、FGFR、TNFR、PDGFR、 MET、Tie(即Tie-1或Tie-2(TEK))、RAGE和EPH受体或T细胞受体。 在一些实施方案中，CSR是任一VEGFR1、FGFR2、FGFR4、IGF1-R或 Tie-1。
[0033]也考虑了这样的异多聚体，其中来自ECD的结构域或其部分在 所述结构域内含有改变配体结合作用或特异性或其它活性的突变。与未修 饰的ECD或全长受体相比，此突变改变该ECD或含有该ECD的全长受 体的配体结合作用或其它活性，从而所述异多聚体显示改变的配体结合作 用或特异性。此类异多聚体的示例是这样的异多聚体，其包括被修饰以与 两种配体(如HER1和HER3配体)结合的HER1ECD。例如，通过用例如 F替换S442修饰HER ECD或修饰HER受体中相应位置改变了配体结合 作用。此类修饰产生与NRG-2β相互作用的HER1ECD。此类异多聚体可 以含有来自HER1和来自HER3或HER4的ECD或其部分，从而所得的 ECD可以与至少两种或更多种如三、四、五、六和七种HER受体的配体 相互作用。
[0034]本文中提供这样的杂合ECD，每一杂合ECD含有一种或多种 CSR的ECD的至少结构域I、II和III的全部或部分，从而至少两个所述 结构域来自不同细胞表面受体的ECD并且所述杂合ECD含有细胞表面受 体的ECD的足够部分(其包括结构域II的足够部分)，旨在所述杂合ECD 与多聚化结构域连接时与细胞表面受体二聚化，和/或含有配体结合结构域 的足够部分，旨在与从中衍生ECD结构域或其部分的ECD的配体相互作 用。在一些实施方案中，所述的细胞表面受体是HER家族的成员。因此， 例如，结构域I来自HER1、结构域II来自HER2并且结构域III来自HER3。 在另一实施方案中，结构域I和III来自在结构域III中含有突变的ECD， 其中所述的突变使结构域III能够与HER3或HER4的配体结合。
[0035]所述杂合ECD包括例如这些杂合ECD，其含有来自如此ECD 的亚结构域或其部分，其中所述的ECD在所述亚结构域中含有改变配体 结合作用或特异性的突变。此类突变的示例是上文和下文所述的那些突变， 如对HER1的修饰，从而修饰的HER1与两种或多种配体(如EGF和 NRG-2β)相互作用。
[0036]本文中也提供了本文所提供杂合ECD的嵌合多肽，其中所述的 杂合ECD直接地或经接头地与多聚化结构域连接。多聚化结构域包括免 疫球蛋白恒定结构域(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、 相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键 的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性 空穴中的任一种。在一些情况下，所述多聚化结构域是Fc结构域。Fc结 构域可以来自任何免疫球蛋白分子，包括来自IgG、IgM或IgE。本文中 提供在本文所提供的至少两个嵌合杂合ECD多肽之间形成的多聚体。
[0037]本文中提供这样的异多聚体，其含有来自HER1的ECD的全部 或部分和来自HER3或HER4的ECD的全部或部分，以至于若所述异多 聚体含有HER1、HER3或HER4的ECD的截短部分，则所述截短部分 至少包括亚结构域I、II和III。
[0038]本文中提供含有与多聚化结构域连接的足够用于配体结合和/或 二聚化的ECD或其部分的嵌合多肽。本文所提供的嵌合多肽的ECD或其 部分可以来自HER2、HER3或HER4ECD中的任一种或其修饰形式。此 类的示例是：HER2-530(SEQ ID NO：14)、HER2-595(SEQ ID NO：16)、 HER2-650(SEQ ID NO：18)、Her3-500(SEQ ID NO：20)、p85Her3(SEQ ID NO：22)、HER3-519(SEQ ID NO：24)、HER3-621(SEQ ID NO：26)、 HER4-485(SEQ ID NO：28)、HER4-522(SEQ ID NO：30)、HER4-650(SEQ ID NO：32)、在任一SEQ ID NO：32、34、127、141、146、159和54-125 中所述的多肽和任意前述ECD的等位变体及物种变体以及其修饰形式， 如被修饰以改变活性的形式(见，例如，SEQ ID No.414的第25-645位残基 或其包括残基442F的部分，其中所述的SEQ ID No.414给出了修饰的 HER1(EGFR1)的序列，其中在442处的S由F替换以产生与NRG2β和 EGF结合的ECD)。也提供这样的异多聚体，其含有来自以下的两种或多 种嵌合多肽：任一HER1-501(SEQ ID NO：10)、HER1-621(SEQ ID NO：12)、 HER1S442F(SEQ ID No.414，第25-645位残基)、或任意前述HER1多肽 中足够用于(针对含有S442F突变的HER1S442F的)配体结合和/或受体二 聚化的部分、HER2-530(SEQ ID NO：14)、HER2-595(SEQ ID NO：16)、 HER2-650(SEQ ID NO：18)、Her3-500(SEQ ID NO：20)、p85Her3(SEQ ID NO：22)、HER3-519(SEQ ID NO：24)、HER3-621(SEQ ID NO：26)、 HER4-485(SEQ ID NO：28)、HER4-522(SEQ ID NO：30)、HER4-650(SEQ ID NO：32)、在任一SEQ ID NO：32、34、127、141、146、159和54-125 中所示的多肽、和任意前述ECD的等位变体及物种变体，其中所述异多 聚体内的ECD或其部分直接地或经接头间接地与多聚化结构域连接。
[0039]提供这样的嵌合多肽，其含有与多聚化结构域连接的HER1受 体的ECD或其部分，如任一上文所列出的那些，其中ECD或其部分包括 修饰，从而与未修饰的ECD或其部分相比，该ECD与额外配体结合。此 类多肽的示例是与多聚化结构域连接的嵌合多肽，该嵌合多肽含有来自 SEQ ID No.414的第25-645位残基的连续氨基酸序列的全部或部分或与之 具有至少约70、80、90、95％序列同一性并且在与SEQ ID No.414的第442 位置相对应的位置处包括改变配体结合作用的突变，如Ser至Phe。对配 体结合作用的改变包括这样的修饰，从而HER1的ECD也与HER3配体(如 NRG-2β)结合。例如，这样的嵌合多肽，其含有多聚化结构域和已修饰 HER1的ECD的足够部分以与EGF和NRG-2β相互作用。
[0040]在多聚体和异多聚体中的嵌合多肽包括含有多聚化结构域的嵌 合多肽，其中所述的多聚化结构域直接地或经接头间接地与SEQ ID No.414的第25-645位氨基酸所示的多肽或其部分连接，其中所述的多肽或 其部分足以实现与至少2种不同配体的配体结合作用。本发明也提供这些 嵌合多肽。
[0041]在一些实施方案中，嵌合多肽或异多聚体的多聚化结构域可以 是免疫球蛋白恒定区(Fc)、亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、 相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键 的游离巯基、和形成稳定二聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性 空穴中的任一种，从而在异多聚体中的嵌合多肽以背靠背式构型相互作用， 由此这两种嵌合多肽的ECD可用于与细胞表面受体的二聚化。在一些情 况下，此多聚化结构域是Fc结构域。Fc结构域可以来自任何免疫球蛋白 分子，包括IgG、IgM或IgE。
[0042]本文中也提供分离的多肽，其含有任一SEQ ID NO：127、141、 146、153、155、157、159、297或299中所示的氨基酸残基序列。这种分 离的多肽可以与多聚化结构域连接以产生嵌合多肽。也提供含有嵌合多肽 的异多聚体，其中所述的嵌合多肽具有任一SEQ ID NO：127、141、146、 153、155、157、159、297或299中所示的氨基酸序列和多聚化结构域的 序列。所述异多聚体可以含有足够用于配体结合和/或受体二聚化的HER ECD或其部分作为第二多肽。
[0043]本文中提供核酸分子，其编码本文所提供的嵌合多肽或在本文 所提供多聚体或异多聚体中的至少一种嵌合多肽，包括本文所提供的杂合 ECD)。本文中提供含有所述核酸分子的载体。也提供含有本文中所述载体 的细胞。
[0044]本文中提供药物组合物，其含有本文中提供的多聚体、异多聚 体或嵌合多肽，或编码性核酸分子。也提供含有分离细胞的药物组合物， 其中所述分离的细胞含有本文提供的核酸或本文提供的载体。在一些实施 方案中，该药物组合物配制用于单次剂量施用。在一些情况下，该药物组 合物也可以配制用于局限(local)、局部(topical)或全身施用。
[0045]本文中提供通过施用本文中所述的任意药物组合物治疗疾病或 病症的方法，所治疗的疾病或病症包括癌症、炎性疾病、血管生成病或过 度增生疾病。癌的示例包括胰腺癌、胃癌、头颈癌、子宫颈癌、肺癌、结 肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质 瘤、膀胱癌、肾癌或乳腺癌。待治疗的疾病中包括增生疾病。增生疾病的 示例包括涉及平滑肌细胞增殖和/或移行的那些增生疾病，或者前眼疾病、 糖尿病性视网膜病变或银屑病。其它待治疗的示例疾病包括再狭窄、眼病、 狭窄、动脉粥样硬化、因血管增厚所致的高血压、膀胱病和阻塞性呼吸道 疾病。其它示例疾病包括与暴露于一种或多种神经调节蛋白(“NRG”)(如 NRG1(包括I、II和III型)、NRG2、NRG3和/或NRG4)相关(例如由其引 起或因其加重)的疾病或病症。NRG相关疾病的实例包括神经学疾病或神 经肌肉病，包括精神分裂症和阿尔茨海默病。
[0046]本文中提供通过施用与另一种抗癌剂联合的本文中所述的任意 药物组合物而治疗癌症的方法。所述抗癌剂包括放射和/或化疗药。在一个 实例中，抗癌剂包括酪氨酸激酶抑制剂或抗体。抗癌剂的示例包括喹唑啉 激酶抑制剂、反义或siRNA或其它双链RNA分子、与HER受体相互作 用的抗体、缀合于放射性核素的抗体、或细胞毒素。其它示例性抗癌剂包 括吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Tykerb)、帕尼单抗(Panitumumab)、埃 罗替尼(Eroltinib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、曲妥珠单抗(Trastuzimab)、 伊马替尼(Imatinib)、铂配合物(platinum complex)或核苷类似物。
[0047]本文中提供治疗HER介导的疾病的方法，包括测试患有所述疾 病的受试者以鉴定哪些HER受体表达或过量表达并且基于该结果，选择 靶向至少一种、一般两种HER受体的多聚体。在一个实施方案中，所述 疾病是癌。癌的示例包括胰腺癌、胃癌、头颈癌、子宫颈癌、肺癌、结肠 直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质瘤、 膀胱癌或乳腺癌。
[0048]本文中提供具有任一在SEQ ID NO：54-125或405中所示氨基 酸序列的多肽。
[0049]本文中提供通过如此方式鉴定与HER受体相互作用的候选治 疗分子的方法，即首先基于结构域II与IV或者I与III内的参与二聚化、 配体结合和/或束缚作用(tethering)中任一作用的区域，使试验分子或其 集合与含有至少约6个氨基酸或6个氨基酸至多到约50个氨基酸或50个 氨基酸的多肽接触，并且随后鉴定并选择与一个或多个所述多肽相互作用 的任何试验分子。在一个实施方案中，在一个文库内包含所述多肽，其中 该文库是基于HER受体的多肽组合文库。试验分子可以与之接触的多肽 示例包括具有任一SEQ ID NO：54-125中所示氨基酸序列的任意多肽、和 具有前述SEQ ID NO的4、5、6、8、10、12个或更多个氨基酸残基的多 肽的任意部分，或SEQ ID NO：405、和具有SEQ ID NO：405的6、8、10、 12、14、15、18、20、25、30、35、40、45个或50个或更多个氨基酸残 基的部分。在分子的文库中存在这些文库，其含有在固体支持物上或病毒 表面上的多肽。在一个实例中，在噬菌体展示文库内包含所述多肽。
[0050]在一个实施方案中，试验分子是分子文库。因此，在一个实例 中，试验分子包括那些在噬菌体展示文库中的分子。在另一个实施方案中， 所述分子是小分子有机化合物或多肽。
[0051]在本文提供的方法中，选择了与结构域I和/或结构域III或与结 构域II或与结构域IV结合的试验分子。在该方法的一个方面，产生了具 有已鉴定的两种或多种多肽试验分子的异二聚体，其中所述异二聚体的一 种肽与结构域II结合并且另一种肽与结构域IV结合。
[0052]本文中提供分离的抗体，其与具有在任一SEQ ID NO：54-125 或405中所示氨基酸序列的任意多肽相互作用。在一个实施方案中，该抗 体是与本文所提供的两种或多种多肽相互作用的多克隆抗体。在一些实例 中，该抗体是receptabody二聚体或多聚体，其含有各自与多聚化结构域 连接的至少2种不同多肽。所述多聚化结构域是免疫球蛋白恒定区(Fc)、 亮氨酸拉链、互补性疏水区、互补性亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作 用结构域、在两个分子之间形成分子间二硫键的游离巯基、和形成稳定多 聚体的相同或相似大小的入空穴突起和补偿性空穴中的任一种。在一个实 例中，此多聚化结构域是Fc结构域。所述Fc结构域可以来自任何免疫球 蛋白分子，如来自IgG、IgM或IgE。
[0053]在所述异多聚体中是这些异多聚体，其中ECD的亚结构域或其 部分在所述结构域内含有改变配体结合作用或特异性或其它活性的突变。 例如，与未修饰的ECD或全长受体相比，此突变改变该ECD或含有该 ECD的全长受体的配体结合作用或其它活性，从而该异多聚体显示改变的 配体结合作用或特异性。此类修饰包括消除或添加或增强某种活性(如与额 外配体结合，如HER1的ECD与HER3的配体(如NRG-2β配体)的相互 作用)的任何修饰。此类修饰的示例是这样的修饰，其对应于在S442位置 处的修饰(如HER1的S442F)或在HER受体的相应位置处的修饰。所得的 ECD与至少两种配体，HER1的配体(如配体EGF)和用于HER3的第二配 体(如NRG-2β)结合或相互作用。
[0054]这些异多聚体可以含有来自HER1和来自HER3或HER4的 ECD或其部分，从而所得的杂合体可以与至少三种HER受体的配体相互 作用。这些异多聚体可以含有多聚化结构域，如本文中所述或本领域技术 人员已知的任何多聚化结构域，如Fc多聚化结构域或其变体(即其T细胞 相互作用受到改变的变体)。
[0055]本发明也提供组合物，其包含异多聚体和同多聚体的混合物， 其中所述的异多聚体包含来自HER1的一种ECD或其部分和来自HER3 的另一种ECD或其部分，并且其中所述的同多聚体包含来自HER1的ECD 或其部分或者来自HER3的ECD或其部分。在一些方面，所述的HER1 部分已经在配体结合作用和/或生物学活性方面受到增强。在其它方面，所 述的HER3部分已经在配体结合作用和/或生物学活性方面受到增强。在又 一个方面，HER1部分和HER3部分均已经在配体结合作用和/或生物学活 性方面受到增强。
[0056]本发明也提供药物组合物，其包含有上文所述的经制剂的用于 局部(topical)、口服、全身或局限(local)施用的组合物。
[0057]在另一个方面，本发明提供用于治疗癌症、炎性疾病、血管生成 病或过度增生疾病的方法，包括施用上文所列出的组合物的治疗有效量。 在一些方面，癌是胰癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子 宫内膜癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌、 肾癌或乳腺癌。在其它方面，所述疾病是增生疾病。在其它方面，所述增 生疾病包括平滑肌细胞的增殖和/或移行或是前眼疾病或是糖尿病性视网 膜病变、或银屑病。在其它方面，所述疾病是再狭窄、眼病、狭窄、动脉 粥样硬化、因血管增厚所致的高血压、膀胱病和阻塞性呼吸道疾病 (obstructive airway diseases)。附图简述
[0058]由于相互作用是动态的，故所示氨基酸位置作为参考和举例。 所示位置反映变动达2，3，4，5个或更多个氨基酸的一系列基因座。变异也 存在于等位变体和物种变体中。本领域技术人员可以通过目视比较或其它 比较法(包括轻易可获得的算法和软件)鉴定相应序列。
[0059]图1(a)描述人EGF受体1(HER1；ErbB1；EGFR)的示意图并 且参照HER1对基因座描述多种特征，但是此类结构在其它家族成员(即 HER2、3、4)中也是保守的。HER(ErbB)家族成员的ECD含有四个亚结 构域，命名为结构域I(L1)、II(S1)、III(L2)和IV(S2)。亚结构域I和III 合作用于配体结合；结构域II含有二聚化所需要的序列(‘二聚化臂’)；并 且结构域IV含有束缚结构域II/IV的序列(HER2例外，其不采取束缚构 象)。在结构域II和IV中二硫键连接的小模块由单个盒代表。显示了结构 域II中的β-发夹/环(又叫做二聚化臂)(对应于全长成熟HER1的第240-260 位氨基酸)。显示了结构域IV中促进束缚的较短β-发夹/环(对应于全长成 熟HER1的第561-569位氨基酸和第572-585位氨基酸)。标出了环区域中 参与受体二聚化和/或束缚作用的某些氨基酸残基。HER全长受体也含有 跨膜结构域(加阴影区)、近膜(JM)结构域、激酶结构域和胞质尾(CT)。
[0060]图1(b)描述了配体诱导的HER二聚化机制。画出了结构域I、 II、III和IV。大部分(约95％)的HER受体以其中结构域II和IV形成分 子内相互作用的束缚构象(tethered conformation)存在，细胞表面上的其 余5％单体状受体处于非束缚构型或开放构型中。配体(E)与HER家族受 体的结构域I和/或III结合。配体结合作用稳定非束缚构象，在此构象中 结构域II内的二聚化臂暴露。结构域II的二聚化臂与另一HER家族受体 的结构域II中的区域相互作用以产生同二聚体和异二聚体。HER受体的 配体结合作用和二聚化诱导内在激酶结构域的激活，导致在胞质尾中特定 酪氨酸残基上的磷酸化和后续的下游信号传导作用。
[0061]图2(a)描述与全长EGFR(NP_005219，对应于SEQ ID NO：2的 第25-1210位氨基酸)的成熟形式(缺少信号序列)相比时的 HER1(EGFR)ECD同工型(isoform)的比对结果和结构域组织形式。所 比对的HER1(EGFR)ECD同工型(缺少信号序列)包括HF100(SEQ ID NO：12)、HF110(SEQ ID NO：10)、HF120(ERRP，SEQ ID NO：34)、HE R1(EGFR)同工型b(NP_958439，对应于SEQ ID NO：12的第25-628位氨 基酸)、HER1(EGFR)同工型c(NP_958440，对应于SEQ ID NO：133的第 25-405位氨基酸)和HER1(EGFR)同工型d(NP_958441，对应于SEQ ID NO：131的第25-705位氨基酸)。结构域I(对应于全长成熟HER1(EGFR) 的第1-165位氨基酸)和结构域III(对应于全长成熟HER1(EGFR)的第 313-481位氨基酸)以粗体显示。结构域II(对应于全长成熟HER1(EGFR) 的第166-312位氨基酸)和结构域IV(对应于全长成熟HER1(EGFR)的第 482-621位氨基酸)以常规字体显示，并突出显示半胱氨酸模块。全长成熟 HER1(EGFR)的非ECD部分以浅灰色显示。与成熟全长HER1(EGFR)中 的氨基酸序列不显示匹配的氨基酸以斜体描述。
[0062]图2(b)描述与全长HER2(AAA75493.1，对应于SEQ ID NO：4 的第23-1255位氨基酸)的成熟形式(缺少信号序列)相比时的HER2ECD同 工型的比对和结构域组织形式。所比对的HER2ECD同工型(缺少信号序 列)包括HF200(SEQ ID NO：18)、ErbB2.1e(对应于SEQ ID NO：137的第 23-633位氨基酸)、HF210(SEQ ID NO：16)、HF220(SEQ ID NO：14)、 ErbB2.1d(对应于SEQ ID NO：136的第25-680位氨基酸)、ErbB2.1f(对应 于SEQ ID NO：138的第23-575位氨基酸)、HER2-int11(对应于SEQ ID NO：141的第23-438位氨基酸)、赫斯达汀(herstatin)(AAD56009，对应 于SEQ ID NO：135的第23-419位氨基酸)和ErbB2.a(对应于SEQ ID NO：139的第23-90位氨基酸)。结构域I(对应于全长成熟HER2的第1-172 位氨基酸)和结构域III(对应于全长成熟HER2的第320-488位氨基酸)以粗 体显示。结构域II(对应于全长成熟HER2的第173-319位氨基酸)和结构 域IV(对应于全长成熟HER2的第489-628位氨基酸)以常规字体显示，并 突出显示半胱氨酸模块。全长成熟HER2(EGFR)的非ECD部分以浅灰色 显示。与成熟全长HER2中的氨基酸序列不显示匹配的氨基酸由斜体描述。
[0063]图2(c)描述与全长HER3(NP_001973.1，对应于SEQ ID NO：6 的第20-1342位氨基酸)的成熟形式(缺少信号序列)相比时的HER3ECD同 工型的比对结果和结构域组织形式。所比对的HER3ECD同工型(缺少信 号序列)包括HF300(SEQ ID NO：26)、HF310(SEQ ID NO：20)、p85HER3(对 应于SEQ ID NO：22的第20-562位氨基酸)、HER3-519(SEQ ID NO：24)、 HER3同工型(AAH02706，对应于SEQ ID NO：143的第20-331位氨基酸)、 HER3-int10(对应于SEQ ID NO：146的第20-403位氨基酸)、p75sHER3(对 应于SEQ ID NO：150的第20-534位氨基酸)、HER3-int11(对应于SEQ ID NO：148的第20-425位氨基酸)、p45sHER3(对应于SEQ ID NO：149的第 20-331位氨基酸)、p50sHER3(对应于SEQ ID NO：151的第20-400位氨基 酸)和HER3同工型2(P21860-2，对应于SEQ ID NO：144的第20-183位 氨基酸)。结构域I(对应于全长成熟HER3的第1-159位氨基酸)和结构域 III(对应于全长成熟HER3的第312-480位氨基酸)以粗体显示。结构域II (对应于全长成熟HER3的第160-311位氨基酸)和结构域IV(对应于全长 成熟HER3的第481-621位氨基酸)以常规字体显示，并突出显示半胱氨酸 模块。全长成熟HER3的非ECD部分以浅灰色显示。与成熟全长HER3 中的氨基酸序列不显示匹配的氨基酸由斜体描述。
[0064]图2(d)描述与HER4(ErbB4)(NP_005226，对应于SEQ ID NO：8 的第26-1308位氨基酸)的成熟形式(缺少信号序列)相比时的 HER4(ErbB4)ECD的比对和结构域组织形式。所比对的ErbB4ECD同工 型(缺少信号序列)包括ErbB4-522(SEQ ID NO：30)、HF400(SEQ ID NO：32)、ErbB4-int11(对应于SEQ ID NO：157的第26-430位氨基酸)、 ErbB4-int12(对应于SEQ ID NO：159的第26-506位氨基酸)、HF410(SEQ ID NO：28)、ErbB4-int9(对应于SEQ ID NO：153的第26-391位氨基酸)和 ErbB4-int10(对应于SEQ ID NO：155的第26-421位氨基酸)。结构域I(对 应于全长成熟ErbB4的第1-163位氨基酸)和结构域III(对应于全长成熟 ErbB4的第309-477位氨基酸)以粗体显示。结构域II(对应于全长成熟 ErbB4的第164-308位氨基酸)和结构域IV(对应于全长成熟ErbB4的第 478-625位氨基酸)以常规字体显示，并突出显示半胱氨酸模块。全长成熟 HER1(EGFR)的非ECD部分以浅灰色显示。与成熟全长ErbB4中的氨基 酸序列不显示匹配的氨基酸由斜体描述。
[0065]图3(a)显示当MDA MB 468细胞用RB200h和酪氨酸激酶抑制 剂AG825处理时观察到的协同性生长抑制效应。
[0066]图3(b)显示当A 431细胞用RB200h和吉非替尼(Gefitinib)(易瑞 沙(Iressa))处理时观察到的协同性生长抑制效应。
[0067]图4显示泛Her配体阱(Pan-Her ligand trap)RB200h的示意图。
[0068]图5显示如通过反相HPLC所分析的HER调蛋白(hermodulin) 构建体(RB600、HFD 100、HDF300和RB200h)的纯度。
[0069]图6a显示工程化二聚体保留对125I-EGF和125I-HRGβ的特异 性：泳道1：HFD100＝HER1-621/Fc、泳道2：HFD200＝HER2-628/Fc、 泳道3：HFD300＝HER3-621/Fc和泳道4：HFD400＝HER4-625/Fc。图6b显示RB200h的工程化二聚体保留对125I-EGF和125I-HRG1β1 的特异性。
[0070]图7a显示与RB200h结合的EU-NRG1β1。
[0071]图7b显示EU-EGF与RB200h结合。
[0072]图7c显示其它HER配体对Eu-EGF结合的竞争。
[0073]图7d显示其它HER配体对Eu-NRG1-b1结合的竞争。
[0074]图8a-c显示RB200h、赫赛汀(Herceptin)或爱必妥(Erbitux) 在A431表皮样癌细胞(A431 epidermoid cancer cell)中抑制EGF配体刺 激的HER家族蛋白磷酸化。
[0075]图8d-f显示RB200h、赫赛汀或爱必妥在A431表皮样癌细胞中 抑制NRG1β1配体刺激的HER家族蛋白磷酸化。
[0076]图9a-c显示RB200h、赫赛汀或爱必妥在ZR-75-1乳腺癌细胞 中抑制EGF配体刺激的HER家族蛋白磷酸化。
[0077]图9d-f显示RB200h、赫赛汀或爱必妥在ZR-75-1乳腺癌细胞 中抑制NRG1β1配体刺激的HER家族蛋白磷酸化。图10a显示RB600比RB200h在抑制由EGF刺激的受体磷酸化方面 更有力。
[0078]图10b显示RB600比RB200h在抑制由NRG1β1刺激的受体磷 酸化方面更有力。
[0079]图11a显示RB200h抑制培养的肿瘤细胞A431细胞增殖。
[0080]图11b显示RB200h抑制培养的肿瘤细胞：MDA-MB-468乳腺 癌细胞。
[0081]图12a-b显示RB200h抑制ZR-75-1(图11a)和A549(图11b)肿 瘤细胞的配体刺激及未刺激的软琼脂集落生长。
[0082]图13a显示RB200h抑制由EGF诱导的配体诱导乳腺癌细胞增 殖。
[0083]图13b显示RB200h抑制由NRG1β1诱导的配体诱导乳腺癌细 胞增殖。
[0084]图13c显示RB200h抑制由LPA诱导的配体诱导乳腺癌细胞增 殖。
[0085]图14a显示RB200h抑制由EGF诱导的SUM149乳腺癌细胞的 配体诱导乳腺癌细胞增殖。
[0086]图14b显示RB200h抑制由LPA诱导的SUM149乳腺癌细胞的 配体诱导乳腺癌细胞增殖。
[0087]图15a-d显示RB200h与酪氨酸激酶抑制剂：AG-825、吉非替 尼、和埃罗替尼(Erlotinib)的协同性生长抑制。
[0088]图16显示RB200h与酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的协同性生长 抑制。
[0089]图17显示RB200h与AG 825酪氨酸激酶抑制剂具有协同性抗 增殖作用。
[0090]图18显示RB200h与易瑞沙在A431表皮癌细胞中产生有力的 协同抗增殖应答。
[0091]图19显示BT474乳腺癌细胞中RB200h与易瑞沙之间的协同作 用。
[0092]图20显示对RB200h在A431皮下模型中的治疗评价。裸小鼠 中皮下A431肿瘤的平均肿瘤体积。在第10日开始给药。与Bonferroni 验后检验组合的两因素方差分析(Two-way ANOVA with Bonferroni′s post test)。在本图中，＊统计显著性表示p＜0.05，＊＊表示p＜0.01，并且＊＊＊表示 p＜0.001。
[0093]图21显示用于通过PCR从HFD100中产生HFD100突变体的 方法示意图。
[0094]图22显示HFD100-T39S对EGF(图22a)、HB-EGF(图22b)，和 TGF-α(图22c)具有增强的亲和力。
[0095]图23显示HFD100突变体对EGF、HB-EGF、和TGF-α的结 合亲和力和相关表达水平。
[0096]图24显示初步毒性研究的平均体重(图A)和终末肿瘤体积(图 B)。
[0097]图25显示裸小鼠中皮下A431肿瘤的平均肿瘤体积。在第10日 开始给药。使用与Bonferroni验后检验组合的两因素方差分析计算统计显 著性＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001。
[0098]图26显示皮下A431肿瘤的平均肿瘤重量。使用单因素方差分 析(One way ANOVA)计算统计显著性。
[0099]图27显示治疗研究期间的小鼠体重。发明详述
A.定义
B.泛细胞表面受体特异的治疗剂
C.HER受体和其它细胞表面受体结构和活性
1.HER1ECD结构和结构域组织形式
2.HER2ECD结构和结构域组织形式
3.HER3ECD结构和结构域组织形式
4.HER4ECD结构和结构域组织形式
5.HER家族配体、配体特异性和配体介导的受体激活。
6.二聚化与束缚以及活性同二聚体和异二聚体的产生
7.HER家族受体活性
a.细胞增殖
b.细胞存活
c.血管生成
d.移行和侵入
8.其它CSR ECD
a.VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR)
b.FGFR1-FGFR4
c.IGF 1R
d.RAGE和其它CSR
D.ECD多聚体的组分和ECD多聚体的形成
1.ECD多肽
a.HER家族全长ECD
i.HER1ECD
ii.HER2ECD
iii.HER3ECD
iv.HER4ECD
b.HER家族截短的ECD
i.截短的HER1ECD
ii.截短的HER2ECD
iii.截短的HER3ECD
iv.截短的HER4ECD
c.杂合ECD
d.其它CSR或RTK ECD或其部分
e.可变剪接的多肽同工型
2.多聚体的形成
a.肽接头
b.异双官能连接剂
c.多肽多聚化结构域
i.免疫球蛋白结构域
(a).Fc结构域
(b).入空穴突起(即隆突和孔洞(knobs and holes))
ii.亮氨酸拉链
(a)fos和jun
(b)GCN4
ii.其它多聚化结构域
(a)R/PKA-AD/AKAP
3嵌合ECD多肽
a.示例性嵌合HER ECD多肽
E.ECD多聚体
a.全长HER1ECD和另一CSR的ECD的全部或部分
b.两个或多个截短的ECD组分
c.杂合ECD多聚体
d.相同或从相同CSR衍生的ECD组分
F.产生编码嵌合ECD多肽融合物的核酸的方法和产生所得的ECD多 聚体
1.合成的基因和多肽
2.克隆和分离ECD多肽的方法
3.产生和克隆ECD多肽嵌合体的方法
4.表达系统
a.原核表达
b.酵母
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
5.转染和转化的方法
6.ECD多肽、嵌合多肽、以及所得ECD多聚体的回收和纯化
G.评估或监测ECD多聚体活性的测定法
1.激酶/磷酸化测定法
2.复合/二聚化
3.配体结合法
4.细胞增殖测定法
5.细胞疾病模型测定法
6.动物模型
H.ECD多聚体和ECD多聚体组合物的制备、制剂和施用
I.用ECD多聚体治疗的示例性方法
1.HER介导的疾病或病症
a.癌
b.血管生成
c.神经调节蛋白相关的疾病
d.平滑肌增殖相关的疾病和病况
2.RTK介导的病症或疾病
a.血管生成相关性眼病
b.血管生成相关性动脉粥样硬化
c.其它的血管生成相关性治疗
d.癌
3.其它CSR介导的疾病或病症
4.选择ECD多聚体的ECD多肽组分
5.患者选择
6.联合疗法
J.用于鉴定、筛选和产生泛HER治疗剂的方法
1.泛HER治疗剂的靶
2.鉴定泛HER治疗剂的筛选方法
a.噬菌体展示
i.肽文库
ii.多聚体多肽(异二聚体肽)
b.示例性筛选测定法
K.实施例
A.定义
A.定义
B.泛细胞表面受体特异的治疗剂
C.HER受体和其它细胞表面受体结构和活性
1.HER1ECD结构和结构域组织形式
2.HER2ECD结构和结构域组织形式
3.HER3ECD结构和结构域组织形式
4.HER4ECD结构和结构域组织形式
5.HER家族配体、配体特异性和配体介导的受体激活。
6.二聚化与束缚以及活性同二聚体和异二聚体的产生
7.HER家族受体活性
a.细胞增殖
b.细胞存活
c.血管生成
d.移行和侵入
8.其它CSR ECD
a.VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR)
b.FGFR1-FGFR4
c.IGF 1R
d.RAGE和其它CSR
D.ECD多聚体的组分和ECD多聚体的形成
1.ECD多肽
a.HER家族全长ECD
i.HER1ECD
ii.HER2ECD
iii.HER3ECD
iv.HER4ECD
b.HER家族截短的ECD
i.截短的HER1ECD
ii.截短的HER2ECD
iii.截短的HER3ECD
iv.截短的HER4ECD
c.杂合ECD
d.其它CSR或RTK ECD或其部分
e.可变剪接的多肽同工型
2.多聚体的形成
a.肽接头
b.异双官能连接剂
c.多肽多聚化结构域
i.免疫球蛋白结构域
(a).Fc结构域
(b).入空穴突起(即隆突和孔洞(knobs and holes))
ii.亮氨酸拉链
(a)fos和jun
(b)GCN4
ii.其它多聚化结构域
(a)R/PKA-AD/AKAP
3嵌合ECD多肽
a.示例性嵌合HER ECD多肽
E.ECD多聚体
a.全长HER1ECD和另一CSR的ECD的全部或部分
b.两个或多个截短的ECD组分
c.杂合ECD多聚体
d.相同或从相同CSR衍生的ECD组分
F.产生编码嵌合ECD多肽融合物的核酸的方法和产生所得的ECD多 聚体
1.合成的基因和多肽
2.克隆和分离ECD多肽的方法
3.产生和克隆ECD多肽嵌合体的方法
4.表达系统
a.原核表达
b.酵母
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
5.转染和转化的方法
6.ECD多肽、嵌合多肽、以及所得ECD多聚体的回收和纯化
G.评估或监测ECD多聚体活性的测定法
1.激酶/磷酸化测定法
2.复合/二聚化
3.配体结合法
4.细胞增殖测定法
5.细胞疾病模型测定法
6.动物模型
H.ECD多聚体和ECD多聚体组合物的制备、制剂和施用
I.用ECD多聚体治疗的示例性方法
1.HER介导的疾病或病症
a.癌
b.血管生成
c.神经调节蛋白相关的疾病
d.平滑肌增殖相关的疾病和病况
2.RTK介导的病症或疾病
a.血管生成相关性眼病
b.血管生成相关性动脉粥样硬化
c.其它的血管生成相关性治疗
d.癌
3.其它CSR介导的疾病或病症
4.选择ECD多聚体的ECD多肽组分
5.患者选择
6.联合疗法
J.用于鉴定、筛选和产生泛HER治疗剂的方法
1.泛HER治疗剂的靶
2.鉴定泛HER治疗剂的筛选方法
a.噬菌体展示
i.肽文库
ii.多聚体多肽(异二聚体肽)
b.示例性筛选测定法
K.实施例
A.定义
[0100]除非另外定义，本文中所用的全部术语和科学术语具有与本发 明所属领域的技术人员通常理解的相同意思。除非另外说明，在本文公开 中通篇提及的全部专利、本专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK 序列、网站和其它公开的材料通过引用的方式全文并入。在本文的术语存 在多种定义的情况下，在本部分中的那些定义是优先的。在参考URL或 其它项目如标识符或地址，应当理解此类标识符可以变化并且互联网上的 具体信息可以往来变换，但是等价信息是已知的并且可以轻易地获得，如 通过检索互联网和/或适宜数据库。对其援引表示此类信息的可用性和公众 普及。
[0101]如本文中所用，“泛细胞表面受体治疗剂”或“泛细胞表面受体特 异的治疗剂”是能调节两种或多种细胞表面受体活性的分子，包括基于肽的 化合物和小分子。
[0102]如本文中所用，“泛HER治疗剂”或“泛HER特异的治疗剂”是 能调节两种或多种HER(ErbB)受体活性的泛细胞表面受体治疗剂(分子， 包括基于肽的化合物和小分子)。通常，泛HER治疗剂靶向至少2种不同 HER受体，如通过配体结合作用和/或与受体的相互作用。
[0103]如本文中所用，抗癌剂包括任何癌症疗法和用于所述疗法的药 物并且包括放射疗法、外科手术、抗癌化合物(包括小分子)、化疗药(如顺 铂和gencytinbine)以及单克隆抗体。
[0104]如本文中所用，细胞表面受体是一种蛋白质，其表达在细胞表 面上并且一般包括跨膜结构域或使它锚定至细胞表面的其它部分。作为受 体，它与介导或参与细胞表面受体活性(如信号转导或配体内化)的配体结 合。细胞表面受体包括但不限于单次跨膜受体和G蛋白偶联受体。受体酪 氨酸激酶，如生长因子受体也属于此类细胞表面受体之列。
[0105]如本文中所用，结构域指多肽的如此部分(具有3个或更多个、 通常5或7个或更多个氨基酸的序列)，该部分是在结构上和/或功能上可 区分或可定义的。例如，结构域包括能够在由一个或多个结构性基序(例如 由环区连接的α螺旋和/或β折叠链的组合)组成的蛋白质中形成独立折叠 结构和/或由功能活性(如激酶活性)识别的那些部分。蛋白质可以具有一个 或多于一个的不同结构域。例如，结构域可以由与相关家族成员的序列同 源性(如定义胞外结构域的同源性和基序)进行鉴定、定义或区分。在另一 个实例中，结构域可以由其功能(如由酶活性(例如激酶活性))或与生物分子 相互作用的能力(如DNA结合、配体结合和二聚化)进行区分。结构域可以 独立地显示功能或活性，从而独立地或与另一分子融合的结构域可以表现 活性，例如蛋白水解活性或配体结合作用。结构域可以是来自多肽的线性 氨基酸序列或非线性氨基酸序列。许多多肽含有多个结构域，例如，在图 1中示出了HER1(EGFR)的结构域结构：其包括ECD、跨膜结构域、近膜 结构域、激酶结构域和羧基端胞质结构域。对于HER1(EGFR)，所述ECD 包括4个亚结构域，称作I(或L1)、II(或S1)、III(或L2)和IV(或S2)。“L” 亚结构域(I和III)参与配体相互作用，II(S1)和IV(S2)结构域经束缚区 (tethering region)相互作用；亚结构域II(S1)包括二聚化环。本领域技 术人员熟悉结构域并且可以借助与其它此类结构域的结构同源性和/或功 能同源性鉴定它们。
[0106]如本文中所用，胞质结构域是参与信号转导的结构域。
[0107]如本文中所用，胞外结构域(ECD)是细胞表面受体的如此部分， 其存在于受体的表面上并且包括配体结合位点。出于本文目的，谈及ECD 时ECD包括含有ECD的任何分子或其部分，只要该ECD多肽不含与关 联受体的另一种结构域(即跨膜结构域、蛋白激酶结构域或其它结构域)相 关的任何连续序列。因此，例如，ECD多肽包括CSR的可变剪接同工型， 其中所述的同工型具有含ECD部分，但是缺少关联CSR的任何其它结构 域，并且还具有与关联CSR的另一种结构域序列不相关或不匹配的额外序 列。这些额外序列可以是编码内含子的序列(intron-encoded sequences)， 如在内含子融合蛋白同工型中出现。通常，所述额外序列不抑制或不干扰 CSR ECD多肽的配体结合作用和/或受体二聚化活性。ECD多肽也包括杂 合ECD。
[0108]如本文中所用，杂合ECD指这样的ECD，其含有来自不同细 胞表面受体的ECD的部分。通常，杂合ECD含有来自不同细胞表面受体 的至少两个ECD亚结构域。
[0109]如本文中所用，嵌合多肽指含有如此部分的多肽，其中所述的 部分来自至少2种不同多肽或单种多肽的两个不邻接部分。因此，嵌合多 肽一般包括来自一种多肽的全部或部分的氨基酸残基序列和来自另一种不 同多肽的全部或部分的氨基酸序列。这两个部分可以直接或间接地连接并 且可以通过强度足以在平衡条件下和生理条件下(如等张pH 7缓冲盐水中) 维持绝大部分所述嵌合多肽的完整性的肽键、其它共价键或其它非共价相 互作用而连接。出于本文目的，嵌合多肽包括这些多肽，其含有直接或间 接与多聚化结构域连接的CSR的ECD部分的全部或部分。嵌合多肽也可 以包括额外序列，例如表位标签。
[0110]如本文中所用，融合构建体指含有来自一个核酸分子的编码序 列和来自另一个核酸分子的编码序列的核酸分子，其中所述的编码序列位 于同一个可读框中，从而该融合构建体在宿主细胞中转录和翻译时，产生 含有两个蛋白质的蛋白质。这两个分子可以在所述构建体中是相邻的或由 含有1、2、3或更多、一般少于10、9、8、7、6个氨基酸的接头多肽隔开。 由融合构建体编码的蛋白质产物称作融合多肽。间隔区可以编码改变该融 合多肽特性(如溶解度或胞内运输)的多肽。
[0111]如本文中所用，融合蛋白指含有来自多于两个蛋白质或肽的两 个或多个直接或经肽键间接连接的部分的嵌合蛋白。
[0112]如本文中所用，多聚化结构域指促进一个多肽分子与含有互补 性多聚化结构域(complementary multimerization domain)的另一个多肽 分子的稳定相互作用的氨基酸序列，其可以是相同或不同的多聚化结构域， 以与第一结构域形成稳定的多聚体。通常，多肽直接或间接地与多聚化结 构域连接。示例的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉 链、疏水区、亲水区、相容性蛋白质-蛋白质相互作用结构域(如，但不限 于PKA的R亚基和锚定结构域(AD))、在两个分子之间形成分子间二硫键 的游离巯基、和形成稳定多聚体的相同或相似大小的入空穴突起(即，入孔 洞的隆突(knobs into holes))和补偿性空穴。此多聚化结构域例如可以是 免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白序列可以是免疫球蛋白恒定结构域，如来 自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD和IgM的Fc结构 域或其部分。
[0113]如本文中所用，“入孔洞的隆突”(也在本文中称作入空穴突起) 指工程化的特定多聚化结构域，从而在此类结构域两者之间和/或在此类结 构域多者之中的空间相互作用不仅促进稳定相互作用，还促进异二聚体(或 多聚体)从单体混合物中优先于同二聚体(或同多聚体)形成。这可以例如通 过构建突起和空穴而实现。可以通过用体积较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸) 替换来自第一多肽界面的小体积氨基酸侧链而构建突起。通过用体积较小 的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大体积氨基酸侧链而任选地在第 二多肽界面上产生对应于所述突起的大小相同或相似的补偿性“空穴”。
[0114]如本文中所用，互补性多聚化结构域指这样的两个或多个多聚 化结构域，它们相互作用以形成与每一此结构域连接的多肽的稳定多聚体。 互补性多聚化结构域可以是相同结构域或结构域家族的成员，如Fc区、亮 氨酸拉链、以及隆突和孔洞)。
[0115]如本文中所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”指这样的多 肽，其含有抗体重链的恒定区，但不包括免疫球蛋白结构域的第一恒定区。 因此，Fc指IgA、IgD和IgE的免疫球蛋白结构域的最后两个恒定区或IgE 和IgM的免疫球蛋白结构域的最后三个恒定区。任选地，Fc结构域可以 包括在这些结构域氨基端的柔性铰链的全部或部分。对于IgA和IgM，Fc 可以包括J链。对于IgG的示例性Fc结构域而言，Fc含有免疫球蛋白结 构域Cγ2和Cγ3，和任选地在Cγ1与Cγ2之间的铰链的全部或部分。Fc 区的边界可以变动，但是通常，包括铰链区的至少一部分。IgG Fc结构域 的示例性序列在SEQ ID NO：167中描述。此外，Fc也包括任何等位变体 或物种变体或任何变异或修饰形式，如改变与FcR的结合作用或改变Fc 介导的效应子功能的任意变体或修饰形式。其它Fc结构域(包括修饰的Fc 结构域)的示例性序列在SEQ ID NO：168或169中描述。
[0116]如本文中所用，“Fc嵌合体”指其中一个或多个多肽直接或间 接与Fc区或其衍生物连接的嵌合多肽。一般，Fc嵌合体组合有免疫球蛋 白的Fc区和另一种多肽(例如ECD多肽)。Fc多肽的衍生物或经修饰的Fc 多肽是本领域技术人员已知的。
[0117]如本文中所用，含有包括ECD部分和多聚化结构域的至少两个 嵌合多肽的多肽也称作“ECD多聚体”(又称作同多聚体或异多聚体或同 二聚体或异二聚体)。在其中多聚化结构域源自抗体或其部分的情况下，此 多肽可以称作免疫黏附素(immunoadhesins)或receptabody二聚体或多 聚体。所述多聚体的组成多肽在本文中也称作嵌合多肽。多聚化结构域与 ECD的连接可以是直接或间接的并且可以使用重组核酸方法以产生融合 蛋白来实现。可以使用化学偶联方法实现连接，如使用异双官能试剂。示 例性偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基 硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(imidoester)的双官能衍生物(如二 亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊 二醛)、双-叠氮化合物(如双-(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如 双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活 性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
[0118]如本文中所用，抗体指具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子， 其中所述的特定氨基酸序列识别对其靶为独特的特定抗原。免疫球蛋白是 结构上显示为“Y”形分子的糖蛋白，所述的分子含有由二硫键连接的(来 自5类重链：γ、δ、α、μ、ε中任一类的)两条相同重链和两条相同轻链。 每条重链具有恒定区(CH)，其对于同一类的全部免疫球蛋白是相同的，和 可变区(VH)，其充当抗原结合位点并且根据抗原特异性而在免疫球蛋白之 间不同。重链γ、δ、α具有由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成的恒定 区并具有铰链区，而重链μ、ε的恒定区由四个结构域(CH1、CH2、CH3、 CH4)组成。轻链具有一个恒定结构域(CL)和一个可变结构域(VL)。出于本 文目的，对抗体的称谓指这样的分子，其含有免疫球蛋白分子的全部或部 分，其含有免疫球蛋白分子的一个或多个结构域。例如，Fab片段是抗体 分子的部分，其由每条重链和每条轻链的一个恒定结构域和一个可变结构 域组成。Fc片段由重链的2-3个恒定结构域和任选地铰链区的全部或部分 (取决于抗体的类)组成。因此，对抗体的称谓指多克隆抗体、单克隆抗体 或含有抗体部分的任何分子，例如receptabody二聚体或多聚体，其中将 两种多肽(即至少两个CSR的ECD或其部分)连接在一起的多聚化结构域 是抗体或其部分(如Fc片段)。
[0119]如本文中所用，单克隆抗体指有高度特异性的抗体，该抗体在 实验室中通过由B细胞与肿瘤细胞融合所致的单个杂交细胞的克隆产生。
[0120]如本文中所用，缀合指两个或多个分子的连接、配对或接合。 例如，相同或不同的两个或多个多肽(或其片段、结构域或活性部分)可以 连接在一起，或多肽(或其片段、结构域或活性部分)可以与合成分子或化 学分子或其它部分连接。两个或多个分子的接合可以通过直接连接(如通过 将编码一个多肽的核酸序列与编码另一个多肽的核酸序列连接)而进行，或 可以是间接的，如通过一个分子与另一个分子的非共价或共价偶联作用。 例如，两个或多个分子或多肽的缀合可以通过化学连接实现。
[0121]如本文中所用，“标签”或“表位标签”指通常添加至多肽氨基端 或羧基端的氨基酸序列。包含与多肽融合的标签可以利于多肽纯化和/或检 测。通常，标签或标签多肽指这样的多肽，其具有足够残基以提供被抗体 识别的表位或可以服务于检测或纯化，不过是足够短的，从而它不干扰与 之连接的嵌合多肽的活性。标签多肽一般是足够独特的，从而与标签多肽 特异性结合的抗体基本上不与连接于该标签多肽的多肽中的表位交叉反 应。合适的标签多肽通常具有至少5个或6个氨基酸残基，并且一般具有 约8-50个氨基酸残基，常见具有9-30残基。标签可以与多聚体中的一个 或多个嵌合多肽连接并且允许检测或从样本或混合物中回收此多聚体。此 类标签是熟知的并且可以轻易地合成和设计。示例性标签多肽包括用于亲 和纯化的那些标签多肽并且包括His标签、流感血凝素(HA)标签多肽及其 抗体12CA5(Field等(1988)Mol Cell.Biol.5：2159-2165)；c-myc标签及其 8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(见，例如，Evan等(1985)Molecular and Cellular Biology 5：3610-3616)和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其 抗体(Paborsky等(1990)Protein Engineering5：547-553(1990)。
[0122]如本文中所用，融合标签多肽指含有与标签多肽融合的ECD多 肽的嵌合多肽。
[0123]如本文中所用，束缚作用指受体单体的两个结构域之间的相互 作用，从而该单体以使其较不易用于相互作用的构象存在。例如，亚结构 域II(S1)可以与HER1、HER3和HER4中的亚结构域IV(S2)结构域相互 作用，形成受束缚的无活性结构。当处于束缚状态时，受体或其同工型更 难用于或不可用于二聚化和/或受体结合。单体形式的HER1、HER3和 HER4的ECD以束缚形式存在，从而显示比非束缚形式更低的配体亲和 力。在亚结构域IV中缺少某些残基的HER2以非束缚形式存在并且可用 于与HER1、HER3和HER4的二聚化。在配体与束缚(单体)的形式结合 后，这种束缚性相互作用被释放并且该ECD(或受体)处在可用于二聚化的 构象，其涉及在两个ECD的结构域II之间的相互作用。
[0124]如本文中所用，本文中提及调节CSR或HER受体的活性，意 指这种受体的任何活性(如配体结合作用或其它信号转导相关活性)被改 变。
[0125]如本文中所用，背靠背式构型指两个ECD如此构型，从而每个 ECD可用于与细胞表面受体的二聚化。在处于背靠背式构型时，含有多聚 化结构域的嵌合多肽的每个ECD部分在形成ECD多聚体后如此取向，从 而每个ECD或其部分可用于与细胞表面受体的二聚化。
[0126]如本文中所用，谈及两个嵌合多肽时的二聚体和二聚化意指这 两个嵌合多肽之间的相互作用。当适度二聚化时，在每一嵌合多肽或所述 嵌合多肽至少之一中的ECD可用于与细胞表面受体的二聚化。
[0127]如本文中所用，“与细胞表面受体的二聚化”指细胞表面受体 与本文所提供多聚体中的ECD或与另一种细胞表面受体的相互作用。本 语言所指的“二聚体”或“二聚化”将从上下文中是显而易见的。
[0128]如本文中所用，“包含结构域的多肽”指这样的多肽，其含有 关于关联受体的相应结构域的完整结构域。该完整结构域参考关联多肽内 的所述特定结构域的定义而确定。例如，包含结构域的受体同工型指这样 的同工型，其含有与关联受体中发现的完整结构域相应的结构域。若关联 受体例如含有在第400-420位氨基酸位置之间的21个氨基酸跨膜结构域， 则包含这种跨膜结构域的受体同工型含有与关联受体的这21个氨基酸结 构域具有实质同一性的21个氨基酸结构域。实质同一性指与关联受体的结 构域相比时，可以含有等位变异和保守替换的结构域。与关联受体的结构 域相比时，实质上相同的结构域不具有氨基酸的缺失、非保守性替换或插 入。
[0129]如本文中所用，等位变体或等位变异指由与基因的参照形式不 同的基因所编码(即由等位基因编码)的多肽。一般，基因的参照形式编码 来自某物种的群体或单个参照成员中的多肽的野生型形式和/或超优势形 式。通常，包括在两个物种间和在多个物种间变体的等位变体一般与来自 相同物种的野生型和/或超优势形式具有至少80％、90％或更大的氨基酸同 一性；同一性的程度取决于基因和是否是在物种间或在物种内进行比较。 通常，种内等位变体与一种多肽的野生型和/或超优势形式具有至少约 80％、85％、90％或95％同一性或更大，包括96％、97％、98％、99％或 更大的同一性。
[0130]如本文中所用，物种变体指在两个物种间和在多个物种间相同 多肽的变体。通常地，物种间变体与来自另一个物种的野生型和/或超优势 形式具有至少约60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性或更大的同 一性，包括与一种多肽的野生型和/或超优势形式的96％、97％、98％、99％ 或更大的同一性。
[0131]如本文中所用，修饰指的是修饰多肽的氨基酸序列或核酸分子 中核苷酸的序列并且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和替换。
[0132]如本文中所用，可读框指核酸分子中的核苷酸或核糖核苷酸序 列，其编码功能性多肽或其部分(一般至少约50个氨基酸)。可读框可以编 码全长多肽或其部分。可读框可以通过有效地连接一个或多个外显子或者 外显子和内含子而产生，此时终止密码子位于该内含子中并且该内含子的 全部或部位于转录的mRNA内。
[0133]如本文中所用，多肽指共价连接的两个或多个氨基酸。术语“多 肽”和“蛋白质”在本中可交换地使用。
[0134]如本文中所用，截短或缩短就核酸分子或蛋白质的缩短而言， 是指核酸分子中核苷酸或核糖核苷酸的序列或多肽中氨基酸序列残基的序 列，与该蛋白质或核酸分子的野生型或超优势形式相比，前者小于全长。
[0135]如本文中所用，参照基因指可以用来绘出基因中内含子和外显 子位置的基因。参照基因可以是如与表达的基因序列比较以绘出基因中内 含子和外显子位置的基因组DNA或其部分。参照基因也可以是编码多肽 的野生型或超优势形式的基因。
[0136]如本文中所用，蛋白质或基因的家族或者相关家族分别指彼此 具有同源性和/或结构相似性和/或功能相似性的一组蛋白质或基因。
[0137]如本文中所用，提前终止密码子是这样的终止密码子，其在核 酸分子的可读框中用来产生或创造蛋白质的全长形式(如多肽的野生型或 超优势形式)的终止密码子之前出现。提前终止密码子的出现可以是例如可 变剪接和突变的结果。
[0138]如本文中所用，激酶是催化分子磷酸化的蛋白质，其中所述的 分子一般是生物分子，包括大分子和小分子，例如，该分子可以是小分子 或蛋白质。磷酸化包括自身磷酸化。一些激酶具有组成型激酶活性。另一 些激酶需要激活。例如，参与信号转导的许多激酶是磷酸化的。磷酸化激 活激酶对途径中另一生物分子的活性。一些激酶通过蛋白质结构的变化和/ 或与另一分子相互作用而受到调节。例如，蛋白质的复合或分子与激酶的 结合可以激活或抑制激酶活性。
[0139]如本文中所用，调节和调节作用(modulation)指分子(如蛋白质) 活性的变化。示例的活性包括但不限于生物学活性，如信号转导。调节可 以包括活性的增加(即上调作用或激动剂活性)或活性的减少(即下调作用 或抑制作用)或活性的任何其它改变(如周期性、频率、持续时间、动力学 或其它参数的变化)。调节可以是环境依赖性的并且调节一般相比于指定的 状态，例如，野生型蛋白质、处于组成型状态的蛋白质或在指定的细胞类 型或条件中表达的蛋白质。
[0140]如本文中所用，抑制和抑制作用指相对于未抑制活性的活性降 低。
[0141]如本文中所用，组合物指任何混合物。它可以是溶液、混悬液、 液体、糊状物、含水物、非含水物或其任意组合。
[0142]如本文中所用，组合指在两个物品(item)之间或多个物品之间 的任何联合。组合可以是两个或多个独立的物品，如两个组合物或两个集 合，可以是其混合物，如两个或多个物品的单一混合物或其任何变化。组 合的要素通常地是功能上相关或关联的。试剂盒是包装的组合，其任选地 包括使用组合或其要素的说明书。
[0143]如本文中所用，药物效果或治疗效果指当施用意图用于治疗疾 病或病症或用于改善其症状的药物后所观察的效果。
[0144]如本文中所用，血管生成指从现有血管中形成新血管；新血管 化(neovascularization)指形成新血管。生理性血管生成受到严格调节并且 是对再生和胚发育必需的。在出生后及成年生活期间，血管生成存在于伤 口修复和操练的肌肉中并且通常限于数日或数周。相反，病理性血管生成 (或异常血管生成)可以持续数月或数年，例如支持实体肿瘤和白血病发展。 它为炎性细胞进入慢性炎症部位(例如节段性回肠炎和慢性膀胱炎)提供通 道。它是失明的最常见病因；它在类风湿性关节炎中摧毁软骨并有助于动 脉粥样硬化斑块的生长和出血。它在子宫内膜异位中导致腹膜内出血。肿 瘤生长是血管生成依赖性的。肿瘤通过释放刺激血管生成的因子而征募其 自身血液供应。此类因子包括VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、Tek、EPHA2、 AGE和其它等。AGE-RAGE相互作用可以凭借经NF-κB和AP-1因子的 VEGF基因转录活化而激发血管生成。VEGF在大量人癌症(包括乳腺癌、 肺癌、结肠直肠癌)中过量产生。
[0145]如本文中所用，血管原性疾病(或血管发生相关的疾病)是其中血 管发生的平衡被改变或其时间控制被改变的疾病。血管原性疾病包括其中 出现血管发生的改变(如不想要的血管化)的那些疾病。此类疾病包括但不 限于细胞增生疾病，包括癌、糖尿病性视网膜病变和其它糖尿病并发症、 炎性疾病、子宫内膜异位和其它疾病，其中过度血管化是疾病过程(包括上 述的那些疾病过程)的部分。
[0146]如本文中所用，HER(ErbB)相关的疾病或HER受体介导的疾病 是其中HER受体和/或配体涉及病因学、病理学或其发展的一些方面的任 何疾病、病况或病症。尤其，涉及包括例如HER受体家族成员或配体的 表达或过量表达或活性。疾病包括但不限于增生疾病，包括癌，例如但不 限于胰癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前 列腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌或乳腺癌。其它 病况包括涉及细胞增殖和/或移行的那些疾病，包括那些疾病涉及病理性炎 症反应、非恶性过度增生疾病如眼病、皮肤病、平滑肌细胞增殖和/或移行 所致的病况如狭窄(包括再狭窄)、动脉粥样硬化、膀胱、心脏或其它肌肉 的肌性增厚(muscle thickening)、子宫内膜异位或类风湿性关节炎。
[0147]如本文中所用，治疗意指其中改善或有益地改变病况、病症或 疾病的症状或其它征候的任何方式。
[0148]如本文中所用，治疗效果意指对受试者治疗所致的效果，其中 所述的治疗改变、一般改善或减轻疾病或病症的症状或治愈疾病或病症。 治疗有效量指在施用于受试者后产生治疗效果的组合物、分子或化合物的 量。
[0149]如本文中所用，术语“受试者”指动物，包括哺乳动物，如人类。
[0150]如本文中所用，″患者″指人受试者。
[0151]如本文中所用，″个体″可以是受试者。
[0152]如本文中所用，正常水平或值可以按照本领域技术人员已知的 多种方式定义。一般而言，正常水平指在健康群体范围内CSR或CSR配 体的表达水平。正常水平(或参考水平)基于健康受试者的测量结果，如来 自指定来源(即血液、血清、组织或其它来源)。正常水平往往被称为″正常 范围″，其一般指健康群体的中位值95％的值范围。参考值在本文中可与 正常水平互换地使用，但是可以根据受试者或来源而与正常水平不同。例 如，CSR或配体的正常水平可以在2岁患者与50岁患者之间是不同的。 因此，参考水平一般取决于群体的特定部分的正常水平。因此，出于本文 目的，正常水平或参考水平是可以与试验患者进行比较的预定标准或对照。
[0153]如本文中所用，升高的水平指增加超过正常水平或参考水平的 CSR或CSR配体的任何表达水平。CSR或CSR配体在试验受试者中的表 达可以与CSR或配体的正常水平或对照水平比较，以确定该水平是否升 高。
[0154]如本文中所用，活性指生物分子如多肽的功能或起功能作用或 其相互作用的变化，此类活性的示例(但非限制性)是：复合、二聚化、多 聚化、受体相关的激酶活性或其它酶活性或催化活性、受体相关的蛋白酶 活性、磷酸化、去磷酸化、自体磷酸化、与其它分子形成复合体的能力、 配体结合作用、催化活性或酶活性、激活(包括自身激活和激活其它多肽)、 抑制或调节另一分子的功能、刺激或抑制信号转导和/或细胞应答如细胞增 殖、移行、分化和生长、降解、膜定位、膜结合和肿瘤发生。活性可以通 过本文中所述的测定法和通过本领域技术人员已知的任何适宜的测定法进 行评估，所述的测定法包括但不限于体外测定法(包括基于细胞的测定法)、 体内测定法(包括在针对特定疾病的动物模型中的测定法)。
[0155]如本文中所用，复合指两个或多个分子(如两个蛋白质分子)形成 复合体的相互作用。这种相互作用可以通过非共价键和/或共价键进行，并 且包括但不限于疏水性的和静电的相互作用、范德瓦尔斯力和氢键。通常， 蛋白质-蛋白质相互作用涉及疏水性相互作用和氢键。复合可以受环境条件 (如温度、pH、离子强度和压力以蛋白质浓度)影响。
[0156]如本文中所用，二聚化指两个分子(如两个受体分子)的相互作 用。二聚化包括其中两个相同分子相互作用的同二聚化。二聚化也包括其 中两个不同分子相互作用的异二聚化。一般而言，二聚化涉及通过每个分 子中所含二聚化结构域或多聚化结构域的相互作用而彼此相互作用的两个 分子。类似地，多聚化指多个分子形成二聚体、三聚体或更高阶寡聚体的 相互作用，其中所述的分子是相同类型或是不同的。
[0157]涉及两个嵌合多肽的二聚化指借助每一嵌合多肽的多聚化结构 域之间相互作用而出现的二聚化。受体二聚化指两个受体之间导致受体活 化的二聚化，或受体和能够与该受体二聚化的ECD部分(如ECD多聚体) 之间的二聚化，这种二聚化随后将调节该受体的激活。
[0158]如本文中所用，硅片上法(in silico)指使用计算机进行的研究和实 验。硅片上法包括但不限于分子建模研究、生物分子对接实验(docking experiments)和虚呈现(virtual representation)分子结构和/或过程(如分 子相互作用)。
[0159]如本文中所用，生物学样本指从活体或病毒来源或其它大分子 和生物分子中获得的任何样本，并且包括从中可以获得核酸或蛋白质或其 它大分子的受试者的任何细胞类型或组织。该生物学样本可以是直接从生 物学来源获得的样本或是经过加工的样本。例如，扩增的分离核酸构成生 物学样本。生物学样本包括但不限于体液如血液、血浆、血清、脑脊液、 滑膜液、尿和汗、来自动物和植物的组织和器官以及从其中衍生的加工样 本。还包括土壤样本和水样本和其它环境样本、病毒、细菌、真菌、藻类、 原生生物和其组分。
[0160]如本文中所用，术语“核酸”指单链和/或双链多核苷酸，如脱 氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA或DNA的类似物或衍生物。 术语“核酸”也包括核酸的类似物，如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA和 此类其它类似物和衍生物或其组合。核酸可以指多核苷酸，如脱氧核糖核 酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。本术语也包括由核苷酸类似物组成的RNA或 DNA的衍生物、变体和类似物、单链(有义或反义)和双链多核苷酸作为等 同物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。 对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
[0161]如本文中所用，术语“多核苷酸”指含有至少两个连接的核苷 酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核 酸(RNA)和DNA衍生物或RNA衍生物，所述的衍生物含有例如核苷酸类 似物或除磷酸二酯键之外的″主链″键，例如磷酸三酯键、磷酰胺键、硫代 磷酸酯键、硫酯键、或肽键(肽核酸)。术语“寡核苷酸”也在本文中与“多核 苷酸”基本上同义地使用，尽管本领域技术人员认识到寡核苷酸(例如PCR 引物)通常小于约50-100个核苷酸长度。
[0162]多核苷酸包括核苷酸类似物，包括例如，允许多核苷酸质量差 异的质量修饰的核苷酸；含有允许检测多核苷酸的可检测标记物(如荧光、 放射、发光或化学发光标记物)的核苷酸；或含有促进多核苷酸固定至固体 支持物的反应基团如(生物素或巯基)上的核苷酸；多核苷酸也可以含有选 择性(如化学、酶或光解)切割的一个或多个主链键。例如，多核苷酸可以 包括一个或多个脱氧核糖核苷酸，后接一个或多个核糖核苷酸，其后可以 是一个或多个脱氧核糖核苷酸，此种序列在核糖核苷酸序列处通过碱水解 作用是可切割的。多核苷酸也可以含有相对耐受切割的一个或多个键，例 如，一种嵌合寡核苷酸引物，其可以包括通过肽核酸键连接的核苷酸和至 少一个在3′端的核苷酸，其中所述在3′端的核苷酸由磷酸二酯键或其它合 适键连接并且能够由聚合酶延伸。肽核酸分子可以使用熟知方法制备(见， 例如，Weiler等人，Nucleic acids Res.25：2792-2799(1997))。
[0163]如本文中所用，寡核苷酸指包括DNA、RNA、核酸类似物(如 PNA)及其组合的聚合物。出于本文目的，引物和探针是单链寡核苷酸或是 部分单链的寡核苷酸。
[0164]如本文中所用，合成涉及例如合成核酸分子或合成基因或合成 肽时，指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分 子。
[0165]如本文中所用，通过重组方法或使用重组DNA方法产生意指使 用熟知的分子生物学方法以表达由所克隆的DNA编码的蛋白质。
[0166]如本文中所用，术语“载体(vector)”指能够运输已经与之连 接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是游离型载体，即能够在染色 体外复制的核酸。载体包括能够自我复制和/或表达与其连接的核酸的那些 载体。能够指导与其有效连接的基因表达的载体在本文中称作″表达载体 ″。一般而言，表达载体常常为″质粒″形式，其中所述的质粒通常是在其 载体形式下不与染色体结合的环状双链DNA环。可互换地使用″质粒″和″ 载体″，因为质粒是最常使用的载体形式。起到等效功能的此类其它载体形 式在下文中为本领域所知。
[0167]如本文中所用，短语“有效连接”就核酸序列而言，通常意指核 酸分子或其节段共价地连接成一段核酸，如DNA或RNA，无论是单链形 式或是双链形式。所述节段不必是邻接的，但两个或多个组分如此紧靠， 从而所述组分处在允许它们以预期方式发挥作用的关系中。例如，RNA的 节段(外显子)可以通过如剪接作用而有效连接以形成一个单一RNA分子。 在另一个实例中，DNA节段可以有效连接，从而在一个控制节段上的控制 或调节序列允许其它节段的表达或复制或其它此类控制。因此，在调节区 有效与报道分子连接或任何其它多核苷酸连接的情况下，或者报道分子或 任何多核苷酸有效与调节区连接的情况下，所述多核苷酸/报道分子的表达 受该调节区影响或控制(例如，受调节或改变，如增加或减少)。对于基因 表达，核苷酸的序列以如此方式与调节序列连接，从而当适宜的分子信号 (如转录激活蛋白)与所述调节序列结合时控制或允许基因表达。异源核酸 (如DNA)与核苷酸的调节序列和效应序列(如启动子、增强子、转录终止位 点和翻译终止位点和其它信号序列)有效连接，指此种DNA与此类核苷酸 序列之间的关系。例如，异源DNA与启动子的有效连接指DNA与启动子 之间的物理关系，从而此种DNA的转录由RNA聚合酶从所述启动子启动， 其中所述的RNA聚合酶特异性地识别、结合于并转录可读框内的所述 DNA。
[0168]如本文中所用，异源核酸与核苷酸的调节序列和效应序列(如启 动子、增强子、转录终止位点和翻译终止位点和其它信号序列)的有效连接， 指所述核酸(如DNA)与所述核苷酸序列之间的关系。例如，异源DNA与 启动子的有效连接指该DNA与此启动子之间的如此物理关系，从而所述 DNA的转录由RNA聚合酶从所述启动子启动，其中所述的RNA聚合酶 特异性地识别、结合于并转录所述DNA。因此，有效连接或有效结合指核 酸(如DNA)与核苷酸的调节序列和效应序列(如启动子、增强子、转录终止 位点和翻译终止位点和其它信号序列)的功能关系。为了优化表达和/或体 外转录，可能必需要除去、添加或改变克隆的5′非翻译部分以消除额外的、 潜在不适合的备选翻译起始(即起点)密码子或可能在转录水平或翻译水平 上干扰或降低表达的其它序列。备选地，共有核糖体结合位点(见，例如， Kozak J.Biol.Chem.266：19867-19870(1991))可以紧邻起始密码子的5′插 入并且可以增强表达。可以经验地确定对此类修饰的要求(或需要)。
[0169]如本文中所用，当谈及多肽时术语“有效连接”，例如当在短 语“细胞表面受体的至少一个亚结构域或其部分有效连接至另一个亚结构 域或其部分”的上下文中使用时，意指这两个氨基酸序列由每一序列中末尾 氨基酸残基之间的肽键连接以形成单一的氨基酸残基序列。
[0170]如本文中所用，在谈及产生多肽(如同工型和内含子融合蛋白) 时所用的短语“自核酸产生”，包括通过翻译核酸分子而实实在在地产生多 肽分子和产生多肽。
[0171]如本文中所用，谈及多肽时的产生，指所表达蛋白质(或可回收 或可分离的所表达蛋白质)的表达和回收。可以影响蛋白质产生的因素包括 所选表达系统和宿主细胞、细胞培养条件、宿主细胞对蛋白质的分泌和为 纯化目的而检测蛋白质的能力。蛋白质的产生可以通过评估蛋白质例如向 细胞培养基中分泌而进行监测。
[0172]如本文中所用，分泌指蛋白质借以运输至细胞外环境或在革兰 氏阴性细菌的情况下运输至周质间隙的过程。通常，分泌通过细胞内分泌 途径发生，例如在真核细胞中，这涉及内质网和高尔基体。
[0173]如本文中所用，就来自不同物种的分子(如核酸分子或多肽)而 言，同源的是指相应的分子(即物种变体)。此类分子一般是相似的并且通 常共有约45％序列同一性或同源性。本领域技术人员可以鉴定物种之间的 同系物(homologs)。
