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磷原子修饰的核酸的合成方法

阅读：661发布：2022-06-05

专利汇可以提供磷原子修饰的核酸的合成方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明所述为包含手性 X-膦酸酯部分的磷原子修饰的核酸的合成方法。本发明所述的方法提供经由含有化学稳定的H-膦酸酯部分的非手性分子与核苷/核苷酸的不对称反应生成的高非对映体纯度的骨架修饰的核酸。，下面是磷原子修饰的核酸的合成方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于合成包含手性X-膦酸酯部分的核酸的方法，包括将包含非手性的H-膦酸酯部分的分子与包含5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体；并且将缩合的中间体转化为含有手性X-膦酸酯部分的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述将包含非手性H-膦酸酯部分的分子与包含
5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体的步骤为一锅反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含手性X-膦酸酯部分的核酸为式1的化合物：
1 d d 1 1
其中R 为-OH、-SH、NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔
1 1 1 e e a c
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
2 2 +1 +1 +1
基-Y-或杂芳基-Y-，或为Na 、Li 或K 的阳离子；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1
各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、
1 1 1 b c b
炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分；
各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
f f
各个X独立地为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRR、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔- + - + - +
硫基、-SZ，-SeZ 或-BH3Z ；
f
其中各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基；
+
Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、+
仲、叔或季，或者Z 为单价金属离子；
3
R 为氢、封闭基团、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；并且n为1至大约200的整数。
31
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过 P NMR波谱学或反相HPLC确定，所述式1的化合物的各个X-膦酸酯部分为超过98％非对映体纯度的。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述各个X-膦酸酯部分具有RP构型。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述各个X-膦酸酯部分具有SP构型。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述各个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含非手性H-膦酸酯部分的分子为式2的化合物：
1 d d 1 1 1
其中R 为-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
1 1 e e a c
基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
2 2
基-Y-或杂芳基-Y-；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1 1 1
R 为氢、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、
1 b c b
杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分；并且
Ba为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；并且
+
Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或单价金属离子。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包含手性试剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述手性试剂为式3的化合物：
5
其中W1和W2独立地为-NG-、-O-或-S-；
1 2 3 4 5
G、G、G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳
1 2 3 4 5 6
基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中
1 2 3 4 5 6
不超过四个的G、G、G、G 和G 为G。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含5′-OH部分的核苷为式4的化合物：
2 d d 1 1
其中各个R 独立地为氢、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔
1 1 1 b c b
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
2 2
基-Y-或杂芳基-Y-；
2 d
Y 为O、NR 或S；
各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
m为0至n-1的整数；
n为1至大约200的整数；
OA连接至三苯甲基部分、甲硅烷基部分、乙酰基部分、酰基部分、芳基酰基部分、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；
J为O并且D为H，或者J为S、Se或BH3并且D为手性配体Ci或式A的部分：
其中W1和W2独立地为NHG5、OH或SH；
A为氢、酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分；并且
其中G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G1、G2、G3、G4和G5中的两个为G6，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且G1、G2、G3、G4和G5中不超过四个为G6。
12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供缩合试剂CR，通过该试剂包含非手性H-膦酸酯部分的分子被活化以与手性试剂反应形成手性中间体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述缩合试剂CR为Ar3PL2、(ArO)3PL2、其中
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷
2 3 5 6 7 8
基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z 和Z、Z 和Z、Z 和Z、
8 9 9 7 7 8 9
Z 和Z、Z 和Z 或Z 和Z 和Z 的任何一起形成3至20元脂环或杂环；
-
Q 为反离子；
L为离去基团；
w为0至3的整数；并且
Ar为芳基、杂芳基，和/或一个Ar基团连接于聚合物载体。
- - - -
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述缩合试剂CR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、- - - - -
TfO、Tf2N、AsF6、ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述缩合试剂CR的离去基团为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述缩合试剂为双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、(PhO)3PCl2、Ph3PCl2、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷六氟磷酸盐(MNTP)或3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)。
17.根据权利要求12所述的方法，进一步包括提供活化试剂AR。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述活化试剂AR为
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
其中Z 、Z 、Z 、Z 、Z 、Z 、Z 、Z 、Z 、Z 和Z 独立地为氢、烷基、氨基烷基、环烷
11
基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z
12 11 13 11 14 12 13 12 14 13 14 15 16 15 17 16 17 18
和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z
19 20 21
和Z 或Z 和Z 的任何一起形成3至20元脂环或杂环，或者形成5或20元芳香环；并且-
Q 为反离子。
- - - -
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述活化试剂AR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、- - - - -
TfO、Tf2N、AsF6、ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述活化试剂AR为咪唑、4，5-二氰基咪唑(DCI)、4，5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑、5-乙硫基四唑、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲基磺酸盐、N-氰基甲基二甲基铵三氟甲基磺酸盐。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述活化试剂AR为4，5-二氰基咪唑(DCI)、
1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、3-硝基-1，2，
4-三唑(NT)、四唑或N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述活化试剂AR为N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在质子惰性有机溶剂中进行。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述溶剂为乙腈、吡啶、四氢呋喃或二氯甲烷。
25.根据权利要求24所述的方法，其中当所述质子惰性有机溶剂不是碱性时，在反应步骤中存在碱。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱为吡啶、喹啉、N，N-二甲基苯胺或N-氰基甲基吡咯烷。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱为
22 23
其中Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、
22 23
杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或其中Z 和Z 一起形成3至10元脂环或杂环。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱为N-氰基甲基吡咯烷。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述质子惰性有机溶剂为无水的。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述无水的质子惰性有机溶剂为新鲜蒸馏的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为吡啶或乙腈。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括：对缩合的中间体加帽并修饰加帽的缩合中间体以生成式5的化合物：
其中R1为-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳
1 1 a c
基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-OR 或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2 2
各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂
2
芳基-Y-；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1 1
各个R 独立地为氢、-NRR、-N3、卤素，烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、
1 1 b c b
芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分；
各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
各个J为S、Se或BH3；
v为2至n-1之间的整数；
OA连接于与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；
A为酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分；并且
1 2 3 4 5
G、G、G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳
1 2 3 4 5 6
基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多
1
约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、
2 3 4 5 6
G、G、G 和G 中的不超过四个为G。
1
33.根据权利要求32所述的方法，进一步包括步骤：(a)脱去式5的化合物的R 的封闭以生成式4的化合物，其中m至少为1，J为S、Se或BH3并且D为式A的部分；(b)使用权利要求10的方法将式4的化合物反应，其中转化缩合的中间体的步骤包括对缩合的中间体加帽并且修饰加帽的缩合中间体以生成式5的化合物，其中v大于2并且小于约200；并且(c)可选地重复步骤(a)和(b)以形成式5的化合物，其中v为大于3并且小于约200。
34.根据权利要求32或33所述的方法进一步包括将式5的化合物转化为式1的化
1 d d
合物的步骤，其中各个Ba部分为未封闭的；R 为-OH、-SH、NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、
1 1 1 1 1 e e a
炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-ORc
或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
2 2 +1 +1 +1
基-Y-或杂芳基-Y-，或为Na 、Li 或K 的阳离子；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1
各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、
1 1 1
炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-；
3
R 为H；
- + - + - +
各个X独立地为-SZ，-SeZ 或-BH3Z ；和
+
Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、+
仲、叔或季，或Z 为单价金属离子。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括将缩合的中间体酸化以产生式4的化合物，其中m至少为1，J为O，并且D为H。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述缩合的中间体包括式A’的部分：
其中A为氢；并且
1 2 3 4
其中G 和G 独立地为烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂芳基或芳基，并且G、G 和
5 1 2 3 4
G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和
5 6
G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳
1 2 3 4 5
环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、G、G 和G 中不
6
超过四个为G。
37.根据权利要求35所述的方法，进一步包括：(a)使用权利要求10的方法，将式4的化合物--其中m至少为1，J为O，并且D为H--反应，其中将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括将缩合的中间体酸化以生成式4的化合物，其中m至少为2并且小于约
200；J为O，并且D为H，并且(b)可选地重复步骤(a)以生成式4的化合物，其中m为大于
2并且小于约200。
38.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述酸化包括加入一定量的勃朗斯特酸或路易斯酸，该量有效地将缩合的中间体转化为式4的化合物而不将嘌呤或嘧啶部分从缩合的中间体除去。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述酸化包括将1％三氟乙酸加入至有机溶剂中，将3％二氯乙酸加入至有机溶剂中，或将3％三氯乙酸加入至有机溶剂中。
40.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述酸化进一步包括加入阳离子清除剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述阳离子清除剂为三乙基甲硅烷或三异丙基甲硅烷。
42.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述将缩合的中间体转化为式1的化合物
1
的步骤进一步包括在酸化缩合的中间体步骤前脱去R 的封闭。
43.根据权利要求35或37所述的方法，进一步包括修饰式4的化合物以引入X部分因
3
而生成式1的化合物，其中R 为封闭基团或与固体载体连接的连接部分。
44.权利要求43所述方法，进一步包括处理权利要求35的产物以产生式1的化合物，
1 d d 1 1 1
其中R 为-OH、-SH、NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、
1 1 e e a c
芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
2 2 +1 +1 +1
基-Y-或杂芳基-Y，或为Na 、Li 或K 的阳离子；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1
各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、
1 1 1
炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-；
各个Ba部分为未封闭的；
3
R 为H；
f f
各个X独立地为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRR、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔- + - + - +
硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z ；
f
其中各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基；
+
Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、+
仲、叔或季，或者Z 为单价金属例子；并且
n为大于1并且小于约200。
45.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述修饰步骤使用硼化试剂、硫亲电子试剂或硒亲电子试剂进行。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：
24 25 24 25
S8(式B)、Z -S-S-Z 或Z -S-X-Z ，
24 25
其中Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、
24 25
杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z 和Z 一起形成
3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；
f f
X为SO2、O或NR ；并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为具有下式之一的化合物：
Se(式G)、Z26-Se-Se-Z27或Z26-Se-X-Z27，
其中Z26和Z27独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或Z26和Z27置于一起置于一起以形成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；
X为SO2、O或NRf；并且Rf为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述修饰步骤使用硅烷化试剂而后使用硫亲电子试剂、硒亲电子试剂、硼化试剂、烷化剂、醛或酰化剂进行。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述硅烷化试剂为三甲基氯甲硅烷(TMS-Cl)、三异丙基氯甲硅烷(TIPS-Cl)、叔丁基二甲基氯甲硅烷(TBDMS-Cl)、叔丁基二苯基氯甲硅烷(TBDPS-Cl)、1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(HMDS)、N-三甲基甲硅烷基二甲胺(TMSDMA)、N-三甲基甲硅烷基二乙胺(TMSDEA)、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺(TMSA)、N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)或N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：
24 25 24 25
S8(式B)、Z -S-S-Z 或Z -S-X-Z ，
24 25
其中Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、
24 25
杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z 和Z 一起形成
3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；
f f
X为SO2、O或NR ；并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为含有下式之一的化合物：
Se(式G)、Z26-Se-Se-Z27或Z26-Se-X-Z27，
其中Z26和Z27独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z26和Z27一起形成
3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；
X为SO2、O或NRf；并且Rf为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述烷化剂为卤代烷、卤代烯、卤代炔、烷基磺酸酯、烯基磺酸酯或炔基磺酸酯。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述醛为对位甲醛、烷基醛、烯基醛、炔基醛或芳香醛。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述酰化剂为式M或N的化合物：
7
其中G 为烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳杂氧基；并且
M为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。
61.根据权利要求43所述的方法，其中所述修饰步骤为通过与卤化剂反应而后与亲核试剂反应进行。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、Br2、I2、磺酰氯(SO2Cl2)、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、一氯化硫、二氯化硫、氯胺、CuCl2、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、CI4、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)或N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)。
f f f f f
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述亲核试剂为NRRH、ROH或RSH，其中R 为f f f
氢、烷基、烯基、炔基或芳基，并且NRRH的至少一个R 不是氢。
5
64.根据权利要求10所述的方法，其中所述手性试剂为式3的化合物，其中W1为NHG并且W2为O。
65.根据权利要求10所述的方法，其中所述手性试剂为式O或式P：
66.根据权利要求10所述的方法，其中所述手性试剂为式Q或式R：
a
67.根据权利要求3、8、32或34所述的方法，其中所述R 为取代或未取代的三苯甲基或取代的甲硅烷基。
a
68.根据权利要求44所述的方法，其中所述R 为取代或未取代的三苯甲基或取代的甲硅烷基。
b
69.根据权利要求3、8、11或32所述的方法，其中所述R 为取代或未取代的三苯甲基、取代的甲硅烷基、乙酰基、酰基或取代的甲基醚。
3
70.根据权利要求3所述的方法，其中所述R 为封闭基团，其为取代的三苯甲基、酰基、取代的甲硅烷基或取代的苯甲基。
3
71.根据权利要求3所述的方法，其中所述R 为与固体载体连接的连接部分。
72.根据权利要求3、8、11或32所述的方法，其中所述Ba部分的封闭基团为甲苯基、酰基、甲酰基、二烷基甲脒基、异丁酰基、苯氧基乙酰基或三苯甲基部分，其中任何一个可为未取代的或取代的。
1 d d
73.根据权利要求3、8或34所述的方法，其中所述R 为-N3、-NRR、炔氧基或-OH。
1 d d
74.根据权利要求43所述的方法，其中所述R 为-N3、-NRR、炔氧基或-OH。
2 d d
75.根据权利要求3、8、11、32或34所述的方法，其中所述R 为-NRR、烷基、烯基、炔
1 1 1 1 1
基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y 并且被荧光或生物分子结合部分取代。
2 d d 1
76.根据权利要求43所述的方法，其中所述R 为-NRR、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、
1 1 1 1
烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y 并且被荧光或生物分子结合部分取代。
2
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述R 上的取代基为荧光部分。
2
78.根据权利要求75所述的方法，其中所述R 上的取代基为生物素或亲和素。
2
79.根据权利要求76所述的方法，其中所述R 上的取代基为荧光部分。
2
80.根据权利要求76所述的方法，其中所述R 上的取代基为生物素或亲和素。
2
81.根据权利要求3、8、11、32、34或42所述的方法，其中所述R 为-OH、-N3、氢、卤素、烷氧基或炔氧基。
2
82.根据权利要求3、8、11、32或34所述的方法，其中所述R 为-OH、-N3、氢、卤素、烷氧基或炔氧基。
83.根据权利要求43所述的方法，其中所述Ba为5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。
84.根据权利要求3、8、11、32或34所述的方法，其中所述Ba通过用荧光或生物结合部分取代而修饰。
85.根据权利要求43所述的方法，其中所述Ba通过用荧光或生物结合部分取代而修饰。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述Ba上的取代基为荧光部分。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述Ba上的取代基为生物素或亲和素。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述Ba上的取代基为荧光部分。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述Ba上的取代基为生物素或亲和素。
90.根据权利要求3、8或34所述的方法，其中所述Z是吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。
91.根据权利要求43所述的方法，其中所述Z是吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。
f f - +
92.根据权利要求3或34所述的方法，其中所述X为烷基、烷氧基、-NRR、-SZ
- +
或-BH3Z。
f f - + - +
93.根据权利要求43所述的方法，其中所述X为烷基、烷氧基、-NRR、-SZ 或-BH3Z。
94.根据权利要求47所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为式F、式E或式B。
95.根据权利要求54所述的方法，其中所述硫亲电子试剂为式F、式E或式B。
96.根据权利要求49所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为式G或式J。
97.根据权利要求56所述的方法，其中所述硒亲电子试剂为式G或式J。
98.根据权利要求50或57所述的方法，其中所述硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。
99.根据权利要求62所述的方法，其中所述卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、磺酰氯(SO2Cl2)或N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)。
100.根据权利要求16所述的方法，其中所述缩合试剂为双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、Ph3PCl2或N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)。
101.一种确定或检测样品中靶标分子的方法，该方法包括：将疑似含有靶标分子的样品与根据权利要求3的核酸感应分子接触，其中由信号生成单元产生的信号的变化表明在所述样品中存在所述靶标。
102.根据权利要求101所述方法，进一步包括定量由信号生成单元生成的信号的变化以定量样品中靶标分子的量。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述信号生成单元检测荧光、表面等离子共振、荧光猝灭、化学发光、干涉测量法或折射率检测。
104.根据权利要求101所述的方法，其中所述样品为环境样品、生物危险材料、有机样品、药物、毒素、香料、香味或生物样品。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述样品为生物学样品，其为细胞、细胞提取物、细胞溶解产物、组织、组织提取物、体液、血清、血液或血液制品。
106.根据权利要求101所述的方法，其中所述核酸感应分子特异性地与靶标分子结合。
107.根据权利要求101所述的方法，其中所述靶标分子的存在表明病理症状的存在。
108.一种从核酸模板扩增核酸的所需区域的方法，包括：(a)提供多个具有与感兴趣的共有序列互补的固定的核苷酸序列区域的第一PCR引物；(b)提供多个第二PCR引物，(c)通过PCR使用所述多个第一PCR引物和所述多个第二PCR引物扩增核酸模板，其中所述多种第一引物的一部分实质结合任何存在于模板上的感兴趣的共有序列，并且所述多个第二引物的一部分在模板上离开第一引物的位置结合，从而由第一引物和第二引物侧接的核酸区域被特异性地扩增，而且其中所述多个第一PCR引物和/或所述多个第二PCT引物为根据权利要求3的核酸分子。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述模板为基因组DNA。
110.根据权利要求108所述的方法，其中模板为真核基因组DNA。
111.根据权利要求108所述的方法，其中所述模板为人类基因组DNA。
112.根据权利要求108所述的方法，其中所述模板为原核DNA。
113.根据权利要求108所述的方法，其中所述模板为克隆的基因组DNA、DNA的亚基因组区域、染色体或亚染色体区域。
114.根据权利要求108所述的方法，其中所述模板为RNA。
115.根据权利要求1所述的方法，其中所述将缩合的中间体转化为式1的化合物的方法包括：修饰缩合的中间体以产生式5的化合物：
1 d d 1 1 1
其中R 为-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳
1 1 e e a c
基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR ；
1 d
Y 为O、NR、S或Se；
a
R 为封闭部分；
c
R 为封闭基团；
d
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e
(R)2或-HP(O)(R)；
e 2 2 2 2
各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂
2
芳基-Y-；
2 d
Y 为O、NR 或S；
2 d d 1 1 1
各个R 独立地为氢、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、
1 1 b c b
芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分；
各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基；
各个J为S、Se或BH3；
v为整数1；
OA连接于与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；
A为酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分；并且
1 2 3 4 5
G、G、G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳
1 2 3 4 5 6
基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多
1
约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、
2 3 4 5 6
G、G、G 和G 中不超过四个为G。

说明书全文

磷原子修饰的核酸的合成方法

技术领域

[0001] 本文描述了包含手性X-膦酸酯部分的磷原子修饰的核酸的合成方法。在此所述的方法提供了通过包含化学稳定的H-膦酸酯部分的非手性分子与核苷/核苷酸的不对称
反应生成的高非对映体纯度的骨架修饰的核酸。

[0002] 发明背景

[0003] 寡核苷酸在治疗、诊断、研究及新的和纳米材料的应用上有用途。DNA或RNA天然序列的应用受到它们对核酸酶的稳定性的局限。并且，体外研究已显示：反义核苷酸的性质诸如结合亲和力、与互补RNA的序列特异性结合、对核酸酶的稳定性，受到磷原子的构型的影响。因此，在该领域需要一些方法来产生在磷上受立体控制并且展现需要的对降解的稳定性而保持对外源性或者内源性互补DNA/RNA序列的亲和力的寡核苷酸。需要这些化合物可在固体载体或在溶液中简单合成，并且允许对寡核苷酸的糖或核碱基的广泛的合成修饰。

[0004] 本文描述了磷原子-修饰的多聚和寡聚核酸的立体控制的合成，其中在一些实施方式中为在固体载体上进行的。

[0005] 发明简述

[0006] 在本发明的一个方面，提供了包含手性X-膦酸酯部分的核酸的合成方法，包括将包含非手性的H-膦酸酯部分的分子与包含5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体，并且将缩合的中间体转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸。

[0007] 在一些实施方式中，在该方法中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子和与包含5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体的步骤为一锅(one-pot)反应。

[0008] 在一些实施方式中，该方法提供了式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸。

[0009]

[0010] 在式1的化合物的一些实施方式中，R1为-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、1 1 1 1 1 e
烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)
e a c 1 d a c
(R)、-OR 或-SR。Y 为O、NR、S或Se。R 为封闭部分(blocking moiety)。R 为封闭基
d
团。各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e e 2 2
(R)2或-HP(O)(R)。各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔
2 2 2 +1 +1 +1 2 d 2
基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-，或为Na 、Li 或K 的阳离子。Y 为O、NR 或S。各个R
d d 1 1 1
独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、
1 1 b c b
芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。各个Ba独立地为封闭或未封闭
的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。各个X独立地为烷基、烷氧f f - + - + - + f
基、芳基、烷硫基、酰基、-NRR、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z。R+
的每个例子独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺
3
离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z为单价金属离子。R 为氢、封闭基团、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；并且n为1至大约200的整数。

[0011] 在该方法的一些实施方式中，式1的化合物的每个X-膦酸酯部分为由31P NMR光谱学或反相HPLC确定的超过98％非对映体纯度。在该方法的一些实施方式中，每个X-膦
酸酯部分具有RP构型。在该方法的其他实施方式中，每个X-膦酸酯部分具有SP构型。在
该方法的其他实施方式中，每个X-膦酸酯独立地具有RP构型或SP构型。

[0012] 在该方法的另一些实施方式中，包含非手性H-膦酸酯部分的分子为式2的化合物。

[0013]

[0014] 在式2中，R1为-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc。Y1为O、NRd、S或Se。Ra为封闭部分。Rc为封闭基团。各个Rd独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)。各个Re独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-。Y2为O、NRd或S。R2为氢、-NRdRd、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb为封闭部分。Ba为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。Z+为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或单价金属离子。

[0015] 在该方法的一些实施方式中，该方法进一步包括手性试剂。在该方法的另一些实施方式中，手性试剂为式3的化合物。

[0016]

[0017] W1和W2独立地为-NG5-、-O-或-S-。G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、1 2 3 4 5 6
环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为
1 2 3 4 5 6
单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、G、G 和G 中不超过四个为G。

[0018] 在该方法的一些实施方式中，包含5′-OH部分的核苷为式4的化合物。

[0019]2 d d 1 1

[0020] 各个R 独立地为氢、-NRR、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔1 1 1 b c b 1 d
基-Y-、芳基-Y-、-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。Y 为O、NR、S或Se。
c d
R 为封闭基团。各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基e e e 2
甲酸酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯
2 2 2 2 2 d
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-。Y 为O、NR 或S。各个Ba独立地为封闭或未
封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。m为0至n-1的整数。
n为1至大约200的整数。OA连接至三苯甲基部分、甲硅烷基部分、乙酰基部分、酰基部分、芳基酰基部分、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分。J为O且D为H，或
者J为S、Se或BH3并且D为手性配体Ci或式A的部分。

[0021]

[0022] 在式A中，W1和W2独立地为NHG5、OH或SH。A为氢、酰基、芳基、芳烷基或甲硅烷基部分。G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G1、G2、G3、G4和G5中的两个为G6，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G1、G2、G3、G4和G5中不超过四个为G6。

[0023] 在该方法的另一些实施方式中，该方法进一步包括提供缩合试剂CR，其中包含非手性H-膦酸酯部分的分子被激活以与手性试剂反应形成手性中间体。

[0024] 在该方法的另一个实施方式中，缩合试剂CR为Ar3PL2、(ArO)3PL2、

[0025]1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[0026] Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷2 3 5 6 7
基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z 和Z、Z 和Z、Z
8 8 9 9 7 7 8 9 -
和Z、Z 和Z、Z 和Z 或Z 和Z 和Z 中的任何一起形成3至20元脂环或杂环。Q 为反离
子，L为离去基团，并且w为0至3的整数。Ar为芳基、杂芳基和/或一个Ar基团连接于聚
- - - - -
合物载体。在该方法的一些实施方式中，缩合试剂CR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、TfO、- - - -
Tf2N、AsF6、ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。在该方法的其他实施方式中，缩合试剂CR的离去基团为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。

[0027] 在该方法的一些实施方式中，缩合试剂为碳酰氯、氯甲酸三氯甲酯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、乙二酰氯、Ph3PCl2、(PhO)3PCl2、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷六氟磷酸盐(MNTP)或3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)。

[0028]

[0029] 在该方法的另一个实施方式中，该方法进一步包括提供活化试剂AR。在一个实施方式中，活化试剂AR为

[0030]

[0031] 其中Z11、Z12、Z13、Z14、Z15、Z16、Z17、Z18、Z19、Z20和Z21独立地为氢、烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z11和Z12、Z11和Z13、Z11和Z14、Z12和Z13、Z12和Z14、Z13和Z14、Z15和Z16、Z15和Z17、Z16和Z17、Z18和Z19或Z20和Z21中的任何一起形成3至20元脂环或杂环，或者形成5或20元芳香环；并且Q-为反离子。在一个实施方式中，活化试剂AR的反离子为Cl-、Br-、BF4-、PF6-、TfO-、Tf2N-、AsF6-、ClO4-或SbF6-，其中Tf为CF3SO2。在一个实施方式中，活化试剂AR为咪唑、4，5-二氰基咪唑(DCI)、4，5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑、
5-乙硫基四唑、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲基磺酸盐、N-氰基甲基二甲基铵三氟甲基磺酸盐。在另一个实施方式中，活化试剂AR为4，5-二氰基咪唑(DCI)、1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑或N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。