[0174]如本文中所用，异源核酸是这样的核酸，其通常不由表达此核 酸的细胞在体内产生，或由该细胞产生，但处于不同基因座处或被不同地 表达，或者介导或编码通过影响转录、翻译或其它可调节性生物化学过程 而改变内源核酸(如DNA)表达的中介体。异源核酸通常对导入该核酸的细 胞而言不是内源性的，但是已经从另一种细胞获得或合成地制备。异源核 酸可以是内源性的，不过是从不同基因座表达或其表达被改变的核酸。通 常，尽管不是必然地，此类核酸编码在正常情况下细胞不产生或者表达所 述核酸的细胞不按照该细胞中的相同方式产生的RNA和蛋白质。异源核 酸(如DNA)也可以称作外源核酸(如DNA)。因此，异源核酸或外源核酸包 括不以基因组中所存在的对应核酸分子(如DNA)的完全相同方向和位置存 在的核酸分子。它也可以指来自另一种生物或物种(即外源)的核酸分子。 异源核酸就分离的核酸分子而言，可以指此分子的一个部分，其从不同来 源或从来自此分子的另一部分的基因座衍生。异源分泌信号的示例包括不 作为所编码分子的内源信号序列的任何前序列(即信号序列)或前原序列， 例如，但不限于tPA前原序列、前胃泌素原序列和本领域技术人员已知的 任何其它序列。
[0175]类似地，就多肽的部分而言，异源的是指嵌合多肽中与其余部 分相比较的一个部分。因此，在杂合ECD中，其中所述的杂合ECD含有 来自HER1的亚结构域I、来自HER2的亚结构域II和来自HER3的亚结 构域III，每种亚结构域对于每一其它亚结构域而言是异源性的。
[0176]异源分子可以从不同遗传来源或物种衍生。因此，与特定CSR ECD或其同工型异源的分子包括含有如此序列的任何分子，其中所述的序 列不从所述CSR ECD或其同工型衍生或不与之是内源的。异源分子的实 例包括来自相同或不同物种的不同多肽的分泌信号、标签如融合标签或标 记物、或任何其它分子的全部或部分。异源分子可以与目的核酸或多肽序 列融合以产生融合分子或嵌合分子或可以经共价或非共价连接而化学地连 接。
[0177]如本文中所用，异源分泌信号指来自相同或不同物种的来自多 肽的信号序列，其中所述的信号序列在序列上与内源信号序列不同。异源 分泌信号可以在衍生此异源分泌信号的宿主细胞中使用，或它可以在与衍 生该信号序列的细胞不同的宿主细胞中使用。
[0178]如本文中所用，多肽的活性部分，如就ECD的活性部分而言， 指具有活性的多肽的部分。
[0179]如本文中所用，蛋白质的纯化指分离蛋白质的过程，如从匀浆 中分离蛋白质的过程，其中所述的匀浆可以含有细胞和组织组分，包括 DNA、细胞膜和其它蛋白质。蛋白质可以按照本领域技术人员已知的多种 方式中任意方式，例如根据其等电点通过使它们经过pH梯度凝胶或离子 交换柱、根据其大小或分子量通过大小排阻层析法或通过SDS-PAGE(十二 烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析法或根据其疏水性进行纯化。其它 纯化技术包括但不限于沉淀法或亲和层析法，包括免疫亲和层析法和包括 任一这些方法的组合的其它方法。此外，可以通过在分子上包括标签如用 于亲和纯化的组氨酸标签或用于鉴定的可检测标记而促进纯化。
[0180]如本文中所用，″分离″就分子(如核酸分子、寡核苷酸、多肽或 抗体)而言，表示此分子已经因人工操作而异于该分子在其天然环境中存在 的状态。例如，认为通过重组宿主细胞产生或在其中所包含的分子是″分离 的″。类似地，认为从其天然来源或重组宿主细胞中已经部分或基本上纯化 的或通过合成方法产生的分子是″分离的″。根据预期应用，分离的分子可 以任何形式存在，如在动物、细胞或其提取物中存在；脱水的、在蒸汽、 溶液或混悬液中；或固定在固体支持物上。
[0181]如本文中所用，基本上纯的多肽或分离多肽(或其它分子)是可交 换使用的并且意指所述多肽已经从来源中被纯化或具有如通过层析技术或 此类其它技术(如在非还原或还原条件使用例如考马斯兰或银染法的 SDS-PAGE)所检测到的样本均一性。均一性通常意指与其它来源蛋白质的 混杂小于约5％或小于5％。
[0182]如本文中所用，检测包括允许显示(通过眼睛或设备)蛋白质的方 法。可以利用对蛋白质特异的抗体使蛋白质可显现。也可以通过蛋白质与 包括表位标签在内的标签或标记物融合而促进蛋白质的检测。
[0183]如本文中所用，标记物指可检测的化合物或组合物，其直接或 间接地与多肽缀合，从而产生标记的多肽。标记物可以是本身可检测的(例 如放射性同位素标记物或荧光标记物)；或在酶标记物的情况下，可以催化 底物化合物或组合物的可检测化学变化。标记物的非限制性实例包括生荧 光(fluorogenic)部分、绿色荧光蛋白或萤光素酶。
[0184]如本文中所用，表达指这样的过程，其中基因所编码的信息转 化成在细胞中存在和发挥作用的结构物。表达的基因包括那些转录成 mRNA并随后翻译成蛋白质的基因和那些转录成RNA但不翻译成蛋白质 的基因(例如转移RNA和核糖体RNA)。出于本文目的，表达的蛋白质可 以滞留在细胞内，如滞留在细胞质内，或可以从细胞分泌出来。
[0185]如本文中所用，启动子区指基因的DNA部分，其中所述的DNA 部分控制与之有效连接的DNA的转录。启动子区包括足够用于RNA聚合 酶识别、结合和转录起始的特定DNA序列。启动子区的这个部分称作启 动子。此外，启动子区包括调节RNA聚合酶识别、结合和转录起始活性 的序列。这些序列可以是顺式作用的或可以应答于反式作用因子。根据调 节作用的本质，启动子可以是组成型或受调节型的。
[0186]如本文中所用，调节区意指正向或负向地影响有效连接的基因 表达的顺式作用核苷酸序列。调节区包括赋予基因诱导型表达(即需要用于 增加转录的物质或刺激物)的核苷酸序列。当诱导物存在或处于升高的浓度 时，可以增加基因表达。调节区也包括造成基因表达阻遏(即物质或刺激物 减少转录)的序列。当阻遏物存在或处于升高的浓度时，可以降低基因表达。 已知调节区影响、调节或控制体内生物学活性，包括细胞增殖、细胞生长 和死亡、细胞分化和免疫调节。调节区一般与一种或多种反式作用蛋白结 合，这引起基因转录增加或减少。
[0187]基因调节区的示例是启动子和增强子。启动子是位于转录或翻 译起始位点附近的序列，一般位于翻译起始位点5′。启动子通常位于翻译 起始位点的1Kb范围内，不过可以位于更远处，例如，2Kb、3Kb、4Kb、 5Kb或更远，多至包括10Kb。已知当位于基因的5′或3′时或位于外显子 或内含子中或为它们的一部分时，增强子影响基因表达。增强子也可以与 基因相隔明显距离时发挥作用，例如距离约3Kb、5Kb、7Kb、10Kb、 15Kb或更远。
[0188]除启动子区外，调节区也包括利于翻译的序列、内含子剪接信 号、维持基因正确可读框以允许符合可读框地翻译mRNA的序列，以及终 止密码子、前导序列和融合配偶体(partner)序列、用于产生多基因或多 顺反子的内部核糖体结合位点(IRES)元件、信使(messages)、提供目的基因 转录物正确聚腺苷酸化的聚腺苷酸化信号和终止密码子，并且可以任选地 包含于表达载体中。
[0189]如本文中所用，在本文出现的多种氨基酸序列中存在的″氨基酸 ″根据其熟知的三字母或单字母缩写(见表2)确定。在多种DNA片段中存 在的核苷酸以本领域惯常使用的标准单字母命名给出。
[0190]如本文中所用，″氨基酸残基″指在肽键处化学消化(水解)多肽后 所形成的氨基酸。本文中所述的氨基酸残基通常地是″L″同分异构形式。 处于″D″同分异构形式的残基可以替换任何L-氨基酸残基，只要多肽保留 想要的功能特性即可。NH2指在多肽的氨基末端处存在的游离氨基。 COOH指在多肽的羧基末端处存在的游离羧基。与J.Biol.Chem.， 243：3552-59(1969)中描述的及在37C.F.R，§§.1.821-1.822中采用的标准多 肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写示于表2：表2-对应表
[0191]本文通过式子所表述的氨基酸残基的全部序列具有在氨基端至 羧基端的常规方向上的从左至右方向。此外，将短语“氨基酸残基”定义为 包括列于对应表中的氨基酸、修饰氨基酸、非天然氨基酸和罕有氨基酸。 此外，应当指出在氨基酸残基序列的开始和末尾处的短直水平线表示与含 一个或多个氨基酸残基的其它序列或与氨基末尾基团如NH2或与羧基末尾 基团如COOH连接的肽键。
[0192]在肽或蛋白质中，对氨基酸的合适保守替换是本领域技术人员 已知的并且通常地可以实行而不改变所得分子的活性。本领域技术人员知 道，一般而言，在多肽的非必需区中的单个氨基酸替换基本上不改变生物 学活性(见，例如，Watson等Molecular Biology of the Gene，第四版，1987， The Benjamin/Cummings Pub.co.，第224页)。
[0193]此类替换可以例如根据在下表3中所述的那些替换进行：表3
最初残基 保守性替换 Ala(A) Gly；Ser Arg(R) Lys Asn(N) Gln；His Cys(C) Ser Gln(Q) Asn Glu(E) Asp Gly(G) Ala；Pro His(H) Asn；Gln Ile(I) Leu；Val Leu(L) Ile；Val Lys(K) Arg；Gln；Glu Met(M) Leu；Tyr；Ile Phe(F) Met；Leu；Tyr Ser(S) Thr Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr Tyr(Y) Trp；Phe Val(V) Ile；Leu
其它替换(包括非保守性变化)也是允许的并且可以经验地或根据其它 已知的保守性或非保守性替换而确定。
最初残基 保守性替换 Ala(A) Gly；Ser Arg(R) Lys Asn(N) Gln；His Cys(C) Ser Gln(Q) Asn Glu(E) Asp Gly(G) Ala；Pro His(H) Asn；Gln Ile(I) Leu；Val Leu(L) Ile；Val Lys(K) Arg；Gln；Glu Met(M) Leu；Tyr；Ile Phe(F) Met；Leu；Tyr Ser(S) Thr Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr Tyr(Y) Trp；Phe Val(V) Ile；Leu
其它替换(包括非保守性变化)也是允许的并且可以经验地或根据其它 已知的保守性或非保守性替换而确定。
[0194]如本文中所用，肽模拟物是模拟特定肽的生物学活性形式的构 象和某些立体化学特征的化合物。一般而言，设计肽模拟物旨在模拟化合 物的某些有利特性，但不模拟导致生物学活性构象丧失和键破坏的不利特 性，如柔性。肽模拟物可以通过用生物电子等排体(bioisostere)替换对不 利特性有贡献的某些基团或键而从生物活性化合物中制备。生物电子等排 体是本领域技术人员已知的。例如，亚甲基生物电子等排体CH2S已经用 作脑啡肽类似物中的酰胺替换(见，例如，Spatola(1983)在Weinstein编辑 的Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins第7 卷第267-357页，Marcel Dekker，New York)。可口服施用的吗啡是作为 内啡肽的肽模拟物的化合物。出于本文目的，环肽属于肽模拟物，所述环 肽是其中一个或多个肽键由模拟物替换的多肽。本文中提供的异多聚体和 多聚体和杂合ECD和嵌合多肽可以通过用模拟物替换键进行修饰，并且 本文中提供了此类分子。
[0195]如本文中所用，两个蛋白质或核酸之间的″相似性″指所述蛋白 质的氨基酸序列之间或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以 基于序列和其中所含残基的同一性和/或同源性的程度。用于评估蛋白质或 核酸之间相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评估序列 相似性的一种方法中，以如此方式比对两个氨基酸序列或核苷酸序列，从 而在所述序列之间产生最大水平的同一性。″同一性″指氨基酸序列或核苷 酸序列不变异的程度。氨基酸序列的比对和某种程度上核苷酸序列的比对 也可以考虑到保守性差异和/或氨基酸(或核苷酸)的常见替换。保守性差异 是保留所涉及残基的物理-化学特性的那些差异。比对可以是全局性的(在 整个序列长度范围内比对所比较的序列并且包括全部残基)或局部的(仅比 对包括最相似区域的序列部分)。
[0196]″同一性″本身具有本领域已知的含义并且可以使用公开的技术 计算(见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993； Computer Analysis of Sequence Data，第I部，Griffin，A.M.和Griffin， H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press， New York，1991)。尽管存在众多方法来测量两个多核苷酸序列或多肽序列 之间的同一性，然而术语“同一性”是技术人员熟知的(Carillo，H.和Lipton， D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
[0197]如本文中所用，沿每个SEQ ID的全长与同工型的全长相比较的 序列同一性，指与指定SEQ ID所定义的参考多肽沿其全长相比，同工型 多肽沿其全长的氨基酸序列的同一性百分数。例如，若多肽A具有100个 氨基酸并且多肽B具有与多肽A第1-95位氨基酸相同的95个氨基酸，则 与多肽B的全长相比，当沿多肽A的全长比较序列同一性时，多肽B具有 95％同一性。一般，当同工型多肽或参考多肽是缺少信号序列的成熟多肽 时，沿所述多肽的全长(除所述信号序列部分之外)比较序列同一性。例如， 若同工型缺少信号肽，但参考多肽含有信号肽，则为确定序列同一性而沿 这两条多肽全长的比较排除该参考多肽的信号序列部分。如下文所讨论和 本领域技术人员已知，用于评估同一性的多种程序和方法是本领域技术人 员已知的。例如，当考虑全部长度时，可以利用如使用Needleman-Wunsch 全局比对算法的全局比对法来找到两条序列的最佳比对和同一性。高水平 的同一性(如90％或95％同一性)可以不用软件而轻易地确定。
[0198]如本文中所用，同源(就核酸序列和/或氨基酸序列而言)意指约 大于或等于25％的序列同源性、一般大于或等于25％、40％、60％、70％、 80％、85％、90％或95％、90％或95％的序列同源性；可以根据需要指定 精确百分数。出于本文目的，术语“同源性”和“同一性”常常可交换地 使用，除非另外说明。一般而言，为确定同源性或同一性百分数，如此比 对序列，从而获得最高级别的匹配(见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988； Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑， Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data， 第I部，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey， 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编 辑，M Stockton Press，New York，1991；Carillo等(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。借助序列同源性，保守氨基酸的数目通过标准比对算法程 序加以确定，并可以随每位供应商建立的默认空位罚分一起使用。实质上 同源的核酸分子一般以中等严格性或高度严格性沿目的核酸全部长度发生 杂交。还考虑了这样的核酸分子，其含有替换杂交性核酸分子中密码子的 简并密码子。
[0199]无论任何两种核酸分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”的核苷酸序列，可 以使用已知的计算机算法如″FASTA″程序，使用例如在Pearson等(1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：2444中的默认参数，确定“同一性”或“同源 性”(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.等Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等，J Molec Biol 215：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，编辑， Academic Press，San Diego，1994和Carillo等(1988)SIAM J Applied Math 48：1073))。例如，可以使用国家生物信息数据库中心的BLAST功能来确 定同一性。其它商业性或公众可用的程序包括DNAStar“MegAlign”程序 (Madison，WI)和威斯康辛大学Genetics Computer Group(UWG)″Gap″程 序(Madison WI))。可以通过例如使用GAP计算机程序(例如，Needleman 等(1970)J.Mol.Biol.48：443，其由Smith和Waterman改进((1981)Adv. Appl.Math.2：482)比较序列信息来确定蛋白质和/或核酸分子的同源性或 同一性百分数。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的所比对符号(即 核苷酸或氨基酸)的数目除以两条序列之较短序列中的符号总数。用于GAP 程序的默认参数可以包括：(1)如Schwartz和Dayhoff编著，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，国家生物医学研究基金会， 第353-358页(1979)所述，Gribskov等(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的一 元比较矩阵(含有用于同一性的值1和用于非同一性的值0)和加权比较矩 阵；(2)用于每个空位的罚分3.0和用于每个空位内每个符号的额外罚分 0.10；和(3)对末端空位的无罚分。
[0200]因此，如本文中所用，术语“同一性”或“同源性”代表在试验和 参考多肽或多核苷酸之间的比较。
[0201]如本文中所用，术语至少“90％同一于”指相对于参考核酸序列 或氨基酸序列的同一性百分数90-99.99。在90％或更高水平上的同一性表 示这样的事实，即出于举例目的假定将100个氨基酸的试验多肽长度和参 考多肽长度比较。试验多肽中不超过10％的(即100个中的10个)氨基酸与 参考多肽的氨基酸不同。可以在试验多核苷酸和参考多核苷酸之间实行类 似比较。此类不同可以表述为随机分布在氨基酸序列的整个长度范围内的 点突变或它们可以簇集在长度各异至多到可允许最大值(例如10/100氨基 酸不同(大约90％同一性))的一个或多个位置中。将不同定义为核酸或氨基 酸替换、插入或缺失。在高于约85-90％的同源性或同一性水平上，该结果 应当不依赖于程序和空位参数设置；可以轻易地评估如此高水平的同一性， 往往通过人工比对而无需依赖软件进行如此评估。
[0202]如本文中所用，比对的序列指利用同源性(相似性和/或同一性) 来比对核苷酸或氨基酸的序列中的相应位置。一般而言，将相关达50％或 更高同一性的两个或多个序列比对。比对的序列组指在相应位置处比对的 2个或多个序列并且可以包括相对于基因组DNA序列而比对从RNA如 EST和其它cDNA衍生的序列。
[0203]如本文中所用，包含参考多肽中所述的特定氨基酸百分数的多 肽是指多肽与参考多肽之间所共有的连续相同氨基酸的比例。例如，包含 70％在参考多肽(其具有在147个氨基酸的SEQ ID NO：XX中描述的氨基 酸序列)中所述氨基酸的同工型意指该参考多肽含有在SEQ ID NO：XX中 描述的氨基酸序列的至少103个连续氨基酸。
[0204]如本文中所用，″引物″指含有2个或多个、通常多于3个脱氧 核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，从所述引物可以启动引物延伸产物 的合成。引物可以作为在适宜条件(例如存在4种不同三磷酸核苷和聚合剂 如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶)下、适宜缓冲液中和在合适温度 上模板指导的DNA合成过程中的一个起始点发挥作用。有助于合成的实 验条件包括存在三磷酸核苷和用于聚合和延伸的试剂如DNA聚合酶，以 及合适缓冲液、温度和pH。某些核酸分子可以作为″探针″和作为″引物″ 发挥作用。然而，引物具有用于延伸的3′羟基。引物可以用于多种方法中， 所述的方法包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多种PCR、锅柄式PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、 原位PCR、连接作用介导的PCR和其它扩增方法。
[0205]如本文中所用，″引物对″指一组引物，其包括与(例如通过PCR) 待扩增的序列5′端杂交的5′(上游)引物和与该待扩增的序列3′端的互补序 列杂交的3′(下游)引物。
[0206]如本文中所用，“特异性杂交”指通过核酸分子(例如寡核苷酸) 的互补性碱基配对作用与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异 性杂交的体外及体内参数，如特定分子的长度和组成。对体外杂交特别重 要的参数还包括退火温度和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。用于在高严 格性下除去非特异性结合的核酸分子的示例性洗涤条件是0.1×SSPE， 0.1％SDS，65℃并且在中等严格性下是0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃。等 效的严格性条件是本领域已知的。技术人员可以轻易地调整这些参数以实 现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。
[0207]如本文中所用，有效量是对于预防、治愈、减轻、阻止或部分 阻止疾病或病症的症状所必需的治疗剂的量。
[0208]如本文中所用，单位剂量形式指适用于人和动物受试者并且单 独包装的物理上分开的单元，这一点为本领域已知。
[0209]如本文中所用，单剂量制剂指用于直接施用的制剂。
[0211]如本文中所用，范围和量可以表述为“约”某个具体值或范围。 “约”也包括确切量。因此，“约5个碱基”意指“大约5个碱基”并还指 “5个碱基”。
[0212]如本文中所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件 或状况出现或不出现，并且该描述包括其中所述事件或状况出现的情况和 其中它不出现的情况。例如，任选替代的基团意指该基团未被替代或者被 替代。B.泛细胞表面受体特异的治疗剂
[0213]本文中提供这样的化合物，其是与一个或多个、一般两个或多 个细胞表面受体如HER家族成员尤其HER1、HER3和HER4、胰岛素样 生长因子-1受体(IGF-1R或IGF1R)、尤其IFG1R和血管内皮细胞生长因 子受体(VEGFR)家族成员相互作用的治疗剂或候选治疗剂。这些治疗剂和 候选治疗剂通过特异性地靶向在激活疾病途径中合作的至少一个或多个受 体和/或其配体而起作用。此类治疗剂克服或解决与靶向单一受体的治疗剂 相关的问题。
[0214]例如，使用抗HER药物如赫赛(曲妥珠单抗)的问题是因为 仅在乳腺癌的亚组中出现HER2过量表达所致的有限效力，以及有限的应 答持续时间，其原因在于针对该药物的耐药性可能发展，如通过激活其它 受体发展。对于以非HER家族成员的受体为靶的药物观察到类似问题。 赫赛(曲妥珠单抗)的耐药性机制在于其它的HER家族成员共表达。耐 药性的其它机制包括IGF-1R共表达；金属蛋白酶介导的HER2激活(通过 “修剪(clippling)”胞外结构域和上调PI3K-AKT(磷脂酰肌醇-3-激酶- 蛋白激酶B)途径，这往往通过丢失PTEN(磷酸酶及张力蛋白同源物，其中 该蛋白在癌中突变；参见例如Nahta等(2006)Cancer Lett.8：123-38；Hynes 等(2005)Nature Reviews Cancer 5：341-354)而介导。HER1/EGFR治疗剂 的耐药性机制类似于赫赛(曲妥珠单抗)的那些耐药性机制。数据显示 60％的患者(88/145位患者)表达一种或两种HER家族成员；18.6％(27/145) 共表达三种HER家族成员。该数据还显示累积性受体表达预告严重得多 的疾病(p＜0.0001)。其它数据表明约40％的乳腺癌共表达两种HER家族 成员。在其它癌中HER家族成员共表达的频率与在乳腺癌中的频率是可 比的，预计多至约50％患者同时表达HERs，并且因此可以耐受靶向单一 对象(single agent)的治疗剂，这可能因组成型激活AKT(蛋白激酶B)及组 成型激活刺激细胞增殖的其它细胞途径所致(Hynes等(2005)Nature Reviews Cancer 5：341-354)。HER家族成员的同时共表达也引起诱导存活 素(一种抗凋亡因子；Xia等(2006)Oncogene24：6213-6221)以及介导产生在 肿瘤发展中重要的不同生长因子(例如血管内皮细胞生长因子；VEGF)。
[0215]这里得到的结论是：针对任何特定HER的治疗剂的耐药性往往 通过其余HER家族成员的表达或通过相关的受体酪氨酸激酶如IGF1R、 VEGFR、FGFR等的表达所介导。例如，IGF-1R通过与HER2异二聚体 化而直接抑制赫赛(曲妥珠单抗)的活性(Nahta等(2006)Cancer Lett.8：123-38)。
[0216]除共同过量表达之外，任何特定HER家族成员过量表达的频率 在癌之间是不同的。本文发现HER家族中过量表达最常见的成员是HER1 和HER3，并且过量表达最不常见的成员是HER4。TGF-α是最常见表达 的配体。下表提供估计的发病率和HER家族成员过量表达频率的估计分 布(从文献来源测定；全部数据基于免疫组织化学)：表4：过量表达的患者百分数
疾病 死亡率＊＊ (美国) HER1 HER2 HER3 HER4
NSCLC＊ 113,000 60 20-50 84 pos 乳腺癌 40,580 16 25 18 12 结肠直肠癌 56,730 70 pos 50 胰腺癌 31,270 33 25 50 pos 肝癌 14,270 68 21 84 61 胃食管癌 24,000 30-50 10-20 81 pos
＊非小细胞肺癌
＊＊癌症事实和数据(Cancer Facts and Figures)，2003
疾病 死亡率＊＊ (美国) HER1 HER2 HER3 HER4
NSCLC＊ 113,000 60 20-50 84 pos 乳腺癌 40,580 16 25 18 12 结肠直肠癌 56,730 70 pos 50 胰腺癌 31,270 33 25 50 pos 肝癌 14,270 68 21 84 61 胃食管癌 24,000 30-50 10-20 81 pos
＊非小细胞肺癌
＊＊癌症事实和数据(Cancer Facts and Figures)，2003
[0217]HER家族成员共表达对治疗提出挑战，其中所述的共表达通过 备选HER家族成员的代偿性上调而导致缺乏应答或耐药性发展。本文中 认识到如此观察结果：不同HER家族成员以重叠及协同性方式有助于肿 瘤发展和进展，并且在本文中利用这种观察结果来基于肿瘤中的受体表达 提供可设计旨在避免耐药性问题和可设计用于特定肿瘤的治疗剂。本文所 提供的治疗剂和候选治疗剂通过靶向至少一种或多种细胞表面受体、一般 两种或多种细胞表面受体如多种HER家族成员和/或靶向参与或涉及导向 单一细胞表面受体的药物的耐药性的HER家族成员和任何其它细胞表面 受体而解决这些问题，包括本文中确定的那些问题和其它问题。
[0218]基于HER家族成员以及其它细胞表面受体的结构、功能作用和 相互作用，本文中提供用于靶向和介入的众多治疗位点。这些治疗位点包 括参与配体结合的受体区域和参与受体二聚化的区域和参与束缚作用的区 域。这些区域可以同时在多种受体中被靶向，从而一种治疗剂干扰两种或 多种受体的配体结合和/或受体二聚化。本文中提供几种方法和候选治疗分 子。
[0219]提供了用于靶向受体区域(包括负责二聚化、配体结合和/或束缚 作用的结构域)的方法。尤其，受体二聚化由相互作用于多个受体的治疗剂 阻断。这些治疗剂包括本文所提供和下文详述的异多聚体。
[0220]另外，提供用于产生与靶区域相互作用的治疗剂。例如，靶向 亚结构域II和IV以干扰受体二聚化和/或以稳定或促进束缚作用。作为这 些方法中的第一步骤，如通过噬菌体展示选择法，鉴定了分别与DII和IV 同源区特异性结合的肽。随后，鉴定到结合DII和IV的合适的高亲和力 肽配对物(peptide pairs)并且使用可用方法之一如化学合成或PEG化法 构建异二聚体。所鉴定的同时结合DII和IV的高亲和力异二聚体肽可以 牢固地维持受体的处于其自身抑制性构型。此外，所选的肽结合物可以靶 向HER家族受体的结构域II和结构域IV中的同源区。使用这种方法靶向 的肽可以交联在束缚的、无活性HER家族成员中的结构域间区域(例如， 稳定DII/IV相互作用)；或可以结合(例如在单一受体的DII上的)不同位点， 因而在空间上抑制该受体二聚化的能力。
[0221]也提供用与多个配体结合的治疗剂靶向配体的方法。可以筛选 受体的配体以鉴定与其结合的分子。可以产生含有两种或多种此类分子的 异多聚体。
[0222]提供用于使受体的束缚构象稳定的方法。HER1、3和4以束缚 形式和开放形式存在。束缚作用在亚结构域II与IV相互作用后形成。在 这种形式中，(DII中的)主要的二聚化臂不能够与其它受体相互作用并且因 而不能形成受体二聚体或异二聚体。估计在细胞表面上的HER受体(HER2 例外，认为它组成型地‘备用于二聚化’)在约95％时间以束缚形式存在于 细胞上(即便用配体刺激时)。稳定受体的束缚形式，从而它不能采取开放 构型，这抑制了受体活性。
[0223]因此，本文中提供解决一个或全部的以上所提及考虑事项和问 题的治疗剂和方法。本文中提供靶向多个受体、尤其HER家族成员的治 疗剂。尤其地，本文中提供泛细胞表面受体治疗剂(包括泛HER治疗剂)、 用于产生并使用此类治疗剂来治疗涉及HER家族受体及其配体的疾病和 病症的方法。也提供用于鉴定泛Her治疗剂候选分子的方法和用于它们的 筛选测定法。此类方法在本文的J部分和实施例中描述。
[0224]在一些实施方案中，设计泛细胞表面受体特异的治疗剂旨在与 一个或多个受体的配体相互作用和/或旨在与一个或多个受体相互作用，以 调节(通常抑制)两个以上受体的活性。这通过形成来自至少一种HER和另 一RTK或其它CSR的两种或多种ECD或其片段的异多聚体而实现，其 中所述的其它CSR可以是或可以不是HER家族的成员。尤其地，至少一 种ECD来自HER受体并且包括至少结构域I、II和III的部分以允许配 体结合及与细胞表面受体二聚化。一般如此连接所述异多聚体，从而二聚 化结构域处于与细胞表面受体相互作用的位置。一般，所述ECD可以包 括促进两种或多种ECD二聚化或多聚化的多聚化结构域。在ECD中包括 含有来自两种或多种不同受体的结构域的杂合ECD。
[0225]在异多聚体中的至少一种ECD含有结构域I-III并且根据需要 含有结构域IV的足够部分，从而所述异多聚体与配体相互作用和/或可用 于与细胞表面受体二聚化，以至于所述异多聚体调节至少两种细胞表面受 体的活性。至少两种细胞表面受体通常包括至少一种HER受体家族成员。
[0226]含有来自两种不同HER家族成员的至少两种ECD或其部分的 泛Her治疗剂可以通过连接受体的胞外结构域部分(如类似于赫赛汀和爱 必妥)和/或通过结合可激活一种或多种受体的配体而阻断HER家族两种或 多种成员的活性。泛Her治疗剂调节两种或多种细胞表面受体(包括作为 HER受体的至少一种细胞表面受体)的活性。
[0227]也提供这样的多聚体，其中所述ECD的两种或多种从相同HER 受体衍生。然而在此类多聚体的二聚体中，所述ECD含有不同的ECD部 分。
[0228]以下部分描述示例性治疗剂、产生、筛选和使用它们的方法。C.HER受体和其它细胞表面受体结构和活性
[0229]本文中提供含有来自不同细胞表面受体(包括受体的HER家族 成员)的ECD的多聚体。此多聚体包括与多聚化结构域连接的受体结构域 和亚结构域的组合。为设计如本文中提供的此类ECD多聚体，对受体结 构和功能的理解是有利的。该部分提供此类描述。
[0230]受体酪氨酸激酶是参与胚胎发生、细胞生长与分化并参与几种 疾病过程包括如此多样的疾病如癌、自身免疫疾病和其它慢性人类疾病的 庞大细胞信号分子家族(综述见Hynes和Lane(2005)Nat Rev Cancer 5： 341-54)。这些受体酪氨酸激酶中表征最充分的是受体酪氨酸激酶中的人 EGF受体家族(HER)。这些受体称作I类受体。受体HER家族属于受体 酪氨酸激酶(RTK)家族，并具有蛋白酪氨酸激酶活性(除HER3外；综述， 参见例如，Jorissen等(2003)Exptl.Cell Res.284：31-53；Dawson等 (2005)Mol.Cell Biol.25：7734-7742，其描述了本文中所用的命名法；和 Bazley等(2005)Endocrine Related-Cancer 12：S17-S27)。存在4种编码 HER家族成员的受体基因：HER1(EGFR或ErbB1)、HER2(或c-erbB-2 或ErbB2或NEU)、HER3(c-erbB3或ErbB3)和HER4(c-erbB4或ErbB4)。 所述编码基因可以经可变剪接以产生众多变体，包括截短变体和作为内含 子融合蛋白的变体。所述受体中的某些在正常发育、分化、移行、伤口愈 合和凋亡中发挥作用，这是必需活性。异常功能和活性在多种疾病状态(包 括癌)中发挥作用。
[0231]示例性人HER家族受体的序列在SEQ ID NO：2(HER1)、 4(HER2)、6(HER3)和8(HER4)中描述并且分别由SEQ ID NO：1、3、5 和7中所述的核苷酸序列编码。一般，编码的HER多肽经历翻译后加工 过程以产生缺少信号序列的成熟多肽。阐述了成熟全长多肽的氨基酸序列 并将它们在图2(A)-(D)和相应附图解说中描述。出于本文目的，在描述示 例性HER家族受体、其ECD部分或ECD同工型中的氨基酸编号参考成 熟多肽的编号，除非特别说明并非如此。此外，用来描述结构域组织形式 的氨基酸位置旨在阐述性说明，并且不意图限制提供的实施方案的范围。 应当理解多肽和对其结构域的描述是基于与相似受体的同源性分析和比对 而在理论上衍生的。因此，确切位置可以变化，并且对每种受体不必是相 同的。
[0232]如图1中所述，HER家族的每个成员共有共同的结构域组织形 式，其包括含约620个氨基酸的胞外结构域部分(ECD或胞外结构域或细 胞外结构域)、跨膜结构域和胞质酪氨酸激酶结构域。ECD部分显示四个 亚结构域，命名为I(L1)、II(S1)、III(L2)和IV(S2)。在全长HER家族之 间的序列同一性对于HER1(EGFR)与HER3是37％并且对于HER1与 HER2是49％，同时每种结构域之间序列同一性的程度不同。例如，酪氨 酸激酶结构域的序列同一性最高(约59-81％)，而羧基端结构域的同一性最 低(约12-31％)。在ECD结构域内部，亚结构域I和III共有大约37％的 序列同一性而结构域II和IV是同源的并共有约17％序列同一性(Ferguson 等(2003)Mol.Cell，11：507-517)。
[0233]亚结构域I和III又称作L结构域，并构成二叶状配体结合位 点。每一L结构域均含有形成桶样结构的六转角单链右手β螺旋，其中所 述的桶样结构在每一末端被一个α螺旋覆盖。配体结合在L1和L2结构域 之间。
[0234]亚结构域II和IV又称作S结构域或半胱氨酸丰富(CR)结构域 (又叫做弗林(furin)样重复结构域)并且构成半胱氨酸丰富区。这个Cys丰 富区域由形成杆状结构的一系列二硫键连接的小模块组成。每一结构域中 存在两种类型的二硫键连接模块：C1二硫键，其中单个二硫键约束了间插 性弓样环，和C2二硫键，其中两个二硫键以Cys1-Cys3和Cys2-Cys4模 式连接4个连续半胱氨酸以形成隆突样结构(Ferguson等(2003) Molecular.Cell，11：507-517)。结构域II含有三个连续C2模块，后续5个 C1模块，而结构域IV含有7个模块，其中头两个是C1模块，后续C2 模块、2个C1模块和另一C2模块。
[0235]一般而言，结构域II和IV介导HER结构的分子内接触和分子 间接触。例如，分子内相互作用在亚结构域I和IV之间在一个称作“束缚” 的过程中发生，在所述的过程中β-环从第五Cys丰富模块中突出(见图1)。 该β-环与来自结构域IV内模块5和模块6中的等效但较小的环相互作用。 结构域II和IV的相互作用进一步由这两个区域之间的氢键以及糖类贡献 而稳定。此外，与HER1的结构域II中Y246对应的氨基酸残基的侧链同 与结构域IV中D563和K585对应的氨基酸残基的侧链形成氢键。在表5 中描述对介导结构域II/IV之间接触重要的在成熟HER家族受体的ECD 中的相应氨基酸残基。在HER2中不存在结构域II和IV之间的相互作用， 部分原因是与其余HER家族成员相比，存在非保守氨基酸残基(即表5中 用斜体表示的残基)。
[0236]也存在分子间相互作用并且允许受体-受体相互作用，其中所述 的受体-受体相互作用是作为活性HER受体特征的同二聚化和异二聚化所 必需的。实际上，上文所述在结构域II的模块5中介导束缚作用的同一种 环对二聚化负责。该环常称作″二聚化臂″。对应于Y246的氨基酸残基在 促进二聚化所需要的分子间相互作用中也是重要的。
[0237]HER家族受体还包括跨膜(TM)结构域(据不同报道在第621、 622或626-644或647位残基处开始)和胞质结构域。所述跨膜结构域贯通 锚定该受体的胞浆膜并且通常包括疏水残基。一般，构成跨膜结构域的残 基形成α-螺旋。
[0238]作为位于跨膜结构域和激酶结构域之间区域的近膜(JM)结构域 起到多种调节功能，例如，下调作用和配体依赖性内化事件、极化细胞中(例 如EGFR)的基底外侧分选和与蛋白质如eps8和钙调蛋白联合。此外，JM 结构域在受体运输中发挥作用并且需要(连同跨膜结构域)用于靶向EGFR 至胞膜穴样内陷。
[0239]酪氨酸激酶结构域是受体酪氨酸激酶(RTKs)共有的保守催化核 心并且负责介导在羧基端结构域中存在的羧基端酪氨酸残基的转磷酸作 用。酪氨酸激酶结构域的激活在因配体与受体结合所诱导的构象变化后出 现。
[0240]羧基端(CT)结构域含有对其磷酸化则调节信号转导的酪氨酸残 基。每个HER家族成员的所述酪氨酸残基和附近氨基酸与多种第二信使 相互作用以调节特定的生物学反应和生物化学反应。例如，含有例如 SH2(src同源性-2)结构或PTB结构域的第二信使识别磷酸化″停靠位点 (docking sites)″并且与受体相互作用以通过与其它信号组分相互作用而 传递在该受体处收到的信号至细胞质或细胞核。还存在几个丝氨酸/苏氨酸 残基，其中对这些残基的磷酸化影响受体下调作用及内吞过程。在EGFR 羧基端中的第984-996位残基(图1)充当肌动蛋白结合位点并在配体激活激 酶结构域后参与更大的受体寡聚体形成和/或受体簇集作用。1.HER1ECD结构和结构域组织形式
[0241]在图2(A)中描述一种全长成熟ECD和多种HER1ECD同工型 的结构域组织形式。HER1的胞外部分包括成熟HER1受体的第1-621位 残基并含有亚结构域I(第1-165位氨基酸残基)、II(第166-313位氨基酸残 基)、III(第314-481位氨基酸残基)和IV(第482-621位氨基酸残基)。HER1 的I、II和III结构域与I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R，参见例如， Garret等(2002)Cell、110：763-773)的头三个结构域具有结构同源性和序列 同源性。类似于IGF-1R，L结构域(即结构域I和III)具有在每一末端被α 螺旋和二硫键覆盖的六转角β螺旋结构。与IGF-1相比较时，HER1序列 包括有助于这些生物化学结构的氨基酸插入物，其中所述的生物化学结构 对HER1介导配体结合是重要的。在这些生物化学结构中包括V形突起 (V-shaped excursion)(第8-18位残基)，这种V形突起位于结构域I的大 β折叠上方以形成配体结合界面的主要部分。在结构域III中，相应的区域 形成也参与配体结合的一个环(第316-326位残基)。结构域III中存在的第 三插入区域(第351-369位残基)是在结构域III的第二转角中的一个额外 环。该环是防止配体结合的多种抗体的表位(即LA22、LA58和LA90，参 见例如，Wu等(1989)J Biol Chem.，264：17469-17475)。此外，在β螺旋螺 线管的第四转角中的其它环参与配体结合作用。
[0242]TGF-α(HER1的一种配体)与一个受体分子的两个L结构域(I和 III)的大β折叠相互作用。类似地，配体EGF也与HER1的两个结构域I 和III相互作用，虽然认为EGF与结构域III的相互作用是EGF的主要结 合位点(Kim等(2002)FEBS，269：2323-2329)。交联研究已经确定EGF配 体的氨基端和羧基端部分分别与HER1受体的结构域I和III相互作用。 在结构域III中与成熟全长HER1相对应的氨基酸Gly441通过与人EGF 的Arg45相互作用而参与介导与EGF结合。具有202个氨基酸(对应于成 熟HER1多肽的第302-503位氨基酸)的40kDa HER1片段足以保留HER1 对EGF的全部配体结合能力。所述具有202个氨基酸的部分含有结构域 III的全部以及结构域II和结构域IV中每一结构域的仅一些残基(Kohda 等(1993)JBC 268：1976)。
[0243]EGFR的结构域II含有8个二硫键连接的模块。结构域II与结 构域I和III均相互作用。与结构域III的接触通过模块6和7发生，而模 块7和8具有一定程度的柔性，因而其作用是在EGFR分子的无配体形式 中产生铰链。一个大的有序环从结构域II的模块5形成并且直接伸出远离 配体结合位点。这个环对应于第240-260位残基(也描述为第242-259位残 基)并含有反平行β-带状结构。此环(又叫做二聚化臂)对于介导分子间相互 作用以及介导受体-受体接触是重要的。在HER1的无活性构象或″束缚″ 构象中，该环通过在分别与成熟全长ECD的第561-569和572-585位氨基 酸相对应的模块5和6中的相似环结构之间插入而有助于分子内相互作用 (见图1)。在上表5中描述了有助于结构域II/IV相互作用的氨基酸残基。
[0244]结构域II环的缺失取消了HER1ECD二聚化的能力，因此显示 它在促进分子间相互作用方面的重要性。二聚化通过该环在结构域I、II 和III之间的空间中伸出横穿第二个HER分子的结构域II而介导。例如， 接触由二聚化臂第244-253位残基与第二HER分子中在结构域II的凹面 上的第229-239、262-278和282-288位残基产生。结构域II中的Tyr246 与第二HER分子中的Gly264及Cys283残基形成氢键，并且Tyr246的苯 基环也与相邻分子的Ser262和Ser282相互作用。在EGFR的结构域II 和另一个HER分子之间的其它氨基酸接触包括Tyr251与Phe263，Gly264， Tyr275及Arg285；Pro248与Phe230及Ala265；Met253与Thr278；和 Tyr251与Arg285。此外，Asn247和Asn256对于维持这个环处在适宜构 象下是重要的。绝大部分的这些残基是在HER家族成员之间保守的并且 在HER家族受体之间类似地发挥作用。此外，脯氨酸残基存在于HER家 族受体的这个环内第243、248、255和257位置的任一位置处，同时HER3 含有3个脯氨酸。脯氨酸残基进一步稳定该环构象。例如，HER1在第248 和257位置处含有脯氨酸。
[0245]除了结构域IV(模块5和6)参与束缚无活性HER1分子之外， 似乎也需要HER1的结构域IV的模块1的至少部分以维持活性HER1分 子的结构完整性。例如，如上文提及，HER1的40kDa蛋白水解片段(其 含有结构域III的全部以及结构域II和IV的部分)保留完全的配体结合能 力。在该分子中存在的结构域IV的部分对应于第482-503位氨基酸，包括 模块1的全部。与成熟HER1分子中Trp492对应的氨基酸通过与结构域 III中的疏水口袋相互作用而在维持HER1分子稳定性中发挥作用。含有全 部的结构域I、II和III但缺少全部的结构域IV的重组HER1分子不能够 结合配体(对应于成熟HER1的第1-476位氨基酸，参见例如，Elleman等 (2001)Biochemistry 40：8930-8939)。因此，对于HER1的配体结合能力而 言似乎需要结构域IV的模块1的至少全部或部分。对于配体结合和信号 传导作用而言，结构域IV的剩余部分是可抛弃的。例如，HER1的正常配 体结合和信号传导特性存在于丢失成熟HER1多肽的第521-603位残基的 一种HER1分子中。2.HER2ECD结构和结构域组织形式
[0246]在图2(B)中描述一种全长成熟HER2ECD和多种HER2ECD 同工型的结构域组织形式。HER2的胞外部分包括成熟HER2受体的第 1-628位残基并含有亚结构域I(第1-172位氨基酸残基)、II(第173-319位 氨基酸残基)、III(第320-488位氨基酸残基)和IV(第489-628位氨基酸残 基)。尽管具有相似的结构域组织形式，然而对HER2的晶体分析已经证实 HER2不具备作为其余HER家族成员的″束缚″、无活性结构特征的同一 分子内相互作用。换句话说，在结构域II的模块5中的环不与结构域IV 的残基相互作用。上表5描述了在HER家族受体中介导结构域II/IV之间 接触的氨基酸，并给出了在HER2中不保守的那些氨基酸。例如，在HER1、 HER3和HER4的第564、563及561位置处保守的Gly残基分别在HER2 中由一个脯氨酸替换。该脯氨酸残基在空间上抑制在其余HER家族受体 中观察到的相互作用(即Gly残基与相应的HER3氨基酸Phe251相互作 用)。因此，由于序列差异，HER2不以“束缚”、无活性状态存在，而组成 型地以活性构象存在，其中HER2在结构域II中的二聚化臂暴露。
[0247]尽管在HER家族受体之间仅具有33-44％序列同源性，然而结 构域II二聚化臂在包括HER2在内的全部HER家族受体之间是功能高度 保守的。在HER2中，这个二聚化臂对应于成熟HER2的第246-267位氨 基酸残基。由于HER2总是以活性、非束缚构象存在，暴露其二聚化臂， 因此HER2是其余HER家族成员的优选异二聚体配偶体。然而，HER2 不形成同二聚体。不能形成同二聚体的原因似乎是静电排斥作用，因为 HER2的二聚化臂和HER2中该二聚化臂接触的口袋均呈电负性。HER2 的高电负性可以归因于与其余HER家族成员相比，在HER2中的酸性及 碱性残基数目更多。然而当HER2在细胞中过量表达时，它能够同二聚化。 过量表达后观察到的同二聚化涉及HER2的羧基端结构域中的疏水区，尤 其对于受体过量表达后观察到的配体非依赖性多聚化(Garret等(2003) Mol.Cell，11；495-505)。
[0248]此外，与其它HER家族受体不同，HER2不与配体结合。这种 不能结合配体的一个原因是配体结合结构域I和III的紧密靠近和相对方 向。在HER2中，相对立的结构域I和III导致彼此间相当大量的直接接 触。在这种构象中，配体不能够与任何潜在结合位点结合，因为每个结合 位点被相对立的配体结合结构域封闭(Garret等(2003)Molecular Cell， 11：495-505)。此外，与其它HER家族成员相比，HER2在结构域I和III 的配体结合界面中含有可以抑制配体相互作用的序列差异。例如，Arg12(对 应于HER1中的Thr15、HER3中的Ser18、HER4中的Ser12)和Pro14(对 应于HER1中的Leu17、HER3中的Thr20、HER4中的Leu14)与其余 HER家族成员中等同位置处的相应残基不同。这些残基是与配体形成伸展 状β折叠的V形突起的部分，并且干扰HER2结合配体的能力。在结构域 I和III中的其它序列差异也导致HER2不能够与配体结合。3.HER3ECD结构和结构域组织形式
[0249]在图2(C)中描述一种全长成熟HER3ECD和多种HER3ECD 同工型的结构域组织形式。HER3的胞外部分包括成熟HER3受体的第 1-621位残基并含有亚结构域I(第1-166位氨基酸残基)、II(第167-311位 氨基酸残基)、III(第312-480位氨基酸残基)和IV(第481-621位氨基酸残 基)。如同其它HER家族受体，HER3的结构域I、II和III的结构可以与 IGF-1R叠加，并且显示如其它HER受体那样的众多相同结构特征。例如， HER3的结构域I和III显示被含二硫键的模块的伸展重复序列间断的β- 螺旋结构。在结构域II与III之间存在高程度的结构域间灵活性，而IGF-1R 不显示这一点。此外，HER3在结构域II中显示特征性β-发夹环或二聚化 臂(对应于HER3的第242-259位氨基酸)。该β-发夹环提供与结构域IV中 保守残基的分子内接触，产生闭合或无活性的HER3结构。上表5中给出 了在这种束缚相互作用中重要的残基，并且这些残基包括Y246与D562及 K583、F251与G563、和Q252与H565的相互作用。当结合配体后，构 象变化使结构域I和III重定向，使二聚化臂从束缚的结构中暴露以允许受 体二聚化。
[0250]不像其它HER家族受体，HER3没有功能性激酶结构域。改变 激酶区域中4个在全部蛋白酪氨酸激酶之间保守的氨基酸残基引起HER3 激酶功能失调。然而，HER3在其羧基端结构域中保留酪氨酸残基并且在 适当激活和转磷酸作用后能够诱导细胞信号传导作用。因而，HER3的同 二聚化不能支持线性信号传导作用。对于HER3而言，优先的二聚化配偶 体是HER2。4.HER4ECD结构和结构域组织形式
[0251]在图2(D)中描述一种全长成熟HER4ECD和多种HER4ECD 同工型的结构域组织形式。HER4的胞外部分包括成熟HER4受体的第 1-625位残基并含有亚结构域I(第1-163位氨基酸残基)、II(第164-308位 氨基酸残基)、III(第309-477位氨基酸残基)和IV(第478-625位氨基酸残 基)。HER4与HER1最相似，因为如同HER1那样，HER4能够结合配体 并表现激酶活性。在HER4中存在这样的结构域组织形式，其包括存在对 束缚作用和二聚化均重要的二聚化臂。上表5概述了在结构域II和IV中 将HER4锁定于无活性状态下的保守残基。在HER1中的相应二聚化臂对 应于HER4的第237-258位氨基酸残基。就配体结合结构域I和III而言， 结构域I是负责配体神经调节蛋白(NRG)结合至HER4的主要结构域。 HER4的结构域I识别NRG的氨基端残基(Kim等(2002)Eur.J.Biochem 269：2323-2329)。
[0252]全长HER4受体表达为四种可变剪接同工型。可变剪接同工型 中的两种在胞质尾中不同(即CYT-1和CYT-2)，并且其余两种在近膜区中 不同(即JM-a和JM-b)。可变剪接的结果是产生具有不同信号传导能力的 同工型。例如，CYT-1同工型含有一个额外外显子，其含有在CYT-2同 工型中不存在的用于信号分子的额外停靠位点(即SH2)。此外，所述JM同 工型在它们对蛋白酶切割例如被肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)切割的敏 感性方面不同。5.HER家族配体、配体特异性和配体介导的受体激活
[0253]受体ErbB(HER)家族成员的活性需要配体结合以二聚化，这引 起催化活性，最终导致信号转导。存在分别属于配体EGF家族的几种HER 特异性配体(参见例如，表6)。全部EGF配体具有EGF样结构域，该结构 域是一个带六个半胱氨酸的45-55氨基酸基序，其中所述的六个半胱氨酸 相互作用以形成由二硫键共价连接的3个环。该区域对赋予HER配体的 结合特异性是重要的。在EGF配体中的其它结构基序包括免疫球蛋白样结 构域、肝素结合位点和糖基化位点。通常，配体最初表达为需要蛋白酶剪 切以在溶液中实现活性和/或以与细胞表面HER蛋白结合的膜锚定蛋白。 这种切割要求起到控制配体可获得性和受体激活的作用。参与EGF配体散 播的蛋白酶包括例如来自金属蛋白酶家族(包括去整联蛋白和金属蛋白酶 (ADAM)家族)和基质金属蛋白酶(MMP)家族的那些蛋白酶。G蛋白偶联受 体(GPCR)的激活调节EGF配体的产生。在癌症中，肿瘤中的GPCR信号 传导作用失调和EGF配体占优势与HER受体的组成型激活相关。
[0254]表6列出了这些配体中最熟知和表征最充分之列的配体及其受 体特异性。基于受体偏好性，将配体分成三组(下表中概述为第1-3组)。这 些配体均不与HER2结合，其中HER2与其余家族成员中的每一种成员异 二聚化。在下表中，细胞因子神经调节蛋白(NRG)家族的备选名称包括Neu 分化因子、NDF或Her调节蛋白(heregulin；HRG)。配体的神经调节蛋白 /Her调节蛋白家族是从可变剪接的NRG-1、NRG-2、NRG-3或NRG-4基 因衍生的结构相关性生长因子。例如，存在从NRG-1基因衍生的至少14 种可溶的跨膜蛋白同工型。跨膜NRG-1同工型胞外结构域的蛋白酶解加工 释放出可溶性生长因子。HRG-1β是这些可溶性生长因子之一并且含有对 直接与HER3和HER4结合是必需的Ig结构域和EGF样结构域。仅含有 Her调节蛋白β的EGF结构域的重组人HRG-1β足以结合并激活HER受 体。NRG-1基因的另一种同工型是HRG1-α。HRGα对HER3和HER4 的结合亲和力比HRGβ弱100倍(Jones等(1999)FEBS Letters，447： 227-231)。存在至少两种NRG-2同工型，称作NRG2-α和NRG2-β。NRG2-α 和NRG2-β均是HER3激动剂并刺激HER3信号传导作用。NRG2β也是 HER4的激动剂，但NRG2-α不是HER4酪氨酸磷酸化或信号传导作用的 有力刺激物。不存在其它已报道的NRG-3和NRG-4的同工型。
[0255]由于存在远远超过15种可以与HER家族成员结合的不同EGF 配体，因而控制和调节HER家族信号传导作用是复杂的。在调节这种复 杂信号系统的因子中包括受体配体的组织特异性表达。例如，NRG优势地 表达在实质器官内以及胚中枢和周围神经系统中。此外，虽然配体一般能 够与单体受体结合，然而它们不能够激活单体受体。相反，与单体受体相 比，受体的二聚体形成和最终HER介导的激活与信号传导作用由两个 HER受体与一个配体的复合体的更高稳定性驱动。与单体受体的配体结合 不仅介导单体受体的构象变化以允许受体同二聚化或异二聚化(见下文)， 而且配体还在一旦二聚体受体形成后使之稳定。因此，对于激活，多种二 聚体配对物取决于受体浓度以及配体浓度。因此，HER的激活受其配体的 空间和时间表达控制。6.二聚化与束缚、以及活性同二聚体和异二聚体的产生
[0256]控制HER家族受体激活的机制取决于配体结合和在受体中构象 变化的诱导。一般，在HER受体的无活性形式与活性形式之间存在平衡。 至少在HER1的例子下，大约95％以束缚形式或无活性形式存在于细胞表 面上；并且仅5％处于活性形式。
[0257]在结合的配体缺乏时，在单体受体中，结构域II中的二聚化臂 因与相同分子内的亚结构域IV相互作用而被埋入一个分子内系索(tether) 中，因而使受体自身抑制。因此，正常情况下，除HER2之外，所有HER 受体处于无活性或″束缚″的构象。束缚的构象是受体的闭合形式，其中所 述的闭合形式防止该受体与其它HER家族成员相互作用。正常情况下， 在这种构象中，保持配体结合结构域I和III远隔分开。对于全部HER家 族受体也是如此，除HER2之外。对于HER2，即便作为单体受体，结构 域I和III在结构上靠近并且在空间上抑制配体与该区域的结合。因此， HER2不能够与配体结合，并且总是使HER2的二聚化臂暴露并且随时准 备用于促进与另一HER家族受体二聚化。
[0258]HER受体分子的配体诱导二聚化诱导受体激活并提供受体 HER家族的正常下游信号作用机制。激活性配体与结构域I和/或III相互 作用，促进ECD中的重排，导致束缚构象开放和二聚化臂的暴露。结合 的配体将结构域I和III的相对位置固定，迫使它们转动(对于HER1而言， 大约130°)。这种重排打破分子内结构域II/IV连接或束缚，并且释放二聚 化臂，从而该二聚化臂能够参与分子间相互作用。这产生受体的″开放″或 活性构象并使分子有能力与其它HER家族成员二聚化。HER2总是处于开 放构象，即便作为单体也是如此。因此，即便缺乏配体，然而HER2能够 与另一HER家族成员二聚化，虽然HER2不与自身二聚化，除非过量表 达。在开放构型中，二聚化臂(见图1)从结构域II中伸出并且能够通过非 共价相互作用(如同嗜性及疏水性相互作用、范德瓦尔斯相互作用和氢键作 用)与位于第二受体中结构域II二聚化环的基部处的口袋相互作用。在二 聚化环中的突变可以导致组成型二聚化，在HER2的情况下已经证实这种 组成型二聚化诱导细胞转化(Bazley等(2005)Endocrine-Related Cancer 12：S17-S27)。在亚结构域环II与亚结构域I和II之间存在接触。也可以形 成更高级的结构如异四聚体(见，例如，Jorissen等(2003)Exptl.Cell Res. 284：31-53)。
[0259]仅二聚化臂不足以发生二聚化。额外的相互作用(包括结构域 II/III相互作用)使受体二聚化作用稳定(见，例如，Dawson等(2005) Mol.Cell.Biol.25：7734-7742)。如上所讨论，尽管二聚化臂是在HER1、2、 3和4之间高度保守的，然而HER2不能形成同二聚体。对于HER1，模 块6为同二聚化提供额外的自我互补性相互作用(包括D279和H280)。模 块7参与HER2/HER3异二聚化。这些残基是在全部四种HER受体之间 保守的(见，例如，Dawson等(2005)Mol.Cell.Biol.25：7734-7742)。7.HER家族受体活性
[0260]HER表达于上皮、间充质和神经元起源的多种组织并且调节生 长、存活、增殖和分化。在正常生理条件下，HER的激活由其配体的空间 和时间表达控制，其中所述的配体是生长因子EGF家族的成员(见上文)。 配体与HER受体的结合诱导受体同二聚体和异二聚体形成和内在激酶结 构域的活化，造成在胞质尾中的特定酪氨酸残基上磷酸化。这些磷酸化的 残基充当一系列效应蛋白的停靠位点，其中召集所述效应蛋白导致胞内信 号传导途径活化。例如，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途径通过召集PI3K 的p85接头亚基至受体而受到刺激。促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途 径通过召集生长因子受体结合蛋白2(GRB2)或SHC至受体而激活。
[0261]每种受体的活化在几个方面彼此不同。例如，HER2没有相应的 生长因子配体，并且HER3没有充分定义的酪氨酸激酶活性。这两种受体 通常共依赖于其它成员以便能够发生信号传导作用，尽管当HER2充分地 过量表达时，HER2能够在无共受体(co-receptor)或配体下有力地发生 信号传导作用。相反，HER3同二聚体是完全无活性的，原因在于酪氨酸 激酶结构域的缺陷性激酶活性。一般，HER异二聚体比HER同二聚体更 有力地发生信号传导作用。这是因为异二聚体提供来自两种不同受体的不 同胞质尾，因而提供用于召集不同效应分子的额外磷酸酪氨酸残基和不同 磷酸化模式。因此，HER异二聚化是可以借以使信号扩增并多样化信号的 机制。HER2/HER3异二聚体是最有力的受体信号作用配对物。 HER2/HER3异二聚体的效力增加存在几个原因。首先，HER2和HER3 与多样信号传导途径偶联，所述的信号传导途径、包括在细胞增殖中重要 的促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径、和调节细胞存活和抗凋亡信号的 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径。此外，HER2/HER3异二聚体也具有 延长的信号传导作用，其原因在于受体的高效再循环和细胞表面受体表达 的低效下调作用。
[0262]已经证实每一种HER受体在多种细胞过程包括细胞分化、细胞 增殖、细胞存活、血管生成以及移行与侵入中发挥作用。HER受体是在发 育的胚和成年组织中细胞增殖和分化的必需中介体，但是它们的不适当激 活与多种癌(包括例如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌)和其它疾病的发展和严 重性相关。存在影响疾病相关性HER受体不适当激活的众多机制。在这 些机制中包括例如导致受体过量表达的基因扩增异常或转录异常、基因突 变和因HER配体过量产生所致的自分泌刺激作用。因此，靶向HER受体， 例如通过本文中提供的泛治疗剂而靶向HER受体，是可以借以调节这些 过程以治疗与不适当的HER信号传导作用相关的疾病或病症的机制。以 下过程属于由HER受体信号传导作用介导的此类活性和相应细胞过程。 这些过程、细胞增殖、细胞存活、血管生成和细胞移行与侵入是肿瘤发生 的标志。这些过程也可以进行体外监测，如在G部分中描述，以评估此类 治疗剂的可行性。a.细胞增殖
[0263]HER受体信号传导作用通过控制细胞周期检查点(checkpoint) 而在调节增殖中发挥作用。例如，HER2的过量表达调节异常G1-S转换 并且驱动细胞增殖。由HER2诱导的强烈信号导致蛋白质c-Myc和细胞周 期蛋白D增加的水平。这些蛋白质的每一种均起到螯合蛋白质p27，其中 所述的p27是细胞周期蛋白激酶抑制剂。细胞周期蛋白E-CDK2介导进入 细胞周期。对p27的螯合防止p27与细胞周期蛋白E-CDK2结合以抑制其 活性，并且因此导致不受控制的细胞增殖。对HER2信号作用的抑制导致 MAPK和P13K/AKT途径下调，这降低c-Myc和细胞周期蛋白D的水平。 这允许未复合的p27结合至细胞周期蛋白E-CDK2并灭活后者以防止持续 的细胞增殖。b.细胞存活
[0264]HER家族受体通过调节参与内在凋亡途径的效应蛋白而调节细 胞存活。例如，因HER信号作用所致的细胞存活通过PI3K/AKT途径介 导，其中所述的PI3K/AKT途径以抑制促凋亡蛋白BAD和胱天蛋白酶9 的底物为靶。此外，由AKT磷酸化的靶底物也包括抑制几种促凋亡基因 例如FAS配体以及其它转录因子(即NF-κB)表达的转录因子，其中所述的 其它转录因子上调促存活蛋白例如BCL-XL的水平。c.血管生成
[0265]HER信号传导作用诱导多种促血管生成因子例如血管内皮生长 因子(VEGF)表达。例如，HER1的激活诱导产生VEGF。此外，HER2的 过量表达与结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌和非小细胞肺癌中 VEGF的增加产生相关。VEGF的血管生成效果通过它结合并激活两种表 达在内皮细胞上的相关受体(即VEGFR-1和VEGFR-2)而与其在新血管发 育(即血管生成)和血管维持或未成熟血管存活中的作用相关。血管生成在 肿瘤发生中发挥作用。d.移行和侵入
[0266]对HER信号传导作用的刺激也介导细胞运动性和移行的多个方 面，其中所述的细胞运动性和移行在胚发育、伤口愈合期间以及在肿瘤生 长和转移中发挥重要作用。细胞运动反应可以由类型广泛的在HER激活 后所诱导的信号传导途径启动。例如，由HER1对PLCγ依赖性途径的激 活与HER1诱导的细胞移行相关，因为对这种酶的抑制阻断EGF诱导的 细胞移动(Jorissen等(2003)Exp.Cell Res.284：31-53)。EGF介导的细胞移 行机制已经与刺激肌动蛋白细胞骨架重排关联，其原因是PLC-γ介导的释 放肌动蛋白修饰蛋白(即凝溶胶蛋白、肌动蛋白抑制蛋白、肌动蛋白丝切蛋 白(cofolin)和CapG)。MAPK也在HER介导的细胞运动性中发挥作用， 例如，通过调节整联蛋白水平。参与HER介导的细胞移行和运动性的其 它信号传导途径或效应分子包括PI3-K和参与膜变皱和伪足形成的下游效 应分子Rac、和参与细胞变圆和皮质肌动蛋白聚合的Rho。
[0267]此外，由HER信号传导作用诱导的移行和侵入还与切割胞外基 质组分的基质金属蛋白酶(MMP)的增加表达有关。例如，由神经调节蛋白 对HER3和HER4的刺激与因诱导MMP-2和MMP-9所致的肿瘤细胞侵 入和产生蛋白水解活性关联。8.其它CSR ECD
[0268]除了靶向HER家族成员外，也可以设计本文中提供的治疗剂旨 在还靶向参与疾病过程的任何其它细胞表面受体(CSR)或其配体，所述疾 病过程包括但不限于肿瘤发生、血管生成或炎性疾病。尤其地，其余ECD 来自参与或涉及发展靶向一种受体的治疗剂耐药性的受体。
[0269]一般地，此种CSR是受体酪氨酸激酶(RTK)。通常地，此种治 疗剂含有足以与配体相互作用和/或防止受体二聚化的CSR的ECD或其部 分。RTKs的实例包括但不限于表皮生长因子(EGF)受体(如上所讨论)、血 小板衍生的生长因子(PDGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、胰岛 素样生长因子(IGF)受体、神经生长因子(NGF)受体、血管内皮生长因子 (VEGF)受体、针对肝配蛋白(称作Eph)的受体、肝细胞生长因子(HGF)受 体(称作MET)、TIE/Tie-1或TEK/Tie-2(血管形成因子-1的受体)、盘基菌 蛋白(discoidin)结构域受体(DDR)和其它RTKs，如Tyro3/Axl。可以用 ECD部分作为治疗剂的其它CSR包括但不限于TNFR(即TNFR1、 TNFR2、CD27、4-1BB、OX40、HVEM、LtβR、CD30、GITR、CD40 和其它等)或RAGE。表7列出示例性CSR并描述了构成各自多肽的ECD 的氨基酸。RTKs和其它CSRs的示例性序列和所编码的氨基酸在任意的 SEQ ID NO：193-262中描述。
[0270]包括生长因子受体在内的RTKs的胞外结构域由多样类别的模 块结构域构成，其中所述的模块结构域包括但不限于纤连蛋白III型结构 域、半胱氨酸丰富结构域、表皮生长因子结构域和免疫球蛋白(Ig)样结构域。 对于许多RTKs而言，Ig样结构域负责配体结合作用(参见例如，Wiesmann 等(2000)J Mol.Med.78：247-260)。Ig样结构域一般含有形成含3-5条β- 链的两个反平行β-折叠的80-110个残基，同时所述的β-折叠在一些情况 下由二硫键连接。根据β-链数目，Ig样结构域分成四类：V(可变)、I(中间)、 和C1和C2(恒定)。例如，C2类的结构域含有最少数目的β-链，在第一β- 折叠内含有4条β-链并且在第二β-折叠内含有4条β-链。表8描述含有Ig 样结构域的示例性RTK家族成员及与它们结合的配体。
[0271]以下讨论意在举例。应当理解可以在异多聚体中组合对于配体 结合和/或二聚化所需要的ECD或其部分，特别是与HER ECD或其部分 组合。(a)VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR)
[0272]VEGFR1和VEGFR2与VEGF结合并且在VEGF-诱导的血管 生成反应中发挥作用。内皮细胞形态发生需要VEGFR1，而VEGFR2在 有丝分裂发生中发挥作用。VEGFR1和VEGFR2的ECD结构均含有7个 Ig样结构域，并且这两种受体类似地与VEGF结合，虽然VEGFR1也与 配体PIGF结合。因此，VEGFR1与VEGFR2之间在功能上的不同似乎 在于受体的胞内酪氨酸激酶序列和它们不同的信号转导特性。相关受体 VEGFR3也含有7个Ig样结构域，但是不与VEGF结合。对于SEQ ID NO：254中所述的VEGFR1的序列，第一Ig样结构域对应于第32-123位 氨基酸，第二Ig样结构域对应于第151-214位氨基酸，第三Ig样结构域 对应于第230-327位氨基酸，第四Ig样结构域对应于第335-421位氨基酸， 第五Ig样结构域对应于第428-553位氨基酸，第六Ig样结构域对应于第 556-654位氨基酸，并且第七Ig样结构域对应于第661-747位氨基酸。对 于SEQ ID NO：256中所述的VEGFR2的序列，第一Ig样结构域对应于第 46-110位氨基酸，第二Ig样结构域对应于第141-207位氨基酸，第三Ig 样结构域对应于第224-320位氨基酸，第四Ig样结构域对应于第328-414 位氨基酸，第五Ig样结构域对应于第421-548位氨基酸，第六Ig样结构 域对应于第551-660位氨基酸并且第七Ig样结构域对应于第667-753位氨 基酸。
[0273]对于VEGFR1，第二Ig样结构域(结构域2)决定配体结合作用 和特异性，因为从VEGFR1ECD中缺失该结构域取消了该受体结合VEGF 的能力(Smyth等(1996)EMBO J.15：4919-4927)。缺失其余结构域仅减少与 VEGF的结合，但不取消这种结合。然而，单独的结构域2不足以结合 VEGF。结构域1和2或结构域2和3也不显示与VEGF结合，或仅显示 与VEGF微弱结合。VEGFR1中仅含有结构域1、2和3的ECD部分具 有与全长VEGFR1实质上相同的对VEGF的亲和力。(b)FGFR1-FGFR4
[0274]FGFR的ECD含有三个Ig样结构域。例如，对于SEQ ID NO： 236中所述的FGFR2的序列，第一Ig样结构域对应于第39-125位氨基酸， 第二Ig样结构域对应于第154-247位氨基酸并且第三Ig样结构域对应于 第256-358位氨基酸。存在由可变剪接产生的4种FGFR。各FGFR由配 体亚组(属于至少19种相关FGF配体)激活并且在Ig结构域III中的可变 剪接可以显著改变某些配体的特异性(Chellaiah等(1999)JBC， 274：34785-34794)。因此，FGF配体的主要配体结合位点一般位于不同的 Ig样结构域中，最通常位于结构域2和结构域3中(Cheon等(1994)PNAS， 91：989-993)。例如，FGFR2中的结构域3突变抑制与FGF2的结合，而不 影响与FGF1和FGF7的结合。此外，用嵌合FGFR分子的研究已经确定 FGF1与结构域2或结构域3结合；FGF2优先地识别含有Ig结构域2和 3的FGFR1的远端序列；FGF8识别Ig结构域2或FGFR3氨基端和羧基 端的序列；并且FGF9结合作用依赖于FGFR3中的Ig结构域2氨基端的 序列并且该序列包括FGFR3中的Ig结构域2，而不需要结构域3(Chellaiah 等(1999)JBC，274：34785-34794)。对于FGF与FGFR的结合，肝素的存在 优化配体结合亲和力。c)IGF-1R
[0275]RTK受体的示例是IGF-1R。胰岛素受体家族含有同源的酪氨 酸激酶受体，包括胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子1受体(IFG1R)和胰 岛素受体相关受体。IR和IGF-1R均作为单条多肽链合成并且被蛋白酶切 割以产生由二硫键连接的两条不同的链，称作α和β。α链是该受体的胞 外部分并结合配体，而β链具有一个胞外区、单次跨膜节段和一个在结合 配体后介导信号转导的胞内酪氨酸激酶结构域。IGF-1R的胞外部分具有6 个在结构上不同的结构域。头三个结构域与HER胞外结构域I-III同源， 也即L1(对应于SEQ ID NO：260的第51-61位氨基酸)、半胱氨酸丰富结构 域(对应于SEQ ID NO：260的第175-333位氨基酸)和L2(对应于SEQ ID NO：260的第352-467位氨基酸)。这三个结构域形成该受体的最小配体结 合部分并且介导与胰岛素的低亲和力结合。L2结构域的羧基端是三个胞外 纤连蛋白3型模块，为在α链中的一个模块(对应于SEQ ID NO：260的第 489-587位氨基酸)，在α-β连接模块中的一个模块(对应于SEQ ID NO：260 的第611-703位氨基酸)和在β链中的第三模块(对应于SEQ ID NO：260的 第831-926位氨基酸)。α和β链形成αβ异二聚体并且两个异二聚体通过二 硫键连接以形成完整的(αβ)2受体。就HER家族受体而言，需要配体结合 以激活该受体并诱导胞质结构域的转磷酸作用。IGF-1R的激活涉及细胞生 长、转化和凋亡。(d)RAGE和其它CSR
[0276]本文中还构思了其它CSR ECD，包括来自RAGE CSRs的那些 ECD(见共同待决的美国申请系列号11/429,090)并且其中引用的参考文献 描述了RAGE CSR和示例性ECD及CSR同工型。上表7也描述了全长 RAGE和其ECD部分的序列。D.ECD多聚体的组分和ECD多聚体的形成
[0277]ECD异多聚体包括用于与配体结合和/或二聚化的至少2种不同 ECD或其部分。在本文的示例性实施方案中，组分ECD中至少一种是用 于配体结合和/或二聚化的HER ECD，通常HER1、3或4中至少一种的 ECD或其部分。通常，ECD中至少两种是来自HER、特别是来自HER1 和HER3或HER4的。其它ECD包括这样的ECD，其来自其它CSR，通 常是RTKs，特别是与肿瘤发生或血管生成或炎性疾病相关的任何CSR， 并且一般是与靶向单一细胞表面受体的药物的耐药性相关的任何CSR。 ECD多肽也可以是含有来自两种或多种CSR的结构域的杂合ECD分子。 在异多聚体中的ECD连接，从而形成多聚体、至少异二聚体。构思了允 许或导致ECD相互作用以形成异多聚体的任何连接，从而所得的多聚体 分子与针对该ECD关联受体之一或全部的配体相互作用和/或与所述关联 受体或其它相互作用性受体之一或这两者相互作用，以抑制二聚化。此类 连接可以是基于共价及非共价相互作用的任何稳定连接。1.ECD多肽
[0278]用于产生本文所提供的ECD多聚体中的ECD多肽可以是CSR 例如任何RTK的ECD的全部或部分，或其含有ECD的任何部分。一般， 除非所述ECD是HER2的全部或部分，否则所得的ECD保留其结合配体 的能力。此外，属于HER家族(例如全部或部分的HER1、HER2、HER3 或HER4)的ECD一般也保留其与HER家族受体(包括全长HER家族受体) 二聚化的能力。因此，当多聚体配偶体是HER ECD时，则该HER ECD 多肽部分包括亚结构域I和亚结构域III的至少足够部分以结合配体和亚结 构域II的足够部分用于二聚化。通常地，该HER ECD也含有亚结构域IV 的模块1的至少部分。亚结构域IV的剩余部分是任选的。(a)HER家族全长ECD
[0279]在本文提供的HER多聚体中含有的ECD多肽可以是HER多 肽的全长ECD。对于HER多肽而言，所述HER ECD含有足以能够结合 配体和足以介导与关联或相关HER家族受体二聚化的结构域I、II、III 和IV。HER ECD多肽也包括在HER多肽的ECD部分内的等位变体或物 种变体或其它已知变体，只要所得HER ECD多肽保留其与配体结合和/ 或与关联受体或相关HER家族受体二聚化的能力。(i)HER1ECD
[0280]全长HER1ECD多肽可以用在本文所提供ECD多聚体的形成 中。这种全长HER1ECD含有成熟HER1受体的第1-621位氨基酸残基 (HER1-621；HF100)。HF100分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：11中描述 并且编码具有在SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的全长HER1ECD多 肽。全长HER1ECD多肽包括与SEQ ID NO：12中所示示例性HER1ECD 多肽相比时，在氨基酸序列中具有一个或多个变异的任何全长HER1ECD 多肽。在HER1多肽中的变异的示例是与如SEQ ID NO：263中所示前体 HER1多肽中的任何等位变体相对应的任何变异。在HER1全长ECD多 肽中的示例性变异包括与SEQ ID NO：12中的R74Q、P242R、R497K或 C604S中任意一个或多个相对应的任意一个或多个变异。(ii)HER2ECD
[0281]本文提供的ECD多聚体也可以含有这样的全长HER2ECD多 肽，其含有成熟HER2受体的第1-628位氨基酸残基(HER2-650；HF200)。 HF200分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：17中描述并且编码具有在SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列的全长HER2ECD多肽。全长HER2ECD 多肽包括与SEQ ID NO：18中所示示例性HER2ECD多肽相比时，在氨 基酸序列中具有一个或多个变异的任何全长HER2ECD多肽。在HER2 多肽中的变异的示例是与如SEQ ID NO：264所示前体HER2多肽中的任 何等位变体相对应的任何变异。在HER2全长ECD多肽中的示例性变异 包括与如SEQ ID NO：18所示的任意一个或多个W430C相对应的任意一 个或多个变异。(iii)HER3ECD
[0282]在另一个例子中，全长HER3ECD多肽可以用在本文所提供 ECD多聚体的形成中。这种HER3ECD多肽含有成熟HER3受体的第 1-621位氨基酸残基(HER3-621；HF300)。HF300分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：25中描述并且编码具有在SEQ ID NO：26中所述氨基酸序列的全长 HER3ECD多肽。全长HER3ECD多肽包括与SEQ ID NO：26中所述示 例性HER3ECD多肽相比时，在氨基酸序列中具有一个或多个变异的任何 全长HER3ECD多肽。在HER3多肽中的变异的示例是与如SEQ ID NO：265所示前体HER3多肽中的任何等位变体相对应的任何变异。在 HER3全长ECD多肽中的示例性变异包括与SEQ ID NO：26中任意一个或 多个G541E相对应的任意一个或多个变异。(iv)HER4ECD
[0283]本文提供的ECD多聚体也可以含有这样的全长HER4ECD多 肽，其含有成熟HER4受体的第1-625位氨基酸残基(HER4-650；HF400)。 HF400分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：31中描述并且编码具有在SEQ ID NO：32中所述氨基酸序列的全长HER4ECD多肽。全长HER4ECD 多肽包括与SEQ ID NO：32中所述示例性HER4ECD多肽相比时，在氨 基酸序列中具有一个或多个变异的任何全长HER4ECD多肽。在HER4 多肽中的变异的示例是与如SEQ ID NO：266所示前体HER4多肽中的任 何等位变体相对应的任何变异。在HER4全长ECD多肽中的示例性变异 包括与如SEQ ID NO：32所示氨基酸序列相对应的任意一个或多个氨基酸 变异。(b)HER家族的截短ECD
[0284]在本文提供的HER多聚体中所含有的ECD多肽可以是HER 多肽的截短ECD。对于截短的HER多肽而言，所述HER ECD一般含有 结构域I和III的足够部分以结合配体和结构域II的足够部分以介导受体 二聚化。通常，截短的HER ECD也含有结构域IV的模块1的至少一部 分以例如稳定该分子。结构域IV的任何剩余部分是任选的。此外，截短 的ECD多肽也可以包括不是该HER ECD部分的额外序列，只要所述的 额外序列不抑制或不干扰所述HER ECD多肽的配体结合作用和/或受体二 聚化。例如，截短的ECD多肽可以包括通过可变剪接产生的多肽，例如， 但不限于含有内含子编码的氨基酸的多肽。截短的HER ECD多肽也包括 在截短HER多肽的ECD部分内的等位变体或物种变体或其它已知变体， 只要所得的截短HER ECD多肽保留其与配体结合和/或与关联受体或相关 HER家族受体二聚化的能力。(i)截短的HER1ECD
[0285]在一个实例中，可以用在本文提供的ECD多聚体中的截短 HER1ECD多肽含有成熟HER1受体的第1-501位氨基酸残基 (HER1-501；HF110)。HF110分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：9中描述 并且编码具有在SEQ ID NO：10中所述氨基酸序列的截短HER1ECD多 肽。HF110含有关联HER1ECD的结构域I、II和III的全部，和结构域 IV的模块1的全部。
[0286]还构思了用于ECD多聚体中的是因可变剪接而产生的截短 HER1ECD多肽。此类同工型包括本领域已知或在相关美国专利公开号 US 2005-0239088中描述或本文以下作为内含子融合蛋白提供的任何同工 型。这样一种示例性截短HER1ECD多肽是由SEQ ID NO：128中所述核 苷酸序列编码的EGFR同工型b(NP_958439；SEQ ID NO：129)。这种截短 的HER1ECD多肽具有628个氨基酸(包括对应于第1-24位氨基酸残基的 信号肽)并且在其羧基端含有一个在关联HER1ECD中不存在的额外氨基 酸。在SEQ ID NO：129中描述的前体截短的HER1ECD多肽的成熟形式 (不包括信号序列)具有604个氨基酸长度，如图2(A)中描述，并且含有一 种关联HER1ECD的结构域I、II和III以及结构域IV的几乎全部，及至 并且包括绝大部分的模块7。在其它实例中，截短的HER1ECD多肽可以 包括由SEQ ID NO：130中所述核苷酸序列编码的EGFR同工型d (NP_958441；SEQ ID NO：131)。这种截短的HER1ECD多肽具有705个 氨基酸(包括对应于第1-24位氨基酸残基的信号肽)并且在其羧基端含有76 个在关联HER1ECD中不存在的额外氨基酸。在SEQ ID NO：131中描述 的前体截短的HER1ECD多肽的成熟形式(不包括信号序列)具有681个氨 基酸长度，如图2(A)中描述，并且含有关联HER1ECD的结构域I、II和 III以及结构域IV的大部分，包括及至模块7和模块7的大部分。
[0287]截短的HER1ECD多肽包括，与例如SEQ ID NO：10、129或 131中所述的示例性截短HER1ECD多肽相比时，在氨基酸序列中具有一 个或多个变异的任何截短的HER1ECD多肽。在HER1多肽中的变异的 示例是与如SEQ ID NO：263所示前体HER1多肽中的任何等位变体相对 应的任何变异。在截短的HER1ECD多肽中的示例性变异包括与SEQ ID NO：10中的R74Q、P242R或R497K中任意一个或多个相对应的任意一个 或多个变异。示例性变异也可以包括与具有如SEQ ID NO：129或131所示 氨基酸序列的截短HER1多肽中R98Q、P266R、R521K、C628S或V674I 相对应的任意一个或多个氨基酸变异。(ii)截短的HER2ECD
[0288]ECD多聚体也可以含有截短的HER2ECD多肽。例如，含有成 熟HER2受体的第1-573位氨基酸残基的截短HER2ECD多肽 (HER2-595；HF210)可以在ECD多聚体的形成中使用。HF210分子的核 苷酸序列在SEQ ID NO：15中描述并且编码具有在SEQ ID NO：16中所述 氨基酸序列的截短HER2ECD多肽。HF210包含关联HER2ECD的结构 域I、II和III的全部，以及及至并包括结构域IV的模块5的部分。本文 中还提供含有成熟Her2受体的第1-508位氨基酸残基的截短HER2ECD 多肽(HER2-530；HF220)作为多聚化配偶体。HF220的核苷酸序列在SEQ ID NO：13中描述并且编码具有在SEQ ID NO：14中所述氨基酸序列的截 短HER2ECD多肽。HF220包含关联HER2受体的结构域I、II和III的 全部，以及及至并包括结构域IV的模块1的全部。
[0289]还构思了用于ECD多聚体中的是因可变剪接而产生的截短 HER2ECD多肽。此类同工型包括本领域已知或在相关美国专利公开号 US 2005-0239088中描述或本文以下作为内含子融合蛋白提供的任何同工 型。这样的一种示例性截短HER2ECD多肽是具有SEQ ID NO：137中所 述氨基酸序列的ErbB2.1e。这种截短的HER2ECD多肽具有633个氨基 酸，包括对应于第1-22位氨基酸残基的信号肽。在SEQ ID NO：137中描 述的前体截短的HER2ECD多肽的成熟形式(不包括信号序列)具有611个 氨基酸长度，如图2(B)中描述，并且含有关联HER2ECD的结构域I、II 和III以及结构域IV的几乎全部，及至并包括模块7的大部分。在额外的 实例中，截短的HER2ECD多肽是具有SEQ ID NO：136中所述氨基酸序 列的ErbB2.1d。这种截短的HER2ECD多肽具有680个氨基酸，包括对 应于第1-24位氨基酸残基的信号肽，其中该信号肽与SEQ ID NO：4所示 的关联HER2中的信号肽相比，含有两个氨基酸插入物。ErbB2.1d还在其 羧基端含有30个在关联HER1ECD中不存在的额外氨基酸。在SEQ ID NO：136中描述的前体截短的HER2ECD多肽的成熟形式(不包括信号序 列)具有656个氨基酸长度，如图2(B)中描述，并且含有关联HER2ECD 的结构域I、II和III，以及结构域IV的大部分，包括模块1-7的全部。
[0290]截短的HER2ECD多肽包括，与例如SEQ ID NO：14、16、136 和137中所述的示例性截短HER2ECD多肽相比时，在氨基酸序列中具有 一个或多个变异的任何截短的HER2ECD多肽。在HER2多肽中的变异 的示例是与如SEQ ID NO：264所示前体HER2多肽中的任何等位变体相 对应的任何变异。在截短的HER2ECD多肽中的示例性变异包括与SEQ ID NO：14或16中W430C相对应的任意一个或多个变异。示例性变异也 可以包括与具有分别如SEQ ID NO：137或136中所述氨基酸序列的截短 HER2多肽中W452C或W454C对应的任意一个或多个氨基酸变异。(iii)截短的HER3ECD
[0291]ECD多聚体也可以含有这样的截短HER3ECD多肽 (HER3-500；HF310)，其含有成熟HER3受体的第1-500位氨基酸残基。 HF310分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：19中描述并且编码具有在SEQ ID NO：20中所述氨基酸序列的截短HER3ECD多肽。HF310包括关联 HER3ECD的结构域I、II和III的全部，以及及至并包括结构域IV的模 块1的部分。在另一个实例中，ECD多聚体可以含有这样的截短HER3 ECD多肽(HER3-519)，其含有成熟HER3受体的第1-519位氨基酸残基 (HER3-519)。HER3-519的核苷酸序列在SEQ ID NO：23中描述并且编 码具有在SEQ ID NO：24中所述氨基酸序列的截短HER3ECD多肽。 HER3-519包括关联HER3ECD的结构域I、II和III的全部，以及及至 并包括结构域IV的模块3的部分。
[0292]还构思了用于ECD多聚体中的是因可变剪接而产生的截短 HER3ECD多肽。此类同工型包括本领域已知或在相关美国专利公开号 US 2005-0239088中描述或本文以下作为内含子融合蛋白提供的任何同工 型。这样一种示例性截短HER3ECD多肽是在SEQ ID NO：22中描述并 且由SEQ ID NO：21中所述核苷酸序列编码的p85HER3。这种截短的 HER3ECD多肽具有562个氨基酸，包括对应于第1-19位氨基酸残基的 信号肽，并且在其羧基端含有24个在关联HER3ECD中不存在的额外氨 基酸。在SEQ ID NO：22中描述的前体截短的HER3ECD多肽的成熟形 式(不包括信号序列)是543个氨基酸长度，如图2(C)中描述，并且含有关 联HER3ECD的结构域I、II和III，和及至并包括结构域IV的模块3的 部分。
[0293]截短的HER3ECD多肽包括，与例如SEQ ID NO：14、16、136 和137中所述的示例性截短HER3ECD多肽相比时，在氨基酸序列中具有 一个或多个变异的任何截短的HER3ECD多肽。在HER3多肽中的变异 的示例是与如SEQ ID NO：265所示前体HER3多肽中的任何等位变体相 对应的任何变异。(iv)截短的HER4ECD
[0294]此外，可以形成含有截短的HER4ECD的ECD多聚体。一种 示例性截短HER4ECD多肽含有成熟HER4受体的第1-522位氨基酸残基 (HER4-522)。HER4-522分子的核苷酸序列在SEQ ID NO：29中描述并且 编码具有在SEQ ID NO：30中所述氨基酸序列的截短HER4ECD多肽。 HER4-522包括关联HER3ECD的结构域I、II和III的全部，并且包括 及至并包括结构域IV的模块1。另一种示例性截短的HER4ECD多肽含 有成熟HER4受体的第1-460位氨基酸残基(HF410；HER4-485)。HF410 的核苷酸序列在SEQ ID NO：27中描述并且编码具有在SEQ ID NO：28中 所述氨基酸序列的截短HER4ECD多肽。HF410包括关联HER4ECD的 结构域I、II的全部，和结构域III的大部分。
[0295]还构思了用于ECD多聚体中的是因可变剪接而产生的截短 HER4ECD多肽。此类同工型包括本领域已知或在相关美国专利公开号 US 2005-0239088中描述或本文以下作为内含子融合蛋白提供的任何同工 型。这样一种示例性截短HER4ECD多肽是在SEQ ID NO：159中描述并 且由SEQ ID NO：158中所述核苷酸序列编码的ErbB4_int12。这种截短的 HER4ECD多肽是506个氨基酸，包括对应于第1-25位氨基酸残基的信 号肽，并且在其羧基端含有10个在关联HER4ECD中不存在的额外氨基 酸。所述的额外氨基酸由保留作为可变剪接产物的HER4基因内含子12 的一部分编码。在SEQ ID NO：159中描述的前体截短的HER4ECD多肽 的成熟形式(不包括信号序列)是481个氨基酸长度，如图2(D)中描述，并 且含有关联HER4ECD的结构域I、II，及结构域III的大部分。
[0296]截短的HER4ECD多肽包括，与例如SEQ ID NO：28、30和 159中所述的示例性截短HER4ECD多肽相比时，在氨基酸序列中具有一 个或多个变异的任何截短的HER4ECD多肽。在HER3多肽中的变异的 示例是与如SEQ ID NO：266中所述前体HER4多肽中的任何等位变体相 对应的任何变异。(c)杂合ECD
[0297]本文中提供含有来自两种或多种HER受体的亚结构域的杂合 ECD或其部分。通常地，杂合ECD含有一种或多种HER受体的结构域I 或III的全部或足够部分以与配体结合，和结构域II的全部或足够部分以 介导来自相同或另一HER ECD的受体二聚化。因此，杂合ECD分子可 以含有全部HER家族ECD的部分，通常是三个HER家族ECD的部分和 两个HER家族ECD的至少一部分。一般地，此类ECD包括来自HER2 的亚结构域II并包括这样的亚结构域I与III，其可以来自相同或不同受体、 来自ErbB1、3或4。如此选择每个亚结构域部分，从而所得的ECD二聚 化并与至少一种配体结合，并且可以与两种或多种(不同)配体结合。因此， 如此选择结构域组合，从而它与至少一种配体结合，并且可以与两种配体 结合，并且该结构域组合也包括亚结构域II的足够部分用于二聚化。此类 杂合体的示例是这样的单体杂合ECD，其含有来自HER3或HER4的亚 结构域I、来自HER2的亚结构域II和来自HER1的亚结构域III。例如， 提供这样的杂合ECD，其含有来自ErbB3的亚结构域I、来自ErbB2的 亚结构域II和来自ErbB1的亚结构域III。HRG结合至HER3或HER4(亚 结构域I)，和EGF将主要与HER1的亚结构域III相互作用(见，例如， Singer等(2001)J.Biol.Chem.276：44266-44274；Kim等(2002)Eur.J. Biochem.269：2323-2329).因此，所述杂合体与至少两种配体结合(见，例 如，Singer等(2001)J.Biol.Chem.276：44266-44274)。此外，当添加多聚 化结构域和形成嵌合多聚体后，所得的嵌合分子可以与至少两种不同HER 受体和至少2种不同配体相互作用。(d)其它CSR或RTK ECD或其部分
[0298]其它ECD多肽，包括足以结合配体的CSR或其它RTK的任何 ECD部分或其片段，可以用在本文所提供ECD多聚体的形成中。一般， 此类CSR ECD或其部分是参与疾病病因学的任意CSR的ECD和/或参与 靶向单一细胞表面受体的药物的耐药性的CSR的ECD。在表7中描述示 例性CSR或RTK受体，该表还指出每一分别的受体各自的ECD部分。 因此，构思了如表7中所述的任何全长ECD用作本文中的多聚化配偶体。 也构思了在表7中所述的任意CSR的全长ECD的部分或片段用作多聚化 配偶体，只要所述的部分或片段保留其结合配体和/或与关联受体二聚化的 能力。例如，VEGFR ECD(如VEGFR1)的部分或片段至少含有Ig-结构域 1、2和3的足够部分以与配体结合。在另一个实例中，FGFR ECD(如任 一FGFR1-4)的部分或片段至少含有Ig-结构域2和3的足够部分以结合配 体。在额外实例中，IGF-1R ECD的部分或片段至少含有L1结构域、半 胱氨酸丰富结构域和L2结构域的足够部分以与配体结合和/或介导受体二 聚化。(c)可变剪接的多肽同工型
[0299]用在本文所提供ECD多聚体的形成中的其它ECD多肽包括任 何同工型，其含有CSR的ECD部分或片段以及任选地含有与关联受体的 结构域序列不匹配的额外氨基酸。此类ECD多肽包括例如可变剪接的CSR 或其它RTKs。一般，含有ECD的多肽同工型结合配体和/或与细胞表面 受体二聚化。可变剪接的同工型包括例如因外显子延伸、外显子插入、外 显子缺失、外显子截短或内含子滞留而产生的那些可变剪接的同工型。此 类可变剪接的同工型是本领域已知的(见例如，美国专利申请号6,414,130； 公开的美国专利申请号US2005/0239088、US2004/0022785A1、 US20050123538；公开的国际专利申请号WO0044403、WO0161356和 WO0214470)并且在SEQ ID NO：22、129、131、133、135、136、137、 138、139、143、144、149、150、151、301-399和408-413任一项中描述。 例如，可变剪接的同工型包括HER1同工型，包括但不限于在SEQ ID NO：129，131或133中描述的任意HER1同工型；HER2同工型，包括但 不限于在SEQ ID NO：135或385-399任意项中描述的赫斯达汀或其变体； 或其它可变剪接的同工型，包括但不限于在SEQ ID NO：136-139或408-413 中所述的任意可变剪接的同工型；HER3同工型，包括但不限于在SEQ ID NO：22、143、144、149、150或151中所述的任意HER3同工型)。
[0300]可变剪接的同工型也可以包括HER1基因的其它同工型。HER1 基因(SEQ ID NO：400)由27个内含子所隔断的28个外显子组成。在本文 中提供为SEQ ID NO：400的HER1的示例性基因组序列中，外显子1包 括第1-254位核苷酸，包括5′-非翻译区。起始密码子在第167位核苷酸处 开始。内含子1包括第255-614位核苷酸；外显子2包括第615-766位核 苷酸；内含子2包括第767-1126位核苷酸；外显子3包括第1127-1310位 核苷酸；内含子3包括第1311-1670位核苷酸；外显子4包括第1671-1805 位核苷酸；内含子4包括第1806-2165位核苷酸；外显子5包括第2166-2234 位核苷酸；内含子5包括第2235-2594位核苷酸；外显子6包括第2595-2713 位核苷酸；内含子6包括第2714-3073位核苷酸；外显子7包括第3074-3215 位核苷酸；内含子7包括第3216-3575位核苷酸；外显子8包括第3576-3692 位核苷酸；内含子8包括第3693-4052位核苷酸；外显子9包括第4043-4179 位核苷酸；内含子9包括第4180-4539位核苷酸；外显子10包括第4540-4613 位核苷酸；内含子10包括第4614-4973位核苷酸；外显子11包括第 4974-5063位核苷酸；内含子11包括第5064-5423位核苷酸；外显子12包 括第5424-5623位核苷酸；内含子12包括第5624-5983位核苷酸；外显子 13包括第5984-6116位核苷酸；内含子13包括第6117-6476位核苷酸；外 显子14包括第6477-6567位核苷酸；内含子14包括第6568-6927位核苷 酸；外显子15包括第6928-7085位核苷酸；内含子15包括第7086-7445 位核苷酸；外显子16包括第7446-7484位核苷酸；内含子16包括第 7485-7844位核苷酸；外显子17包括第7845-7988位核苷酸；内含子17包 括第7987-8346位核苷酸；外显子18包括第8347-8469位核苷酸；内含子 18包括第8470-8829位核苷酸；外显子19包括第8830-8295位核苷酸；内 含子19包括第8929-9288位核苷酸；外显子20包括第9289-9474位核苷 酸；内含子20包括第9475-9834位核苷酸；外显子21包括第9835-9990 位核苷酸；内含子21包括第9991-10350位核苷酸；外显子22包括第 10351-10426位核苷酸；内含子22包括第10427-10786位核苷酸；外显子 23包括第10787-10933位核苷酸；内含子23包括第10934-11293位核苷酸； 外显子24包括第11294-11391位核苷酸；内含子24包括第11392-11751 位核苷酸；外显子25包括第11752-11919位核苷酸；内含子26包括第 11920-12279位核苷酸；外显子26包括第12280-12327位核苷酸；内含子 26包括第12328-12687位核苷酸；外显子27包括第12688-12796位核苷酸； 内含子27包括第12797-13156位核苷酸；并且外显子28包括第13157-15233 位核苷酸。外显子28中的终止密码子在第13516位核苷酸位置处开始并且 外显子28的剩余部分包括3′-非翻译区。在RNA剪接和去除所述内含子后， HER1的初级转录物含有外显子1-28并且编码1210个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。HER1基因的可变剪接的同工型在实施例10中描述及阐述，并 且包括具有保留的内含子序列的同工型。这种示例性HER1同工型的序列 在SEQ ID NO：126中描述，并且编码具有SEQ ID NO：127中所述氨基酸 序列的多肽。
[0301]可变剪接的同工型也可以包括HER2基因的其它同工型。HER2 基因(SEQ ID NO：401)由26个内含子所隔断的27个外显子组成。在本文 中提供为SEQ ID NO：401的HER的示例性基因组序列中，外显子1包括 第181-349位核苷酸，包括5′-非翻译区。起始密码子在第277位核苷酸处 开始。内含子1包括第350-709位核苷酸；外显子2包括第710-861位核 苷酸；内含子2包括第862-1221位核苷酸；外显子3包括第1222-1435； 内含子3包括第1436-1795位核苷酸；外显子4包括第1796-1930位核苷 酸；内含子4包括第1931-2290位核苷酸；外显子5包括第2291-2359位 核苷酸；内含子5包括第2360-2719位核苷酸；外显子6包括第2720-2835 位核苷酸；内含子6包括第2836-3195位核苷酸；外显子7包括第3196-3337 位核苷酸；内含子7包括第3338-3697位核苷酸；外显子8包括第3698-3817 位核苷酸；内含子8包括第3818-4177位核苷酸；外显子9包括第4178-4304 位核苷酸；内含子9包括第4305-4664位核苷酸；外显子10包括第4665-4738 位核苷酸；内含子10包括第4739-5098位核苷酸；外显子11包括第 5099-5189位核苷酸；内含子11包括第5190-5549位核苷酸；外显子12包 括第5550-5749位核苷酸；内含子12包括第5750-6109位核苷酸；外显子 13包括第6110-6242位核苷酸；内含子13包括第6243-6602位核苷酸；外 显子14包括第6603-6696位核苷酸；内含子14包括第6694-7053位核苷 酸；外显子15包括第7054-7214位核苷酸；内含子15包括第7215-7574 位核苷酸；外显子16包括第7575-7622位核苷酸；内含子16包括第 7623-7982位核苷酸；外显子17包括第7983-8121位核苷酸；内含子17包 括第8122-8481位核苷酸；外显子18包括第8482-8604位核苷酸；内含子 18包括第8605-8964位核苷酸；外显子19包括第8695-9067位核苷酸；内 含子19包括第9068-9427位核苷酸；外显子20包括第9428-9610位核苷 酸；内含子20包括第9611-9970位核苷酸；外显子21包括第9971-10126 位核苷酸；内含子21包括第10127-10486位核苷酸；外显子22包括第 10487-10562位核苷酸；内含子22包括第10563-10922位核苷酸；外显子 23包括第10923-11069位核苷酸；内含子23包括第11070-11429位核苷酸； 外显子24包括第11430-11527位核苷酸；内含子24包括第11528-11887 位核苷酸；外显子25包括第11888-12076位核苷酸；内含子26包括第 12077-12436位核苷酸；外显子26包括第12437-12689位核苷酸；内含子 26包括第12690-13049位核苷酸并且外显子27包括第13050-14018位核苷 酸。外显子27中的终止密码子在第13403位核苷酸位置处开始并且外显子 27的剩余部分包括3′-非翻译区。在RNA剪接和去除所述内含子后，HER2 的初级转录物含有外显子1-27并且编码1255个氨基酸的多肽(SEQ ID NO： 4)。HER2基因的可变剪接的同工型在实施例10中描述及阐述，并且包括 具有保留内含子序列的那些同工型。一个这样的示例性HER2同工型的序 列在SEQ ID NO：140中描述，并且编码具有SEQ ID NO：141中所述氨基 酸序列的多肽。
[0302]可变剪接的同工型也可以包括HER3基因的其它同工型。HER3 基因(SEQ ID NO：402)由27个内含子所隔断的28个外显子组成。在本文 中提供为SEQ ID NO：402的HER3的示例性基因组序列中，外显子1包 括第181-460位核苷酸，包括5′-非翻译区。起始密码子在第379位核苷酸 处开始。内含子1包括第461-820位核苷酸；外显子2包括第821-972位 核苷酸；内含子2包括第973-1332位核苷酸；外显子3包括第1333-1519 位核苷酸；内含子3包括第1520-1879位核苷酸；外显子4包括第1880-2005 位核苷酸；内含子4包括第2006-2365位核苷酸；外显子5包括第2366-2431 位核苷酸；内含子5包括第2432-2791位核苷酸；外显子6包括第2792-2910 位核苷酸；内含子6包括第2911-3270位核苷酸；外显子7包括第3237-3412 位核苷酸；内含子7包括第3413-3772位核苷酸；外显子8包括第3773-3886 位核苷酸；内含子8包括第3887-4246位核苷酸；外显子9包括第4247-4367 位核苷酸；内含子9包括第4368-4727位核苷酸；外显子10包括第4728-4801 位核苷酸；内含子10包括第4802-5161位核苷酸；外显子11包括第 5162-5252位核苷酸；内含子11包括第5253-5612位核苷酸；外显子12包 括第5613-5818位核苷酸；内含子12包括第5819-6178位核苷酸；外显子 13包括第6179-6311位核苷酸；内含子13包括第6312-6671位核苷酸；外 显子14包括第6672-6762位核苷酸；内含子14包括第6763-7122位核苷 酸；外显子15包括第7123-7277位核苷酸；内含子15包括第7278-7637 位核苷酸；外显子16包括第7638-7691位核苷酸；内含子16包括第 7692-8051位核苷酸；外显子17包括第8052-8193位核苷酸；内含子17包 括第8194-8553位核苷酸；外显子18包括第8554-8673位核苷酸；内含子 18包括第8674-9033位核苷酸；外显子19包括第9034-9132位核苷酸；内 含子19包括第9133-9492位核苷酸；外显子20包括第9493-9678位核苷 酸；内含子20包括第9679-10038位核苷酸；外显子21包括第10039-10194 位核苷酸；内含子21包括第10195-10554位核苷酸；外显子22包括第 10555-10630位核苷酸；内含子22包括第10631-10990位核苷酸；外显子 23包括第10991-11137位核苷酸；内含子23包括第11138-11497位核苷酸； 外显子24包括第11498-11595位核苷酸；内含子24包括第11596-11955 位核苷酸；外显子25包括第11956-12147位核苷酸；内含子26包括第 12148-12507位核苷酸；外显子26包括第12508-12579位核苷酸；内含子 26包括第12580-12939位核苷酸；外显子27包括第12940-13240位核苷酸； 内含子27包括第13241-13600位核苷酸和外显子28包括第13601-14875 位核苷酸。外显子28中的终止密码子在第14125位核苷酸位置处开始并且 外显子28的剩余部分包括3′-非翻译区。在RNA剪接和去除所述内含子后， ErbB3的初级转录物含有外显子1-28并且编码1342个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：6)。HER3基因的可变剪接的同工型在实施例10中描述及阐述， 并且包括具有保留内含子序列的那些同工型。这样的示例性HER3同工型 的序列在SEQ ID NO：145和147中描述，并且分别编码具有SEQ ID NO： 146和148中所述氨基酸序列的多肽。
[0303]可变剪接的同工型也可以包括HER4基因的其它同工型。HER4 基因(SEQ ID NO：403)由27个内含子所隔断的28个外显子组成。在本文 中提供为SEQ ID NO：403的HER4的示例性基因组序列中，外显子1包 括第181-295位核苷酸，包括5′-非翻译区。起始密码子在第215位核苷酸 处开始。内含子1包括第296-655位核苷酸；外显子2包括第656-807位 核苷酸；内含子2包括第808-1167位核苷酸；外显子3包括第1168-1354 位核苷酸；内含子3包括第1355-1714位核苷酸；外显子4包括第1715-1849 位核苷酸；内含子4包括第1850-2209位核苷酸；外显子5包括第2210-2275 位核苷酸；内含子5包括第2276-2635位核苷酸；外显子6包括第2636-2754 位核苷酸；内含子6包括第2755-3114位核苷酸；外显子7包括第3115-3256 位核苷酸；内含子7包括第3257-3616位核苷酸；外显子8包括第3617-3730 位核苷酸；内含子8包括第3731-4090位核苷酸；外显子9包括第4091-4217 位核苷酸；内含子9包括第4218-4577位核苷酸；外显子10包括第4578-4651 位核苷酸；内含子10包括第4652-5011位核苷酸；外显子11包括第 5012-5102位核苷酸；内含子11包括第5103-5462位核苷酸；外显子12包 括第5463-5662位核苷酸；内含子12包括第5663-6022位核苷酸；外显子 13包括第6023-6155位核苷酸；内含子13包括第6156-6515位核苷酸；外 显子14包括第6516-6609位核苷酸；内含子14包括第6610-6969位核苷 酸；外显子15包括第6970-7124位核苷酸；内含子15包括第7125-7484 位核苷酸；外显子16包括第7485-7559位核苷酸；内含子16包括第 7560-7919位核苷酸；外显子17包括第7920-8052位核苷酸；内含子17包 括第8053-8412位核苷酸；外显子18包括第8413-8535位核苷酸；内含子 18包括第8536-8895位核苷酸；外显子19包括第8896-8994位核苷酸；内 含子19包括第8995-9354位核苷酸；外显子20包括第9355-9540位核苷 酸；内含子20包括第9541-9900位核苷酸；外显子21包括第9901-10056 位核苷酸；内含子21包括第10057-10416位核苷酸；外显子22包括第 10417-10492位核苷酸；内含子22包括第10493-10852位核苷酸；外显子 23包括第10853-10999位核苷酸；内含子23包括第11000-11359位核苷酸； 外显子24包括第11360-11457位核苷酸；内含子24包括第11458-11817 位核苷酸；外显子25包括第11818-11988位核苷酸；内含子26包括第 11989-12348位核苷酸；外显子26包括第12349-12396位核苷酸；内含子 26包括第12397-12756位核苷酸；外显子27包括第12757-13054位核苷酸； 内含子27包括第13055-13414位核苷酸并且外显子28包括第13415-15385 位核苷酸。外显子28中的终止密码子在第13858位核苷酸位置处开始并且 外显子28的剩余部分包括3′-非翻译区。在RNA剪接和去除所述内含子后， HER4的初级转录物含有外显子1-28并且编码1308个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：8)。HER4基因的可变剪接的同工型在实施例10中描述及阐述， 并且包括具有保留内含子序列的那些同工型。这样的示例性HER4同工型 的序列在SEQ ID NO：152、154、156或158中描述，并且分别编码具有 SEQ ID NO：153、155、157或159中所述氨基酸序列的多肽。
[0304]可变剪接的同工型也可以包括IGF-1R基因的同工型。IGF1-R 基因(SEQ ID NO：404)由20个内含子所隔断的21个外显子组成。在本文 中提供为SEQ ID NO：404的IGF1-R的示例性基因组序列中，外显子1 包括第181-306位核苷酸，包括5′-非翻译区。起始密码子在第213位核苷 酸处开始。内含子1包括第307-666位核苷酸；外显子2包括第667-1212 位核苷酸；内含子2包括第1213-1572位核苷酸；外显子3包括第1573-1884 位核苷酸；内含子3包括第1885-2255位核苷酸；外显子4包括第2256-2394 位核苷酸；内含子4包括第2395-2754位核苷酸；外显子5包括第2755-2899 位核苷酸；内含子5包括第2990-3259位核苷酸；外显子6包括第3260-3474 位核苷酸；内含子6包括第3475-3834位核苷酸；外显子7包括第3835-3961 位核苷酸；内含子7包括第3962-4321位核苷酸；外显子8包括第4322-4560 位核苷酸；内含子8包括第4561-4920位核苷酸；外显子9包括第4921-5088 位核苷酸；内含子9包括第5089-5448位核苷酸；外显子10包括第5449-5653 位核苷酸；内含子10包括第5654-6013位核苷酸；外显子11包括第 6014-6297位核苷酸；内含子11包括第6298-6657位核苷酸；外显子12包 括第6658-6794位核苷酸；内含子12包括第6795-7154位核苷酸；外显子 13包括第7155-7314位核苷酸；内含子13包括第7315-7674位核苷酸；外 显子14包括第7675-7777位核苷酸；内含子14包括第7778-8137位核苷 酸；外显子15包括第8138-8208位核苷酸；内含子15包括第8209-8568 位核苷酸；外显子16包括第8569-8798位核苷酸；内含子16包括第 8799-9158位核苷酸；外显子17包括第9159-9269位核苷酸；内含子17包 括第9270-9629位核苷酸；外显子18包括第9630-9789位核苷酸；内含子 18包括第9790-10149位核苷酸；外显子19包括第10150-10279位核苷酸； 内含子19包括第10280-10639位核苷酸；外显子20包括第10640-10774 位核苷酸；内含子20包括第10775-11134位核苷酸并且外显子21包括第 11135-12356位核苷酸。外显子21中的终止密码子在第11514位核苷酸位 置处开始并且外显子21的剩余部分包括3′-非翻译区。在RNA剪接和去除 所述内含子后，IGF1-R的初级转录物含有外显子1-21并且编码1367个氨 基酸的多肽(SEQ ID NO：290)。IGF1-R基因的可变剪接的同工型在实施例 11中描述和阐述，并且包括具有保留内含子序列的那些同工型。这样的示 例性IGF1-R同工型的序列在SEQ ID NO：297或299中描述，并且分别编 码具有SEQ ID NO：298或300中所述氨基酸序列的多肽。
[0305]在本文中提供并在SEQ ID NO：127、141、146、148、153、155、 157、159、298或300中描述的HER1、HER2、HER3、HER4和IGF1-R 的可变剪接的同工型可以用在本文所提供ECD多聚体的形成中。备选地， 所述同工型可以单独地或与任何其它同工型组合地使用以治疗由它们的关 联受体介导的任何疾病。此类疾病的示例是任何血管生成疾病、肿瘤生成 疾病或炎性疾病，尤其癌症，如本文中所述并为本领域技术人员已知。2.ECD多聚体的形成
[0306]ECD多聚体，包括HER ECD多聚体，可以是共价连接、非共 价连接或化学连接的受体ECD的多聚体，以形成二聚体、三聚体或更大 的多聚体。在一些情况下，多聚体可以通过两个或多个ECD多肽二聚化 而形成。两个ECD多肽之间的多聚化可以是自发的，或可以因两个或多 个多肽的强制键接而发生。在一个实例中，多聚体可以由不同ECD多肽 上的半胱氨酸残基之间所形成的二硫键连接。在另一个实例中多聚体可以 包括经共价或非共价相互作用与肽部分连接的ECD多肽融合至可溶性多 肽。此类肽可以是肽接头(间隔肽)或具有促进多聚化特性的肽。在另外的 实例中，多聚体可以在两个多肽之间通过化学连接例如通过使用异双官能 性接头形成。a.肽接头
[0307]肽接头可以用来产生多肽多聚体，例如当一个多聚化配偶体是 HER家族受体的ECD的全部或部分时的多聚体。在一个实例中，肽接头 可以融合于第一多肽的羧基末端和第二多肽的氨基末端。这种结构可以重 复多次，从而至少1个、优选2、3、4或更多个可溶性多肽通过在其相应 末端处的肽接头彼此连接。例如，多聚体多肽可以具有序列Z1-X-Z2，其 中Z1和Z2分别是细胞表面多肽的ECD的全部或部分序列并且X是肽接 头的序列。在一些情况下，Z1和/或Z2是HER家族受体的ECD的全部或 部分。在另一个实例中，Z1和Z2是相同的或它们是不同的。在另一个实例 中，所述多肽具有序列Z1-X-Z2(-X-Z)n，其中″n″是任意整数，即通常是1 或2。
[0308]一般地，所述肽接头的长度足以允许可溶性ECD多肽与邻近可 溶性ECD多肽形成键。肽接头的实例包括-Gly-Gly-、GGGGG(SEQ ID NO：273)、GGGGS或(GGGGS)n(SEQ ID NO：174)、SSSSG或 (SSSSG)n(SEQ ID NO：187)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO：175)、 GGSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：176)、 GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(SEQ ID NO：177)、 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：178)、EGKS S GS GS ES KEF(SEQ ID NO：179)或者AlaAlaProAla或(AlaAlaProAla)n(SEQ ID NO：188)，其中n是1-6，如1、2、3或4。示例性接头包括：(1)带NcoI末端的Gly4Ser SEQ ID NO.189
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG
(2)带NcoI末端的(Gly4Ser)2 SEQ ID NO.190
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG
(3)带NcoI末端的(Ser4Gly)4 SEQ ID NO.191
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
(4)带NcoI末端的(Ser4Gly)2 SEQ ID NO.192
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG
(2)带NcoI末端的(Gly4Ser)2 SEQ ID NO.190
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG
(3)带NcoI末端的(Ser4Gly)4 SEQ ID NO.191
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
(4)带NcoI末端的(Ser4Gly)2 SEQ ID NO.192
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
[0309]连接部分例如在Huston等(1988)PNAS 85：5879-5883，Whitlow 等(1993)Protein Engineering6：989-995和Newton等(1996)Biochemistry 35：545-553中描述。其它的合适肽接头包括在美国专利号4,751,180或 4,935,233中所描述的任意的那些肽接头，所述的专利通过引用的方式并入 本文。使用任何合适的常规技术，可以在与编码可溶性ECD多肽的多核 苷酸相同的可读框之间或之内插入编码所需肽接头的多核苷酸。在一个实 例中，融合多肽具有来自2-4个由肽接头分隔的可溶性ECD多肽，包括是 HER ECD多肽的全部或部分的一个可溶性ECD多肽。b.异双官能连接剂
[0310]一种ECD多肽与另一种ECD多肽连接产生异多聚体融合多肽 的所述连接可以是直接或间接的。例如，两种或多种ECD多肽的连接可 以通过化学键接实现或由异双官能性接头促进，如本领域已知的或本文中 提供的那样。
[0311]本领域技术人员已知用来在氨基与巯基之间形成共价键和用来 将巯基导入蛋白质的众多异双官能性交联试剂(见，例如，PIERCE CATALOG，ImmunoTechnology Catalog&Handbook，1992-1993，该文 献描述了此类试剂的制备和用途并提供此类试剂的商业来源；还参见，例 如，Cumber等(1992)Bioconjugate Chem.3：397-401；Thorpe等(1987) Cancer Res.47：5924-5931；Gordon等(1987)Proc.Natl.Acad Sci. 84：308-312；Walden等(1986)J.Mol.Cell Immunol.2：191-197；Carlsson 等(1978)Biochem.J.173：723-737；Mahan等(1987)Anal.Biochem. 162：163-170；Wawryznaczak等(1992)Br.J.Cancer 66：361-366；Fattom 等(1992)Infection&Immun.60：584-589)。这些试剂可以用来在一个ECD 多肽的氨基端部分和另一ECD多肽的羧基端部分之间或在每一这些部分 与接头之间形成共价键。这些试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2- 吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP；二硫化物接头)；磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2- 吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧羰基-α- 甲苄基硫代硫酸酯(SMBT，位阻焦硫酸盐接头)；琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡 啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(LC-SPDP)；磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰 亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)；琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二 硫代)丁酸酯(SPDB；位阻二硫键接头)；磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4- 甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯(SAED)；磺基琥珀酰亚胺基 7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA)；磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基 -α-(2-吡啶基二硫代)甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SMPT)；1，4-二-[3′-(2′- 吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷(DPDPB)；4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基 -α-(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，位阻焦硫酸盐接头)；磺基琥珀酰亚胺基 -6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SMPT)；间- 马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(MBS)；间-马来酰亚胺基苯 甲酰基-N-羟基-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙 酰)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫醚接头)；磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘代乙酰)氨基 苯甲酸酯(磺基-SIAB)；琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯 (SMPB)；磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基 -SMPB)；叠氮苯甲酰基酰肼(azidobenzoyl hydrazide)(ABH)。这些接头例 如可以与肽接头如增加柔性或溶解度或提供或消除空间位阻的那些肽接头 组合使用。可以使用本领域技术人员已知的用于连接一个多肽分子至另一 个分子的任何其它接头。总体特性是这样的，即所得分子是生物相容的(用 于施用至动物，包括人)并且所得分子是调节细胞表面分子如HER或其它 细胞表面分子或受体的活性的异多聚体分子。c.多肽多聚化结构域
[0312]两个或多个多肽的相互作用可以通过直接或间接与本身能够相 互作用以形成稳定结构的任何部分或其它多肽连接而加以促进。例如，分 立的编码的多肽链可以通过多聚化而连接，其中所述多肽的多聚化由多聚 化结构域介导。一般，提供这种多聚化结构域用于在第一嵌合多肽与第二 嵌合多肽之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。嵌合多肽包括例如将编 码多肽中ECD部分的核酸与编码多聚化结构域的核酸(直接或间接)连接。 一般，至少一种多聚化配偶体是编码直接或间接与多聚化结构域连接的全 部或部分HER ECD的核酸。同多聚体或异多聚体多肽可以从共表达分别 的嵌合多肽产生。第一和第二嵌合多肽可以是相同或不同的。
[0313]通常，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作 用的任一结构域。所述多聚化结构域可以通过免疫球蛋白序列、亮氨酸拉 链、疏水区、亲水区、在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形组分子间 二硫键的游离巯基而相互作用。此外，多聚化结构域可以包括这样的氨基 酸序列，其包含与含有孔洞的氨基酸序列互补的突起，如在例如美国专利 申请系列号08/399,106中描述。可以设计这种多聚化区域，从而空间相互 作用不仅促进稳定的相互作用，还进一步促进异二聚体从嵌合单体的混合 物中优先于同二聚体形成。通常，通过用体积较大侧链(例如酪氨酸或色氨 酸)替换来自第一多肽界面的小体积氨基酸侧链而构建突起。通过用体积较 小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大体积氨基酸侧链而在第二多 肽界面上任选地产生与所述突起的大小相同或相似的补偿性“空穴”。
[0314]ECD嵌合多肽例如本文中提供的任意的ECD嵌合多肽可以在 任何部位但是一般经其氨基端或羧基端与多聚化结构域的氨基端或羧基端 连接，以形成嵌合多肽。连接可以是直接的或经接头间接的。另外，嵌合 多肽可以是融合蛋白或可以通过化学键接如经共价或非共价相互作用形 成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，编码多肽的全部或部 分ECD的核酸可以直接或间接地或任选经接头结构域而有效连接至编码 多聚化结构域序列的核酸。一般，构建体编码其中ECD多肽的羧基端与 多聚化结构域氨基端连接的嵌合蛋白。在一些情况下，构建体可以编码其 中ECD多肽的氨基端与多聚化结构域氨基端或羧基端连接的嵌合蛋白。
[0315]多肽多聚体含有通过将两个相同或不同ECD多肽直接或间接与 多聚化结构域连接而产生的两个嵌合蛋白。在一些实例中，当所述多聚化 结构域是多肽时，将编码ECD-多聚化结构域嵌合多肽的基因融合体插入 适宜的表达载体。所得的ECD-多聚化结构域嵌合蛋白可以表达在用所述 重组表达载体转化的宿主细胞中，并允许装配成多聚体，其中多聚化结构 域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与ECD多肽的化学键接可以 使用如上所讨论的异双官能性接头实现。
[0316]所得的嵌合多肽和由其形成的多聚体可以通过如下文F部分中 详述的任意合适方法纯化，例如通过经过A蛋白柱或G蛋白柱的亲和层析 法。在将编码不同ECD嵌合多肽的两种核酸分子转化至细胞的情况下， 将出现同二聚体和异二聚体的形成。可以调节用于表达的条件从而支持异 二聚体形成胜过同二聚体形成。i.免疫球蛋白结构域
[0317]多聚化结构域包括这样的多聚化结构域，其包含能够与额外氨 基酸序列的多聚化结构域反应以形成分子间二硫键的游离巯基部分。例如， 多聚化结构域可以包括如来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM 和IgE的免疫球蛋白分子的一部分。通常地，该部分是免疫球蛋白恒定区 (Fc)。已经描述了制备这样的融合蛋白，其含有与抗体衍生性多肽的多个 部分(包括Fc结构域)融合的可溶性ECD多肽，参见例如，Ashkenazi等 (1991)PNAS 88：10535；Byrn等(1990)Nature，344：677；以及Hollenbaugh 和Aruffo等(1992)″Construction of Immnoglobulin Fusion Proteins″在 Current Protocols in Immunology，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。
[0318]抗体与特异性抗原结合并且含有由二硫键共价连接的两条相同 重链和两条相同轻链。重链和轻链均含有结合抗原的可变区，还含有恒定 (C)区。在每一链中，一种结构域(V)具有取决于分子的抗体特异性的可变 氨基酸序列。另一种结构域(C)具有相同类别的分子之间常见的相当稳定的 序列。所述结构域依次从氨基末端编号。例如，IgG轻链由从氨基端至羧 基端以VL-CL顺序连接的两个免疫球蛋白结构域组成，分别称作轻链可变 结构域和轻链恒定结构域。IgG重链由从氨基端至羧基端以 VH-CH1-CH2-CH3顺序连接的四个免疫球蛋白结构域(称作可变重链结构 域、恒定重链结构域1、恒定重链结构域2和恒定重链结构域3)组成。所 得抗体分子是一种四条链分子，其中每条重链通过二硫键连接至一条轻链， 并且两条重链通过二硫键彼此连接。重链的连接由重链的柔性区(称作铰链 区)介导。抗体分子的片段可以例如通过酶切割产生。例如，当由木瓜蛋白 酶的蛋白酶切后，将重链恒定区的二聚体即Fc结构域与两个Fab区(即含 有可变区的部分)分开。
[0319]在人类中，存在基于抗体重链进行分类的5种抗体同种型，称 作德耳塔(δ)、伽马(γ)、缪(μ)和阿尔法(α)和埃泼西隆(ε)，分别产生抗体IgD、 IgG、IgM、IgA和IgE类。IgA和IgG类含有亚类IgA1、IgA2、IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重链之间的序列差异引起在例如C结构 域数目、铰链区域存在性和链间二硫键数目及位置方面不同的多个同种型。 例如，IgM和IgE重链含有替换铰链区的额外C结构域(C4)。IgG、IgD 和IgA的Fc区通过其Cγ3、Cδ3和Cα3结构域彼此配对，而IgM和IgE 的Fc区通过其Cμ4和Cε4结构域而二聚化。IgM和IgA分别形成具10 个和4个抗原结合位点的多聚体结构。
[0320]本文中提供的ECD免疫球蛋白嵌合多肽包括全长免疫球蛋白多 肽。备选地，所述免疫球蛋白多肽是小于全长的，即含有重链、轻链、Fab、 Fab2、Fv或Fc。在一个实例中，将ECD免疫球蛋白嵌合多肽装配成单体 或异多聚体或同多聚体并且特别装配成二聚体或四聚体。可以使用结构变 化的链或基本单元来装配单体和异多聚体及同多聚体。例如，ECD多肽可 以融合于免疫球蛋白分子的全部或部分，后者包括免疫球蛋白分子的CH、 CL、VH、或VL结构域的全部或部分(见，例如，美国专利申请号5,116,964)。 嵌合ECD多肽可以轻易地由经适宜核酸分子转化的哺乳动物细胞产生并 分泌。分泌形式包括其中ECD多肽存在于重链二聚体中的那些；轻链单 体或二聚体；和其中ECD多肽与一条或多条轻链或重链融合的重链和轻 链异四聚体，包括其中及至并包括全部四种可变区类似物被置换的异四聚 体。在一些实例中，一种或多于一种的核酸融合分子可以转化至宿主细胞 内以产生多聚体，其中所述多聚体的ECD部分是相同或不同的。在一些 实例中，存在非-ECD肽轻链-重链可变区样结构域，因而产生异双官能性 抗体。在一些实例中，可以使嵌合多肽与缺少铰链二硫化物的免疫球蛋白 分子的部分融合，其中两个ECD多肽部分的非共价或共价相互作用使该 分子联结成同二聚体或异二聚体。(a)Fc结构域
[0321]一般，ECD嵌合蛋白的免疫球蛋白部分包括免疫球蛋白多肽的 重链，最常见地是重链的恒定结构域。人IgG亚型的重链恒定区的示例性 序列在SEQ ID NO：163(IgG1)、SEQ ID NO：164(IgG2)、SEQ ID NO：165(IgG3)和SEQ ID NO：166(IgG4)中描述。例如，对于SEQ ID NO：163中所述的示例性重链恒定区，CH1结构域对应于第1-98位氨基酸， 铰链区对应于第90-110位氨基酸，CH2结构域对应于第111-223位氨基酸 并且CH3结构域对应于第224-330位氨基酸。
[0322]在一个实例中，免疫球蛋白多肽嵌合蛋白可以包括免疫球蛋白 多肽的Fc区。一般，这种融合物保留至少有功能活性的铰链、免疫球蛋白 重链的恒定区的CH2和CH3结构域。例如，IgG1的全长Fc序列包括在 SEQ ID NO：163中所述的序列的第99-330位氨基酸。hIgG1的示例性Fc 序列在SEQ ID NO：167中描述并且含有对应于SEQ ID NO：163的第 100-110位氨基酸的几乎全部铰链序列，和如SEQ ID NO：163中所述的CH2 和CH3结构域的完整序列。另一种示例的Fc多肽在PCT申请WO 93/10151中描述，并且是从氨基端铰链区延伸至人IgG1抗体(SEQ ID NO：168)Fc区的天然羧基端的单链多肽。产生连接的精确部位不是关键性 的：具体部位是熟知的并且可以进行选择以优化ECD多肽的生物学活性、 分泌或结合特征。例如，其它示例性Fc多肽序列在SEQ ID NO：163中所 述序列的氨基酸C109或P113处开始(参见例如，US 2006/0024298)。
[0323]除了hIgG1Fc以外，也可以在本文提供的ECD嵌合多肽中包括 其它Fc区，例如，在意图使通过Fc/FcγR相互作用介导的效应功能最小 化的情况下，可构思与很少召集补体和效应细胞的IgG同种型(例如IgG2 或IgG4的Fc)融合。此外，Fc融合物可以含有基本由这样的免疫球蛋白 基因编码的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白基因属于任意的抗体 类别，包括但不限于抗体的IgG(包括人亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、 IgA(包括人亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE和IgM类别。此外，可以使用 接头来将Fc共价连接至另一多肽以产生Fc嵌合体。
[0324]本文中还构思了经修饰的Fc结构域用于具有ECD多肽的嵌合 体中，参见例如美国专利公开号US 2006/0024298；和国际专利公开号WO 2005/063816的示例性修饰。在一些实例中，Fc区是这样的，从而它比野 生型免疫球蛋白重链的Fc区具有改变的(即更高或更低的)效应子功能。抗 体的Fc区与众多Fc受体和配体相互作用，赋予一系列重要的功能性能力， 称作效应子功能。Fc效应子功能包括例如Fc受体结合作用、补体固定和 T细胞耗竭活性(参见例如，美国专利号6,136,310)。测定T细胞耗竭活性、 Fc效应子功能和抗体稳定性的方法是本领域已知的。例如，IgG分子的Fc 区与FcγR相互作用。这些FcγR受体表达在多种免疫细胞中，其中所述免 疫细胞包括例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性 粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、 天然杀伤细胞(NK)和γδT细胞。Fc/FcγR复合体的形成召集这些效应细 胞至结合抗原的部位，通常这在细胞内导致信号传导事件和重要的后续免 疫应答，如释放炎性介质、B细胞活化、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性 攻击。介导细胞毒性和吞噬性效应子功能的能力是抗体借以摧毁靶细胞的 潜在机制。表达FcγR的细胞毒细胞对靶细胞上已结合抗体的识别和裂解 作用叫做抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。针对不同抗体同种型的 其它Fc受体包括FcεR(IgE)、FcαR(IgA)和FcμR(IgM)。
[0325]因此，修饰的Fc结构域可以具有改变的亲和力，包括但不限于， 对Fc受体增加的亲和力或降低的亲和力或无亲和力。例如，不同的IgG 亚类对FcγR具有不同亲和力，其中IgG1和IgG3一般比IgG2和IgG4实 质更好地与该受体结合。此外，不同FcγR介导不同的效应子功能。FcγR1、 FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发激活作用的正调节物，其特征在 于具有免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞内结构域。然而， FcγRIIb具有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)并因而是抑制性的。 改变Fc区对受体的亲和力可以调节由Fc结构域诱导的效应子功能。
[0326]在一个实例中，使用为优化与某些FcγR结合来更好介导效应子 功能例如ADCC而进行修饰的Fc区。此类修饰的Fc区可以含有与SEQ ID NO：167中所述示例性Fc序列的G20S、G20A、S23D、S23E、S23N、S23Q、 S23T、K30H、K30Y、D33Y、R39Y、E42Y、T44H、V48I、S51E、H52D、 E56Y、E56I、E56H、K58E、G65D、E67L、E67H、S82A、S82D、S88T、 S108G、S108I、K110T、K110E、K110D、A111D、A114Y、A114L、A114I、 I116D、I116E、I116N、I116Q、E117Y、E117A、K118T、K118F、K118A 和P180L的任意一种或多种相对应的修饰或其组合。含有这些突变的经修 饰Fc可以具有与FcR例如激活性受体FcγRIIIa的增强的结合作用和/或可 以具有与抑制性受体FcγRIIb的减弱的结合作用(参见例如，US 2006/0024298)。修饰以具有与FcR的增强结合作用的Fc区可以在患者中 利于摧毁癌细胞方面是更有效的，即便与ECD多肽连接时也是如此。存 在抗体借以摧毁肿瘤细胞的众多可能机制，包括通过阻断所需生长途径的 抗增殖作用、导致凋亡的胞内信号传导作用、增强的受体下调和/或周转、 ADCC和通过促进适应性免疫应答。
[0327]在另一个实例中，也已知具有降低或消除与FcγR结合的替换的 多种Fc突变体。此类突变蛋白用于需要降低或消除由Fc介导的效应子功 能的情况。这在需要拮抗而不是杀死携带靶抗原的细胞的情况下往往是这 样。此种Fc的示例是在美国专利号5,457,035中描述和在SEQ ID NO：169 中给出的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：168中所 述的Fc序列相同，除了已经将第19位氨基酸从Leu变成Ala，第20位氨 基酸从Leu变成Glu，和第22位氨基酸从Gly变成Ala之外。可以在任何 Fc序列例如在SEQ ID NO：167中所述的示例性Fc序列中产生相似突变。 这种突变蛋白显示对Fc受体降低的亲和力。
[0328]在一些情况下，本文中提供的ECD多肽Fc嵌合蛋白可以被修 饰以增强与补体蛋白C1q的结合。除了与FcR相互作用以外，Fc也与补 体蛋白C1q相互作用以介导补体依赖的细胞毒性(CDC)。C1q与丝氨酸蛋 白酶C1r和C1s形成复合体以形成C1复合体。C1q能够结合6个抗体， 尽管与2个IgG结合足以激活补体级联。类似于Fc与FcR的相互作用， 不同IgG亚类对C1q具有不同亲和力，而IgG1和IgG3一般比IgG2和IgG4 实质上更好地结合。因此，具有与C1q增加的结合作用的经修饰Fc介导 增强的CDC，这是抗体借以促进摧毁肿瘤细胞的一种可能机制。在Fc区 中增加与C1q结合的示例性修饰包括但不限于氨基酸修饰与SEQ ID NO：167中的K110W、K110Y和E117S相对应的修饰。
[0329]在额外的实例中，可以使用在其与FcRn的结合作用上受到修饰 的Fc区，因而改善ECD-Fc嵌合多肽的药物代谢动力学。FcRn是新生期 的FcR，与之结合可使内吞的抗体从内吞体中再循环回血流中。该过程因 全长分子的大尺寸，与防止肾脏过滤的作用相结合时，产生1-3周的有利 抗体血清半寿期。Fc与FcRn的结合也在抗体运输中发挥作用。在Fc蛋 白质中用于增强与FcRn结合的示例性修饰包括修饰与SEQ ID NO：267中 T34Q、T34E、M212L和M212F相对应的氨基酸。
[0330]一般，多肽多聚体是通过两个相同或不同ECD多肽直接或间接 连接至Fc多肽而产生的两种嵌合蛋白的二聚体。在一些实例中，将编码 ECD-Fc嵌合蛋白的融合基因插入适宜的表达载体。所得的ECD-Fc嵌合 蛋白可以表达于用所述重组表达载体转化的宿主细胞中，并允许极其类似 于抗体分子那样装配，其中在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二价ECD 多肽。一般，宿主细胞和表达系统是允许糖基化与SEQ ID NO：167中N81 相对应的氨基酸的哺乳动物表达系统。在该位置处的糖基化对于稳定Fc 蛋白质是重要的。在不考虑在该位置处糖基化的情况下，也可以使用其它 宿主细胞。
[0331]所得的含Fc部分的嵌合多肽和由其形成的多聚体可以通过经过 A蛋白柱或G蛋白柱的亲和层析法纯化。在将编码不同ECD嵌合多肽的 两种核酸转化入细胞的情况下，异二聚体的形成必须以生物化学方式实现， 因为携带Fc结构域的ECD嵌合分子还将表达为二硫键连接的同二聚体。 因此，在有助于破坏链间二硫键而不影响链内二硫键的条件下能减少同二 聚体。一般，将具有不同胞外部分的嵌合单体以等摩尔量混合并且氧化以 形成同二聚体与异二聚体的混合物。这种混合物的组分由层析技术分离。 备选地，可以通过基因工程设计并表达这样的ECD融合分子而偏向地形 成异二聚体这种类型，其中所述的ECD融合分子含有ECD多肽，后接 hIgG的Fc-结构域，随后是c-jun或c-fos亮氨酸拉链(见下文)。由于亮氨 酸拉链优势地形成异二聚体，故它们可以根据需要用来驱动所述异二聚体 的形成。也可以设计含有Fc区的ECD嵌合多肽以包括具金属螯合物的标 签或其它表位的标签。这种加标签的结构域可以通过金属螯合物层析和/ 或通过抗体用于快速纯化，以允许蛋白质印迹物、免疫沉淀物或生物测定 法中活性清除/阻断作用的检测。(b).入空穴突起(即隆突和孔洞)
[0332]在一个方面，设计ECD多聚体以在第一嵌合多肽与第二嵌合多 肽之间含有促进异寡聚化胜过同寡聚化的界面。一般，第一和第二ECD 嵌合多肽之一或这两者的多聚化结构域是经修饰的抗体片段，从而该抗体 分子的界面受到修饰以便于和/或促进异二聚化。在一些情况下，抗体分子 是经修饰的Fc区。因此，修饰包括导入突起至第一Fc多肽和导入空穴至 第二Fc多肽，从而所述突起可位于该空穴中以促进含有Fc的第一及第二 嵌合ECD多肽复合。
[0333]一般，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的稳定相互作用是通过相 同或不同多聚化结构域的界面相互作用，其中所述的多聚化结构域含有免 疫球蛋白恒定结构域的CH3结构域的足够部分。多个结构数据和功能数据 显示抗体重链结合由CH3结构域指导。例如，X射线结晶学已经显示Fc 区中人IgG1重链之间的分子间结合包括在CH3结构域之间广泛的蛋白质/ 蛋白质相互作用，而糖基化CH2结构域借助其糖类而相互作用(Deisenhofer 等(1981)Biochem.20：2361)。此外，存在两个重链间二硫键，它们在哺乳 动物细胞中的抗体表达期间高效形成，除非截短所述重链而移除CH2和 CH3结构域(King等(1992)Biochem.J.281：317)。因此，重链装配似乎促进 二硫键形成，但非反之亦然。对CH3结构域的界面的设计促进含有不同重 链的异多聚体形成并且阻碍相应同多聚体装配(参见例如，美国专利号5, 731,168；国际专利申请WO 98/50431和WO 2005/063816；Ridgway等 (1996)Protein Engineering，9：617-621).