[0032]

[0033] 在实施方式中，活化试剂AR为N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。

[0034] 在该方法的一些实施方式中，反应在质子惰性有机溶剂中进行。在该方法的其他实施方式中，溶剂为乙腈、吡啶、四氢呋喃或二氯甲烷。在该方法的其他实施方式中，当质子惰性有机溶剂不是碱性时，在反应步骤中存在碱。在该方法的一些实施方式中，碱为吡啶、喹啉或N，N-二甲基苯胺。在该方法的一些实施方式中，碱为

[0035]

[0036] 其中Z22和Z23独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或其中任意的Z22和Z23一起形成3至10元脂环或杂环。在该方法的一些实施方式中，碱为N-氰基甲基吡咯烷。在该方法的一些实施方式中，质子惰性有机溶剂为无水的。在该方法的其他实施方式中，无水质子惰性有机溶剂为新鲜蒸馏的。在该方法的另一个实施方式中，新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为吡啶。在该方法的另一个实施方式中，新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为乙腈。

[0037] 在该方法的一些实施方式中，将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括：修饰缩合的中间体以生成式5的化合物。

[0038]

[0039] 在式5中，R1为-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-P(O)(Re)2、-HP(O)(Re)、-ORa或-SRc。Y1为O、NRd、S或Se。Ra为封闭部分。Rc为封闭基团。各个Rd独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(Re)2或-HP(O)(Re)。各个Re独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳基-Y2-或杂芳基-Y2-。Y2为O、NRd或S。各个R2独立地为氢、-NRdRd、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳基-Y1-、杂芳基-Y1-、-ORb或-SRc，其中Rb为封闭部分。各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶，或修饰的核碱基。各个J为S、Se或BH3。v为整数1。OA连接至与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分。A为酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分。G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G1、G2、G3、G4和G5中的两个为G6，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合
1 2 3 4 5 6
的，并且其中G、G、G、G 和G 中不超过四个为G。

[0040] 在该方法的一些实施方式中，将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括：将缩合的中间体加帽并且修饰加帽的中间体以形成式5的化合物。

[0041]1 d d 1 1

[0042] 在式5中，R 为-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔1 1 1 e e a c 1 d
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR。Y 为O、NR、S或Se。
a c d
R 为封闭部分。R 为封闭基团。各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的e e e
甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、
2 2 2 2 2 2 d 2
烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-。Y 为O、NR 或S。各个R 独立
d d 1 1 1 1
地为氢、-NRR、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳
1 b c b
基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧
啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶，或修饰的核碱基。各个J为S、Se或BH3。v为2至n-1的整数。OA连接至与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分。A为酰基、芳基、烷基、
1 2 3 4 5
芳烷基或甲硅烷基部分。G、G、G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、
1 2 3 4 5 6
杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非
1 2 3 4 5 6
稠合的，并且其中G、G、G、G 和G 中不超过四个为G。
1

[0043] 在该方法的一些实施方式中，该方法进一步包括步骤：(a)脱去式5的化合物R 的封闭以生成式4的化合物，其中m至少为1，J为S、Se或BH3并且D为式A的部分；(b)使用权利要求10的方法将式4的化合物反应，其中转化缩合的中间体的步骤包括将缩合的中间体加帽并且修饰加帽的中间体以生成式5的化合物，其中v大于2并且小于约200；并且
(c)可选地重复步骤(a)和(b)以形成式5的化合物，其中v为大于3并且小于约200。

[0044] 在该方法的其他实施方式中，该方法进一步包括将式5的化合物转化为式1的化1 d d
合物的步骤，其中各个Ba部分为未封闭的。R 为-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、
1 1 1 1 1 e e a
炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-ORc 1 d a c d
或-SR。Y 为O、NR、S或Se。R 为封闭部分。R 为封闭基团。各个R 独立地为氢、烷基、烯e e e
基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。各个R 独立
2 2 2 2 2
地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-，或+1 +1 +1 2 d 2 d d
者是Na 、Li 或K 的阳离子。Y 为O、NR 或S。各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、
1 1 1 1 1 b c
卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，b 3 - + - + - + +
其中R 为封闭部分。R 为H。各个X独立地为-SZ、-SeZ 或-BH3Z。Z 为铵离子、烷基
铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z为单价金属离子。

[0045] 在该方法的一些实施方式中，将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括将缩合的中间体酸化以产生式4的化合物，其中m至少为1，J为O，并且D为H。在该方法的一些实施方式中，缩合的中间体包含式A’的部分。

[0046]1 2

[0047] A为氢并且G 和G 独立地为烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂芳基或芳基，并3 4 5 1
且G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、
2 3 4 5 6
G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个
1 2 3 4
环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、G、G
5 6
和G 中不超过四个为G。

[0048] 在该方法的一些实施方式中，该方法进一步包括：(a)使用权利要求10的方法，将式4的化合物反应，其中m至少为1，J为O，并且D为H，其中将缩合的中间体转化为式1的化合物的步骤包括将缩合的中间体酸化以生成式4的化合物，其中m至少为2并且小于约
200；J为O，并且D为H，并且(b)可选地重复步骤(a)以生成式4的化合物，其中m为大于
2并且小于200。

[0049] 在该方法的一些实施方式中，酸化包括加入一定量的勃朗斯特酸或路易斯酸，该量有效地将缩合的中间体转化为式4的化合物而不将嘌呤或嘧啶部分从缩合的中间体除去。在该方法的其他实施方式中，酸化包括加入有机溶剂中的1％三氟乙酸，有机溶剂中的3％二氯乙酸，或有机溶剂中的3％三氯乙酸。在该方法的另一个实施方式中，酸化进一步包括加入阳离子清除剂。在该方法的一些实施方式中，阳离子清除剂为三乙基甲硅烷或三异丙基甲硅烷。

[0050] 在该方法的一些实施方式中，将缩合的中间体转化至式1的化合物的步骤还包括1
在酸化缩合的中间体步骤前脱去R 的封闭。

[0051] 在该方法的其他实施方式中，该方法进一步包括修饰式4的化合物的步骤以引入3
X部分，从而生成式1的化合物，其中R 为封闭基团或与固体载体连接的连接部分。

[0052] 在该方法的另一些实施方式中，该方法进一步包括处理X-修饰的化合物以生成1 d d 1
式1的化合物，其中R 为-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯
1 1 1 1 e e a c 1
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR。Y 为O、
d a c d
NR、S或Se。R 为封闭部分。R 为封闭基团。各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、e e e
酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。各个R 独立地为氢、烷基、
2 2 2 2 2 +1 +1
芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-，或者是Na 、Li+1 2 d 2 d d
或K 的阳离子。Y 为O、NR 或S。各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、烷基、
1 1 1 1 1 b c b
烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为
3
封闭部分。各个Ba部分为未封闭的。R 为H。各个X独立地为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、f f - + - + - + f
酰基、-NRR、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z。各个R 独立地为氢、+
烷基、烯基、炔基或芳基。Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z为单价金属离子。n大于1并且小于约200。

[0053] 在该方法的一些实施方式中，修饰步骤使用硼化试剂、硫亲电子试剂或硒亲电子试剂进行。

[0054] 在该方法的一些实施方式中，硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：

[0055] S8(式B)、Z24-S-S-Z25或Z24-S-X-Z25。

[0056] Z24和Z25独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、24 25
杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z 和Z 一起形成f f
3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR ；并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0057] 在该方法的一些实施方式中，硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：

[0058]

[0059] 在该方法的一些实施方式中，硒亲电子试剂为具有以下式的化合物：

[0060] Se(式G)、Z26-Se-Se-Z27或Z26-Se-X-Z27

[0061] Z26和Z27独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、26 27
杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或Z 和Z 一起形成3f f
至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR，并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0062] 在该方法的一些实施方式中，硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物。

[0063]

[0064] 在该方法的一些实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。

[0065] 在该方法的一些实施方式中，修饰步骤使用硅烷化试剂而后使用硫亲电子试剂、硒亲电子试剂、硼化试剂、烷化剂、醛或酰化剂进行。

[0066] 在该方法的一些实施方式中，硅烷化试剂为三甲基氯甲硅烷(TMS-Cl)、三异丙基氯甲硅烷(TIPS-Cl)、叔丁基二甲基氯甲硅烷(TBDMS-Cl)、叔丁基二苯基氯甲硅烷
(TBDPS-Cl)、1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(HMDS)、N-三甲基甲硅烷基二甲胺(TMSDMA)、N-三甲基甲硅烷基二乙胺(TMSDEA)、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺(TMSA)、N，O-双(三甲基
甲硅烷基)乙酰胺(BSA)或N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。

[0067] 在该方法的一些实施方式中，硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：S8(式B)、24 25 24 25 24 25
Z -S-S-Z 或Z -S-X-Z ，其中Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，
24 25 f
或者Z 和Z 一起形成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR ；并
f
且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0068] 在该方法的一些实施方式中，硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：

[0069]

[0070] 在该方法的一些实施方式中，硒亲电子试剂为含有下式之一的化合物：Se(式G)、26 27 26 27 26 27
Z -Se-Se-Z 或Z -Se-X-Z ，其中Z 和Z 独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰
26 27 f
基，或者Z 和Z 一起形成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR ；
f
并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0071] 在该方法的一些实施方式中，硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物：

[0072]

[0073] 在该方法的一些实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。

[0074] 在该方法的一些实施方式中，烷化剂为卤代烷、卤代烯、卤代炔、烷基磺酸酯、烯基磺酸酯或炔基磺酸酯。在该方法的其他实施方式中，醛为对位甲醛、烷基醛、烯基醛、炔基醛或芳香醛。

[0075] 在该方法的一些实施方式中，酰化剂为式M或N的化合物。

[0076]

[0077] G7为烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳杂氧基；并且M为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。

[0078] 在该方法的一些实施方式中，修饰步骤是通过与卤化剂反应而后与亲核试剂反应进行的。在该方法的一些实施方式中，卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、Br2、I2、磺酰氯(SO2Cl2)、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、一氯化硫、二氯化硫、氯胺、CuCl2、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、CI4、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)或N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)。在该方法的其他实施f f f f f f f
方式中，亲核试剂为NRRH、ROH或RSH，其中R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基，并且NRRHf
的至少一个R 不是氢。

[0079] 在该方法的一些实施方式中，手性试剂为式3的化合物，其中W1为NHG5并且W2为OH。在该方法的一些实施方式中，手性试剂为式O或式P。

[0080]

[0081] 在该方法的一些实施方式中，手性试剂为式Q或式R。

[0082]

[0083] 在该方法的一些实施方式中，Ra为取代或未取代的三苯甲基或取代的甲硅烷基。a
在该方法的其他实施方式中，其中R 为取代或未取代的三苯甲基或取代的甲硅烷基。在该b
方法的其他实施方式中，R 为取代或未取代的三苯甲基、取代的甲硅烷基、乙酰基、酰基或取代的甲醚。

[0084] 在该方法的一些实施方式中，R3为封闭基团，其为取代的三苯甲基、酰基、取代的3
甲硅烷基或取代的苯甲基。在该方法的其他实施方式中，R 为与固体载体连接的连接部分。

[0085] 在该方法的一些实施方式中，Ba部分的封闭基团为苯甲基、酰基、甲酰基、二烷基甲脒基、异丁酰基、苯氧基乙酰基或三苯甲基部分，它们中的任何可为未取代或取代的。在1 d d 1
该方法的一些实施方式中，R 为-N3、-NRR、炔氧基或-OH。在该方法的一些实施方式中，Rd d 2 d d
为-N3、-NRR、炔氧基或-OH。在该方法的其他实施方式中，R 为-NRR、烷基、烯基、炔基、
1 1 1 1 1
烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-，并且被荧光或生物分子结合部分
2 d d 1 1
取代。在该方法的另一些实施方式中，R 为-NRR、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、
1 1 1
炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-，并且被荧光或生物分子结合部分取代。

[0086] 在该方法的一些实施方式中，R2上的取代基为荧光部分。在该方法的其他实施方2 2
式中，在R 上的取代基为生物素或亲和素。在该方法的另一些实施方式中，R 上的取代基
2
为荧光部分。在该方法的一些实施方式中，R 上的取代基为生物素或亲和素。在该方法的
2
其他实施方式中，R 为-OH、-N3、氢、卤素、烷氧基或炔氧基。在该方法的另一些实施方式中，
2
R 为-OH、-N3、氢、卤素、烷氧基或炔氧基。

[0087] 在该方法的一些实施方式中，Ba为5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。在该方法的其他实施方式中，Ba通过被荧光或生物结合部分取代而修饰。在该方法的另一些实施方式中，Ba通过被荧光或生物结合部分取代而修饰。在该方法的一些实施方式中，Ba上的取代基为荧光部分。在该方法的其他实施方式中，Ba上的取代基为生物素或亲和
素。在该方法的另一些实施方式中，Ba上的取代基为荧光部分。在该方法的一些实施方式中，Ba上的取代基为生物素或亲和素。

[0088] 在该方法的一些实施方式中，Z是吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。在该方法的其他实施方式中，Z是吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。在该方法的一些实施方式中，X为烷基、烷f f - + - + f f - +氧基、-NRR、-SZ 或-BH3Z。在该方法的其他实施方式中，X为烷基、烷氧基、-NRR、-SZ- +
或-BH3Z。

[0089] 在该方法的实施方式中，硫亲电子试剂为式F、式E或式B。在该方法的一些实施方式中，硫亲电子试剂为式F、式E或式B。在该方法的其他实施方式中，硒亲电子试剂为式G或式L。在该方法的另一些实施方式中，硒亲电子试剂为式G或式L。在该方法的一些实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯代吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。在该方法的其他实施方式中，卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、磺酰氯(SO2Cl2)或N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)。在该方法的另一些实施方式中，缩合试剂为双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、Ph3PCl2或N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)。

[0090] 本发明的另一个方面，提供了确定或检测样品中靶标分子的方法，方法包括：将疑似含有靶标分子的样品与根据本发明的方法合成的式1的核酸感应分子(sensor
molecule)接触，其中由信号生成单元(signal generating unit)产生的信号变化表明在所述样品中存在所述靶标。核酸感应分子特异性地与靶标分子结合。在一些实施方式中，有多种核酸感应分子。在一些实施方式中，多种核酸感应分子包括特异性结合差异靶标分子的核酸感应分子。在一些例子中，该方法进一步包括定量由信号生成单元生成的信号的变化，以定量样品中靶标分子的量。信号生成单元检测任何类型的信号，包括但不局限于荧光、表面等离子共振、荧光猝灭、化学发光、干涉测量法或折射率检测。

[0091] 被检测的样品为环境样品、生物危险材料、有机样品、药物、毒素、香料、香味或生物样品。生物学样品为细胞、细胞提取物、细胞溶解产物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品。在该方法的一些实施方式中，靶标分子的存在表明病理症状的存在。在该方法的一些实施方式中，靶标分子的存在表明所需分子的存在。

[0092] 在本发明的另一个方面，提供了从核酸模板扩增核酸所需区域的方法，包括：(a)提供多个具有与感兴趣的共有序列互补的固定的核苷酸序列区域的第一PCR引物；(b)提供多个第二PCR引物，(c)在下述条件下通过PCR使用所述多个第一PCR引物和所述多个第
二PCR引物扩增核酸模板，其中所述多个第一引物的一部分实质结合任何存在于模板上的感兴趣的共有序列，并且所述多个第二引物的一部分在模板上离开第一引物的位置结合，从而由第一引物和第二引物侧接(flanked)的核酸区域被特异性地扩增，而且其中所述多个第一PCR引物和/或所述多个第二PCT引物为根据本发明的方法产生的式1的核酸分子。

[0093] 在一些实施方式中，模板为基因组DNA。在一些实施方式中，模板为真核基因组DNA。在一些实施方式中，模板为人类基因组DNA。在一些实施方式中，模板为原核DNA。在一些实施方式中，模板为其是克隆的基因组DNA、DNA的亚基因组区域、染色体或亚染色体区域的DNA。在一些实施方式中，模板为RNA。

[0094] 交叉参考

[0095] 本说明书中公开的所有出版物和专利申请的全部均通过引用方式结合在本文中，就好像各个单独的出版物或专利申请明确地和单独地表明通过引用结合在本文中一样。

[0096] 图简述

[0097] 在所附的权利要求书中详细地阐明了本发明的新特征。通过参考下面的阐述利用本发明原理的说明性实施方式的详细说明和图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，图中：

[0098] 图1.(SP)-4tt的1H NMR谱图(CDCl3)

[0099] 图2.(SP)-4tt的31P NMR谱图(CDCl3)

[0100] 图3.(RP)-4tt的1H NMR谱图(CDCl3)

[0101] 图4.(RP)-4tt的31P NMR谱图(CDCl3)

[0102] 图5A.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0103] 图5B.使用BTC代替Ph3PCl2的(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0104] 图6A.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0105] 图6B.使用BTC代替Ph3PCl2的(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0106] 图7A.(RP)-5tt的原始UPLC 分布

[0107] 图7B.(RP)-5tt的原始UPLC 分布

[0108] 图8.(RP)-5tt的原始UPLC 分布

[0109] 图9A.(SP)-5ct的原始UPLC 分布

[0110] 图9B.(SP)-5ct的原始UPLC 分布

[0111] 图10A.(RP)-5ct的原始UPLC 分布

[0112] 图10B.(RP)-5ct的原始UPLC 分布

[0113] 图11.(SP)-5at的原始UPLC 分布

[0114] 图12.(RP)-5at的原始UPLC 分布

[0115] 图13.(SP)-5gt的原始UPLC 分布

[0116] 图14.(RP)-5gt的原始UPLC 分布

[0117] 图15A.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0118] 图15B.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0119] 图16A.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0120] 图16B.(SP)-5tt的原始UPLC 分布

[0121] 图17A.(RP)-5tt的原始UPLC 分布

[0122] 图17B.(RP)-5tt的原始UPLC 分布

[0123] 图18.(SP)-5ct的原始UPLC 分布

[0124] 图19.(RP)-5ct的原始UPLC 分布

[0125] 图20A.(SP)-5at的原始UPLC 分布

[0126] 图20B.(SP)-5at的原始UPLC 分布

[0127] 图21.(SP)-5at的原始UPLC 分布

[0128] 图22A.(RP)-5at的原始UPLC 分布

[0129] 图22B.(RP)-5at的原始UPLC 分布

[0130] 图23.(SP)-5gt的原始UPLC 分布

[0131] 图24.(RP)-5gt的原始UPLC 分布

[0132] 图25.(SP)-7tt的原始UPLC 分布

[0133] 图26.(RP)-7tt的原始UPLC 分布

[0134] 图27.(SP)-8tt的原始UPLC 分布

[0135] 图28.(RP)-8tt的原始UPLC 分布

[0136] 图29A.全(all)-(SP)-[TPS]3T的原始UPLC 分布

[0137] 图29B.全-(SR)-[TPS]3T的MALDI TOF-MS谱图

[0138] 图30A.(SP，RP，SP)-[TPS]3T的原始UPLC 分布

[0139] 图30B.(SP，RP，SP)-[TPS]3T的MALDI TOF-MS谱图

[0140] 图31A.(RP，SP，RP)-[TPS]3T的原始UPLC 分布

[0141] 图31B.(RP，SP，RP)-[TPS]3T的MALDI TOF-MS谱图

[0142] 图32A.全-(RP)-[TPS]3T的原始UPLC 分布

[0143] 图32B.全-(RP)-[TPS]3T的MALDI TOF-MS谱图

[0144] 图33A.(SP)-9uMu的原始UPLC 分布

[0145] 图33B.(SR)-9uMu的MALDI TOF-MS谱图

[0146] 图34A.(RP)-9uMu的原始UPLC 分布

[0147] 图34B.(RP)-9uMu的MALDI TOF-MS谱图

[0148] 图35A.(SP)-10uFu的原始UPLC 分布

[0149] 图35B.(SP)-10uFu的MALDI TOF-MS谱图

[0150] 图36A.(RP)-10uFu的原始UPLC 分布

[0151] 图36B.(RP)-10uFu的MALDI TOF-MS谱图

[0152] 图37A.(SP)-11nt的原始UPLC 分布

[0153] 图37B.(SP)-11nt的MALDI TOF-MS谱图

[0154] 图38A.(RP)-11nt的原始UPLC 分布

[0155] 图38B.(RP)-11nt的MALDI TOF-MS谱图

[0156] 发明详述

[0157] 定义

[0158] 除非另外说明，在包括说明书和权利要求的本申请中使用的以下术语具有如下定义。必须说明的是，如用于说明书和附加权利要求中的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数含义，除非上下文有明确的另外表示。除非另外表明，使用质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。在本申请中，除非另外说明，“或”或“和”的使用是指“和/或”。另外的，术语“包括(including)”以及其他形式，诸如“包含(include)”、“含有(includes)”和“包括的(included)”的使用是非限定性的。

[0159] 术语“核酸”包括多聚-或寡聚-核糖核苷酸(RNA)和多聚-或寡聚-脱氧核糖核苷酸(DNA)；衍生自核碱基和/或修饰的核碱基的N-苷类或C-苷类的RNA或DNA；衍生
自糖和/或修饰的糖的核酸；以及衍生自磷酸桥联和/或修饰的磷原子桥联的核酸。该术
语包括包含核碱基、修饰的核碱基、糖、修饰的糖、磷酸桥联或修饰的磷原子桥联的任意组合的核酸。例子包括，但是不局限于，包含核糖部分的核酸、包含脱氧-核糖部分的核酸、包含核糖和脱氧核糖部分的核酸、包含核糖和修饰的核糖部分的核酸。前缀多聚-指含有约1至约10,000个核苷酸单体单元的核酸并且其中前缀寡聚-指含有约1至约200个核苷酸
单体单元的核酸。

[0160] 术语“核碱基”指参与一个核酸链以序列特异性方式结合另一个互补链的氢键结合的核酸的部分。最常见的天然存在的核碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。

[0161] 术语“修饰的核碱基”指可替代核碱基的部分。修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电学性质或一些其他的物理化学性质，并且保留一个核酸链以序列特异性方式结合另一个核酸链的氢键结合的性质。修饰的核碱基可与所有五个天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤)配对，而基本上不影响熔融性状、被细胞内酶的识别或寡核苷酸双链体(duplex)的活性。

[0162] 术语“核苷”指其中核碱基或修饰的核碱基与糖或修饰的糖共价结合的部分。

[0163] 术语“糖”指以闭合和/或开放形式的单糖。糖包括但不局限于核糖、脱氧核糖、呋喃戊糖、吡喃戊糖和吡喃己糖部分。

[0164] 术语“修饰的糖”指可替代糖的部分。修饰的糖模拟糖的空间排列、电学性质或一些其他的理化性质。

[0165] 术语“核苷酸”指其中核碱基或修饰的核碱基与糖或修饰的糖共价连接且糖或修饰的糖与磷酸基团或修饰的磷原子部分共价连接的部分。

[0166] 术语“手性试剂”指手性或对映体纯度的(enantiopure)并且可用于核酸合成中的不对称性诱导的化合物。

[0167] 术语“手性配体”或“手性助剂(chiral auxiliary)”指手性或对映体纯度的并且控制反应的立体化学结果的部分。

[0168] 在缩合反应中，术语“缩合试剂”指活化活性较小的位点并且使其更易受到亲和试剂的攻击的试剂。

[0169] 术语“封闭部分”指暂时屏蔽官能团的反应性基团。随后官能团可以通过除去封闭部分去屏蔽。

[0170] 术语“硼化试剂”、“硫亲电子试剂”、“硒亲电子试剂”指用于为在磷原子上修饰而分别引入BH3、S和Se基团的修饰步骤的化合物。

[0171] 术语“部分”指分子的特定片段或官能团。化学部分通常是被插入或附加在分子上的被识别的化学实体。

[0172] 术语“固体载体”指任何允许核酸的大规模合成生产并且可在需要时重新使用的支持物。如本文所用，该术语是指不溶于在合成核酸的反应步骤中使用的介质、并且衍生为包含反应性基团的聚合物。

[0173] “连接部分”指可选的位于末端核苷和固体载体之间或在末端核酸和其他的核苷、核苷酸或核酸之间的任何部分。

[0174] 如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“缓解”或“改善”在本文中可交换使用。这些术语指获得包括但不局限于治疗益处和/或预防益处的有益或需要的结果的方法。治疗益处是指正在治疗的根本病症的根除或者改善。并且，治疗益处通过根除和改善一个或多个与根本病症相关的生理症状而达到，从而在患者中观察到改善，尽管患者仍可能经受根本病症折磨。对于预防益处，可将组合物施用给处于发展特定疾病的风险的患者，或施用给报告了一个或多个疾病的生理症状的患者，尽管该疾病的诊断不一定已经确定。

[0175] 如本文所用术语“治疗效果”，包含如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延缓或消除疾病或症状的出现，延缓或消除疾病或状态的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或状态的进程，或其任何组合。