[0334]因此，本文提供的ECD多聚体可以在第一和第二嵌合ECD多 肽的界面之间形成，其中第一多肽的多聚化结构域至少含有Fc结构域的 CH3界面的足够部分，所述部分已经受到修饰以含有突起，并且第二多肽 的多聚化结构域至少含有Fc结构域的CH3界面的足够部分，所述部分已 经受到修饰以含有空穴。经修饰的CH3界面的全部或足够部分可以来自 IgG、IgA，IgD、IgE或IgM免疫球蛋白。在美国专利号5,731,168中描述 多种免疫球蛋白分子CH3结构域中作为修饰靶标的界面残基。通常，多聚 化结构域是从IgG抗体例如IgG1衍生的CH3结构域的全部或足够部分。
[0335]替换和/或修饰氨基酸以在多肽中产生突起或空穴的靶氨基酸一 般是与第二多肽界面中一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。 受修饰以含有突起氨基酸的第一多肽包括以如此氨基酸替换天然或原初氨 基酸，其中所述的氨基酸具有从第一多肽界面中伸出的至少一个侧链并且 因而可定位于第二多肽相邻界面中的补偿性空穴内。大多数情况下，替换 氨基酸是比原初氨基酸残基具有较大侧链体积的氨基酸。本领域技术人员 知道如何确定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定作为理想替换氨基酸旨 在产生突起的那些氨基酸。通常，用于形成突起的替换残基是天然存在的 氨基酸残基并包括例如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。 在一些实例中，所鉴定用于替换的原初残基是具有小体积侧链的氨基酸残 基，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨 酸。
[0336]受修饰以含有空穴的第二多肽是包括用如此氨基酸替换天然或 原初氨基酸的多肽，其中所述的氨基酸具有从第二多肽界面缩回的至少一 个侧链并且因而能够接纳来自第一多肽界面的相应突起。大多数情况下， 替换氨基酸是比原初氨基酸残基具有较小侧链体积的氨基酸。本领域技术 人员知道如何确定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定作为理想替换氨基 酸用于形成空穴的那些氨基酸。通常，用于形成空穴的替换残基是天然存 在的氨基酸残基并包括例如丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(v)。 在一些实例中，鉴定用于替换的原初氨基酸是具有大体积侧链的氨基酸， 例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
[0337]例如，人IgG1的CH3界面涉及位于四条反平行β-链上的每个 结构域上的16个残基，其从每个表面埋下1090(参见例如，Deisenhofer 等(1981)Biochemistry，20：2361-2370；Miller等(1990)J.Mol.Biol，216， 965-973；Ridgway等(1996)Prot.Engin.，9：617-621；美国专利5,731,168)。 例如在美国专利5,731,168；国际专利申请WO98/50431和WO 2005/063816；和Ridgway等(1996)Prot.Engin.，9：617-621中描述产生突 起或空穴的CH3结构域修饰。例如，在CH3结构域中产生突起或空穴的修 饰可以是替换与SEQ ID NO：163中所述序列的界面氨基酸Q230、V231、 Y232、T233、L234、V246、S247、L248、T249、C250、L251、V252、 K253、G254、F255、Y256、K275、T276、T277、P278、V279、L280、 D281、G285、S286、F287、F288、L289、Y290、S291、K292、L293、 T294，和V295相对应的任意氨基酸。在一些实例中，在CH3结构域中产生 突起或空穴的修饰一般靶向在两条中央反平行β-链上定位的残基。目的是 使产生的突起能通过突入周围溶剂而被接纳而不是由配偶体CH3结构域中 的补偿性空穴接纳的风险最小化。此类修饰的示例包括例如替换与界面氨 基酸T249、L251、P278、F288、Y290和K292相对应的任意氨基酸。用 于在CH3结构域界面中修饰以产生突起/空穴相互作用的氨基酸配对示例 包括修饰T249及Y290和F288及T277。例如，修饰可以包括T249Y及 Y290T；T249W及Y290A；F288A及T277W；F288W及T277S；和Y290T 及T249Y。
[0338]在一些实例中，可以产生多于一种的界面相互作用。例如，修 饰也包括例如在第一多肽中产生突起的两种或多种修饰和在第二多肽中产 生空穴的两种或多种修饰。此类修饰的示例包括例如，修饰第一多肽中的 T249Y及F288A和修饰第二多肽中的T277W及Y290T；修饰第一多肽中 的T277W及F288W和修饰第二多肽中的T277S及Y290A；或修饰第一 多肽中的F288A及Y290A和修饰第二多肽中的T249W及T277S。
[0339]就本文中所述的其它多聚化结构域，包括任何免疫球蛋白分子 的全部或部分或其变体，如Fc结构域或其变体，含有CH3突起/空穴修饰 的Fc变体可以与ECD多肽的任何位置连接，不过一般经其氨基端或羧基 端，与第一和/或第二ECD多肽的氨基端或羧基端连接以形成嵌合多肽。 连接可以是直接的或经接头间接的。另外，该嵌合多肽可以是融合蛋白或 可以通过化学连接如通过共价或非共价相互作用形成。一般地，隆突和孔 洞分子通过共表达连接至含有CH3突起修饰的Fc变体的第一ECD多肽和 连接至含有CH3空穴修饰的Fc变体的第二ECD多肽而产生。ii.亮氨酸拉链
[0340]制备ECD多肽多聚体的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链结构 域。亮氨酸拉链是促进其中存在亮氨酸拉链的蛋白质多聚化的肽。一般， 亮氨酸拉链是这样的术语，其用来指作为几种蛋白质的保守结构域而存在 的含有4-5个亮氨酸残基的重复七集体(heptad)基序。亮氨酸拉链折叠 为短的、平行卷曲的螺旋，并且认为负责使其中亮氨酸拉链形成结构域的 蛋白质寡聚化。最初在几种DNA结合蛋白中鉴定到亮氨酸拉链(参见例如， Landschulz等(1988)Science 240：1759)，并且迄今已经在多种蛋白质中找到 它们。在已知的亮氨酸拉链中，有二聚化或三聚化的天然存在肽及其衍生 物。含有直接或间接与亮氨酸拉链肽连接的ECD多肽的重组嵌合蛋白可 以在合适的宿主细胞中表达，并且形成的ECD多肽多聚体可以从培养上 清液回收。
[0341]亮氨酸拉链结构域折叠为短的、平行卷曲的螺旋(O′Shea等 (1991)Science，254：539)。该平行卷曲螺旋的总体结构已经表征为首先由 Crick在1953年提出的″隆突-入-孔洞″填充体(packing)(Acta Crystallogr.， 6：689)。由亮氨酸拉链结构域形成的二聚体由名为(abcdefg)n的七集体重复 序列稳定(参见例如，McLachlan和Stewart(1978)J.MoI.Biol.98：293)， 其中残基a和d通常是疏水残基，而d是在螺旋的相同表面上排成一线的 亮氨酸。带相反电荷的残基通常出现在位置g和e处。因此，在从两个亮 氨酸拉链结构域中形成的平行卷曲螺旋中，由第一螺旋的疏水侧链形成的″ 隆突″填充至形成于第二螺旋的侧链之间的″孔洞″内。
[0342]在位置d处的亮氨酸残基提供大的疏水稳定能并且对于二聚体 形成是重要的(Krystek等(1991)Int.J.Peptide Res.38：229)。疏水稳定能提 供主要推动力用于从螺旋状单体形成卷曲螺旋。静电的相互作用也有助于 卷曲螺旋的化学计量学和几何学。(a)fos和jun
[0343]两种核转化蛋白fos和jun显示有亮氨酸拉链结构域，鼠原癌基 因c-myc的基因产物也是如此。亮氨酸拉链结构域对于这些蛋白质的生物 学活性(DNA结合)是必需的。胞核癌基因fos和jun的产物含有偏好地形 成异二聚体的亮氨酸拉链结构域(O′Shea等(1989)Science，245：646；Turner 和Tijian等(1989)Science，243：1689)。例如，人转录因子c-jun和c-fos的 亮氨酸拉链结构域已经证实以1∶1化学计量形成稳定的异二聚体(参见例 如，Busch和Sassone-Corsi(1990)Trends Genetics，6：36-40；Gentz等(1989) Science，243：1695-1699)。虽然已经证实也形成jun-jun同二聚体，然而它 们的稳定性比jun-fos异二聚体低约1000倍。
[0344]因此，一般而言，使用jun-fos组合产生本文提供的ECD多肽 多聚体。通常地，c-jun或c-fos的亮氨酸拉链结构域通过基因工程融合基 因以符合可读框方式融合在多肽的ECD的羧基端。c-jun和c-fos亮氨酸 拉链的示例性氨基酸序列分别在SEQ ID NO：170和171中描述。在一些 情况下，亮氨酸拉链的序列可以例如通过添加允许二硫键形成的半胱氨酸 残基或在羧基端添加便于测量肽浓度的酪氨酸残基而进行修饰。经修饰的 c-jun和c-fos亮氨酸拉链的所编码氨基酸的此类示例性序列分别在SEQ ID NO：172和173中描述。此外，ECD多肽与亮氨酸拉链的连接可以是直 接的或可以使用柔性接头结构域如IgG铰链区或在多种长度和组合下的小 体积氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸的其它多肽接头进行。在 一些情况下，亮氨酸拉链与编码的多肽羧基端的分离可以通过与编码蛋白 酶切割位点如凝血酶切割位点的序列融合而实行。此外，所述嵌合蛋白可 以加标签，例如加上6×组氨酸标签，以允许通过金属螯合物层析法和/或 通过可获得抗体的表位例如myc标签进行快速纯化，以允许对蛋白质印迹 物、免疫沉淀物或生物测定法中活性清除/阻断作用的检测。(b).GCN4
[0345]亮氨酸拉链结构域也在一种核蛋白中存在，其中所述的核蛋白 作为参与酿酒酵母(S.cerevisiae)中氮代谢总体控制(GCN4)基因家族的转 录激活物发挥作用。该蛋白质能够二聚化并结合含有GCN4识别序列的启 动子序列，因而在氮除去时激活转录。能够形成二聚复合体的GCN4亮氨 酸拉链的示例性序列在SEQ ID NO：180中描述。
[0346]已经发现在代表GCN4亮氨酸拉链结构域的合成肽的残基a和 d中的氨基酸替换(即在描述为SEQ ID NO：180的序列中的氨基酸替换)改 变了亮氨酸拉链结构域的寡聚化特性。例如，当位置a处的全部残基改成 异亮氨酸时，亮氨酸拉链仍形成平行二聚体。当除此变化之外，还有位置 d处的全部亮氨酸残基改成异亮氨酸时，产生的肽在溶液中自发形成三聚 体平行卷曲螺旋。能够形成三聚体的这种GNC4亮氨酸拉链结构域的示例 性序列在SEQ ID NO：181中描述。用异亮氨酸替换在位置d处的全部氨基 酸并用亮氨酸替换在位置a处的全部氨基酸产生发生四聚化的肽。这种能 够形成四聚体的GNC4亮氨酸拉链结构域的示例性序列在SEQ ID NO： 182中描述。含有这些替换的肽仍称作亮氨酸拉链结构域，因为人们认为 寡聚体形成机制与常规的亮氨酸拉链结构域，如上文所述和在SEQ ID NO：180中描述的GCN4是相同的。iii.其它多聚化结构域
[0347]其它多聚化结构域是本领域技术人员已知的，并且是便于分别 产生并表达为ECD融合物的两个或多个多肽的蛋白质-蛋白质相互作用的 任意多聚化结构域。可以用来提供两个嵌合多肽之间蛋白质-蛋白质相互作 用的其它多聚化结构域的实例包括但不限于芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌 RNA酶抑制剂模块(参见例如，Deyev等(2003)Nat.Biotechnol. 21：1486-1492)；选择特定的蛋白质结构域(参见例如，Terskikh等(1997) PNAS 94：1663-1668和Muller等(1998)FEBS Lett.422：259-264)；选择特 定的肽基序(参见例如，de Kruif等(1996)J.Biol.Chem.271：7630-7634和 Muller等(1998)FEBS Lett.432：45-49)；和使用二硫桥以增强稳定性(de Kruif等(1996)J.Biol.Chem.271：7630-7634和Schmiedl等(2000)Protein Eng.13：725-734)。另一类型的多聚化结构域的示例是其中通过不同亚基多 肽之间的蛋白质-蛋白质相互作用促进多聚化的一种多聚化结构域，如下文 对PKA/AKAP相互作用的描述那样。(a).R/PKA-AD/AKAP
[0348]异多聚体ECD多肽也可以利用cAMP依赖性蛋白激酶(PKA) 的调节亚基(R)与A激酶锚定蛋白(AKAP，参见例如，Rossi等(2006)PNAS 103：6841-6846)的锚定结构域(AD)之间的蛋白质-蛋白质相互作用而产生。 在PKA中存在两种类型的R亚基(RI和RII)，每种亚基具有α和β同工 型。R亚基作为二聚体存在，并且对于RII，二聚化结构域位于44个氨基 端残基内(参见例如，SEQ ID NO：183)。AKAP通过它们的AD结构域的 相互作用而相互作用于PKA的R亚基以调节其活性。AKAP仅与二聚体 状R亚基结合。例如，对于人RIIα而言，AD与形成自23个氨基端残基 的疏水表面结合。AD的示例性序列是在SEQ ID NO：184中描述的AD1， 它是从AKAP-IS(优化用于RII选择性结合的一种合成肽)衍生的一个17 氨基酸残基序列。因此，可以通过(直接或间接地)连接编码ECD多肽(如 HER ECD多肽)的核酸与编码R亚基序列(即SEQ ID NO：183)的核酸而产 生异多聚体ECD多肽。这产生同二聚体分子，原因在于R亚基实现二聚 体自发形成。以串联方式，可以通过将编码另一ECD多肽的核酸与编码 AD序列的核酸连接而产生另一ECD多肽融合物。在共表达这两个组件后， 如在宿主细胞中共转染所述的ECD嵌合组件后，二聚体状R亚基为结合 至AD序列提供停靠位点，产生异多聚体分子。这种结合事件可以通过共 价键例如二硫键进一步稳定。在一些实例中，柔性接头残基可以融合在编 码ECD多肽的核酸与编码多聚化结构域之间。在另一个实例中，可以将 编码ECD多肽的核酸融合至编码R亚基的核酸，其中所述的R亚基含有 并入R亚基氨基末端附近以便于共价连接的半胱氨酸残基(参见例如，SEQ ID NO：185)。类似地，可以将编码配偶体ECD多肽的核酸融合至编码AD 亚基的核酸，其中所述的AD亚基也含有并入AD氨基末端及羧基末端的 半胱氨酸残基(参见例如，SEQ ID NO：186)。3.嵌合ECD多肽
[0349]如本文中所述制备用于形成ECD多聚体的嵌合ECD多肽。嵌 合ECD多肽一般含有与多聚化结构域直接或间接连接的CSR的ECD的 全部或部分。示例性多聚化结构域是本文中所述的任意多聚化结构域，包 括但不限于免疫球蛋白序列(即恒定区(Fc))、亮氨酸拉链、相容性蛋白质- 蛋白质相互作用结构域、卷曲螺旋基序、螺旋环基序、互补性疏水区、互 补性亲水区、大小相同或相似的入空穴突起和补偿性空穴和足以形成稳定 多聚体的任何其它多聚化结构域。为了允许形成多聚体分子，多聚化结构 域在第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间是相同或互补的。一旦表达，分别 的嵌合ECD多肽的单体通过所述多聚化结构域稳定地联结以形成多聚体 ECD多肽。
[0350]CSR的任何ECD部分可以用作多聚体配偶体。例如，可以使用 上文所述的任意ECD或在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、127、129、131、133、135、136、137、138、139、 141、143、144、146、148、149、150、151、153、155、157、159、298、 200或301-399任意项中所述的那些ECD或CSR的任何ECD部分，包括 FGFR、VEGFR、IGF1-R和其剪接变体的ECD，如在表7中描述及在SEQ ID NO：194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、 218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、 244、246、248、250、252、254、256、258、260或262任意项中所述的 任何CSR的ECD部分来产生嵌合的ECD多肽，其中所述ECD多肽的全 部或部分与多聚化结构域连接。一般，所述ECD部分的至少一个，不过 有时两个，是与多聚化结构域连接的足以结合配体和/或二聚化的HER家 族受体的全部或部分(即HER1、HER2、HER3或HER4分子的全部或部 分)。用作多聚化配偶体的HER家族受体的ECD或其部分的实例在上文 中描述并且在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、129、131、136、137和159任意项中给出。在一些实例中，多聚 体配偶体中至少之一者是HER1受体的ECD的全部或部分。例如，多聚 体HER ECD多肽的示例是在HER1/HER3或HER1/HER4的ECD或其 部分之间形成的多聚体。此外，用在形成ECD多聚体中的嵌合ECD多肽 可以包括与多聚化结构域连接的杂合ECD多肽。
[0351]在一个实例中，ECD嵌合多肽包括将ECD多肽与来自免疫球 蛋白分子的序列直接或间接连接。在一个实例中，多聚化组分是来自人 IgG、IgM、IgD、IgM或IgA的免疫球蛋白衍生结构域，或是来自其它动 物，包括但不限于小鼠，可比较的免疫球蛋白结构域。在其它实例中，多 聚化组分选自IgG、IgG重链及IgG轻链的任意Fc结构域。一般，使用 IgG的Fc结构域，并且它可以选自IgG同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4，以及每一同种型组内的任何同种异型(allotype)。在大多数情况下， Fc结构域是IgG1的Fc结构域或其衍生物，其可以为了本文中所述的具体 想要的特性而修饰。Fc部分最常见含有铰链区的至少部分和免疫球蛋白重 链的CH2和CH3结构域。用作多聚化组分的示例性Fc序列在SEQ ID NO：167中描述，不过例如取决于Fc序列中所用铰链部分的长度，其它Fc 序列是已知的。一般，ECD多肽与Fc序列的融合通过直接连接进行。不 过也可以通过间接连接如通过肽接头或化学接头(包括异双官能性交联剂) 进行。通常，CSR(包括任意HER家族受体)的氨基端ECD或其部分在羧 基端与人IgG1的Fc部分和根据需要与肽接头和/或表位标签融合。a.示例性嵌合的HER ECD多肽
[0352]为用在本文所提供ECD多聚体的形成中而包括的嵌合多肽包括 这样的任何嵌合多肽，其含有HER1的全长ECD或其截短部分和Fc多聚 化组分并且任选地含有用于纯化和/或检测所述HER1ECD嵌合多肽的表 位标签如c-myc或组氨酸标签。示例性HER1-Fc嵌合多肽在SEQ ID NO： 38和40中分别描述并且由SEQ ID NO：37和39中所述的核苷酸序列分 别编码。例如，如SEQ ID NO：38描述的示例性HER1-Fc嵌合多肽 (HF110-Fc；HER1-501/Fc；HFD110)含有在SEQ ID NO：10中所述的HER1 的截短ECD序列(对应于SEQ ID NO：38的第1-501位氨基酸)，这种截短 ECD序列在氨基端处有效连接于含有XhoI限制性接头的序列(对应于第 502-503位氨基酸))、肽接头序列(对应于第504-508位氨基酸)和Fc多聚化 组分的序列(对应于第509-739位氨基酸)。在另一个实例中，如SEQ ID NO：40描述的示例性HER1-Fc嵌合多肽(HF100-Fc；HER1-621/Fc； HFD100)含有在SEQ ID NO：12中所述的HER1的全长ECD序列(对应于 SEQ ID NO：40的第1-621位氨基酸)、肽接头序列(对应于第622-626位氨 基酸)和Fc多聚化组分的序列(对应于第627-857位氨基酸)。此外，HER1-Fc 分子(包括例如示例性HF110-Fc和HF100-Fc分子)可以任选地含有表位标 签。例如，在SEQ ID NO：38中所述的示例性HF110-Fc分子也可以任选 地包括myc表位标签组(对应于SEQ ID NO：38的第740-749位氨基酸)。 在另一个实例中，在SEQ ID NO：40中所述的HF100-Fc分子也可以任选 地包括His表位标签或其它标签(即HFD100T)。示例性HFD100T分子在 SEQ ID NO：406中描述并且含有HER1的全长ECD序列(对应于SEQ ID NO：406的第1-621位氨基酸)，这种全长ECD序列在氨基端处有效连接于 含有Xbal接头的序列(对应于第622-623位氨基酸))、肽接头序列(对应于 第624-627位氨基酸)、Fc多聚化组分的序列(对应于第628-858位氨基酸)、 含有AgeI接头的序列(对应于第859-860位氨基酸)和6×组氨酸标签的序 列(对应于SEQ ID NO：406的第861-866位氨基酸)。
[0353]为用在本文所提供ECD多聚体的形成中而包括的嵌合多肽包括 这样的任何嵌合多肽，其含有HER2的全长ECD或其截短部分和Fc多聚 化组分并且任选地含有用于纯化和/或检测所述HER2ECD嵌合多肽的表 位标签如c-myc标签或组氨酸标签。示例性HER2-Fc嵌合多肽在SEQ ID NO：42中描述并且由SEQ ID NO：41中所述的核苷酸序列编码。如SEQ ID NO：40描述的示例性HER2-Fc嵌合多肽(HF200-Fc；HER2-650/Fc； HFD200)含有在SEQ ID NO：18中所述的HER2的全长ECD序列(对应于 SEQ ID NO：42的第1-628位氨基酸)，这种全长ECD序列在氨基端处有 效连接于含有肽接头序列的序列(对应于第629-633位氨基酸)和Fc多聚化 组分的序列(对应于第634-864位氨基酸)。此外，HER2-Fc分子(包括例如 示例性HF200-Fc分子)可以任选地含有表位标签。
[0354]为用在本文所提供ECD多聚体的形成中而包括的嵌合多肽包括 这样的任何嵌合多肽，其含有HER3的全长ECD或其截短部分和Fc多聚 化组分并且任选地含有用于纯化和/或检测所述HER3ECD嵌合多肽的表 位标签如c-myc标签或组氨酸标签。示例性HER3-Fc嵌合多肽在SEQ ID NO：44和46中分别描述并且由SEQ ID NO：43和45中所述的核苷酸序 列分别编码。例如，如SEQ ID NO：44中描述的示例性HER3-Fc嵌合多 肽(HF310-Fc；HER3-500/Fc；HFD310)含有在SEQ ID NO：20中所述的 HER3的截短ECD序列(对应于SEQ ID NO：44的第1-500位氨基酸)，这 种截短ECD序列在氨基端处有效连接于含有肽接头序列的序列(对应于第 501-505位氨基酸)和Fc多聚化组分的序列(对应于第506-736位氨基酸)。 在另一个实例中，如SEQ ID NO：46中描述的示例性HER3-Fc嵌合多肽 (HF300-Fc；HER3-621/Fc；HFD300)含有在SEQ ID NO：26中所述的 HER3的全长ECD序列(对应于SEQ ID NO：46的第1-621位氨基酸)，这 种全长ECD序列在氨基端处有效连接于含有肽接头序列的序列(对应于第 622-626位氨基酸)和Fc多聚化组分的序列(对应于第627-857位氨基酸)。 此外，HER3-Fc分子(包括例如示例性HF310-Fc和HF300-Fc分子)可以任 选地含有表位标签。
[0355]为用在本文所提供ECD多聚体的形成中而包括的嵌合多肽包括 这样的任何嵌合多肽，其含有HER4的全长ECD或其截短部分和Fc多聚 化组分并且任选地含有用于纯化和/或检测所述HER4ECD嵌合多肽的表 位标签如c-myc或组氨酸标签。示例性HER4-Fc嵌合多肽在SEQ ID NO： 48中描述并且由SEQ ID NO：47中所述的核苷酸序列编码。如SEQ ID NO： 48中描述的示例性HER4-Fc嵌合多肽(HF400-Fc；HER4-650/Fc；HFD400) 含有在SEQ ID NO：32中所述的HER4的全长ECD序列(对应于SEQ ID NO：48的第1-625位氨基酸)，这种全长ECD序列在氨基端处有效连接于 含有肽接头序列的序列(对应于第626-630位氨基酸)和Fc多聚化组分的序 列(对应于第631-861位氨基酸)。此外，HER4-Fc分子(包括例如示例性 HF400-Fc分子)可以任选地含有表位标签。E.ECD多聚体
[0356]本文中提供的ECD多聚体含有通过其各自的多聚化结构域相互 作用而稳定结合的至少两个ECD多肽。ECD多聚体可以是是同多聚体， 不过最常见的是其中多聚体的ECD多肽组分不同的异多聚体。ECD异多 聚体是泛受体治疗剂，包括泛HER治疗剂。ECD多聚体靶向HER家族 成员上的几种表位。因此，所得的ECD多聚体分子调节，通常抑制两种 或多种关联性或相互作用性CSR的活性。调节可以通过与一种或多种配体 相互作用和/或通过与全长关联受体或其它相互作用性CSR的二聚化而进 行。因此，所述多聚体ECD多肽与各ECD多肽中每一种多肽的一种或多 种配体，通常两种或多种配体结合和/或与细胞表面上的关联受体或相互作 用性受体二聚化。因此，所得的ECD多肽多聚体用作关联CSR的拮抗剂。 此类拮抗剂用于治疗因关联受体的配体结合和/或激活所致的疾病。
[0357]HER家族受体最常见处于无活性形式，仅有至多5％的跨膜 HER分子处于活性构型。正常情况下，对于全长HER受体，决定无活性 形式转变至活性形式的机制是配体结合作用。配体结合作用使受体分子方 向重新取向，迫使二聚化臂从束缚构象转变成具有与另一种HER分子二 聚化潜力的构象。可以通过迫使HER分子的胞外结构域的全部或部分与 多聚化结构域如但不限于Fc片段二聚化而模拟HER分子的活性形式。因 此，HER ECD与多聚化结构域的融合迫使该HER分子采取配体非依赖性 激活(即非束缚)构象，类似于组成型激活的HER2分子。例如，当所述多 聚化结构域是Fc分子的情况下，嵌合多肽表达可以产生为同二聚体，其中 通过Fc结构域的相互作用而迫使所表达的两个单体多肽之间二聚化。在一 些情况下，这种同二聚体与该ECD的单体形式相比较，可以导致ECD多 肽的改善特性。在一个实例中，HER ECD的全部或部分与Fc多聚化结构 域的连接可以产生能够具有高配体结合亲和力的高亲和力受体复合体，而 该ECD的单体形式不能够结合配体。例如，如实施例4中所述，含有成 熟HER1受体的完整ECD(即第1-621位氨基酸)的单体ECD分子仅显示 与EGF的最小结合。当该ECD多肽与Fc多聚化结构域连接时，同二聚 体HER1ECD分子与EGF结合的能力明显增加。
[0358]提出利用这种相同机制来稳定CSR分子的异多聚体，用于产生 泛受体ECD多聚体(包括泛HER ECD多聚体)作为广谱的高亲和力受体治 疗剂。
[0359]因此，属于泛受体治疗剂活性的是对多于一种的配体具有亲和 力的高亲和力可溶性受体复合体。因此，泛受体多聚体可以用作配体阱以 隔绝配体(包括生长因子配体)。可以由所述ECD多聚体隔绝的配体是已知 与多聚体的ECD多肽结合或相互作用的那些配体。当ECD多聚体的组分 含有HER分子中足以结合配体的一个或多个全部或部分ECD的情况下， 该ECD多聚体潜在地可以隔绝任意一种或多种在表6中所述的配体组合。 例如，若所述多聚体是HER1和HER4的组合，则至少10种不同配体可 以是靶。或者，若所述多聚体是HER1与HER3的组合，则下述任意一种 或多种配体可以被该多聚体分子隔绝，其中所述的配体包括EGF、双调蛋 白、TGF-α、β动物纤维素、肝素结合EGF、表皮调节素或神经调节蛋白 1或2(Her调节蛋白1或2)。因此，在多聚体的ECD多肽组分之一是HER 分子(例如HER1)而其余组分是另一CSR的全部或部分的一些情况下，此 ECD多聚体可以与至少7种配体相互作用，其中所述配体中的6种是由 HER1的ECD识别的配体，而剩余一种或多种配体由配偶体ECD多肽识 别。额外配体可以是参与疾病过程(如但不限于增生疾病、血管生成病或炎 性疾病)的生长因子或其它配体分子。此类配体的示例包括VEGF、FGF、 胰岛素、HGF、血管形成因子和其它配体。在额外的实例中，可以设计从 一种或多种杂合ECD多肽的组合中产生的ECD多聚体，从而该ECD多 聚体含有针对2种、3种或多到4种不同CSR的足够配体结合部分并且因 此具有使2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种 配体隔绝于其各自的全长CSR的能力。
[0360]本文中提供的ECD多聚体对CSR的调节也可以通过与关联性 或相互作用性跨膜受体直接相互作用进行。例如，通过与共受体二聚化以 产生全长同二聚体受体和全长异二聚体受体，从而使得用以效应子召集及 下游信号作用的催化性尾部自我磷酸化而激活几乎全部RTK受体。例如， 作为HER信号传导作用放大和多样化的一种机制，HER受体以多种组合 发生二聚化。已经观察了全长HER受体的全部组合，其中HER2作为最 常见的二聚化配偶体。因此，对CSR、尤其RTKs(包括HER)二聚化能力 的任何干扰将破坏受体介导的信号传导作用。可以破坏CSR二聚化的分子 的示例是ECD多聚体、尤其HER ECD多聚体。因与多聚化结构域融合(例 如与Fc蛋白融合)产生的HER ECD多聚体的激活高亲和力形式预示一种″ 背靠背″构象，其中无论是否由配体结合，所述的″背靠背″构象代表结构 域II内的二聚化臂处在相互作用于跨膜受体的构型。这种相互作用会干扰 全长HER受体在跨膜区处与另一全长HER受体匹配的能力，因而抑制该 受体的激活。对干扰关联受体二聚化的其它CSR ECD(包括其它RTK ECD 多聚体)构思了类似的相互作用和抑制作用。因此，除隔绝配体或取而代之， 本文提供的泛受体多聚体可以与一种或多种受体二聚化以抑制其活性。如 下所述，跨膜受体的活性可以通过测定法(包括但不限于磷酸化法或细胞增 殖法)进行评估。
[0361]一般，ECD多聚体是二聚体，不过也可以是三聚体或更大的多 聚体，这取决于例如为形成多聚体所选择的多聚化结构域。例如，Fc结构 域将产生二聚体分子。此外，作为亮氨酸拉链的多聚化结构域通常也产生 二聚体ECD分子。然而，亮氨酸拉链的变体形式例如变体GCN4可以用 来产生三聚体或更大的多聚体。在需要高阶多聚化结构域的情况下，可以 据此选择多聚化结构域。本领域技术人员熟悉示例性多聚化结构域(如本文 中提供的任意多聚化结构域)的结构组织形式。a.全长HER1ECD和另一CSR的ECD的全部或部分
[0362]本文中提供一种ECD多聚体，其含有与多聚化结构域连接的 HER1的全长ECD作为第一多肽和也与多聚化结构域连接的另一CSR的 ECD的全部或部分作为第二多肽。第一和第二多肽的多聚化结构域可以是 相同或不同的，不过在多聚化结构域不同的情况下，所述的多聚化结构域 是互补性的，以允许多聚体组分之间稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。全长 HER1ECD多肽的示例是HF100或其等位变体或物种变体，其中所述的 HF100包括如SEQ ID NO：12中描述的成熟HER1受体的第1-621位氨基 酸。第二多肽的ECD可以是任意CSR的、尤其涉及疾病过程的任意CSR 的ECD的全部或部分，其中所述的疾病过程涉及增殖、血管生成或炎症， 只要这种ECD多肽不是全长HER2分子。然而，第二多肽的ECD可以是 HER2分子中足以与其它HER分子二聚化的ECD的部分。截短的HER2 ECD多肽的示例包括在SEQ ID NO：18中描述的HF220分子和在SEQ ID NO：16中描述的HF210分子及其等位变体。在一些情况下，优选含有全长 HER1分子和截短的HER2分子HF210的ECD多聚体，因为在该截短 HER2分子的亚结构域IV中存在的模块2-5影响此截短HER2分子的二聚 化能力，如实施例5中描述。
[0363]含有全长HER1ECD作为第一多肽的ECD多聚体可以将HER3 或HER4受体的ECD的全部或部分作为其第二多肽组分。此种ECD多聚 体具体地是这样一种ECD多聚体，其具有结合来自EGF、双调蛋白、 TGF-α、β动物纤维素、肝素结合性EGF或表皮调节素和一种或多种神经 调节蛋白中的两种或多种配体的能力。这种多肽也可以与HER受体的任 意一种或多种二聚化。例如，与HER4ECD多肽的全部或部分组合的ECD 多聚体具有结合神经调节蛋白1-4中任意者(包括其任意同工型)的能力。此 种ECD多聚体的示例是这样一种ECD多聚体，其中该多聚体的第一多肽 是全长HER1ECD(即在SEQ ID NO：12中描述的HF100或其等位变体) 并且第二多肽是能够结合配体的截短HER4多肽，例如，但不限于在SEQ ID NO：28中描述的HF410分子或其等位变体。此ECD多聚体的HER4 部分也可以是这样一种全长HER4分子，其含有如在SEQ ID NO：32中描 述的成熟HER4受体的完整ECD部分(即HF400)。在一些实例中，HER1 ECD与全部或部分HER4ECD的多聚化由多聚化结构域介导。例如，可 以共表达在SEQ ID NO：40中描述的示例性嵌合多肽(HF100-Fc或如在 SEQ ID NO：406中描述的其加表位标签形式)和在SEQ ID NO：48中描述的 嵌合多肽(HF400-Fc))以产生多聚体分子。
[0364]然而，通常，在多聚体中全长HER1ECD多肽与HER3ECD 多肽的全部或部分联合，从而所得的多聚体具有结合神经调节蛋白1或2 中任意者(包括其任意同工型)和/或与细胞表面上任意一种或多种HER受 体二聚化的能力。此种ECD多聚体的示例是这样的一种ECD多聚体，其 中该多聚体的第一多肽是全长HER1ECD并且该多聚体的第二多肽是 HER3多肽的全部或部分。HER1和HER3是最常见的过量表达的受体中 的两种受体。因此，HER1和HER3的ECD多聚体具有这样的能力，即 捕获与两种最常见的过量表达的受体结合的配体，同时忽略与HER4(即神 经调节蛋白3和神经调节蛋白4)结合的一些配体，其中所述的HER4未证 实在癌中具有广泛活性(Barnes等(2005)Clin Cancer Res 11：2163-8； Srinivasan等(1998)J Pathol.185：236-45)。
[0365]在一个实例中，HER1ECD和HER3ECD的ECD多聚体可以 包括全长的HER1ECD作为第一多肽和截短的HER3ECD多肽作为第二 多肽，其中每种多肽与多聚化结构域连接。如上文提及，全长HER1分子 的示例是HF100分子(SEQ ID NO：12)或其等位变体。构思了任意的截短 HER3ECD多肽，只要它保留结合神经调节蛋白1或2同工型中任意一种 或多种和/或二聚化的能力即可。这种截短的HER3ECD多肽的示例包括 在SEQ ID NO：20中描述的HF310、在SEQ ID NO：22中描述的p85HER3 或在SEQ ID NO：24中描述的ErbB3-519或其等位变体。例如，可以共表 达在SEQ ID NO：40中描述的示例性嵌合多肽(HF100-Fc，或如在SEQ ID NO：406中描述的其加表位标签形式)及在SEQ ID NO：44中描述的示例性 嵌合多肽(HF310-Fc)以产生多聚体分子。
[0366]在另一个实例中，HER1ECD和HER3ECD的ECD多聚体可 以包括全长的HER1ECD(如HF100分子(SEQ ID NO：12))作为第一多肽和 全长HER3ECD分子作为第二多肽，其中每种多肽与多聚化结构域连接。 一种示例性全长HER3ECD分子包括如在SEQ ID NO：26(HF300)中描述 的成熟HER3全长受体的第1-621位氨基酸。HER1/HER3的全长ECD多 聚体可以通过其分别的多聚化结构域相互作用而连接。第一全长HER1 ECD多肽及第二HER3ECD多肽的多聚化结构域可以是相同或不同的， 不过在多聚化结构域不同的情况下，所述的多聚化结构域是互补性的，以 允许多聚体组分之间稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。在一个实例中，第一 和第二多肽各自与Fc片段(例如但不限于IgG1 Fc片段)连接。与Fc片段 连接的全长HER1和HER3ECD嵌合多肽的示例分别在SEQ ID NO：40 或SEQ ID NO：46中描述。因此，HER1/HER3ECD多聚体可以在这样的 核酸序列共表达后形成，其中所述的核酸序列编码具有在SEQ ID NO：40(或如在SEQ ID NO：406中描述的其加表位标签形式)和SEQ ID NO：46(或如在SEQ ID NO：407中描述的其加表位标签形式)中所述氨基酸 序列的多肽或等位变体。此外，根据需要，在SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：46中所述的嵌合多肽的序列之一或两者可以含有添加的表位标签(如 组氨酸标签的c-myc)，其随后可以并入所得的HER1/HER3ECD多聚体。 例如，可以产生这样的多聚体，其中的一种或两种嵌合多肽具有SEQ ID NO：406和/或SEQ ID NO：407中所述的氨基酸序列。
[0367]此外，可与全长HER1ECD结合以形成ECD多聚体的第二多肽 可以是任意长度的CSR ECD多肽，只要这种第二ECD多肽保留与配体结 合和/或二聚化的能力即可。可在多聚体中与全长HER1ECD多肽组合的 示例性ECD多肽包括但不限于VEGFR1或2、FGFR1-4、IGF1-R、Tie-1、 Tie-2、MET、PDGFRA或B、PDGFRB、Epha1-8、TNFR、RAGE或者 参与疾病过程的任何其它CSR的全部或部分，其中所述疾病过程以增殖、 血管生成或炎性组分为特征。在表7中描述示例性CSR的全长ECD多肽 的示例性序列。如本文中对例举的一些RTKs所述，其足以结合配体的部 分是本领域已知的。若未知，则对于配体结合所需要的亚结构域可以基于 比对相关受体和/或通过使用重组DNA技术连同配体结合测定法而经验地 确定。为用在具有全长HER1ECD多肽的多聚体中所构思的其它CSR及 其ECD部分可以基于待治疗疾病和/或基于CSR对药物的耐药性贡献而经 验地确定，其中所述的药物靶向单一细胞表面受体。此外，任意CSR的 可变剪接同工型可以用在具有全长HER1ECD多肽的多聚体中。这些可变 剪接同工型的示例是如实施例11中所述并描述为SEQ ID NO：298-300 的IGF-1R同工型。可以用在ECD多聚体中的其它CSR同工型在SEQ ID NO：301-384任意项中描述。b.两个或多个截短的ECD组分
[0368]本文中也提供在任意CSR ECD的两个或多个截短的ECD部分 之间形成的ECD多聚体分子，其中所述CSR的至少之一是缩短的HER 分子。一般，截短ECD部分的至少之一(一般两个截短的ECD部分)足以 结合配体和/或与CSR二聚化，除非所述截短ECD多肽衍生自HER2，在 这种情况下该多肽部分必须至少能够与另一细胞表面受体二聚化。这种分 子可以通过调节，通常是抑制一种或多种HER受体和/或另一CSR而作为 泛受体治疗剂起作用。调节作用可以通过隔绝配体和/或通过与所述CSR 二聚化而进行。在一些实例中，第一和第二多肽组分中的每一种可以直接 连接或经多聚化结构域间接连接。第一和第二多肽的多聚化结构域可以是 相同或不同的，不过在多聚化结构域不同的情况下，所述的多聚化结构域 是互补性的，以允许多聚体组分之间稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。所述 的ECD多聚体可以在两个缩短的HER多肽之间形成，其中所述的缩短 HER多肽一般是不同HER受体中保留其配体结合和/或二聚化能力的截短 ECD多肽。本领域技术人员可以确定待用于产生所述ECD多聚体的HER 分子的部分，从而至少一个(一般两个缩短的HER多肽)保留它们结合配体 和/或二聚化的能力。例如，通常地，截短的HER1、2或3分子含有亚结 构域I和III中结合配体的足够部分、亚结构域II中用于二聚化的足够部 分和亚结构域IV的至少模块I。截短的HER2分子通常含有亚结构域I、 II和III的至少足够部分和亚结构域IV的至少模块2-5以二聚化。
[0369]构思了用在杂合ECD多聚体中的截短HER ECD的任意组合。 例如，截短HER1ECD多肽可以与截短的HER2、HER3或HER4多肽组 合；截短的HER2ECD多肽可以与截短的HER3或HER4ECD多肽组合； 和截短的HER3多肽可以与截短的HER4ECD组合。截短的HER多肽的 示例包括本文中所述的任意的截短HER多肽，例如在SEQ ID NO：10、 14、16、20、24、28、30、34中描述了任意的截短HER多肽；HER受体 的可变剪接变体，例如在SEQ ID NO：22、127、129、131、133、135、 136、137、138、139、141、143、144、146、148、149、150、151、153、 155、157或159中描述的任意可变剪接变体；或其任意等位变体或物种变 体。在一个实例中，赫斯达汀分子或其变体(如在SEQ ID NO：135或385-399 任意项中描述)可以与任何其它的截短ECD HER多肽组合。在一个实例 中，ECD多聚体可以包括HER1ECD的部分作为第一多肽和HER3ECD 多肽的部分作为第二多肽，其中每种多肽与多聚化结构域连接。截短的 HER1分子的示例是HF110(SEQ ID NO：10)或其等位变体。截短的HER3 分子的示例是HF310(SEQ ID NO：20)、p85-HER3(SEQ ID NO：22)，或 ErbB3-519(SEQ ID NO：24)或其等位变体。例如，可以共表达在SEQ ID NO：38中描述的示例性嵌合多肽(HER1-501/Fc；HFD110，带或不带c-myc 标签)和在SEQ ID NO：44中描述的嵌合多肽(HER3-500/Fc；HFD310)以产 生作为截短的HER1/HER3ECD异多聚体的多聚体分子。
[0370]在其它实例中，本文提供的ECD多聚体可以含有截短的HER ECD多肽作为第一多肽和不是受体HER家族的另一种截短CSR ECD多 肽作为第二多肽。如同上文，截短的HER ECD多肽可以是HER1、HER2、 HER3、或HER4受体的ECD的部分，只要多聚体的至少一个多肽组分(一 般两个多肽组分)与配体结合和/或与跨膜受体二聚化。示例性截短的HER 家族受体包括但不限于在SEQ ID NO：10、14、16、20、22、24、26、28、 30、34、127、129、131、133、135、136、137、138、139、141、143、144、 146、148、149、150、151、153、155、157、159、或385-399任意项中所 述的任意的截短HER家族受体或其任意等位变体或物种变体。嵌合ECD 多肽可以包括与多聚化结构域连接的另一细胞表面受体的ECD多肽的全 部或部分。任意的截短ECD CSR组合在本文中得到构思以形成具有缩短 HER ECD多肽的ECD多聚体，并且可以基于以下方面经验地确定：待治 疗的疾病、分别的CSR对该疾病的贡献、针对该CSR的已知配体、CSR 对药物的耐药性的贡献和其它因素，其中所述的药物靶向单一细胞表面受 体。CSR的示例在上文描述并且包括但不限于IGF-R1、VEGFR(即 VEGFR1或VEGFR2)、FGFR(即FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4)、 TNFR、PDGFRA或PDGFRB、MET、Tie(Tie-1或Tie-2)、Eph受体或 RAGE。示例性CSR的全长ECD多肽的示例性序列在表7中描述。如本 文中对例举的一些RTKs所述，其足以结合配体的部分是本领域已知的。 若未知，则对于配体结合所需要的亚结构域可以基于比对相关受体和/或通 过使用重组DNA技术连同配体结合测定法而经验地确定。此外，任意CSR 的可变剪接同工型可以用在多聚体中。这些可变剪接同工型的示例是如实 施例11中描述和作为SEQ ID NO：298-300描述的IGF-1R的同工型。可 以用在ECD多聚体中的其它CSR同工型在SEQ ID NO：301-384任意项 中描述。c.杂合ECD多聚体
[0371]本文中提供这样的ECD多聚体，其中所述多聚体的嵌合ECD 多肽之一或两者是这样的杂合ECD分子，其含有与多聚化结构域连接的 来自任意两个或多个CSR的ECD部分的配体结合结构域和/或二聚化结构 域。此类杂合ECD分子如本文以上所述。例如，一种这样的杂合ECD多 肽含有来自HER2的亚结构域II和来自相同或不同的受体的、来自HER1、 3或4的亚结构域I和III。杂合ECD的其它组合可以基于相关CSR的已 知亚结构域的活性而经验地确定。一般，所述ECD杂合体中一种杂合体 的至少一个亚结构域赋予所得ECD多聚体的二聚化能力。两个或多个相 同或不同的杂合ECD分子可以直接或间接地连接在一起。在一个实例中， 杂合ECD分子可以通过第一杂合ECD多肽与多聚化结构域的融合和第二 杂合ECD多肽与同一种或互补性多聚化结构域的融合而连接。杂合ECD 多聚体的形成在共表达第一和第二多肽的各自编码性核酸后实现。
[0372]此外，可以形成这样的ECD多聚体，其中所述多聚体的多肽中 仅一多肽是杂合ECD并且第二多肽是任何其它CSR分子的全部或部分， 例如上文所述的任意的全长ECD多肽或上文所述的任意的截短ECD多 肽。一般，另一CSR ECD多肽是HER家族受体的全部或部分、HER家 族受体的可变剪接同工型或其等位变体。除HER家族受体之外的其它CSR 可以与杂合ECD组合并且可以基于待治疗的疾病和/或所述CSR与药物的 耐药性的关联性进行适当选择，其中所述的药物靶向单一细胞表面受体。d.相同的或从相同CSR衍生的ECD组分
[0373]本文中也提供通过隔绝配体和/或通过与关联CSR或其它相互 作用性CSR的直接相互作用而对至少一种、有时两种或多种CSR调节的 同多聚体或异多聚体。此类ECD多聚体可以是与多聚化结构域连接的第 一ECD多肽以及与多聚化结构域连接的第二ECD多肽的同多聚体、一般 是同二聚体，其中所述的第一和第二多肽是相同的。或者，此类ECD多 聚体可以是这样的异多聚体，其中第一和第二ECD多肽各自从相同的关 联CSR衍生，不过它们是不同的。一般，但并非总如此，在所述ECD组 分是相同或从相同受体衍生的情况下，仅单种受体的活性被靶向。例如， 在一些情况下，一种ECD多聚体是用于调节至少全长IGF1-R的活性的候 选治疗剂，其中所述的ECD多聚体以全长IGF1-R ECD(即对应于SEQ ID NO：260的第31-935位氨基酸)作为第一多肽并且以与第一多肽相同的多肽 或其截短多肽或同工型作为第二多肽。在另一个实例中，含有赫斯达汀和/ 或另一种HER2ECD组分的同多聚体或异多聚体是例如通过直接与细胞 表面上的全长HER1，HER3或HER4受体相互作用而用于调节至少一种 (不过一般两种或多种)CSR的候选物。F.产生编码嵌合ECD多肽融合物的核酸的方法和产生所得的ECD多 聚体
[0374]可以使用在ECD、其部分、尤其足够用于配体结合和/或受体二 聚化的部分以及可变剪接部分之间产生嵌合多肽的任何适用方法。类似地， 可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现从嵌合多肽形成多聚体。如 所述，所述多聚体一般包括来自至少一种HER家族成员(一般是HER1或 HER3或HER4)和第二HER家族成员的ECD和/或来自CSR(如IGF1-R、 VEGFR和FGFR)或来自涉及肿瘤发生或炎性或其它疾病过程的其它受体 的ECD。
[0375]提供用于产生编码ECD嵌合多肽的核酸分子的示例性方法，其 中所述的ECD嵌合多肽包括直接或间接地与本文所述多聚化结构域连接 的ECD多肽。此类方法包括用于核酸分子的体外合成方法，如PCR、合 成基因构建法以及体外连接分离的和/或合成的核酸片段法。可以通过克隆 方法分离CSR(包括HER家族受体或其它RTKs)的核酸分子，其中所述的 克隆方法包括PCR扩增从细胞分离的RNA和DNA以及通过杂交筛选核 酸分子文库和/或表达筛选法。
[0376]ECD多肽或其部分可以使用体外和体内合成方法从编码ECD 多肽的核酸分子产生。ECD多聚体(其含有一个或多个嵌合ECD多肽(例 如ECD-Fc蛋白质融合物)或ECD与任何其它多聚化结构域的连接)可以在 适合产生所需量和所需形式的ECD多肽多聚体的任何生物内表达后产生， 其中所述的ECD多肽多聚体是施用和治疗所需要的。表达宿主包括原核 及真核生物，如大肠杆菌(E.coli)、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞(包 括人细胞系)和转基因动物。ECD多肽或ECD多肽多聚体也可以从表达所 述ECD多肽或ECD多肽多聚体的细胞和生物中分离，所述的细胞和生物 包括其中重组地产生ECD多肽的细胞和生物和其中不用重组手段而合成 同工型(如通过可变剪接事件产生基因组编码的同工型)的那些细胞和生 物。1.合成基因和合成多肽
[0377]编码ECD多肽的核酸分子可以通过本领域技术人员已知的方 法，使用合成基因合成法合成。在此类方法中，将ECD的多肽序列进行″ 回复翻译(back-translated)″以产生编码ECD或其部分的一种或多种核 酸分子。将所述回复翻译的核酸分子随后如通过使用自动DNA合成技术 合成为一个或多个DNA片段。随后有效地连接所述片段以形成编码ECD 多肽的核酸分子。嵌合ECD多肽可以通过将编码ECD多肽的核酸分子与 额外核酸分子(如编码多聚化结构域的任何核酸分子或编码表位或融合标 签的其它核酸、用于调节转录和翻译的调节序列、载体和其它多肽编码性 核酸分子)连接而产生。ECD编码性核酸分子也可以有效地与其它融合标 签或标记物如用于示踪用途，包括放射标记物和荧光部分连接。
[0378]回复翻译过程使用遗传密码子以获得针对任何目的多肽(如 ECD多肽)的核苷酸基因序列。遗传密码子具有简并性，64种密码子指定 20种氨基酸和3种终止密码子。这种简并性提供核酸设计和产生中的灵活 性，例如允许并入限制性位点以便于连接核酸片段和/或在每种合成片段内 安置独特的身份标志序列。遗传密码子的简并性也允许设计核酸分子以避 免不想要的核苷酸序列，包括不想要的限制性位点、剪接供体或受体部位 或可能有损于高效翻译的其它核苷酸序列。此外，生物有时偏嗜特定密码 子使用和/或定义的GC与AT核苷酸比例。因此，遗传密码子的简并性允 许设计为在特定生物或生物类别中表达所定制的核酸分子。此外，可以基 于序列而优化(或非优化)设计用于不同表达水平的核酸分子。回复翻译通 过选择编码多肽的密码子而进行。此类过程可以使用遗传密码子表和多肽 序列以人工方式进行。或者，可以使用计算机程序(包括可公开获得的软件) 来产生回复翻译的核酸序列。
[0379]为合成回复翻译的核酸分子，可以使用本领域用于核酸合成的 任何可用方法。例如，通过标准自动化方法合成与编码ECD的核苷酸序 列的片段相对应的各种寡核苷酸并且在复性或杂交反应中混合在一起。此 类寡核苷酸如此合成，从而复性过程导致基因利用互补序列配对时所形成 的重叠性单链突出端(通常约100核苷酸长度)由所述寡核苷酸自行装配。 利用连接作用(例如噬菌体T4DNA连接酶)封闭双链体DNA中的单个核苷 酸″切口″。限制性核酸内切酶接头序列可以随后例如用来将合成基因插入 适用于蛋白质表达的多种重组DNA载体的任一载体内。在另一种相似的 方法中，通过寡核苷酸化学合成法制备一系列重叠性寡核苷酸。这些寡核 苷酸的复性产生带缺口的DNA结构。可以使用酶(如DNA聚合酶I)催化 的DNA合成来填平这些缺口，并且使用连接作用来封闭双链体结构中的 任何切口。可以使用PCR和/或其它DNA扩增技术来扩增所形成的线形 DNA双链体。
[0380]额外的核苷酸序列可以与编码ECD的核酸分子连接，因而产生 ECD融合物，包括含有旨在克隆合成基因至载体内的限制性核酸内切酶位 点的接头序列，其中所述的载体例如是蛋白质表达载体或设计用于扩增编 码核心蛋白质的DNA序列的载体。此外，描绘了功能性DNA元件的额外 核苷酸序列可以有效地与编码ECD的核酸分子连接。此类序列的实例包 括但不限于设计旨在促进胞内蛋白质表达的启动子序列或设计旨在促进蛋 白质分泌的前体序列。可以与编码ECD的核酸分子有效连接的核苷酸序 列的其它实例包括便于多肽纯化和/或检测的序列。例如，融合标签如表位 标签或荧光部分可以与同工型融合或连接。额外的核苷酸序列如描述蛋白 质结合区域的序列也可以与编码ECD的核酸分子连接。此类区域包括但 不限于促进摄取ECD多肽至特定靶细胞或增强合成基因的药代动力学的 序列。
[0381]ECD多肽也可以使用自动化合成多肽合成法合成。克隆性和/ 或硅片上(in silico)生成的多肽序列可以逐段合成并随后化学地连接起来。 或者，嵌合分子可以作为单一多肽合成。此类多肽随后可以在本文中所述 的测定法和治疗施用中使用。2.克隆和分离ECD多肽的方法
[0382[可以使用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方 法克隆或分离编码ECD的核酸分子，包括编码ECD融合物的核酸分子。 此类方法包括核酸的PCR扩增法和文库筛选法，包括核酸杂交筛选法、基 于抗体的筛选法和基于活性的筛选法。
[0382[可以使用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方 法克隆或分离编码ECD的核酸分子，包括编码ECD融合物的核酸分子。 此类方法包括核酸的PCR扩增法和文库筛选法，包括核酸杂交筛选法、基 于抗体的筛选法和基于活性的筛选法。
[0383]也可以使用文库筛选法分离编码ECD多肽的核酸分子。例如， 可以通过与编码ECD多肽或其部分的核酸分子杂交筛选作为cDNA的代 表已表达RNA转录物的核酸文库。例如，编码ECD多肽的部分(例如HER 家族ECD的结构域IV的模块1的部分)的核酸序列可以用来基于与同源 序列的杂交而筛选含有结构域IV的分子。
[0384]表达文库筛选法可以用来分离编码ECD多肽的核酸分子。例如， 表达文库可以用识别特定ECD或ECD的部分的抗体筛选。可以获得和/ 或制备这样的抗体，其特异性地结合ECD多肽或在ECD内所含的区域或 肽。特异性地结合ECD多肽的抗体可以用来筛选含有编码ECD(如HER 家族受体的ECD)的核酸分子的表达文库。制备和分离抗体(包括多克隆与 单克隆抗体及其片段)的方法是本领域熟知的。制备和分离重组抗体和合成 抗体的方法也是本领域熟知的。例如，此类抗体可以使用固相肽合成法构 建或可以使用在特异性结合候选多肽的抗体中的抗原结合位点的核苷酸序 列及氨基酸序列信息而重组产生。抗体也可以通过筛选含有可变重链和可 变轻链的或含有其抗原结合部分的组合文库而获得。制备、分离和使用多 克隆、单克隆及非天然抗体的方法例如在Kontermann和Dubel编著 (2001)″Antibody Engineering″Springer Verlag；Howard和Bethell编著 (2001)″Basic Methods in Antibody Production and Characterization″ CRC Press；和O′Brien与Aitkin编著(2001)″Antibody Phage Display″ Humana Press中综述。此类抗体也可以用来筛选ECD多肽的存在，例如 旨在检测在细胞、组织或提取物中ECD多肽的表达。
[0385]用于扩增核酸的方法可以用来分离编码ECD多肽的核酸分子， 例如包括聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可以用作从中可以分 离到编码ECD的核酸分子的原材料。例如，可以在扩增方法中使用DNA 和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、体液样本(例如血液、血清、 唾液)、来自健康或患病受试者的样本。核酸文库也可以用作原材料的来源。 可以设计旨在扩增ECD分子的引物。例如，可以基于从其中产生ECD分 子的已表达序列设计引物。可以基于ECD氨基酸序列的回复翻译而设计 引物。对由扩增产生的核酸分子可以进行测序并证实编码ECD。3.产生和克隆ECD多肽嵌合体的方法
[0386]嵌合蛋白是包含从不同或异源蛋白质或肽衍生的两种或多种区 域的多肽。嵌合蛋白可以含有几种序列，包括信号肽序列、一种或多种针 对CSR(如HER家族受体)的ECD或其部分的序列和任何其它异源序列(如 接头序列、多聚化结构域序列(即Fc结构域、亮氨酸拉链或形成多聚体的 其它序列))和/或用以促进蛋白质纯化的表位标签或其它部分的序列。例如， ECD多肽可以直接连接至另一多肽(即另一ECD多肽或其部分和/或多聚 化结构域)以形成融合蛋白。或者，所述蛋白质可以隔开一段足以确保蛋白 质形成正确二级结构和三级结构的距离。合适的接头序列(1)将采取柔性伸 展构象，(2)将不显示形成可能与融合多肽的功能性结构域相互作用的有序 二极结构的倾向，并且(3)将具有可以促进与功能性蛋白质结构域相互作用 的最小疏水特征或电荷特征。在上文讨论了示例性接头序列并且其通常包 括含有Gly、Asn或Ser或其它中性氨基酸(包括Thr或Ala)的那些接头序 列。通常，通过如上所述的重组DNA技术连接ECD部分与异源序列。或 者，异源序列可以通过异双官能性交联剂(如本文中所述任意异双官能性交 联剂)共价地与ECD部分连接。
[0387]通常地，ECD融合分子编码这样的嵌合多肽，其具有CSR中足 以结合配体的ECD的全部或部分，所述ECD的全部或部分与便于多聚体 形成的异源多肽(如多聚化结构域)连接。
[0388]此外，ECD多肽也可以直接或间接与一种或多种其它异源序列 连接。例如，ECD嵌合多肽也可以包括与一个标签多肽融合，其中所述的 标签多肽提供抗标签抗体可与之选择性结合的表位。ECD多肽融合物的此 类加表位标签形式是有用的，因为可以使用针对该标签多肽的标记抗体检 测这种形式的存在。这种表位标签的提供允许通过使用抗标签抗体的亲和 纯化法轻易地纯化该ECD融合多肽。
[0389]嵌合蛋白可以使用酶切和从想要的序列连接片段的常规技术制 备。例如，想要的序列可以使用寡核苷酸合成仪合成或通过适度的限制性 酶消化而从产生所述蛋白质的亲代细胞的DNA中分离或通过用适宜引物 对基因组DNA进行PCR而从靶来源如细胞、组织、载体或其它靶来源获 得。在一个实例中，可以通过如连续轮次地连接由PCR扩增的DNA靶序 列至载体的工程化重组位点处而产生ECD嵌合序列。例如，针对一种或 多种ECD多肽、融合标签和/或多聚化结构域序列的核酸序列可以使用引 物进行PCR扩增，其中所述的引物与对应链杂交并且分布在靶DNA中的 目的区域侧翼。可以使用已知表达靶DNA分子的细胞或组织或其他来源， 或者含有靶DNA分子的序列的载体作为PCR扩增事件的起始产物。PCR 扩增产物可以亚克隆至载体用于进一步序列的重组操作，例如旨在产生与 载体内已经含有的另一核酸序列融合，或用于表达靶分子。
[0390]也可以设计PCR扩增中所用的PCR引物旨在促进核酸序列的 有效连接。例如，可以向引物添加非模板互补的5′延伸物以允许对PCR产 物的多种扩增后操作，而不显著影响扩增本身。例如，这些5′延伸物可以 包括限制性位点、启动子序列、限制性酶接头序列、蛋白酶切割位点序列 或表位标签序列。在一个实例中，出于产生融合序列的目的，可并入引物 的序列包括，例如，编码myc表位标签的序列或其它的小表位标签，从而 扩增的PCR产物有效地含有目的核酸序列与表位标签的融合物。
[0391]在另一个实例中，限制性酶位点并入引物可以促进扩增产物亚 克隆至含有相容的限制性位点的载体，如通过提供用于连接核酸序列的粘 末端。多重PCR扩增的产物亚克隆至单个载体可以作为有效连接或融合不 同核酸序列的策略使用。可以被并入引物序列的限制性酶位点的实例可以 包括但不限于Xho I限制性位点(CTCGAG，SEQ ID NO：267)、NheI限制 性位点(GCTAGC，SEQ ID NO：268)、Not I限制性位点(GCGGCCGC， SEQ ID NO：269)、EcoRI限制性位点(GAATTC，SEQ ID NO：270)、AgeI 位点(ACCGGT，SEQ ID NO：271)或Xba I限制性位点(TCTAGA，SEQ ID NO：272)。用于PCR产物亚克隆至载体的其它方法包括平末端克隆法、TA 克隆法、不依赖连接的克隆法和体内克隆法。
[0392]在引物中产生有效限制性酶位点需要用相容的限制性酶消化 PCR片段以暴露粘末端或对于一些限制性酶位点则暴露平末端，用于随后 亚克隆。向引物中设计限制性酶位点时存在几种因素待考虑，从而该限制 性酶位点保留对限制性酶的相容性。首先，在PCR引物内的所设计限制性 位点上游添加2-6个额外碱基可以极大地增加消化扩增产物的效率。可以 用来改善限制性酶对限制性酶位点消化的其它方法包括除去可阻断DNA 的任何热稳定性聚合酶的蛋白酶K处理法、用克列诺或T4DNA聚合酶的 末端平滑化法和/或添加亚精胺。用于改善PCR产物的消化效率的备选方 法也可以包括在扩增后使片段连环化。这通过首先用T4多核苷酸激酶处 理纯化的PCR产物(若所述引物还未磷酸化)而实现。若使用具校正作用的 热稳定聚合酶如Pfu，则末端可以已经平端化，或若使用无校正作用的酶 如Taq，则扩增的PCR产物可以用T4DNA聚合酶处理以使所述末端平 滑化。PCR产物可以用T4DNA连接酶连接。这从所述片段的末端有效地 移去限制性酶位点并且允许高效消化。
[0393]在将含有已暴露的限制性酶位点的PCR产物亚克隆至载体，例 如旨在创造与目的序列的融合之前，有时候需要将消化的PCR产物与仍未 切割的那些PCR产物分开。在此类实例中，可以在进行PCR前在引物5′ 末端添加荧光标签。这允许鉴定消化的产物，因为那些已经被成功消化的 产物将在消化后将丢失荧光标记物。
[0394]在一些情况下，使用扩增的PCR产物可以导致在融合蛋白产物 中并入限制性酶接头序列，其中所述扩增的PCR产物含有用于随后亚克隆 至载体以产生融合序列的限制性位点。通常，此类接头序列是短小的并且 不破坏多肽的功能，只要该序列是有效连接的。
[0395]可以以包含编码ECD嵌合多肽的核酸分子的载体形式提供该核 酸分子。此种载体的一个实例是质粒。多种表达载体是可获得及本领域技 术人员已知的，并可以用于表达ECD多肽(包括嵌合ECD多肽)。表达载 体的选择可以受宿主表达系统选择的影响。一般而言，表达载体可以包括 转录启动子并任选地包括增强子、翻译信号和转录终止及翻译终止信号。 用于稳定转化的表达载体一般具有允许选择并维持转化细胞的选择标记。 在一些情况下，复制起点可以用来放大载体的拷贝数目。此外，众多表达 载体提供毗邻多克隆位点的羧基端或氨基端表位标签，从而自该载体表达 的任何所得蛋白质将具有以符合可读框方式插入多肽序列的表位标签。具 有插入的表位标签的示例性表达载体是pcDNA/myc-His哺乳动物表达载 体(Invitrogen，SEQ ID NO：161)。因此，例如从这种载体表达的ECD多 肽导致含有羧基端myc-组氨酸标签的多肽的表达，其中所述的myc-组氨 酸标签具有在SEQ ID NO：162中所述的氨基酸序列。因此，可以表达带 myc-组氨酸标签的任何ECD多肽或其部分。含有标签的此类示例性多肽 在实施例中描述并且用“T”指示，例如，HER1-621(T)分子是含有全长 HER1ECD后接羧基端myc-组氨酸标签的多肽。本文中提供的含有表位 标签序列的ECD多肽的示例性序列在SEQ ID NO：274和275中描述。可 以通过本领域技术人员已知的任何方法产生含有表位标签(如，但不限于 c-myc标签、组氨酸标签或SEQ ID NO：162中所述c-myc/组氨酸标签组合) 的任何ECD多肽或其截短部分。4.表达系统
[0396]将编码嵌合多肽(如本文中提供的任意嵌合多肽)的DNA转染至 宿主细胞用于表达。在需要ECD多聚体多肽的其中由多聚化结构域介导 多聚化的一些情况下，用编码分别的嵌合ECD分子的DNA转化宿主细胞， 其中所述分别的嵌合ECD分子将产生多聚体，同时最佳地选择所述宿主 细胞旨在能够以所需方式装配出此多聚体的分别的链。分别的单体多肽的 装配通过每种相应多聚化结构域的相互作用得以促进，其中在嵌合ECD 多肽之间所述的相应多聚化结构域是相同的或互补的。在HER家族受体 ECD或其部分作为该多聚体多肽的一种或两种ECD部分的情况下，如此 选择多聚化结构域，从而单体的装配使HER分子的二聚化臂偏离配偶体 多聚体分子取向。这种取向称作″背靠背″并且确保该二聚化臂可接近用于 与细胞表面上的关联HER二聚化。
[0397]ECD多肽，包括嵌合ECD多肽，可以在适合产生所需量或所 需形式的多肽的任何生物中表达，其中所述的多肽是施用和治疗所需要的。 通常地，可以进行工程化以表达异源DNA并具有分泌途径的任何细胞类 型是合适的。表达宿主包括原核及真核生物，如大肠杆菌、酵母、植物、 昆虫细胞、哺乳动物细胞(包括人细胞系)和转基因动物。表达宿主可以在 其蛋白质产生水平以及对所表达蛋白质发生的翻译后修饰类型方面不同。 对表达宿主的选择可以基于这些因素和其它因素如管理和安全性的考虑、 生产成本和是否需要纯化和纯化方法而进行。a.原核表达
[0398]原核生物尤其大肠杆菌提供了用于产生大量蛋白质(如本文中提 供的ECD多肽和ECD多肽融合物)的系统。也可以使用其它微生物菌株， 如芽孢杆菌属(bacilli)例如枯草杆芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、假单胞菌属 (Pseudomonas)的多个物种或其它细菌菌株。细菌(包括大肠杆菌)的转化是 本领域技术人员熟知的简单而快速的技术。在此类原核系统中，常使用含 有从与宿主相容的物种衍生的复制位点和控制序列的质粒载体。例如，对 于大肠杆菌的常用载体包括PBR322、pUC18、pBAD及其衍生物。常用 的原核控制序列(其含有用于转录起始的启动子，任选地具有操纵子及核糖 体结合位点序列)包括常用启动子，如β-内酰胺酶(青霉素酶)与乳糖(lac)启 动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、阿拉伯糖启动子和λ衍生的P1启动 子和N-基因核糖体结合位点。然而，可以使用与原核生物相容的任何可用 启动子系统。用于大肠杆菌的表达载体可以含有诱导型启动子，此类启动 子用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达对宿主细胞显示某些毒性的蛋 白质。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、 T7和SP6RNA启动子和温度调节型λPL启动子。
[0399]ECD多肽可以在大肠杆菌的胞质环境中表达。细胞质是还原性 环境并且对于某些分子，这可能导致不溶性包涵体形成。可以使用还原剂 如二硫苏糖和β-巯基乙醇及变性剂如HCl胍和脲来重新溶解蛋白质。备选 方法是在细菌周质间隙中表达ECD多肽(包括ECD多肽融合物)，其中所 述的周质间隙提供氧化环境和伴侣蛋白样和二硫键异构酶并且可以导致可 溶性蛋白质的产生。在一些实例中，用于细菌中的前体或信号序列(包括 OmpA、OmpF、PelB)或其它前体序列如通过替换内源性前体序列，与待 表达的蛋白质融合，指导该蛋白质至周质。随后由周质内部的信号肽除去 所述前导肽。周质导向性前体序列或前导序列的实例包括来自果胶酸裂合 酶的pelB前导序列和从碱性磷酸酶基因衍生的前导序列。在一些情况下， 周质表达允许表达的蛋白质泄露至培养基中。蛋白质的分泌允许快速而简 单地从培养上清液中纯化。可以通过渗透裂解法从周质中获得不分泌的蛋 白质。类似于胞质表达，在一些情况下，蛋白质可以变得不可溶解并且可 以使用变性剂和还原剂来促进增溶及再折叠。诱导温度和生长温度也可以 影响表达水平和溶解度，一般使用在25℃和37C之间的温度。一般，细 菌产生非糖基化蛋白质。因此，若蛋白质的功能需要糖基化，可以从宿主 细胞中纯化后以体外方式添加糖基化。b.酵母
[0400]酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸 克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是 可以用于产生ECD多肽的熟知酵母表达宿主。酵母可以用游离型复制载 体或通过由同源重组所致的稳定的染色体整合作用进行转化。一般，使用 诱导型启动子来调节基因表达。此类启动子的实例包括GAL1、GAL7和 GAL5和金属硫蛋白启动子如CUP1、AOX1或者其它毕赤酵母或其它酵 母启动子。其它酵母启动子包括用于糖酵解酶的启动子，例如，从Yep13 获得的3-磷酸甘油酸激酶的那些启动子或来自烯醇化酶基因或Leu2基因 的那些启动子。表达载体常包括选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3 以选择并维持转化的DNA。用于酵母中的示例性表达载体系统是允许通过 生长在含有葡萄糖的培养基中而选择转化细胞的POT1载体系统(参见例 如，美国专利号4,931,373)。在酵母中表达的蛋白质往往是可溶性的。与伴 侣蛋白如Bip和蛋白质二硫键异构酶共表达可以改善表达的水平和溶解 度。此外，可以使用分泌信号肽融合物指导在酵母中表达的蛋白质分泌， 所述的分泌信号肽融合物例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号 物以及与酵母细胞表面蛋白(如Aga2p交配黏附受体或Arxula adeninivorans葡萄糖淀粉酶)的融合物或在酵母中促进多肽分泌的任何其 它异源或同源前体序列。可以设计蛋白酶例如Kex-2蛋白酶切割位点以在 所表达多肽经分泌途径离开时从该多肽中除去融合序列。酵母也能够在 Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。c.昆虫细胞
[0401]昆虫细胞，尤其是利用杆状病毒表达的昆虫细胞用于表达多肽， 如ECD多肽，包括ECD多肽融合物。昆虫细胞表达高水平的蛋白质并且 能够实施为高等真核生物所用的大部分翻译后修饰。杆状病毒具有受限的 宿主范围，这改善了安全性并降低管理机关对真核表达的顾虑。常见表达 载体使用用于高水平表达的启动子，如杆状病毒多角体蛋白启动子。通常 使用的杆状病毒系统包括杆状病毒(如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和昆虫细胞系，如从草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)衍生的Sf9、美洲一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表 达，待表达的分子的核苷酸序列紧邻杆状病毒多角体蛋白起始密码子下游 融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中得到精确加工并且可以用来将表达 的蛋白质分泌至培养基中。例如，哺乳动物组织纤溶酶原激活物的前体序 列促进昆虫细胞表达并分泌蛋白质。此外，细胞系美洲一星粘虫(A7S)和黑 脉金斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白 质。
[0402]昆虫细胞中的备选表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如 Schnieder2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞 (白纹伊蚊(Aedes albopictus)可以用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可以在 用镉或铜的重金属诱导存在下诱导高水平表达。一般通过使用选择标记如 新霉素和潮霉素维持表达载体。d.哺乳动物细胞
[0403]哺乳动物的表达系统可以用来表达ECD多肽，包括本文中提供 的ECD多肽融合物。表达构建体可以通过病毒感染如通过使用腺病毒载 体或通过直接DNA转移法如通过常规转染法(包括脂质体、磷酸钙、DEAE- 葡聚糖)和通过物理方法如电穿孔法和微量注射法转移至哺乳动物细胞。示 例性表达载体包括例如pcDNA3.1/myc-His(Invitrogen，SEQ ID NO：161)。 用于哺乳动物细胞的表达载体一般包括mRNA加帽位点、TATA盒、翻译 起始序列(Kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。此类载体常包括用于高水 平表达的转录启动子-增强子(例如SV40启动子-增强子)、人巨细胞病毒 (CMV)启动子(如hCMV-MIE启动子-增强子)和劳斯肉瘤病毒(RSV)长末 端重复序列或其它病毒启动子，如从多瘤病毒、腺病毒II、牛乳头瘤病毒 或禽肉瘤病毒衍生的那些病毒启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括β- 肌动蛋白启动子-增强子和人金属硫蛋白II启动子。这些启动子-增强子在 多种细胞类型中有活性。组织型和细胞型启动子和增强子区也可以用于表 达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自基因如弹性蛋白酶I、胰岛 素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、 β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因的 那些控制元件。选择标记可以用来选择并维持具有表达构建体的细胞。选 择标记基因的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌 呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖甙磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷 激酶。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质以 活性状态表达在细胞表面上。
[0404]众多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、 鸡、和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、 MT2、小鼠NS0(非分泌性)和其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异体杂交瘤细 胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293T、 293S、2B8、和HKB细胞。细胞系也可适应于无血清培养基，后者促进 从细胞培养基中纯化分泌的蛋白。一种如此细胞系的实例是无血清 EBNA-1细胞系(Pham等(2003)Biotechnol Bioeng.84：332-42)。e.植物
[0405]转基因植物细胞和植物可以用来表达ECD多肽。表达构建体一 般使用直接DNA转移法(如微抛射体轰击法与PEG介导转移至原生质体) 和用农杆菌(agrobacterium)介导的转化法转移至植物中。表达载体可以包 括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化 技术通常在双子叶植物宿主如拟南芥(Arabidopsis)和烟草(tobacco)与单子 叶植物宿主如玉米和稻之间区分。用于表达的植物启动子的实例包括花椰 菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子和遍在 蛋白与UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷 酸转移酶常用来促进选择并维持转化的细胞。转化的植物细胞可以维持在 培养中作为细胞、团集体(愈伤组织)或再生成完整植物。转基因植物细胞 也可以包括为产生CSR同工型而设计的藻类(参见例如，Mayfield等 (2003)PNAS 100：438-442)。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模 式，故这可以影响这些宿主中所产生的CSR同工型的选择。5.转染和转化的方法
[0406]宿主细胞的转化或转染使用适于所选宿主细胞的标准技术实 现。转染方法是本领域技术人员已知的，例如磷酸钙法和电穿孔法，以及 使用促进转染的市售阳离子脂质试剂，如LipofectamineTM、 LipofectamineTM2000或(Invitrogen，Carlsbad CA)。根据所 用的宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。例如使用氯化钙 的钙处理法或电穿孔法通常用于含有大量细胞壁屏障的原核生物或其它细 胞。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染法用于转化某些植物细 胞。对于无此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用磷酸钙沉淀法。对植物 细胞(参见例如，Shaw等(1983)Gene，23：315，WO89/05859)、哺乳动物细 胞(参见例如，美国专利号4,399,216，Keown等Methods in Enzymolog.，(1990)185：527；Mansour等(1988)Nature 336：348)或酵母细胞 (参见例如Val Solingen等(1977)J Bact(1977)130：946，Hsiao等(1979)Proc. Natl.Acad.Sci，76：3829)描述了转化的概述方面。用于导入DNA至宿主 细胞的其它方法包括但不限于核显微注射法、电穿孔法、细菌原生质体与 完整细胞融合法或使用聚阳离子，如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲 溴化物或聚鸟氨酸。6.ECD多肽、嵌合多肽和所得ECD多聚体的回收和纯化
[0407]可以使用本领域熟知的多种技术分离ECD多肽和嵌合ECD多 肽，包括ECD多肽多聚体。本领域技术人员可以轻易地按照已知用于分 离多肽和蛋白质的方法以便获得本文所提供的分离多肽或蛋白质之一。这 些方法包括但不限于免疫层析法、HPLC、大小排阻层析法和离子交换层 析法。离子交换层析法的实例包括阴离子和阳离子交换法并包括使用 DEAE琼脂糖凝胶、DEAE交联葡聚糖凝胶、CM琼脂糖凝胶、SP琼脂糖 凝胶或本领域技术人员已知的任何其它类似的柱子。可以使用针对嵌合 ECD多肽中表位标签的抗体或针对该ECD多肽的抗体促进从细胞培养基 或从裂解的细胞中分离ECD多肽或ECD多聚体多肽并且将它们随后通过 免疫沉淀法分离以及通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离。或者， ECD多肽或嵌合ECD多肽(包括ECD多聚体)可以通过多肽特异性抗体与 ECD多肽结合和/或随后该抗体与A蛋白或G蛋白琼脂糖凝胶柱结合并从 该柱中洗脱此蛋白质而予以分离。ECD多肽的纯化也可以包括用与蛋白质 结合的试剂固定的亲和柱或亲和珠并且随后进行一个或多个柱步骤以从该 结合剂上洗脱所述蛋白质。亲和试剂的实例包括伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、 肝素-Toyopearl或Cibacrom blue 3Ga琼脂糖凝胶。也可以通过使用此类 树脂如苯基醚、丁基醚或丙基醚的疏水相互作用层析法纯化蛋白质。
[0408]在一些实例中，可以使用免疫亲和层析法纯化嵌合ECD多肽。 在此类实例中，ECD多肽可以表达为融合蛋白，其带有如本文中所述的表 位标签，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 或硫氧还蛋白(TRX)、myc标签和/或组氨酸标签。用于表达并纯化此类融 合蛋白的试剂盒可商业地从New England BioLab(Beverly，Mass.)， Pharmacia(Piscataway，NJ.)，Invitrogen和其它公司获得。蛋白质也可以与 标签融合并随后通过使用针对这种表位的特异性抗体进行纯化。在一些实 例中，可以使用以结合表位标签的试剂所固定的亲和柱或亲和珠来纯化 ECD多肽融合物。例如，结合试剂可以包括与GST表位标签相互作用的 谷胱甘肽、与聚组氨酸标签相互作用的固定化金属亲和试剂(如Cu2+或 Ni2+)、抗表位抗体(如抗myc抗体)和/或可固定至柱或珠上的用于纯化嵌合 ECD蛋白的任何其它试剂。
[0409]在需要纯化的同多聚体或异多聚体分子含有Fc结构域或其混合 物的情况下，可以使用本领域技术人员已知及如实施例中详述的方法回收 或纯化所述分子。在宿主细胞共表达编码含有Fc结构域的第一多肽的核酸 和编码也含有Fc结构域的第二多肽的核酸时，所得的表达分子将作为第一 多肽的同二聚体、第二多肽的同二聚体以及第一与第二多肽的异二聚体形 成，其中每种二聚体通过Fc多聚化结构域相互作用而连接。同二聚体和异 二聚体的组合可以从培养基中作为分泌的多肽回收，虽然它在不带信号序 列而直接产生时也可以从宿主细胞裂解物中加以回收。若所述同多聚体或 异多聚体是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100) 从膜上释放所述同多聚体或异多聚体。
[0410]可以方便地通过多种方法从条件培养基中纯化具有抗体恒定结 构域或其混合物的同二聚体或异二聚体，从而与其它颗粒状细胞残片或杂 质蛋白质分开，所述的方法包括但不限于羟基磷灰石层析法、凝胶电泳法、 透析法或亲和层析法。在多聚体具有CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ.)用于纯化。根据待回收的多肽， 也可用的是用于蛋白质纯化的其它技术，如在离子交换柱上分级、乙醇沉 淀、反相HPLC、在二氧化硅上层析、在肝素琼脂糖凝胶上层析、在阴离 子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上层析、聚焦层析、SDS-PAGE和 硫酸铵沉淀法。
[0411]除此之外，还可以使用A蛋白或G蛋白。A蛋白作为亲和配体 的适用性取决于物种和在嵌合体中所用免疫球蛋白Fc结构域的同种型。A 蛋白可以用来纯化基于基于人γ1、γ2或γ4重链的免疫黏附素(Lindmark 等(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13)。推荐G蛋白用于全部小鼠同种型和 用于人γ3(Guss等(1986)EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体如A蛋白或G 蛋白或能够与多聚体分子相互作用的其它亲和配体的基质常是琼脂糖，不 过其它基质是可用的。机械稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙 烯)苯提供比用琼脂糖可实现的更快流速和更短加工时间。免疫粘附分子与 A蛋白亲和柱或G蛋白亲和柱结合的条件完全由Fc结构域的特征即物种 和同种型决定。通常，当选择正确的配体时，从无条件限制的培养液 (unconditioned culture fluid)直接产生高效结合作用。含有ECD-Fc的已结 合分子可以在酸性pH(在3.0或高于3.0)或在含有温和离液盐的中性pH缓 冲液中洗脱。另外或此外，已结合分子可以用过量IgG洗脱。根据需要， 可以将洗脱的分子中和至碱性pH。所得的纯化分子含有纯化的(一般大于 95％)同多聚体和异多聚体。
[0412]几种因素可以用来富集异多聚体分子脱离同二聚体，这包括但 不限于使用仅识别多聚体分子的一种嵌合多肽组分的抗表位标签抗体或受 体特异性抗体。例如，嵌合多肽之一可以与表位标签(即c-myc或His)融 合。因此，例如根据据所用多聚化结构域，使用A蛋白亲和柱或其它初步 纯化法纯化后，纯化的分子可以使用第二亲和柱或其它基质进一步富集。 例如，任何结合剂可以固定至亲和柱或亲和珠以进一步纯化ECD多聚体。 这种示例是金属亲和剂如用于镍亲和性金属层析柱的Ni2+的固定化。在第 一嵌合多肽仅由第二亲和柱识别的情况下，可以洗去含有第二嵌合多肽的 同二聚体，仅留下第一多肽的同二聚体以及第一和第二多肽的异二聚体。 进一步的连续亲和步骤可以用来纯化异多聚体。此类进一步亲和步骤包括 在亲和柱或其它基质上固定仅识别异多聚体中存在的第二嵌合多肽但不识 别剩余的同多聚体的抗受体抗体或配体。例如，实施例3描述使用EGF 亲和柱作为最终纯化步骤，随后使用制备型SEC柱以除去任何过量配体而 纯化HER1/HER3ECD多聚体。作为最终富集方法，可以根据ECD多聚 体的组分，使用例如识别ECD多聚体中一种组分的任何结合剂、配体或 抗受体抗体而经验地设计相似的亲和柱。
[0413]此外，可以采用一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤， 使用使用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧甲基或其它脂族基团的硅胶) 以进一步纯化蛋白质。也可以使用在各种组合中的一些或全部前述纯化步 骤提供基本上均一的分离的重组蛋白。
[0414]在纯化前，可以将含有分泌性ECD多肽(包括嵌合ECD多肽和 /或ECD多聚体)的条件培养基净化和/或浓缩。净化可以通过离心、随后过 滤而进行。浓缩可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行，例如，使 用切向流膜或使用搅拌式细胞系统滤器。多种分子量(MW)分离截断值可 以用于浓缩过程。例如，可以使用10,000MW分离截断值。实施例详述 了纯化HER1/HER3(例如，Rb200和Rb200h)的异多聚体以及纯化同多聚 体(HER1/HER1和HER3/HER3)和异多聚体(HER1/HER3)的混合物的多 种方法。因此，在一个方面，本发明提供包含异多聚体与同多聚体的混合 物的组合物，其中所述异多聚体包含来自HER1的ECD或其部分和来自 HER3的另一种ECD或其部分，并且其中所述同多聚体包含来自HER1 的ECD或其部分和来自HER3的ECD或其部分。该混合物可以具有处于 任意比例的三种多聚体组分。在一些情况下，三种多聚体组分的比例取决 于所用表达系统的类型。在一个实施方案中，三种多聚体组分的比例彼此 大约相等。G.评估或监测ECD多聚体活性的测定法
[0415]通常地，ECD多聚体调节一种或多种、一般两种或多种关联CSR 或其它相互作用性CSR的一种或多种生物学活性。体外和体内测定法可以 用来监测ECD多聚体的生物学活性。本文中提供示例性体外和体内测定 法来评估RTK ECD多聚体、尤其HER ECD多聚体的生物学活性。众多 测定法可用于其它CSR ECD多聚体。此外，用于CSR的生物学活性的多 种测定法是本领域技术人员已知的，并且可以根据待测试的ECD多聚体 选择已知评估具体CSR活性的任意测定法。测试ECD多聚体对RTK活 性影响的测定法包括但不限于激酶测定法、同二聚化和异二聚化测定法、 蛋白质：蛋白质相互作用测定法、结构测定法、细胞信号传导作用测定法和 体内表型测定法。测定法也包括使用动物模型，包括其中可以观察和/或测 量生物学活性的疾病模型。ECD多聚体在此类测定法中的剂量反应曲线可 以用来评估对生物学活性的调节作用以及还用来确定用于施用的ECD多 聚体的治疗有效量。示例性测定法描述如下。1.激酶/磷酸化测定法
[0416]可以直接和间接地检测和/或测量激酶活性。例如，抗磷酸酪氨 酸的抗体可以用来检测RTK的磷酸化。例如，RTK的酪氨酸激酶活性的 激活可以在针对RTK的配体存在下进行测量。转磷酸作用可以通过抗磷 酸酪氨酸抗体检测。可以在ECD多聚体存在或不存在下测量和/或检测转 磷酸作用，因而测量ECD多聚体调节RTK转磷酸作用的能力。简而言之， 表达RTK的细胞可以暴露于ECD多聚体并用配体处理。将细胞裂解并且 将蛋白质提取物(完整细胞提取物或分级提取物)加载到聚丙烯酰胺凝胶 上、通过电泳进行分离并且转移到膜上，如用于蛋白质印迹。用抗RTK 抗体的免疫沉淀法也可以用来对RTK蛋白质分级和分离，随后进行凝胶 电泳和蛋白质印迹。所述膜可以用检测磷酸化的抗磷酸酪氨酸抗体探测以 及用检测全部RTK蛋白质的抗RTK抗体探测。对照细胞(如不表达RTK 同工型的细胞和不暴露于配体的细胞)可以接受相同过程处理用于比较。
[0417]也可以直接测量酪氨酸磷酸化，如通过质谱法。例如，ECD多 聚体对RTK磷酸化状态的影响可以通过用多种浓度的ECD多聚体处理完 整细胞并测量对RTK激活的影响而进行测量，所述RTK可以通过免疫沉 淀法分离并用胰酶消化以产生肽片段用于质谱法分析。肽质谱法是已充分 建立的用于对蛋白质定量性测定酪氨酸磷酸化程度的方法；酪氨酸的磷酸 化增加了含有磷酸酪氨酸的肽离子的质量，并且这种肽通过质谱法轻易地 与非磷酸化的肽分开。
[0418]例如，已知在HER2RTK中的酪氨酸-1139和酪氨酸-1248是自 我磷酸化的。可以基于多肽序列经验地确定或预告胰酶消化的肽，例如通 过使用ExPASy-PeptideMass程序。可以从含有这些酪氨酸的肽质谱数据 中确定酪氨酸-1139和酪氨酸-1248的磷酸化程度。此类测定法可以用来评 估RTK的自身磷酸化程度及ECD多聚体调节RTK转磷酸作用的能力。2.复合/二聚化
[0419]可以检测和/或测量复合作用，如RTKs和ECD多聚体二聚化。 例如，可以将分离的多肽混合在一起，进行凝胶电泳和蛋白质印迹。RTKs 和/或ECD多聚体也可以添加至细胞和细胞提取物(如完整细胞或分级的提 取物)，并且可以进行凝胶电泳和蛋白质印迹。识别所述多肽的抗体可以用 来检测单体、二聚体和其它复合形式的存在。或者，可以在所述测定法中 检测标记的RTKs和/或标记的ECD多聚体。此类测定法可以用来比较在 ECD多聚体存在或不存在下RTK的同二聚化或两种或多种RTK的异二 聚化。也可以实行测定法以评估ECD多聚体与RTK二聚化的能力。例如， 可以评估HER ECD多聚体与HER1、HER2、HER3和HER4的异二聚 化能力。此外、可以评估ECD多聚体对RTK同二聚化或异二聚化能力调 节的能力。例如，可以评估HER ECD多聚体调节HER2与HER1、HER3 或HER4及其它组合的异二聚化能力。
[0420]在另一个实例中，可以实行分子大小排阻分析法。用特定的大 小排阻柱实行分子大小排阻法，并且将洗脱的分子与一组参考标准品比较。 分子可以单独地施用或可以与另一种分子组合。例如，任何RTK多肽、 嵌合多肽或ECD多聚体可以施用至大小排阻柱。如实施例4中所述，可 以确定洗脱体积并且对每种分子计算分子量。或者，可以共施用两种或多 种多肽并且评估洗脱曲线以确定这两种或多种多肽或分子是否能够形成寡 聚体分子。3.配体结合作用
[0421]通常，RTK结合一种或多种配体。配体结合作用调节该受体的 活性并且因而调节例如信号转导途径中的信号传导作用。可以在ECD多 聚体存在下测量配体与ECD多聚体的结合以及RTK的配体结合作用。例 如，标记配体如放射标记配体可以在ECD多聚体存在和不存在(对照)下添 加至纯化或部分纯化的RTK。免疫沉淀法和放射活性测量法可以用来定量 在ECD多聚体存在和不存在下与RTK结合的配体的数量。也可以评估 ECD多聚体的配体结合作用，如通过将ECD多聚体与标记配体孵育并且 例如与相应RTK的野生型或优势形式所结合的数量相比较，确定由ECD 多聚体所结合的标记配体的数量。4.细胞增殖测定法
[0422]众多RTK例如VEGFR、HER家族受体和其它生长因子受体参 与细胞增殖。可以测量ECD多聚体对细胞增殖的影响。待测试的细胞一 般表达靶RTK受体。例如，配体可以添加至表达RTK的细胞。ECD多 聚体可以在配体添加之前、同时或之后添加至这些细胞，并且测量对细胞 增殖的影响。细胞增殖的水平可以通过用染料如Alamar蓝或结晶紫或其 它相似染料标记，随后进行最适密度测量而加以评估。MTT[3-(4，5-二甲 基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]也可以用来评估细胞增殖。使用MTT 作为增殖试剂，其基于来自活细胞的线粒体脱氢酶切割淡黄色MTT的四 唑环并形成深蓝色甲臜晶体的能力，其中所述的甲臜晶体聚集在健康细胞 内，因为它不可透过细胞膜。通过添加去垢剂对细胞的增溶导致该晶体的 释放和增溶。可以通过分光光度计测量手段定量直接正比于活的增殖细胞 数目的颜色。因此，在所选细胞与ECD多聚体于配体存在或不存在下孵 育后，可以将MTT添加至该细胞，可以用去垢剂对细胞增溶，并且在570nm 处读数吸光度。或者，细胞可以在增殖实验前用放射标记物如3H-氚或其 它荧光标记如CFSE预标记。5.细胞疾病模型测定法
[0423]可以使用源自疾病或病症或可进行调节以模拟疾病或病症的细 胞来测量和/或检测ECD多聚体的效果。添加ECD多聚体或将其在细胞中 表达并且测量或检测表型，与不暴露于或不表达ECD多聚体的细胞比较。 此类测定法可以用来测量效应，包括对细胞增殖、转移、炎症、血管生成、 病原体感染和骨吸收作用的效应。
[0424]例如，可以在血管生成中测量ECD多聚体的效应。例如，可以 使用由内皮细胞如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)引起的体外小管形成作为 测定法以测量血管生成和对血管生成的效用。向体外血管生成测定系统添 加数量可变的ECD多聚体是一种适用于筛选作为血管生成调节物的ECD 多聚体的有效性的方法。6.动物模型
[0425]动物模型可以用来评估ECD多聚体的效应。例如，可以测量 ECD多聚体对癌细胞增殖、移行和侵入力的影响。在这样一种测定法中， 在体外培养后，将癌细胞如卵巢癌细胞用胰酶消化，悬浮在合适的缓冲液 中并注射至小鼠(例如注射至模型小鼠如Balb/c裸小鼠的腹侧和肩部)。在 癌细胞通过任何合适的施用途径(即皮下、静脉内、腹膜内和其它途径)施 用至小鼠之前、同时或之后，对小鼠共施用ECD多聚体。随时间监测肿 瘤生长。可以用其它细胞类型和动物模型进行相似的测定法。例如，鼠肺 癌(LLC)细胞和C57BL/6小鼠和SCID小鼠。肿瘤生长可以与未施用ECD 多聚体的小鼠进行比较，或与ECD多聚体的相应关联受体或相互作用性 受体缺陷的小鼠进行比较。
[0426]在另一个实例中，可以使用测定法(如角膜微囊袋测定法(corneal micropocket assay))评估ECD多聚体对眼部疾病的效果。简而言之，在测 定法前，小鼠通过注射施以ECD多聚体(或对照)2-3日。随后，将小鼠麻 醉，并将配体如VEGF或其它生长因子配体的团粒植入眼睛的角膜微囊袋。 随后测量新血管形成，例如在植入后5日。随后与对照相比，评估ECD 多聚体对血管生成的效果。
[0427]本领域已知的任何动物模型可以用来评估ECD多聚体如HER 多聚体的效果，其中所述的动物模型包括转基因小鼠(如人源化转基因小鼠 模型)，如表达DR和DQ主要组织相容性复合体II分子的动脉粥样硬化症 小鼠，其可以用作例如自身免疫病，包括类风湿性关节炎、腹腔疾病、多 发性硬化和胰岛素依赖性糖尿病的模型(Gregersen等(2004)Tissue Antigens 63(5)：383-94))；可以用作动脉粥样硬化模型的载脂蛋白-E缺陷小 鼠(ApoE-/-)；可以用作例如炎性肠病和节段性回肠炎(Scheinin(2003)Clin. Exp.Immunol.133(1)：38-43)模型的IL-10敲除小鼠；以及阿尔茨海默病模 型，如过量表达突变的淀粉状蛋白前体蛋白的转基因小鼠和表达家族常染 色体显性连锁的PS1的小鼠。动物模型也包括受到诱导或处理以显示疾病 的动物，如用作多发性硬化模型的EAE诱导的动物。H.ECD多聚体和ECD多聚体组合物的制备、制剂和施用
[0428]可以配制ECD多聚体和ECD多聚体组合物(包括HER ECD多 聚体和HER ECD多聚体组合物)用于通过本领域技术人员已知的任何途 径施用，所述的途径包括肌内、静脉内、皮内、腹膜内注射、皮下、硬膜 外、经鼻、经口、直肠、局部、吸入性、口颊(例如，舌下)和经皮施用或 任意途径。ECD多聚体可以通过任何的方便途径施用，例如通过输注或大 丸剂注射、通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口粘膜、直肠的和肠粘膜等) 吸收并且可以与其它生物活性药物依次、间歇式或在相同的组合物中施用。 施用可以根据治疗部位是局限、局部或全身性的。局部施用至需要治疗的 区域可以例如通过(但不限于)在外科手术期间局部输注、局部应用(例如在 外科手术后与伤口敷料组合)、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入 物而实现。施用也可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控制的释放(如 通过泵)。在任一给定情况下的最适合途径将取决于正在治疗的疾病或病况 的性质和严重性以及取决于所用具体组合物的性质。
[0429]多种送递系统是已知的并且可以用来施用ECD多聚体，如，但 不限于，脂质体中的包囊、微粒子、微囊、能够表达所述化合物的重组细 胞、受体介导的内吞作用和递送编码ECD多聚体的核酸分子(如逆转录病 毒递送系统)。
[0430]可以制备含有ECD多聚体的药物组合物，通常，在考虑管理机 关批准或根据广泛认可的用于动物和人类中的药典而制备可药用的组合 物。药物组合物可以包括ECD多聚体及与其共同施用的载体(carrier)，如 稀释剂、佐剂、赋形剂或载体(vehicle)。此类药用载体可以是无菌液体， 如水和油，后者包括石油源、动物源、植物源或合成来源的那些油，如花 生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当静脉内施用药物组合物时，水是常用 载体。也可以使用盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，尤其用 于可注射溶液剂。组合物可以随活性成分一起含有：稀释剂如乳糖、蔗糖、 磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；和粘合 剂如淀粉、天然胶如金合欢树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素及其衍生物、聚维酮、交联聚维酮和本领域技术人员已知的此类其 它粘合剂。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦 芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、 脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。根据需要，组合物也可以含 有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精 衍生物、失水山梨醇单月桂酸酯、乙酸三乙醇胺钠(triethanolamine sodium acetate)、油酸三乙醇胺和此类其它物质。这些组合物可以采用溶液剂、混 悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂和缓释制剂形式。组合物可以配 制为栓剂，具有常规的粘合剂和载体如三酰甘油。口服制剂可以包括标准 载体，如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、 碳酸镁、和此类其它物质。合适的药用载体实例在E.W.Martin的 ″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述。此类组合物含有治疗有效 量的化合物，其中所述的化合物通常处于纯化形式，还有合适量的载体， 从而提供用于施用至患者的合适形式。所述制剂应当适合施用模式。
[0431]制剂以单位剂量形式提供用于施用至人类和动物，所述的单位 剂量形式例如是片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外用溶液 剂或混悬剂以及口服溶液剂或口服混悬剂，和含有合适量的所述化合物及 其可药用衍生物的油：水乳剂。药用治疗活性化合物及其衍生物一般以单位 剂量形式或多剂量形式配制和施用。如本文中所用的单位剂量形式指如本 领域已知，适用于人和动物受试者并且单独包装的物理上分开的单元。每 个单位剂量含有足以产生所需治疗效果的预定量的治疗活性化合物连同所 需要的药用载体、载体(vehicle)或稀释剂。单位剂量形式的实例包括安瓿 及注射器和单独包装的片剂或胶囊剂。单位剂量形式可以以单位剂量形式 的一部分或多个单位剂量形式的方式施用。多剂量形式是包装在单一容器 内的以分开的单位剂量形式待施用的多个相同单位剂量形式。多剂量形式 的实例包括小药瓶装、瓶装片剂或胶囊剂或品脱型瓶或加仑型瓶。因此， 多剂量形式是在包装物内不分开的多个单位剂量。
[0432]可以制备含有0.005％-100％活性成分同时用无毒载体补足作为 平衡的剂型或组合物。对于口服施用，药物组合物可以采取例如通过常规 方法制备的片剂或胶囊剂形式，其中所述的片剂或胶囊剂含有可药用赋形 剂如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维 素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸 镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿 润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。所述片剂可以通过本领域熟知方法包衣。
[0433]药用制品也可以是液体形式，例如，溶液剂、糖浆剂或混悬剂， 或可以作为用前与水或其它合适载体(vehicle)重构的药物产物存在。此类 液体制品可以通过常规方法与可药用添加剂如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、 纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)； 非水载体(vehicle)(例如，杏仁油、油质酯或分级的植物油)；和防腐剂(例 如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)一起制备。
[0434]可以提供适于直肠施用的制剂作为单位剂量栓剂。这些栓剂可 以通过混合所述活性化合物与一种或多种常规固体载体(例如可可脂)并且 随后使所得混合物成型而制备。
[0435]适于局部施加至皮肤或眼部的制剂包括膏剂、乳膏剂、洗剂、 糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶剂和油剂。示例性载体包括凡士林、羊毛 脂、聚乙二醇、醇和其两种或多种的组合。局部用制剂也可以含有0.05-15、 20、25重量百分数的增稠剂，所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、甲基 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(亚烷基二醇)、聚羟烷基、(甲基) 丙烯酸酯或聚(甲基)丙烯酰胺。局部用制剂往往通过滴注法施用或作为膏 剂施加至结膜囊。它也可以用于眼部、面部窦道和外耳道的灌洗或润滑。 它也可以注射至眼前房或其它位置。处于液体状态的局部用制剂也可以在 活性组分从其中释放的长条或角膜接触透镜形式的亲水性三维聚合物基质 中存在。
[0436]对于通过吸入施用，本文中使用的化合物可以使用合适的推进 剂，从增压包装物或喷雾器中以气溶胶喷雾呈送形式递送，其中所述的推 进剂例如是二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它 合适的气体。在增压气溶胶剂的情况下，单位剂量可以通过提供递送计算 数量的阀而确定。可以配制用在吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊剂和 药筒，其含有所述化合物和合适散剂基质(如乳糖或淀粉)的散剂混合物。
[0437]适于口颊(舌下)施用的制剂包括例如在加调味剂的基质(通常是 蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶)中含有活性化合物的锭剂；和在惰性基质 (如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中含有化合物的软锭剂。
[0438]可以配制ECD多聚体的药物组合物用于通过注射作肠胃外施 用，例如，通过大丸剂注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量 形式(例如，在安瓿或在多剂量容器中)随添加的防腐剂一起存在。该组合 物可以是在油质或水质载体(vehicle)中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可 以含有制剂物质，如悬浮剂、稳定剂或分散剂。或者，活性成分可以处于 粉末形式以便在用前与合适载体(vehicle)(如无热原的灭菌水或其它溶剂) 重构。
[0439]适于经皮施用的制剂可以作为分开的贴剂存在，其中所述的贴 剂适合与受者的表皮保持密切接触延长的时间期间。此类贴剂合适地含有 活性化合物，其中该活性化合物以例如0.1-0.2M浓度的任选地缓冲的水溶 液存在。适于经皮施用的制剂也可以通过离子电渗法递送(见，例如， Pharmaceutical Research 3(6)，318(1986))并且一般采取活性化合物的任选 地缓冲的水溶液的形式。
[0440]药物组合物也可以通过控释手段和/或控释递送装置施用(见，例 如，美国专利号3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770； 3,916,899；4,008,719；4,687,610；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548； 5,354,566；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566中)。
[0441]在某些实施方案中，脂质体和/或纳粒子也可以与ECD多聚体施 用一起使用。脂质体从分散于含水介质中并自发形成多层共中心双层小泡 的磷脂中形成(又称作多层脂质体(MLV))。MLV的直径通常是25nm-4μm。 对MLV的超声处理导致形成直径200-500的在内核中含有水溶液的小的 单层脂质体(SUV)。
[0442]当分散在水中时，根据脂类与水的摩尔比例，磷脂可以形成除 脂质体之外的多种结构。在低比例上，脂质体形成。脂质体的物理特征依 赖于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以显示对离子性和极 性物质的低通透性，但是在升高的温度上，发生明显改善脂质体通透性的 相变。这种相变涉及从紧密堆积的有序结构(称作凝胶状态)改变成松散堆 积的有序性略低的结构(称作流体状态)。这种情况在特征性相变温度处发 生并导致对离子、糖类和药物的通透性增加。
[0443]脂质体通过以下不同机制与细胞相互作用：通过网状内皮系统 的吞噬性细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的内吞作用；通过非特异性的弱 疏水力或静电力或通过与细胞表面组分特异性相互作用而吸附至细胞表 面；通过脂质体的脂双层插入胞浆膜而与胞浆膜融合，同时释放脂质体内 容物至细胞质内；以及通过转移脂质体的脂类至细胞膜或亚细胞膜，或者 反之亦然，但无脂质体内容物的任何结合。变动脂质体配方可以改变哪一 种机制是有效的，尽管多于一种机制的可以在相同时间发挥作用。
[0444]纳米囊(nanocapsule)通常可以稳定和可重复方式捕获化合物。 为避免胞内聚合物过载所致的副作用，可以使用体内可降解的聚合物设计 此类超细粒子(直径大小约0.1微米)。构思了符合这些要求的生物可降解的 聚氰基丙烯酸烷基酯纳粒子用于本文中，并且此类粒子可以是轻易地制得。
[0445]施用方法可以用来降低ECD多聚体对降解过程如蛋白酶降解和 经抗原性和免疫原性应答所致的免疫学介入过程的暴露。此类方法的实例 包括在治疗部位处局部施用。ECD多聚体也可以受到修饰以调节血清稳定 性和半寿期以及降低免疫原性。此类修饰可以通过本领域已知的任何方法 进行并且包括添加分子至ECD多聚体(如PEG化)和添加载体蛋白(如血清 白蛋白)以及糖基化(Raju等(2001)Biochemistry 40(3)：8868-76；van Der Auwera等(2001)Am J Hematol.66(4)：245-51)。此外，因Fc之间多聚化所 形成的那些ECD多聚体的Fc部分调节血清稳定性和半寿期。
[0446]据报道治疗剂的PEG化(pegylation)提高对蛋白酶裂解的耐 受性；增加血浆半寿期并且降低抗原性及免疫原性。PEG方法学的实例是 本领域已知的(参见例如，Lu和Felix，Int.J.Peptide Protein Res.，43： 127-138，1994；Lu和Felix等，Peptide Res.，6：142-6，1993；Felix等，Int.J. Peptide Res.，46：253-64，1995；Benhar等J.Biol.Chem.，269：13398-404， 1994；Brumeanu等，J Immunol，154：3088-95，1995；还参见Calieeti等 (2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77和Molineux等 (2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。PEG化也可以用在核酸分子的 体内递送中。例如，腺病毒的PEG化可以增加稳定性和基因转移(见，例 如，Cheng等(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。
[0447]所需的血液水平可以通过连续输注活性物质维持，如由血液水 平所确定。应当指出由于毒性或者骨髓、肝或肾脏机能障碍，主治医生将 知道如何终止及何时终止、中断或调节治疗至较低剂量。反过来，若临尿 应答不充分(排除毒性副作用)，则主治医生将知道如何以及何时调节治疗 至较高水平，例如通过经口、经肺、肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或 皮下注射)、吸入(通过精细粉末制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或舌下施 用途径施用，并且可以将所述活性物质制剂为适合每种施用途径的剂型 (见，例如，国际PCT申请号WO 93/25221和WO 94/17784以及欧洲专利 申请613,683)。
[0448]在可药用载体中以这样的量包括ECD多聚体，其中所述的量足 以对治疗的患者产生治疗有用效果，而没有不利副作用。治疗有效浓度可 以通过在已知的体外和体内系统(如本文中提供的测定法)中测试化合物而 经验地确定。
[0449]ECD多聚体在组合物中的浓度将取决于该复合体的吸收、失活、 排泄速率、该复合体的物理化学特征、给药方案和所施用的量以及本领域 技术人员已知的其它因素。
[0450]可以通过标准临床技术确定待施用以治疗疾病或病症例如癌、 自身免疫病和感染的ECD多聚体的量。此外，可以使用体外测定法和动 物模型来帮助确定最佳剂量范围。精确剂量(其可以经验地确定)可取决于 施用途径和疾病的严重性。用于施用的合适剂量范围可以是约0.01pg/kg 体重至1mg/kg体重并且更常见是0.05mg/kg至200mg/kg ECD多聚体比 患者体重。
[0451]ECD多聚体可以一次性施用或可以分成众多更小剂量以间隔时 间施用。ECD多聚体可以在治疗时间期间(例如经数小时、数日、数周或 数月)以一个或多个剂量施用。在一些情况下，连续施用是有用的。应当理 解精确剂量和治疗持续时间与待治疗的疾病相关并且可以使用已知测试方 法或通过从体内或体外实验数据中外推而经验地确定。应当指出浓度和剂 量值也可以随待缓解病症的严重性而变化。还应当理解对于具体受试者而 言，特定给药方案应当根据个体需要和施用或监督施用该组合物的人员的 专业判断随时间调整，并且本文中所述的浓度范围仅是示例性的而不意图 限制组合物及含有这些组合物的联合的范围或用途。I.用ECD多聚体治疗的示例性方法
[0452]本文中提供用ECD多聚体和ECD多聚体的混合物治疗疾病和 病况的方法。ECD多聚体(包括HER ECD多聚体)可以用在治疗涉及 CSR(包括RTK并且尤其HER蛋白家族(包括本文中所述的那些HER蛋 白家族))的多种疾病和病况中。CSR信号传导作用涉及多种疾病和病况的 病因学并且构思了任何此类疾病或病症由本文提供的ECD多聚体治疗。 使用本文所提供ECD多聚体的治疗包括但不限于治疗血管生成相关的疾 病和病况，包括眼病、动脉粥样硬化、癌和血管损伤；神经变性疾病，包 括阿尔茨海默病；炎性疾病和病况，包括动脉粥样硬化；与细胞增殖相关 的疾病和病况，包括癌；平滑肌细胞相关疾病；和多种自身免疫病。对于 通过ECD多聚体治疗RTK介导性、尤其HER介导性疾病和病况，描述 了示例性疗法和临床前研究。还描述了对其它CSR介导性疾病和病况(例 如，但不限于RAGE介导性疾病和病况)的示例性疗法。此类描述仅意在 示例并且不限于具体的ECD多聚体。治疗可以通过合适途径施用分子的 制剂而实现，其中所述的分子可以作为组合物中的多肽而提供作并且可以 与导向剂连接用于定向递送，或在递送载体(vehicle)(如脂质体)中包囊化， 或作为裸核酸或于载体中递送。具体疗法和剂量可以由本领域技术人员确 定。疗法评估中的考虑因素包括待治疗的疾病、该疾病的严重性和过程、 此分子是否为预防还是为治疗目的施用、先前的疗法、患者临床史和治疗 应答和主治医生的斟酌处理。1.HER介导的疾病或病症
[0453]HER(ErbB)相关的疾病或HER受体介导的疾病是HER受体和 /或配体在病因学、病理学或其发展的一些方面中涉及的任何疾病、病况或 病症。尤其涉及包括例如HER受体家族成员或配体的表达或过量表达或 活性。疾病包括但不限于增生性疾病，所述增生性疾病例如包括癌，但不 限于胰癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前 列腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌或乳腺癌。其它 疾病包括涉及细胞增殖和/或移行，包括涉及病理性炎症反应的细胞增殖和 /或移行的那些疾病；非恶性过度增生疾病，如眼病、皮肤病、因平滑肌细 胞增殖和/或移行所致的疾病，如狭窄，包括再狭窄；动脉粥样硬化；膀胱、 心脏或其它肌肉的肌性增厚；子宫内膜异位或类风湿性关节炎。可以用本 文所提供HER ECD多聚体治疗的其它疾病包括由HER家族受体或其配 体介导的任何疾病或病症，包括但不限于侵占性、生长迟缓、精神分裂症、 休克、帕金森病、阿尔茨海默病、充血性心肌病、先兆子痫、神经系统疾 病和心力衰竭。此类疾病或治疗的示例描述如下。a.癌
[0454]如所讨论，HER家族受体常常表达在多种人类癌中，并且其表 达已经与多种癌症的病理关联。例如，HER信号传导作用的过度活化或 调节异常可以导致与肿瘤发生相关的异常细胞活化，包括细胞增殖、血管 生成和移行与侵入。几种机制可以解释在癌中出现的HER家族受体信号 传导作用的调节异常，其中所述机制包括但不限于配体的过量产生、受体 的过量产生或受体的组成型激活。因为在癌和其它疾病中的作用，故HER 受体成为治疗靶。然而，HER家族成员的共表达往往通过备选的HER家 族成员的代偿性上调而导致对此类疗法的应答缺乏或导致耐受性发展。因 此，本文中提供的HER ECD多聚体可以用作对癌的备选疗法，尤其在以 两种或多种细胞表面受体共表达为特征或与之相关的癌中。
[0455]含有全部或部分HER1、HER2、HER3或HER4ECD的ECD 多聚体可以在癌症治疗中使用。在一个方面，本发明提供用于通过施用治 疗有效量的药物组合物而治疗多种类型癌症、炎性疾病、血管生成病或过 度增生疾病的方法，其中所述的药物组合物包含异多聚体和同多聚体的混 合物，其中所述的异多聚体包含来自HER1的ECD或其部分和来自HER3 的另一ECD或其部分，并且其中所述的同多聚体包含来自HER1的ECD 或其部分或者来自HER3的ECD或其部分。在一些情况下，癌症是胰癌、 胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食 管癌、卵巢癌、子宫癌、神经胶质瘤、膀胱癌、肾癌或乳腺癌。在其它情 况下，所治疗的疾病是增生性疾病。此类增生性疾病的非限制性实例包括 平滑肌细胞的增殖和/或移行或是前眼疾病或是糖尿病性视网膜病变、或银 屑病。在其它情况下，所治疗的疾病是再狭窄、眼病、狭窄、动脉粥样硬 化、因血管增厚所致的高血压、膀胱病和阻塞性呼吸道疾病。
[0456]本文中待治疗的癌实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、 肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancy)。此类癌的其它实 例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细 胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺 癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、 乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、食管癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、 子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、 肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。可以与HER ECD 多聚体使用的联合疗法包括抗激素化合物、保心药、抗癌剂如化疗剂和生 长抑制剂和如本文中所述的任何其它药物。
[0457]可用HER ECD多聚体治疗的癌通常是表达至少一种HER受 体、一般多于一种HER受体的癌。此类癌可以通过用于检测HER表达的 本领域已知的任何方法鉴定。例如，HER2表达可以使用可获得的诊断/预 后测定法(包括HERCEPTEST.RTM.(Dako))进行评估。对来自肿瘤活组织 检查的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并且符合HER2蛋白质染色密度 标准。符合小于阈值的肿瘤可以表征为不过量表达HER2，而具有大于或 等于阈值的那些肿瘤可以表征为过量表达HER2。在治疗的一个实施例中， 将过量表达HER2的肿瘤评估为用HER ECD多聚体(如本文提供的任意 HER ECD多聚体)治疗的候选者。b.血管生成
[0458]血管生成是涉及从现有血管中受调节地形成新血管的过程，此 过程常常滋养肿瘤和促进癌转移。VEGF的产生是血管生成及癌细胞移行 的一个必要的因子。众多因子诱导VEGF表达，包括通过HER家族受体 的EGF和TGF-α信号传导作用。实际上，HER1和HER2均是在血管生 成中涉及的癌相关基因(Yance等(2006)Int.Can.Ther.，5：9-29)。HER家 族受体也差异性地表达在内皮细胞上。例如，在正常内皮细胞上，HER2、 HER3和HER4表达，而在肿瘤衍生的内皮细胞上，HER1、HER2和HER4 表达(Amin等(2006)Cancer Res.66：2173-80)。因此，如与正常细胞相比较 的那样，肿瘤衍生的内皮细胞已经丧失HER3表达而获得HER1表达，这 与内皮细胞在VEGF产生和促进血管生成中对EGF的反应性相一致。
[0459]靶向HER家族受体(如由本文提供的ECD多聚体)可以用作对 血管生成的疗法。可以使用体外或体内测定法来评估ECD多聚体对血管 生成的影响。例如，可以测试人乳腺癌衍生的MDA-MB-231细胞(其分泌 血管生成因子VEGF)以确定ECD多聚体是否可以拮抗血管生成因子的产 生。此外，可以通过分析人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖而测试在ECD 多聚体存在或不存在下或在重组血管生成因子存在下，产生在这些细胞的 上清液中的血管生成因子的活性。可以比较增殖的HUVEC掺入[3H]-胸苷 的情形以确定在ECD多聚体存在下HUVEC的增殖是否降低。c.神经调节蛋白相关的疾病
[0460]神经调节蛋白(NRG)是由四个不同基因编码的一组复杂配体 (NRG1-4)。认为这些分子中的一些分子在跨膜前体形式下有活性，如包含 NRG胞外结构域的游离配体。NRG的跨膜形式和游离形式通过HER 1-4 受体发挥其生物学效应。这些配体在神经肌肉突触发育、神经元-胶质细胞 相互作用和调节心脏发育及功能的细胞相互作用中发挥作用。从HER 1-4 的胞外结构域衍生的治疗剂(如含有HER家族的配体结合结构域的单体分 子、同二聚体分子和异二聚体分子)可以用于治疗与暴露于至少一种NRG 相关(例如由其引起或因其加重)的疾病，如神经学疾病或神经肌肉病。在 一个实施方案中，所述疾病与HER3和HER4结合的NRG1(包括NRG1 的I、II和III型)相关。可以通过如本文所述的HER ECD治疗剂治疗的 NRG相关疾病的实例包括但不限于阿尔茨海默病和精神分裂症。
[0461]其中NRG被调节异常的神经学疾病的实例可以是阿尔茨海默 病(Chaudhury等(2003)J Neuropathol Exp Neurol 62：42-54)。Chaudhury 等检验了在源自认知正常的老年人类阿尔茨海默病患者和双重转基因小鼠 的海马中NRG1和erbB激酶的表达和分布，其中所述的双重转基因小鼠 表现阿尔茨海默病表型。NRG-1和erbB4这两者的表达均与神经斑块中的 活性细胞元件特异性相关，提示自分泌性和/或旁分泌性相互作用。如本文 中所述的HER ECD多聚体可以用来治疗阿尔茨海默病及相关病况。多种 小鼠模型可用于人阿尔茨海默病，所述的小鼠模型包括过量表达突变淀粉 状蛋白前体蛋白的转基因小鼠和表达家族常染色体显性连锁的PS1的小鼠 和表达两种蛋白质(PS1M146L/APPK670N：M671L)的小鼠。阿尔茨海默模 型例如通过注射HER ECD多聚体进行治疗。斑块的发展可以例如通过观 察海马、内嗅皮质和脑皮质中的神经斑块，使用染色法和抗体反应性测定 法进行评估。
[0462]精神分裂症仍是严重和基本上无法解决的神经系统疾病。估计1 ％的世界人口患有作为本病特征的严重行为性、情感性和认知缺损。目前， 认为缺乏分子标记的症状有助于诊断。NRG与精神分裂症之间联系的证据 首先由Stefannson等(2002)Am J Hum Genet 71：877-892提出。最近数据 已经表明增加的NRG1转录物水平出现在精神分裂症患者的额前皮质和外 周白细胞中(Hashimoto等(2004)Mol Psychiatry 9：299-307；Petryshen等 (2005)Mol Psychiatry 10：366-74)。NRG1与精神分裂症之间的联系可能与 NRG1逆转某些神经突触的长时程势差有关(Kwon等(2005)J Neurosci 25：9378-83)。如本文所述的HER ECD多聚体可以用来治疗精神分裂症。d.平滑肌增殖相关的疾病和病况
[0463]HER ECD多聚体可以用于治疗哺乳动物(如人类)中涉及平滑肌 细胞增殖的多种疾病和病况。实例是治疗涉及血管平滑肌细胞(VSMC)增 殖并导致内膜超常增生(如血管狭窄，因血管成形术或外科手术或支架植入 物所致的再狭窄)的心脏病、动脉粥样硬化和高血压。在此类病况中，多种 细胞及所释放细胞因子的互动以自分泌、旁分泌或近分泌方式发挥作用， 这导致VSMC从其在中层内的正常位置移行至受损内膜处。移行的VSMC 过度增殖并导致内膜增厚，这引起血管的狭窄或闭塞。这个问题因血小板 在损伤部位处聚集和沉积而加重。α-凝血酶(一种多功能丝氨酸蛋白酶)是在 损伤部分浓集并刺激VSMC增殖。在该受体激活后，VSMC产生并分泌 多种自分泌性生长因子，包括PDGF-AA，HB-EGF和TGF。EGFR参与 信号转导级联，后者最终导致成纤维细胞及VSMC移行并增殖，以及导致 刺激VSMC分泌对内皮细胞具有促分裂原作用的多种因子和诱导内皮细 胞中的趋化应答。用HER ECD多聚体的治疗可以用来调节此类信号传导 作用和应答。
[0464]HER ECD多聚体，如含有HER2和HER3之一或两者的ECD 的全部或部分的HER ECD异多聚体，可以用来治疗其中HER(如HER2 和HER3)调节膀胱SMC(如在应答于影响下泌尿道的阻塞综合征时出现的 膀胱壁增厚)的病况。HER ECD多聚体可以在控制膀胱平滑肌细胞增殖并 因此在预防或治疗尿道阻塞综合征中使用。
[0465]HER ECD多聚体可以用来治疗具有涉及平滑肌细胞增殖的基 础病理的阻塞性呼吸道疾病。一种实例是表现气道炎症和支气管狭窄的哮 喘。已经证实EGF刺激人气道SMC增殖并且可以是参与阻塞性呼吸道疾 病中气道SMC病理性增殖的一个因子。HER ECD多聚体可以用来调节 HER1对EGF的作用和应答。2.RTK介导的疾病或病症
a.血管生成相关性眼病
a.血管生成相关性眼病
[0466]ECD多聚体，包括但不限于含有VEGFR、PDGFR、TIE/TEK、 FGF、EGFR和EphA的一种或多种ECD或其部分的那些ECD多聚体， 可以用于血管生成相关性眼病和病况(包括涉及新血管形成的眼病)的治疗 中。眼部新血管病的特征是新血管侵入眼结构(如视网膜或角膜)。这是失 明的最常见病因并且参与大约20％的眼病。在年龄相关性黄斑变性中，相 关的视觉问题由脉络膜毛细管经过布鲁赫膜中的缺损向内生长和在视网膜 色素上皮细胞下方的维管组织增殖引起。血管生成损伤也与糖尿病性视网 膜病变、早产儿视网膜病、角膜移植、新血管性青光眼和晶状体后纤维组 织增生症相关。与角膜新血管形成相关的其它疾病包括但不限于流行性角 膜结膜炎、维生素A缺乏症、角膜接触透镜过度磨损、异位性角膜炎、上 方角膜缘角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、干燥综合征、红斑痤疮、 phylectenulosis、梅毒、结核菌感染、脂质变性、化学物烧伤、细菌性溃疡、 真菌性溃疡、单纯疱疹病毒感染、带状疱症病毒感染、原虫感染、卡波奇 肉瘤、蚕蚀性角膜炎、Terrien角膜边缘性变性、边缘角化(marginal keratolysis)、类风湿性关节炎，全身性狼疮、多动脉炎、外伤、Wegener肉 芽肿、巩膜炎、重症多形红斑(Stevens Johnson disease)、天疱疮放射状角 膜切开术和角膜移植排异(corneal graph rejection)。与视网膜/脉络膜新血 管形成相关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细 胞贫血症、结节病、梅毒、弹力纤维假黄瘤、湿疹样癌、静脉阻塞、动脉 阻塞、颈动脉阻塞病、慢性玻璃体炎、结核杆菌感染、莱姆病、全身性红 斑狼疮、早产儿视网膜病、伊尔斯病、贝赫切特病、引起视网膜炎和脉络 膜炎的感染、拟眼组织胞浆菌病、贝斯特病、近视、视凹、Stargart病、 睫状体扁平部炎、慢性视网膜剥落、高黏滞综合征、弓形体病、外伤和激 光外科手术后并发症。其它疾病包括但不限于与发红(前房角的新血管形成 (neovascularization of the angle))相关的疾病和由纤维血管或纤维组织 异常增殖(包括增殖性玻璃体视网膜病的全部形式)引起的疾病。
[0467]如本文中所述，可以在动物模型中(例如在角膜植入物内)评估 ECD多聚体对血管生成的治疗效果(如在治疗眼病中)。例如，可以在裸小 鼠模型(如在裸小鼠中的表皮样A431肿瘤和在裸小鼠中植入的VEGF转导 或PIGF转导的大鼠C6神经胶质瘤)中评估如由RTK介导的对血管生成 的调节作用。ECD多聚体可以作为蛋白质进行局部或全身注射。可以比较 受治疗的对照与受ECD多聚体治疗的模型之间的肿瘤以观察肿瘤抑制表 型，包括不良血管化和苍白肿瘤、坏死、增生减少和肿瘤细胞凋亡增加。
[0468]可以用含有全部或部分TIE/TEK ECD的ECD异多聚体治疗的 眼病实例是以眼部新血管形成为特征的眼病，包括但不限于糖尿病性视网 膜病变(糖尿病的主要并发症)、早产儿视网膜病(常导致慢性视觉问题并具 有高失明风险的这种毁灭性眼病是早产婴儿护理期间的一种严重并发症)、 新生血管性青光眼、视网膜母细胞瘤、新生血管性青光眼、发红、眼色素 层炎、黄斑变性和角膜移植物新血管形成。其它的眼部炎性疾病、眼肿瘤 和与脉络膜或虹膜新血管形成相关的疾病也可以用TIE/TEK ECD多聚体 治疗。
[0469]含有全部或部分PDGFR ECD的ECD异多聚体也可以用在治疗 增殖性玻璃体视网膜病中。兔结膜成纤维细胞(RCF)可以注射至例如兔动 物模型中的眼的玻璃体部分内，通过gas vitreomy注射大约1×105个RCF。 可以在同一日注射局限性或全身性施用的ECD多聚体。可以例如在外科 手术后2-4周观察对增殖玻璃体视网膜病的效果，如减轻疾病症状。
[0470]含有全部或部分EphA ECD的ECD异多聚体可以用来治疗具 有调节异常和/或不适宜的血管生成的疾病或病症(如眼病中)。例如，可以 在动物模型(如小鼠角膜模型中)评估EphA ECD多聚体对肝配蛋白A-1诱 导的血管生成的效果。将仅含有肝配蛋白A-1或还有ECD多聚体的 Hydron团粒植入小鼠角膜。在植入后当日进行肉眼观察以观察ECD多聚 体抑制或减少血管生成。b.血管生成相关性动脉粥样硬化
[0471]RTK ECD多聚体，例如含有VEGFR1(Flt-1)或TIE/TEK的全 部或部分ECD中之一或两者的ECD异多聚体可以用来治疗与动脉粥样硬 化相关的血管生成病况，如动脉粥样硬化斑块的新血管形成。已经证实在 血管网中形成的斑块具有血管生成刺激活性。在人冠状动脉粥样损伤中的 VEGF表达与人冠状动脉粥样硬化进程相关。
[0472]动物模型可以用来在动脉粥样硬化的治疗中评估ECD多聚体。 载脂蛋白-E缺陷小鼠(ApoE-/-)易患动脉粥样硬化。此类小鼠通过注射ECD 多聚体(例如VEGFR ECD多聚体)持续一段时间(如持续5周)加以治疗， 从第5、10和20周龄开始。主动脉根部处的损伤在对照ApoE-/-小鼠和经 同工型治疗的ApoE-/-小鼠之间进行评估以观察同工型治疗的小鼠中动脉 硬化损伤的减少。c.其它血管生成相关性疗法
[0473]RTK ECD多聚体，例如含有全部或部分VEGFR ECD和全部 或部分EphA ECD的ECD异多聚体也可以用来治疗治疗血管生成和炎性 相关性病况如滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、软骨毁坏和血管翳形成，如 类风湿性关节炎(RA)中出现那样。可以使用II型胶原蛋白诱导的关节炎(如 小鼠中诱导的多关节性关节炎)的自体免疫模型作为人RA模型。可以对用 ECD多聚体(如通过局部注射蛋白质)治疗的小鼠观察关节炎症状(包括爪 肿胀、红斑和关节强直)的减轻。也可以观察到滑膜血管生成和滑膜炎症的 减轻。血管生成在RA的血管翳形成和维持中发挥重要作用。ECD多聚体 可以单独或与其它同工型和其它疗法组合地用于调节血管生成。例如，血 管生成抑制物可以与ECD多聚体组合地用于治疗RA。示例性血管生成抑 制物包括但不限于制管张素(angiostatin)、抗血管生成性抗凝血酶III、癌 抑素(canstatin)、软骨衍生抑制物、纤连蛋白片段、IL-12、血管抑制素 (vasculostatin)和本领域已知的其它血管生成抑制物(参见例如，Paleolog等 (2002)Arthritis Research Therapy 4(supp 3)S81-S90)。
[0474]适合用ECD多聚体(包括例如VEGFR ECD多聚体)治疗的其它 血管生成相关性病况包括血管瘤。儿童最常见的血管生成病之一是血管瘤。 在大多数病例中，该肿瘤是良性的并且无需介入而消退。在更严重的病例 中，该肿瘤发展成巨大海绵状和浸润形式并且引起临床并发症。血管瘤的 全身形式-血管瘤病具有高死亡率。存在不能治疗或难以用当前所用治疗剂 治疗的众多血管瘤病例。
[0475]ECD多聚体(如VEGFR ECD多聚体)可以用在此类疾病和病况 治疗中，其中血管生成是如遗传性出血性之蜘蛛痣(Osler-Weber-Rendu disease)或遗传性出血性毛细血管扩张症中损伤的原因。这种病是一种遗传 性疾病，其特征在于多个小血管瘤、血液或淋巴管肿瘤。血管瘤存在于皮 肤和粘膜中，常伴有鼻衄(鼻出血)或胃肠道出血并且有时伴有肺及肝脏动 静脉瘘。以不利的血管通透性为特征的疾病和病况也可以由ECD多聚体 治疗。这些疾病包括与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格 斯综合征、肺炎、肾病综合征、心包积液和胸腔积液。
[0476]血管生成也参与正常生理过程如再生和伤口愈合。血管生成是 排卵中的重要步骤并且也是受精后囊胚着床中的重要步骤。通过ECD多 聚体(如含有全部或部分VEGFR ECD的ECD异多聚体)调节血管生成可 以用来诱导闭经、阻断排卵和防止囊胚着床。ECD多聚体也可以用在外科 过程中。例如，在伤口愈合中，过度修复或纤维组织增生可以是外科过程 的有害副作用并且可以因血管生成引起或加重。粘连是外科手术的常见并 发症并且引起问题，如小肠梗阻。
[0477]用于治疗血管生成相关的疾病和病况的RTK ECD多聚体也可 以用在联合疗法中，如与抗血管生成药物、与RTK相关性途径中其它信 号分子相互作用，包括调节VEGFR配体或其它生长因子配体的分子联合。 例如，证实了已知抗风湿药物布西拉明(BUC)在其作用机制中包括抑制滑 膜细胞产生VEGF。通过抑制滑膜细胞产生VEGF，从而抑制关节炎性滑 膜中血管生成和滑膜增生而介导BUC的抗风湿效果。此类药物与EGF多 聚体的联合疗法可以提供用于治疗的多种作用机制和位点。d.癌
[0478]RTK同工型，如同工型TIE/TEK、VEGFR、MET和FGFR， 可以用于治疗癌。RTK同工型(包括但不限于VEGFR同工型如Flt1同工 型、FGFR同工型如FGFR4同工型、和EphA1同工型)可以用来治疗癌。 本文中待治疗的癌的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和 白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌的额外实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上 皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹 膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、 卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结 肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾(kidney)或肾(renal)癌、前 列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌以 及头颈癌。
[0479]例如，含有全部或部分TIE/TEK ECD的ECD异多聚体可以用 于癌的治疗中(如通过调节肿瘤相关性血管生成)。血管化参与调节癌生长 和扩散。例如，抑制血管生成和抑制新血管形成抑制了实体肿瘤生长和扩 张。已经证实Tie/Tek受体(如Tie2)影响正常组织和癌组织中的血管发育。 TIE/TEK ECD多聚体可以用作肿瘤血管生成的抑制物。可以在动物模型 中通过用TIE/TEK ECD多聚体处理大鼠角膜而监测对血管生成的效果， 其中将所述的TIE/TEK ECD多聚体配制为以外科手术方式植入大鼠角膜 微囊袋的hydron团粒中的条件介质(conditioned media)或配制为施用至窗 室(window chamber)的纯化蛋白质(例如100μg/剂量)。例如，大鼠模型(如 具有无血管角膜的F344大鼠)可以与肿瘤细胞的条件介质联合使用或通过 植入肿瘤片段至眼的窗室以诱导血管生成。角膜可以进行组织学检验以检 测由肿瘤细胞的条件介质诱导的血管生成抑制。TIE/TEK ECD多聚体也 可以用来治疗恶性肿瘤和转移性病况，如实体肿瘤，包括原发性和转移性 肉瘤和癌。
[0480]含有全部或部分FGFR4ECD的ECD异多聚体可以用来治疗癌 症，例如垂体肿瘤。动物模型可以用来模拟人垂体肿瘤的进展过程。例如， 在转基因小鼠中表达的氨基端缩短形式的FGFR即ptd-FGFR4重现了垂 体肿瘤发生(Ezzat等(2002)J Clin.Invest.109：69-78)，包括在延长和庞大的 超常增生不存在下的垂体腺瘤形成。FGFR4ECD多聚体可以施用至 ptd-FGFR4小鼠并且将垂体构造和肿瘤进展过程与对照小鼠比较。3.其它CSR介导的疾病或病症
[0481]本文中也提供用至少含有非RTK CSR(如，但不限于TNFR或 RAGE)作为组分之一的ECD异多聚体治疗疾病。例如，至少含有RAGE 的全部或部分ECD的ECD多聚体可以用来治疗糖尿病相关的疾病和病 况，包括牙周病、自身免疫病以及脉管疾病和小管间质性疾病。使用RAGE ECD多聚体的疗法也包括治疗眼部疾病(包括黄斑变性)、心脏血管疾病、 神经变性的疾病(包括阿尔茨海默症)、炎性疾病(包括类风湿性关节炎)以及 与细胞增生相关的疾病和病况(包括癌症)。在另一个实例中，至少含有受 体TNFR家族的全部或部分ECD的ECD多聚体可以用来治疗类风湿性关 节炎、节段性回肠炎、自身免疫病、风湿病、炎性肠病、阿尔茨海默症和 其他疾病，尤其炎性疾病。4.ECD多聚体的ECD多肽组分的选择
[0482]在决定哪种ECD多聚体分子用于治疗所选疾病时，确定ECD 多聚体的组分是考虑因素。可以经验地确定几种因素以例行设计用于治疗 疾病或病症的ECD异多聚体。首先，应当确定待治疗的疾病。一般，此 种疾病是显示耐受单一受体靶向性疗法的疾病，例如原因是对所述疾病病 因学有贡献的多种CSR(包括RTK并且尤其HER)的过量表达。其次，可 以确定参与该疾病病因学的一种或多种CSR或CSR的配体。此类CSR 或配体可以是所设计ECD多聚体的靶，从而设计该ECD多聚以便调节(一 般抑制)所述CSR或其配体的活性。因此，ECD多聚体应当含有靶CSR 的足以与该CSR二聚化的ECD的全部或部分作为一种组分和/或含有足以 与所述靶CRS的配体相结合的ECD的全部或部分。本领域技术人员知道 或可鉴定到参与所选疾病的病因学的CSR(包括RTK或HER家族受体)和 /或其配体。例如，上文描述了CSR对一些示例性疾病和病症的贡献。第 三，可以确定所述ECD中足以结合配体和/或与关联性或相互作用性受体 二聚化的组成部分。示例性ECD分子的此类部分是在本文描述过的或是 已知的或可以由本领域技术人员例行确定，例如，基于与相关受体比对和/ 或通过使用重组DNA技术连同配体结合测定法。至少两种或多种已鉴定 的靶CSR的ECD的全部或部分可以直接或间接地连接以形成多聚体，例 如通过各自与多聚化结构域连接。在一些情况下，根据用来连接各种组成 部分的方法，所述多聚体可以是二聚体或高阶多聚体。所得ECD多聚体 则是用于治疗所选疾病的候选治疗剂。
[0483]例如，HER受体(例如HER1)涉及多种癌，所述的癌包括但不 限于其中HER1过量表达的那些癌(即结肠直肠癌、头和颈癌、前列腺癌、 胰腺癌、肝癌、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌、子宫颈癌/ 子宫癌、神经胶质瘤癌、膀胱癌和其他癌)。因此，可以设计这样的ECD 多聚体，其具有HER1ECD的全部或部分作为一种组分，旨在靶向HER1 信号传导作用作为治疗癌症的一种机制。在异多聚体的设计中，可以鉴定 也涉及所选疾病的另一种CSR分子并且将其用作所述异多聚体的第二多 肽组分。例如，其它HER受体和其配体过量表达于或涉及多种癌中。例 如，如同HER1那样，HER3过量表达于乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、 肝癌和食道癌中。因此，用于治疗多种癌的候选ECD治疗剂将是这样一 种ECD治疗剂，其是HER1的全部或部分ECD和HER2的全部或部分 ECD的异多聚体。在第二个实例中，所选疾病可以是血管生成病。本领域 技术人员知道VEGFR1和RAGE均参与血管生成的病因学。因此，可以 设计这样的异多聚体作为候选治疗剂，其含有VEGFR1的ECD的全部或 部分和RAGE的ECD的全部或部分。5.患者的选择
[0484]如先前提及，多种疾病和病症因不适当地激活CSR、尤其HER 家族受体而引起，其原因在于例如配体的过量产生、受体的过量产生或受 体的组成型激活。患者对药物或分子(如本文中提供的ECD多聚体)的应答 往往可以基于药物或分子所靶向的CSR或配体的相关表达而进行预测。可 以。因此，根据需要，在治疗疾病或病症之前，可以分析患者的配体或CSR 表达以选出这样的患者，其中预计所述患者对于用本发明所提供ECD多 聚体的疗法具有增强的应答性。例如，若ECD多聚体治疗剂靶向至少一 种HER1受体，可以分析患者的HER1表达。在另一实例中，若已知待治 疗的疾病由特异性配体介导，则用靶向该配体的ECD多聚体治疗之前， 可以分析患者的所述配体表达。可以将患者样本(即血液、血清、肿瘤、组 织、细胞或其它来源)中配体或CSR的表达与对照样本或正常样本比较， 旨在选出具有升高的CSR或配体水平的那些患者。如此所选的患者可以确 保对预计最可能应答于给定治疗剂的那些患者亚群治疗。
[0485]在一个方面，可以在患者中评估CSR的表达。在一个实例中， 可以在诊断性或预后性测定法中通过评价在组织或细胞表面上存在的 CSR蛋白的增加水平(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)而确定表达。 备选地，或此外，细胞中编码CSR的核酸的水平可以例如通过荧光原位杂 交(FISH；见WO 98/45479)、DNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)(如实时定 量PCR(RT-PCR))进行估计。另外，CSR的过量表达可以通过测量在生物 体液(如血清)中散播的抗原(例如可溶性CSR)(见例如，美国专利号 4,933,294；WO91/05264；5,401,638；Sias等(1990)J Immunol.Methods， 132：73-80)进行估计。在另一种测定法中，可以从患者分离细胞并且使该细 胞暴露于用可检测标记物(例如放射性同位素或荧光标记物标记)任选标记 的CSR特异性抗体，并且可以分析该抗体与细胞的结合作用。在另一个实 例中，患者的这种细胞可以在体内暴露于一种抗体并且该抗体的结合作用 可以如此进行评估，即通过用于放射活性的外部扫描法或通过分析从先前 暴露于该抗体的患者中取得的活组织检样。本领域技术人员已知的任何其 它测定法可以用来确定患者中的CSR水平，所述的测定法是例如，但不限 于免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)和其它方法。在一些情况下， 选择具有磷酸化形式受体表达增加的患者可以用来尤其是鉴定具有升高的 激活受体水平的那些患者亚组。本领域已知检测CSR磷酸化的多种测定 法，包括但不限于例如使用抗磷酸酪氨酸抗体或抗磷酸(anti-phospho)特异 性CSR抗体的免疫印迹法或ELISA。
[0486]在一些情况下，可以确定CSR配体的水平作为选择患者的一个 指标。例如，患者的组织或肿瘤中的配体水平可以使用免疫组织化学法 (IHC，参见例如，Scher等(1995)Clin.Cancer Research，1：545-550)确定。 备选地，或此外，在样本、组织、肿瘤或其它来源中的配体水平可以根据 用于检测白质或编码性核酸的任何方法确定。这种方法的示例是ELISA、 PCR(包括RT-PCR)、流式细胞术、FISH、DNA印迹法和其它方法。此外， 如上文，CSR的配体可以使用体内诊断测定法进行评估，例如通过施用与 待检测分子结合的分子(如抗体)并且用可检测标记物(即放射标记物)进行 标记并且外部地扫描该患者以定位所述标记物。例如，可以在患者样本如 在血清中，使用标准ELISA方法(即市售ELISA试剂盒，如来自R&D Systems)或通过免疫组织化学法和组织微阵列分析福尔马林固定的原代肿 瘤的切片中的HER家族受体的配体，如TGF-α、EGF或双调蛋白(参见例 如，Ishikawa等(2005)Cancer Res.65：9176)。在另一个实例中，RT-PCR 可以用来评估在患者细胞样本中，如在患者的肿瘤细胞(Mahtouk等 (2005)Oncogene，24：3512-3524)或血液、骨髓或淋巴结(如在分离自其中的 单核细胞)中的配体表达。6.联合疗法
[0487]ECD多聚体(如RTK ECD多聚体，包括HER ECD多聚体)可 以与每种其它多聚体联合使用或作为它们与治疗疾病及病况的其它现有药 物及治疗剂的混合物加以使用，并具有相加性或协同性治疗效果。例如， 如本文中所述的众多ECD多聚体可以用来治疗血管生成相关性病况和疾 病和/或控制肿瘤增殖。此类疗法可以联合抗血管生成性和/或抗肿瘤药物和 /或治疗剂进行。用于联合疗法的抗血管生成性和/或抗肿瘤药物和/或治疗 剂包括可以用在联合疗法中的酪氨酸激酶抑制剂和能够调节酪氨酸激酶信 号转导的分子，包括但不限于4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶(参见例如，美国专 利号5,639,757)和喹唑啉化合物和组合物(例如，美国专利号5,792,771。用 在联合疗法中的其它化合物包括类固醇如血管生成抑制性4，9(11)-类固醇 和C21-氧化的类固醇、制管张素、内皮抑制素、血管抑制素、癌抑素 (canstatin)和乳腺丝抑蛋白(maspin)、血管形成因子、细菌多糖CM101 和抗体LM609(美国专利号5,753,230)、血小板反应蛋白(TSP-I)、血小板因 子4(PF4)、干扰素、金属蛋白酶抑制物、药学试剂(包括 AGM-1470/TNP-470、沙利度胺和羧胺三唑(CAI))、可的松(如在肝素或肝 素片段存在下)、抗侵入因子、视黄酸与紫杉醇(美国专利号5,716,981；通 过引用的方式并入本文)、鲨鱼软骨提取物、阴离子聚酰胺或聚脲低聚体、 氧化吲哚衍生物、雌二醇衍生物以及噻唑并嘧啶衍生物。
[0488]治疗癌症(包括治疗过量表达HER的癌症)可以包括使用抗癌剂 的联合疗法，所述的抗癌剂例如是抗HER抗体、小分子酪氨酸激酶抑制 物、反义寡核苷酸，针对HER/配体的疫苗或免疫缀合物(即偶联于放射性 同位素或细胞毒素的抗体)。此类抗癌剂的示例包括吉非替尼、拉帕替尼、 帕尼单抗、埃罗替尼、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、伊马替尼、铂配合物或 核苷类似物。其它抗癌剂包括放射法或化疗药和/或生长抑制剂，包括共施 用不同化疗药剂的混合物。细胞毒性剂或化疗药的实例包括例如紫杉烷类 (如紫杉醇和多西他赛)和蒽环类抗生素、多柔比星/阿霉素、去甲柔红霉素、 柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲蝶呤、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、泊 非霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鬼臼毒素或鬼臼 毒素衍生物如依托泊甙或磷酸依托泊甙、美法仑、长春碱、长春新碱、异 长春碱、长春地辛、长春罗新、美登醇、埃博霉素A或B、泰索帝、紫杉 酚等。此类其它治疗剂包括雌莫司汀、顺铂、考布他汀及类似物和环磷酰 胺。针对此类化疗药的制剂和给药方案可以根据制造商说明书或如由熟练 执业者所决定而使用。此类化疗药的制剂和给药方案也在Chemotherapy Service编著，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，Md.(1992)中描 述。
[0489]其它化合物可以在联合疗法中与ECD多聚体一起使用。抗激素 化合物可以例如在联合疗法中与ECD多聚体一起使用。此类化合物的实 例包括处于该类分子的已知剂量上的抗雌激素化合物，如他莫昔芬；抗孕 酮，如奥那司酮；以及抗雄激素，如氟他胺。共施用保心药(防止或减少可 能与疗法相关的心肌机能障碍)或一种或多种细胞因子也可以是有益的。除 上述治疗方案外，患者可以接受外科摘除癌细胞法和/或放射疗法。
[0490]联合疗法可以增加治疗的有效性，并在一些情况下产生协同效 应，从而这种联合比单独疗法的相加性效应更有效。例如，用化疗药物(如 酪氨酸激酶抑制剂)和如本文所述ECD多聚体的联合疗法可以显示对肿瘤 细胞生长的协同抑制作用，即比分别使用两种药物的相加性联合更大的生 长抑制效应。
[0491]佐剂和其它免疫调节剂可以在治疗癌症中与ECD多聚体联合使 用，例如旨在增加针对肿瘤细胞的免疫应答。佐剂的实例包括但不限于细 菌DNA、减毒结核杆菌细胞(BCG；Bacillus-Calmette-Guerin)的核酸部分、 来自BCG基因组的合成性寡核苷酸、和含有CpG基序的合成性寡核苷酸 (CpG ODN；Wooldridge等(1997)Blood 89：2994-2998)、左旋咪唑、氢氧 化铝(Alum)、BCG、弗氏不完全佐剂(IFA)、QS-21(植物衍生性免疫促进 剂)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和二硝基苯酚(DNP)。免疫调节剂的实例包括但 不限于细胞因子如白细胞介素(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1α、 IL-1β和IL-1RA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激 因子、抑瘤素M、促红细胞生成素、白血病抑制因子(LIF)、干扰素、B7.1(也 称为CD80)、B7.2(也称为B70、CD86)、TNF家族成员(TNF-α、TNF-β、 LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail) 及MIF、干扰素、细胞因子类如IL-2和IL-12；以及化疗药物类如甲氨蝶呤 和苯丁酸氮芥。
[0492]实施例显示除了使用现有治疗药物之外，还使用多种形式的异 多聚体以及异多聚体与同多聚体的混合物产生了协同性结果。J.用于鉴定、筛选和产生泛HER治疗剂的方法
[0493]除了本文中提供的ECD多聚体，还可以鉴定其它候选性泛HER 治疗剂。本文提供鉴定泛HER治疗剂的方法和针对它们的筛选测定法。 所述方法设计旨在通过如此方式确定靶向ECD亚结构域而干扰配体结合 和/或受体二聚化和/或束缚的分子，即通过鉴定与在多于一种HER受体家 族成员上的参与这些活性的区域相互作用的分子(如小分子和多肽)。此类 治疗剂可以同时靶向HER家族中不具备HER受体多重共表达的几种成 员。1.针对泛HER治疗剂的靶
[0494]为设计此类泛HER治疗分子，鉴定了作为参与特定活性而被鉴 定的相似表位或保守区域。例如，鉴定了参与束缚作用的区域以筛选出稳 定或促进束缚作用的候选分子；鉴定了参与配体结合的区域以筛选出干扰 配体与两种或多种HER家族成员相互作用的候选物。并且鉴定了参与二 聚化的区域。
[0495]所述区域以该受体家族晶体结构数据为基础并且据此鉴定。例 如，针对受体的如此方面设计拮抗治疗剂，其中所述的方面决定受体是否 处于无活性或有活性构象，以便偏好性地靶向受体的激活形式，其中所述 的受体激活形式构成细胞表面上的约5％HER家族受体。由晶体结构预测 的此类结构组分的实例包括例如，维持受体处在受束缚或无活性状态的结 构组分、促进二聚化的结构组分和/或促进配体结合的结构组分。下文描述 这些结构组分的每一种作为用于设计泛HER治疗剂的潜在靶。
[0496]例如，在亚结构域II(D II)和IV(D IV)中的区域参与束缚作用和 参与受体二聚化。可以鉴定保守区域以筛选出抑制多于一种的HER家族 成员二聚化的候选化合物和/或使系索(tether)稳定或使结构域交联以稳 定束缚构象的候选化合物。在实施例中例举来自几种HER家族成员的此 类已鉴定多肽。
[0497]对于该方法而言，鉴定了每种HER受体(HER1、HER2、HER3 和HER4)中在每个靶结构域区中的同源多肽序列。在一些实例中、也可以 比对在IGF1-R及其它细胞表面受体中的同源区域以鉴定潜在的靶序列。 一般，如此衍生靶序列，即通过使用在一种或多种HER受体(一般是HER1 和/或HER3)中的氨基酸序列并从晶体结构中建模，随后已鉴定的序列与其 它HER家族受体比对，并挑出最保守的序列。还鉴定了在其它HER受体 中的相应序列。可以例如使用噬菌体展示法鉴定针对这些靶序列的结合蛋 白。可以富集所述的结合蛋白以鉴定与些区域之一者或多者结合并1)抑制 配体结合、2)抑制受体联合成为二聚体或异二聚体和/或3)抑制解束缚反应 (untethering reaction)(即激活HER分子)的那些结合蛋白。在一些情况 下，所鉴定的肽的亲和力可以因两种或多种肽交联(即产生肽异二聚体)而 增加，从而交联的肽与同一分子的两个区域结合并防止该分子解折叠。所 述交联的肽可以是识别相同结构域中不同表位的肽或它们可以是识别不同 结构域中不同表位的肽。例如因为在HER受体的束缚构象中结构域II和 IV接近，故识别结构域II中一个表位的肽可以与识别结构域IV束缚区中 一个表位的肽交联以抑制对束缚构象的解束缚。
[0498]在一个实例中，设计泛HER治疗性拮抗剂旨在通过阻止二聚化 而锁定受体处于自身抑制构型。因此，在结构域II中的区域和/或在结构域 IV中的区域可以作为靶。例如，在结构域II的二聚化臂中的区域或此二 聚化臂周围的区域可以作为防止二聚化和HER家族受体联合的靶。在另 一个实例中，在结构域IV中的区域可以作为防止二聚化臂与结构域IV中 同源区域联合的靶，其中在受体处于束缚构象时所述的联合发生。因此， 可以鉴定与例如在单一受体的结构域II上的不同位点结合并因而在空间上 抑制该受体二聚化能力的拮抗剂，如通过噬菌体展示法所鉴定的肽或其它 分子(如抗体)或其它小分子治疗剂。基于与HER3在结构域II或结构域IV 中的比对结果而显示在HER家族成员之间保守的靶表位区域可以用作免 疫原以产生针对这些区域的抗体，或可以用作靶底物以使用例如噬菌体展 示技术富集针对这些位点的肽结合物。实施例8描述了对示例性同源靶表 位的鉴定，其中所述的同源靶表位也在SEQ ID NO：62-93任意项中描述(结 构域II表位)或在SEQ ID NO：94-125任意项中描述(结构域IV表位)。此 外，实施例5描述了HER2中参与二聚化的示例性区域(在SEQ ID NO：405 中描述)。因此，例如，噬菌体展示法可以用来鉴定与结构域II和/或结构 域IV的同源区域中不同位点结合的肽，其中所述的同源区域可以分别与 结构域II和/或结构域IV中的区域结合，以通过抑制二聚化而维持受体处 于自身抑制构型。亲和力更高的肽结合物可以通过产生如本文以下所述的 肽异二聚体而制得。这种方法的优势在于它针对仅占细胞表面上HER受 体约5％的非束缚形式受体，因此，所得的治疗剂将仅靶向活跃地发生信 号作用的那些受体亚群，而不是细胞表面上的95％受束缚及无活性的受 体。这将提高对受体的有效打靶并减少药物剂量，因为靶总数降低达大约 15-20倍。
[0499]在另一个实例中，结构域II和结构域IV上的相似同源区域可以 作为靶，以产生使HER受体的束缚构象稳定的泛HER治疗拮抗剂。此类 治疗剂靶向HER受体的无活性形式(即约95％的HER细胞表面受体)并防 止它们采取活性构象的能力。这种方法的可行性得到晶体结构数据的支持， 其中所述的晶体结构数据显示在HER受体的非束缚或无活性形式中结构 域II与IV之间的密切相互作用。HER1和HER3的ECD的晶体结构显示 在配体刺激之前，受体在细胞表面上维持处于自身抑制或束缚构型。在这 种构型中，在结构域II中的二聚化臂与结构域IV中的同源区域之间的分 子内特异性接触约束了负责配体结合的两个区域(即结构域I和III)的相对 取向，从而结构域I和III不能同时接触配体。这些结构特征表明若可以受 体锁定处于自身抑制的束缚构型，则可以阻止配体依赖性HER受体激活。 结构域II和IV序列的靠近预示所述序列可以因为其密切接近而交联。因 此，可以靶向在结构域II和IV中如上文及在实施例8中所述以及在SEQ ID NO：62-93任意项中所述(结构域II表位)和在SEQ ID NO：94-125任意项 中所述(结构域IV表位)的相同表位区域。对于此方法，选择了靶向在HER 家族受体结构域II和结构域IV这二者中同源区域的例如由噬菌体展示方 法学鉴定的肽结合物。若使用如本文所述的方法使两种肽二聚化，其中一 种肽结合结构域II而另一种肽结合结构域IV，则所述肽可以与束缚的无 活性HER家族成员中的结构域间区域(例如稳定结构域II和IV的相互作 用)交联。因此，所得拮抗剂分子与束缚形式的受体结合，并将这种束缚形 式就地″锁定″，因而阻止形成受体的高亲和力、非束缚形式。
[0500]在另一个实例中，在结构域I和III中的配体结合区域可以被由 本文所述方法所鉴定的泛HER治疗剂靶向。如同上文，可以鉴定HER家 族受体之间参与配体结合的同源靶区域。例如，参与配体结合的HER1的 区域可以通过与TGF-α复合的HER1的晶体结构确定(Garrett等(2002) Cell，110：763-773)。该晶体结构可以取自具有1D，1MOX的PDB蛋白质 数据库。可以通过HER1、HER2、HER3和HER4的多重比对而确定在 其它HER家族受体中的同源区域。实施例7描述由这种比对鉴定的区域， 并且所比对的序列在SEQ ID NO：54-61任意项中描述。这些序列可以例如 通过组合肽文库、噬菌体展示技术或通过多克隆方法进行打靶(参见例如， Haurum和Bregenholt(2005)IDrugs，8：404-409)。预期由此类方法鉴定的 泛HER治疗剂将通过阻断结构域I和/或III中的位点(如借助空间阻抑作 用)抑制多种配体与多种HER受体结合。此种治疗剂将靶向无活性的HER 受体，并抑制它们采取活性构象的能力，其中所述的活性构象仅于结合配 体后才出现。2.鉴定泛HER治疗剂的筛选方法
[0501]本文中提供了鉴定靶向多于一种HER家族受体的泛HER治疗 剂的方法。筛选了分子集合。此类集合包括例如，小分子有机化合物和其 它生物分子，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结 构类似物或其组合。在一个实例中，将所述集合针对已鉴定的多肽进行筛 选，其中所述已鉴定的多肽是在受体家族之间保守的，并且参与特定活性。
[0502]已鉴定的多肽也可以由用于筛选分子文库以鉴定与所鉴定分子 相互作用的那些分子的任意多种方法进行筛选。例如，候选的泛HER治 疗剂可以通过噬菌体展示法所衍生的肽进行鉴定。富集此类肽以鉴定与如 上所讨论的HER受体家族之间的保守序列元件(即在SEQ ID NO：54-125 或405任意项中所述的任何一种或多种肽表位)结合的那些肽。a.噬菌体展示法
[0503]充分建立的噬菌体展示技术包括产生展示在噬菌体上的文库或 肽。这些文库或肽可以含有例如多达1010种不同肽，因此优于众多的小分 子组合文库。肽(往往具有7-20个或更多个氨基酸)与蛋白质靶的相互作用 可以是高度特异性的，有时候比小分子有更高特异性。肽可以加以修饰以 增强其治疗效力。例如，可以通过PEG化或与其它血清蛋白质(如白蛋白 融合)而降低血清短暂停留性和肾脏迅速滤除性。PEG化不仅增加血清停 留性，也可以降低免疫原性。此外，可以通过连接两种或多种协同性非重 叠肽以形成高亲和力的异二聚体结合物而改善肽与蛋白质靶的亲和力。
[0504]噬菌体展示法和此类其它方法可以按照不同方式使用。首先， 本文所鉴定的多肽可以针对已展示的多肽的文库进行筛选，以鉴定文库中 可作为候选泛HER治疗剂的那些多肽。或者，可以展示本文中已鉴定的 肽并且针对小分子和其它多肽的文库筛选以鉴定泛HER治疗剂候选者。i.肽文库
[0505]在本文提供的方法中所产生并筛选的肽文库用于提供HER家 族受体的新配体和产生泛HER治疗剂。可以根据本文中详述的方法和本 领域技术人员通常可获得的方法设计并淘选肽文库(参见例如，美国专利号 5,723,286和美国专利申请号US20040023887)。在一个方面，可以使用市 售噬菌体展示文库(例如，或GRABDGI BioTechnologies，Inc.，Edison，NJ.；C7C二硫键约束的肽文库或7-氨基酸 和12-氨基酸线形文库，New England Biolabs)。在另一个方面，可以根据 本领域已知的方法制备寡核苷酸文库并将其插入用于肽表达的适宜载体。 例如，可以使用编码噬菌体结构蛋白、优选编码可接近的噬菌体蛋白如噬 菌体衣壳蛋白(coat protein)的载体。尽管本领域技术人员理解可以使用 多种噬菌体，不过载体一般是或衍生自丝状噬菌体，例如f1、fd、Pf1、 M13和其它噬菌体。尤其，fd-tet载体已经在文献中广泛描述(见，例如， Zacher等(1980)Gene 9：127-140；Smith等(1985)，Science 228：1315-1317； Parmley和Smith(1988)Gene，73：305-318).