[0176] “烷基”基团指脂肪族碳氢基团。烷基部分可以为饱和烷基基团(意味着其不含有任何不饱和单元，例如，碳-碳双键或碳-碳三键)或者烷基部分可为不饱和烷基基团(意味着其包含至少一个不饱和单元)。烷基部分，无论是饱和或不饱和的，可以为支链、直链或包括环状部分。烷基的连接点在不是环的一部分的碳原子上。

[0177] “烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论在本文中何时出现，如“1至10”的数值范围指在所述范围内的每个整数，例如，“1至10个碳原子”意思是烷基基团可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至并且包括10个碳原子组成，尽管本定义也包括没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基包括分支和直链烷基基团。在本文所述化合物的烷基基团可指定为“C1-C6烷基”或相似的指定。仅以例子的方式，“C1-C6烷基”表明在烷基链中有一个、两个、三个、四个、五个或六个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基基团包括，但是不局限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。在一个方面，烷基为C1-C6烷基。

[0178] 如本文所用，术语“芳基”指芳香环，其中形成环的每个原子为碳原子。芳香环由五个、六个、七个、八个、九个或多于九个碳原子形成。芳基为取代的或未取代的。在一个方面，芳基为苯基或萘基。根据结构，芳基可为单价基团或双价基团(也就是，亚芳基基团)。在一个方面，芳基为C6-C10芳基。

[0179] ″杂芳基″，或可选的，″杂芳香族的″指包括一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子并且可为单环、双环、三环或四环系统的5-至18-元芳香族基团(也就是，C5-C13杂芳基)。无论在本文何处出现，诸如″5至18″的数字范围指在给定范围的每个整数；例
如，″5至18个环原子″意思是杂芳基基团可由5个环原子、6个环原子等至最多并包括
18个环原子组成。含有N的″杂芳香族的″或″杂芳基″部分指其中至少一个环的骨架
原子为氮原子的芳香基团。多环杂芳基可为稠合或非稠合的。杂芳基中杂原子可选地为
氧化的。如果出现，一个或多个氮原子可选择地为季铵化的。杂芳基通过环中任意原子连接分子的其余部分。杂芳基的例子包括但不局限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1，3-苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1，4]二氧杂卓基(dioxepinyl)、苯并[b][1，4]噁嗪基、1，4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯丙噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并噁唑基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并呋咱基、苯并噻唑基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并噻吩并[3，2-D]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4，6]咪唑并[1，2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、环戊[d]嘧啶基、6，7-二氢-5H-环戊[4，5]噻吩并[2，
3-d]嘧啶基、5，6-二氢苯并[h]喹唑啉基、5，6-二氢苯并[h]噌啉基、6，7-二氢-5H-苯并[6，7]环庚[1，2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋咱基、呋喃酮基、呋喃并[3，2-c]吡啶基、5，6，7，8，9，10-六氢环辛[d]嘧啶基、5，6，7，8，9，10-六氢环辛[d]哒嗪基、5，6，7，8，9，10-六氢环辛[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢氮茚基、异喹啉基、中氮茚基、异噁唑基、5，8-亚甲基-5，6，7，
8-四氢喹唑啉基、萘啶基、1，6-萘啶酮基(naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧氮杂卓基(oxoazepinyl)、噁唑基、环氧乙烷基、5，6，6a，7，8，9，10，10a-八氢苯并[h]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、酚噻嗪基、酚噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3，2-d]嘧啶基、吡啶并[3，4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹噁啉基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、5，6，7，
8-四氢喹唑啉基、5，6，7，8-四氢苯并[4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶基、6，7，8，9-四氢-5H-环庚[4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶基、5，6，7，8-四氢吡啶并[4，5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、硫代吡喃基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2，3-d]嘧啶基、噻吩并[3，2-d]嘧啶基、噻吩并[2，3-c]吡啶基和苯硫基(也就是噻吩基)。除非在专利说明书中特定地说明，杂芳
基部分可选地被一个或多个取代基取代，这些取代基独立地为：烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、羟基、卤代、氰基、硝基、氧代、硫代、三a a a a a a a a
甲基甲硅烷基、-OR、-SR、-OC(O)R、-N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)a a a a a a
OR、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)tR(其中t为1或2)、-S(O)tOR(其中t为1或2)或-S(O)
a a
tN(R)2(其中t为1或2)其中各个R 独立地为氢、烷基、氟代烷基、碳环基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基。

[0180] 术语“脂环的”指既是脂肪族的又是环状的所有碳部分。脂环基团包含一个或多个全碳环，其可为饱和的或不饱和的，但是不具有芳香性质。脂环基团为取代的或未取代的，并且可以含有从一至十个碳原子。在一个方面，脂环为单环环烷烃。在另一个方面，脂环为双环环烷烃。

[0181] 术语″芳烷基″指被芳基取代的烷基。合适的芳烷基包括苯甲基、吡啶甲基等，其所有可为可选地被取代的。

[0182] “酰基部分”指烷基(C＝O)、芳基(C＝O)或芳烷基(C＝O)基团。酰基部分可以具有为氧、氨基、硫或硒基的在羰基和碳氢基团之间的插入部分(Y)。例如，酰基基团可为烷基-Y-(C＝O)、芳基-Y-(C＝O)或芳烷基-Y-(C＝O)。

[0183] “烯基”基团为含有至少一个碳-碳双键的直链、支链和环状碳氢基团。烯基基团可为被取代的。

[0184] “炔基”基团为含有至少一个碳-碳三键的直链、支链和环状碳氢基团。炔基基团可为被取代的。

[0185] “烷氧基”基团指连接至氧的烷基，即(烷基)-O-基团，其中烷基为如在本文所定义。例子包括甲氧基(-OCH3)或乙氧基(-OCH2CH3)基团。

[0186] “烯氧基”基团指连接至氧的烯基，即(烯基)-O-基团，其中烯基为如在本文所定义。

[0187] “炔氧基”基团指连接至氧的炔基，即(炔基)-O-基团，其中炔基为如在本文所定义。

[0188] “芳氧基”基团指连接至氧的芳基，即(芳基)-O-基团，其中芳基为如在本文所定义。例子包括苯氧基(-OC6H5)。

[0189] 术语“烷硒基”指具有连接其上的取代的硒基的烷基，即(烷基)-Se-基团，其中烷基为如在本文所定义。

[0190] 术语“烯硒基”指具有连接其上的取代的硒基的烯基，即(烯基)-Se-基团，其中烯基为如在本文所定义。

[0191] 术语“炔硒基”指具有连接其上的取代的硒基的炔基，即(炔基)-Se-基团，其中炔基为如在本文所定义。

[0192] 术语“烷硫基”指连接至桥联硫原子的烷基，即(烷基)-S-基团，其中烷基为如在本文所定义。例如，烷硫基为甲基硫等。

[0193] 术语“烯硫基”指连接于桥联硫原子的烯基，即(烯基)-S-基团，其中烯基为如在本文所定义。

[0194] 术语“炔硫基”指连接于桥联硫原子的炔基，即(炔基)-S-基团，其中炔基为如在本文所定义。

[0195] 术语“烷氨基”指被至少一个烷基取代的氨基，即-NH(烷基)或-N-(烷基)2，其中烷基为如在本文所定义。

[0196] 术语“烯氨基”指被至少一个烯基取代的氨基，即-NH(烯基)或-N-(烯基)2，其中烯基为如在本文所定义。

[0197] 术语“炔氨基”指被至少一个炔基取代的氨基，即-NH(炔基)或-N-(炔基)2，其中炔基为如在本文所定义。

[0198] 术语″卤素″意在包括氟、氯、溴和碘。

[0199] ″荧光基团″指当由具有选择的波长的光激发时发射出不同波长的光的分子。荧光基团包括但不局限于吲哚基团、荧光素、四甲基若丹明、德克萨斯红、BODIPY、5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸(EDANS)、香豆素和萤光黄。

[0200] “铵离子”为化学式NH4+的带正电荷的多原子阳离子。

[0201] “烷基铵离子”为至少一个氢原子被烷基取代的铵离子，其中烷基为如在本文所定义。例子包括三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子。

[0202] “亚胺离子”具有通用结构R2C＝NR2+。R基团指如在本文所定义的烷基、烯基、炔基、芳基。“杂芳香族亚胺离子”指其中氮和其所连接的R基团形成杂芳香族环的亚胺离子。“杂环亚胺离子”指其中氮和其所连接的R基团形成杂环的亚胺离子。

[0203] 术语“氨基”或“胺”指-N(Rh)2基团，其中各个Rh独立地为氢、烷基、氟代烷基、碳环基、碳环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基，除非在专利说明书中f f另外的特定说明。当-N(R)2基团具有两个不是氢的R，它们可与氮原子一起形成4-、5-、f
6-或7-元环。例如，-N(R)2意在包括但不局限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。任何一个
或多个氢、烷基、氟代烷基、碳环基、碳环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基可选地被一个或多个取代基取代，该取代基独立地为烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、羟基、卤代、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、硝i i i i i i i
基、三甲基甲硅烷基、-OR、-SR、-OC(O)R、-N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-C(O)i i i i i i i i i i i
N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(NR)N(R)2、-N(R)S(O)
i f f
tR(其中t为1或2)、-S(O)tOR(其中t为1或2)或-S(O)tN(R)2(其中t为1或2)，其中
i
R 独立地为氢、烷基、氟代烷基、碳环基、碳环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基。

[0204] 如本文所用，“氨基甲酸酯”指连接于式-C(O)OR的氨基的部分，其中R为烷基、氟代烷基、碳环基、碳环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基。例子包括但不局限于Boc(叔丁基-OC(O)-)、CBz(苯甲基-OC(O)-)、Teoc(Me3SiCH2CH2OC(O)-)、alloc(烯丙基-OC(O)-)或Fmoc(9-芴基甲基-OC(O)-)。

[0205] 如本文所用，“取代的甲硅烷基”指具有式R3Si-的部分。例子包括，但不局限于，TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基)。

[0206] 术语″巯基″指-SH基团，并且包括取代的巯基，也就是-SRj基团，其中Rj各个独立地为如本文所述的取代的或未取代的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基芳烷基、杂环基或杂环烷基。

[0207] 合成方法

[0208] 合成含有手性X-膦酸酯部分的核酸的方法的一般讨论。

[0209] 本方法提供磷原子修饰的核酸的有效的合成，其中控制在磷原子上的立体化学构型，因此产生立体定义的寡核苷酸。该方法消除对非对映体混合物的复杂的分离的需要并且允许使用可容易获得的廉价的非手性起始材料。本发明公开的合成方法包括将非手性H-膦酸酯部分(式2)与包含诸如羟基的亲核部分的核苷(式4-1，其中Q1为任何封闭基
团、连接于支持物或核苷酸链上的连接部分)不对称反应，以提供包含手性X-膦酸酯部分的磷原子修饰的核酸(如路线1所示的式1的化合物)。以该方法，合成了具有高非对映体
纯度的核苷酸多聚体或寡聚体。在一些实施方式中，核酸包含在核碱基、糖部分和/或保护基团上的修饰。

[0210] 路线1.式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸的合成。

[0211]

[0212] 式2的包含非手性H-膦酸酯部分的分子与式4-1的包含亲核部分的核苷反应导致缩合的中间体的生成；其被转化为包含手性X-膦酸酯部分的核酸。缩合的中间体的合成包括步骤：(a)使用缩合试剂活化式2的化合物，(b)与手性试剂反应，接下来(c)与式4-1的化合物反应。通用的路线显示于路线2中。手性试剂作为手性助剂基团连接于缩合的中间体上。在本文提供的方法中，可进行导致缩合的中间体的步骤(a)-(c)而不需分离任何中间体，即在同一锅或一锅中。因此，本方法排除了对个别的中间体的分离的需要。本文所公开的方法可在溶液中或固体载体上进行。根据反应条件，活化试剂的加入可对缩合步骤有益。例如，活化试剂可在步骤(a)-(c)完成后加入反应中或可在步骤(a)-(c)的同时加
入反应中。

[0213] 路线2.导致缩合的中间体的形成的反应步骤。

[0214]

[0215] 在一个实施方式中，缩合的中间体通过如下过程被转化为式1的含有手性X-膦酸酯部分的核酸：用部分A(其为酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分)对缩合的中间体上的手性助剂加帽，并且修饰磷以引入J，其为S、Se或BH3，从而产生式5-1的化合物。在一个实施方式中(选择A，路线3)，通过切割手性助剂并且脱去封闭基团的封闭以及如需要的话从固体载体上切割，将式5-1的化合物转化为式1的化合物，其中X为S、Se或BH3，且n为1(二聚体)。当形成二聚体时，路线3中的加帽步骤为可选的。或者(选择B，路线3)，式5-1的化合物通过重复产生缩合的中间体的步骤而进行链延长，其中将另外的式2的单
体加入寡核苷酸中。重复加帽、修饰、脱封闭和链延长步骤直到达到需要的n。在该时候，切割各个膦酸酯上的手性助剂，切割剩余的封闭基团，如果需要包括从固体载体上的切割，以产生式1的化合物，其中X为S、Se或BH3，并且n为大于或等于2并且小于约200。

[0216] 路线3.通过途径A将式1的化合物转化为缩合的中间体。

[0217]

[0218] 在本文提供的另一个方法中，通过酸化缩合的中间体以在R1上除去封闭基团，其也除去手性助剂，将缩合的中间体转化为式1的含有手性X膦酸酯部分的核酸。在一个实施方式中(选择A，路线4)，式4的化合物经修饰在磷上引入X部分以生成式1的化合物，
脱去其封闭，以除去剩余的封闭基团，并且需要的话从合成支持物上除去，以产生式1的化
3
合物，其中R 为氢并且n为1。

[0219] 或者，在路线4(选择B)中的式4的化合物经过链延长反应的步骤，继而酸化以脱1 1
去新加入的核苷的R 封闭基团的封闭。将该链延长步骤和R 脱封闭步骤进行m个重复。
在该时候，式4的化合物(其中m等于n-1)经修饰在各个磷上引入X部分以产生式1的化
合物，脱去其封闭，以除去剩余的封闭基团，并且需要的话从合成支持物上除去，以产生式1
3
的化合物，其中R 为氢并且n为大于或等于2并且小于约200。

[0220] 路线4.通过途径B将缩合的中间体转化为式1的化合物。

[0221]f f

[0222] 在路线4的选择A和选择B中，X为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRR、烯氧- + - + - + f基、炔氧基、烯硫基、炔硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z，其中各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔+
基或芳基；Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z为单价金属离子。在另外的实施方式中，Z为吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。

[0223] 磷原子修饰的式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸。

[0224] 本发明的方法提供如下通式1-1或通式1-2的含有手性X-膦酸酯部分的核酸：

[0225]

[0226] 其中X-膦酸酯部分连接天然核苷部分或非天然核苷部分，其中天然核糖环被较大或较小的含氧环取代或者其中环被非环结构取代，其中W3为-S-、-O-、取代的或未取代的氨基、烯基、亚烯基或或亚炔基。在核酸的其他的实施方式中，X-膦酸酯部分连接天然核苷部与非天然核苷部分。在核酸的另一些实施方式中，X-膦酸酯部分通过不同的糖部分将核苷部分相互连接。

[0227] 在本发明的一个实施方式中，包含手性X-膦酸酯部分的核酸为式1的化合物：

[0228]

[0229] 在式1中，R1为-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯1 1 1 1 e e a c
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR。

[0230] Y1为O、NRd、S或Se。

[0231] Ra为封闭部分。

[0232] Rc为封闭基团。

[0233] 各个Rd独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸e e酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。

[0234] 各个Re独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳2 2 +1 +1 +1
基-Y-或杂芳基-Y-，或为Na 、Li 或K 的阳离子。

[0235] Y2为O、NRd或S。

[0236] 各个R2独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯1 1 1 1 b c b
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。

[0237] 各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。

[0238] 各个X独立地为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRfRf、烯氧基、炔氧基、烯硫- + - + - +基、炔硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z。

[0239] 各个Rf独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0240] Z+为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z为单价金属离子。

[0241] R3为氢、封闭基团、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分；并且n为1至大约200的整数。

[0242] 在一个实施方式中，任何R2基团被例如荧光部分、生物素部分或亲和素部分取代。

[0243] 在一个实施方式中，本文中所述的核酸是从所有的核糖核苷酸单体所制备的。在另一些实施方式中，其是从所有的脱氧核糖核苷酸单体制备的。在另一些实施方式中，核酸是从核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体的混合物制备的。在一个实施方式中，核酸为RNA2
和DNA部分的混合物。在另一些实施方式中，核酸包括在不存在于RNA或DNA核酸中的R
上的取代基。

[0244] Ba代表核碱基，其为天然的或修饰的核碱基。各个核碱基独立地为封闭或未封闭的。

[0245] 各个X独立地为烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRfRf、烯氧基、炔氧基、烯硫- + - + - + f +基、炔硫基、-SZ、-SeZ 或-BH3Z，其中各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基；Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或f f - + - +
季，或者Z为单价金属离子。在一些实施方式中，X为烷基、烷氧基、-NRR、-SZ 或-BH3Z。
在另外的实施方式中，Z为吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。

[0246] R3为氢、封闭基团、与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分，其使用3
本文的方法或本领域已知的方法制备。连接使用任何已知的方法制备的R 的核酸包含修
饰、未修饰的磷原子或修饰和非修饰磷的混合物的磷原子，并且包含在磷原子上的任何构
3
型。在一个实施方式中，R 为与另一核酸或核苷酸连接的连接部分。

[0247] X-膦酸酯部分。

[0248] 如本文所用，X-膦酸酯部分指经修饰与部分X共价连接的核苷间骨架链接的磷原子，其中X可为但不局限于硫、硒、烷基、硼、酰基、氨基、巯基或烷氧基。X部分通过替代核苷间骨架中的一个氧原子来修饰磷原子。作为非限制性例子，两个核酸片段的核苷间骨架链接如下所示(在虚线矩形框中)。以下左手的结构表示天然核苷间骨架链接中存在的膦酸酯基团。以下右手的结构表示作为核苷间骨架链接的X-膦酸酯部分。

[0249]

[0250] 硫代磷酸酯(phosphorothioate)部分包括作为X部分的硫部分。硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)部分包含作为X部分的硒部分。烷基膦酸酯部分(例如，甲基膦酸
酯)包含作为X部分的烷基(例如，甲基)。硼烷膦酸酯(boronophosphonate)部分包含作
为X部分的硼烷基团。

[0251] 在实施方式中，核酸在骨架链接中包含硫代磷酸酯基团。在一些实施方式中，核酸在骨架链接中包含硒代磷酸酯基团。在另外的实施方式中，核酸在骨架链接中包括烷基膦酸酯基团(例如，甲基膦酸酯)。在其他实施方式中，核酸在骨架链接中包括硼烷膦酸酯基团。

[0252] 各个X部分可独立地选自在本文所述的各种X部分。这允许在一个核酸中出现多个X部分。在一个实施方式中，核酸中使用相同的X部分。在另外的实施方式中，核酸中使用不同的X部分。例如，在一个核酸中，一些X-膦酸酯为硫代磷酸酯(phosphothioate)部分，而在相同核酸中的其他的X膦酸酯为烷基膦酸酯部分。对于本领域的技术人员明显的是，其他的磷的修饰的变化和改变是可能的，并且取决于这些核酸的使用和应用。在一些实施方式中，X部分的选择取决于核酸的生物化学性质及其与生物样品的相互作用。

[0253] X-膦酸酯部分的构型。

[0254] 本文所述方法对于在核苷间骨架链接中各个磷原子的构型的控制是有用的。手性试剂允许对X膦酸酯手性的特定控制。因此，可在各个合成循环中选择RP或SP构型，从而允许核酸产物的总体三维结构的控制。在一些实施方式中，对RP和SP构型的选择赋予核酸链的特定三维超结构。

[0255] 在一些实施方式中，各个X-膦酸酯部分可以具有RP构型。在另外的实施方式中，各个X-膦酸酯部分可以具有SP构型。在另一实施方式中，各个X-膦酸酯部分独立地可为RP构型或SP构型。在特定的实施方式中，核酸中的X-膦酸酯部分在RP和SP间交替，诸如
RP、SP、RP或SP、RP、SP。在另外的特定的实施方式中，核酸中的X-膦酸酯部分含有重复的RP、RP、SP、SP构型。在其他实施方式中，核酸包含全部的RP构型。在另外的实施方式中，核酸包含全部的SP部分。在一些实施方式中，5′和3′端核苷间骨架链接为SP构型，并且内部的核苷间骨架链接全部为RP构型。本文所述的实施方式用作使用这些方法如何控制构型的
例子。本文所述的核酸不局限于这些构型模式。对于本领域的技术人员明显的是，RP和SP构型的其他变化和交替方式是可能的，并且取决于核酸的使用和应用。

[0256] X膦酸酯构型的纯度确定。

[0257] 使用常规分析方法，例如但是不局限于31P NMR波谱或反相HPLC，确定核酸上的各个X膦酸酯部分的构型纯度。在一个实施方式中，使用在本文中描述的方法，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过80％非对映体纯度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过60％非对映体纯度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过70％非对映体纯度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过85％非
对映体纯度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过90％非对映体纯
度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过95％非对映体纯度。在另
一实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过98％非对映体纯度。在另一实施方
式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过99％非对映体纯度。在一个实施方式中，化合物的各个X-膦酸酯部分可为超过约60％，超过约70％，超过约80％，超过约83％，超过约
84％，超过约85％，超过约86％，超过约87％，超过约88％，超过约89％，超过约90％，超过约91％，超过约92％，超过约93％，超过约94％，超过约95％，超过约96％，超过约97％，超过约98％，或超过约99％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约
60％至约99.9％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约60％至
约99％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约60％至约70％非
对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约70％至约80％非对映体纯
度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约80％至约90％非对映体纯度。在一
个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约80％至约99％非对映体纯度。在一个实施方
式中，各个X-膦酸酯部分可为从约85％至约95％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为从约90％至约95％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯
部分可为从约95％至约99％非对映体纯度。在一个实施方式中，各个X-膦酸酯部分可为
从约90％至约99.9％非对映体纯度。

[0258] 特定构型超过另外的构型的量影响核酸的三维结构以及其稳定性。因此，不同的构型影响核酸的生物学、化学和物理学特性。在一个实施方式中，核酸包含的SP构型的百分比多于RP构型的百分比。在另一实施方式中，核酸包含的RP构型的百分比多于SP构型的百分比。在另一实施方式中，核酸包含相同的的RP构型和SP构型的百分比。在一个实施方式中，核酸可包含0-20％RP构型。在一个实施方式中，核酸可包含20-40％RP构型。在一个实施方式中，核酸可包含40-60％RP构型。在一个实施方式中，核酸可包含60-80％RP构型。在一个实施方式中，核酸可包含80-100％RP构型。在一个实施方式中，核酸可包含
0-20％SP构型。在一个实施方式中，核酸可包含20-40％SP构型。在一个实施方式中，核酸可包含40-60％SP构型。在一个实施方式中，核酸可包含60-80％SP构型。在一个实施
方式中，核酸可包含80-100％SP构型。

[0259] 磷原子修饰的核酸的长度。

[0260] 式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸含有约1个核苷至约200个核苷。在一些实施方式中，式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸进一步组合为寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，式1的核酸为二聚体。在另外的实施方式中，式1的核酸包含最多约100个核苷。在另外的实施方式中，式1的核酸包含最多约150个核苷。在另外的实施方式中，式1的核酸包含最多约200个核苷。在另外的实施方式中，式1的核酸包含最多约300个核苷。
在一些实施方式中，式1的核酸包含从1至约200个核苷。在另外的实施方式中，核酸包含从1至约150个核苷。在另外的实施方式中，核酸包含从1至约10个核苷。在另外的实施
方式中，核酸包含从约10至约50个核苷。在另外的实施方式中，核酸包含从约10至约100个核苷。在一些实施方式中，核酸包含从1至约5个核苷，或约5至约10个核苷，或约5至
约15个核苷，或约10至约20个核苷，或约15至约25个核苷，或约20至约30个核苷，或约
25至约35个核苷，或约30至约40个核苷。在式1的一些实施方式中，n为1至大约200
的整数。在式1的一些实施方式中，n为1至约150的整数。在式1的一些实施方式中，n
为1至约10的整数。在式1的一些实施方式中，n为10至约50的整数。在式1的一些实
施方式中，n为10至约100的整数。在式1的一些实施方式中，n为1至约5，或约5至约
10，或约5至约15，或约10至约20，或约15至约25，或约20至约30，或约25至约35，或约
30至约40的整数。

[0261] 磷原子修饰的核酸的另外的变体。

[0262] 式1的核酸可为单链的。在一些实施方式中，式1的核酸与互补链杂交形成双链核酸。

[0263] 在一些实施方式中，式1的核酸可含有开放的线性结构。在另外的实施方式中，式1的核酸的各个末端结合形成环状结构。

[0264] 在核酸中，各个单元的糖组分包含相同或不同的糖。在一些实施方式中，糖为修饰的糖或被取代的糖。在一些实施方式中，所有的糖为核糖糖部分。在一些实施方式中，所有的糖为脱氧核糖糖部分。在另外的实施方式中，所有的糖为呋喃戊糖、吡喃戊糖或吡喃己糖部分。在另外的实施方式中，糖组分包含闭合的环结构或开放的结构。