[0506]选择或构建噬菌体载体以含有位于编码噬菌体结构蛋白的基因 的5′区域中的克隆位点，从而该肽在如本文以下所述的亲和力富集方法中 易接近受体。噬菌体结构蛋白通常是衣壳蛋白。适宜的衣壳蛋白实例是菌 毛(pill)。合适的载体可以允许定向克隆编码肽的寡核苷酸序列，从而所述 肽表达在成熟衣壳蛋白的氨基端处或在距离该氨基端约100个氨基酸残基 的范围内。一般，该衣壳蛋白表达为具有前导序列的前蛋白。
[0507]一般，如此插入寡核苷酸文库，从而加工的噬菌体外壳蛋白 (outer protein)的氨基端是该肽的第一残基，即位于编码前导蛋白的序列的 3′末端与编码成熟蛋白质的序列的5′末端或此5′末端的一部分之间。通过 克隆含有文库成员的可变区域的寡核苷酸(和任何间隔区，如下文所讨论) 至所选克隆位点内而构建寡核苷酸文库。使用已知的重组DNA技术(通常 见，Sambrook等(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版.， Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)，可以构 建这样的寡核苷酸，其1)去掉不想要的限制性位点并添加想要的限制性位 点；2)重构已经被去掉的任何序列的恰当部分(例如正确的信号肽酶位点)； 3)若存在的话，插入间隔区残基；和/或4)根据需要，校正翻译可读框，以 产生有活性的感染性噬菌体。
[0508]寡核苷酸的中央部分通常含有一种或多种HER家族受体表位结 合序列并任选含有间隔区序列。所述序列最终作为与成熟衣壳蛋白的氨基 端融合或与其内部融合的肽(具备或不具备间隔区)表达在已装配噬菌体颗 粒的外部、可接近表面上。文库的大小将根据可变密码子数目并且因而根 据肽的大小而变化，这是想要的。通常，该文库将具有至少约106个成员， 通常至少107个并且一般108个或更多个成员。为产生形成一系列编码随机 氨基酸集合的密码子并最终克隆至载体内的寡核苷酸集合，使用一种密码 子基序，如(NNK)x，其中N可以是A、C、G或T(名义上等摩尔)，K是 G或T(名义上等摩尔)并且x一般是至多达约5、6、7、8或更大数字，因 而产生五肽、六肽、七肽和八肽或更大肽的文库。第三位置也可以是G或 C，命名为″S″。因此，NNK或NNS编码1)全部种类的氨基酸；编码2) 仅一种终止密码子；并且3)使密码子偏倚性从6∶1降低至3∶1。
[0509]应当理解，在较长的肽的情况下，生成的文库的大小可能变成 克隆过程中的限制因素。本领域已知在适宜重组载体内从随机生成的寡核 苷酸混合物表达肽(见，例如，Oliphant等，Gene 44：177-183)。例如，密码 子基序(NNK)6产生32个密码子：对应于12种氨基酸中每一种氨基酸的一 个密码子，对应于5种氨基酸中每一种氨基酸的两个密码子，对应于3种 氨基酸中每一种氨基酸的三个密码子和一个(琥珀)终止密码子。虽然这种 基序产生与可用标准寡核苷酸合成方法所获得的相同的合理密码子分布， 不过它导致针对含有单一密码子残基的肽的偏倚性。具体而言，一个六密 码子的完整集合含有一种序列，此序列编码仅由单一密码子氨基酸构成的 每种肽，然而含有729(36)种序列，所述序列编码仅有三密码子氨基酸的每 种肽。
[0510]一种旨在使针对单一密码子残基的偏倚性最小化的备选方法包 括合成20种活化的三核苷酸，其中每种三核苷酸代表20种遗传编码的氨 基酸之一的密码子。这些三核苷酸由常规方法合成，从支持物上取下，同 时保留碱基和5-OH保护基团，并且通过用于活化单核苷的方法添加3′O- 亚磷酰胺(并且用b-氰乙基保护磷酸酯)而加以活化(一般参见，McBride和 Caruthers，1983，Tetrahedron Letters 22：245)。使用作为结构单元的这些三 聚体制备简并性寡密码子。将所述三聚体以想要的摩尔比例混合并安置在 合成仪中。该比例通常是大致等摩尔的，不过可以是可调式不等比例的， 以获得由简并性寡核苷酸集合编码的某些氨基酸的过量代表至不足代表。 基本上如对利用活化单核苷作为结构单元的常规合成法所述进行三聚体缩 合以形成寡密码子(见，例如，Atkinson和Smith，1984，Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait编辑，第35-82页)。这种方法产生用于克隆的寡核苷 酸群体，所述的寡核苷酸群体能够编码均等分布的(或可调式不等分布)的 可能肽序列。有利地，该方法可以在产生较长的肽序列中使用，因为由 (NNK)6基序引起的偏倚性范围随每个额外的氨基酸残基增加达3倍。
[0511]当密码子基序是如上所述的(NNK)x时并且当x等于8时，存在 2.6×1010种可能的八肽。可能难以产生含有大部分所述八肽的文库。因此， 可以通过使用多到约10％的可能序列构建亚组文库而实现对所述八肽的 采样，其中随后筛选重组噬菌体颗粒的亚组。根据需要，为扩展亚组文库 的多样性，回收的噬菌体亚组可以进行诱变并且接受后续轮次的筛选。该 诱变步骤可以按照两种常见方式进行：所回收噬菌体的可变区域可以进行 诱变处理，或额外的可变氨基酸可以添加至临近原始可变序列的区域。
[0512]为了使得在早期淘选轮次中找到的结合活性肽(即结合物)多样 化，可以将阳性噬菌体测序以确定所述活性肽的均一性。随后可以根据这 些肽序列合成寡核苷酸。合成过程在每个步骤上用掺入低水平的全部碱基 进行以造成一级寡核苷酸序列轻度变异。这种(轻度)简并性寡核苷酸的混 合物随后可以通过本领域技术人员已知的方法克隆至亲和噬菌体。这种方 法产生了作为二级文库部分的原始肽序列的系统的受控变异。然而，这需 要在诱变前应当对每个阳性噬菌体进行测序，并且因此所述阳性噬菌体用 于扩大已回收的少数噬菌体的多样性。
[0513]致使所选噬菌体多样化的备选方法允许诱变回收的噬菌体的汇 集物或亚组。根据该方法，汇集从淘选过程中回收的噬菌体并分离单链 DNA。该DNA通过用如亚硝酸、甲酸或肼处理进行诱变。这些处理对DNA 产生多种损伤。随后用逆转录酶复制这种损伤的DNA，其中所述的逆转录 酶在遇到损伤部位时错误地掺入碱基。随后通过用限制性核酸酶切割而分 离出含有编码受体结合性肽的序列的节段，其中所述的限制性核酸酶对于 分布在肽编码序列侧翼的位点是特异性的。这种诱变处理的节段随后再克 隆至未受损的载体DNA，将这种DNA转化至细胞内，并且根据已知方法 产生二级文库。常用诱变方法是本领域已知的(参见例如，Myers等1985， Nucl.Acids Res.13：3131-3145；Myers等1985，Science 229：242-246；Myers， 1989，Current Protocols in Molecular Bioglogy第I卷，8.3.1-8.3.6，F. Ausubel等编辑，J.Wiley and Sons，New York).
[0514]在另一种常用方法中，可以使用多种方法向肽或发现有活性的 肽添加氨基酸。在一个实例中，分别测定在早期淘选中所选出肽的序列并 且合成包含所测定的序列和邻近简并性序列的新寡核苷酸。随后克隆这些 新寡核苷酸以产生二级文库。或者，可以使用向携带肽的噬菌体汇集物添 加第二HER结合序列的方法。根据一种方法，限制位点紧靠第一HER结 合序列安置。优选地，酶应当在其识别序列外侧切割。该识别位点可以与 第一结合序列相距几个碱基。为插入第二HER结合序列，将噬菌体DNA 汇集物消化并通过用克列诺片段补平突出端加以末端平滑化。将末端平滑 化的简并合成的双链寡核苷酸随后与该位点连接以产生紧靠第一结合序列 的第二结合序列。随后如前扩增并且筛选这种二级文库。
[0515]在一些情况下，合适的是合成较长肽以结合某些受体，在其它 情况下，想要的是提供具有由间隔区(例如接头)残基隔开的两种或多种 HER结合序列的肽。例如，结合序列可以由间隔区隔开，其中所述的间隔 区使得肽区域以不同方式呈现至受体。在结合区之间的距离可以短至1个 残基，或至少2-20个残基或多到至少100个残基。优选的间隔区是3、6、 9、12、15或18个残基长度。为探测大的结合位点或串联性结合位点(例如， 在结构域II上的表位和在结构域IV上的表位)，结合区可以由含有多达 20-30个氨基酸残基的间隔区隔开。在存在时，间隔区残基的数目一般是至 少2个残基，并且常常少于20个残基。
[0516]寡核苷酸文库可以具有由间隔区(例如接头)隔开的结合序列，并 且因此可以由下式代表：(NNK)y-(abc)n-(NNK)z，其中N和K如先前定义 (注意如先前定义的S可以替代K)，并且y+z等于约5、6、7、8或更大数 字，a、b和c代表相同或不同的核苷酸，包含编码间隔区氨基酸的密码子， n是多到约3、6、9或12个氨基酸或更多个氨基酸。间隔区残基可以是有 些柔性的，包含寡甘氨酸或寡-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸，例如旨在提供文库 结构域与大的结合位点中位点相互作用的多样性能力，其中所述的大的结 合位点因与噬菌体蛋白连接是相对不受约束的。刚性间隔区(例如寡脯氨酸) 也可以单独地或与其它间隔区(包括甘氨酸间隔区)组合而插入。可能需要 使HER结合序列相互靠近并且使用一个间隔区以使所述结合序列彼此定 向，例如通过在两种序列之间使用(如可以由序列为甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸 的间隔区提供的)转角。为了增加这种转角的稳定性，可能想要或必需在每 种可变区的两个末端之一或两个末端处添加半胱氨酸残基。所述半胱氨酸 残基随后形成二硫桥以将可变区在一个环中固定在一起，并且在这种方式 中也可以模拟环肽的作用。本领域技术人员理解也可以使用多种其它类型 的共价连接用于环化。
[0517]如上文所述的间隔区残基也可以位于HER结合序列的两个末端 之一处或两个末端处。例如，可以通过使半胱氨酸残基位于肽的两个末端 处而设计无插入性间隔区的环肽。如上文所述，柔性间隔区(例如寡甘氨酸) 可以促进肽与所选的受体相互作用。备选地，刚性间隔区可以使得肽如同 位于刚性臂的末端处那样呈现，其中残基(例如脯氨酸残基)的数目不仅决 定臂长度，也决定该臂的如此方向，其中肽在所述方向上定向。可以使用 由带电荷或不带电荷的亲水氨基酸(例如Thr、His、Asn、Gln、Arg、Glu、 Asp、Met、Lys)组成的亲水间隔区或由疏水氨基酸(例如Phe、Leu、Ile、 Gly、Val、Ala)组成的疏水间隔区来呈送该肽至在多种局部环境下的受体 结合位点。
[0518]值得注意的是，因为其大小和/或序列，一些肽可以造成其载体 噬菌体的感染性严重缺损。这导致噬菌体在每轮次淘选后在再感染及扩增 期间从群体中丢失。为了最大程度减少与缺陷感染性相关的问题，可以将 从洗脱的噬菌体制备的DNA转化至适宜的宿主细胞(例如大肠杆菌)中，优 选通过电穿孔法转化(见，例如，Dower等，Nucl.Acids Res.16：6127-6145) 或熟知的化学方法进行。将细胞培育持续一段足以表达标记物的时间，并 且如一般对DNA转化进行选择那样加以选择。扩增菌落，并且根据已建 立方法收获噬菌体用于亲和富集。在亲和富集中鉴定的噬菌体可以通过感 染至宿主细胞进行再扩增。通过在适宜的抗生素(如四环素或氨苄青霉素) 中生长而选出成功的转化体。这可以在固体培养基上或在液体生长培养基 中进行。
[0519]为生长在固体培养基上，将细胞以高密度(约108-109个转化体每 m2)培育在例如含有选择性抗生素的L-琼脂的大表面上，以形成基本上汇 合的菌苔。将细胞和突出的噬菌体从此表面上刮下并且制备噬菌体用于第 一轮淘选(见，例如Parmley和Smith，1988，Gene 73：305-318)。为生长在 液体培养中，可以将细胞培育在L-肉汤和抗生素中经过约10次或更多次 倍增。通过标准方法收获噬菌体(见Sambrook等，1989，Molecular Cloning， 第二版)。在液体培养中的生长可能因文库大小而是更便利的，而在固体培 养基上的生长可以提供扩增过程期间较少的偏向几率。
[0520]对于所需克隆的亲和富集，将通常约103-104个文库当量(一个文 库当量是每种重组体之一；含109个成员文库的104个当量是109×104＝1013 个噬菌体)，不过一般至少102个文库当量，多到约105-106个文库当量与受 体(或其部分)孵育，其中针对所述受体寻找想要的肽。所述受体处在适于 亲和富集的几种形式之一。在一个实例中，该受体固定在表面或粒子上， 并且携带肽的噬菌体文库随后根据本领域已知的方法在固定的受体上淘 选。例如，此受体可以表达在单层细胞的细胞表面上(如因转染所致，或利 用天然表达所述合适受体的细胞)。此外，HER分子的ECD部分可以与 Fc结构域连接并且选择可以针对固定在A蛋白琼脂糖上的HER-Fc复合体 进行。在此种实例中，可以针对无关Fc融合蛋白-A(或G)蛋白琼脂糖复合 体清除噬菌体展示文库。在一个备选方案中，受体与可识别的配体(其可以 经一个系索连接)结合。这种配体的具体实例是生物素。将如此修饰的受体 与噬菌体文库孵育并且结合作用随两种反应物在溶液中发生。所得的复合 体随后经生物素部分与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白结合。链霉抗生 物素蛋白可以固定在表面(如塑料平板)上或固定在粒子上，在这种情况下 复合体(噬菌体/肽/受体/生物素/链霉抗生物素蛋白)物理性地被保留；或链 霉抗生物素蛋白可以用荧光团标记，例如，旨在标记活性噬菌体/肽以通过 分选方法(例如在荧光激活细胞分选器上)检测和/或分离。
[0521]随后可以通过对更多指定的靶(例如任意的亚结构域I-IV中鉴 定的表位区域)淘选而促进结合性噬菌体的富集。因此，例如，根据HER 分子的目的亚结构域(例如在SEQ ID NO：54-61任意项(亚结构域I和III) 中、在SEQ ID NO：62-93任意项(亚结构域II)中和/或在SEQ ID NO： 94-125或405任意项(亚结构域IV)中所述的任意一种或多种目的亚结构 域)，可以针对各种合成肽进一步筛选阳性噬菌体克隆。噬菌体可以针对 SEQ ID NO：54-125或405任意项中所述的各种合成肽进行富集。这种富 集将允许确定HER家族受体上的噬菌体结合位点。为鉴定作为泛HER治 疗剂的那些分子，也可以在其它HER家族受体即在HER-Fc-A蛋白琼脂 糖复合体上或在表达其它HER受体的单层细胞上进行后续筛选，以鉴定 与多于一种HER家族受体结合的那些分子。
[0522]在每个步骤中，通过洗涤而除去因非特异性相互作用与HER家 族受体结合的噬菌体。确定每种目的受体/肽的所需洗涤程度和严格性。可 以通过调节结合性孵育以及后续洗涤的条件对回收的肽的结合特征产生一 定程度的控制。温度、pH、离子强度、二价阳离子浓度和洗涤的体积及持 续时间将选择对该受体具有特定范围亲和力的肽。基于慢解离速率的选择 是最实用的方法，其中所述的慢解离速率通常预示高亲和力。这可以通过 在饱和量的游离配体存在下持续孵育或通过增加洗涤的体积、次数和时间 长度而进行。在每种情况下，防止解离的肽-噬菌体再结合，并且随时间增 加，回收到亲和力越来越高的肽-噬菌体。可以额外地调整结合和洗涤流程 以找到在特定条件下结合受体的肽。一旦已知赋予受体分子一些亲和力和 特异性的肽序列，则可以围绕这种结合基序建立多样性。例如，可变的肽 区域可以安置在所鉴定序列的两个末端之一或两个末端上。已知序列可以 从文献中确定或可以衍生自早期轮次的淘选。ii.多聚体多肽(异二聚体肽)
[0523]可以通过共价连接两种或多种已鉴定(如使用噬菌体展示技术鉴 定)的结合肽的氨基酸序列制备多聚体多肽(配体)。根据多价配体的预期目 的，可以合并与HER分子上的相同或不同结构域位点结合的多肽以形成 单个分子。在构建多价配体以与不同受体或受体的不同亚结构域上的相同 或相应位点结合时，用于与该受体结合的肽配体的氨基酸序列可以是相同 或不同的，条件是如果使用不同氨基酸序列，则它们均与相同位点结合。 可以类似地制备其它的细胞表面特异性多肽。
[0524]多价多肽可以通过表达分别与各个位点结合的氨基酸序列并且 随后将它们共价连接在一起，或通过将所述多价配体表达为单一氨基酸序 列而制备，其中所述的单一氨基酸序列在其内部含有用于结合的特异性氨 基酸序列的组合。与亚结构域中或亚结构域之间的不同位点结合的氨基酸 多肽的合并可以用来产生这样的分子，所述分子是亲和力更高的肽配体或 能够使HER受体上的不同亚结构域交联在一起。
[0525]无论通过重组基因表达产生或通过常规连接技术产生，多种多 肽可以通过长度各异的接头偶联。在重组地表达所连接序列并且基于平均 氨基酸长度约4埃的情况下，用于连接两种氨基酸序列的接头一般是约3 至约12个氨基酸长度。可以通过选择用来构建接头的氨基酸而调节在氨基 酸序列之间的接头的柔性程度。甘氨酸与丝氨酸的组合用于产生柔性、相 对不限制的接头。可以在连接序列中使用具有更复杂侧链的氨基酸而构建 刚性更高的接头。
[0526]在一个实例中，多聚体构建体的制备物包括一种或多种结合肽。 例如，因与结合靶而由噬菌体展示法鉴定的肽是生物素化的并且与抗生物 素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白复合以形成四聚物构建体。 这些四聚物构建体随后与靶或其部分(例如表达想要的HER靶的细胞和不 表达所述靶的细胞)孵育，并且检测与所述四聚物构建体的结合作用。可以 使用本领域已知的任何检测方法检测结合作用。例如，为了检测结合作用， 抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白可以与可检测标记 (例如放射标记物、荧光标记物或发生颜色变化的酶标记物，如HRP(辣根 过氧化物酶)、TMB(四甲基联苯胺)或碱性磷酸酶)缀合。任选地可以在血 清存在下筛选多聚体复合物。因此，该测定法还可以用来迅速评估血清对 肽与靶结合的影响。
[0527]生物素化肽优选地与中性抗生物素蛋白-HRP (neutravidin-HRP)复合。中性抗生物素蛋白显示与除了其它替代物之外 的分子的非特异性较低结合作用，其原因在于缺乏结合凝集素的糖部分和 缺乏中性抗生物素蛋白中结合细胞黏附受体的RYD结构域(参见例如， Hiller等(1987)Biochem J.248：167-171；Alon等(1990)Biochem.Biophys. Res.Commum.，170：236-41)。
[0528]生物素/抗生物素蛋白复合体的使用允许相对容易地制备含有 1-4种不同结合肽的四聚物构建体。此外，可以通过包含与相同靶上不同表 位结合的两种或多种靶向性部分而增加靶向性构建体的亲和力和亲合力。 本文中所述的筛选测定法可以用于鉴定结合多肽的组合，其中所述的结合 多肽具有增加的亲和力和/或当在此类多聚物构建体中包含时交联不同的 亚结构域(即旨在稳定束缚构象)。b.计算机辅助的优化
[0529]可以用于鉴定有药学活性的泛HER治疗分子的另一种方法是使 用计算机辅助的优化技术以找到针对配体产生更高亲和力的可能突变。实 施例提供有关如何可能使用此类计算机辅助的优化技术的指导。例如，可 以按照这种方式产生对配体具有增强结合作用的HER1、HER2、HER3 或HER4并且用作组分以产生异多聚体、同多聚体及其混合物。c.示例性筛选测定法
[0530]本文中还提供鉴定有药学活性的泛HER治疗分子的筛选测定 法。可以使用针对特定细胞表面受体活性的已知测定法类似地鉴定泛细胞 表面特异性分子。
[0531]泛治疗分子包括例如1)肽(如可溶性肽，其包括带Ig尾的融合肽) 和随机肽文库的成员(见，例如，Lam等1991，Nature 354：82-84；Houghten 等1991，Nature 354：84-86)和由D-和/或L-构型氨基酸制成的组合化学衍 生性分子文库；2)磷酸肽(例如，随机性和部分简并性定向磷酸肽文库的成 员，参见例如Songyang等，1993，Cell，72：767-778)；3)抗体(例如多克隆 抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体和单链抗体以 及抗体的Fab、F(ab′)2、Fab表达文库片段和抗体的表位结合片段)；和4) 有机和无机小分子。示例性分子是从噬菌体展示技术中鉴定的肽配体，如 本文以上所述。
[0532]试验分子也可以包括众多化学品类别，尽管它们一般是有机分 子、优选具有大于50且小于2500道尔顿分子量的小分子有机化合物。此 类分子可以包含对于结构性地与蛋白质相互作用、尤其氢键作用所需的官 能团，并且一般包括至少氨基、羰基、羟基或羧基，优选地包含至少两种 化学官能团。所述分子往往包含用一个或多个上述官能团取代的环碳或杂 环结构和/或芳族或多芳族结构。所述分子可以获自众多广泛的来源(包括 合成化合物或天然化合物的文库)。合成化合物文库可商业地从例如 Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton， NJ.)，Brandon Associates(Merrimack，N.H.)和Microsource(New Milford， Conn.)获得。稀有化学品文库可从Aldrich Chemical Company， Inc.(Milwaukee，Wis.)获得。包含细菌、真菌、植物或动物提取物的天然化 合物文库例如可从Pan Laboratories(Bothell，Wash.)获得。此外，众多方 法可用于随机合成和定向合成众多类型的有机化合物和生物分子，包括表 达随机化寡核苷酸。
[0533]备选地，可以轻易地产生处于细菌、真菌、植物和动物提取物 形式的天然化合物文库。用于合成分子文库的方法是可轻易获得的(见，例 如，DeWitt等1993，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：6909；Erb等1994，Proc. Natl.Acad.Sci USA 91：11422；Zuckermann等1994，J.Med.Chem. 37：2678；Cho等1993，Science 261：1303；Carell等1994，Angew.Chem. Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33：2061；和Gallop等1994，J.Med.Chem.37：1233)。此外，天然化合物 或合成性化合物文库以及化合物可以通过常规化学方法、物理方法和生物 化学方法轻易地加以修饰(见，例如，Blondelle等1996，Trends in Biotech. 14：60)并且可以用来产生组合文库。在另一种方法中，先前鉴定的药学试 剂可以进行定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化 (amidification)，并且可以对类似物筛选HER调节活性。
[0534]用于产生组合文库的众多方法是本领域已知的，包括涉及生物 学文库法；空间可寻址平行固相或液相文库法；需要去褶合的合成性文库 法；“一珠一种化合物”文库法；以及使用亲和层析选择的合成文库法的那 些方法。生物学文库法限于多肽或肽文库，而其它四种方法适用于多肽、 肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(K.S.Lam，1997，Anticancer Drug Des.12：145)。
[0535]文库可以在溶液中通过本领域通常已知的用于确定配体是否竞 争性地结合在共同结合位点上的方法进行筛选。此类方法可以包括筛选在 溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques 13：412-421)或在珠上(Lam， 1991，Nature 354：82-84)、在芯片上(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、在 细菌或孢子上(Ladner，美国专利号5,223,409)、在质粒上(Cull等1992， Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott和Smith， 1990，Science 249：386-390；Devlin，1990，Science 249：404-406；Cwirla等， 1990，Proc.Nat.Acad.Sci USA 97：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol. 222：301-310；Ladner，见上文)的文库。任一种所述文库(包括其任何试验分 子)可以与HER分子的全部或部分(如在亚结构域I、II、III或IV中鉴定 的和在SEQ ID NO：54-125任意项中描述的HER表位区域的任何部分)接 触并且可以评估试验分子与HER ECD或其部分的相互作用。可以鉴定显 示与所述表位区域中至少一种或多种表位区域相互作用的候选泛HER治 疗剂。此类泛HER治疗剂还将显示与至少一种或多种全长HER分子或其 ECD部分、一般至少两种或至少三种HER分子的相互作用。
[0536]在所述筛选测定法是结合测定法的情况下，HER的全部或部分 或其HER ECD的全部或部分(如在SEQ ID NO：54-125和405中描述的肽 表位中的任一种或试验分子)可以与标记物连接，其中所述的标记物可以直 接或间接地提供可检测信号。多种标记物包括放射性同位素、荧光分子、 化学发光分子、酶、特异性结合分子、粒子(例如磁性粒子)等。特异性结 合分子包括配对物，如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛 (antidigoxin)等。对于特异结合性成员，互补性成员通常根据已知方法，用 提供检测作用的分子进行标记。可以在筛选测定法中包括多种其它试剂。 这些试剂包括可以用来促进最佳的蛋白质-蛋白质结合作用或减少和/或减 少非特异性或背景相互作用的试剂，如盐、中性蛋白质(例如白蛋白)、去 垢剂等。可以使用改善测定法效率的试剂，如蛋白酶抑制物、核酸酶抑制 物或抗微生物药。所述组分以任何顺序添加以产生必要的结合作用。在促 进最佳活性的任何温度上，一般在4℃至40℃上进行孵育。根据最佳活性 选择孵育时间，不过也可以对孵育时间优化以促进迅速的高通量筛选。通 常，0.1-1小时是足够的。一般而言，多种所测定的混合物是用不同的测试 物质浓度平行地运行以获得针对这些浓度的不同应答。一般，这些浓度的 一个浓度起到阴性对照作用，即处于零浓度或低于检测水平。
[0537]在一个实例中，可以如上文所述针对噬菌体展示文库筛选与 HER受体分子或其部分结合的配体。已经公开了构建及分析这些文库的细 节以及用于生物淘选和选择结合物的基本方法(见，例如，WO 96/04557； Mandecki等1997，Display Technologies--Novel Targets and Strategies，P. Guttry(编辑)，International Business Communications，Inc.Southborogh， Mass，第231-254页；Ravera等1998，Oncogene 16：1993-1999；Scott和 Smith，1990，Science 249：386-390)；Grihalde等，1995，Gene 166：187-195； Chen等1996，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：1997-2001；Kay等1993，Gene 128：59-65；Carcamo等1998，Proc.Natl.Acad.Sci USA 95：11146-11151； Hoogenboom，1997，Trends Biotechnol.15：62-70；Rader和Barbas，1997， Curr.Opin.Biotechnol.8：503-508；所述的全部文献通过引用的方式并入本 文)。
[0538]针对已知药学活性化合物而设计模拟物是一种基于“先导 (lead)”化合物而开发药物的已知方法。当活性化合物难以合成或其合成 昂贵或该化合物不适合特定的施用方法，例如，肽通常对于口服组合物而 言是不适宜的活性物质，因为它们易于被消化道内的蛋白酶迅速降解，所 述开发药物的方法是令人想要的。通常利用模拟物设计、合成和测试来避 免针对某种靶特性大规模筛选分子。
[0539]在设计源自具有给定靶特性的化合物的模拟物时存在共同采用 的几个步骤。首先，确定在决定所述靶特性方面是关键和/或重要的该化合 物的特定部分。在肽的情况下，这可以通过系统地变动在该肽中的氨基酸 残基(例如通过依次置换每个残基)而进行。构成该化合物的活性区的那些 部分或残基称作该化合物的″药效团″。
[0540]一旦已经找到药效团，则根据该药效团的物理特性(例如立体化 学、结合、大小和/或电荷)，使用一系列来源的数据(例如光谱技术、X射 线衍射数据和NMR)对其结构建模。可以在建模过程中使用计算性分析法、 相似性作图法(其对药效团的电荷和/或体积建模，而非原子间结合作用)和 其它技术。在所述方法的改变形式中，对配体及其结合配偶体的三维结构 建模。尤其在配体和/或结合配偶体于结合时改变构象的情况下，这可以是 尤其有用的，从而允许该模型将这一点考虑到模拟物的设计中。随后选择 模板分子，并且可以将模拟该药效团的化学基团移植到此模板上。可以方 便地选择模板分子和被移植到此模板分子上的化学基团，从而模拟物容易 合成，这是药学可接受的，不在体内降解并且保留先导化合物的生物学活 性。随后筛选所找到的模拟物以确定它们显示靶特性的程度或它们抑制所 述靶特性至何种程度。随后可以实施进一步优化或修饰以获得用于体内测 试或临床测试的一种或多种最终模拟物。
[0541]可以测试在上文所述方法中鉴定到的泛HER治疗剂功能性地 调节一种或多种HER活性的能力。此类活性是本领域技术人员已知的并 且在上文G部分中描述。此类测定法的示例包括配体结合、细胞增殖、细 胞磷酸化和复合/二聚化。因此，可以在进一步的筛选测定法中测试本文中 因基于与HER分子或其部分的高亲和力结合而被鉴定为候选物的任何候 选泛HER治疗剂以确定该候选治疗剂是否拥有泛HER治疗剂特性，即针 对HER激活的抑制特性。例如，最佳地靶向在结构域II中的二聚化臂的 泛HER治疗剂将抑制HER分子与自身或与其它HER家族分子的二聚化。 类似地，在缺乏二聚化的情况下，也预期这种候选治疗剂将抑制HER分 子在受适宜配体刺激时诱导细胞磷酸化或细胞增殖的能力。在另一个实例 中，起到使系索稳定的作用(例如通过交联结构域II和IV)的泛HER治疗 剂将抑制HER分子转变成激活状态的能力。因此，可以测试这种候选泛 HER治疗剂调节(一般抑制)二聚化或细胞活化的能力，其中所述的细胞活 化由配体存在下所刺激的细胞增殖或细胞磷酸化进行评估。在额外的实例 中，可以通过分析任意一种或多种HER家族与配体的结合作用而测试候 选泛HER治疗剂抑制配体结合的能力，其中所述配体包括但不限于EGF、 双调蛋白、TGF-α或任一种神经调节蛋白(即HRGβ)。所鉴定的泛HER治 疗剂将调节(一般抑制)针对至少两种HER受体的一种或多种的上文所述的 HER介导性活性。K.实施例
[0542]仅出于示例性目的而包括以下实施例，并且不意图限制本发明 的范围。实施例1HER胞外结构域的克隆
[0543]克隆并表达了含有HER分子的全部或部分胞外结构域的多种 HER衍生物。A.克隆HER ECD衍生物
[0544]HER1-621(SEQ ID NO：12)如下克隆：将胞外结构域(全长HER1 受体的氨基酸序列的第1-621位氨基酸(从Gail Clinton获得；SEQ ID NO：2))进行PCR扩增并借助KpnI-XhoI限制性位点而亚克隆至 pcDNA3.1Myc-His载体(Invitrogen；还参见pcDNA3.1 Myc-His的序列 SEQ ID No.161)以产生pcDNA/HER1-621-myc-His载体。
[0545]HER3-621(SEQ ID NO：26)如下克隆：将胞外结构域(全长HER3 受体的氨基酸序列的第1-621位氨基酸(见，SEQ ID NO：6))进行PCR扩增 并借助KpnI-Xbal限制性位点而亚克隆至pcDNA3.1Myc-His载体以产生 pcDNA/HER3-621-myc-His载体。
[0546]克隆了额外的ECD衍生物。在下表描述它们的设计和相应的编 码性核酸和编码的氨基酸序列标识：
[0547]图2(A)-2(D)描述了这些已克隆同工型中的每一种与其相应关联 受体的比对结果B.蛋白质表达和分泌
[0548]为在人细胞中表达HER ECD衍生物，将人胚肾293T细胞以 2×106个细胞/孔接种在6孔平板中并且维持于Dulbecco改良的Eagle培养 基(DMEM)及10％胎牛血清(Invitrogen)中。使用LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)，根据制造商说明书转染细胞。在转染当日，5μg质粒DNA 与在0.5ml无血清DMEM中的15μl LipofectAMINE 2000混合。将混合物 在室温孵育20分钟，随后添加至细胞上。将细胞在37℃于CO2培养箱内 孵育48小时。为研究HER ECD衍生物的蛋白质分泌作用，收集条件培养 基48小时。通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离、随后使用抗His抗体 (Qiagen)的免疫印迹法分析此条件培养基。将抗体1∶5000稀释。
[0549]对来自培养的人细胞的培养基评估每种HER ECD衍生物的分 泌作用。在下表10中描述对HER ECD衍生物分泌的比较。
实施例2HER-Fc融合制备物和蛋白质表达
A.人IgG1的Fc片段的克隆
实施例2HER-Fc融合制备物和蛋白质表达
A.人IgG1的Fc片段的克隆
[0550]使用以下的正向及反向引物对从单链cDNA汇集物中PCR扩增 出人IgG1的Fc片段(在SEQ ID NO：167中描述，并对应于SEQ ID NO：163 中所述的氨基酸序列的氨基酸Pro100-Lys330)：5′CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT ACT C 3′(SEQ ID NO：49)
5′TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(SEQ ID NO：50)
PCR片段经凝胶纯化并亚克隆至pDrive克隆载体(Qiagen PCR克隆 试剂盒，Qiagen，Valencai CA，SEQ ID NO：160)以产生pDrive/IgG1Fc。
B.Fc与HER胞外结构域的融合
5′TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(SEQ ID NO：50)
PCR片段经凝胶纯化并亚克隆至pDrive克隆载体(Qiagen PCR克隆 试剂盒，Qiagen，Valencai CA，SEQ ID NO：160)以产生pDrive/IgG1Fc。
B.Fc与HER胞外结构域的融合
[0551]HER1-621/Fc(SEQ ID NO：40)如下克隆：pcDNA/ HER1-621-myc-His载体用XhoI和AgeI进行限制性消化。使用Qiagen 凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化所切割的质粒。使用以下的引物从 pDrive/IgG1Fc载体PCR扩增出人IgG1Fc片段：5′ATTA CTCGAG GGA CGA ATG GAC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT C 3′(含有XhoI位点，SEQ ID NO：51)
5′ACTT ACCGGT TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(含有AgeI 位点，SEQ ID NO：52)。
经PCR扩增的Fc片段用XhoI和AgeI消化并连接至消化的pcDNA/ HER1-621-myc-His载体中。
5′ACTT ACCGGT TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(含有AgeI 位点，SEQ ID NO：52)。
经PCR扩增的Fc片段用XhoI和AgeI消化并连接至消化的pcDNA/ HER1-621-myc-His载体中。
[0552]HER3-621/Fc(SEQ ID NO：46)如下克隆： pcDNA/HER3-621-myc-His载体用XbaI和AgeI进行限制性消化。使用 Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化已切割的质粒。用以下引物从pDrive/IgG1Fc 中PCR扩增出人IgG1Fc片段：5′ATTA TCTAGA GGA CGA ATG GAC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT C(含有XbaI位点，SEQ ID NO：53)
5′ACTT ACCGGT TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(含有AgeI 位点，SEQ ID NO：52)。
5′ACTT ACCGGT TTT ACC CGG GGA CAG GGA G 3′(含有AgeI 位点，SEQ ID NO：52)。
[0553]经PCR扩增的Fc片段用XbaI和AgeI消化并连接至消化的 pcDNA/HER3-621-myc-His载体中。
[0554]类似地制备另外的融合构建体。全部的所得融合构建体通过 DNA测序验证。下表中描述示例性Fc融合蛋白构建体：
C.蛋白质表达和分泌
C.蛋白质表达和分泌
[0555]为产生HER-Fc嵌合蛋白，如实施例1中描述，使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)分别转染HER ECD Fc融合构建体 (HER1-621/Fc；HER3-621/Fc；HER2-650/Fc；HER4-650/Fc)至293T细 胞中。在转染后48小时收集条件培养基。在变性蛋白质凝胶上分离等量的 条件培养基(20μl)。用抗His(Qiagen)抗体或抗Fc(Sigma)抗体探测蛋白质印 迹物以检验蛋白质表达和分泌。在下表12中描述对HER ECD衍生物分泌 的比较。
[0556]为产生HER1和HER3的多聚体，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据制造商说明书，分别将HER Fc融合构建体 (HER1-621/Fc和HER3-621/Fc)共转染至293T细胞。来自每次转染的条件 培养基在转染后48小时收集。在变性蛋白质凝胶上分离等量的条件培养基 (20μl)。用抗His(Qiagen)抗体或抗Fc(Sigma)抗体探测蛋白质印迹物以检验 蛋白质表达和分泌。
[0557]为表达异二聚体RB200h(又叫做HFD100/300H(将全长HER1 ECD经Fc结构域与全长HER3ECD连接)，Her1和Her3的构建体以 1∶3(Her1∶Her3)比例共转染。在转染5小时后，将培养基更换为 DMEM+1％FBS(低IgG)。在转染4天后收集第一条件培养基，随后补料 并且进行第二次收集。
[0558]使用之前适应于无血清培养基(FreeStyle 293)的CHO细胞和 HEK 293T细胞实施悬浮细胞蛋白质表达。将HEK 293T细胞以1×106个 细胞/ml随Freestyle 293培养基(Invitrogen)接种于WaveBioReactor中。 次日，使用1∶2比例的25kD线性PEI(Polysciences)∶DNA将HER ECD构 建体(HER1-621/Fc和HER3-621/Fc)转染至293T细胞内。为表达异二聚体 RB200h，Her1和Her3的构建体以1∶3(Her1∶Her3)比例共转染。在转染5 小时后，将培养基体积加倍。每日监测活细胞和蛋白质产生。在转染6日 后，收集条件培养基。实施例3HER(HF)衍生物和HER-Fc(HFD)分子的纯化
[0559]带后缀“T”的全部HF分子含有羧基端6-组氨酸尾用于金属亲和 纯化。使用Ni亲和金属层析法，随后利用制备型大小排阻层析法(SEC)纯 化全部这些分子。首先，将含有分泌型HF分子的条件培养基(CM)通过离 心(30分钟，10K转/分钟)净化并随后过滤(0.3微米)。随后使用Pall切向流 浓缩器(Pau Corporation，Ann Arbor，MI)将净化的CM浓缩4倍以产生终 体积至大约400ml。
[0560]通过添加10×Ni-NTA上样缓冲液使CM达到50mM NaPO4(pH 8.0)和350mM NaCl。随后将溶液以流速0.6ml/分钟加载到用缓冲液A(缓 冲液A：50mM NaPO4(pH 8)，350mM NaCl)预平衡的1.5ml镍亲和金属 层析柱(Ni-NTA Agarose，Qiagen，Germany)上。在加载后，用缓冲液A洗 涤该柱直至在280nm处的吸光度指示没有留下未结合的蛋白质。随后通过 缓冲液A+150mM咪唑的等度梯度洗脱HF分子。合并含有HF分子的峰 级分并浓缩至1ml，随后加载至制备型SEC柱(Superose 12 10/300GL， Amersham Biosciences，Sweden)上。通过免疫印迹法，用辣根过氧化物酶 缀合的小鼠抗His6-标签抗体(HyTest Ltd.，Turku，Finland)鉴定含有HF单 体的峰级分。实施HF分子的氨基酸测序以证实每种分子。
[0561]HFD100/HFD300T异二聚体是HFD100和HFD300T的Fc融合 物。产生这种分子的瞬时转染也产生名为HFD100和HFD300T的同二聚 体。HFD300T同二聚体和HFD100/HFD300T异二聚体通过Ni-NTA亲和 层析法(Ni-NTA Agarose，Qiagen，Germany)进行纯化，因为HF300T含有 羧基端6-组氨酸标签。条件培养基(CM)如上所述净化并浓缩。所得的CM 加载到1.5ml A蛋白柱(nProtein A Sepharose 4 Fast Flow，Amersham Biosciences，Sweden)上并且用免疫纯IgG洗脱缓冲液(Pierce，Rockford，IL) 洗脱。在洗脱后，通过添加50μl 1M tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和级分。合 并含有蛋白的级分并且使溶液达到50mM NaPO4(pH 8.0)和350mM NaCl。将该合并物加载到用缓冲液A预平衡的1.5ml镍亲和金属层析柱 (Ni-NTA Agarose，Qiagen，Germany)。收集含有HFD100同二聚体的流出 物(流出液)。用缓冲液A洗涤后，以缓冲液A+150mM咪唑的等度梯度洗 脱HFD300T同二聚体和HFD100/HFD300T异二聚体蛋白。
[0562]通过使用3ml CNBr活化的Sepharose 4 Fast F1ow珠 (Amersham Biosciences，Finland)，将10mg EGF(R&D Systems， Minneapolis，MN)共价地连接至琼脂糖凝胶(sepharose)固体支持物而产生 10ml EGF亲和柱。合并来自Ni-NTA洗脱液的峰级分并立即在所述EGF 亲和柱上层析。收集流出液中与HFD300T相对应的峰。用IgG洗脱缓冲 液洗脱HFD100/HFD300T异二聚体，并合并含有蛋白质的级分并立即在 制备型SEC柱(Superose 12 10/300GL，Amersham Biosciences，Sweden)上 层析。该步骤除去在EGF亲和柱步骤期间所洗脱出的任何EGF。将含有 纯化的HFD100/300T的级分用50μl 1M tris缓冲液(pH 8.0)中和、将缓冲 液改变为PBS并用30kD截断值Amicon离心过滤柱(Millipore，Billerica， MA)浓缩。
[0563]通过如此方式纯化RB600，即从实施例2中的转染细胞取得条 件培养基并且通过在4℃在12,000×g离心15分钟进行净化，随后经3μm Versapore 3000T滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)过滤。将净化的条 件培养基经30kDa截断值的Ultrasette Screen Channal切向流过滤装置 (Pall Corporation，East Hills，NY)浓缩10倍并施加至MabSelect SuRe亲和 柱(GE Healthcare Biosciences AB，Sweden)。此柱用含有0.1％(v/v)TX-114 的PBS彻底洗涤并用IgG洗脱缓冲液(Pierce Biotechnology Inc.，Rockville， IL)洗脱。洗脱的级分立即以1M Tris-HCL中和至pH 8.0。
[0564]在此阶段，从MabSelect SuRe亲和柱洗脱的含有Fc的蛋白质 由RB200h异二聚体以及HFD100和HFD300h同二聚体组成。RB200h异 二聚体以及HFD100和HFD300h同二聚体的这种混合物叫做RB600。在 对PBS(RB600)透析后，这种同二聚体/异二聚体混合物直接作为混合物使 用，或用作原材料用以进一步纯化RB200h(经Fc结构域与全长HER3ECD 连接的全长HER1ECD；又叫做HFD1000/HFD300H)。RB200h的结构示 于图4。纯度分析
[0565]使用分析性反相HPLC来确定蛋白质纯度。使用应用于AKTA： Purifier System(GE-Healthcare)的来自Kromasil的分析性C4柱(150×46 mm；5mm；100A)进行蛋白质的反相HPLC。缓冲液A由在水中的 0.1％TFA(v/v)构成并且缓冲液B含有25％2-丙醇；75％乙腈； 0.1％TFA(v/v)。一般，加载50-100mg蛋白质并且使用5-95％缓冲液B的 线性梯度来洗脱样本(流速＝0.5ml/分钟；梯度＝6％/分钟)。
[0566]在该系统的条件下，首先洗脱含有2条erbB3链的同二聚体， 随后是异二聚体(RB200h)，然后是erbB1同二聚体。使用两种方法进行峰 指定。首先，使用从单一转染的细胞(仅编码一种多肽链)中纯化的标准物 来鉴定同二聚体峰(见图5)。其次，提交来自每个峰的级分进行氨基端测序 (Stanford：PAN设施)以验证原初指定结果(数据未显示)。
[0567]纯化方案使用A蛋白柱、Ni-琼脂糖凝胶柱和EGFR-Affybody 柱的组合。通过SDS PAGE和反相HPLC判定纯化的RB200h具有＞90％ 的纯度。如分析性反相HPLC色谱柱法显示，RB200h(经Fc结构域与全 长HER 3 ECD连接的全长HER 1 ECD)是纯的，具有不超过10％的HFD 100与HFD 300的联合混杂(图5)。实施例4HER ECD或HER-Fc与配体的结合
A.HER ECD衍生物与表皮生长因子(EGF)的结合
A.HER ECD衍生物与表皮生长因子(EGF)的结合
[0568]HER1(HER1)、HER2、HER3和HER4的胞外结构域融合于人 Fc(见实施例1和2)以产生嵌合多肽。HER ECD(HER-T)或HER-Fc从来 自细胞的条件培养基中获得，其中所述的细胞用相关载体转染(见上文实施 例1和2)。上清液从用相关cDNA构建体瞬时转染的293T细胞收集。如 下确定放射标记的EGF(Amersham)对含有HER1-621/Fc、HER2-650/Fc、 HER3-621/Fc、HER4-650/Fc、HER1-501/Fc、HER1-621(T)、HER1-501(T) 的上清液的结合：通过将20μl上清液与在Hepes缓冲液(pH 7.5)中的5nM 125I-EGF于1000×过量的冷EGF存在或不存在下在室温混合2小时实施 结合。在结合测定法结束时，添加化学交联接头BS3(Pierce)以交联结合的 分子。将样本在SDS-PAGE凝胶上分离并且暴露胶片用于检测。归一化与 HER分子结合的估计的125I至等摩尔浓度。结果显示125I-EGF仅与HER1 衍生物结合，并且没有检测到125I-EGF与HER2-650/Fc(HFD200)、 HER3-650/Fc(HFD300)或与HER4-650/Fc(HDD400)的结合。125I-EGF与 HER1-621/Fc(HFD100)的结合受过量的冷EGF竞争。
[0569]使用抗HER1抗体(R&D Systems)进行蛋白质印迹，然后用光密 度测定法来评估HER1-衍生物的相对水平，并且随后用来归一化与每种蛋 白质的配体结合作用。结果显示HER1-621/Fc(HFD100)比 HER1-501/Fc(HFD110)和HER1-501(HF110)具有对125I-EGF的更大结合 亲和力，并且比无Fc的全长HER1ECD(HER1-621；HF100)具有大得多 的结合亲和力。下文证明Fc融合物在表达后形成二聚体。因此，这些配体 结合作用结果显示由Fc部分介导的融合/二聚化作用恢复了HER1的全长 ECD的高亲和力结合作用，其超过HER1-501单体分子的亲和力结合作用。
[0570]另外的实验证实与HF100相比，HFD100(HER-621/Fc)和 HFD110(HER1-501/Fc)显示与125I-EGF配体明显增加的结合，而HF110 不显示与125I-EGF的可检测结合。此外，如所预期，数据表明 HER1/HER3(HFD100/HFD300)异二聚体比HF100和HF110明显更多地与 125I-EGF结合，但是比HFD100或HFD110同二聚体更少地与125I-EGF结 合。B.HER ECD衍生物与Her调节蛋白(HRG)的结合
[0571]使用如上文A部分对EGF结合作用所述的相似测定法，实施 HER ECD衍生物与Her调节蛋白的结合。简而言之，从用cDNA构建体 瞬时转染的293T细胞中收集上清液，其中所述的DNA构建体编码 HF300(HER3-621)、HF310(HER3-501)、HFD300(HER3-621/Fc)、 HFD310(HER3-501/Fc)和纯化的HFD110/HFD310异多聚体(通过IgG1的 Fc片段连接的HF110和HF310的构建体)。通过将增加量的上清液(从 2.5μl-20μl上清液)与5nM125I-HRG在20μl Hepes缓冲液(pH 7.5)的总体积 中于室温混合2小时实施结合。在结合测定法结束时，添加1mM BS3以 交联结合的分子。在SDS-PAGE凝胶上分离结合反应物。将所述蛋白质凝 胶干燥并暴露于胶片2小时和6小时。
[0572]结果显示所测试的全部衍生物某种程度地结合HRG，尽管水平 各异。对于所测试的全部衍生物，结合作用是剂量依赖性的，并在20μl 上清液时观察到最大结合作用。使用抗HER3抗体(R&D Systems)进行的 平行蛋白质印迹法，然后用光密度测定法来评估HER3-衍生物的相对水平 并且随后用来基于相等的结合位点数目而归一化与每种蛋白质的配体结合 作用，其对于抗HER3结合位点是等价的。在这种归一化后，结果证实 HRG显示与HF300分子的最低结合作用，与测试的其余衍生物相比，仅 是其结合作用的约10％。在归一化后，HF310、HFD300、HFD310和 HFD110/HFD310均显示与HRG的等效结合作用。C.对HER衍生物与表皮生长因子(EGF)及Her调节蛋白(HRGβ)结合 的比较性分析
[0573]通过测试多种HER衍生物与125I-EGF(HER1的一种天然配体) 和125I-HRG(HER3和HER4的一种天然配体)的结合而比较所述HER衍 生物特异性。放射标记的EGF与HER1-621/Fc、HER2-650/Fc、 HER3-621/Fc、HER4-650/Fc的结合作用如上文所述测定。使用如对125I-EG F的结合作用所述的相同条件测定125I放射标记的HRG与HER1-621/Fc、 HER2-650/Fc、HER3-621/Fc、HER4-650/Fc的结合。用抗His抗体探测 蛋白质印迹物以比较蛋白质水平。结果显示放射标记的EGF仅与 HER1-621/Fc结合并且不与测试的其它分子结合。放射标记的HRG仅与 HER3-621/Fc和HER4-650/Fc分子结合。
[0574]测试来自细胞的条件培养基与125I-EGF和125I-HRG的结合作 用，其中所述的细胞用HER1-621/Fc和HER3-621/Fc(见实施例2)或 HER1-501/Fc和HER3-501/Fc共转染。数据显示用 HER1-621/Fc：HER3-621/Fc共转染的细胞产生与放射标记的EGF结合和 与HRG结合的蛋白质。
[0575]用抗HER1抗体和抗HER3(R&D Systems)探测蛋白质印迹物以 比较蛋白质水平。放射标记配体的结合作用与共转染细胞所表达蛋白质的 量成正比，其中所述的蛋白质包括HER1/HER1同二聚体、HER1/HER3 异二聚体和HER3/HER3同二聚体。
[0576]HER1-621/Fc同二聚体(称作HFD100)结合125I-EGF，而 HER3-621/Fc 同二聚体(HFD300)和HER4-625/Fc(HFD400)结合 125I-HRG1β1(图6a)。HER2-628/Fc(HFD200)不显示任何可检测的125I-EGF 或125I-HRG1β1结合作用(图6a)。数据显示HFD100、HFD200、HFD300 和HFD 400保留其对EGF和HRG1bl的特异性(图6a)：泳道1：HFD100 ＝HER1-621/Fc、泳道2：HFD200＝HER2-628/Fc、泳道3：HFD300＝ HER3-621/Fc并且泳道4：HFD400＝HER4-625/Fc。在平行研究中，这些 配体的交联作用可以被其相应的非标记配体竞争，表明这种结合作用是特 异性的。
[0577]制备嵌合构建体HER1-621/Fc和HER3-621/Fc(称作RB200h) 以产生泛HER配体结合性HER调蛋白。使用125I-EGF或125I-HRG1β1， 通过交联研究测试这种分子(RB200h)结合HER1或HER3配体的能力。数 据显示RB200h结合EGF和HRG1β1(图6b)。这些研究结果揭示在嵌合 性HER调蛋白(RB200h)中的HER1和HER3保留其结合各自配体的能力 并且提示RB200h作为候选的泛HER配体结合物。实施例5HER胞外结构域和HER/Fc分子的二聚体结构和寡聚体结 构的形成
[0578]在激活形式中，HER分子以便于与细胞表面受体二聚化形成的 方向呈现其二聚化臂。HER衍生物与Fc结构域的连接预计模拟激活受体 的″背靠背″构象。为证实HER衍生物和/或HER/Fc嵌合多肽形成多聚体， 在HER家族胞外结构域多肽上开展分子大小排阻分析。该方法学允许简 化分析受体胞外结构域联合成同二聚体或异二聚体的能力。为开展分子大 小排阻分析，将洗脱的分子与参考标准物比较。下表13显示所用的分子质 量标准物及其洗脱体积。较小的体积在柱的保留体积中洗脱出来，而较大 的分子根据其增加的分子量在较小体积中洗脱出来。
[0579]使用用PBS以流速0.7ml/分钟平衡的A TSK3000大小排阻柱 (Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA)上开展分子大小排阻分析。使用 凝胶过滤标准物(BioRad，Hercules，CA)来校准该柱。将它们的洗脱体积对 分子量作图。通过注射30μg在PBS中的每种分子，测定每种未知物的洗 脱体积，并且计算它们的表观分子量。在注射之间维持在柱上的流量。使 用分子量标准物的标准曲线确定分子量。表14汇总结果：
[0580]数据显示HER家族的几种胞外结构域形成了多聚体结构。化合 物可以捕获配体，并且形成阻止跨膜受体二聚化并且因而与跨膜蛋白结合 并干扰其活性的“假(mock)”二聚体。
[0581]HER1-501显示表观分子量112,170道尔顿，其大于预计分子量 60,000道尔顿；HER2-595显示表观分子量162,000道尔顿而预计分子量 是67,000道尔顿。HER2-530(HF220T)不形成二聚体结构，其中与 HER2-595(HF210T)相比，所述的HER2-530丢失了结构域IV中跨模块2-5 的HER2胞外结构域节段 (CSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVT CFGPEADQCVACAHYKDPPF，其对应于SEQ ID NO：16中的第508-573 位氨基酸)。后一结果表明这个丢失的节段(或节段部分)对于二聚化是重要 的。将两种多肽的序列差异在以下加下划线并用粗体标出。加阴影的序列 是所用的标签并且在两种分子中是相同的。由于标签对于这两种分子是相 同，因而它们在所观察到对二聚化的影响中不发挥作用。具有亲和标签的210(SEQ ID NO：274)
TQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV
QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT
GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA
LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP
LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE
SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR
CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES
FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP
DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH
NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC
WGPGPTQCVN
LESRG PFEQKLISEE DLNMHTGHHH
HHH
具有亲和标签的220(SEQ ID NO：275)
TQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV
QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT
GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA
LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP
LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE
SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR
CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES
FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP
DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH
NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC
WGPGPTQCVN LESRGPFEQK LISEEDLNMH TGHHHHHH
TQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV
QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT
GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA
LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP
LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE
SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR
CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES
FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP
DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH
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WGPGPTQCVN
LESRG PFEQKLISEE DLNMHTGHHH
HHH
具有亲和标签的220(SEQ ID NO：275)
TQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV
QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT
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LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE
SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR
CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES
FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP
DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH
NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC
WGPGPTQCVN LESRGPFEQK LISEEDLNMH TGHHHHHH
[0582]该数据还显示HER-Fc蛋白也形成高阶的寡聚体。HER1-621/Fc 和HER3-621/Fc均具有预计分子量180,000道尔顿，并且具有通过大小排 阻层析观察到的分别大于970,000和843,000道尔顿的分子量。因为这些 测定法在配体不存在下进行，故此结果进一步证实配体对于产生二聚化(或 更大的聚合物)结构是不需要的。实施例6
HER受体增殖和磷酸化：由HER衍生物所致的抑制
A.细胞系中的HER表达谱
HER受体增殖和磷酸化：由HER衍生物所致的抑制
A.细胞系中的HER表达谱
[0583]通过荧光激活细胞分选法(FACS)分析HER表达水平以鉴定受 体及其在多种细胞系表面上的相对数量。使所选细胞接触受体特异性抗体 并且评估受体特异性抗体结合细胞后的荧光强度。
[0584]将细胞从组织培养平板中用5nM EDTA取出并重悬于含有 1％BSA的PBS(PBS.BSA)中。在混悬液中的细胞与在分别的试管内分别 针对HER1、2、3和4的单克隆抗体在4℃孵育1小时。用第一抗体孵育 后，细胞用冷的PBS.BSA洗涤一次。随后添加以荧光染料PE(Jackson) 标记的针对小鼠或人IgG(取决于第一抗体的来源)的第二抗体。将细胞在4 ℃孵育30分钟并用PBS.BSA洗涤二次。细胞通过添加Cytofix(BD-554655) 进行固定并保持在4℃黑暗下。使用细胞分选装置(BD FACSCalibur Flow Cytometer)进行FACS。每个细胞系分析10,000个细胞。每种细胞系中每 种HER受体的平均荧光强度(MFI)通过MFI以BD CellQuest Pro软件测 量。评分：++++＞1000MFI，+++100-1000MFI，++50-100MFI，+＜50 MFI，但具有高于背景的信号。
[0585]表15描述多种细胞系中的受体HER家族的所得表达谱。
B.细胞增殖测定法
B.细胞增殖测定法
[0586]细胞系MCF7、ZR75-1、ME180从ATCC购买并且维持在 10％FBS DMEM中。将细胞以2000个细胞每孔在96孔平板中接种于补 加有1％FBS的DMEM中。接种2-3小时后，在配体(EGF或HRGβ)存在 下添加增加浓度的候选HER ECD衍生物至培养物中。将细胞在37℃孵育 约72小时。通过Alamar Blue法测量细胞相对密度。在PBS中以4μM浓 度准备Alamar Blue(Sigma)，将其以1/10培养基体积(终浓度0.4μM)添加 至微量培养板内并将平板返回培养箱。在37℃2-4小时后在激发光＝ 530nm/发射光＝590nm处读取荧光。结果
[0587]细胞增殖数据：HFD100/300制备物是比例未知的HFD100/100、 HFD300/300和HFD100/300分子的汇集物。然而，数据证实这种混杂材料 实行抑制的能力。HFD100/300抑制了受HRGβ(5nm)刺激的ME180增殖。 该数据显示约3nM HFD100/300以及针对EGF刺激的HER1具有大于 80％的抑制作用。HF310T抑制了受HRGβ刺激的MCF7增殖(在1μm时 约95％)。C.基于ELISA的HER受体磷酸化测定法
[0588]在基于ELISA的HER受体磷酸化测定法中评估HER受体的磷 酸化。多种细胞(A431，MCF7，SK-BR3、SK-OV3、MCF7/HER2)在无血清 培养基中进行血清饥饿约24小时。细胞随后用递增浓度的候选HER ECD 衍生物(见下文)在37℃处理30分钟。随后添加配体(EGF，3nM和/或 HRGβ，5nM)孵育10分钟。在处理后，细胞用PBS洗涤一次并且用添加 蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物组和磷酸酶抑制剂组， Calbiochem)的100μl 1×细胞裂解缓冲液(Cell Singaling)裂解。
[0589]细胞在冰上裂解15分钟并且将细胞裂解物加至96孔平板内， 其中所述的平板用相应的受体特异性捕获抗体(抗体从R&D System购 买)，以制造商推荐浓度(0.4-4μg/ml)和条件(在PBS中、室温、过夜)预包被。 细胞裂解物与捕获抗体平板在室温孵育3小时。平板用PBST缓冲液洗涤 3次。抗磷酸酪氨酸抗体克隆4G10HRP缀合物(Upstate)以1∶1000稀释在 1％BSA.PBS中并且以100μl/孔添加至所述平板持续1小时，以检测在酪 氨酸上磷酸化的特异性HER受体。在PBST洗涤3次后，使平板通过添 加100μl底物溶液(TMB，Sigma)显色并由50μl SDS终止液终止。通过微 量平板读数仪(Molecular Devices，VERS Amax)在650nm处测定光密度。i.HER1-501
[0590]在A431细胞和MCF7细胞中测试HER1-501抑制HER1和 HER2磷酸化的能力。在EGF存在下向细胞添加递增浓度的HER1-501， 至多到最大浓度600nM。如所预期，没有观察到MCF7细胞中HER1的 磷酸化。相反，HER1以剂量依赖性方式抑制A431细胞中HER1的磷酸 化，IC50为98nM。与该蛋白质不存在相比时，在600nM HER1-501上 所实现的对HER1磷酸化的最大抑制是约60％。HER1-501也以剂量依赖 性方式抑制MCF7和A431细胞中HER2的磷酸化，IC50分别是18nM 和42nM。与该蛋白质不存在相比时，在600nM HER1-501上所实现的对 测试的两种细胞系中HER2磷酸化的最大抑制是约50％。ii.HER2-595和HER2-530
[0591]在MCF7/HER2细胞中测试了HER2-595和HER2-530抑制 HER2和HER3磷酸化的能力。在HRG存在下向细胞添加递增浓度的 HER2-595或HER2-530(0、7.4nM、22.2nM、66.7nM、200nM和600nM)。 数据显示HER2-595和HER2-530以剂量依赖性方式抑制HER2和HER3 的磷酸化；HER2-595更强力。与该蛋白质不存在相比时，由600nM HER2-595在MCF7/HER2细胞中实现的对HER2和HER3磷酸化的最大 抑制是约55％，而与该蛋白质不存在相比时，由600nM HER2-530实现 的最大抑制是约35％。iii.HER3-621和HER3-500
[0592]在MCF7细胞中测试了HER3-621和HER3-500抑制HER3磷 酸化的能力。在HRG存在下向细胞添加递增浓度的HER3-621和 HER3-500，至多到最大浓度600nM。数据显示HER3-621和HER3-500 以剂量依赖性方式抑制HER3的磷酸化，虽然HER3-500更强力。 HER3-500的IC50是39nM，而HER3-621的IC50是48nM。与该蛋白 质不存在相比时，由600nM HER3-500实现的对MCF7细胞中HER3磷 酸化的最大抑制是约78％，并且与该蛋白质不存在相比时，由600nM HER3-621实现的最大抑制是约38％。
[0593]在SK-BR3细胞中测试了HER3-621和HER3-500抑制HER1 和HER3磷酸化的能力。在HRG存在下向细胞添加递增浓度的HER3-621 和HER3-500，至多到最大浓度600nM。在受HER3-500刺激的SK-BR3 细胞中没有观察到HER1的磷酸化。类似于MCF7细胞，HER3-621和 HER3-500以剂量依赖性方式抑制SK-BR3细胞中HER3的磷酸化，而 HER3-500更强力。与该蛋白质不存在相比时，由600nM HER3-500实现 的对SK-BR3细胞中HER3磷酸化的最大抑制是约75％，并且与该蛋白质 不存在相比时，由600nM HER3-621实现的最大抑制是约55％。iv.HER1-621/Fc
[0594]在A431细胞中测试了HER1-621/Fc抑制HER1磷酸化的能力。 在EGF存在下向细胞添加递增浓度的HER1-621/Fc(0.8nM-600nM)。 HER1-621/Fc以剂量依赖性方式抑制A431细胞中HER1的磷酸化，IC50 为8.8nM。在600nM处，HER1-621/Fc显示几乎完全抑制HER1磷酸化， 与该蛋白质不存在相比时，抑制磷酸化约99％。v.HER3-621/Fc
[0595]在MCF7细胞中测试了HER3-621/Fc抑制HER3磷酸化的能 力。在HRG存在下向细胞添加递增浓度的HER3-621/Fc(0.8nM-600nM)。 HER3-621/Fc以剂量依赖性方式抑制MCF7细胞中HER3的磷酸化。与该 蛋白质不存在相比时，由600nM HER3-621/FC实现的对MCF7细胞中 HER3磷酸化的最大抑制是约70％。vi.HER1-621/Fc：HER3-621/Fc嵌合体。
[0596]在A431细胞中测试了HER1-621/Fc：HER3-621/Fc抑制HER1 磷酸化的能力。来自经HER1-621/Fc和Her3-621/Fc共转染的细胞的条件 培养基上清液进行连续2倍稀释并在EGF存在下添加至细胞中。在纯 (neat)上清液中的重组蛋白质是约2μg/ml(约10nM)。来自未经HER ECD/Fc蛋白质转染的细胞的上清液用作对照。该结果显示对照上清液表 现对HER1磷酸化的很少抑制或无抑制，而观察到因纯上清液所致的少量 抑制(小于10％)。相反，含有HER1-621/Fc：HER3-621/Fc嵌合体的上清液 以剂量依赖性方式抑制受EGF刺激的A431细胞中HER1的磷酸化。与该 蛋白质不存在相比时，由含有HER1-621/Fc：HER3-621/Fc嵌合体的纯上清 液所实现的对A431细胞中HER1磷酸化的最大抑制是约55％。D.纯化的HFD100/300ECD多聚体对HER受体增殖和磷酸化的抑制
1.磷酸化
1.磷酸化
[0597]通过纯化的HFD100/300H如上文C部分中所述评估HER受体 的磷酸化。在SK-BR3细胞中测试纯化的HFD100/300H(含有带His表位 标签的HER1-621/Fc和HER3-621/Fc的ECD分子)抑制HER1和HER3 磷酸化的能力。为了评估EGF所诱导HER1磷酸化的作用，在EGF存在 下向细胞添加递增浓度0.3nM-600nM的HFD100/300H。结果显示 HFD100/300H分子以剂量依赖性方式抑制受EGF刺激的SK-BR3细胞中 HER1的磷酸化。与该蛋白质不存在相比时，由600nM HFD100/300H实 现的对SK-BR3细胞中HER1磷酸化的最大抑制是约60％。为了评估 HRGβ所诱导HER3磷酸化的作用，在HRGβ存在下向细胞添加递增浓度 0.3nM-600nM的HFD100/300H。结果显示HFD100/300H分子以剂量依 赖性方式抑制受浓度约67nM的HRGβ刺激的SK-BR3细胞中HER3磷 酸化，其中在此浓度上抑制水平达到平稳。与该蛋白质不存在相比时，在 浓度范围67nM-600nM HFD100/300H上所实现的对SK-BR3细胞中 HER3磷酸化的最大抑制是约65％。
[0598]HFD100/300H对受EGF或HRGβ刺激的SK-BR3细胞中 HER1、HER2和HER3的磷酸化的影响与2C4(又叫做帕妥珠单抗 (petuzumab))进行比较，其中所述的2C4是靶向HER2二聚化结构域的 单克隆抗体。结果显示HFD100/300H(600nM)抑制受配体刺激的SK-BR3 细胞中HER1的磷酸化(约60％)、HER2的磷酸化(约65％)和HER3的磷 酸化(约55％)。2C4单克隆抗体抑制HER2的磷酸化(约35％)、HER3的 磷酸化(约65％)，但不显示可检测的对HER1磷酸化的抑制。因此，与2C4 抗体相比时，HFD100/300H是能够抑制HER1、HER2和HER3磷酸化的 泛HER抑制物。2.增殖
[0599]如上文B部分中所述评估纯化的HFD 100/300H对受HER配 体刺激的细胞增殖的影响。结果显示纯化的HFD 100/300(由A蛋白纯化) 以剂量依赖性方式抑制受EGF(3nM)或HRG(5nM)刺激的HT-29细胞增 殖。与所述蛋白质不存在相比，在测试的两种配体存在下，由约200nM HFD100/300实现的对增殖的最大抑制是约55％。也测试了纯化的HFD 100/300H(含有组氨酸标签)对受配体刺激的ZR 75-1细胞增殖的影响。结 果显示纯化的HFD 100/300H以剂量依赖性方式抑制受HRG刺激的 ZR-75-1细胞增殖，在约600nM处观察到约80％的最大抑制。 HFD100/300H分子也以剂量依赖性方式抑制由多到约1nM EGF刺激的 ZR-75-1细胞增殖，其中观察到的抑制作用在至多到约600nM HFD100/300H的浓度时达到平稳。与该蛋白质不存在相比时，在约1nM 纯化的HFD 100/300H时观察到的最大抑制是约80％。E.HER ECD衍生物对HER磷酸化的抑制效应的总结
[0600]测试了多种示例性HER ECD分子抑制HER磷酸化的能力。在 表16中描述了结果总结。在指明没有测定抑制效应时，是指未进行实验。 结果显示HER1-621/Fc：HER3-621/Fc嵌合体是泛HER候选分子.