[0265] 在核酸结构中，磷原子桥联通常指形成核酸的核苷间骨架。核酸的核苷间骨架链接包括但不局限于描述于美国专利No.6,608,186和Joyce，G.F.Nature，2002，418，
214-220中的2′至5′磷原子桥联、3′至5′磷原子桥联、5′至3′磷原子桥联和3′至
2′磷原子桥联和4′至2′磷原子桥联。核苷间骨架链接中的变化的非限制性的例子如下所示：

[0266]

[0267] 取决于糖或修饰的糖组分，也可考虑其他类型的磷原子桥联，包括但不局限于如下显示并描述于Xu，L.等人，J.Med.Chem.，2005，48，4177-4181中的亚甲基双膦酸酯桥联。

[0268]

[0269] 式1的核酸可以包含相同或不同的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包括全部均相同的核碱基。在另外的实施方式中，式1的核酸包括全部均不同的核碱基。在另外的的实施方式中，式1的核酸包含天然存在的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包含修饰的核碱基。在再其他实施方式中，核酸包含模拟在自然界中发现的核酸的核碱基序列的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包含天然存在的核碱基和修饰的核碱基的混合物。

[0270] 含有非手性H-膦酸酯部分的分子。

[0271] 包含非手性H-膦酸酯部分的分子为式2的化合物：

[0272]

[0273] 在式2中，R1为-NRdRd、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔1 1 1 e e a c
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR。

[0274] Y1为O、NRd、S或Se。

[0275] Ra为封闭部分。

[0276] Rc为封闭基团。

[0277] 各个Rd独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸e e酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。

[0278] 各个Re独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y2-、烯基-Y2-、炔基-Y2-、芳2 2
基-Y-或杂芳基-Y-。

[0279] Y2为O、NRd或S。

[0280] R2为氢、-NRdRd、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯基-Y1-、炔基-Y1-、芳1 1 b c b
基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。

[0281] Ba为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。

[0282] Z+为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或单价金属离子。

[0283] 在一些实施方式中，Z为吡啶鎓离子、三乙基铵离子、N，N-二异丙基乙基铵离子、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯离子、钠离子或钾离子。

[0284] 在一些实施方式中，糖为核糖环。在另外的实施方式中，糖为脱氧核糖、呋喃戊糖、吡喃戊糖或吡喃己糖部分。在另外的实施方式中，糖为修饰的糖。在一些实施方式中，糖为甘油类似物或取代的糖。

[0285] H-膦酸酯核苷单体易于制备并且稳定。其制备方法已被记录(参见例如，Froehler，B.C.Methods in Molecular Biology.In Protocols for Oligonucleotides and Analogs；Agrawal，S.，Ed.；Humana：Totowa，1993；vol 20，p 63-80)。

[0286] 在一些实施方式中，核苷单体包含连接于核苷的3′位置的非手性的H-膦酸酯部分。在另外的实施方式中，核苷单体包含通过中间连接部分连接于核苷部分的3′位置的非手性的H-膦酸酯部分。在特定的实施方式中，中间连接部分为亚甲基(参见例如，
WO/2001/02415)。在一些实施方式中，H-膦酸酯部分连接于核苷单体的2′位置。在另外的实施方式中，核苷单体包含连接于核苷的5′位置的非手性H-膦酸酯部分。

[0287] 具有游离亲核部分的化合物。

[0288] 包含游离的亲核部分的化合物为式4-1的化合物，并且在手性中间体的磷中心发生反应。亲核基团或部分对磷的进攻方向取决于在手性中间体(缩合的中间体)上的手性助剂的取代。在一个实施方式中，活化试剂的加入可有助于含有游离的亲核部分的化合物在手性中间体的磷中心发生反应。

[0289]

[0290] 在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为使用本文中所述方法事先制备的核酸，或者其使用其他已知的核酸合成方法制备。在一个实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物包含单个的核苷单体。在另一实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物包含超过一个核苷单元。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为链延长步骤的产物。在其他实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为寡聚体。在另外的实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为多聚体。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物含有羟基作为游离的亲核部分。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物包含氨基作为游离的亲核部分。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物包含巯基作为游离的亲核部分。

[0291] 在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物在核苷糖的任何位置包含亲核部分。在一些实施方式中，亲核部分位于糖的5′位置。在一些实施方式中，亲核部分位于糖的4′位置。在另外的实施方式中，亲核部分位于糖的3′位置。在另外的实施方式中，亲核部分位于糖的2′位置。

[0292] 在一些实施方式中，式4-1的化合物为包含5′-OH部分的核苷以及为式4的化合物：

[0293]2 d d 1

[0294] 在式4中，各个R 独立地为氢、-NRR、-N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯1 1 1 1 b c b
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。
1 d

[0295] Y 为O、NR、S或Se。c

[0296] R 为封闭基团。d

[0297] 各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸e e酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。
e 2 2 2

[0298] 各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳2 2
基-Y-或杂芳基-Y-。
2 d

[0299] Y 为O、NR 或S。

[0300] 各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。

[0301] m为0至n-1的整数。

[0302] n为1至大约200的整数。

[0303] OA连接至三苯甲基部分、甲硅烷基部分、乙酰基部分、酰基部分、芳香酰基部分、与固体载体连接的连接部分或者与核酸连接的连接部分。

[0304] J为O并且D为H，或者J为S、Se或BH3并且D为手性配体Ci或式A的部分：

[0305]

[0306] 其中W1和W2独立地为NHG5、OH或SH。

[0307] A为氢、酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分。

[0308] G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂芳基或芳基，1 2 3 4 5 6
或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约
1 2
20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、
3 4 5 6
G、G 和G 中不超过四个为G。

[0309] 在另外的实施方式中，其中J为S、Se或BH3并且D为式A-I的部分：

[0310]

[0311] 其中U1、U3、U2、r、G1、G2、G3、G4、W1、W2、A在本文中如式3-I所定义。在式A-I的实施方式中，A为氢。

[0312] 在一些实施方式中，式4的包含5′-OH部分的核苷是来自之前如本文所描述的链延长循环的中间体。在其他实施方式中，式4的化合物为来自另外的已知核酸合成方法的中间体。在一些实施方式中，式4的化合物连接于固体载体。在另外的实施方式中，式4的化合物不连接于固体载体并且游离存在于溶剂或溶液中。

[0313] 在实施方式中，m为0，式4的化合物为单个核苷单元并且被认为是核酸的第一个核苷。在一些实施方式中，m为0，式4的化合物为通过3′-氧连接于另一个核酸的核苷单元。在另外的实施方式中，m大于0，式4的化合物为包含5′-OH部分的多聚或寡聚核
酸。在另外的实施方式中，m大于0，式4的化合物为之前链延长循环的终产物。在一些实施方式中，当m大于0时，式4的化合物为核苷，其进一步通过在核苷的3′位置或另外的位置的链接连接至核苷酸上。

[0314] 当式4的化合物连接至另一个核苷酸或核酸时，膦酸酯核苷间骨架链接包括但不局限于2′至5′磷原子桥联、3′至5′磷原子桥联、5′至3′磷原子桥联和3′至2′磷原子桥联和4′至2′磷原子桥联。膦酸酯核苷间骨架链接包括其他类型的磷原子桥联，包括但不局限于亚甲基二膦酸酯桥联。

[0315] 式1的核酸包含相同的或不同的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包含全部均相同的核碱基。在另外的实施方式中，式1的核酸包含不同的核碱基。在另外的实施方式中，式1的核酸包含天然存在的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包含修饰的核碱基。在其他实施方式中，核酸包含模拟在自然界中发现的核酸的核碱基序列的核碱基。在一些实施方式中，式1的核酸包含天然存在的核碱基和修饰的核碱基的混合物。

[0316] 包含游离的亲核部分的化合物在溶液中为游离的。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物不连接至固体载体。这使核酸可在溶液中合成(液体相合成或溶液相合成)。或者，包含游离的亲核部分的化合物预先连接至诸如固体载体的另外的部分。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物是以核苷的3′羟基连接至固相载体的核苷。核酸与固体载体的连接允许使用固相合成进行合成。在核酸合成中，连接至固体载体的化合物在一个或重复的链延长循环中用不同的试剂处理，以与单个核酸单元逐步获得生长的核酸链的延长。通常不进行纯化步骤，直到合成完整装配的核酸序列之后。不同类型的固体载体材料是已知的，并且用于核酸、蛋白质和寡糖的合成。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物通过连接部分连接至固体载体。在另外的实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物不通过连接部分连接至固体载体。

[0317] 包含游离的亲核部分的化合物包含糖、取代的糖或修饰的糖。在一些实施方式中，糖为核糖糖。在一些实施方式中，糖为脱氧核糖糖。在一些实施方式中，含有游离的亲核部分的化合物包含核酸糖和脱氧核糖糖的混合物。在另外的实施方式中，糖为呋喃戊糖、吡喃戊糖、吡喃己糖部分或其混合物。在另外的实施方式中，糖包含闭合的环，开放结构或其混合物。

[0318] 包含未保护的-OH部分的核苷反应物可在糖核心的任何位置含有未保护的-OH基团。在一个实施方式中，非手性的H-膦酸酯部分与包含5′-OH部分的核苷缩合形成缩合
的中间体。在另一实施方式中，非手性的H-膦酸酯部分与包含4′-OH部分的核苷缩合形
成缩合的中间体。在另一实施方式中，非手性的H-膦酸酯部分与包含3′-OH部分的核苷
缩合形成缩合的中间体。在再另一实施方式中，非手性的H-膦酸酯部分与包含2′-OH部
分的核苷缩合形成缩合的中间体。

[0319] 在一些实施方式中，酸化缩合的中间体产生式4的化合物，其中m至少为1。在另外的实施方式中，缩合的中间体包含式A’的部分，其与式A的部分等同，其中A为氢并且其1 2 3 4 5
中G 和G 独立地为烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂芳基或芳基并且G、G 和G 独立
1 2 3 4 5
地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和G 中
6
的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或
1 2 3 4 5
含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、G、G 和G 中不超过
6
四个为G。

[0320] 合成方法的详细讨论。

[0321] 核酸链的扩增可以3′至5′的方向进行。在一个实施方式中，核酸可从5′-端游离的羟基以重复循环的化学反应合成。或者，核酸链的扩增可以5′至3′的方向进行。
在一个实施方式中，核酸可从3′-端游离的羟基以重复循环的化学反应合成。

[0322] 核酸的合成方法的一个实施方式显示于路线5中(途径A)。可以理解的，本文所述的方法不局限于所示的路线，其事件的序列或其中间体。在一个实施方式中，描述于路线
5中，式2的非手性H-膦酸酯用缩合试剂处理以形成结构II的中间体。在一个实施方式
中，活化试剂在缩合步骤中加入反应混合物中。活化试剂的使用取决于反应条件，诸如用于反应中的溶剂。不分离结构II的中间体并且与手性试剂在同一锅中处理以形成结构III的手性中间体。不分离结构III的中间体并且与结构IV的核苷或修饰的核苷在同一锅中进行反应以提供结构V的手性亚磷酸盐化合物。在一些实施方式中，提取结构V至溶剂中以从副产物、杂质和/或试剂中分离其。在另外的实施方式中，当方法是经由固相合成进行时，包含结构V的化合物的固体载体经过滤不含副产物、杂质和/或试剂。如果最终的核酸比二
聚体大，在结构V的化合物中的手性助剂用封闭基团加帽来提供结构VI的化合物。如果最终的核酸为二聚体，则加帽步骤不是必要的。结构VI的化合物与亲电试剂反应而修饰，以提供结构VII的化合物。脱去修饰的和加帽的结构VII的缩合中间体的封闭，以在增长的
核酸链的5′-端除去封闭基团以提供结构IV的化合物。结构IV的化合物可选地允许重
新进入链延长循环，以形成缩合的中间体、加帽的缩合中间体、修饰的加帽的缩合中间体以及5′脱保护的修饰的加帽中间体。在至少一轮链延长循环以后，5′-脱保护的修饰的加帽中间体通过除去手性助剂配体和其他保护基团(例如，核碱基、修饰的核碱基、糖和修饰的糖保护基团)而进一步脱去封闭以提供式1的核酸。在另外的实施方式中，包含5′-OH
部分的核苷为如上所述的上一链延长循环的中间体。在其他实施方式中，包含5′-OH部
分的核苷为从另一个已知的核酸合成方法获得的中间体。在与第一个核苷的一个合成循环后，核苷、核苷酸或含有未保护的-OH部分的核酸可用于接下去的延长循环。在使用固体载体的实施方式中，磷原子修饰的核酸继而从固体载体上切割。在一些实施方式中，核酸由于纯化目的而仍旧连接于固体载体并且在纯化后从固体载体上切割。在一个实施方式中，当
1 2
式A的手性助剂配体的G 和G 位置为氢时，描述于路线5(路径A)的合成是有用的。在其
他实施方式中，结构III-VII的化合物包含式A-I的部分而不是式A的部分。

[0323] 路线5.经由途径A合成式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸。

[0324]

[0325] 在另一些实施方式中，如路线6(途径B)所述，用缩合试剂处理式2的非手性H-膦酸酯以形成结构II的中间体。在一个实施方式中，活化试剂在缩合步骤中加入反应混合物中。活化试剂的使用取决于反应条件，诸如用于反应中的溶剂。不分离结构II的中间体并且与手性试剂在同一锅中处理以形成结构III的手性中间体。不分离结构III的中间体并且与结构IX的核苷或修饰的核苷在同一锅中进行反应以提供结构X的手性亚磷酸盐化合
物。在一些实施方式中，提取结构X至溶剂中以从副产物、杂质和/或试剂中分离。在另
外的实施方式中，当方法是经由固相合成进行时，包含结构X的化合物的固体载体经过滤不含副产物、杂质和/或试剂。结构X的化合物用酸处理以在增长的核酸链(结构XI)的
5′-端除去封闭基团。酸化步骤也除去手性助剂配体以提供结构IX的化合物。5′-脱封
闭的中间体可选地允许重新进入链延长循环以形成含有封闭的5′-端的缩合的中间体，
其继而酸化以除去5′-端封闭基团和手性助剂配体。在至少一轮链延长循环后，5′-脱
保护的中间体进行酸化步骤以引入与各个磷原子键合的部分X以提供结构XII的化合物。
通过除去剩余的保护基团(例如，核碱基、修饰的核碱基、糖或其保护基团被去除的修饰的糖)来脱去修饰的中间体的封闭，从而提供式1的核酸。在另外的实施方式中，包含5′-OH部分的核苷为来自如上所述的前一链延长循环的中间体。在其他实施方式中，包含5′-OH部分的核苷为从另一个已知的核酸合成方法获得的中间体。在与第一个核苷的一个合成循环后，核苷、核苷酸或含有未保护的-OH部分的核酸可用于接下去的延长循环。在使用固体载体的实施方式中，磷原子修饰的核酸继而从固体载体上切割。在一些实施方式中，核酸由于纯化目的而仍旧连接于固体载体并且在纯化后从固体载体上切割。在一个实施方式中，
1 2
当式A的手性助剂配体的G 和G 位置为氢时，描述于路线6(路径B)的合成是有用的。在
一些实施方式中，结构III、X和XI的化合物包含式A-I的部分替代式A的部分。

[0326] 路线6.经由途径B合成式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸。

[0327]

[0328] 反向5′至3′核酸合成。

[0329] 式1的包含手性X-膦酸酯部分的磷酸可选择地从5′至3′的方向合成。在应用固体载体的实施方式中，核酸通过增长的核酸的5′端连接至固体载体，因此使其3′基团用于反应，包括酶反应(例如，连接和聚合)。在一些实施方式中，通过制备在5′位置包含非手性的H-膦酸酯部分并且在3′位置以羟基保护的核苷单体来工程化定向。在一个实施
4 b
方式中，核酸根据路线7合成。在路线7中，-R 为如前定义的-OR，或在合成的最后一个循
4 1
环中为R，其与本文中定义的R 等同。

[0330] 路线7.式1的含有手性X-膦酸酯部分的核酸的5′至3′合成。

[0331]

[0332] 在路线7所描述的实施方式中，用缩合试剂处理结构Ir的非手性H-膦酸酯以形成结构IIr的中间体。不分离结构IIr的中间体并且与手性试剂在同一锅中处理以形成结
构IIIr的手性中间体。在一个实施方式中，在缩合步骤中使用活化试剂。活化试剂的使用取决于反应条件，诸如用于反应中的溶剂。不分离结构IIIr的中间体并且与结构XIII的
核苷或修饰的核苷在同一锅中进行反应以提供结构XIV的手性亚磷酸盐化合物。在一些实施方式中，提取结构XIV至溶剂中以从副产物、杂质和/或试剂中分离。在另外的实施方式中，当方法是经由固相合成进行时，包含结构XIV的化合物的固体载体经过滤不含副产物、杂质和/或试剂。结构XIV的化合物用酸处理以在增长的核酸链(结构XV)的3′-端除
去封闭基团。酸化步骤也除去手性助剂配体以提供结构XIII的化合物。3′-脱封闭的中
间体可选地允许重新进入链延长循环以形成含有封闭的3′-端的缩合的中间体，其继而
酸化以除去3′-端封基团和手性助剂配体。在至少一轮链延长循环后，3′-脱保护的中
间体进行酸化步骤以引入与各个磷原子键合的X部分以提供结构XVI的化合物。通过除去
剩余的保护基团(例如，核碱基、修饰的核碱基、糖或其保护基团被去除的修饰的糖)来脱去修饰的中间体的封闭，从而提供式1的核酸。在另外的实施方式中，包含3′-OH部分的核苷为如本文所述的前一链延长循环的中间体。在其他实施方式中，包含3′-OH部分的核苷为从另一个已知的核酸合成方法获得的中间体。在与第一个核苷的一个合成循环后，核苷、核苷酸或含有未保护的-OH部分的核酸可用于接下去的延长循环。在使用固体载体的实施方式中，磷原子修饰的核酸继而在5’端从固体载体中上切割。在一些实施方式中，核酸由于纯化目的而可选地仍旧连接于固体载体并且在纯化后从固体载体上切割。在一个方面，当式A的手性助剂配体的G1和G2位置不是氢时，描述于路线7的合成是有用的。反相
5′至3′的合成可使用路线7中的起始材料，通过类似于途径A中步骤的机理完成。在一
些实施方式中，结构IIIr、XIV和XV的化合物包含式A-I的部分替代式A的部分。

[0333] 链延长循环。

[0334] 磷原子修饰的核酸的立体选择性合成包含链延长循环。链延长循环开始于待加入核酸的下一单元化合物(例如，包含非手性的H-膦酸酯部分的分子)与包含游离的亲核部分(例如，羟基部分)的另一个化合物之间的缩合反应。在一些实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为单体核苷。在另外的实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为来自本文所述的前一链延长循环的核酸寡聚体或多聚体。在另外的实施方式中，包含游离的亲核部分的化合物为来自使用本领域已知的其他方法进行的链延长循环的核酸寡聚体或多
聚体。

[0335] 链延长循环的循环数目由被合成的核酸的长度决定。在一些实施方式中，链延长循环发生一次。在另外的实施方式中，链延长循环重复超过一次以与单个核苷酸单元逐步获得生长的寡核酸链的延长。

[0336] 在一个实施方式中，如果核酸为二聚体，则需要一轮链延长循环。在另一些实施方式中，如果核酸包含十个核苷单元，则需要9轮链延长循环。在另一些实施方式中，如果20个另外的核苷单元需要加入至预先合成的核酸链，则需要20轮链延长循环。对本领域技术人员明显的是，链延长循环的数目可根据核酸的目标长度调节。通过本文方法合成的核酸不局限于如在本文所述的链延长循环的数目。

[0337] 经由途径A获得的缩合的中间体的修饰以引入X-膦酸酯部分。

[0338] 路线8.经由途径A获得的缩合的中间体的修饰

[0339]1 d d 1

[0340] 在式5的化合物中，R 为-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯1 1 1 1 e e a c
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)、-OR 或-SR。
1 d a

[0341] Y 为O、NR、S或Se；R 为封闭部分。c

[0342] R 为封闭基团。d

[0343] 各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸e e酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)。
e 2 2 2

[0344] 各个R 独立地为烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳2 2
基-Y-或杂芳基-Y-。
2 d

[0345] Y 为O、NR 或S。2 d d 1 1

[0346] 各个R 独立地为氢、-NRR、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔1 1 1 b c b
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-OR 或-SR，其中R 为封闭部分。

[0347] 各个Ba独立地为封闭或未封闭的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或修饰的核碱基。

[0348] 各个J为S、Se或BH3；v为1至n-1的整数。

[0349] OA连接于与固体载体连接的连接部分或与核酸连接的连接部分。

[0350] A为酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分；并且G1、G2、G3、G4和G5独立地为氢、1 2 3 4 5
烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和G 中的两个为
6
G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原
1 2 3 4 5
子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且其中G、G、G、G 和G 中的不超过四个为
6
G。

[0351] 在一些实施方式中，式5的化合物包含连接于磷原子的式A-I的部分。在另外的实施方式中，式5的化合物包含连接于磷原子的式A的部分。在途径A所显示的方法中，加入新的核苷多产生的缩合的中间体被加帽以产生式V的化合物，并且然后在磷上修饰以引入J(其为S、Se或BH3)，从而产生式5的化合物，其中v为1至n-1的整数。式5的化合物
被处理以切割加帽的手性助剂并且脱去剩余的封闭基团的封闭，或者其用于链延长和磷修饰的进一步的循环。在最终的核酸为二聚体的情况下，加帽不是必须的。在结构V的一个实施方式中，A为氢、酰基、芳基、烷基、芳烷基或甲硅烷基部分。在路线9的一个实施方式中，加入新的核苷所产生的缩合的中间体不被加帽以产生结构V的化合物，其中v为0。该结构V(其中v为0)继而在磷原子上修饰以引入J(其为S、Se或BH3)，从而产生式5的化
合物，其中v为0的整数。

[0352] 在一些实施方式中，修饰试剂为硫亲电子试剂、硒亲电子试剂或硼化试剂。

[0353] 在一些实施方式中，硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：

[0354] S8(式B)、Z24-S-S-Z25或Z24-S-X-Z25，

[0355] 其中Z24和Z25独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳24 25
基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z 和Z 一起形f f
成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR ；并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。在另外的实施方式中，硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：

[0356]

[0357] 在另外的实施方式中，硫亲电子试剂为式F、式E或式B。

[0358] 在一些实施方式中，硒亲电子试剂为具有下式之一的化合物：

[0359] Se(式G)、Z26-Se-Se-Z27或Z26-Se-X-Z27，

[0360] 其中Z26和Z27独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或Z26和Z27一起形成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NRf；并且Rf为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0361] 在另外的实施方式中，硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物。

[0362]

[0363] 在一些实施方式中，硒亲电子试剂为式G或式L。

[0364] 在一些实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)、苯胺-氰基硼烷、三苯基磷化氢-碳化烷氧硼烷。

[0365] 在另外的实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。

[0366] 在另外的实施方式中，在修饰经由途径A获得的缩合的中间体后，式5的化合物在1
R 位置脱去封闭以生成式4的化合物，其中m至少为1，J为S、Se或BH3，并且D为式A的部
1
分。在一些实施方式中，在脱去R 的封闭之后，生成式4的化合物，其中D为式A-I的部分。
式4的化合物与结构III的核苷反应以产生缩合的中间体。转化缩合的中间体的步骤包括
将缩合的中间体加帽并且修饰加帽的缩合中间体以产生式5的化合物。在式5的化合物的
1
一些实施方式中，v超过2并且少于约200。可选地重复在R 位置脱去封闭、与结构III的
核苷反应、加帽和修饰以形成式5的化合物，其中v以1个整数增加。在式5的化合物的一
些实施方式中，v大于3并且少于约200。

[0367] 在另外的实施方式中，式5的化合物被转化为式1的化合物，其中在一些实施方式中，各个Ba部分为未封闭的。在另外的实施方式中，式5的化合物被转化为式1的化合物，其中不是所有的Ba部分为未封闭的。1 d d 1 1

[0368] R 为-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔1 1 1 e e a c 1 d
基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-OR 或-SR ；其中Y 或O、NR、S或a c 1
Se，R 为封闭部分，并且R 为封闭基团。在一些实施方式中，R 为脱去封闭的。在其他实施
1
方式中，R 仍旧为封闭的。
d

[0369] 各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)e e e 2 2(R)2或-HP(O)(R)，并且各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、
2 2 2 +1 +1 +1 2 d
炔基-Y-、芳基-Y-或杂芳基-Y-、或者为Na 、Li 或K 的阳离子，其中Y 为O、NR 或S。
2 d d 1

[0370] 各个R 独立地为氢、-OH、-SH、-NRR、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯1 1 1 1
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-。
3 3

[0371] 在一些实施方式中，R 为H。在另外的实施方式中，R 为封闭基团或连接至固体载- + - +体、核苷、核苷酸或核酸的连接部分。在一些实施方式中，各个X独立地为-SZ、-SeZ 或- + +
BH3Z ；并且Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一个可+
为伯、仲、叔或季，或Z 为单价金属离子。