实施例7鉴定HER1、HER3、HER4的配体结合表面和HER2的类 似序列
实施例7鉴定HER1、HER3、HER4的配体结合表面和HER2的类 似序列
[0601]鉴定了HER家族全部四种成员的大致配体结合区域。所述区域 通与TGF-α复合的人EGFR(第1-501位残基)的晶体结构(具有1D，1MOX 的PDB蛋白质数据库，参见例如Garrett等(2002)Cell，110：763-773) 和多重比对成熟形式(即与参考SEQ ID NO相比较时，缺少信号肽)的 HER1(SEQ ID NO：2)、HER2(SEQ ID NO：4)、HER3(SEQ ID NO：6)和 HER4(SEQ ID NO：8)而确定。在表17中描述了结构域I(DI)和结构域 III(DIII)中对于配体结合作用重要的氨基酸的鉴定结果。根据HER蛋白的 成熟形式进行编号。可以靶向这些氨基酸序列以干扰配体与相应HER蛋 白的结合。
实施例8
对HER家族分子的亚结构域II(DII)和亚结构域IV(DIV)中的靶多肽 的鉴定
实施例8
对HER家族分子的亚结构域II(DII)和亚结构域IV(DIV)中的靶多肽 的鉴定
[0602]在本实施例中，鉴定用作肽结合底物(用于例如噬菌体展示法) 或用作免疫原以产生多克隆抗体的来自HER3、和HER1、HER2和HER4 的连续区域，以鉴定可以靶向HER家族的亚结构域II(DII)或亚结构域 IV(DIV)的分子。此类分子可以充当靶向二聚化结构域和/或通过同参与束 缚作用的DII和DIV序列相互作用而靶向并使束缚作用稳定的候选泛 HER治疗剂。
[0603]比对HER家族受体中DII或DIV的序列。HER3是同源性分析 的原型，并且将序列保守的肽确定为DII靶或DIV靶。下表18描述DII 中已鉴定的靶肽，在相邻列中显示SEQ ID NO(#)。下表19描述DIV中已 鉴定的靶肽，在相邻列中显示SEQ ID NO(#)。
实施例9通过噬菌体展示法鉴定结合HER家族中暴露的保守残基的 肽
实施例9通过噬菌体展示法鉴定结合HER家族中暴露的保守残基的 肽
[0604]噬菌体展示法是可以用来筛选与靶多肽相互作用的候选治疗 剂，如在实施例7-8中鉴定的那些候选治疗剂和在SEQ ID NO：54-125任 意项中所述的经鉴定的靶肽的方法示例。A.噬菌体文库选择
[0605]噬菌体展示肽文库(受限制的环C7C文库和7氨基酸和12氨基 酸线性文库)从New England BioLabs获得。针对无关Fc融合蛋白-A蛋白 (或G蛋白)琼脂糖复合体排除噬菌体展示文库。针对人HER3-621/Fc-A蛋 白琼脂糖复合体选择经排除过的噬菌体文库。作为与IgG1 Fc区融合的 HER3胞外结构域的HER3-621/Fc从R&D Systens购买，或如实施例2 所述制备。噬菌体用低pH缓冲液(或用从HER3结构域中保守的序列元件 中选择的合成肽汇集物，见上文实施例6和7)洗脱。进行四轮选择，此后 随机挑取单个蚀斑并在大肠杆菌中扩增后通过噬菌体酶联免疫吸附测定法 (ELISA)和DNA测序法进行分析。B.噬菌体ELISA
[0606]为实施噬菌体ELISA，96孔平板用HER3-621/Fc包被；洗涤并 用BSA/蔗糖缓冲液封闭。封闭后，将各种噬菌体培养基添加至孔内并在室 温孵育2小时。通过反复洗涤除去未结合的噬菌体。使用HRP缀合的M 13 抗体(R&D Systems)检测结合的噬菌体。进一步使用各种合成肽筛选阳性 噬菌体克隆，其中所述的合成肽选自在HER受体家族成员中保守的HER3 胞外结构域(见上文实施例6和7)以确定在HER3上的可能的噬菌体结合 位点。相似的噬菌体结合法可以使用表达HER3的单层细胞实施。C.鉴定用于异二聚化的肽
[0607]一旦鉴定了阳性噬菌体并确定了结合肽，则使用抗生物素蛋白- 生物素相互作用来鉴定适用于异二聚化的协同性肽配对物。本测定法利用 单一抗生物素蛋白分子以高亲和力和特异性结合四种不同生物素分子的能 力。简而言之，生物素化肽和中性抗生物素蛋白-HRP以4∶1比例混合。将 该混合物在转动器上在4℃孵育60分钟，随后添加软的释放抗生物素蛋白 -琼脂糖凝胶以除去过量的肽。软的释放抗生物素蛋白-琼脂糖凝胶通过离 心法沉淀。将所得的上清液稀释至HER3结合测定法所需要的浓度。实施例10用于克隆其它HER同工型的方法
A.信使RNA的制备
A.信使RNA的制备
[0608]从Clontech(BD Biosciences，Clontech，Palo Alto，CA)和 Stratagene(La Jolla，CA)购买从健康或患病组织的主要人组织类型或细胞 系中分离的mRNA。汇集等量的mRNA并且用其作为基于逆转录的PCR 扩增(RT-PCR)的模板。B.cDNA合成
[0609]将mRNA在70℃于40％DMSO存在下变性10分钟并且在冰上 猝冷。第一链cDNA用200ng寡聚(dT)或20ng随机六聚体在含有 10％DMSO、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、2mM每种dNTP、5μg mRNA和200单位逆转录酶 (Stratagene，La Jolla，CA)的20μl反应中合成。在37℃孵育1小时后，汇 集来自两个反应的cDNA并用10单位RNA酶H(Promega，Madison，WI) 处理。C.PCR扩增
[0610]设计用于RT-PCR克隆的正向引物和反向引物，旨在克隆HER 家族成员的剪接变体。使用Oligo 6.6软件(Molecular Biology Insights，Inc.， Cascade，CO)选择基因特异性PCR引物并且由 Qiagen-Operon(Richmond，CA)合成所述引物。选择分布在起始密码子侧 翼的正向引物(F1，F2)。使用Hiller描述的方法(Genome Biology(2005)，6： R58)从HER基因(表20)的内含子序列选择反向引物(R1)(见表21)。每个 PCR反应含有在总体积70μl中的10ng逆转录的cDNA，0.2μM F1/R1引 物混合物、1mM Mg(OAc)2、0.2mM dNTP(Amersham，Piscataway，NJ)、 1×XL-缓冲液和0.04U/μlrTth DNA聚合酶(Applied Biosystems)。PCR条 件是94℃，45秒、60℃，1分钟和68℃，2分钟，36个循环。以68℃持续 20分钟的延伸步骤结束反应。表20：用于克隆CSR同工型的基因列表
家族 成员 基因 (SEQ ID NO.) nt ACC.# 催化结构域 SEQ ID NO： ORF prt ACC.# SEQ ID NO： HER EGFR 400 NM_005228 2380-3148 1 247-3879 NP_005219 2 ERBB2 401 NM_004448 2396-3164 3 239-4006 NP_004439 4 ERBB3 402 NM_001982 2318-3086 5 194-4222 NP_001973 6 ERBB4 403 NM_005235 2285-2953 7 34-3960 NP_005226 8
表21：用于PCR克隆的引物
SEQ ID NO 引物名称 序列 276 EGFR-F1 ATC GGG AGA GCC GGA GCG AG 277 EGFR-F2 AGC AGC GAT GCG ACC CTC CG 278 EGFR-int11R1 CCA GGC TTT GGC TGT GGT CA 279 HER2-F1 ATG GGG CCG GAG CCG CAG T 280 HER2-F2 GCA CCA TGG AGC TGG CGG C
281 HER2-int11R1 ATC AGG CCC CCT CTT TCT CAG 282 HER3-F1 TCC CTT CAC CCT CTG CGG A 283 HER3-F2 GCG GAG TCA TGA GGG CGA A 284 HER3-int11R1 CTG AAG ATG CCA TTT CCT CCA TAC 285 HER3-int10R1 CAA TTT ATG CCA GTG GTT CAC CTA 286 HER4-F1 ATT GTC AGC ACG GGA TCT GAG A 287 HER4-F2 CTG AGA CTT CCA AAA AAT GAA GCC 288 HER4-int12R1 AAT GGG AAA AAA TTT AAG TTT CTA TGT T
D.PCR产物的克隆和测序
家族 成员 基因 (SEQ ID NO.) nt ACC.# 催化结构域 SEQ ID NO： ORF prt ACC.# SEQ ID NO： HER EGFR 400 NM_005228 2380-3148 1 247-3879 NP_005219 2 ERBB2 401 NM_004448 2396-3164 3 239-4006 NP_004439 4 ERBB3 402 NM_001982 2318-3086 5 194-4222 NP_001973 6 ERBB4 403 NM_005235 2285-2953 7 34-3960 NP_005226 8
表21：用于PCR克隆的引物
SEQ ID NO 引物名称 序列 276 EGFR-F1 ATC GGG AGA GCC GGA GCG AG 277 EGFR-F2 AGC AGC GAT GCG ACC CTC CG 278 EGFR-int11R1 CCA GGC TTT GGC TGT GGT CA 279 HER2-F1 ATG GGG CCG GAG CCG CAG T 280 HER2-F2 GCA CCA TGG AGC TGG CGG C
281 HER2-int11R1 ATC AGG CCC CCT CTT TCT CAG 282 HER3-F1 TCC CTT CAC CCT CTG CGG A 283 HER3-F2 GCG GAG TCA TGA GGG CGA A 284 HER3-int11R1 CTG AAG ATG CCA TTT CCT CCA TAC 285 HER3-int10R1 CAA TTT ATG CCA GTG GTT CAC CTA 286 HER4-F1 ATT GTC AGC ACG GGA TCT GAG A 287 HER4-F2 CTG AGA CTT CCA AAA AAT GAA GCC 288 HER4-int12R1 AAT GGG AAA AAA TTT AAG TTT CTA TGT T
D.PCR产物的克隆和测序
[0611]在0.8％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并且用 Gelstar(BioWhitaker Molecular Application，Walkersville，MD)染色来自 可检测条带的DNA。DNA条带用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen， Valencia，CA)提取，连接至pDrive UA-克隆载体(Qiagen)并转化入DH10B 细胞。在含有25μg/ml卡那霉素、0.1mM IPTG和60μg/ml X-gal的LB琼 脂平板上选择重组质粒。对于每个转染，随机挑取12个菌落并且通过PCR 用UA载体引物测定其cDNA插入物大小。随后用M13正向及反向载体引 物对克隆双向测序。使用跨缺口区的完整定向测序的定制引物对全部克隆 进行完整测序。E.序列分析
[0612]对可变剪接的计算性分析通过使用SIM4(一种用于分析剪接变 体的计算机程序)将每种cDNA序列与其相应基因组序列比对而进行。仅考 虑具有规范(例如GT-AG)供体-受体剪接位点的转录物用于分析。进一步研 究编码HER同工型的克隆(见下文，表22).F.示例性HER同工型
[0613]在下表22中描述使用本文中所述的方法制备的示例性HER同 工型。提供编码HER同工型的核酸分子并且其序列在该表中标出的SEQ ID下描述。示例性HER同工型多肽的氨基酸序列在标出的SEQ ID下描 述。表22：HER同工型
基因 ID 类型 长度 所用引物 SEQ ID NO(nt，aa) EGFR HER1-int11 内含子融合物 433 EGFR-F1， EGFR-F2， EGFR-int11R1 126，127 ERBB2 HER2-int11 内含子融合物 438 HER2-F1， HER2-F2， HER2-int11R1 140，141 ERBB3 HER3-int10 内含子融合物 403 HER3-F1， HER3-F2， HER3-int11R1 145，146 ERBB3 HER3-int11 内含子融合物 425 HER3-F1， HER3-F2， HER3-int10R1 147，148 ERBB4 ERBB4-int12_tr 内含子融合物 506 HER4-F1， HER4-F2， HER4-int12R1 158，159 ERBB4 ERBB4_int11 内含子融合物 430 156，157 ERBB4 ERBB4_int10 内含子融合物 421 154，155 ERBB4 ERBB4_int9 内含子融合物 391 152，153
实施例11用于克隆IGF1R同工型的方法
A.信使RNA的制备
基因 ID 类型 长度 所用引物 SEQ ID NO(nt，aa) EGFR HER1-int11 内含子融合物 433 EGFR-F1， EGFR-F2， EGFR-int11R1 126，127 ERBB2 HER2-int11 内含子融合物 438 HER2-F1， HER2-F2， HER2-int11R1 140，141 ERBB3 HER3-int10 内含子融合物 403 HER3-F1， HER3-F2， HER3-int11R1 145，146 ERBB3 HER3-int11 内含子融合物 425 HER3-F1， HER3-F2， HER3-int10R1 147，148 ERBB4 ERBB4-int12_tr 内含子融合物 506 HER4-F1， HER4-F2， HER4-int12R1 158，159 ERBB4 ERBB4_int11 内含子融合物 430 156，157 ERBB4 ERBB4_int10 内含子融合物 421 154，155 ERBB4 ERBB4_int9 内含子融合物 391 152，153
实施例11用于克隆IGF1R同工型的方法
A.信使RNA的制备
[0614]从Clontech(BD Biosciences，Clontech，Palo Alto，CA)和 Stratagene(La Jolla，CA)购买从健康或患病组织的主要人组织类型或细胞 系中分离的mRNA。汇集等量的mRNA并且用其作为基于逆转录的PCR 扩增(RT-PCR)的模板。B.cDNA合成
[0615]将mRNA在70℃于40％DMSO存在下变性10分钟并且在冰上 猝冷。第一链cDNA用200ng寡聚(dT)或20ng随机六聚体在含有 10％DMSO、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、2mM每种dNTP、5μg mRNA和200单位逆转录酶 (Stratagene，La Jolla，CA)的20μl反应中合成。在37℃孵育1小时后，汇 集来自两个反应的cDNA并用10单位RNA酶H(Promega，Madison，WI) 处理。C.PCR扩增
[0616]设计用于RT-PCR克隆的正向引物和反向引物，旨在克隆 IGF1R的剪接变体。使用Oligo 6.6软件(Molecular Biology Insights，Inc.， Cascade，CO)选择基因特异性PCR引物并且由 Qiagen-Operon(Richmond，CA)合成所述引物。选择分布在起始密码子侧 翼的正向引物(F1，F2)。使用Hiller描述的方法(Genome Biology(2005)，6： R58)从IGFR1基因(SEQ ID NO：404，表23)的内含子序列选择反向引物 (R1)(见表24)。每个PCR反应含有在总体积70μl中的10ng逆转录的 cDNA，0.2μM F1/R1引物混合物、1mM Mg(OAc)2、0.2mM dNTP(Amersham，Piscataway，NJ)、1×XL-缓冲液和0.04U/μlrTth DNA 聚合酶(Applied Biosystems)。PCR条件是94℃，45秒、60℃，1分钟和 68℃，2分钟，36个循环。以68℃持续20分钟的延伸步骤结束反应。表23：用于克隆IGF1R同工型的基因列表
蛋白质 基因SEQ ID NO： nt ACC.# SEQ ID NO： prtACC.# SEQ ID NO： IGF1R 404 X04434 289 CAA28030 290
表24：用于PCR克隆的引物
SEQ ID NO 引物名称 大小 序列 位置 Tm 长度 291 IGF1R_F1 TGA GAA AGG GAA TTT CAT CCC 14 65 21 292 IGF1R_F2 AGG AAT GAA GTC TGG CTC CG 42 66 20 293 IGF1R_内含子10R1 2280 GGC TCC GTC TCA GTG GCT AC 2358 66 20
294 IGF1R_内含子11R1 2496 CTA GGT TGT GAG GAA GGT GGC 2558 66 21 295 IGF1R_内含子12R1 2664 AGG AGG TAA CCT GTG CAG TCA 2724 64 21 296 IGF1R_内含子13R1 3039 ATG TAA GCC AGG TTG AAA GCA 3110 65 21
D.PCR产物的克隆和测序
蛋白质 基因SEQ ID NO： nt ACC.# SEQ ID NO： prtACC.# SEQ ID NO： IGF1R 404 X04434 289 CAA28030 290
表24：用于PCR克隆的引物
SEQ ID NO 引物名称 大小 序列 位置 Tm 长度 291 IGF1R_F1 TGA GAA AGG GAA TTT CAT CCC 14 65 21 292 IGF1R_F2 AGG AAT GAA GTC TGG CTC CG 42 66 20 293 IGF1R_内含子10R1 2280 GGC TCC GTC TCA GTG GCT AC 2358 66 20
294 IGF1R_内含子11R1 2496 CTA GGT TGT GAG GAA GGT GGC 2558 66 21 295 IGF1R_内含子12R1 2664 AGG AGG TAA CCT GTG CAG TCA 2724 64 21 296 IGF1R_内含子13R1 3039 ATG TAA GCC AGG TTG AAA GCA 3110 65 21
D.PCR产物的克隆和测序
[0617]在0.8％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并且用 Gelstar(BioWhitaker Molecular Application，Walkersville，MD)染色来自 可检测条带的DNA。DNA条带用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen， Valencia，CA)提取，连接入pDrive UA-克隆载体(Qiagen)并转化至DH10B 细胞。在含有25μg/ml卡那霉素、0.1mM IPTG和60μg/ml X-gal的LB琼 脂平板上选择重组质粒。对于每个转染，随机挑取12个菌落并且通过PCR 用UA载体引物测定其cDNA插入物大小。随后用M13正向及反向载体引 物对克隆双向测序。使用跨缺口区的完整定向测序的定制引物对全部克隆 进行完整测序。E.序列分析
[0618]对可变剪接的计算性分析通过使用SIM4(一种用于分析剪接变 体的计算机程序)将每种cDNA序列与其相应基因组序列比对而进行。仅考 虑具有规范(例如GT-AG)供体-受体剪接位点的转录物用于分析。进一步研 究编码IGF1R同工型的克隆(见下文，表25)。F.示例性IGF1R同工型
[0619]在下表25中描述使用本文中所述的方法制备的示例性IGF1R 同工型。提供编码IGF1R同工型的核酸分子并且其序列在SEQ ID NO： 297和299的任意项中描述。示例性IGF1R同工型多肽的氨基酸序列在 SEQ ID NO：298和300的任意项中描述。表25：IGF1R同工型
基因 ID 类型 长度 新长度 所用引物 SEQ ID NO(nt，aa) IGF1R SR024A03 内含子 融合物 759 25 IGF1R_F1，IGF1R_F2； IGF1R_内含子10R1 297，298 IGF1R SR024B04 内含子 融合物 831 3 IGF1R_F1，IGF1R_F2； IGF1R_内含子11R1 299，300
实施例12
用HER1ECD/HER3ECD异多聚体和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)协同地 抑制肿瘤细胞生长
基因 ID 类型 长度 新长度 所用引物 SEQ ID NO(nt，aa) IGF1R SR024A03 内含子 融合物 759 25 IGF1R_F1，IGF1R_F2； IGF1R_内含子10R1 297，298 IGF1R SR024B04 内含子 融合物 831 3 IGF1R_F1，IGF1R_F2； IGF1R_内含子11R1 299，300
实施例12
用HER1ECD/HER3ECD异多聚体和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)协同地 抑制肿瘤细胞生长
[0620]将指数期生长的肿瘤细胞(从ATCC购买)以密度1000个细胞/ 孔转移至96孔微量稀释平板中。(MDA MB 468乳腺癌细胞用于图3a中所 述的实验，而A 431鳞状细胞癌细胞用于图3b中所述的实验)。允许细胞 贴壁24小时并且添加试验化合物至终末稀释度1×∶1μM用于RB200h(经 Fc结构域与全长HER3ECD连接的全长HER1ECD)；和50μM的 AG-825(HER2相关的酪氨酸激酶的一种抑制物；Osherov等1993；图3A)； 或50μM吉非替尼/易瑞沙(EGFR相关的激酶的一种抑制物；Herbst，2002； 图3b)。随后一式两份同时施用化合物并且进行连续2倍稀释。
[0621]在72小时孵育后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并用甲醇 中的0.5％结晶紫染色。随后在水中柔和洗涤平板并使其干燥过夜。与所贴 壁细胞的蛋白质结合的结晶紫溶解于Sorenson缓冲液(在50％乙醇中的 0.025M柠檬酸钠，0.025M柠檬酸)，0.1ml/孔。在ELISA平板读数仪中 于540nm波长处分析平板。将活细胞相对于对照的分数作图并分析 (CalcuSyn；Biosoft，Cambridge，UK)。
[0622]来自所测试的最低浓度的结果示于图3A和图3B。横穿标注为 “组合”列的虚线是预期来自所测试药物的相加效应的结果(RB200h加AG 825，图3A；RB200h加易瑞沙，图3B)。如图3A和图3B中所示，HER1 ECD/HER3ECD异多聚体(RB200h)与所测试的酪氨酸激酶抑制剂二者之 一的组合显示协同性生长抑制效应，大大高于该组合对生长的相加效应。
[0623]该结果是显著的，因为它意味可以通过与RB200h组合而避免 与化疗药相关的毒性。尤其，可以避免批准用于治疗非小细胞肺癌疗法的 易瑞沙的致命毒性(见http://www.medscape.com/vievvarticle/456223)。此 外，仅约30％亚洲人和10％白种人表现EGFR/HER1的突变，而这是易 瑞沙/吉非替尼效力所需要的，并且对其它TKI而言可能存在相似情况 (http://en.wikipedia.org/wiki/Gefitinib)。耐药性机制也已经得到描述(除肿 瘤相关的EGFR酪氨酸激酶保留野生型氨基酸序列之外)。属于这些机制 之列的是获得“第二位点”突变(Pao等2005)和生长因子过量表达 (Ishikawa等2005)。因此，若通过与RB200h或其它受体多聚体组合而协 同地增强相对于毒性的效力而可以增加敏感性且可以避免与TKI相关的毒 性，则这将导致可对涉及酪氨酸激酶的癌症或其它疾病进行成功治疗的患 者数目急剧增加。实施例13
通过Biacore表面等离子体共振法(Surface Plasmon Resonance)测定 的EGF和NRG1β1与RB200h的结合
通过Biacore表面等离子体共振法(Surface Plasmon Resonance)测定 的EGF和NRG1β1与RB200h的结合
[0624]为了测定生长因子配体对RB200h(又叫做100/300h(含有带HIS 表位标签的HER1-621/Fc和HER3-621/Fc的ECD分子))的亲和力，通过 Biacore开展结合研究。在25℃用基于表面等离子体共振的生物传感仪器 BIAcore 3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)进行结合实验。为固定配体， 将冻干的无载体的人EGF和HRG(R&D Systems)溶解于HBP-ES缓冲液 (20mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，pH 7.5，BIAcore AB)并 稀释至0.2mg/ml。将PBS中的RB200h在相同缓冲液中稀释至0.2mg/ml。 使用NHS/EDC偶联法将这些分子固定至BIAcore CM5芯片上。将EGF 或NRG1β1固定在Biacore芯片上，随后流过RB200h溶液。一旦达到10000 次响应单位的靶表面共振，则用乙醇胺猝灭该表面。制备用于全部试验的 空白流通池。
[0625]以不同流速和以不同分析物浓度进行注射以证实不存在传质效 应(mass transfer effect)。一式两份或三份开展表26中所示的最终测量。数 据评价通过全局拟合(global fitting)，使用Scrubber(BioLogic软件)进行。 配体的解离常数(Kd)从配体解离速率对配体结合速率的比例确定。这些研 究揭示HER调蛋白RB200h以Kd 24nM与EGF结合，而它以Kd 56nM 与NRG1β1结合(表26)。表26.结合亲和力
溶液中的分子 表面上的分子 KD(nM) RB200h EGF 24 RB200h NRG1β1 56
实施例14用铕标记的EGF或NRG1β1开展RB200h的饱和结合研 究
溶液中的分子 表面上的分子 KD(nM) RB200h EGF 24 RB200h NRG1β1 56
实施例14用铕标记的EGF或NRG1β1开展RB200h的饱和结合研 究
[0626]因为仅在固定NRG1β1时才可能通过Biocore方法测定HER3 配体(NRG1β1)与RB200h的结合作用，故通过另一种方法-时间分辨荧光 测定法(DELFIA)开展RB200h的结合研究。对于HER1配体结合活性，通 过DELFIA法，使用铕标记的配体Eu-EGF确定HER调蛋白的配体结合 活性，或对于HER3配体结合活性，用Eu-NRG1β1在抗IgG Fc包被的微 量滴定板上确定HER调蛋白的配体结合活性。将RB200h固定在抗Fc包 被的96孔板上并且使用在如图7a和b中所示大浓度范围内的镧系元素(铕) 标记配体(Eu-EGF或Eu-NRG1β1)确定EGF或NRG1β1的结合亲和力。 DELFIA 96孔黄色板(PerkinElmer)用抗人IgG Fc抗体(Sigma)以0.5μg/孔 (100μl/孔体积)在4℃包被过夜。将板用PBS/0.05％吐温20洗涤两次并随 后用含有1％BSA、5％蔗糖和0.01％叠氮钠的PBS缓冲液在室温大约22 ℃(RT)下封闭2小时。封闭后，吸出缓冲液，将板在室温下空气干燥过夜， 密封并随后贮藏在4℃持续一个月。在测定当日，抗IgG Fc包被的板用 DELFIA L＊R洗涤缓冲液(PerkinElmer)洗涤3次并且HER调蛋白以10 ng/孔或20ng/孔添加在DELFIA结合缓冲液中的50μl/孔体积中。在30℃ 孵育2小时并温和振摇，此后，将50μl铕(Eu)标记的配体以图中所示的多 种浓度或下述浓度添加至孔内。
[0627]对于饱和结合研究，复孔含有用于测定非特异性结合作用的100 倍过量的非标记配体以及Eu标记配体。对于常规分析HER调蛋白的配体 结合活性而言，如上所述开展研究，除了仅使用固定的饱和浓度30nM的 Eu-EGF(用于总结合作用)处或除了在5μM非标记EGF(用于非特异性结合 作用)存在下定量HER1配体结合能力外。类似地，为了定量HER3配体 结合能力，仅使用100nM Eu-NRG1β1(用于总结合作用)或10μM非标记 NRG1β1(用于非特异性结合作用)存在下分析HER调蛋白。添加配体后， 在30℃孵育2小时并温和振摇。随后，将板置于冰上，迅速用含0.02％吐 温20的冰冷DELFIA洗涤缓冲液(PerkinElmer)洗涤3次以除去未结合的 配体。为了定量结合的Eu-标记配体，添加130μl/孔的DELFIA增强溶液， 将板在室温孵育15分钟，随后在荧光板读数仪(Envision，2100型， PerkinElmer)上在Eu时间分辨滤过设置下读数。数据使用单-位点或两- 位点结合曲线拟合软件进行分析以产生Kd和Bmax。对于常规分析，HER 调蛋白的特异结合活性表述为飞摩尔(fmol)结合配体/每毫克蛋白质或每 飞摩尔HER调蛋白。
[0628]HER调蛋白RB200h以可饱和方式结合Eu-EGF或 Eu-NRG1β1。Eu标记配体的结合作用可以被其各自的非标记配体EGF 或NRG1β1替换，表明这种结合作用是特异性的(图7a和b)。Eu-EGF或 NRG1β1的Kd是大约10nM。此外，NRG1β1以高于Biacore所观察到的 亲和力与固定的RB200h结合(Kd约10nM)。总之，数据显示RB200h以 高亲和力结合HER1和HER3配体。实施例15
HER调蛋白RB200h抑制EGF和神经调节蛋白-1β刺激的HER家族 蛋白酪氨酸磷酸化
HER调蛋白RB200h抑制EGF和神经调节蛋白-1β刺激的HER家族 蛋白酪氨酸磷酸化
[0629]以上实施例证实HER调蛋白RB200h结合EGF(HER1配体)和 NRG1β1(HER3配体)。随后开展研究以确定RB200h是否将阻断对HER 家族蛋白酪氨酸磷酸化的配体诱导刺激作用(其中配体是EGF或 NRG1β1)。方法
细胞系和组织培养
细胞系和组织培养
[0630]从美国典型培养物保藏中心(Manassa，VA)购买人结肠直肠腺癌 细胞系HT-29、人肺癌A549、胃癌NCI-N87、乳腺导管癌ZR-75-1、表皮 样癌A431和乳腺腺癌细胞系SK-BR-3、ACHN肾癌细胞系，而SUM149 细胞来自Asterand。HT-29和SK-BR-3细胞在补加有10％胎牛血清的 McCoys 5a(Mediatch，Herndon，VA)中培养，NCI-N87和ZR-75-1细胞 在补加有10％胎牛血清的RPMI(Mediatch)中培养，并且A549和A431 细胞在补加有10％胎牛血清的DMEM(Mediatch)中培养。SUM149细胞在 补加有胰岛素(5μg/ml)、氢化可的松(1μg/ml)、HEPES缓冲液(10mM)和 5％胎牛血清的Ham′s F-12培养基中培养。全部细胞在培养箱中于37℃、 在含％CO2和95％空气的加湿气氛下培育。细胞每周传代培养两次。用于HER家族蛋白的磷酸酪氨酸ELISA
[0631]测试了细胞系A431、A549、HT-29、N87、SK-BR-3和ZR-75-1 细胞。A431细胞具有高水平的HER1和低水平的HER2和HER3。将细 胞以适合于其各自生长速度的密度接种在96孔板内的生长培养基中，一般 每孔5,000-20,000个细胞，并且孵育过夜，随后实行血清饥饿24小时。休 眠细胞用50μl/孔含0.1％BSA的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)预处理， 并添加系列稀释的抑制物(HER调蛋白或赫赛汀或爱必妥)，并且将细胞在 37℃，5％CO2孵育30分钟。HER家族蛋白磷酸化用生长因子(3nM EGF 或1nM NRG-β1)在37℃，5％CO2刺激10分钟。在刺激后，将带细胞的 板置于冰上，用200μl/孔冰冷的PBS洗涤1次并且用100μl/孔的含有磷酸 酶抑制剂混合物I组和II组(EMD Biosciences，San Diego，CA)和通用蛋白 酶抑制剂混合物(Sigma)的冰冷1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling， Danvers，MA)在冰上裂解大约30分钟。
[0632]在初步研究中，发现RB200h转入源自以这种HER调蛋白所处 理的细胞的裂解物内，并且这种水平的RB200h与HER1竞争结合捕获抗 体，但是没有观察到RB200h对下文所述的HER3或HER2与其相应捕获 抗体结合的明显竞争。RB200h与HER1对HER1捕获抗体的这种竞争作 用通过用A蛋白-琼脂糖凝胶珠净化所述裂解物而消除，其中所述的A蛋 白-琼脂糖凝胶珠结合RB200h中的Fc结构域，如下文所述。这一点通过 下述实验进行验证，在所述实验中将在本研究中所用最高浓度的RB200h 掺入含有HER1、HER2和HER3的细胞裂解物并随后用A蛋白珠处理， 随后对HER1或HER2或HER3捕获抗体实施ELISA。
[0633]如上文所述，来自RB200h所处理细胞的细胞裂解物与20μl/孔 50％A蛋白-琼脂糖凝胶珠浆液(Invitrogen，Carlsbad，CA)(其在裂解缓冲 液中平衡)在板振荡器上在4℃孵育过夜，以除去RB200h。随后将所述珠 经离心而从裂解物中除去，并且不含RB200h杂质的上清液用于磷酸酪氨 酸ELISA。用于ELISA的HER1或HER2或HER3捕获抗体板制备如下。 96孔Immulon 4HXB微量滴定板(Thermo，Waltham，MA)用PBS中的如 下所述捕获抗体以100μl/孔在室温2小时或在4℃包被过夜。使用以下的 抗HER胞外结构域捕获抗体。对于HER1检测，抗人EGFR抗体(#AF231， 0.4μg/ml)是捕获抗体；对于HER2检测，人抗ErbB2捕获抗体(#DYC1768， 4μg/ml)仅用于具有RB200h的研究(见下文)；对于HER3检测，人Erb3 DuoSet IC(#DYC1769，4μg/ml)是捕获抗体。我们发现赫赛汀与HER2竞 争结合上文提及的HER2捕获抗体(DYC 1768)，但是赫赛汀不与细胞 HER2竞争结合来自R&D Systems的称作AF1129的抗ErbB2捕获抗体。 因此，当使用赫赛汀或C225时，在抗人ErbB2抗体(#AF1129，2μg/ml) 上所捕获的细胞裂解物中开展HER2检测。全部捕获抗体来自R&D Systems(Minneapolis，MN)，稀释于PBS中并用PBS中的2％牛血清白蛋 白(Equitech，Kerrville，TX)和0.05％吐温20(Fisher，Waltham，MA)封闭。 如上文加工的细胞裂解物(75μl)转移至已包被板的每孔中，在4℃孵育过 夜，同时混合，并且随后用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-吐温)洗涤4次。 用100μl/孔的抗磷酸酪氨酸-HRP缀合物(R&D Systems)检测HER蛋白上 的酪氨酸磷酸化，其中所述的抗磷酸酪氨酸-HRP缀合物根据制造商说明 书稀释于含有2％BSA的PBS中并在室温孵育2小时。将板用PBS-吐温 洗涤4次，并随后用100μl/孔TMB底物显色，随后用100μl/孔的针对TMB 的终止试剂(均来自Sigma)终止。显色时间是变化的，从而经显色板的光密 度是0.5-1.0。光密度由VERSAmax微量板读数仪(Molecular Devices， Sunnyvale，CA)在650nm处确定。结果
[0634]EGF处理A431细胞引起刺激全部三种HER蛋白的酪氨酸磷酸 化：HER1受到最大刺激(约10倍)，随后是HER2(4-倍)和最后是HER3(2 倍)。在表27中列出了检测到EGF刺激全部细胞系中HER1的磷酸化达2 倍-10倍，但是它仅刺激所测试细胞系的A431、HT-29、SK-BR-3和ZR-75-1 细胞中HER 2磷酸化达1.6倍-4倍。EGF仅在所测试细胞系A431和 SK-BR-3细胞中诱导HER3磷酸化刺激达2倍-3倍(表27)。当A431细胞 经递增剂量的RB200h处理，随后用EGF刺激时，与仅用EGF刺激的细 胞相比，存在全部三种HER1、HER2和HER3蛋白的酪氨酸磷酸化的剂 量依赖性抑制，这一点通过抗磷酸酪氨酸ELISA确定(图8a)。对于HER1 磷酸化，观察到用RB200h的最大反应是大约75％抑制，EC50是160nM(图 8a和表27和28)。在表II中列出的全部所测试细胞观察到RB200h对EGF 刺激的磷酸化的这种抑制效应。然而，针对其它的HER家族的生物物质 (biolgic)如赫赛汀和C225(爱必妥)，仅C225是与RB200h同样有效的，其 中所述的C225抑制EGF与HER1结合(表27和28)。赫赛汀不以任何显 著水平抑制EGF刺激的HER蛋白磷酸化，这些研究将在以下进一步讨论。表27：通过RB200h和其它生物物质抑制HER家族蛋白磷酸化 (PanHER指数)。
表28：通过RB200h、赫赛汀或爱必妥抑制肿瘤细胞中EGF或NRG1β1 刺激的HER家族蛋白酪氨酸磷酸化。
表28：通过RB200h、赫赛汀或爱必妥抑制肿瘤细胞中EGF或NRG1β1 刺激的HER家族蛋白酪氨酸磷酸化。
[0635]除了刺激HER1磷酸化之外，EGF还引起刺激HER2(4倍)和 HER3(3倍)磷酸化，提示EGF诱导的HER1与HER2或HER3的异二聚 化。这种EGF刺激的HER2或HER3磷酸化还由RB200h抑制达大约 60％(图8a)。因为生长因子(如EGF)诱导HER家族受体蛋白质异二聚化并 诱导其分别的配偶体的转磷酸化，因此评估某种分子对于受配体刺激的全 部三种HER蛋白的抑制效力是重要的。这通过将抑制磷酸化数据表述为 “panHER指数”进行。
[0636]该指数测量HER家族蛋白的平均％抑制并且如下导出： panHER指数等于HER调蛋白或另一种试剂对(配体刺激的 [HER1+HER2+HER3]磷酸化的抑制％/3)。panHER指数对于受EGF刺激 的A431细胞中的RB200h是70％，表示有效阻断EGF诱导的HER蛋白 的信号传导作用(表27)。在具有低水平HER1而具有中等水平HER2和 HER3的另一种肿瘤细胞系ZR-75-1乳腺癌细胞中，RB200h抑制EGF刺 激的HER1和HER2磷酸化分别达40和20％，panHER指数是约20％， EC50是50-100nM(图9a，表27和28)。在ZR-75-1细胞中，HER3磷酸化 在EGF刺激后无明显增加，因此，RB200h对EGF处理的细胞中的HER3 磷酸化无影响。
[0637]NRG1β1(HER3配体)处理A431细胞引起大约2倍-4倍HER3 磷酸化刺激。在其它细胞中见到由NRG1β1刺激HER3磷酸化的这种水平， 而ZR-75-1例外，在其中NRG1β1引起大约7倍HER3磷酸化刺激。在研 究的大多数肿瘤细胞中，NRG1β1刺激HER2的磷酸化，但是仅在测试的 某些肿瘤细胞系中观察到HER1磷酸化。在NRG1β1刺激的A431或 ZR-75-1细胞中，RB200h引起最大的HER3磷酸化的剂量依赖性抑制， 并引起最大60-80％抑制，EC50是大约120nM并且panHER指数是45-60 ％(图8d和9d，表27和28)。NRG1β1对A431细胞的刺激没有导致HER1 磷酸化的任何显著变化，因此没有观察到RB200h对HER1的影响。另一 方面，NRG1β1处理ZR-75-1细胞刺激了全部三种HER1、HER2和HER3 磷酸化，并且这些磷酸化受RB200h抑制达40-60％，panHER指数是约 50％并且EC50是24-90nM，这取决于HER蛋白质(图9d、表27和28)。 用RB200h对其它肿瘤细胞系实施类似研究并且RB200h也在各种肿瘤细 胞中抑制EGF或NRG1β1刺激的磷酸化(表27和28)。
[0638]测试了已知调节HER家族蛋白磷酸化的针对HER家族蛋白的 其它生物物质(即C225或爱必妥(针对HER1)和赫赛汀(针对HER2)) 对EGF或NRG1β1刺激的磷酸化的影响。在A431和ZR-75-1细胞中， C225引起EGF刺激的HER1磷酸化的最大剂量依赖性抑制，EC50是约8 nM并且40-80％最大抑制效果(图8c和9c，表27和28)。类似地，C225 抑制所测试的其它细胞系中EGF刺激的HER1磷酸化，其效力与RB200h 相当(表27和28)。在EGF刺激的A431或ZR-75-1细胞中，C225也抑制 HER2磷酸化，但仅抑制在A431细胞中的HER3磷酸化，其类似于RB200h 的效果，不过与RB200h相比，C225对HER3具有较低效力(图8c，表27 和28)。然而，与RB200h的效果不同，结合HER1的C225不抑制所测试 的任意细胞系中NRG1β1刺激的HER家族蛋白磷酸化(图8c和9c和表27 和28)。
[0639]测试了赫赛汀(其针对HER2)调节HER家族蛋白酪氨酸磷酸化 的能力。在EGF刺激的A431中，赫赛汀仅引起低水平(约20％)的HER2 或HER3磷酸化抑制作用，而在NRG1β1刺激的细胞中，仅抑制HER3 磷酸化至约30％的低抑制作用(图8b和e，表27和28)。然而，在EGF刺 激的ZR-75-1细胞中，赫赛汀并不抑制HER家族蛋白磷酸化，相反还引 起HER2磷酸化的大约60％刺激(图9b)。然而，相对它对HER2的影响， 赫赛汀在NRG1β1刺激ZR-75-1细胞后50％抑制HER3磷酸化。在测试 的全部细胞(A431、A549、HT29、N87、SK-BR-3和ZR-75-1细胞)中始终 如一地观察到赫赛汀抑制HER3酪氨酸磷酸化至低水平20-30％，尤其在 NRG1β1刺激的细胞中。在测试的前述细胞系中，仅在A431细胞中，赫 赛汀处理引起HER2磷酸化的轻微抑制(约20％)。在全部其它细胞系中， 如上文提及，赫赛汀处理引起刺激HER2酪氨酸磷酸化，与未处理细胞相 比，为10-60％刺激。
[0640]在其他细胞系中也开展有关RB200h、赫赛汀和C225抑制配体 刺激的磷酸化的相似研究。数据汇总于表27和表28。通过对几种细胞系 比较RB200h、赫赛汀和C225对HER家族蛋白磷酸化的平均％抑制 (panHER指数)，HER调蛋白RB200h在抑制配体诱导的HER家族蛋白 磷酸化方面是最有效的。尽管C225在抑制EGF刺激的HER家族蛋白磷 酸化方面与RB200h同样有效，不过它在抑制NRG1β1刺激的HER蛋白 磷酸化方面不是有效的。就NRG1β1刺激的细胞而言，仅RB200h抑制全 部HER家族蛋白的磷酸化，而赫赛汀或C225则否，如由panHER指数(表 27和28)所判断的那样。数据显示HER调蛋白RB200h阻断全部三种HER 家族的EGF(HER1配体)或NRG1β1(HER3配体)刺激的酪氨酸磷酸化，即 HER1、HER2和HER3磷酸化，而C225或赫赛汀则否。总而言之，数据 显示RB200h是HER1和HER3蛋白的配体阱并具有广谱的抗HER活性。实施例16
多样类型的HER1配体和HER3配体结合至RB200h
多样类型的HER1配体和HER3配体结合至RB200h
[0641]开展研究以确定除EGF之外的其它HER1配体或除NRG1β1 之外的其它HER3配体是否与RB200h结合。在这些研究中，配体的结合 能力由其替换与RB200h结合的Eu-EGF或Eu-NRG1β1的能力进行测试。 实验如实施例14中所述进行。
[0642]如图7c和d中所示，未标记的EGF、HB-EGF、TGF-α抑制 Eu-EGF结合，表明这些HER1配体与RB200h结合。在类似研究中， NRG1-α、NRG1β3a和NRG1β1抑制Eu-NRG1β1与RB200h的结合，而 EGF则不抑制，表明这些神经调节蛋白与RB200h结合(图7d)。此外，生 长因子(如与HER家族配体无关的胰岛素或胰岛素样生长因子-1)不竞争结 合Eu-EGF或Eu-NRG1β1(图7c和d)，表明RB200h特异地结合HER1 配体或HER3配体。这表明RB200h不会非特异地结合生长因子，而是高 度特异地结合HER1配体或HER3配体。总之，数据显示RB200h中的 HER1和HER3ECD如其天然对应物那样在配体结合能力中发挥功能。实施例17
RB200h中的HER1和HER3的配体结合能力是相互独立的
RB200h中的HER1和HER3的配体结合能力是相互独立的
[0643]为研究RB200h中在HER1和HER3上的配体结合位点是否彼 此独立，在HER3配体(NRG1β1)存在下开展Eu-EGF与RB200h结合的 竞争研究，并且反之开展Eu-NRG1β1被非标记EGF竞争的竞争研究。实 验如实施例14中所述实施。
[0644]数据显示在Eu-EGF结合的情况下，仅未标记的EGF、HB-EGF 或TGF-α与Eu-EGF竞争结合RB200h，但未标记的NRG1β1不竞争。类 似地，仅未标记的NGR1β1竞争Eu-NRG-1β1结合作用，但不竞争EGF。 总之，数据显示HER1配体结合位点独立于HER3配体结合位点而结合 HER1配体。反之也是如此，即HER-3配体结合位点可以独立于HER1 配体结合位点而结合HER3配体。实施例18
HER调蛋白在单层培养物和在软琼脂中抑制细胞增殖
HER调蛋白在单层培养物和在软琼脂中抑制细胞增殖
[0645]因为RB200h结合EGF(HER1配体)及NRG1β1(HER3配体) 两者并且抑制生长因子刺激的HER家族蛋白酪氨酸磷酸化，故RB200h 也可能抑制细胞增殖。这通过用或不用RB200h开展的单层细胞增殖研究 进行测试。
[0646]软琼脂集落生长测定法基于Hudziak等(1987)所述的方法进行， 除了该测定法在24孔板中进行以外，其中在所述的24孔板中以含有10％ 胎牛血清的培养基中的1.5ml 0.5％琼脂糖作为基础层，并且含有细胞的顶 层是在10％胎牛血清中的0.5ml 0.25％琼脂糖。将化合物添加至顶层。在 37℃在具有5％CO2和95％空气的加湿培养箱中实施集落生长。每隔大约 3日，添加50μl/孔无菌水以防止变干。细胞集落用1.0ml/孔在水中的 0.001％结晶紫在4℃染色过夜。使用显微镜计数细胞集落。
[0647]HER调蛋白RB200h以剂量依赖性方式抑制A431表皮样癌和 MDA-MB-468乳腺癌细胞增殖，EC50分别是71nM和1.4nM(图11)。筛 查了单层培养的几种其它肿瘤细胞系对RB200h的敏感性。将本项研究延 伸以包括其它随机选择的肿瘤细胞。多样类型的肿瘤细胞(包括皮肤癌、乳 腺癌和肺癌细胞)的生长受RB200h抑制(表29)。然而，一些肿瘤细胞系(包 括乳腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌细胞)对RB200h的生长抑制作用不敏感。表29：RB 200抑制单层培养中的多样类型肿瘤细胞的增殖
[0648]还通过软琼脂集落生长测定法测试了RB200h抑制不依赖贴壁 性生长的能力。在软琼脂测定法中测试了在单层生长中对RB200h的生长 抑制作用敏感的两种肿瘤细胞系ZR-75-1乳腺癌和A549肺癌细胞。 ZR-75-1细胞在软琼脂中生长不良，不过经EGF(HER1配体)或 NRG1β1(HER3配体)刺激以形成集落，其中生长因子NRG1β更有效，产 生9倍刺激，而EGF引起集落生长的3倍刺激(图12a)。RB200h抑制EGF 或NRG1β1刺激的ZR-75-1细胞软琼脂集落生长，表明RB200h的行为类 似于针对这些生长因子的配体阱(图12a)。A549肺癌细胞在软琼脂中易于 形成集落，不过与不用生长因子处理相比，可以受到NRG1β1或EGF刺 激分别达1.3倍和1.4倍(图12b)。这种水平的集落生长刺激作用比对于 ZR-75-1细胞所观察到的水平小得多。RB200h处理A549细胞导致在生长 因子缺乏下对集落生长的大约65％抑制(图12b)。然而，RB200h不造成 EGF或NRG1β1处理的集落生长的统计显著性抑制(图12b)。后一个研究 结果可能归因于这样的事实：A549细胞在软琼脂中在不添加生长因子时轻 易地形成集落以及添加EGF或NRG1β1仅引起集落生长的勉强够格的 (～1.3倍)刺激作用，因此对于集落生长而言，它们不依赖于这些配体。总 之，数据显示RB200h通过作为生长因子配体阱和通过非配体阱机制发挥 作用而抑制细胞增殖。实施例19在无血清培养基中研究RB200h阻断EGF或NRG1β1诱导 的细胞增殖
[0649]为进一步检验RB200h是HER1配体阱或HER3配体阱的假设， 开展研究以确定RB200h是否抑制EGF或NRG1β1刺激的细胞增殖。如所述在无血清培养基中开展细胞增殖研究。根据细胞系，将细胞以 每孔2000-6000个细胞铺种在96孔组织培养板内(Falcon#35-3075，Becton Dickinson，NJ)，并且随后培育过夜(15-18小时)。对于在含血清的培养基中 开展的细胞增殖研究，细胞随后用或不用所述化合物处理，并允许其生长 3-5日。如下文在无血清生长条件下实行RB200h对生长因子(EGF或 NRG1β1)刺激增殖的影响。在血清中接种细胞后，将细胞培育过夜(15-20 小时)，随后将细胞转换为无血清培养基并培育24-48小时(血清饥饿)。细 胞随后用生长因子或LPA处理并且用或不用RB200h处理，并且培育3-5 日。细胞增殖如前所述通过结晶紫染色法(Sugarman，1987)定量。简而言 之，倾去培养基，将细胞用PBS洗涤一次，随后添加在甲醇中的50μl/孔 0.5％(w/v)结晶紫染液(Sigma-Aldrich，St Loius，MO)并孵育20分钟。将板 用水洗涤3次并且随后空气干燥过夜。结合细胞的染料用100μl/孔 Sorenson缓冲液(在50％乙醇中的25mM柠檬酸钠)在板振荡器上洗脱15 分钟。该板随后在板读数仪上在540nm波长处读取吸光度，其中所述的 吸光度与孔内细胞的数目成比例。
[0650]EGF刺激SUM149细胞增殖。EGF刺激的这种增殖由RB200h 完全阻断(图13a和14a)。用NRG1b1处理据报道应答于NRG1β1(Lewis， GD等Cancer Res.1996，56：1457-65)的MCF-7细胞(图13b)。该生长因子 在无血清条件下引起对MC7细胞增殖的剂量依赖性刺激。NRG1β1刺激 的这种细胞增殖由RB200h完全阻断。
[0651]总之，对配体刺激的增殖的拮抗作用数据表明RB200h是针对 HER1配体和HER3配体的配体阱。实施例20
HER调蛋白抑制GPCR配体刺激的细胞增殖
HER调蛋白抑制GPCR配体刺激的细胞增殖
[0652]对于肿瘤细胞而言，生长因子的重要源头来自ADAM金属蛋白 酶的GPCR配体激活作用，其中所述的ADAM金属蛋白酶切割跨膜结合 的生长因子如双调蛋白、HB-EGF或TGF-α，最终释放这些生长因子 (Huovila，AJ等TIBS 2005，30：413-422)。如此产生的生长因子随后以旁 分泌或以自分泌方式可用于刺激肿瘤细胞增殖。因为RB200h结合HER1 配体和HER3配体，故它可以阻断肿瘤细胞的这个生长因子源头并且导致 肿瘤细胞生长抑制。使用SUM149乳腺癌细胞检验该假设，其中据报道 SUM149乳腺癌细是双调蛋白(AR)自分泌产生性及AR依赖性细胞 (Willmarth，NE和Ethier，SP.J.Biol.Chem.2006，281：37728-37737)。
[0653]细胞增殖如实施例19中所述进行。在无血清生长方式下进行 GPCR配体LPA刺激的增殖作用。
[0654]用溶血磷脂酸(LPA)处理SUM149细胞导致细胞增殖的剂量依 赖性增加(图13b和14b)。LPA刺激的这种增殖被RB200h完全阻断(图13b 和14b)，这与以下观点相一致：HER调蛋白作为生长因子配体阱针对 GPCR激活的生长因子释放发挥作用。实施例21HER调蛋白与酪氨酸激酶抑制剂协同
[0655]当与针对HER1或HER2激酶的酪氨酸激酶抑制剂联合时，针 对HER家族蛋白的生物物质(Biologic agent)已经显示在抑制细胞增殖方 面的协同应答(Mendelsohn，J和Baselga，J.Semin.Oncol.2006，33： 369-385)。因此，我们用RB200h和酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(易瑞沙)、 埃罗替尼(Tarceva)(FDA批准的一种EGFR激酶抑制剂)并用酪氨酸磷酸化 抑制剂(tyrphostin)AG 825(HER2激酶抑制剂)在单层细胞增殖测定法中实 施联合研究。
[0656]细胞增殖研究如所述在含血清培养基或在无血清培养中进行。 根据细胞系，将细胞以每孔2000-6000个细胞铺种在96孔组织培养板内 (Falcon#35-3075，Becton Dickinson，NJ)，并且随后培育过夜(15-18小时)。 对于在含血清培养基中进行的细胞增殖研究，将细胞随后用或不用所述化 合物处理，并允许其生长3-5日。对于在无血清生长条件下进行的细胞增 殖研究，在血清中接种细胞后，将细胞培育过夜(15-20小时)，随后将细胞 转换为无血清培养基并培育24-48小时(血清饥饿)。化合物如RB200h、IRS、 易瑞沙、吉非替尼、埃罗替尼和AG-825随后一式两份同时应用并且进行 连续倍比稀释。细胞增殖如前所述通过结晶紫染色法(Sugarman，1987)定 量化。简而言之，倾去培养基，将细胞用PBS洗涤一次，随后添加在甲醇 中的50μl/孔0.5％(w/v)结晶紫染液(Sigma-Aldrich，St Loius，MO)并孵育 20分钟。将板用水洗涤3次并且随后空气干燥过夜。结合细胞的染料用100 μl/孔Sorenson缓冲液(在50％乙醇中的25mM柠檬酸钠)在板振荡器上洗 脱15分钟。该板随后在板读数仪上在540nm波长处读取吸光度，其中所 述的吸光度与孔内细胞的数目直接成比例。
[0657]在NSCLC(H1437)细胞中，仅RB200h或仅AG 825抑制细胞 生长至低水平。这些肿瘤细胞耐受EGFR和HER2激酶抑制剂。联合的 RB200h和AG 825产生明显协同作用(图15a)。协同作用数据由专门设计 用于客观地确定药物联合研究中协同作用的程序(T-C Chou和P.Talalay； Trends Pharmacol.Sci 4，450-454)CalcuSyn(Biosoft，Cambridge UK)分析。 使用该分析数据，CalcuSyn程序产生称作联合指数(CI)的参数。当CI小 于1.0时，则两种化合物之间存在协同作用。CI为1，意味存在相加性应 答并且大于1的CI表示化合物之间存在拮抗作用。对于AG-825而言，与 RB200h的联合在NSCLC H1437细胞内在所测试的全部浓度上是协同的， CI是0.20(图15a)。
[0658]在乳腺癌细胞系MDA-MB-468中针对EGFR的另一种酪氨酸 激酶抑制剂吉非替尼也与RB200h高度协同，C.I是0.20(图15b)。这种与 RB200h的协同作用也在埃罗替尼中观察到，其中埃罗替尼是FDA批准的 另一种EGFR激酶抑制剂(图15c)。在NSCLC细胞H2122中也发现Rb200h 与埃罗替尼协同发挥作用(图16)。相反，在正常细胞如Hs578Bst中，RB200h 未显著抑制细胞增殖并且在RB200h和吉非替尼之间也不存在协同作用(图 15d)。在几种其它肿瘤细胞系中也见到RB200h与AG-825或与易瑞沙之 间的协同作用。
[0659]图17-20显示与RB200h或酪氨酸激酶抑制剂相比，在A431细 胞中RB200h与AG825、在A431细胞中RB200h与易瑞沙、和在BT474 细胞中RB200h与IRS的连续稀释物协同地发挥抑制细胞增殖的作用。在 一些细胞中，协同作用是强烈的，而在其它细胞中，存在微弱的协同作用(表 30)。表30：RB200与酪氨酸激酶抑制剂高度地协同
[0660]总之，数据显示在极低剂量上的RB200h的确与针对HER1或 HER2激酶的酪氨酸激酶抑制剂的生长抑制活性协同。这暗示RB200h可 以作为治疗剂与针对HER1或HER2激酶的酪氨酸激酶抑制剂联合而具有 其最大用途，包括在耐受这些激酶抑制剂的那些患者中的用途。实施例22
HER调蛋白RB200h在A431人肿瘤异种移植模型中具有体内抗肿瘤 效力。
HER调蛋白RB200h在A431人肿瘤异种移植模型中具有体内抗肿瘤 效力。
[0661]使用裸小鼠，在A431人肿瘤异种移植模型中测试RB200h的体 内效力。在本实施例中给出了所用的一般方法，以及所用的一般方法的一 些变化。动物
[0662]从供应商处(Harlan，UK)获得小鼠。小鼠在本研究开始时是4-6 周龄。小鼠饲养在屏障单元内的消毒隔离间中，由荧光灯照明，其中将所 述的荧光灯设置为产生12小时光照-黑暗循环(7点开启，19.00点关闭)，如 1986年英国动物事务(科学程序法)法案(United Kingdom Home Office Animals(Scientific Procedures)Act)推荐。通过设计旨在维持23±2℃空气 温度的系统调节房间环境。小鼠在实验期间以2只或5只分组住在塑料笼 内(Techniplast UK)，所述的塑料笼具有已辐照过的卧具并配以筑巢材料和 丰容环境(environmental enrichment)。随意供给无菌辐射过的2019啮齿类 食料(Harlan Teckland UK，产品编号Q219DJ1R2)和高压灭菌水。初步毒性研究
[0663]每组2只小鼠，共分三组如下：组1：每周三次腹膜内注射 (n＝2)30mg/kg RB200h；组2：每周在第1-5日循环腹膜内注射(n＝2)75mg/kg 易瑞沙；和组3：每周三次腹膜内注射(n＝2)10mg/kg RB200h并且每周在 第1-5日循环腹膜内注射38mg/kg易瑞沙。治疗评价
[0664]存在以下8个组：组1：每周三次腹膜内注射RB200h的载体 (n＝10)，组2：每周三次腹膜内注射(n＝10)10mg/kg RB200h，组3：(n＝10)30 mg/kg RB200h每周三次腹膜内注射，组4：每周在第1-5日循环腹膜内注 射易瑞沙的载体(n＝10)，组5：每周在第1-5日循环腹膜内注射(n＝10)38 mg/kg易瑞沙，组6：每周在第1-5日循环腹膜内注射(n＝10)75mg/kg易瑞 沙，组7：RB200h和易瑞沙的载体(n＝10)，和组8：每周三次腹膜内注射 (n＝10)10mg/kg RB200h和每周在第1-5日循环腹膜内注射38mg/kg易瑞 沙。肿瘤起始
[0665]A431细胞由PRECOS供应并在37℃于5％CO2和加湿环境下 体外维持在含有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Sigma，Poole，UK)的 RPMI1640培养基(Gibco，Paisley，UK)中。将源自亚汇合(sub-confluent) 单层的细胞用0.025％EDTA收集、在上文所述培养基中洗涤两次，并重悬 于无菌磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中用于体内施用。将细胞以1×107个 细胞在100μl体积中皮下注射至小鼠。肿瘤监测
[0666]对于初步毒性研究，将小鼠分配至治疗组并且治疗在第5日以 给药体积为每次注射150μl开始持续2周。对于治疗研究，将小鼠分配至 治疗组，并且在平均肿瘤体积达到50-100mm3时开始治疗并且以给药体积 为每次注射150]μl持续3周给药。每周记录肿瘤大小三次(卡尺测量长度和 宽度和计算的肿瘤横截面积和体积)并每周测量体重。处死
[0667]在研究中保留每只小鼠直至处死或必须从该研究中移除小鼠为 止。如肿瘤大小变得太大或任何有害效果明显，则处死动物。在处死时， 将小鼠麻醉(Hypnorm/Hynovel)并将约1ml血液通过心脏穿刺取出，加 工成血浆，冷冻用于初步研究和治疗研究。小鼠随后通过批准的S1方法处 死。对于治疗研究，将肿瘤切下、称重、测量并在福尔马林中固定。数据和统计学分析
[0668]将体重数据、肿瘤生长和最终肿瘤重量记录并以表格页和图表 格式报告。根据需要使用Minitab开展统计分析。自初步研究的变化
[0669]初步毒性研究在给药12日后终止，以便在给药后3小时收集血 浆样本。由PRECOS添加如下一个额外组用于治疗研究。组9：30mg/kg人 IgG腹膜内注射，每周三次。由PRECOS制备在PBS中的10％DMSO及 5％Cremaphor中的易瑞沙。肿瘤用2×106个细胞每只小鼠引发(initiated) 用于治疗研究。如赞助商所要求，将RB200h和IgG进行静脉内给药用于 治疗研究。因为第一次给药后在组2、组3和组8中的不利作用，将给药 返回至腹膜内注射用于研究的剩余部分。本研究在第26日终止，原因在于 众多小鼠中肿瘤的溃疡。结果
[0670]对于初步毒性研究，用A431细胞如在方法中祥述的那样引发 皮下肿瘤，并且在第5日开始用Rb200h和/或易瑞沙。在A431荷瘤小鼠 中没有观察到不利作用。在整个毒性研究期间，小鼠的体重仍在可接受的 范围(图24A)。在处死前测定肿瘤体积，组1的平均肿瘤大小为非常大。 在易瑞沙处理组中存在对肿瘤大小的抑制(组2和3)(图24B)。
[0671]由于注射1×107个细胞后2周出现的肿瘤的巨大尺寸，故减少 用来引起肿瘤的细胞数目至2×106以增加研究的时间范围(time frame)。 使用两批次的细胞与小鼠(批次A和批次B)经2日启动本研究。在第10 日，肿瘤平均大小达到50-100mm3并且给药开始。对于RB200h、IgG和 RB200h载体的给药改成静脉内施用而非腹膜内施用。将第一批次给药， 并且在组2、组3和组8中的RB200h治疗小鼠中观察到不良反应。在组 3中，在本项研究中所用最高浓度30mg/kg RB200h上，一只小鼠没有恢 复。观察其余小鼠并且它们在1小时后恢复。虽然RB200h先前已经进行 过静脉内施用，然而所述RB200h批次和肿瘤模型不同于本项研究中所用 的RB200h批次和肿瘤模型。本批次中的内毒素水平也比先前所用批次中 的内毒素水平更低。在静脉内给药前，将RB200h升温至37℃并且对组3 中的2只小鼠给药并观察。如前，小鼠在10分钟后出现皮肤红/紫色并在1 小时后恢复。因此将给药方法恢复成腹膜内注射用于剩余小鼠并且未见其 它反应。
[0672]在本研究的整个过程中监测肿瘤大小并且对时间作图的每组均 值示于图25A-D。该数据也总结于下表40。也测量了最终肿瘤重量并且每 组均值示于图26.该数据也总结于表40中。
[0673]与载体组(vehicle group)相比，较高剂量的单独 RB200h(30mg/kg，组3)显著降低肿瘤生长速率(p＜0.05，两因素方差分析)。 也50％显著减少最终肿瘤重量(p＝0.016，单因素方差分析，图26)。相比而 言，10mg/kg RB200h没有显著减弱A431肿瘤生长，尽管存在以大约 15-20％减少肿瘤大小的趋势。由PRECOS提供与RB200h剂量相等的人 IgG剂量(30mg/kg，组9)作为蛋白质对照。没有发现IgG对肿瘤生长的影 响。
[0674]较高剂量的易瑞沙(75mg/kg，组6)显著降低肿瘤生长速率(图2， p＜0.001，两因素方差分析)，而38mg/kg易瑞沙没有与载体组(组4)比较。 当用75mg/kg易瑞沙治疗时，最终肿瘤重量也降低了69％(p＝0.016，单因 素方差分析，图26)。随时间推移，易瑞沙的载体(组4)也具有来自Rb200h 载体组的抑制影响(图25D，p＜0.05，两因素方差分析)并且减少最终肿瘤大 小43％(图26)，尽管这不是显著的。在组合中，10mg/kgRB200h和38mg/kg 易瑞沙(组8)不影响A431肿瘤的生长(图25C和26)。发现载体组(组7)减 少了肿瘤大小30％，不过发现其不是显著的。表40
＊与组1的统计显著性
#与组4的统计显著性
＊与组1的统计显著性
#与组4的统计显著性
[0675]小鼠体重也在本研究的持续期间检测并且如所预期随小鼠的年 龄而逐步增加(图27)。讨论
[0676]本实施例中这些实验的目的是在A431皮下异种移植模型中评 估单独或与易瑞沙组合的RB200h的效果。据报道A431表皮样癌表达高 水平的EGFR和Her2(Ono M等2006.Clin Cancer Res.12(24)：7242-51) 并且它已经用在易瑞沙的临床前期评价(Wakeling AE等，2002.Cancer Res.62(20)：5749-54)中，其中所述的易瑞沙是EGFR酪氨酸激酶结构域的 选择抑制物，目前在美国可在临床上用于治疗NSCLC。RB200h是针对表 达泛Her的肿瘤而专门设计的配体阱分子，并且因此选择A431异种移植 模型以评估RB200h。
[0677]最初的初步毒性研究显示在携带该肿瘤的小鼠中充分耐受腹膜 内施用，然而当施用途径改成静脉内时，观察到不良反应。在用RB200h 静脉内给药的携带ZR75-1的小鼠中未见这种不良反应(P130：RB200h在 携带皮下肿瘤ZR75-1的裸小鼠中的初步毒性研究)。据报道内毒素水平也 小于当前研究所用批次的内毒素水平。所得的效果因此可以归因于RB200h 和/或肿瘤类型的批次制备物中备选参数的变异。
[0678]发现30mg/kg RB200h剂量显著减弱A431肿瘤生长，而10mg/kg 未显著减弱A431肿瘤生长。类似地，最高剂量75mg/kg易瑞沙显著减少 肿瘤生长，而38mg/kg未显著减少肿瘤生长。当RB200h和易瑞沙以较低 剂量联合时，没有观察到肿瘤生长的减弱。在本项研究中没有联合较高的 剂量。虽然易瑞沙比RB200h具有更大的治疗效果，然而本项研究中所用 的易瑞沙剂量接近于MTD，而RB200h的MTD仍未确定。
[0679]开展进一步的剂量上升研究以与临床可获得的剂量对比而确定 RB200h的MTD，从而确定最大治疗反应。另一组实验测试RB200h在其 它模型(如皮下ZR75-1(Her2高表达的乳腺癌细胞系)模型和 MDA-MB231(EGFR高表达的乳腺癌细胞系)骨转移模型)中的影响。BT20 乳腺癌细胞系表达高水平的EGFR和Her2并且因此将用于评价RbB200h。实施例23
设计具有更高配体结合亲和力和能力的panHER配体阱：HER1ECD 基于结构的诱变
设计具有更高配体结合亲和力和能力的panHER配体阱：HER1ECD 基于结构的诱变
[0680]尽管RB200h以大约10nM对HER1或HER3配体显示相对高 的结合亲和力，然而细胞以Kd大约0.3-3nM结合HER1配体(如EGF或 TGF-α)，并且对于HER3配体而言，NRG1β1是大约0.1nM至7.0nM (Holmes等；Slikowski等；Pinkas-Kramarski等1996)。这表明肿瘤细胞 对于HER1或HER3配体具有比RB200h更高的亲和力，其中所述RB200h 对EGF或NRG1-β1结合的Kd是大约10nM。因此，意图设计这样的 panHER配体阱，其亲和力高于对RB200h所观察到的亲和力。这首先通 过计算机建模进行，使用与EGFR(HER1)结合的EGF的已公开的共晶体 结构来优化针对其配体的高亲和力HER1/Fc。将人表皮生长因子和受体胞 外结构域的复合体的晶体结构(Ogiso H等，Cell(2002)775-787)用于基于计 算机的配体-受体相互作用优化。三维蛋白质结构来自结构信息学研究协作 实验室蛋白质数据库(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB)′s Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb))。所 设计配体-受体相互作用的优化基于氨基酸的物理化学特性及其分类，如电 荷、极性、芳香族等。还考虑残基体积、表面积、溶剂可抵达性等。使用 PAM250矩阵来辅助预测氨基酸替换(W.A Pearson，Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA，在Methods in Enzymology一书中，R.Doolittle编辑(ISBN 0-12-182084-X，Academic Press，San Diego)183(1990)63-98；以及还有M.O.Dayhoff，编辑，1978， Atlas of Prtotein Sequence and Structure，第5卷).A.高通量诱变
[0681]如下进行高通量诱变：通过诱变法替换单个氨基酸，随后使克 隆表达并筛选其针对EGF、HB-EGF、TGF-α和双调蛋白(AR)的配体结合 活性。在HER1中第39位置处具有苏氨酸至丝氨酸替换(称作T39S)的突 变体由建模研究预测产生高亲和力，对其筛选并且发现它结合EGF、 TGF-α和HB-EGF。这种HER1/Fc T39S突变体称作HFD120。除了 HFD120之外，还产生了几种其它突变体。
[0682]使用延伸酶(Invitrogen)和pfu聚合酶(Stratagene)进行重叠PCR 以将设计的点突变导入HFD100(模板)(图21和表31)。
[0683]所用的正向引物是EGFR-F1：5′-AATTCGTACG ACCGCCACC ATG GGA CCCTCCGGGACGGCC-3′并且所用的反向引 物是EGFR650-R1：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT CTA GGA CGG GAT CTTAGG CCCA。
[0684]第一轮PCR：HFD100用作PCR模板。使用延伸酶和pfu聚合 酶，以引物EGFR-F1和EGFRmu_R2进行PCR。PCR条件是94℃，2分 钟；然后94℃，45秒；60℃，45秒；68℃，3分钟进行26个循环。对于 引物EGFRmu_F2和EGFR-R1，PCR条件是94℃，2分钟；然后94℃， 45秒；60℃，45秒；68℃，3分钟进行26个循环。扩增后，将PCR产物 在1％琼脂糖凝胶上分离并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯 化。
[0685]第二轮PCR：第一轮PCR产物以摩尔比例1∶1混合。使用延伸 酶和pfu聚合酶以及以下条件9℃，2分钟；然后94℃，45秒；57℃，45秒； 68℃，3分钟持续8个循环而进行PCR。
[0686]第三轮PCR：第二轮PCR产物用作模板。使用延伸酶和pfu聚 合酶，以引物EGFR-F1和EGFR-R1进行PCR。PCR条件是94℃，2分钟； 94℃，45秒；60℃，45秒；68℃，3分钟进行26个循环。PCR产物在1％ 琼脂糖凝胶上分离并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。纯化 的PCR产物亚克隆至p221DONR载体。表31：用于突变分析HFD100的EGFR mu引物
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu01_R2 138 A01 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TCT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu02_R2 137 A02 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGA TTT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu03_R2 137 A03 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TGT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu04_R2 124 A04 TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGT TCA ACT GCG TGA GCT TGT TAC EGFRmu05_R2 124 A05 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TCT TCA AAA GTG TTC AAC TGC GTG AGC TTG TTA C EGFRmu06_R2 121 A06 AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC CAC CTG CGT GAG CTT GTT ACT CG EGFRmu07_R2 121 A07 GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGC CAA TCT GCG TGA GCT TGT TAC TC
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu08_R2 277 A08 GAA TTC GCT CCA CTG TGT TGA CGG CAA TGA GGA CAT AAC CAG EGFRmu09_R2 277 A09 GAA TTC GCT CCA CTG TGT TGA TGG CAA TGA GGA CAT AAC CAG EGFRmu10_R2 205 A10 AAA GAT CAT AAT TCC TCT GCA CCC AGG TAA TTT CCA AAT TCC CA EGFRmu11_R2 338 A11 CTG CTA AGG CAT AGG AAT TTT CCC AGT ACA TAT TTC CTC TGA TGA T EGFRmu12_R2 342 A12 GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT ATC GTA GTA CAT ATT TCC TCT GA EGFRmu13_R2 340 B01 ACT GCT AAG GCA TAG GAA TTT TGG TAG TAC ATA TTT CCT CTG ATG EGFRmu14_R2 367 B02 GGT TTT ATT TGC ATC ATA GTT AGC TAA GAC TGC TAA GGC ATA GGA EGFRmu15_R2 367 B03 GGT TTT ATT TGC ATC ATA GTT AGT TAA GAC TGC TAA GGC ATA GGA EGFRmu16_R2 128 B04 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA ATT TGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu17_R2 128 B05 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA ATT GGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu18_R2 129 B06 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAA TGC CCA ACT GCG TGA GCT EGFRmu19_R2 128 B07 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu20_R2 128 B08 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAT AGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu21_R2 128 B09 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAC CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu22_R2 128 B10 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAA GGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu23_R2 145 B11 GAA CAT CCT CTG GAG GCT GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC CA EGFRmu24_R2 145 B12 TTG AAC ATC CTC TGG AGG CTC CAA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC EGFRmu25_R2 149 C01 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GTG AGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG EGFRmu26_R2 148 C02 TAT TGA ACA TCC TCT GGA GGA GGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGC EGFRmu27_R2 145 C03 GTT ATT GAA CAT CCT CTG GAG GAG GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC C EGFRmu28_R2 145 C04 GTT ATT GAA CAT CCT CTG GAG TTG GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC C EGFRmu29_R2 148 C05 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG AGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG C EGFRmu30_R2 145 C06 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG TAA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC A EGFRmu31_R2 145 C07 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG TTA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC EGFRmu32_R2 118 C08 TGA TCT TCA AAA GTG CCC AAC TCC GTG AGC TTG TTA CTC GTG CC EGFRmu33_R2 118 C09 TGA TCT TCA AAA GTG CCC AAC GAC GTG AGC TTG TTA CTC GTG C