[0372] 经由途径B获得的式4的化合物的修饰以引入X-膦酸酯部分。

[0373] 用于修饰经由途径B获得的式4的化合物的方法示意于反应路线9a和9b中。膦酸酯和亚膦酸酯已知进行互变异构化并且存在平衡。亚膦酸酯互变异构体不如膦酸酯互变异构体稳定。基于非常强的P＝O键，平衡在中性条件下倾向膦酸酯互变异构体。在酸性
条件下，膦酸酯的磷酰基基团成为可逆质子化的。中间体中P-H键的断裂缓慢地发生以形成亚膦酸酯中间体。结构IX继而被修饰以形成结构XII，使用显示于反应图9a和9b的试
剂。

[0374] 反应路线9a.通过使用在磷上的起始卤化反应，经由途径B合成的中间体上的磷的修饰。

[0375]

[0376] 反应路线9b.通过使用起始的硅烷化反应，经由途径B合成的中间体上的磷的修饰。

[0377]

[0378] 在一些实施方式中，修饰步骤通过将结构IX与卤化剂反应，其后与亲核试剂反应而进行(路线9a)。在特定的实施方式中，卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、Br2、I2、磺酰氯(SO2Cl2)、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、一氯化硫、二氯化硫、氯胺、CuCl2、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)或N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)。在其他特定的实施方式中，卤化剂为CCl4、CBr4、Cl2、磺酰氯(SO2Cl2)或N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)。在一些实施方式中，亲核试剂为一级或二级胺、醇或巯基。在另外的实施方式中，亲核试剂为NRfRfH、RfOH或RfSH，其中Rf为氢、烷基、烯基、炔基或芳基，并且至少一个NRfRfH的Rf不是氢。

[0379] 修饰步骤也可以通过将结构IX与硅烷化试剂反应，其后与硫亲电子试剂、硒亲电子试剂、硼化试剂、烷化剂、醛或酰化剂反应而进行(路线9b)。

[0380] 在特定的实施方式中，硅烷化试剂为三甲基氯甲硅烷(TMS-Cl)、三异丙基氯甲硅烷(TIPS-Cl)、叔丁基二甲基氯甲硅烷(TBDMS-Cl)、叔丁基二苯基氯甲硅烷(TBDPS-Cl)、1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(HMDS)、N-三甲基甲硅烷基二甲胺(TMSDMA)、N-三甲基甲硅烷基二乙胺(TMSDEA)、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺(TMSA)，N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙
酰胺(BSA)或N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。

[0381] 在其他特定的实施方式中，硫亲电子试剂为具有下式之一的化合物：

[0382] S8(式B)、Z24-S-S-Z25或Z24-S-X-Z25，

[0383] 其中Z24和Z25独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或者Z24和Z25一起形成3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NRf；并且Rf为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。在另外的实施方式中，硫亲电子试剂为式B、C、D、E或F的化合物：

[0384]

[0385] 在另外的实施方式中，硫亲电子试剂为式F、式E或式B。

[0386] 在一些实施方式中，硒亲电子试剂为具有下式之一的化合物：

[0387] Se(式G)、Z26-Se-Se-Z27或Z26-Se-X-Z27

[0388] 其中Z26和Z27独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳26 27
基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰基、酰胺、酰亚胺或硫代羰基，或Z 和Z 一起形成f f
3至8元脂环或杂环，其可为取代或未取代的；X为SO2、O或NR ；并且R 为氢、烷基、烯基、炔基或芳基。

[0389] 在另外的实施方式中，硒亲电子试剂为式G、H、I、J、K或L的化合物。

[0390]

[0391] 在一些实施方式中，硒亲电子试剂为式G或式I。

[0392] 在一些实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-苯胺(BH3·An)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)、苯胺-氰基硼烷、三苯基磷化氢-碳化烷氧硼烷。在另外的实施方式中，硼化试剂为硼烷-N，N-二异丙基乙胺(BH3·DIPEA)、硼烷-2-氯吡啶(BH3·CPy)、硼烷-四氢呋喃(BH3·THF)或硼烷-二甲硫醚(BH3·Me2S)。

[0393] 在另外的实施方式中，烷化试剂为卤代烷、卤代烯、卤代炔、烷基磺酸酯、烯基磺酸酯或炔基磺酸酯。

[0394] 在另外的实施方式中，醛为对位甲醛、烷基醛、烯基醛、炔基醛或芳香醛。

[0395] 在其他实施方式中，酰化剂为式M或N的化合物：

[0396]7

[0397] 其中G 为烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳杂氧基；并且M为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。

[0398] 在另外的实施方式中，式4的化合物(其中m至少为一，J为O，并且D为H)在酸化后，与结构III的核苷反应以形成缩合的中间体，其通过酸化转化而产生式4的化合物，其中m至少为2并且少于约200；J为O并且D为H。在另外的实施方式中，式4的化合物
可选择地进一步与结构式III的核苷反应以形成缩合的中间体，然后进行酸化。重复与结构式III的核苷反应和酸化，直到在生长的链中获得理想数目的单元。在一些实施方式中，形成式4的化合物，其中m为以1个整数增长。在一些实施方式中，形成式4的化合物，其
中m为超过2和少于约200。在一些实施方式中，缩合的中间体包含式A-I的部分代替式A
的部分。

[0399] 在另外的实施方式中，式4的化合物被修饰以引入X部分，因此产生式1的化合3
物。在式1的化合物的实施方式中，R 为封闭基团或连接于固体载体的连接部分。在另外的
1 1
实施方式中，R 为脱去封闭的。在其他实施方式中，处理式1的化合物以使R 为保持封闭的。
1 d d
在另外的实施方式中，处理式1的化合物使R 为-OH、-SH、-NRR、-N3、卤素、氢、烷基、烯基、
1 1 1 1 1 e e a
炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-、-P(O)(R)2、-HP(O)(R)、-ORc 1 d a c d
或-SR ；其中Y 为O、NR、S或Se，R 为封闭部分，而且R 为封闭基团，各个R 独立地为氢、e e
烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、取代的甲硅烷基、氨基甲酸酯、-P(O)(R)2或-HP(O)(R)，并且e 2 2 2 2
各个R 独立地为氢、烷基、芳基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-或杂
2 +1 +1 +1 2 d
芳基-Y-，或者为Na 、Li 或K 的阳离子为，其中Y 为O、NR 或S。

[0400] 各个R2独立地为氢、-OH、-SH、-NRdRd、N3、卤素、烷基、烯基、炔基、烷基-Y1-、烯1 1 1 1 2
基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂芳基-Y-。在一些实施方式中，R 为脱去封闭的。在其他
2
实施方式中，R 为保持封闭的。

[0401] 在一些实施方式中，各个Ba部分为未封闭的。在另外的实施方式中，不是所有的3 3
Ba部分为未封闭的。在另外的实施方式中，R 为H。在一些实施方式中，R 为封闭基团或连接至固体载体、核苷、核苷酸或核酸的连接部分。在一些实施方式中，各个X独立地为烷基、烷f f - + - + - +
氧基、芳基、烷硫基、酰基、-NRR、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔硫基、-SZ，-SeZ 或-BH3Z ；
f +
各个R 独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基；Z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳香族亚胺离子+
或杂环亚胺离子，其中任何一个可为伯、仲、叔或季，或者Z 为单价金属离子。

[0402] 用于本发明的方法中的反应条件和试剂

[0403] 条件

[0404] 可发生将含有非手性的H-膦酸酯部分的分子与含有5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体的步骤，而不需要分离任何的中间体。在一些实施方式中，将含有非手性的H-膦酸酯部分的分子与含有5′-OH部分的核苷反应以形成缩合的中间体的步骤可以
一锅反应发生。在实施方式中，包含非手性的H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂、手性试剂和包含游离的亲核部分的化合物在不同的时间加入反应混合物中。在另一些实施方式中，包含非手性的H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂和手性试剂存在于同一反应器皿或同一锅中。
在另一些实施方式中，包含非手性的H-膦酸酯部分的分子、缩合试剂、手性试剂和包含游离的亲核部分的化合物存在于同一反应或同一锅中。这允许反应进行而不需要分离中间体并且减少消耗时间的步骤，产生经济和有效的合成。在特定的实施方式中，非手性的H-膦酸酯、缩合试剂、手性氨基醇、5′-OH核苷同一时间存在于反应中。在另外的实施方式中，用于缩合的手性中间体的形成在原位形成并且不在缩合反应之前分离。在另一些实施方式中，包含非手性的H-膦酸酯部分的分子通过与缩合试剂、手性试剂在不同于手性中间体与含有游离的5′-OH部分的化合物反应的反应器皿中反应而被活化。在一个实施方式中，活化试剂在缩合步骤中加入。在一个实施方式中，活化试剂在非手性H-膦酸酯部分、缩合试剂和手性试剂已经混合在一起后加入。在另一些实施方式中，活化试剂与非手性H-膦酸酯部分、缩合试剂和手性试剂共同加入。取决于反应条件，活化试剂可在合成中有作用，例如在缩合步骤中。例如，如果吡啶用作活化前或缩合步骤中的碱，诸如CMPT的活化试剂不需要出现，因为吡啶可用作亲核催化剂(也就是，活化剂)。如果在缩合步骤中使用另外的碱，诸如N-氰基甲基吡咯烷(CMP)，其不如吡啶一样亲核性的，则诸如CMPT的活化试剂可作为活化试剂加入。

[0405] 固体载体的合成

[0406] 在一些实施方式中，核酸的合成在溶液中进行。在另外的实施方式中，核酸的合成在固相中进行。固体载体的反应基团可为未保护的或保护的。在寡核苷酸合成中，用不同的试剂在几个合成循环中处理固体载体，以与单个核苷酸单元逐步获得生长的寡核酸链的延长。如在本文所用，直接连接于固体载体的链末端的核苷单元称为″第一个核苷″。第一个核苷通过连接体(linker)部分连接在固体载体上，连接体即以共价键连接固体载体的多聚体和核苷的双自由基。连接体在为构建寡核苷酸链而进行的合成循环中为完整的，并且在链装配后切割，以从载体上释放寡核苷酸解。

[0407] 用于固相核酸合成的固体载体包括描述于，例如，US专利4,659,774、5,141,813、4,458,066；Caruthers 美国专利 No.4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、
4,973,679和5,132,418；Andrus等人，美国专利No.5,047,524、5,262,530；以及Koster美国专利No.4,725,677(作为Re34,069重新颁布)中的支持物。在一些实施方式中，固相为
有机多聚体支持物。在另外的实施方式中，固相为无机多聚体支持物。在一些实施方式中，有机多聚体支持物为聚苯乙烯、氨甲基聚苯乙烯、聚乙烯乙二醇-聚苯乙烯接枝共聚体、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、高度交联多聚体(HCP)或其他合成多聚体、碳水化合物(诸如纤维素和淀粉或其他多聚碳水化合物)、或其他有机多聚体和任何共聚体、复合材料或以上无机或有机材料的组合。在另外的实施方式中，无机多聚体支持物为二氧化硅、氧化铝、可控多聚玻璃(CPG)，其为硅胶支持物或氨丙基CPG。其他有用的固体载体包括氟化固体载体(参见例如，WO/2005/070859)、长链烷基胺(LCAA)可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)固体载体(参见例如，S.P.Adams，K.S.Kavka，E.J.Wykes，S.B.Holder和 G.R.Galluppi，J.Am.Chem.Soc.，1983，105，661-663；G.R.Gough，M.J.Bruden 和P.T.Gilham，Tetrahedron Lett.，1981，22，4177-4180)。膜支持物和多聚体膜(参见例如，Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis，Peptides，Proteins and Nucleic Acids，ch 21pp 157-162，1994，Ed.Roger Epton和美国专利No.4,923,901)有利于核酸合成。一旦形成，膜可被化学官能团化以用于核酸合成中。除了以官能团连接于膜上，连接于膜上的连接体或间隔基团可被用于减少膜和合成的链之间的位阻。

[0408] 其他的适合的固体载体包括那些在本领域普遍已知的适合用于固相方法学的，包括例如，作为PrimerTM 200支持物销售的玻璃、可控孔度玻璃(CPG)、乙二酰-可控孔度玻璃(参见例如，Alul，等人，Nucleic Acids Research，1991，19，1527)、TentaGel支持物-氨基聚乙烯甘油衍生的支持物(参见例如，Wright，等人，Tetrahedron Lett.，1993，34，3373)和Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚体。

[0409] 表面活化的共聚体已经被证明可用于在几种固体载体介质上合成天然的和修饰的核酸和蛋白质。固体载体材料可为在多孔性上具有合适均一性的任何多聚体，具有足够的胺含量和足够柔韧以进行任何伴随的操作而不失去完整性。适合的可选的材料的例子包括尼龙、聚丙烯、聚脂、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和硝基纤维素。其他材料也可用作固体载体，取决于研究人员的设计。考虑到一些设计，例如，涂层金属，尤其是金和铂可被选择(参见例如，美国公布No.20010055761)。在寡核苷酸合成的一些实施方式中，例如，核苷锚在由羟基或氨基残基官能化的固体载体上。或者，将固体载体衍生化以提供酸性不稳定的三烷氧基三苯甲基基团，诸如三甲氧基三苯甲基(TMT)。不受理论的限制，可预计的是三烷氧基三苯甲基保护基团的存在可以允许在DNA合成器的通用条件下起始的去三苯甲基
化。为了溶液中寡核苷酸材料与氨水的较快的释放，可选地在支持物上引入二甘醇酸酯连接体。

[0410] 连接部分

[0411] 连接部分或连接体可选地用于连接固体载体与包含游离的亲核部分的化合物。适合的连接体为已知的，诸如短的分子，用于在固相合成技术中连接固体载体至起始核苷分子的官能团(例如，羟基)。在一些实施方式中，连接部分为琥珀酰胺酸连接体、丁二酸酯连接体(-CO-CH2-CH2-CO-)或乙二酰连接体(-CO-CO-)。在另外的实施方式中，连接部分和核苷通过酯键键合。在另外的实施方式中，连接部分和核苷通过酰胺键键合。在另外
的实施方式中，连接部分将核苷和另外的核苷或核酸连接。适合的连接体公开于，例如，Oligonuleotides and Analogues A Practical Approach，Ekstein，F.Ed.，IRL Press，N.Y.，1991，第1章。

[0412] 连接部分用于将含有游离的亲核试剂部分的化合物与另外的核苷、核苷酸或核酸连接。在一些实施方式中，连接部分为磷酸二酯链接。在另外的实施方式中，连接部分为H-膦酸酯部分。在其他实施方式中，连接部分为X-膦酸酯部分。

[0413] 用于合成的溶剂

[0414] 核酸的合成在质子惰性的有机溶剂中进行。在一些实施方式中，溶剂为乙腈、吡啶、四氢呋喃或二氯甲烷。在一些实施方式中，当质子惰性有机溶剂不为碱性时，在反应步骤中存在碱。在一些实施方式中，当存在碱时，碱为吡啶、喹啉或N，N-二甲基苯胺或N-氰基甲基吡咯烷。碱的其他例子包括吡咯烷、哌啶、N-甲基吡咯烷、吡啶、喹啉、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基苯胺或N-氰基甲基吡咯烷。在该方法的一些实施方式中，碱为[0415]

[0416] 其中Z22和Z23独立地为烷基、氨基烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、22 23
芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中任意的Z 和Z 一起形成3至10元脂环或杂环。在该方法的一些实施方式中，碱为N-氰基甲基吡咯烷。在一些实施方式中，质子惰性有机溶剂为无水的。在另外的实施方式中，无水的质子惰性有机溶剂为新鲜蒸馏的。
在一些实施方式中，新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为吡啶。在另外的实施方式中，新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为四氢呋喃。在另外的实施方式中，新鲜蒸馏的无水质子惰性有机溶剂为乙腈。溶剂可为2种或多种溶剂的组合。根据合成中使用的溶剂，加入活化试剂为有益的。

[0417] 除去封闭基团的酸化条件。

[0418] 通过勃朗斯特酸或路易斯酸完成酸化以除去封闭基团。在一些实施方式中，酸化1
用于除去R 的封闭基团。有用的勃朗斯特酸为羧酸、烷基磺酸、芳基磺酸、磷酸及其衍生物、膦酸及其衍生物、烷基膦酸及其衍生物、芳基膦酸及其衍生物、次膦酸、二烷基次膦酸以及二芳基次膦酸，其在有机溶剂或水中(在80％乙酸的情况下)具有值在-0.6(三氟乙酸)
和4.76(乙酸)之间的pKa(25℃，在水中)。用于酸化步骤的酸的浓度(1至80％)取决于
酸的酸性。酸强度必须考虑在内，因为强酸条件会引起去嘌呤化/去嘧啶化，其中嘌呤基或嘧啶基碱从核糖环上被切割。

[0419]

[0420] 在一些实施方式中，酸化通过路易斯酸在有机溶剂中进行。有用的路易斯酸为ZnX2，其中X为Cl、Br、I或CF3SO3。

[0421] 在一些实施方式中，酸化包括加入一定量的勃朗斯特或路易斯酸，该量有效地将缩合的中间体转化为式4的化合物，而不从缩合的中间体上除去嘌呤部分。

[0422] 在酸化步骤有用的酸也包括但不局限于有机溶剂中10％磷酸、有机溶剂中10％氢氯酸、有机溶剂中1％三氟乙酸、有机溶剂中3％二氯乙酸或水中80％乙酸。选择用于该方法中的任何勃朗斯特或路易斯酸的浓度以使酸的浓度不超过引起核碱基从糖部分切割
的浓度。

[0423] 在一些实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入1％三氟乙酸。在一些实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入约0.1至约8％三氟乙酸。在另外的实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入3％二氯乙酸。在另外的实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入约0.1至约10％的二氯乙酸。在其他实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入3％三氯乙酸。在其他实施方式中，酸化包括在有机溶剂中加入约0.1至约10％的三氯乙酸。在一些实施方式中，酸化包括在水中加入80％的乙酸。在一些实施方式中，酸化包括在水中加入约50％至约90％，约50％至约80％，约50％至约70％，约50％至约60％，约70％至约90％的乙酸。在一些实施方式中，酸化包括在酸性试剂中更进一步加入阳离子清除剂。在特定的实
1
施方式中，阳离子清除剂可为三乙基甲硅烷或三异丙基甲硅烷。在一些实施方式中，R 在酸
1
化缩合的中间体步骤之前脱去封闭。在一些实施方式中，R 通过酸化脱去封闭，其包括在有
1
机溶剂中加入1％三氟乙酸。在一些实施方式中，R 通过酸化脱去封闭，其包括在有机溶剂
1
中加入3％二氯乙酸。在一些实施方式中，R 通过酸化脱去封闭，其包括在有机溶剂中加入
3％三氯乙酸。

[0424] 封闭部分或封闭基团的除去

[0425] 位于核碱基或糖部分的诸如羟基或氨基部分的官能团在合成中通常用封闭(保护)基团(部分)封闭，并且在其后脱去封闭。通常，封闭基团提供对特定的反应条件为
惰性的分子的化学官能性，并且可以随后除去分子的该官能性而不在显著损害分子的剩
nd
余部分(参见例如，Green和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2 Ed.，JohnWiley & Sons，New York，1991)。例如，氨基基团可用氮封闭基团封闭，诸如苯二甲酰亚氨基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、三苯基甲基氧硫基、t-BOC，4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)、三苯甲基(Tr)或
9-(p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。羧基基团可被保护作为乙酰基。羟基可被诸如四
氢吡喃基(THP)、t-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧
基哌啶-4-基(Ctmp)、1-(2-氟代苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)、1-(2-氯代乙氧基)
乙基、3-甲氧基-1，5-二甲酰甲氧基戊-3-基(MDP)、双(2-乙酰氧乙氧基)甲基(ACE)、
三异丙基硅氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、
[4-(N-二氯代乙酰基-N-甲基氨基)苯甲氧基]甲基、2-氰基乙基(CN)、三甲基乙酰氧甲
基(PivOM)、levunyl氧甲基(ALE)所保护。其他代表性的羟基封闭基团已被描述(参见
例如，Beaucage等人，Tetrahedron，1992，46，2223)。在一些实施方式中，羟基封闭基团为酸不稳定基团，例如三苯甲基，单甲氧基三苯甲基，二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。化学官能团
也可以通过将它们包括为前体形式而被封闭。因此叠氮基团可被认为是胺的封闭形式，因为叠氮基团易于转化为胺。应用于核酸合成中的另外的代表性保护基团为已知的(参见例如，Agrawal等人，Protocols for Oligonucleotide Conjugates，Eds.，Humana Press，New Jersey，1994，Vol.26，pp.1-72)。

[0426] 不同的方法为已知并且用于从核酸中除去封闭基团。在一些实施方式中，所有封闭基团被除去。在另外的实施方式中，封闭基团部分被除去。在其他实施方式中，可调整反2 2
应条件以除去某些部分上的封闭基团。在其中R 为封闭基团的一些实施方式中，在R 上除
1 1 2
去封闭基团与在R 上除去封闭基团互不相关。在R 和R 上的封闭基团在合成步骤中维持
2
完整，并且在链装配后共同除去。在一些实施方式中，R 封闭基团在从固体载体上切割核酸
1
以及除去核碱基封闭基团的同时被除去。在特定的实施方式中，在R 的封闭基团被除去，
2 1
而在R 的封闭基团和核碱基仍旧完整。在R 的封闭基团固体载体上可用有机碱切割，诸如
1
伯胺、仲胺或其混合物。R 位置的脱去封闭通常被称为前端脱保护。

[0427] 在实施方式中，如果存在，核碱基封闭基团在各个核酸的组装后可用酸试剂切割。在另一实施方式中，一个或多个核碱基封闭基团在非酸性或非碱性条件下被切割，例如，可用氟化盐或氢氟酸复合物切割。在另一实施方式中，一个或多个核碱基封闭基团在碱性或碱性溶剂的存在下在各个核酸组装后可被切割，并且其中核碱基封闭基团在前端脱保护步骤的条件下对胺稳定。

[0428] 在一些实施方式中，核碱基的封闭基团不是必须的。在另外的实施方式中，核碱基的封闭基团是必须的。在其他实施方式中，一些核碱基需要封闭基团而其他核碱基不需要封闭基团。在核碱基被封闭的一些实施方式中，封闭基团在适合于在前端除去封闭基团的1 a a
条件下被完全或部分除去。例如，R 可表示OR，其中R 为酰基并且Ba表示用酰基封闭的
1
鸟嘌呤，该酰基包括但不局限于异丁酰基、乙酰基或4-(叔丁基苯氧基)乙酰基。R 和Ba
的酰基将在同一脱去封闭的步骤中被除去或部分除去。

[0429] 试剂

[0430] 缩合试剂。

[0431] 对本发明的方法有用的缩合试剂(CR)具有以下通式之一：Ar3PL2和(ArO)3PL2，[0432]1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[0433] 其中Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z、Z 和Z 独立地选自烷基、氨基烷基、环烷基、杂环2 3 5
基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z 和Z、Z
6 7 8 8 9 9 7 7 8 9
和Z、Z 和Z、Z 和Z、Z 和Z 或Z 和Z 和Z 的任何一起以形成3至20元脂环或杂环；
-
Q 为反离子；w为0至3的整数；L为离去基团；而且Ar为芳基、杂芳基和/或一个Ar基团
连接至聚合物载体。
- - - - - - -

[0434] 在一些实施方式中，缩合试剂CR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、TfO、Tf2N、AsF6、- -ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。在一些实施方式中，缩合试剂CR的离去基团为F、Cl、Br、I、3-硝基-1，2，4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羟基苯并三唑。

[0435] 可用于该方法中的缩合试剂的例子包括但不局限于五氟苯甲酰基氯、羰基二咪唑(CDI)、1-三甲基苯磺酰基-3-硝基三唑(MSNT)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI-HCl)、苯并三唑-1-基氧代三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、2-(1H-7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，
1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、DIPCDI；N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酸溴(BopBr)、1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷(phospholidinium)六氟磷酸盐(MNTP)、3-硝基-1，2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐
(PyNTP)、溴代三吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)；四甲基氟代甲脒六氟磷酸盐(TFFH)；(PhO)3PCl2和双(三氯甲- - - - -
基)碳酸酯(BTC)。在一些实施方式中，缩合试剂CR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、TfO、- - - -
Tf2N、AsF6、ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。

[0436] 在本发明的其他实施方式中，缩合试剂为1-(2，4，6-三异丙基苯磺酰)-5-(吡啶-2-基)四唑、特戊酰氯、溴代三吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐、N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)、(PhO)3PCl2或2-氯代-5，5-二甲基-2-氧代-1，3，2-二氧膦杂环
己烷、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)或Ph3PCl2。在一个实施方式中，缩合试剂为N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl)。在一个实施方式中，缩合试剂为双(三氯甲
基)碳酸酯(BTC)。在一个实施方式中，缩合试剂为Ph3PCl2。其他已知的缩合试剂已被描述(参见例如，WO/2006/066260)。

[0437] 在另外的实施方式中，缩合试剂为1，3-二甲基-2-(3-硝基-1，2，4-三唑-1-基)-2-吡咯烷-1-基-1，3，2-二氮杂磷杂环戊烷六氟磷酸盐(MNTP)、3-硝基-1，
2，4-三唑-1-基-三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸盐(PyNTP)、二(三氯甲基)碳酸酯
(BTC)、(PhO)3PCl2或Ph3PCl2。

[0438]

[0439] 活化试剂。

[0440] 在本文中有用的活化试剂应该具有强的供质子能力，以能够活化手性中间体使其与包含游离亲核部分的化合物反应。在一个实施方式中，手性中间体为显示于路线5或6中结构III或显示于路线7中结构IIIr。活化试剂通过质子化结构III或IIIr中氮原子
而作用，其中W1为氮。活化试剂的使用取决于用于合成的溶剂。

[0441] 在本发明方法中有用的活化试剂(AR)具有以下通用式中的一个：

[0442]

[0443] Z11、Z12、Z13、Z14、Z15、Z16、Z17、Z18、Z19、Z20和Z21独立地为氢、烷基、氨基烷基、环烷基、11
杂环基、环烷基烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或杂芳氧基，或者其中Z 和
12 11 13 11 14 12 13 12 14 13 14 15 16 15 17 16 17 18
Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和Z 、Z 和
19 20 21 -
Z 或Z 和Z 的任何一起形成3至20元脂环或杂环，或者形成5或20元芳香环。Q 为反
- - - - - -
离子。在该方法的一些实施方式中，活化试剂AR的反离子为Cl、Br、BF4、PF6、TfO、Tf2N、- - -
AsF6、ClO4 或SbF6，其中Tf为CF3SO2。

[0444] 在该方法的一些实施方式中，活化试剂为咪唑、4，5-二氰基咪唑(DCI)、4，5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑、5-乙基硫代四唑、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲基磺酸盐、N-氰基甲基二甲基铵三氟甲基磺酸盐。

[0445] 在该方法的一些实施方式中，活化试剂为4，5-二氰基咪唑(DCI)、1-苯基咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑或N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。

[0446]

[0447] 在该方法的一些实施方式中，活化试剂为N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐(CMPT)。

[0448] 手性试剂。

[0449] 在本发明的方法中，手性试剂用于在生成X-膦酸酯链接中提供立体选择性。许多不同的手性助剂物可用在该方法中，其为式3-I的化合物，其中W1和W2
5
为-O-、-S-或-NG-中的任何，其能够与H-膦酸酯起始材料-式2的化合物反应以形成手
性中间体，如路线5和6中结构III所示。

[0450]

[0451] U1和U3为碳原子，其与U2键合(如果存在的话)，或彼此以单、双或三键键合(如8 8 8 8
果r为0的话)。U2为-C-、-CG-、-CGG-、-NG-、-N-、-O-或-S-，其中r为0至5的整数
并且相邻杂原子不超过两个。当U2的任一个为C时，与其为C第二个的U2之间必须形成三
8 8
键，或与U1或U3中一个形成三键。同样，当任何一个U2为CG 时，与其为-CG-或-N-的第
二个U2之间必须形成双键，或与U1或U3中的一个形成双键。
3 4 1 2

[0452] 例如，在一些实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-CGG-CGG-。在一些实施方式3 1
中，-U1-(U2)r-U3-为-CG ＝CG-。在一些实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-C≡C-。在
3 8 1 2
一些实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-CG ＝C G-CGG-。在一些实施方式中，-U1-(U2)
3 4 1 2 3 4 8 1 2
r-U3-为-CGG-O-CGG-。在一些实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-CGG-NG-CGG-。在一些
3 4 2 3 4
实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-CGG-N-CG-。在一些实施方式中，-U1-(U2)r-U3-为-CGG-N
8 1 2
＝CG-CGG-。
1 2 3 4 5 8

[0453] G、G、G、G、G 和G 独立地为氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳1 2 3 4 5 6
基或芳基，或G、G、G、G 和G 中的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的。在一些实施方式中，形成的环被氧代、硫代、烷基、烯基、炔基、芳杂基或芳基部分所取代。在一
6
些实施方式中，当通过两个G 一起形成的环被取代时，其可被具有足够大体积的部分取代，以在反应中提供立体选择性。
6

[0454] 例如，在一些实施方式中，通过两个G 一起形成的环为环戊基、吡咯基、环丙基、环己基、环戊烯基、四氢吡喃基或哌嗪基。

[0455] 在本发明的一些实施方式中，手性试剂为式3的化合物。

[0456]

[0457] 在式3的一些实施方式中，W1和W2独立地为-NG5-、-O-或-S-；G1、G2、G3、G4和G51 2 3 4 5
独立地氢、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂芳基或芳基，或G、G、G、G 和G 中
6
的两个为G，即其一起形成饱和的、部分不饱和的或不饱和的最多约20个环原子的碳环或
1 2 3 4 5
含有杂原子的环，其为单环或多环，稠合或非稠合的，并且G、G、G、G 和G 中不超过四个
6 1 2 3 4 5
为G。与式3’的化合物类似，任何G、G、G、G 和G 被氧代、硫代，烷基、烯基、炔基、芳杂基或芳基部分所取代。在一些实施方式中，该取代在X-膦酸酯的产生中诱导立体选择性。

[0458] 在本发明的一些实施方式中，手性试剂具有下式之一：

[0459]

[0460] 在一些实施方式中，手性试剂为氨基醇。在其他的一些实施方式中，手性试剂为氨基硫醇。在其他实施方式中，手性试剂为氨基酚。在一些实施方式中，手性试剂为(S)-和(R)-2-甲基氨基-1-苯基乙醇、(1R，2S)-麻黄素或(1R，2S)-2-甲基氨基-1，2-二苯基乙醇。

[0461] 在本发明的其他实施方式中，手性试剂为具有下式之一的化合物：

[0462]

[0463] 手性试剂的选择，例如，式O或其立体异构体式P所呈现的异构体允许磷上的手性的特异性控制。因此RP或者SP构型可在各个合成循环中选择，允许核酸产物的总体三维结构的控制。在本发明的一些实施方式中，核酸产物具有全部RP立体中心。在本发明的一些实施方式中，核酸产物具有全部SP立体中心。在一些实施方式中，选择RP和SP中心，以形成核酸链的特异性三维超结构。

[0464] 核碱基和修饰的核碱基

[0465] 式1中的核碱基Ba为天然核碱基或由天然核碱基衍生的修饰的核碱基。例子包括但不局限于其各个氨基由酰基保护基团保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤、2-氟代尿嘧啶、2-氟代胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、诸如假异胞嘧啶和伪尿嘧啶的嘧啶类似物和其他诸如8-取代嘌呤、黄嘌呤或表
黄嘌呤(后两个为天然降解产物)的修饰的核碱基。公开于Chiu和Rana，RNA，2003，9，
1034-1048，Limbach等人Nucleic AcidsResearch，1994，22，2183-2196以及Revankar和Rao，Comprehensive Natural Products Chemistry，vol.7，313中的修饰的核碱基也预期为式1的Ba部分。

[0466] 由以下通式代表的化合物也预期作为修饰的核碱基：

[0467]

[0468] 在如上式中，R8为具有1至15个碳原子的直链或支链烷基、芳基、芳烷基或芳香氧9 10
烷基，仅以举例的方式包括甲基、异丙基、苯基、苯甲基或苯氧甲基；并且各个R 和R 代表具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。

[0469] 修饰的核碱基也包括已加入一个或多个苯环的大小扩增的核碱基。描述于GlenResearch catalog(www.glenresearch.com)；Krueger AT 等人，Acc.Chem.Res.，
2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.，2002，35，936-943；Benner S.A.，等人，Nat.Rev.Genet.，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.，等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2003，7，
723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2006，10，622-627中的核碱基取代物预期对在本文所述的核酸合成有用。这些大小扩增的核碱基的一些例子如下所示：

[0470]

[0471] 在本文中，修饰的核碱基也包括不认为是核碱基而为其他部分的结构，诸如但不局限于咕啉-或卟啉-衍生的环。卟啉-衍生碱基取代物描述于Morales-Rojas，H和Kool，ET，Org.Lett.，2002，4，4377-4380。如下所示为可用作碱基取代物的卟啉-衍生环的例子：

[0472]

[0473] 其他修饰的核碱基也包括诸如那些如下所示的碱基取代物：

[0474]

[0475] 荧光的修饰的核碱基也是可预期的。这些碱基取代物的非限制性例子包括菲、芘、二苯乙烯、异黄嘌呤、异黄蝶呤、三联苯、三噻吩、苯并三噻吩、香豆素、2，4-二氧四氢蝶啶、栓系二苯乙烯(tethered stillbene)、苯并-尿嘧啶和萘并-尿嘧啶，如下所示：

[0476]

[0477] 修饰的核碱基可为未取代的或者进一步含有取代基，诸如杂原子、烷基基团或连接至荧光部分、生物素或亲和素部分的连接部分或其他蛋白质或多肽。修饰的核碱基也包括一些在多数经典的意义上不是核碱基但与核碱基功能相似的“通用碱基”。一个通用碱基的代表性的例子为3-硝基吡咯。

[0478] 除了结构IV或IX的核苷外，其他核苷也可用在公开于本文的方法中，并且包括含有修饰的核碱基或共价键合于修饰的糖的核碱基的核苷。一些含有修饰的核碱基的核苷的例子包括4-乙酰基胞苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；2′-O-甲基胞苷；5-羧基甲基氨基
甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2′-O-甲基伪尿苷；β，D-半
6
乳糖基辫苷(queosine)；2′-O-甲基鸟苷；N-异戊烯基腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基伪尿
7
苷；1-甲基鸟苷；1-甲基肌苷；2，2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；N-甲基鸟苷；
6
3-甲基-胞苷；5-甲基胞苷；N-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧
基氨基甲基-2-硫代尿苷；β，D-甘露糖基辫苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；
6
2-甲基硫代-N-异戊烯基腺苷；N-((9-β，D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基
甲酰基)苏氨酸；N-((9-β，D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸；尿
苷-5-羟乙酸甲酯；尿苷-5-羟乙酸(v)；伪尿苷；辫苷；2-硫代胞苷；5-甲基-2-硫代尿
苷；2-硫代尿苷；4-硫代尿苷；5-甲基尿苷；2′-O-甲基-5-甲基尿苷以及2′-O-甲基
尿苷。

[0479] 在一些实施方式中，核苷包括具有6′-位的(R)或(S)-手性的6′-修饰的双环核苷类似物，并且包括描述于美国专利第7,399,845号的类似物。在另外的实施方式中，核苷包括具有5′-位的(R)或(S)-手性的5′-修饰的双环核苷类似物，并且包括描述
于美国专利申请公布号20070287831的类似物。

[0480] 在一些实施方式中，核碱基或修饰的核碱基包括诸如抗体、抗体片段、生物素、亲和素、抗生蛋白链菌素、受体配体或螯合部分的生物分子结合部分。在另外的实施方式中，Ba为5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。在其他实施方式中，Ba通过用荧光或生物分子结合部分进行取代而修饰。在一些实施方式中，Ba上的取代基为荧光部分。在另外的实施方式中，Ba上的取代基为生物素或亲和素。

[0481] 核苷酸/核苷的修饰的糖基

[0482] 最普遍的天然存在的核苷酸为连接于核碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的核糖糖。并且修饰的核苷酸为预期的，其中核苷酸的磷酸基团或修饰的磷原子部分可连接于糖或修饰的糖的不同的位置。作为非限制性的例子，修饰的磷原子部分的磷酸基团可连接于糖或修饰的糖的2′、3′、4′或5′羟基部分。如上所述含有修饰的核碱基的核苷酸也可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，包含未保护的-OH部分的核苷酸或修饰的核苷酸用于本文所述的方法中。

[0483] 除了描述于路线1-4b中的核糖部分，其他的修饰的糖也可包括于本文所公开的核酸。在一些实施方式中，修饰的糖含有一个或多个在2′位置的取代基，其包括以下的一个：F；CF3、CN、N3、NO、NO2、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基、O-烷基-N-烷基或N-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为取代或
未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。取代基的例子包括但却不局限于O(CH2)nOCH3和O(CH2)nNH2，其中n为从1至约10，MOE，DMAOE，DMAEOE。在本文也可预期的是描述于WO
2001/088198和Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504的修饰的糖。在一些实施方式中，修饰的糖包括取代的甲硅烷基基团、RNA切割基团、报告基团、荧光标记、嵌入剂、用于提高核酸药物动力学性质的基团或用于提高核酸药效学性质的基团以及其他具有相似
性质的取代基。修饰可在糖或修饰的糖的2′，3′，4′，5′或6′位置，包括在3′-端核苷酸的糖的3′位或在5′-端核苷酸的5′位。

[0484] 修饰的糖也包括代替戊呋喃糖基糖的糖模拟物，诸如环丁基或环戊基部分。教导制备该修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不局限于，美国专利第4,981,957、
5,118,800、5,319,080和5,359,044号。一些预期的修饰的糖包括

[0485]

[0486] 其他的修饰的糖的非限制性例子包括甘油，其形成甘油核酸(GNA)类似物。GNA类似物的一个例子显示于下并且描述于Zhang，R等人，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，
5846-5847；Zhang L，等人，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，4174-4175和Tsai CH等人，PNAS，
2007，14598-14603：

[0487]

[0488] 其中X如本文所定义。GNA衍生的类似物的另一个例子是基于混合的甲酰甘油的乙缩醛缩醛胺的柔性核酸(FNA)，描述于Joyce GF等人，PNAS，1987，84，4398-4402 and Heuberger BD和Switzer C，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，412-413，并且显示于下：

[0489]

[0490] 封闭基团

[0491] 在所述的反应中，在一些实施方式中有必要保护反应官能团，例如羟基、氨基、巯基或羧基基团(这些基团在终产物中是想要的)，以避免它们在不利地参与反应。保护基团用于阻断一些或所有的反应性部分，并且防止该基团参与化学反应直到保护基团被除去。在一个实施方式中，各个保护基团通过不同的方法被除去。在完全不同的反应条件下切割的保护基团实现差异切除的要求。在一些实施方式中，保护基团可用酸、碱和/或氢解除去。诸如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基团为酸不稳定的，并且在特定的实施方式中，在用Cbz基团(可通过氢解除去)和/或Fmoc基团(其为
碱不稳定的)保护的氨基基团存在下，用于保护羧基和羟基反应性部分。在另外的实施方式中，在被甲酸酯的酸不稳定基团诸如叔丁基氨基或氨基甲酸酯(两个均为酸和碱稳定但可水解除去的)封闭的胺存在下，羧酸和羟基反应性部分被诸如但不局限于甲基、乙基和乙酰基的碱不稳定的基团封闭。

[0492] 在另一些实施方式中，羟基反应性部分被诸如苯甲基基团的水解可除去的保护基团所封闭，而能够与酸形成氢键的胺基被诸如Fmoc的碱不稳定的基团封闭。在另一些实施方式中，羧酸反应性部分通过转化为简单的酯化合物被保护，或者在另一些实施方式中，它们被诸如2，4-二甲氧基苯甲基的氧化可除脱保护基团封闭，而共同存在的氨基被氟化物不稳定的甲硅烷基或氨基甲酸酯封闭基团封闭。

[0493] 烯丙基封闭基团在酸-和碱-保护基团的存在下有用，因为前者稳定并且在其后可通过金属或pi-酸催化剂除去。例如，在酸不稳定的叔丁基氨基甲酸酯或碱不稳定的乙酸胺保护基团存在下，烯丙基-封闭的羟基可用Pd(0)-催化的反应脱保护。另外的保护基团的形式为连接了化合物或中间体的树脂。只要残基连接于树脂上，官能团即被封闭而无法反应。一旦从树脂上释放，官能团可用于反应。

[0494] 仅以举例的方式，典型的封闭/保护基团为：

[0495]

[0496] 在合成中用于保护核苷酸的代表性的保护基团包括碱不稳定的保护基团和酸不稳定的保护基团。碱不稳定的保护基团用于保护杂环核碱基的环外氨基基团。该类型的保护通常通过乙酰化获得。三个通常用于该目的的乙酰化基团为苯甲酰基氯、苯氧乙酸酐和异丁酰氯。这些保护基团在用于核酸合成中的反应条件下稳定并且在合成最后的碱处理中以大致相当的速率切割。

[0497] 在一些实施方式中，5′-保护基团为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、2-氯代三苯甲基、DATE、TBTr、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)或9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。

[0498] 在一些实施方式中，巯基部分引入至式1、2、4或5的化合物并且被保护。在一些实施方式中，保护基团包括但不局限于Pixyl、三苯甲基、苯甲基、对-甲氧基苯甲基(PMB)或叔丁基(t-Bu)。

[0499] 其他的保护基团以及产生保护基团和除脱保护基团所用的技术的详细描述，描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，NY，1999，以及Kocienski，Protective Groups，Thieme Verlag，New York，NY，1994，其通过引用引入本文。

[0500] 在一些实施方式中，R1为-ORa，其中Ra为取代或未取代的三苯甲基或取代的甲硅1 d d 2 b
烷基。在另外的实施方式中，R 为-N3、-NRR、炔氧基或-OH。在一些实施方式中，R 为-OR，b
其中R 为取代或未取代的三苯甲基、取代的甲硅烷基、乙酰基、酰基或取代的甲醚。在另外
2 d d 1 1 1 1
的实施方式中，R 为-NRR、烷基、烯基、炔基、烷基-Y-、烯基-Y-、炔基-Y-、芳基-Y-、杂
1 1 d
芳基-Y-、其中Y 为O、NR、S或Se，并且被荧光或生物分子结合部分所取代。在其他实施
2 2
方式中，在R 上的取代基为荧光部分。在一些实施方式中，R 上的取代基为生物素或亲和
2
素。在一些实施方式中，R 为-OH、-N3、氢、卤素、烷氧基或炔氧基。

[0501] 在另外的实施方式中，R3为取代的三苯甲基、酰基、取代的甲硅烷基或取代的苯甲3
基的封闭基团。在其他实施方式中，R 为连接于固体载体的连接部分。在另外的实施方式中，Ba部分的封闭基团为甲苯基、酰基、甲酰基、二烷基甲脒基、异丁酰基、苯氧基乙酰基或三苯甲基部分，其中任何一个可为未取代的或取代的。

[0502] 包含手性X-膦酸酯部分的核酸的应用方法

[0503] 基于稳定性、确定的手性和合成的简易度的组合，按本发明的方法所获得的包含手性X-膦酸酯部分的立体定义的寡核苷酸对于许多应用领域是有用的。广义上，按该方法合成的化合物可用作治疗剂、诊断探针和试剂、用于产生其他寡核苷酸产物的合成工具，和用于多种新材料和计算应用的纳米结构材料。

[0504] 本发明的立体定义的寡核苷酸具有与天然的DNA/RNA等同物相比改善的血清稳定性，特别是硫代磷酸酯类型的立体定义的寡核苷酸。此外，SP异构体比RP异构体更稳定。
在一些实施方式中，血清稳定性的水平通过在选择的位置引入全SP中心或SP中心以提供对降解的抗性而被调节。在另外的实施方式中，引入可选择的RP和/或SP立体中心可提供特定的与内源性或外源性靶标相关的碱基配对，因此保护靶标不被代谢或改善特定的生物反应。

[0505] RNase H的活化也通过存在立体可控的硫代磷酸酯核酸类似物而被调节，其中天然的DNA/RNA比RP立体异构体更加敏感，RP立体异构体比SP异构体更敏感。

[0506] 对于RNA的提高的双倍体稳定性，RP硫代磷酸酯寡核苷酸比SP寡核苷酸的双倍体稳定性高，SP寡核苷酸比天然的DNA/RNA的稳定性高。对于DNA的提高的双倍体稳定性，SP比RP的双倍体稳定性高，RP比天然的DNA/RNA的稳定性高(P.Guga，Curr.Top Med.Chem.，2007，7，695-713)。

[0507] 在一些特定的应用中，这些分子可用作治疗试剂。它们可包含在也含有标准的DNA/RNA核苷的寡核苷酸中，或者它们也可作为本发明的立体可控的寡核苷酸的完整序列合成。一些类型的治疗试剂包括但不局限于反义寡核苷酸、与靶序列形成三螺旋以抑制
不需要的基因的转录并且调节蛋白质表达和/或活性的反基因寡核苷酸、诱捕寡核苷酸
(decoy oligonucleotide)、DNA疫苗、适体、核酶、脱氧核酶(DNA酶或脱氧核糖核酸酶)、siRNA、微RNAs、ncRNAs(非编码RNA)和P-修饰的前药。调节包含间接或直接提高或降低
蛋白质的活性或抑制或促进蛋白质的表达。这些核酸化合物可用于控制细胞增殖、病毒复制或任何其他的细胞信号传导过程。

[0508] 在一个实施方式中，siRNA治疗剂的领域需要可提供对抗RNA酶活性的提高的稳定性的寡核苷酸种类，以延长相比于包含天然核苷的siRNA的作用持续时间。另外，A型
螺旋的形成看起来比在寡核苷酸上存在特定天然元素更能成功预示进入RNAi。通过使用
本发明的立体可控的寡核苷酸可实现这两者的要求，该寡核苷酸可提供提高的稳定性(Y-L Chiu，T.M.RanaRNA，2003，9，1034-1048)。

[0509] 本发明中所述的核酸作为对抗各种疾病状态的治疗试剂有作用，包括用作抗病毒试剂。核酸可用作通过调节DNA和/或RNA活性治疗疾病的试剂。在一些实施方式中，核酸可用于抑制特定的基因表达。例如，核酸可与特定的靶标信使RNA(mRNA)序列互补。它们可用于抑制病毒复制，诸如正痘病毒、痘苗病毒、疱疹、乳头状瘤、流行性感冒、巨细胞病毒和其他病毒。另外的例子包括用于抗HIV RNA或逆转录病毒RNA，或用于与编码tat蛋白质的HIV mRNA或HIV mRNA的TAR区域杂交的反义化合物。在一些实施方式中，核酸模拟
HIV mRNA的TAR区域的二级结构，并且通过如此结合于tat蛋白质。在一个实施方式中，核酸通过细胞与式1的化合物的接触用于抑制靶标蛋白质的表达，其中细胞中其他蛋白质的表达不被抑制或最小程度被抑制。在一些实施方式中，在哺乳动物中靶标蛋白质的抑制在体内发生。在另外的实施方式中，施用治疗有效的量的式1的化合物以抑制靶标蛋白质的表达。

[0510] 其表达可被调节的蛋白质的其他的例子包括Jun N-末端激酶(JNK)蛋白质、二酰基甘油酰基转移酶I、载脂蛋白B、高血糖素受体、AuroraB、酰基CoA胆固醇酰基转移酶-2、c-反应蛋白、STAT(信号传导与转录活化因子)家族蛋白质和MDR P-糖蛋白。核酸可用于抑制蛋白质磷酸酶1B(PTP1B)的表达，RNA-依赖性RNA病毒聚合酶。核酸可用于在癌细胞
中诱导诸如细胞凋亡的事件，或者生成更易于细胞凋亡的细胞。核酸可用于调节蛋白质的活性。例如，其可帮助调节RNA酶H对多药耐受性(MDR)RNA分子的活性。

[0511] 本文所述的核酸对于治疗包括但不局限于高胆固醇血症、严重急性呼吸系统综合症(SARS)、诸如AIDS或HIV的逆转录病毒疾病、其他病毒感染、子宫内感染和癌症的适应症有作用。

[0512] 当用作治疗剂时，本文所述核酸以药物组合物施用。在一些实施方式中，药物组合物包含治疗有效的量的式1的包含手性X-膦酸酯部分的核酸，或其药学可接受的盐以及至少一种选自以下的药学可接受的非活性成分：药学可接受的稀释剂、药学可接受的赋形剂和药学可接受的载体。在另一些实施方式中，药物组合物经配制用于静脉注射、口服施用、颊给药、吸入、鼻腔给药、局部给药、眼内给药或耳部给药。在另外的实施方式中，药物组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、液体、吸入剂、鼻喷雾溶液、栓剂、悬浮剂、凝胶、胶体、分散剂、悬浮液、溶液、乳剂、软膏、洗剂、滴眼剂或滴耳剂。

[0513] 由本发明的方法所合成的化合物的第二个类型用作引物或探针。因为该方法提供天然或非天然序列以及磷中心立体化学的总体控制，可特异性产生任何特定的分子。另外的，额外的RNA酶抗性提供在离体或体内条件下稳定的分子。本发明的立体定义的寡核苷酸可用于研究包含磷原子的酶反应机理的探针，诸如核酸的消化、连接和聚合。该种类的分子可用作研究核酶和脱氧核酶反应机理的探针。它们也可用作研究RNAi和其他非编码RNA调节的基因沉默机理的探针，或者用作分析蛋白质-核酸相互作用的探针。通过加入选择的RP或SP磷立体中心定义三维结构的能力允许设计新种类的所谓的分子信标的可能性。

[0514] 由于本合成方法不局限于有限的天然核碱基，修饰的核碱基或对于碱基或糖或端基的其他修饰允许将该种类的寡核苷酸用作溶液中核酸、蛋白质和任何生物或化学物质的探针或感受器(sensor)。它们可以类似地使用而不含修饰的核碱基，使用标准的检测方法，替代天然的DNA/RNA。任何的这些可作为诊断检测的一部分引入。

[0515] 该诊断测试可使用生物液体、组织、完整细胞或分离的细胞组分进行。如基因表达的抑制，诊断的应用利用核酸与核酸的互补链杂交的能力。杂交为通过Watson-Crick和/或Hoogsteen碱基对的寡聚化合物与RNA或DNA的序列特异性氢键键合。该碱基对的碱基与另一个互补。核酸可用于分析身体状态，例如动物的疾病状态。它们可用于确定样品中腺病毒或流行性感冒病毒，或用作插入试剂或探针。例如，它们可与诸如蛋白质的其他细胞组分用于检测DNA甲基化或探测DNA相互作用。