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu34_R2 118 C10 GAT CTT CAA AAG TGC CCA ACT TCG TGA GCT TGT TAC TCG TGC EGFRmu35_R2 118 C11 ATG ATC TTC AAA AGT GCC CAA GTA CGT GAG CTT GTT ACT CGT G EGFRmu36_R2 115 C12 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCG AGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu37_R2 116 D01 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCT TGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu38_R2 115 D02 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCT CGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu39_R2 115 D03 ATC TTC AAA AGT GCC CAA CTG ATA GAG CTT GTT ACT CGT GCC EGFRmu40_R2 100 D04 ACT GCG TGA GCT TGT TAC TCT GGC CTT GGC AAA CTT TCT TTT C EGFRmu41_R2 1300 D05 CGA CTG CAA GAG AAA ACT GAC GAT GTT GCT TGG TCC TGC CG EGFRmu42_R2 1300 D06 ACG ACT GCA AGA GAA AAC TGA TTA TGT TGC TTG GTC CTG CCG EGFRmu43_R2 1393 D07 GCA TAG CAC AAA TTT TTG TTT CGT GAA ATT ATC ACA TCT CCA TC EGFRmu44_R2 1393 D08 TTT GCA TAG CAC AAA TTT TTG TTA TGT GAA ATT ATC ACATCT CCA TC EGFRmu45_R2 146 D09 TTG AAC ATC CTC TGG AGG CTT TGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CC EGFRmu46_R2 1109 D10 AAA TGC CAC CGG CAG GAT GCG GAG ATC GCC ACT GAT GGA EGFRmu47_R2 1120 D11 GAG TCA CCC CTA AAT GCC AGC GGC AGG ATG TGG AGA TCG EGFRmu48_R2 1126 D12 TGT GAA GGA GTC ACC CCT ATG TGC CAC CGG CAG GAT GTG EGFRmu49_R2 1132 E01 GAG TAT GTG TGA AGG AGT CAG CCC TAA ATG CCA CCG GCA EGFRmu50_R2 1132 E02 GAG TAT GTG TGA AGG AGT CAT TCC TAA ATG CCA CCG GCA G EGFRmu51_R2 1226 E03 CCG TCC TGT TTT CAG GCC ATT CCT GAA TCA GCA AAA ACC CT EGFRmu52_R2 1226 E04 CCG TCC TGT TTT CAG GCC AAT CCT GAA TCA GCA AAA ACC CT EGFRmu53_R2 1228 E05 GTC CGT CCT GTT TTC AGG CTC AGC CTG AAT CAG CAA AAA CC EGFRmu54_R2 1330 E06 GTA ATC CCA AGG ATG TTA TGT CCA GGC TGA CGA CTG CAA GA EGFRmu55_R2 1472 E07 CTG TTT TCA CCT CTG TTG CTT TTA ATT TTG GTT TTC TGA CCG G EGFRmu56_R2 1459 E08 TCT GTT GCT TAT AAT TTT GGT TTC CTG ACC GGA GGT CCC AAA C EGFRmu57_R2 1459 E09 TCT GTT GCT TAT AAT TTT GGT TTG CTG ACC GGA GGT CCC AAA C EGFRmu58_R2 1475 E10 GCA GCT GTT TTC ACC TCT GTT TTT TAT AAT TTT GGT TTT CTG ACC G EGFRmu59_R2 166 E11 CCA AGG ACC ACC TCA CAG TTT TCG AAC ATC CTC TGG AGG CTG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu60_R2 160 E12 CCA CCT CAC AGT TAT TGA ACA GCC TCT GGA GGC TGA GAA AAT EGFRmu61_R2 160 F01 CCA AGG ACC ACC TCA CAG TTT TCG TAC AGC CTC TGG AGG CTG AGA AAA EGFRmu62_R2 127 F02 GAG GCT GAG AAA ATG ATC TTC AGC ATC GCC CAA CTG CGT GAG CTT EGFRmu63_R2 127 F03 TCT GGA GGC TGA GAA AAT GAT TTT CAG CAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu64_R2 95 F04 TGA GCT TGT TAC TCG TGC CTG GGC AAA CTT TCT TTT CCT CCA EGFRmu65_R2 283 F05 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GTC GAA AAT TCG TTG AGG GCA ATG AGG ACA EGFRmu66_R2 314 F06 GTA CAT ATT TCC TCT GAT GAT CCG CAG GTT TTC CAA AGG AAT TC EGFRmu67_R2 329 F07 AAG GCA TAG GAA TTT TCG TAG ACC TGA GTT CCT CTG ATG ATC TGC AGG EGFRmu68_R2 364 F08 CGG TTT TAT TTG CAT CAT AGT TTA ACA TGA CTG CTA AGG CAT AGG AAT EGFRmu69_R2 407 F09 CAT GCA GGA TTT CCT GTA AAT TTG TCA GGC GCA GCT CCT TCA GTC CGG EGFRmu70_R2 448 F10 CGT TGC ACA GGG CAG GGT TCT TTT CGA TCC GCA CGG CGC CAT GCA EGFRmu71_R2 460 F11 TGC TCT CCA CGT TGC ACA GTT TAT CGT TGT TGC TGA ACC GCA CG EGFRmu72_R2 472 F12 CCA CTG GAT GCT CTC CAC GTG GCA CAG GGC AGG GTT GTT G EGFRmu73_R2 202 G01 AGA TCA TAA TTC CTC TGC ACA AGG ACA ATT TCC AAA TTC CCA AGG AC EGFRmu74_R2 202 G02 AGA AGG AAA GAT CAT AAT TCC TCC CCG TAA GGA CAA TTT CCA AAT TCC CAA GGA C EGFRmu75_R2 286 G03 GTT TTC CAA AGG AAT TCG CTC AAA TGT GTT GAG GGC AAT GAG GA EGFRmu76_R2 286 G04 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GAC TCA AAT GTG TTG AGG GCA ATG AGG A EGFRmu77_R2 283 G05 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GTC GAA AAT TCG TTG AGG GCA ATG AGG ACA EGFRmu78_R2 364 G06 CGG TTT TAT TTG CAT CAT AGT TAA ACA TGA CTG CTA AGG CAT AGG AAT EGFRmu79_R2 364 G07 CTT CAG TCC GGT TTT ATT TGC ATT ATA GTT AAA CAT GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT EGFRmu80_R2 448 G08 AGG GCA GGG TTG TTG CTG ATC CGC ACG GCG CCA TGC A EGFRmu81_R2 448 G09 CCA CGT TGC ACA GGG CAG GCT TGT TGC TGA TCC GCA CGG CGC CAT GCA EGFRmu82_R2 103 G10 CCA ACT GCG TGA GCT TGT TAA GCG TGC CTT GGC AAA CTT TCT EGFRmu83_R2 103 G11 CCA ACT GCG AGA GCT TGT TAA GCG TGC CTT GGC AAA CTT TCT T EGFRmu84_R2 127 G12 TCC TCT GGA GGC TGA GAA ATT GAT TTT CAG CAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu85_R2 127 H01 CAT CCT CTG GAG GCT GAG ATA TTG ATT TTC AGC ATC GCC CAA CTG CGT GAG CTT
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu86_R2 124 H02 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAC CGT TCA ACT GCG TGA GCT TGT TAC EGFRmu87_R2 124 H03 AGG CTG AGA AAA TGA TCT TCA TAA CCG TTC AAC TGC GTG AGC TTG TTA C EGFRmu88_R2 124 H04 GAG GCT GAG AAA ATG ATC TTC ATA ATT GTT CAA CTG CGT GAG CTT GTT AC EGFRmu89_R2 1471 H05 GCA GCT GTT TTC ACC TCT GTT TTT TTG AAT TTT GGT TTT CTG ACC GGA G EGFRmu90_R2 1297 H06 CGA CTG CAA GAG AAA ACT GAC GAA CTT GCT TGG TCC TGC CGC G EGFRmu91_R2 507 H07 ACA TGT TGC TGA GAA AGT CAC CCC TGA CTA TGT CCC GCC ACT EGFRmu92_R2 514 H08 GTG GTT CTG GAA GTC CAT CAC GAT CTC GGC GTC ACG GTC ACT GCT GAC TAT GTC C EGFRmu93_R2 532 H09 GCA GCT GCC CAG GTG GTT GTC GCC TTT CAC CGA CAT GTT GCT GAG AAA GTC EGFRmu94_R2 118 H10 TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGT CCA AGT ACG TGA GCT TGT TAC TCG TGC EGFRmu95_R2 115 H11 GAT CTT CAA AAG TGC CCA ACT CAT AGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu96_R2 337 H12 GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT ATC GTG GTA CAT ATT TCC TCT GAT GAT CTG EGFRmu01_F2 1725 A01 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu02_F2 1726 A02 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAA ATC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu03_F2 1726 A03 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAC AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu04_F2 1739 A04 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA EGFRmu05_F2 1739 A05 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA CTT TTG AAG AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu06_F2 1736 A06 CGA GTA ACA AGC TCA CGC AGG TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TT EGFRmu07_F2 1736 A07 GAG TAA CAA GCT CAC GCA GAT TGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TC EGFRmu08_F2 1586 A08 CTG GTT ATG TCC TCA TTG CCG TCA ACA CAG TGG AGC GAA TTC EGFRmu09_F2 1586 A09 CTG GTT ATG TCC TCA TTG CCA TCA ACA CAG TGG AGC GAA TTC EGFRmu10_F2 1658 A10 TGG GAA TTT GGA AAT TAC CTG GGT GCA GAG GAA TTA TGA TCT TT EGFRmu11_F2 1525 A11 ATC ATC AGA GGA AAT ATG TAC TGG GAA AAT TCC TAT GCC TTA GCA G EGFRmu12_F2 1521 A12 TCA GAG GAA ATA TGT ACT ACG ATA ATT CCT ATG CCT TAG CAG TC EGFRmu13_F2 1519 B01 CAT CAG AGG AAA TAT GTA CTA CCA AAA TTC CTA TGC CTT AGC AGT EGFRmu14_F2 1496 B02 TCC TAT GCC TTA GCA GTC TTA GCT AAC TAT GAT GCA AAT AAA ACC EGFRmu15_F2 1496 B03 TCC TAT GCC TTA GCA GTC TTA ACT AAC TAT GAT GCA AAT AAA ACC
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu16_F2 1735 B04 AAG CTC ACG CAG TTG GGC AAA TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu17_F2 1735 B05 AAG CTC ACG CAG TTG GGC CAA TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu18_F2 1734 B06 AGC TCA CGC AGT TGG GCA TTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA GCC EGFRmu19_F2 1735 B07 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu20_F2 1735 B08 AAG CTC ACG CAG TTG GGC TAT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu21_F2 1735 B09 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GGT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu22_F2 1735 B10 AAG CTC ACG CAG TTG GGC CTT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu23_F2 1718 B11 TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTG CCA GCC TCC AGA GGA TGT TC EGFRmu24_F2 1718 B12 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TTG GAG CCT CCA GAG GAT GTT CAA EGFRmu25_F2 1722 C01 CAC TTT TGA AGA TCA TTT TCT CAC CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA EGFRmu26_F2 1722 C02 GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCC TCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA EGFRmu27_F2 1718 C03 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TGC CCT CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA C EGFRmu28_F2 1718 C04 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TGC CCA ACT CCA GAG GAT GTT CAA TAA C EGFRmu29_F2 1722 C05 GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCG CCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA A EGFRmu30_F2 1718 C06 TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTT ACG CCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA A EGFRmu31 F2 1718 C07 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TAA CGC CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA EGFRmu32_F2 1745 C08 GGC ACG AGT AAC AAG CTC ACG GAG TTG GGC ACT TTT GAA GAT CA EGFRmu33_F2 1745 C09 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGT CGT TGG GCA CTT TTG AAG ATC A EGFRmu34_F2 1745 C10 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGA AGT TGG GCA CTT TTG AAG ATC EGFRmu35_F2 1745 C11 CAC GAG TAA CAA GCT CAC GTA CTT GGG CAC TTT TGA AGA TCA T EGFRmu36_F2 1742 C12 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCT CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu37_F2 1743 D01 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCA AGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu38_F2 1742 D02 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCG AGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu39_F2 1742 D03 GGC ACG AGT AAC AAG CTC TAT CAG TTG GGC ACT TTT GAA GAT EGFRmu40_F2 1763 D04 GAA AAG AAA GTT TGC CAA GGC CAG AGT AAC AAG CTC ACG CAG T EGFRmu41_F2 563 D05 CGG CAG GAC CAA GCA ACA TCG TCA GTT TTC TCT TGC AGT CG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu42_F2 563 D06 CGG CAG GAC CAA GCA ACA TAA TCA GTT TTC TCT TGC AGT CGT EGFRmu43_F2 470 D07 GAT GGA GAT GTG ATA ATT TCA CGA AAC AAA AAT TTG TGC TAT GC EGFRmu44_F2 470 D08 GAT GGA GAT GTG ATA ATT TCA CAT AAC AAA AAT TTG TGC TAT GCA AA EGFRmu45_F2 1717 D09 GGC ACT TTT GAA GAT CAT TTT CAA AGC CTC CAG AGG ATG TTC AA EGFRmu46_F2 754 D10 TCC ATC AGT GGC GAT CTC CGC ATC CTG CCG GTG GCA TTT EGFRmu47_F2 743 D11 CGA TCT CCA CAT CCT GCC GCT GGC ATT TAG GGG TGA CT EGFRmu48_F2 737 D12 CAC ATC CTG CCG GTG GCA CAT AGG GGT GAC TCC TTC ACA EGFRmu49_F2 731 E01 TGC CGG TGG CAT TTA GGG CTG ACT CCT TCA CAC ATA CTC EGFRmu50_F2 731 E02 CTG CCG GTG GCA TTT AGG AAT GAC TCC TTC ACA CAT ACT C EGFRmu51_F2 637 E03 AGG GTT TTT GCT GAT TCA GGA ATG GCC TGA AAA CAG GAC GG EGFRmu52_F2 637 E04 AGG GTT TTT GCT GAT TCA GGA TTG GCC TGA AAA CAG GAC GG EGFRmu53_F2 635 E05 GGT TTT TGC TGA TTC AGG CTG AGC CTG AAA ACA GGA CGG AC EGFRmu54_F2 633 E06 TCT TGC AGT CGT CAG CCT GGA CAT AAC ATC CTT GGG ATT AC EGFRmu55_F2 391 E07 CCG GTC AGA AAA CCA AAA TTA AAA GCA ACA GAG GTG AAA ACA G EGFRmu56_F2 404 E08 GTT TGG GAC CTC CGG TCA GGA AAC CAA AAT TAT AAG CAA CAG A EGFRmu57_F2 404 E09 GTT TGG GAC CTC CGG TCA GCA AAC CAA AAT TAT AAG CAA CAG A EGFRmu58_F2 388 E10 CGG TCA GAA AAC CAA AAT TAT AAA AAA CAG AGG TGA AAA CAG CTG C EGFRmu59_F2 1697 E11 CAG CCT CCA GAG GAT GTT CGA AAA CTG TGA GGT GGT CCT TGG EGFRmu60_F2 1703 E12 ATT TTC TCA GCC TCC AGA GGC TGT TCA ATA ACT GTG AGG TGG EGFRmu61_F2 1703 F01 TTT TCT CAG CCT CCA GAG GCT GTA CGA AAA CTG TGA GGT GGT CCT TGG EGFRmu62_F2 1736 F02 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA GAT CAT TTT CTC AGC CTC EGFRmu63_F2 1736 F03 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAT TTT CTC AGC CTC CAG A EGFRmu64_F2 1768 F04 TGG AGG AAA AGA AAG TTT GCC CAG GCA CGA GTA ACA AGC TCA EGFRmu65_F2 1580 F05 TGT CCT CAT TGC CCT CAA CGA ATT TTC GAC AAT TCC TTT GGA AAA CCT GCA EGFRmu66_F2 1549 F06 GAA TTC CTT TGG AAA ACC TGC GGA TCA TCA GAG GAA ATA TGT AC EGFRmu67_F2 1534 F07 CCT GCA GAT CAT CAG AGG AAC TCA GGT CTA CGA AAA TTC CTA TGC CTT EGFRmu68_F2 1499 F08 ATT CCT ATG CCT TAG CAG TCA TGT TAA ACT ATG ATG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 CAA ATA AAA CCG EGFRmu69_F2 1456 F09 CCG GAC TGA AGG AGC TGC GCC TGA CAA ATT TAC AGG AAA TCC TGC ATG EGFRmu70_F2 1415 F10 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCG AAA AGA ACC CTG CCC TGT GCA ACG EGFRmu71_F2 1403 F11 CGT GCG GTT CAG CAA CAA CGA TAA ACT GTG CAA CGT GGA GAG CA EGFRmu72_F2 1391 F12 CAA CAA CCC TGC CCT GTG CCA CGT GGA GAG CAT CCA GTG G EGFRmu73_F2 1661 G01 GTC CTT GGG AAT TTG GAA ATT GTC CTT GTG CAG AGG AAT TATGAT CT EGFRmu74_F2 1661 G02 GTC CTT GGG AAT TTG GAA ATT GTC CTT ACG GGG AGG AAT TAT GAT CTT TCC TTC T EGFRmu75_F2 1577 G03 TCC TCA TTG CCC TCA ACA CAT TTG AGC GAA TTC CTT TGG AAA AC EGFRmu76_F2 1577 G04 TCC TCA TTG CCC TCA ACA CAT TTG AGT CAA TTC CTT TGG AAA ACC TGC A EGFRmu77_F2 1580 G05 TGT CCT CAT TGC CCT CAA CGA ATT TTC GAC AAT TCC TTT GGA AAA CCT GCA EGFRmu78_F2 1499 G06 ATT CCT ATG CCT TAG CAG TCA TGT TTA ACT ATG ATG CAA ATA AAA CCG EGFRmu79_F2 1499 G07 AAT TCC TAT GCC TTA GCA GTC ATG TTT AAC TAT AAT GCA AAT AAA ACC GGA CTG AAG EGFRmu80_F2 1415 G08 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCA GCA ACA ACC CTG CCC T EGFRmu81_F2 1415 G09 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCA GCA ACA AGC CTG CCC TGT GCA ACG TGG EGFRmu82_F2 1760 G10 AGA AAG TTT GCC AAG GCA CGC TTA ACA AGC TCA CGC AGT TGG EGFRmu83_F2 1760 G11 AAG AAA GTT TGC CAA GGC ACG CTT AAC AAG CTC TCG CAG TTG G EGFRmu84_F2 1736 G12 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAA TTT CTC AGC CTC CAG AGG A EGFRmu85_F2 1736 H01 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAA TAT CTC AGC CTC CAG AGG ATG EGFRmu86_F2 1736 H02 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACG GTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA GCC EGFRmu87_F2 1736 H03 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACG GTT ATG AAG ATC ATT TTC TCA GCC T EGFRmu88_F2 1736 H04 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA ATT ATG AAG ATC ATT TTC TCA GCC TC EGFRmu89_F2 392 H05 CTC CGG TCA GAA AAC CAA AAT TCA AAA AAA CAG AGG TGA AAA CAG CTG C EGFRmu90_F2 566 H06 CGC GGC AGG ACC AAG CAA GTT CGT CAG TTT TCT CTT GCA GTC G EGFRmu91_F2 1356 H07 AGT GGC GGG ACA TAG TCA GGG GTG ACT TTC TCA GCA ACA TGT EGFRmu92_F2 1349 H08 GGA CAT AGT CAG CAG TGA CCG TGA CGC CGA GAT CGT GAT GGA CTT CCA GAA CCA C EGFRmu93_F2 1331 H09 GAC TTT CTC AGC AAC ATG TCG GTG AAA GGC GAC AAC CAC CTG GGC AGC TGC EGFRmu94_F2 1745 H10 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGT ACT TGG ACA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA EGFRmu95_F2 1748 H11 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCT ATG AGT TGG GCA CTT
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 TTG AAG ATC EGFRmu96_F2 1526 H12 CAG ATC ATC AGA GGA AAT ATG TAC CAC GAT AAT TCC TAT GCC TTA GCA GTC
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu01_R2 138 A01 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TCT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu02_R2 137 A02 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGA TTT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu03_R2 137 A03 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TGT TCA AAA GTG CCC AAC TGC G EGFRmu04_R2 124 A04 TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGT TCA ACT GCG TGA GCT TGT TAC EGFRmu05_R2 124 A05 CTC TGG AGG CTG AGA AAA TGT TCT TCA AAA GTG TTC AAC TGC GTG AGC TTG TTA C EGFRmu06_R2 121 A06 AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC CAC CTG CGT GAG CTT GTT ACT CG EGFRmu07_R2 121 A07 GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGC CAA TCT GCG TGA GCT TGT TAC TC
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu08_R2 277 A08 GAA TTC GCT CCA CTG TGT TGA CGG CAA TGA GGA CAT AAC CAG EGFRmu09_R2 277 A09 GAA TTC GCT CCA CTG TGT TGA TGG CAA TGA GGA CAT AAC CAG EGFRmu10_R2 205 A10 AAA GAT CAT AAT TCC TCT GCA CCC AGG TAA TTT CCA AAT TCC CA EGFRmu11_R2 338 A11 CTG CTA AGG CAT AGG AAT TTT CCC AGT ACA TAT TTC CTC TGA TGA T EGFRmu12_R2 342 A12 GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT ATC GTA GTA CAT ATT TCC TCT GA EGFRmu13_R2 340 B01 ACT GCT AAG GCA TAG GAA TTT TGG TAG TAC ATA TTT CCT CTG ATG EGFRmu14_R2 367 B02 GGT TTT ATT TGC ATC ATA GTT AGC TAA GAC TGC TAA GGC ATA GGA EGFRmu15_R2 367 B03 GGT TTT ATT TGC ATC ATA GTT AGT TAA GAC TGC TAA GGC ATA GGA EGFRmu16_R2 128 B04 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA ATT TGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu17_R2 128 B05 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA ATT GGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu18_R2 129 B06 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAA TGC CCA ACT GCG TGA GCT EGFRmu19_R2 128 B07 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu20_R2 128 B08 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAT AGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu21_R2 128 B09 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAC CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu22_R2 128 B10 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAA GGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu23_R2 145 B11 GAA CAT CCT CTG GAG GCT GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC CA EGFRmu24_R2 145 B12 TTG AAC ATC CTC TGG AGG CTC CAA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC EGFRmu25_R2 149 C01 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GTG AGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG EGFRmu26_R2 148 C02 TAT TGA ACA TCC TCT GGA GGA GGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGC EGFRmu27_R2 145 C03 GTT ATT GAA CAT CCT CTG GAG GAG GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC C EGFRmu28_R2 145 C04 GTT ATT GAA CAT CCT CTG GAG TTG GGC AAA ATG ATC TTC AAA AGT GCC C EGFRmu29_R2 148 C05 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG AGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG C EGFRmu30_R2 145 C06 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG TAA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC A EGFRmu31_R2 145 C07 TTA TTG AAC ATC CTC TGG AGG GCG TTA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CCC EGFRmu32_R2 118 C08 TGA TCT TCA AAA GTG CCC AAC TCC GTG AGC TTG TTA CTC GTG CC EGFRmu33_R2 118 C09 TGA TCT TCA AAA GTG CCC AAC GAC GTG AGC TTG TTA CTC GTG C
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu34_R2 118 C10 GAT CTT CAA AAG TGC CCA ACT TCG TGA GCT TGT TAC TCG TGC EGFRmu35_R2 118 C11 ATG ATC TTC AAA AGT GCC CAA GTA CGT GAG CTT GTT ACT CGT G EGFRmu36_R2 115 C12 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCG AGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu37_R2 116 D01 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCT TGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu38_R2 115 D02 CTT CAA AAG TGC CCA ACT GCT CGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu39_R2 115 D03 ATC TTC AAA AGT GCC CAA CTG ATA GAG CTT GTT ACT CGT GCC EGFRmu40_R2 100 D04 ACT GCG TGA GCT TGT TAC TCT GGC CTT GGC AAA CTT TCT TTT C EGFRmu41_R2 1300 D05 CGA CTG CAA GAG AAA ACT GAC GAT GTT GCT TGG TCC TGC CG EGFRmu42_R2 1300 D06 ACG ACT GCA AGA GAA AAC TGA TTA TGT TGC TTG GTC CTG CCG EGFRmu43_R2 1393 D07 GCA TAG CAC AAA TTT TTG TTT CGT GAA ATT ATC ACA TCT CCA TC EGFRmu44_R2 1393 D08 TTT GCA TAG CAC AAA TTT TTG TTA TGT GAA ATT ATC ACATCT CCA TC EGFRmu45_R2 146 D09 TTG AAC ATC CTC TGG AGG CTT TGA AAA TGA TCT TCA AAA GTG CC EGFRmu46_R2 1109 D10 AAA TGC CAC CGG CAG GAT GCG GAG ATC GCC ACT GAT GGA EGFRmu47_R2 1120 D11 GAG TCA CCC CTA AAT GCC AGC GGC AGG ATG TGG AGA TCG EGFRmu48_R2 1126 D12 TGT GAA GGA GTC ACC CCT ATG TGC CAC CGG CAG GAT GTG EGFRmu49_R2 1132 E01 GAG TAT GTG TGA AGG AGT CAG CCC TAA ATG CCA CCG GCA EGFRmu50_R2 1132 E02 GAG TAT GTG TGA AGG AGT CAT TCC TAA ATG CCA CCG GCA G EGFRmu51_R2 1226 E03 CCG TCC TGT TTT CAG GCC ATT CCT GAA TCA GCA AAA ACC CT EGFRmu52_R2 1226 E04 CCG TCC TGT TTT CAG GCC AAT CCT GAA TCA GCA AAA ACC CT EGFRmu53_R2 1228 E05 GTC CGT CCT GTT TTC AGG CTC AGC CTG AAT CAG CAA AAA CC EGFRmu54_R2 1330 E06 GTA ATC CCA AGG ATG TTA TGT CCA GGC TGA CGA CTG CAA GA EGFRmu55_R2 1472 E07 CTG TTT TCA CCT CTG TTG CTT TTA ATT TTG GTT TTC TGA CCG G EGFRmu56_R2 1459 E08 TCT GTT GCT TAT AAT TTT GGT TTC CTG ACC GGA GGT CCC AAA C EGFRmu57_R2 1459 E09 TCT GTT GCT TAT AAT TTT GGT TTG CTG ACC GGA GGT CCC AAA C EGFRmu58_R2 1475 E10 GCA GCT GTT TTC ACC TCT GTT TTT TAT AAT TTT GGT TTT CTG ACC G EGFRmu59_R2 166 E11 CCA AGG ACC ACC TCA CAG TTT TCG AAC ATC CTC TGG AGG CTG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu60_R2 160 E12 CCA CCT CAC AGT TAT TGA ACA GCC TCT GGA GGC TGA GAA AAT EGFRmu61_R2 160 F01 CCA AGG ACC ACC TCA CAG TTT TCG TAC AGC CTC TGG AGG CTG AGA AAA EGFRmu62_R2 127 F02 GAG GCT GAG AAA ATG ATC TTC AGC ATC GCC CAA CTG CGT GAG CTT EGFRmu63_R2 127 F03 TCT GGA GGC TGA GAA AAT GAT TTT CAG CAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu64_R2 95 F04 TGA GCT TGT TAC TCG TGC CTG GGC AAA CTT TCT TTT CCT CCA EGFRmu65_R2 283 F05 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GTC GAA AAT TCG TTG AGG GCA ATG AGG ACA EGFRmu66_R2 314 F06 GTA CAT ATT TCC TCT GAT GAT CCG CAG GTT TTC CAA AGG AAT TC EGFRmu67_R2 329 F07 AAG GCA TAG GAA TTT TCG TAG ACC TGA GTT CCT CTG ATG ATC TGC AGG EGFRmu68_R2 364 F08 CGG TTT TAT TTG CAT CAT AGT TTA ACA TGA CTG CTA AGG CAT AGG AAT EGFRmu69_R2 407 F09 CAT GCA GGA TTT CCT GTA AAT TTG TCA GGC GCA GCT CCT TCA GTC CGG EGFRmu70_R2 448 F10 CGT TGC ACA GGG CAG GGT TCT TTT CGA TCC GCA CGG CGC CAT GCA EGFRmu71_R2 460 F11 TGC TCT CCA CGT TGC ACA GTT TAT CGT TGT TGC TGA ACC GCA CG EGFRmu72_R2 472 F12 CCA CTG GAT GCT CTC CAC GTG GCA CAG GGC AGG GTT GTT G EGFRmu73_R2 202 G01 AGA TCA TAA TTC CTC TGC ACA AGG ACA ATT TCC AAA TTC CCA AGG AC EGFRmu74_R2 202 G02 AGA AGG AAA GAT CAT AAT TCC TCC CCG TAA GGA CAA TTT CCA AAT TCC CAA GGA C EGFRmu75_R2 286 G03 GTT TTC CAA AGG AAT TCG CTC AAA TGT GTT GAG GGC AAT GAG GA EGFRmu76_R2 286 G04 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GAC TCA AAT GTG TTG AGG GCA ATG AGG A EGFRmu77_R2 283 G05 TGC AGG TTT TCC AAA GGA ATT GTC GAA AAT TCG TTG AGG GCA ATG AGG ACA EGFRmu78_R2 364 G06 CGG TTT TAT TTG CAT CAT AGT TAA ACA TGA CTG CTA AGG CAT AGG AAT EGFRmu79_R2 364 G07 CTT CAG TCC GGT TTT ATT TGC ATT ATA GTT AAA CAT GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT EGFRmu80_R2 448 G08 AGG GCA GGG TTG TTG CTG ATC CGC ACG GCG CCA TGC A EGFRmu81_R2 448 G09 CCA CGT TGC ACA GGG CAG GCT TGT TGC TGA TCC GCA CGG CGC CAT GCA EGFRmu82_R2 103 G10 CCA ACT GCG TGA GCT TGT TAA GCG TGC CTT GGC AAA CTT TCT EGFRmu83_R2 103 G11 CCA ACT GCG AGA GCT TGT TAA GCG TGC CTT GGC AAA CTT TCT T EGFRmu84_R2 127 G12 TCC TCT GGA GGC TGA GAA ATT GAT TTT CAG CAT CGC CCA ACT GCG TGA GCT T EGFRmu85_R2 127 H01 CAT CCT CTG GAG GCT GAG ATA TTG ATT TTC AGC ATC GCC CAA CTG CGT GAG CTT
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu86_R2 124 H02 GGC TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAC CGT TCA ACT GCG TGA GCT TGT TAC EGFRmu87_R2 124 H03 AGG CTG AGA AAA TGA TCT TCA TAA CCG TTC AAC TGC GTG AGC TTG TTA C EGFRmu88_R2 124 H04 GAG GCT GAG AAA ATG ATC TTC ATA ATT GTT CAA CTG CGT GAG CTT GTT AC EGFRmu89_R2 1471 H05 GCA GCT GTT TTC ACC TCT GTT TTT TTG AAT TTT GGT TTT CTG ACC GGA G EGFRmu90_R2 1297 H06 CGA CTG CAA GAG AAA ACT GAC GAA CTT GCT TGG TCC TGC CGC G EGFRmu91_R2 507 H07 ACA TGT TGC TGA GAA AGT CAC CCC TGA CTA TGT CCC GCC ACT EGFRmu92_R2 514 H08 GTG GTT CTG GAA GTC CAT CAC GAT CTC GGC GTC ACG GTC ACT GCT GAC TAT GTC C EGFRmu93_R2 532 H09 GCA GCT GCC CAG GTG GTT GTC GCC TTT CAC CGA CAT GTT GCT GAG AAA GTC EGFRmu94_R2 118 H10 TGA GAA AAT GAT CTT CAA AAG TGT CCA AGT ACG TGA GCT TGT TAC TCG TGC EGFRmu95_R2 115 H11 GAT CTT CAA AAG TGC CCA ACT CAT AGA GCT TGT TAC TCG TGC CTT EGFRmu96_R2 337 H12 GAC TGC TAA GGC ATA GGA ATT ATC GTG GTA CAT ATT TCC TCT GAT GAT CTG EGFRmu01_F2 1725 A01 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu02_F2 1726 A02 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAA ATC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu03_F2 1726 A03 CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAC AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu04_F2 1739 A04 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA EGFRmu05_F2 1739 A05 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA CTT TTG AAG AAC ATT TTC TCA GCC TCC AGA G EGFRmu06_F2 1736 A06 CGA GTA ACA AGC TCA CGC AGG TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TT EGFRmu07_F2 1736 A07 GAG TAA CAA GCT CAC GCA GAT TGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TC EGFRmu08_F2 1586 A08 CTG GTT ATG TCC TCA TTG CCG TCA ACA CAG TGG AGC GAA TTC EGFRmu09_F2 1586 A09 CTG GTT ATG TCC TCA TTG CCA TCA ACA CAG TGG AGC GAA TTC EGFRmu10_F2 1658 A10 TGG GAA TTT GGA AAT TAC CTG GGT GCA GAG GAA TTA TGA TCT TT EGFRmu11_F2 1525 A11 ATC ATC AGA GGA AAT ATG TAC TGG GAA AAT TCC TAT GCC TTA GCA G EGFRmu12_F2 1521 A12 TCA GAG GAA ATA TGT ACT ACG ATA ATT CCT ATG CCT TAG CAG TC EGFRmu13_F2 1519 B01 CAT CAG AGG AAA TAT GTA CTA CCA AAA TTC CTA TGC CTT AGC AGT EGFRmu14_F2 1496 B02 TCC TAT GCC TTA GCA GTC TTA GCT AAC TAT GAT GCA AAT AAA ACC EGFRmu15_F2 1496 B03 TCC TAT GCC TTA GCA GTC TTA ACT AAC TAT GAT GCA AAT AAA ACC
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu16_F2 1735 B04 AAG CTC ACG CAG TTG GGC AAA TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu17_F2 1735 B05 AAG CTC ACG CAG TTG GGC CAA TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu18_F2 1734 B06 AGC TCA CGC AGT TGG GCA TTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA GCC EGFRmu19_F2 1735 B07 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu20_F2 1735 B08 AAG CTC ACG CAG TTG GGC TAT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu21_F2 1735 B09 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GGT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu22_F2 1735 B10 AAG CTC ACG CAG TTG GGC CTT TTT GAA GAT CAT TTT CTC AGC C EGFRmu23_F2 1718 B11 TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTG CCA GCC TCC AGA GGA TGT TC EGFRmu24_F2 1718 B12 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TTG GAG CCT CCA GAG GAT GTT CAA EGFRmu25_F2 1722 C01 CAC TTT TGA AGA TCA TTT TCT CAC CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA EGFRmu26_F2 1722 C02 GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCC TCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA EGFRmu27_F2 1718 C03 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TGC CCT CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA C EGFRmu28_F2 1718 C04 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TGC CCA ACT CCA GAG GAT GTT CAA TAA C EGFRmu29_F2 1722 C05 GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCG CCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA A EGFRmu30_F2 1718 C06 TGG GCA CTT TTG AAG ATC ATT TTT ACG CCC TCC AGA GGA TGT TCA ATA A EGFRmu31 F2 1718 C07 GGG CAC TTT TGA AGA TCA TTT TAA CGC CCT CCA GAG GAT GTT CAA TAA EGFRmu32_F2 1745 C08 GGC ACG AGT AAC AAG CTC ACG GAG TTG GGC ACT TTT GAA GAT CA EGFRmu33_F2 1745 C09 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGT CGT TGG GCA CTT TTG AAG ATC A EGFRmu34_F2 1745 C10 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGA AGT TGG GCA CTT TTG AAG ATC EGFRmu35_F2 1745 C11 CAC GAG TAA CAA GCT CAC GTA CTT GGG CAC TTT TGA AGA TCA T EGFRmu36_F2 1742 C12 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCT CGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu37_F2 1743 D01 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCA AGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu38_F2 1742 D02 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCG AGC AGT TGG GCA CTT TTG AAG EGFRmu39_F2 1742 D03 GGC ACG AGT AAC AAG CTC TAT CAG TTG GGC ACT TTT GAA GAT EGFRmu40_F2 1763 D04 GAA AAG AAA GTT TGC CAA GGC CAG AGT AAC AAG CTC ACG CAG T EGFRmu41_F2 563 D05 CGG CAG GAC CAA GCA ACA TCG TCA GTT TTC TCT TGC AGT CG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 EGFRmu42_F2 563 D06 CGG CAG GAC CAA GCA ACA TAA TCA GTT TTC TCT TGC AGT CGT EGFRmu43_F2 470 D07 GAT GGA GAT GTG ATA ATT TCA CGA AAC AAA AAT TTG TGC TAT GC EGFRmu44_F2 470 D08 GAT GGA GAT GTG ATA ATT TCA CAT AAC AAA AAT TTG TGC TAT GCA AA EGFRmu45_F2 1717 D09 GGC ACT TTT GAA GAT CAT TTT CAA AGC CTC CAG AGG ATG TTC AA EGFRmu46_F2 754 D10 TCC ATC AGT GGC GAT CTC CGC ATC CTG CCG GTG GCA TTT EGFRmu47_F2 743 D11 CGA TCT CCA CAT CCT GCC GCT GGC ATT TAG GGG TGA CT EGFRmu48_F2 737 D12 CAC ATC CTG CCG GTG GCA CAT AGG GGT GAC TCC TTC ACA EGFRmu49_F2 731 E01 TGC CGG TGG CAT TTA GGG CTG ACT CCT TCA CAC ATA CTC EGFRmu50_F2 731 E02 CTG CCG GTG GCA TTT AGG AAT GAC TCC TTC ACA CAT ACT C EGFRmu51_F2 637 E03 AGG GTT TTT GCT GAT TCA GGA ATG GCC TGA AAA CAG GAC GG EGFRmu52_F2 637 E04 AGG GTT TTT GCT GAT TCA GGA TTG GCC TGA AAA CAG GAC GG EGFRmu53_F2 635 E05 GGT TTT TGC TGA TTC AGG CTG AGC CTG AAA ACA GGA CGG AC EGFRmu54_F2 633 E06 TCT TGC AGT CGT CAG CCT GGA CAT AAC ATC CTT GGG ATT AC EGFRmu55_F2 391 E07 CCG GTC AGA AAA CCA AAA TTA AAA GCA ACA GAG GTG AAA ACA G EGFRmu56_F2 404 E08 GTT TGG GAC CTC CGG TCA GGA AAC CAA AAT TAT AAG CAA CAG A EGFRmu57_F2 404 E09 GTT TGG GAC CTC CGG TCA GCA AAC CAA AAT TAT AAG CAA CAG A EGFRmu58_F2 388 E10 CGG TCA GAA AAC CAA AAT TAT AAA AAA CAG AGG TGA AAA CAG CTG C EGFRmu59_F2 1697 E11 CAG CCT CCA GAG GAT GTT CGA AAA CTG TGA GGT GGT CCT TGG EGFRmu60_F2 1703 E12 ATT TTC TCA GCC TCC AGA GGC TGT TCA ATA ACT GTG AGG TGG EGFRmu61_F2 1703 F01 TTT TCT CAG CCT CCA GAG GCT GTA CGA AAA CTG TGA GGT GGT CCT TGG EGFRmu62_F2 1736 F02 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA GAT CAT TTT CTC AGC CTC EGFRmu63_F2 1736 F03 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAT TTT CTC AGC CTC CAG A EGFRmu64_F2 1768 F04 TGG AGG AAA AGA AAG TTT GCC CAG GCA CGA GTA ACA AGC TCA EGFRmu65_F2 1580 F05 TGT CCT CAT TGC CCT CAA CGA ATT TTC GAC AAT TCC TTT GGA AAA CCT GCA EGFRmu66_F2 1549 F06 GAA TTC CTT TGG AAA ACC TGC GGA TCA TCA GAG GAA ATA TGT AC EGFRmu67_F2 1534 F07 CCT GCA GAT CAT CAG AGG AAC TCA GGT CTA CGA AAA TTC CTA TGC CTT EGFRmu68_F2 1499 F08 ATT CCT ATG CCT TAG CAG TCA TGT TAA ACT ATG ATG
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 CAA ATA AAA CCG EGFRmu69_F2 1456 F09 CCG GAC TGA AGG AGC TGC GCC TGA CAA ATT TAC AGG AAA TCC TGC ATG EGFRmu70_F2 1415 F10 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCG AAA AGA ACC CTG CCC TGT GCA ACG EGFRmu71_F2 1403 F11 CGT GCG GTT CAG CAA CAA CGA TAA ACT GTG CAA CGT GGA GAG CA EGFRmu72_F2 1391 F12 CAA CAA CCC TGC CCT GTG CCA CGT GGA GAG CAT CCA GTG G EGFRmu73_F2 1661 G01 GTC CTT GGG AAT TTG GAA ATT GTC CTT GTG CAG AGG AAT TATGAT CT EGFRmu74_F2 1661 G02 GTC CTT GGG AAT TTG GAA ATT GTC CTT ACG GGG AGG AAT TAT GAT CTT TCC TTC T EGFRmu75_F2 1577 G03 TCC TCA TTG CCC TCA ACA CAT TTG AGC GAA TTC CTT TGG AAA AC EGFRmu76_F2 1577 G04 TCC TCA TTG CCC TCA ACA CAT TTG AGT CAA TTC CTT TGG AAA ACC TGC A EGFRmu77_F2 1580 G05 TGT CCT CAT TGC CCT CAA CGA ATT TTC GAC AAT TCC TTT GGA AAA CCT GCA EGFRmu78_F2 1499 G06 ATT CCT ATG CCT TAG CAG TCA TGT TTA ACT ATG ATG CAA ATA AAA CCG EGFRmu79_F2 1499 G07 AAT TCC TAT GCC TTA GCA GTC ATG TTT AAC TAT AAT GCA AAT AAA ACC GGA CTG AAG EGFRmu80_F2 1415 G08 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCA GCA ACA ACC CTG CCC T EGFRmu81_F2 1415 G09 TGC ATG GCG CCG TGC GGA TCA GCA ACA AGC CTG CCC TGT GCA ACG TGG EGFRmu82_F2 1760 G10 AGA AAG TTT GCC AAG GCA CGC TTA ACA AGC TCA CGC AGT TGG EGFRmu83_F2 1760 G11 AAG AAA GTT TGC CAA GGC ACG CTT AAC AAG CTC TCG CAG TTG G EGFRmu84_F2 1736 G12 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAA TTT CTC AGC CTC CAG AGG A EGFRmu85_F2 1736 H01 AAG CTC ACG CAG TTG GGC GAT GCT GAA AAT CAA TAT CTC AGC CTC CAG AGG ATG EGFRmu86_F2 1736 H02 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACG GTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA GCC EGFRmu87_F2 1736 H03 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACG GTT ATG AAG ATC ATT TTC TCA GCC T EGFRmu88_F2 1736 H04 GTA ACA AGC TCA CGC AGT TGA ACA ATT ATG AAG ATC ATT TTC TCA GCC TC EGFRmu89_F2 392 H05 CTC CGG TCA GAA AAC CAA AAT TCA AAA AAA CAG AGG TGA AAA CAG CTG C EGFRmu90_F2 566 H06 CGC GGC AGG ACC AAG CAA GTT CGT CAG TTT TCT CTT GCA GTC G EGFRmu91_F2 1356 H07 AGT GGC GGG ACA TAG TCA GGG GTG ACT TTC TCA GCA ACA TGT EGFRmu92_F2 1349 H08 GGA CAT AGT CAG CAG TGA CCG TGA CGC CGA GAT CGT GAT GGA CTT CCA GAA CCA C EGFRmu93_F2 1331 H09 GAC TTT CTC AGC AAC ATG TCG GTG AAA GGC GAC AAC CAC CTG GGC AGC TGC EGFRmu94_F2 1745 H10 GCA CGA GTA ACA AGC TCA CGT ACT TGG ACA CTT TTG AAG ATC ATT TTC TCA EGFRmu95_F2 1748 H11 AAG GCA CGA GTA ACA AGC TCT ATG AGT TGG GCA CTT
引物名称 位置bp 孔号 引物序列 TTG AAG ATC EGFRmu96_F2 1526 H12 CAG ATC ATC AGA GGA AAT ATG TAC CAC GAT AAT TCC TAT GCC TTA GCA GTC
[0687]将pDONR221中经证实的HFD100突变体通过LR反应亚克隆 至pcDNA3.2-DEST表达载体。B.蛋白质表达和分泌
[0688]使用Lipofectamin 2000介导的瞬时基因表达法(Invitrogen)，根 据制造商说明书，在293T细胞中表达pcDNA3.2-DEST表达载体中的 HFD100-突变体。在转染后48小时收集条件培养基。通过蛋白质印迹法分 析15μl体积的条件培养基。蛋白质印迹物用抗Fc抗体探测以检验蛋白质 表达和分泌。使用Duoset人EGFR ELISA试剂盒(R&D System)来确定条 件培养基中的重组HFD100-突变体。ELISA板用0.4μg/ml抗EGFR抗体 在室温包被过夜。将包被的板在PBS+0.05％吐温20中洗涤3次，用 PBS/1％BSA在室温封闭2小时并且在PBS+0.05％吐温20中再洗涤3次。 条件培养基最初以1∶1000稀释并且进一步以1∶2的比例稀释。将稀释的条 件培养基(CM)施加至板以按照制造商说明书进行ELISA检测。C.配体结合筛选法
[0689]EU-标记的EGF结合法：板用5μg/ml抗Fc抗体在室温包被过 夜。包被后，将板在PBS/0.05％吐温20中洗涤3次并且用PBS/1％BSA 在室温封闭2小时。在封闭后，将板用PBS/0.05％吐温20洗涤3次。条 件培养基中的重组蛋白(20ng)用1×DELFIA结合缓冲液稀释并且添加至 板(100μl/孔)。板在室温孵育2小时。随后用120μl/孔的冰冷DELFIA洗 涤缓冲液洗涤3次。随后，将DELFIA结合缓冲液中的EU-EGF(0.5nM) 添加至各孔(100μl/孔)并且将板在室温孵育2小时。板用冰冷DELFIA洗 涤缓冲液洗涤3次(120μl/孔)。
[0690]DELFIA增强溶液(110μl/孔)添加至各孔，并且将板在室温再孵 育20分钟。孵育后，板由Envision(PerkinElmer)读数以检测时间分辨的 荧光。D.TGF_和HB-EGF结合作用
[0691]TGF_ELISA试剂盒或HB-EGF ELISA试剂盒(R&D System) 改良用于配体结合测定法。板用1μg/ml抗Fc抗体(Sigma)在室温包被过夜 并且用PBS/1％BSA在室温封闭2小时。经封闭的板与20ng HFD100突 变体蛋白在室温孵育2小时。洗涤板并使其在室温分别与100μl/孔的结合 缓冲液(PBS/1％BSA)中的5-50nM TGF_或5nM HB-EGF再孵育2小时。 洗涤板并使其进一步在室温与300ng/ml生物素化的山羊抗人TGF_抗体 或生物素化的山羊抗人HB-EGF抗体孵育2小时。随后将链霉抗生物素蛋 白-HRP(1∶200稀释)添加至所述板并且在20分钟后施加底物溶液以显色。 板由微量板读数仪读数以确定在OD 650nm处的值。E.结果
[0692]详细的配体结合研究揭示HFD 120以比野生型(HFD100)更高的 亲和力结合HER1配体。与野生型(HFD100)比较，HFD120突变体对EGF 具有2倍的更高亲和力，对HB-EGF具有7倍改善的亲和力以及对TGF-α 具有大于30倍改善的亲和力(图22a-c和表32)。表32：结合亲和力
[0693]称作T43K/S193N/E330D/G588S的突变体，除所设计的T43K 突变之外，还具有由随机PCR导入的突变。这种四重突变体(quad mutant) 具有明显增加的HER1配体结合活性(图23)。对这种突变体进行系统性改 变以产生两种其它HER1突变体，称作S193N/E330D/G588S和 E330D/G588S，与野生型(HFD100)比较，它们均以明显增加的水平结合 HER1配体：EGF，HB-EGF和TGF-α；然而，S193N/E330D/G588S比 E330D/G588S产生更高的蛋白质分泌水平(图23)。实施例24设计具有更高配体结合亲和力和能力的panHER配体阱： 具有增加的配体结合能力的HER调蛋白
[0694]除对HER1配体具有高亲和力的HFD120之外(如上文实施例 18中讨论)，还产生在HER1臂中具有T39S突变的异二聚体 HER1/Fc：HER3/Fc构建体，称作RB220h。这种T39S突变与HFD120中 的T39S突变相同。HFD120如实施例2和3中的HFD100那样表达并纯 化。这种HER调蛋白也表达为包含同二聚体和异二聚体的混合物，称作 RB620，细胞表达系统的这种混合物作为HFD120、HFD300和RB220h 产生。见表33。RB620如实施例2中所述进行表达并如实施例3中对RB600 所述进行纯化。表33：HER调蛋白组合物
分子名称 元件 HFD100 Her1/Fc同二聚体 HFD120 带HER1T39S突变的Her1/Fc同二聚体 HFD300(也称 为HFD300h) Her3/Fc同二聚体 RB200h 纯化的Her1/Fc-Her3/Fc异二聚体 RB220 具有增强的Her1组分(带T39S突变的Her1)的RB200h RB600 (RB-混合物) Her1/Fc同二聚体、Her3/Fc同二聚体、Her1-Her3异二聚体 RB620 具有增强的Her1组分(带T39S突变的Her1)的RB600 RB630 具有增强的Her1组分和增强的Her3组分的RB600
分子名称 元件 HFD100 Her1/Fc同二聚体 HFD120 带HER1T39S突变的Her1/Fc同二聚体 HFD300(也称 为HFD300h) Her3/Fc同二聚体 RB200h 纯化的Her1/Fc-Her3/Fc异二聚体 RB220 具有增强的Her1组分(带T39S突变的Her1)的RB200h RB600 (RB-混合物) Her1/Fc同二聚体、Her3/Fc同二聚体、Her1-Her3异二聚体 RB620 具有增强的Her1组分(带T39S突变的Her1)的RB600 RB630 具有增强的Her1组分和增强的Her3组分的RB600
[0695]将突变体的HER1配体结合活性或HER3配体结合活性(能力) 与野生型构建体比较。比较同二聚体HFD100与HFD120(突变构建体)或 比较RB200h与RB220h(突变构建体)，含有在HER1中的T39S突变的突 变体比其野生型对应物具有高大约2.5倍的EGF结合能力(表34、35、38、 39)。另外，数据显示混合物，如RB600或如RB620，具有更好的、3倍 至10倍更高的HER1配体EGF结合能力(表35、38和39)。
[0696]就野生型和突变型HER调蛋白的HER3配体(NRG1β1)结合能 力而言，差异不如对EGF结合作用所观察到的那样明显。首先，异二聚体 RB200h比混合物RB600具有大约1.6倍更高的NRG1β1结合能力。突变 的异二聚体(RB220h)或突变的混合物RB620的NRG1β1结合能力是大致 相同的(见表38和39)。然而，有趣地发现当异二聚体(野生型RB200h或 突变型RB220h)的NRG1β1结合能力与HER3同二聚体(HFD300)相比较 时，HER3同二聚体HFD300仅具有所述异二聚体的30％结合活性(见表 36和37)。表34：相对的EGF结合活性
蛋白质 与EGF的相对结合作用 HFD％ HFD100-63 1 ＞99％ HFD120-1 1.8 ＞99％ RB200H-X.C 1 ＜0.5％ RB220h-1 2.47 ＜0.5％
表35：相对的EGF结合活性
蛋白质 与EGF的相对结合作用 HFD1xx％ RB2xxh％ RB600-1 1 64％ 27％ RB200h-X.C 0.11 ＜0.5％ RB602-1 1 37％ 46％ RB220h-1 0.29 ＜0.5％
表36：相对的NRG1β1结合活性
蛋白质 与NRG-β1的相对结合作用 HFD2xx％ HFD300％ RB600-1 1 27％ 9％ RB200h-X.C 1.57 95％ 5％ RB602-1 1.68 46％ 17％ RB220h-1 1.76 ＞98％ ＜2％
表37：相对的NRG1β1结合活性
蛋白质 与NRG-β1的特异结合作用 纯度％ RB2xxh％ HFD100-63 0.016 ＞98％ HFD120-1 0.032 ＞98％ RB300-1 0.676 75％ 25％
表38：配体结合的特异性活性：RB200h与RB600
fmol EGF /fmol RB200 SD fmol NRG /fmol RB200 SD EGF∶NRG 之比 RB200h- 65/67/70/72 0.153 0.008 0.302 0.013 0.508 RB220h-1 0.051 0.003 0.407 0.025 0.125 RB620-1 0.174 0.008 0.387 0.031 0.449 RB200h-XC 0.031 0.001 0.363 0.006 0.086 RB600-1 0.283 0.024 0.231 0.009 1.223
表39：配体结合的特异性活性：RB200h与RB600
蛋白质 fmol EGF/mg RB fmol NRG/mg RB RB200h 0.16x106 1.91x106 RB600 1.50x106 1.22x106 RB220h 0.27x106 2.14x106 RB620 0.91x106 2.04x106
蛋白质 与EGF的相对结合作用 HFD％ HFD100-63 1 ＞99％ HFD120-1 1.8 ＞99％ RB200H-X.C 1 ＜0.5％ RB220h-1 2.47 ＜0.5％
表35：相对的EGF结合活性
蛋白质 与EGF的相对结合作用 HFD1xx％ RB2xxh％ RB600-1 1 64％ 27％ RB200h-X.C 0.11 ＜0.5％ RB602-1 1 37％ 46％ RB220h-1 0.29 ＜0.5％
表36：相对的NRG1β1结合活性
蛋白质 与NRG-β1的相对结合作用 HFD2xx％ HFD300％ RB600-1 1 27％ 9％ RB200h-X.C 1.57 95％ 5％ RB602-1 1.68 46％ 17％ RB220h-1 1.76 ＞98％ ＜2％
表37：相对的NRG1β1结合活性
蛋白质 与NRG-β1的特异结合作用 纯度％ RB2xxh％ HFD100-63 0.016 ＞98％ HFD120-1 0.032 ＞98％ RB300-1 0.676 75％ 25％
表38：配体结合的特异性活性：RB200h与RB600
fmol EGF /fmol RB200 SD fmol NRG /fmol RB200 SD EGF∶NRG 之比 RB200h- 65/67/70/72 0.153 0.008 0.302 0.013 0.508 RB220h-1 0.051 0.003 0.407 0.025 0.125 RB620-1 0.174 0.008 0.387 0.031 0.449 RB200h-XC 0.031 0.001 0.363 0.006 0.086 RB600-1 0.283 0.024 0.231 0.009 1.223
表39：配体结合的特异性活性：RB200h与RB600
蛋白质 fmol EGF/mg RB fmol NRG/mg RB RB200h 0.16x106 1.91x106 RB600 1.50x106 1.22x106 RB220h 0.27x106 2.14x106 RB620 0.91x106 2.04x106
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