[0516] 本发明的另一个方面，提供了确定或检测样品中靶标分子的方法，方法包括：将疑为含有靶标分子的样品与根据本发明方法合成的式1的核酸感应分子接触，其中由信号生成单元产生的信号的变化表明所述样品中所述靶标的存在。核酸感应分子特异性地与靶标分子结合。在一些实施方式中，有多种核酸感应分子。在一些实施方式中，多种核酸感应分子包括特异性结合于不同的靶标分子的核酸感应分子。在一些例子中，该方法进一步包括定量由信号生成单元产生的信号的变化，以定量样品中靶标分子的量。信号生成单元检测任何种类的信号，包括但不局限于荧光、表面等离子共振、荧光猝灭、化学发光、干涉测量法或折射率检测。

[0517] 可检测的样品为环境样品、生物危险材料、有机样品、药物、毒素、香料、香味或生物样品。生物学样品为细胞、细胞提取物、细胞溶解产物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品。在该方法的一些实施方式中，靶标分子的存在表明病理症状的存在。在该方法的一些实施方式中，靶标分子的存在表明所需分子的存在。

[0518] 在相关的应用中，由本发明的方法提供的立体定义的寡核苷酸用作PCR的引物或作为使用聚合酶的DNA/RNA合成的模板或引物。解链温度可根据在产物寡核苷酸的磷上选择性引入RP或SP手性的特别应用而优化。

[0519] 在本发明的另一个方面，提供了从核酸模板扩增核酸所需区域的方法，包括：(a)提供多个具有与感兴趣的共有序列互补的固定的核苷酸序列区域的第一PCR引物；(b)提供多个第二PCR引物，(c)在下述条件下通过PCR使用所述多个第一PCR引物和所述多个
第二PCR引物扩增核酸模板，其中所述多个第一引物的一部分实质结合任何存在于模板上的感兴趣的共有序列，并且所述多个第二引物的一部分在模板上离开第一引物的位置结
合，从而由第一个引物和第二引物侧接的核酸区域被特异性地扩增，而且其中所述多个第一PCR引物和/或所述多个第二PCT引物为根据本发明的方法产生的式1的核酸分子。

[0520] 在一些实施方式中，模板为基因组DNA。在一些实施方式中，模板为真核基因组DNA。在一些实施方式中，模板为人类基因组DNA。在一些实施方式中，模板为原核DNA。在一些实施方式中，模板为其是克隆的基因组DNA、DNA的亚基因组区域、染色体或亚染色体区域的DNA。在一些实施方式中，模板为RNA。

[0521] 立体定义的寡核苷酸也是有用的，这是由于作为DNA芯片和寡核苷酸微阵列的底物的它们增高的稳定性和它们保持识别和结合于它们的生物靶标的能力。它们也在无细胞的蛋白质合成中用作天然核酸(诸如tRNA和mRNA)的稳定的寡核苷酸取代物。

[0522] 在同一合成中控制稳定性、包括非天然部分的分子组成和结构的能力是有用的另外的领域也在DNA纳米材料设计中有应用。本发明的立体定义的寡核苷酸可用作构建含有二级、三级、四级或其他更高级结构的核酸纳米结构的物质。在按该方法产生的分子中加入其他有机部分的能力使得其通过设计特异性非天然的更高级结构在纳米材料中应用。
设计的体内稳定性和灵活性将允许这些分子在例如DNA计算机中的应用。另外的，可将金属螯合或传导有机分子包含在本发明的立体定义的寡核苷酸中，并使得它们在电子设备或DNA/RNA纳米机器中作为DNA纳米丝使用(F.A.Aldate，A.L.Palmer，Science，2008，321，
1795-1799)。
实施例

[0523] 一般信息：

[0524] 本文中所有的NMR图谱由Varian Mercury 300记录。1H NMR图谱在CDCl3中在31
300MHz获得，以四甲基硅烷(TMS)(δ0.0)作为内标物。 P NMR图谱获得于121.5MHz，以
85％H3PO4(δ0.0)作为外标物。MALDI TOF-MS由Applied Biosystems Voyager System
4327记录。硅胶柱色谱使用Kanto硅胶60N(球状，中性，63-210μm)进行。分析TLC在
Merck Kieselgel 60-F254板上进行。干燥的有机溶剂在使用前以合适的程序制备。其他的有机溶剂为试剂级并且按收到时使用。ACQUITYUPLC 使用BEH C18(1.7μm，2.1×150mm)进行。dTT、dCT、dAT、dGT、rUOMeU和rUFU硫代磷酸酯二聚体的产率由在260纳米下的UV吸收测定而确定，其中以下天然二聚体的摩尔消光系数的近似值分别为dTT(16800)，dCT(15200)，dAT(22800)，dGT(20000)，rUU(19600)，rUU(19600)。

[0525] 缩写：

[0526] bz：苯甲酰基

[0527] Beaucage试剂：3H-1，2-苯并二硫杂环戊烯-3-酮1，1-二氧化物

[0528] BSA：N，O-双(三甲基甲硅烷)乙酰胺

[0529] BTC：二(三氯甲基)碳酸酯

[0530] ce：氰基乙基

[0531] CF3COIm：N-三氟乙酰基咪唑

[0532] CMP：N-氰基甲基吡咯烷

[0533] CMPT：N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲基磺酸盐

[0534] CPG：可控孔度玻璃

[0535] DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯

[0536] DCA：二氯乙酸

[0537] DCM：二氯甲烷，CH2Cl2

[0538] DMAc：N，N-二甲基乙酰胺

[0539] DMAN：1，8-双(二甲基氨基)萘

[0540] DMTr：4，4′-二甲氧基三苯甲基

[0541] DTD：N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物

[0542] HCP：高度交联的聚苯乙烯

[0543] pac：苯氧基乙酰基

[0544] TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基

[0545] TBDPS：叔丁基二苯基甲硅烷基

[0546] TFA：三氟乙酸

[0547] L-2：与本文中式P相同

[0548] D-2：与本文中式O相同

[0549] L-6：与本文中式R相同

[0550] D-6：与本文中式Q相同

[0551] 实施例1：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环3
[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸腺嘧啶-3′-基
3
N-苯甲酰基-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4tt]

[0552] 8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N3-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(1t)(96.0毫克，120微摩尔)通过与干燥吡啶反复的共
 蒸发干燥，并且然后溶解于干燥的吡啶中(2毫升)。加入BTC(29.7毫克，100微摩尔)，并且搅拌混合物10分钟。通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并且溶解于干燥的吡啶中(1毫
升)的氨基醇L-2(21.3毫克，120微摩尔)溶液，经由注射器逐滴加入至反应混合物中，并且混合物在氩气氛中搅拌5分钟。向通过与干燥吡啶反复的共蒸发制备并溶解于吡啶中
3
(500微摩尔)的N-苯甲酰基-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶(3t)的溶液
中，经由注射器加入反应混合物。在30分钟后，将DTD(42.5毫克，120微摩尔)加入至反应混合物中。另外5分钟后，在减压下蒸发溶剂。浓缩的NH3-EtOH(40毫升；3∶1，v/v)加入至残留物中，并且混合物在室温下搅拌12小时。在减压下浓缩混合物至干燥。粗混合物以CHCl3(15毫升)稀释，并且以0.2M三乙基碳酸氢铵(20毫升)清洗。水层以CHCl3(4×15毫
升)反萃取。合并的有机层以Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥。残留物以PTLC纯化。产物溶解于CHCl3(5毫升)中，以0.2M 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯碳酸
氢盐缓冲液(10毫升)清洗并且以CHCl3(3×5毫升)反萃取。合并的有机层以Na2SO4干
燥，过滤并且浓缩至干燥以得到(SP)-4tt(41.8毫克，98％产量，RP∶SP＝9∶91)，白色泡
1 31
沫。H和 P NMR图谱(分别为图1和2)与以常规的H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。
31
P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ57.4(RP异构体：57.9)。合成路线显示于路线10中。

[0553]

[0554] 路线10.路线5中DNA二聚体的溶液法合成(途径A)。

[0555] 实施例2：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧腺
苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4at]

[0556] 使用如上所述对于(SP)-4tt的反应步骤，用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧腺苷-3′-基膦酸酯
(1a)替代1t，获得(SP)-4at。

[0557] 实施例3：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧胞
苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4ct]

[0558] 使用如上所述对于(SP)-4tt的反应步骤，用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-脱氧胞苷-3′-基膦酸酯
(1c)替代1t，获得(SP)-4ct。

[0559] 实施例4：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟
苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(SP)-4gt]

[0560] 使用如上所述对于(SP)-4tt的反应步骤，用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基膦酸
酯(1g)替代1t，获得(SP)-4gt。

[0561] 实施例5：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环3
[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸腺嘧啶-3′-基
3
N-苯甲酰基-3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4tt]

[0562] 通过通过与实施例1中(SP)-4tt相似的方法使用氨基醇D-2替代L-2，获得1 31
(RP)-4tt，白色泡沫(93％产率，RP∶SP＝95∶5)。H和 P NMR图谱分别显示于图3和
31
4。 P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ57.6(SP异构体：57.3。

[0563]

[0564] 实施例6：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基
3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4at]

[0565] (RP)-4at经由如上所述于实施例2中的转化产生，使用化合物1a和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。

[0566] 实施例7：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基
3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4ct]

[0567] (RP)-4ct经由如上所述于实施例3中的转化产生，使用化合物1c和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。

[0568] 实施例8：经由途径A溶液法合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟
苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-4gt]

[0569] (RP)-4gt经由如上所述于实施例4中的转化产生，使用化合物1g和氨基醇D-2作为手性试剂替代L-2。

[0570] 实施例9：脱保护以形成(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]。

[0571] (SP)-4tt(50微摩尔)通过与干燥吡啶和干燥甲苯的反复共蒸发干燥，并且然后溶解于三乙胺三氢氟酸盐(500微升)中。混合物在室温下搅拌15小时。然后0.1M乙酸铵缓冲液(2.5毫升)加入至混合物中，并且混合物用Et2O(3×3毫升)清洗。合并的有机层
用0.1M乙酸铵缓冲液(3毫升)反萃取。然后在减压下浓缩合并的水层至干燥，并且残留
物以反相柱色谱纯化[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-10％乙腈的线性梯度]以得到
(SP)-5tt。脱保护路线显示于路线11中。

[0572] 路线11.脱保护

[0573]

[0574] 实施例10：脱保护以形成(SP)-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5at]。

[0575] (SP)-5at如上述实施例9使用(SP)-4at替代(SP)-4tt产生。

[0576] 实施例11：脱保护以形成(SP)-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5ct]。

[0577] (SP)-5ct如上述实施例9使用(SP)-4ct替代(SP)-4tt产生。

[0578] 实施例12：脱保护以形成(SP)-脱氧鸟苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5gt]。

[0579] (SP)-5gt如上述实施例9使用(SP)-4gt替代(SP)-4tt产生。

[0580] 实施例13：脱保护以形成(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5tt]。

[0581] (RP)-5tt如上所述在实施例9中使用(RP)-4tt替代(SP)-4tt以如(SP)-5tt类似的方法产生。

[0582] 实施例14：脱保护以形成(RP)-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5at]。

[0583] (RP)-5at如上所述在实施例9中使用(RP)-4at替代(SP)-4tt产生。

[0584] 实施例15：脱保护以形成(RP)-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5ct]。

[0585] (RP)-5ct如上述实施例9使用(RP)-4ct替代(SP)-4tt产生。

[0586] 实施例16：脱保护以形成(RP)-脱氧鸟苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5gt]。

[0587] 以如(SP)-5tt类似的方法，(RP)-5gt如上述实施例9使用(RP)-4gt替代(SP)-4tt产生。

[0588] 实施例17：经由途径B合成(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸腺嘧啶-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯[(RP)-7tt]

[0589] 1t(100微摩尔)通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥，并且然后溶解于干燥的吡啶中(1毫升)。加入N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl；500微摩尔)，并且搅拌混合物5分钟。经由注射器逐滴向混合物中加入氨基醇((αR，2S)-6)(100微摩尔)溶液，其通过与干燥吡啶的共蒸发干燥并且溶解于干燥的吡啶中(1毫升)，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶通过与干燥吡啶反复的共
蒸发干燥，并且溶解于100微摩尔吡啶中。以上混合物经由插管加入至3′-O-(叔丁基二
甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶3t的干燥(100微摩尔)吡啶溶液中。在15分钟后，混合物在减
压下浓缩。残留物用CH2Cl2(5毫升)稀释，并且用饱和的NaHCO3(3×5毫升)清洗。合并
的水层用CH2Cl2(2×5毫升)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓
缩至ca.1毫升。残留物经由注射器逐滴加入至0℃下搅拌的干燥的CH2Cl2(20毫升)中的
1％三氟乙酸(TFA)溶液中。在另外15分钟后，混合物用干燥的CH2Cl2(100毫升)稀释，并且用饱和的NaHCO3水溶液(2×100mL)清洗。合并的水层用CH2Cl2(2×100毫升)反萃取。
合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥以生成粗(RP)-7tt。合成路线显示于路线12中。

[0590] 路线12.路线6中DNA类似物的合成(途径B)。

[0591]

[0592] 实施例18：经由途径B合成(RP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯
[(RP)-7at]

[0593] 粗(RP)-7at如实施例17所述使用1a替代1t生成。

[0594] 实施例19：经由途径B合成(RP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯
[(RP)-7ct]

[0595] 粗(RP)-7ct如在实施例17中所述使用1c替代1t生成。

[0596] 实施例20：经由途径B合成(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸
酯[(RP)-7gt]

[0597] 粗(RP)-7gt如在实施例17中所述使用1g替代1t生成。

[0598] 实施例21：经由途径B合成(SP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸腺嘧啶-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯[(SP)-7tt]

[0599] 粗(SP)-7tt如在实施例17中所述使用(αS，2R)-6替代(αR，2S)-6作为手性试剂而生成。

[0600] 实施例22：经由途径B合成(SP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧腺苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯
[(SP)-7at]

[0601] 粗(SP)-7at如在实施例17中所述使用化合物1a和(αS，2R)-6替代(αR，2S)-6作为手性试剂而生成。

[0602] 实施例23：经由途径B合成(SP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧胞苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸酯
[(SP)-7ct]

[0603] 粗(SP)-7ct如在实施例17中所述使用化合物1c和(αS，2R)-6替代(αR，2S)-6作为手性试剂而生成。

[0604] 实施例24：经由途径B合成(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)脱氧鸟苷-3′-基3′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸腺嘧啶-5′-基H-膦酸
酯[(SP)-7gt]

[0605] 粗(SP)-7gt如在实施例17中所述使用化合物1g替代1t以及化合物(αR，2S)-6替代化合物(αR，2S)-6作为手性试剂而生成。

[0606] 实施例25：修饰以产生(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5tt]，如在通用路线13中所示

[0607] (SP)-7tt通过与干燥吡啶和干燥甲苯反复的共蒸发干燥，并且然后溶解CH3CN(1毫升)。加入N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA；100微升)。1分钟后，加入N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120微摩尔)。在另外3分钟后，在减压下浓缩混合物至干燥以生成粗(RP)-4tt。然后粗(RP)-4tt溶解于三乙胺三氢氟酸盐(1mL)中。混合物在室温下搅拌15小时。然后0.1M乙酸铵缓冲液(5毫升)加入至混合物中，并且混合物用Et2O(3×5毫
升)清洗。合并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(5毫升)反萃取。然后在减压下浓缩合并
的水层至干燥，并且残留物用反相柱色谱纯化[在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-10％
乙腈的线性梯度]以得到(RP)-5tt。修饰步骤显示于路线13中。

[0608] 路线13.磷的修饰以引入硫。

[0609]

[0610] 实施例26：修饰以产生(RP)-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5at]。

[0611] (RP)-5at如在实施例25中所述使用(SP)-7at替代(SP)-7tt生成。

[0612] 实施例27：修饰以产生(RP)-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5ct]。

[0613] (RP)-5ct如在实施例25中所述使用(SP)-7ct替代(SP)-7tt生成。

[0614] 实施例28：修饰以产生(RP)-脱氧鸟苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5gt]。

[0615] (RP)-5gt如在实施例25中所述使用(SP)-7gt替代(SP)-7tt生成。

[0616] 实施例29：修饰以产生(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]。

[0617] (SP)-5tt如在实施例25中所述使用(RP)-7tt替代(SP)-7tt生成。

[0618] 实施例30：修饰以产生(SP)-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5at]。

[0619] (SP)-5at如在实施例25中所述使用(RP)-7at替代(SP)-7tt生成。

[0620] 实施例31：修饰以产生(SP)-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5ct]。

[0621] (SP)-5at如在实施例25中所述使用(RP)-7ct替代(SP)-7tt生成。

[0622] 实施例32：修饰以产生(SP)-脱氧鸟苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5gt]。

[0623] (SP)-5gt如在实施例25中所述使用(RP)-7gt替代(SP)-7tt生成。

[0624] 实施例33：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)
尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯
[(SP)-10uu]

[0625] 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基膦酸酯(8u)(100微摩尔)通过与干
燥吡啶反复的共蒸发干燥，并且然后溶解于干燥的吡啶中(1毫升)。加入N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl；500微摩尔)并且搅拌混合物5分钟。经由注射器逐
滴向混合物中加入氨基醇(L-2)(100微摩尔)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥
并且溶解于干燥的吡啶中(1毫升)，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。2′，3′-O-双(叔
丁基二甲基甲硅烷基)尿苷9u通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并且溶解于100微摩尔
吡啶中。然后以上混合物经由插管加入至2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷
9u(100微摩尔)溶液中。10分钟后，加入N-三氟乙酰咪唑(CF3COIm；200微摩尔)。在另外
30秒后，加入N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120微摩尔)。在另外3分钟后，真空干燥混合物。向残留物中加入浓缩的NH3-EtOH(3∶1，v/v，10毫升)，并且搅拌混合物12小时，而且在减压下浓缩至干燥。然后，混合物用CHCl3(5毫升)稀释，并且用0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0，5mL)清洗。水层用CHCl3(2×5毫升)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥。残留物用PTLC纯化。产物溶解于CHCl3(5毫升)中，用0.2M
1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯碳酸氢盐缓冲液(5mL)清洗并且用CHCl3(2×5毫
升)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩至干燥以生成(SP)-10uu。合成路线显示于路线14。

[0626] 路线14.路线5中RNA类似物的合成(途径A)。

[0627]

[0628] 实施例34：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基
甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷
酸酯[(SP)-10au]

[0629] (SP)-10au如在实施例33中所述使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺
苷-3′-基膦酸酯(8a)替代8u生成。

[0630] 实施例35：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基
甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷
酸酯[(SP)-10cu]

[0631] (SP)-10cu如在实施例33中所述使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞
苷-3′-基膦酸酯(8c)替代8u生成。

[0632] 实施例36：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(SP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二
甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫
代磷酸酯[(SP)-10gu]

[0633] (SP)-10gu如在实施例33中所述使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)
鸟苷-3′-基膦酸酯(8g)替代8u生成。

[0634] 实施例37：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)
尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷酸酯
[(RP)-10uu]

[0635] (Rp)-10uu如在实施例33中所述使用手性试剂D-2替代手性试剂L-2生成。

[0636] 实施例38：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基
甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷
酸酯[(RP)-10au]

[0637] (RP)-10au如在实施例33中所述使用8a替代8u以及手性试剂D-2替代手性试剂L-2生成。

[0638] 实施例39：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基
甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫代磷
酸酯[(RP)-10cu]

[0639] (RP)-10cu如在实施例33中所述使用8c替代8u以及手性试剂D-2替代手性试剂L-2生成。

[0640] 实施例40：经由途径A合成RNA类似物二聚体，(RP)-1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二
甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基硫
代磷酸酯[(RP)-10gu]

[0641] (RP)-10gu如在实施例33中所述使用8g替代8u以及手性试剂D-2替代手性试剂L-2生成。

[0642] 实施例41：脱保护以形成(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11uu]。

[0643] (SP)-10uu(50微摩尔)通过与干燥吡啶和干燥甲苯反复的共蒸发干燥，并且然后溶解于1M氟化四丁铵(TBAF)的干燥THF(500μL)溶液中。混合物在室温下搅拌12小
时。0.05M三乙基乙酸铵缓冲溶液(pH 6.9，2.5毫升)加入至混合物中，并且混合物用
Et2O(3×3毫升)清洗。合并的有机层用0.05M三乙基乙酸铵缓冲液(3毫升)反萃取。合
并的有机层用0.1M乙酸铵缓冲液(3毫升)反萃取。然后在减压下浓缩合并的水层至干
燥，并且残留物用反相柱色谱纯化[在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH 6.9)中0-10％乙腈
的线性梯度]以得到(SP)-11uu。脱保护路线显示于路线15中。

[0644] 路线15.路线5中的脱保护(途径A)。

[0645]

[0646] 实施例42：脱保护以形成(SP)-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11au]。

[0647] (SP)-11au如在实施例41中所述使用(SP)-10au替代(SP)-10uu生成。

[0648] 实施例43：脱保护以形成(SP)-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11cu]。

[0649] (SP)-11cu如在实施例41中所述使用(SP)-10cu替代(SP)-10uu生成。

[0650] 实施例44：脱保护以形成(SP)-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11gu]。

[0651] (SP)-11gu如在实施例41中所述使用(SP)-10gu替代(SP)-10uu生成。

[0652] 实施例45：脱保护以形成(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11uu]。

[0653] (RP)-11uu如在实施例41中所述使用(RP)-10uu替代(SP)-10uu生成。

[0654] 实施例46：脱保护以形成(RP)-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11au]。

[0655] (RP)-11au如在实施例41中所述使用(RP)-10au替代(SP)-10uu生成。

[0656] 实施例47：脱保护以形成(RP)-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11cu]。

[0657] (RP)-11cu如在实施例41中所述使用(RP)-10cu替代(SP)-10uu生成。

[0658] 实施例48：脱保护以形成(RP)-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11gu]。

[0659] (RP)-11gu如在实施例41中所述使用(RP)-10gu替代(SP)-10uu生成。

[0660] 实施例49：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(RP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲
硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12uu]。

[0661] 8u(100微摩尔)通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥，并且然后溶解于干燥的吡啶(1毫升)中。加入N，N’-双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BopCl；500微摩尔)，并且搅拌混合物5分钟。经由注射器逐滴向混合物中加入氨基醇((αR，2S)-6)(100微摩尔)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并且溶解于干燥的吡啶中(1毫升)，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。然后混合物经由插管加入至9u(100微摩尔)溶液中，其通过与干
燥吡啶反复的共蒸发制备并且溶解于吡啶中。15分钟后，在减压下浓缩混合物。残留物用CH2Cl2(5毫升)稀释，并且用饱和的NaHCO3(3×5毫升)清洗。合并的水层用CH2Cl2(2×5
毫升)反萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至ca.1毫升。残留物经由注射器逐滴加入至0℃下搅拌的干燥的CH2Cl2(20毫升)中的1％三氟乙酸(TFA)溶
液中。在另外15分钟后，混合物用干燥的CH2Cl2(100毫升)中稀释，并且用饱和的NaHCO3水溶液(2×100mL)清洗。合并的水层用CH2Cl2(2×100毫升)反萃取。合并的有机层用
31
Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥以生成粗(Rp)-12uu，其由 P NMR分析。合成的路线显示于路线16中。

[0662] 路线16.经由路线6的RNA类似物的合成(途径B).

[0663]

[0664] 实施例50：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(RP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双
(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12au]

[0665] 粗(RP)-12au如实施例49所述使用8a替代8u生成。

[0666] 实施例51：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(RP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双
(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12cu]

[0667] 粗(RP)-12cu如实施例49所述使用8c替代8u生成。

[0668] 实施例52：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(RP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基
2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(RP)-12gu]

[0669] 粗(RP)-12gu如实施例49所述使用8g替代8u生成。

[0670] 实施例53：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(SP)-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-3′-基2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲
硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12uu]

[0671] 粗(SP)-12uu如实施例49所述使用手性试剂(αS，2R)-6替代手性试剂(αR，2S)-6生成。

[0672] 实施例54：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(SP)-6-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)腺苷-3′-基2′，3′-O-双
(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12au]

[0673] 粗(SP)-12au如实施例49所述使用8a替代8u并且手性试剂(αS，2R)-6替代手性试剂(αR，2S)-6生成。

[0674] 实施例55：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(SP)-4-N-苯甲酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胞苷-3′-基2′，3′-O-双
(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12cu]

[0675] 粗(SP)-12cu如实施例49所述使用8c替代8u并且手性试剂(αS，2R)-6替代手性试剂(αR，2S)-6生成。

[0676] 实施例56：经由途径B合成RNA类似物二聚体，(SP)-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)鸟苷-3′-基
2′，3′-O-双(叔丁基二甲基甲硅烷基)尿苷-5′-基H-膦酸酯[(SP)-12gu]

[0677] 粗(SP)-12gu如实施例49所述使用8g替代8u并且手性试剂(αS，2R)-6替代手性试剂(αR，2S)-6生成。

[0678] 实施例57：修饰以形成(RP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11uu].

[0679] (SP)-12uu通过与干燥吡啶和干燥甲苯反复的共蒸发干燥，并且然后溶解于CH3CN(1毫升)中。加入N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA；100微升)。1分钟后，加
入N，N’-二甲基秋兰姆二硫化物(DTD；120微摩尔)。在另外3分钟后，在减压下浓缩混合物至干燥以生成粗(RP)-10uu。然后粗(RP)-10uu溶解于在干燥THF(1毫升)中的1M氟化
四丁铵(TBAF)溶液。混合物在室温下搅拌12h。将0.05M三乙基乙酸铵缓冲溶液(pH6.9，
5毫升)加入至混合物中，并且用Et2O(3×5毫升)清洗混合物。合并的有机层用0.05M三
乙基乙酸铵缓冲液(5毫升)反萃取。然后合并的水层在减压下浓缩至干燥，并且残留物用反相柱色谱纯化[在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH 6.9)中0-10％乙腈的线性梯度]以得
到(RP)-11uu。修饰路线显示于路线17中。

[0680] 路线17.手性硫代磷酸酯的合成。

[0681]

[0682] 实施例58：修饰以形成(RP)-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11au]。

[0683] (RP)-11au如在实施例57所述使用(SP)-12au替代(SP)-12uu生成。

[0684] 实施例59：修饰以形成(RP)-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11cu]。

[0685] (RP)-11cu如在实施例57所述使用(RP)-12cu替代(SP)-12uu生成。

[0686] 实施例60：修饰以形成(RP)-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(RP)-11gu]。

[0687] (RP)-11gu如在实施例57所述使用(SP)-12gu替代(SP)-12uu生成。

[0688] 实施例61：修饰以形成(SP)-尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11uu]。

[0689] (SP)-11uu如在实施例57所述使用(RP)-12uu替代(SP)-12uu生成。

[0690] 实施例62：修饰以形成(SP)-腺苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11au]。

[0691] (SP)-11au如在实施例57所述使用(RP)-12au替代(SP)-12uu生成。

[0692] 实施例63：修饰以形成(SP)-胞苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11cu]。

[0693] (SP)-11cu如在实施例57所述使用(RP)-12cu替代(SP)-12uu生成。

[0694] 实施例64：修饰以形成(SP)-鸟苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯三乙基铵盐[(SP)-11gu]。

[0695] 以和(RP)-11uu相同的方式，(SP)-11gu如在实施例57所述使用(RP)-12gu替代(SP)-12uu生成。

[0696] 实施例65：经由路线5固相合成具有X-膦酸酯部分的DNA类似物(途径A)。

[0697] 通过丁二酰连接体的5′-O-(DMTr)胸腺嘧啶-负载的HCP或CPG树脂(0.5微摩尔)用于合成。链延长以重复表1中的步骤进行。在链延长后，5′-O-DMTr基团用在CH2Cl2中的3％DCA(3×5秒)处理除去，并且用CH2Cl2清洗。然后用25％NH3-吡啶(9∶1，v/v)
在55℃处理HCP或CPG树脂上的寡聚体15h以除去核碱基的手性助剂物和保护基团，并且
也从HCP或CPG树脂上释放寡聚体。HCP或CPG树脂通过过滤除去并且用H2O清洗。将滤
液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O中，用Et2O清洗，并且合并的清洗液用H2O反萃取。将合并的水层浓缩至干燥。分析产生的粗产物和/或用反相柱色谱纯化，以0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度在50℃下以0.5毫升/分钟的速率进行60分钟以
生成立体定向的X-膦酸酯DNA。

[0698] 表1.

[0699]

[0700]

[0701] *表1步骤3中预活化的单体的制备：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(DMTr)-2′-脱氧核糖核苷-3′-基膦酸酯通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥，并
且然后溶解在干燥的吡啶中。将BopCl加入至溶液中，并且搅拌混合物5分钟。经由注射
器逐滴向混合物中加入氨基醇(L-2或D-2)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并
且溶解于干燥的吡啶中，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。

[0702] 全-(Rp)-[TPS]9T(硫代磷酸酯)

[0703] 根据如上所述的典型的过程，在用RP-HPLC纯化十分之一的粗产物后，键合于HCP(0.5微摩尔)的 5′-O-(DMTr)胸腺嘧啶3 ′-O-丁二酸盐产生
全-(Rp)-[TPS]9T[1.52A260单位，17.7纳摩尔(35％)，基于7％减色效应的假设：UV(H2O)α最大267纳米，α最小236纳米]。＜4％的纯化的寡聚物通过与核酸酶P1在37℃孵化1小时而消化。

[0704] 实施例66：经由路线6固相合成具有X-膦酸酯部分的DNA类似物(途径B)。

[0705] 将通过丁二酰或乙二酰连接体的5′-O-(DMTr)胸腺嘧啶-负载的CPG树脂用含1％TFA的CH2Cl2(3×5秒)处理，以除去5′-O-DMTr基团，用CH2Cl2和干燥的吡啶清洗并
且在真空中干燥。链延长以重复下述步骤(a)和(b)形成。(a)在氩气中使用干燥的吡啶
*
中含有相应的预活化的单体 (0.2M)的溶液进行耦合反应(10分钟)。在缩合反应后，用干燥的吡啶和CH2Cl2清洗固体支持物。(b)除去5′-O-DMTr基团并且同时用含1％TFA的
CH2Cl2-Et3SiH(1∶1，v/v)处理手性助剂(3×5秒)，并且接着用CH2Cl2和干燥的吡啶清
洗。产生的树脂上的寡聚核苷H-膦酸酯如上所述转化为X-膦酸酯DNA。

[0706] * 预活化的单体的制备：1，8- 二氮杂双环 [5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(DMTr)-2′-脱氧核糖核苷-3′-基膦酸酯通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥，并
且然后溶解在干燥的吡啶中。将BopCl加入至溶液中，并且搅拌混合物5分钟。经由注射
器逐滴向混合物中加入氨基醇(L-6或D-6)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并
且溶解于干燥的吡啶中，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。

[0707] 硫代磷酸酯(X＝S-)。

[0708] 用含10重量％S8的CS2-吡啶-三乙基胺(35∶35∶1，v/v/v)在室温下处理如上获得的通过丁二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂3小时，并且接着用CS2、吡啶和CH3CN清洗。树脂用25％NH3水溶液在室温下处理超过12小时，并且用H2O清洗。
合并水溶液并且在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的硫代磷酸酯DNA。

[0709] 硼烷膦酸酯(X＝BH3-)。

[0710] 干燥的DMF、N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)和BH3·SMe2在室温下加入至如前获得的通过乙二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂中。在15分钟后，陆
续用DMF、CH3CN和CH3OH清洗树脂。树脂用在CH3OH中的饱和的NH3溶液在室温下处理12
小时，并且用CH3OH清洗。合并CH3OH溶液并且在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的硼烷膦酸酯DNA。

[0711] 羟甲基膦酸酯(X＝CH2OH)。

[0712] 用含0.1M三甲基氯硅烷(TMSCl)的吡啶-1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(1∶9，v/v)在室温下处理如前获得的通过乙二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂10分
钟，以及在室温下用气态甲醛处理30分钟，并且然后用NMP和CH3CN清洗。然后树脂用25％NH3水溶液在室温下处理12小时，并且用H2O清洗。合并的水溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的羟甲基膦酸酯DNA。

[0713] 氨基磷酸酯(X＝NH2)。

[0714] 用含饱和的NH3溶液的CCl4-1，4-二噁烷(4∶1，v/v)在0℃下处理如前获得的通过乙二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂30分钟，并且用1，4二噁烷清洗。
合并的有机溶液在减压下浓缩至干燥，用25％NH3水溶液在室温下处理12小时，并且用H2O清洗。合并的水溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的氨基磷酸酯DNA。

[0715] N-丙基氨基磷酸酯(X＝NHPr)。

[0716] 用CCl4-丙胺(9∶1，v/v)在室温下处理如上获得的通过乙二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂1小时，并且用CH3OH清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至
干燥，用25％NH3水溶液在室温下处理12小时，并且用H2O清洗。合并的水溶液在减压下
浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的N-丙基氨基磷酸酯DNA。

[0717] N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯[X＝NH(CH2)2NMe2]。

[0718] 用CCl4-2-二甲基氨基乙胺(9∶1，v/v)在室温下处理如上获得的通过乙二酰连接体的寡聚核苷H-膦酸酯负载的CPG树脂1小时，并且用CH3CN清洗。合并的有机溶液在
减压下浓缩至干燥，用25％NH3水溶液在室温下处理12小时，并且用H2O清洗。合并的水
溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC纯化以获得立体定向的N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯DNA。

[0719] 实施例67：全-(SP)-d[CSASGST](硫代磷酸酯)的合成。

[0720] 如上所述在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成相应的寡聚核苷H-膦酸酯，并用0.2M Beaucage试剂在BSA-CH3CN(1∶8，v/v)中的溶液在室温下处理30分钟，并且用CH3CN清洗树脂。然后树脂用25％NH3水溶液在室温下处理12小时，并且用H2O清洗。合并的水
溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。RP-HPLC
用在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在50℃下，用
0.5毫升/分钟的流速，使用μBondasphere5μm C18柱( 3.9毫米×150毫米)
(Waters)。

[0721] 实施例68：全-(RP)-d[CSASGST](硫代磷酸酯)的合成。

[0722] 如上所述在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成相应的寡聚核苷H-膦酸酯，并用0.2M Beaucage试剂在BSA-CH3CN(1∶8，v/v)中的溶液在室温下处理30分钟，并且树脂
用CH3CN清洗。用25％NH3水溶液(5毫升)在室温下处理树脂12小时，并且用H2O清洗。
合并的水溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。
RP-HPLC以在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在50℃
下，以0.5毫升/分钟的流速使用μBondasphere 5μm C18柱( 3.9毫米×150毫
米)(Waters)。

[0723] 实施例69：全-(SP)-[TS]9T(硫代磷酸酯)的合成。

[0724] 如上所述在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成相应的寡聚核苷H-膦酸酯，并用0.2M Beaucage试剂在BSA-CH3CN(1∶8，v/v)中的溶液在室温下处理30分钟，并且树脂用CH3CN清洗。用25％NH3水溶液(5毫升)在室温下处理CPG树脂24小时，并且用H2O清洗。
合并的水溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。
RP-HPLC以在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行80分钟，在30℃
下，以0.5毫升/分钟的流速，使用μBondasphere 5μm C18柱( 3.9毫米×150
毫米)(Waters)。

[0725] 实施例70：全(RP)-[TS]9T(硫代磷酸酯)的合成。

[0726] 如上所述在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成相应的寡聚核苷H-膦酸酯，并用0.2M Beaucage试剂在BSA-CH3CN(1∶8，v/v)中的溶液在室温下处理30分钟，并且树脂
用CH3CN清洗。用25％NH3水溶液(5毫升)在室温下处理树脂24小时，并且用H2O清洗。
合并的水溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。
RP-HPLC以在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行80分钟，在30℃
下，以0.5毫升/分钟的流速，使用μBondasphere 5μm C18柱( 3.9毫米×150
毫米)(Waters)。

[0727] 实施例71：全(RP)-[TB]3T(硼烷膦酸酯)的合成。

[0728] 如上所述相应的寡聚核苷H-膦酸酯在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成，并且用干燥的DMF(0.8毫升)、BSA(0.1毫升)和BH3·S(CH3)2(0.1毫升)的混合物在室温下处
理15分钟，并且陆续用DMF、CH3CN和CH3OH清洗树脂。树脂用在CH3OH中的饱和的NH3溶
液(5毫升)在室温下处理2小时，并且用CH3OH清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干
燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。RP-HPLC以在0.1M乙酸铵缓冲液
(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在30℃下，以0.5毫升/分钟的流速，使
用PEGASIL ODS5μm( 4.0毫米×150毫米)(Senshu Pak)。

[0729] 实施例72：全-(SP)-[TB]3T(硼烷膦酸酯)的合成。

[0730] 如上所述相应的寡聚核苷H-膦酸酯在CPG树脂上通过丁二酰连接体合成，并且用干燥的DMF(0.8毫升)、BSA(0.1毫升)和BH3·S(CH3)2(0.1毫升)的混合物在室温下处
理15分钟，并且陆续用DMF、CH3CN和CH3OH清洗树脂。树脂用在CH3OH中的饱和的NH3溶
液(5毫升)在室温下处理2小时，并且用CH3OH清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干
燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。RP-HPLC以在0.1M乙酸铵缓冲液
(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在30℃下，以0.5毫升/分钟的流速，使
用PEGASIL ODS5μm( 4.0毫米×150毫米)(Senshu Pak)。

[0731] 实施例73：全-(SP)-[TN]3T(N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯)的合成。

[0732] 如上所述相应的寡聚核苷H-膦酸酯在CPG树脂上通过乙二酰连接体合成，并且用CCl4-2-二甲基氨基乙胺(9∶1，v/v)在室温下处理1h，并且用CH3CN清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。RP-HPLC以在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在30℃下，
以0.5毫升/分钟的流速，使用PEGASIL ODS 5μm( 4.0毫米×150毫米)(Senshu
Pak)。

[0733] 实施例74：全-(RP)-[TN]3T(N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯)的合成。

[0734] 如上所述相应的寡聚核苷H-膦酸酯在CPG树脂上通过乙二酰连接体合成，并且用CCl4-2-二甲基氨基乙胺(9∶1，v/v)在室温下处理1h，并且用CH3CN清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干燥，并且残留物用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析和表征。RP-HPLC以在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中0-20％乙腈的线性梯度进行60分钟，在30℃下，
以0.5毫升/分钟的流速，使用PEGASIL ODS 5μm( 4.0毫米×150毫米)(Senshu
Pak)。

[0735] 实施例75：经由路线5的X-膦酸酯RNA的固相合成的通用方法(途径A).

[0736] 通过丁二酰连接体的5′-O-(DMTr)尿苷-负载的HCP或CPG树脂用于合成中。链延长以重复表2中的步骤进行。在链延长后，5′-O-DMTr基团通过用在CH2Cl2中的3％
DCA处理除去，并且陆续用CH2Cl2和EtOH清洗。然后用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/
v)在室温下处理树脂2h，并且以过滤除去。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀
释并且在室温下置于密封的烧瓶中48h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。
将含有需要的2′-O-TBS-保护的X-膦酸酯RNA的级分收集并且冻干。残留物用在干燥的
THF中的1M TBAF溶液在室温下处理24h。加入0.05M TEAA缓冲溶液(pH 6.9)，并且蒸发
除去THF。残留物用Sep-pak C18药筒(cartridge)去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体
定向的X-膦酸酯RNA。

[0737] 表2.

[0738]

[0739]

[0740] *表2步骤3中预活化的单体的制备：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(DMTr)-2′-O-(TBS)-核糖核苷-3′-基膦酸酯通过与干燥吡啶反复的共蒸发干
燥，并且然后溶解在干燥的吡啶中。将BopCl加入至溶液中，并且搅拌混合物5分钟。经由注射器逐滴向混合物中加入氨基醇(L-2或D-2)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干
燥并且溶解于干燥的吡啶中，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。

[0741] 实施例76：经由路线6固相合成X-膦酸酯RNA通用方法(途径B).

[0742] 合成H-膦酸酯RNA的方法。通过丁二酰或乙二酰连接体的5′-O-(DMTr)尿苷-负载的CPG树脂用CH2Cl2中的1％TFA(3×5秒)处理以除去5′-O-DMTr基团，用CH2Cl2和
干燥的吡啶清洗并在真空中干燥。链延长以重复以下步骤(a)和(b)进行。(a)在氩气中
*
使用干燥的吡啶中含有相应的预活化的单体 (0.2M)的溶液进行耦合反应(10分钟)。在
缩合反应后，用干燥的吡啶和CH2Cl2清洗固体支持物。(b)除去5′-O-DMTr基团并且同时用含1％TFA的CH2Cl2-Et3SiH(1∶1，v/v)(3×5秒)处理手性助剂，并且接着用CH2Cl2和
干燥的吡啶清洗。产生的树脂上的寡聚核苷H-膦酸酯如下所述转化为骨架修饰的RNA类
似物。

[0743] *预活化的单体的制备

[0744] 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5′-O-(DMTr)-2′-O-(TBS)-核糖核苷-3′-基膦酸酯通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥，并且然后溶解在干燥的吡啶中。将BopCl加入至溶液中，并且搅拌混合物5分钟。经由注射器逐滴向混合物中加入氨基醇(L-6或D-6)溶液，其通过与干燥吡啶反复的共蒸发干燥并且溶解于干燥的吡啶中，并且混合物在氩气中搅拌5分钟。

[0745] 硫代磷酸酯(X＝S-)。

[0746] 如上所述获得的负载到通过丁二酰连接体的CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯，在室温下用10wt％S8在CS2-吡啶-三乙基胺(35∶35∶1，v/v/v)中处理3h，并且陆续用CS2、吡啶和EtOH清洗。然后用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)在室温下处理树脂2h，并且通过过滤除去。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀释并且在室温下置于密封的烧瓶中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。将含有需要的2′-O-TBS-保护
的硫代磷酸酯RNA的级分收集并且冻干。残留物用干燥的THF中的1M TBAF溶液在室温下
处理24h。加入0.05M TEAA缓冲溶液(pH 6.9)，并且通过蒸发除去THF。残留物用Sep-pak C18药筒去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体定向的硫代磷酸酯RNA。

[0747] 硼烷膦酸酯(X＝BH3-)。

[0748] 在室温下将干燥的DMF、N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)和BH3·SMe2加入如上获得的通过乙二酰连接体的负载到CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯。15分钟后，陆
续用DMF、CH3CN和EtOH清洗树脂。然后用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)在室温下处
理树脂2h，并且以过滤除去。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀释，并且在室温下置于密封的烧瓶中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。将含有需要
的2′-O-TBS-保护的硼烷膦酸酯RNA的级分收集并且冻干。残留物用在干燥的THF中的
1M TBAF溶液在室温下处理24h。加入0.05M TEAA缓冲溶液(pH 6.9)，并且通过蒸发除去
THF。残留物以Sep-pak C18药筒去盐，并且以RP-HPLC纯化以提供立体定向的硼烷膦酸酯RNA。

[0749] 羟甲基膦酸酯(X＝CH20H)。

[0750] 如上获得的通过丁二酰连接体的负载到CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯，用含0.1M三甲基甲硅烷氯(TMSCl)的吡啶-1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(1∶9，v/v)在室温下处理10分钟，并且以气态甲醛在室温下处理30分钟，并且然后用NMP和EtOH清洗。然后用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)在室温下处理树脂2h，并且通过过滤除去。滤液用25％NH3
水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀释并且在室温下置于密封的烧瓶中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。将含有需要的2′-O-TBS-保护的羟甲基膦酸酯RNA的级分收
集并且冻干。残留物用含1M TBAF溶液的干燥的THF在室温下处理24h。加入0.05M TEAA
缓冲溶液(pH 6.9)，并且以蒸发除去THF。残留物用Sep-pak C18药筒去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体定向的羟甲基膦酸酯RNA。

[0751] 氨基磷酸酯(X＝NH2)。

[0752] 如上获得的通过乙二酰连接体的负载到CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯，用含饱和的NH3溶液的CCl4-1，4-二噁烷(4∶1，v/v)在0℃下处理30分钟，并且用1，4-二噁烷清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干燥。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀
释并且在室温下置于密封的烧瓶中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。
将含有需要的2′-O-TBS-保护的氨基磷酸酯RNA的级分收集并且冻干。残留物用含1M
TBAF溶液的干燥的THF在室温下处理24h。加入0.05MTEAA缓冲溶液(pH 6.9)，并且通过
蒸发除去THF。残留物用Sep-pak C18药筒去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体定向的氨基磷酸酯RNA。

[0753] N-丙基氨基磷酸酯(X＝NHPr)。

[0754] 如上获得通过乙二酰连接体的的负载到CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯，用CCl4-丙胺(9∶1，v/v)在室温下处理1h，并且用CH3OH清洗。合并的有机溶液在减压下浓缩至干燥。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀释并且在室温下置于密封的烧瓶
中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。将含有需要的2′-O-TBS-保护
的N-丙基氨基磷酸酯RNA的级分收集并且冻干。残留物用含1M TBAF溶液的干燥的THF
在室温下处理24h。加入0.05M TEAA缓冲溶液(pH6.9)，并且通过蒸发除去THF。残留物用Sep-pakC18药筒去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体定向的N-丙基氨基磷酸酯RNA。

[0755] N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯[X＝NH(CH2)2NMe2].

[0756] 如上获得的通过乙二酰连接体的负载到CPG树脂的寡聚核苷H-膦酸酯，用CCl4-2-二甲基氨基乙胺(9∶1，v/v)在室温下处理1h，并且用CH3CN清洗。合并的有机
溶液在减压下浓缩至干燥。滤液用25％NH3水溶液-EtOH(3∶1，v/v)稀释并且在室温下
置于密封的烧瓶中12h。溶液在减压下浓缩，并且残留物用RP-HPLC纯化。将含有需要的
2′-O-TBS-保护的N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯RNA的级分收集并且冻干。残
留物用含1M TBAF溶液的干燥的THF在室温下处理24h。加入0.05M TEAA缓冲溶液(pH
6.9)，并且通过蒸发除去THF。残留物用Sep-pakC18药筒去盐，并且用RP-HPLC纯化以提供立体定向的N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯RNA。

[0757] 实施例77：固相合成；预活化的单体溶液的制备的通用方法。

[0758] 合适的H-膦酸酯单酯通过与干燥吡啶和干燥的甲苯反复的共蒸发干燥，然后溶解于干燥的溶剂中。将缩合试剂逐滴加入溶液中，并且搅拌10分钟。然后加入氨基醇并且另外搅拌10分钟以产生预活化的单体溶液。

[0759] 实施例78：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]

[0760]3

[0761] 通过丁二酰连接体N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(16.4毫克；30.5微摩尔/克，0.5微摩尔)用3％DCA/DCM(3×1毫
升)处理，然后用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗。树脂在减压下干燥后
(＞5分钟)，加入预活化的单体溶液(250微升，25微摩尔；其由8-二氮杂双环[5.4.0]
3
十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦
酸酯(25微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-吡啶(9∶1，v/v，溶剂)、Ph3PCl2(62.5微摩
尔，缩合试剂)和L-2(30微摩尔，氨基醇)组成)。搅拌2分钟，除去反应溶液，并且用
MeCN(3×1mL)清洗树脂，并且在减压下干燥(＞5分钟)。对于修饰步骤，产生的在树脂上
的中间体通过用0.3MDTD/MeCN(500微升，150微摩尔)处理5分钟，然后用MeCN(3×1毫
升)和DCM(3×1毫升)清洗树脂。5′-O-DMTr基团通过用3％DCA/DCM(3×1毫升)处理
除去，并且用DCM(3×1毫升)清洗树脂。然后在55℃下用25％NH3(1毫升)处理树脂上
的硫代磷酸酯二聚体12小时以除去核碱基的手性助剂以及保护基团并且也从树脂上释放
二聚体。树脂通过过滤除去并且用H2O清洗。滤液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O(2毫
升)中，用Et2O(3×2毫升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫升)反萃取。合并的水层
浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，以含0-20％MeOH的0.1M乙酸铵缓冲液(pH
7.0)的线性梯度，15分钟，在55℃，以0.4毫升/分钟的速率。产物与由传统H-膦酸酯方
法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为97％(RP∶SP＝2∶98)。保留时间：13.4分
钟((RP)-5tt：12.3分钟)。通用路线显示于路线18中。UPLC分布显示于图5A中。在另
外的合成(SP)-5tt中，BTC(20微摩尔)替代Ph3PCl2(62.5微摩尔)使用。产物与由传统
H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为95％(RP∶SP＝3∶97)。保留
时间：13.5分钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分布显示于图5B。

[0762] 路线18：经由途径A的硫代磷酸酯二聚体的一般固相合成

[0763]

[0764] 实施例79：固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]。

[0765] 通过丁二酰连接体的N3-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(16.4mg；30.5微摩尔/g，0.5微摩尔)用3％DCA/DCM(3×1毫升)
处理，然后用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗。树脂在减压下干燥后(＞
5分钟)，加入预活化的单体溶液(200微升，25微摩尔；其由8-二氮杂双环[5.4.0]十一
碳-7-烯N3-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25
微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-CMP(9∶1，v/v，溶剂)、Ph3PCl2(62.5微摩尔，缩合试剂)和L-2(30微摩尔，氨基醇)组成)，继续加入5MCMPT/MeCN(50微升，250微摩尔，活化试剂)。
搅拌2分钟，除去反应溶液，并且用MeCN(3×1mL)清洗树脂，并且在减压下干燥(＞5分
钟)。产生的在树脂上的中间体通过用0.3MDTD/MeCN(500微升，150微摩尔)处理5分钟，
然后用MeCN(3×1毫升)和DCM(3×1毫升)清洗树脂。5′-O-DMTr基团通过用3％DCA/
DCM(3×1毫升)处理除去，并且用DCM(3×1毫升)清洗。然后在55℃下用25％NH3(1毫
升)处理树脂上的硫代磷酸酯二聚体12小时以除去核碱基的手性助剂以及保护基团并且
也从树脂上释放二聚体。树脂以过滤除去并且用H2O清洗。滤液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫升)反萃取。
合并的水层浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，以含0-20％MeOH的0.1M乙酸铵
缓冲液(pH 7.0)的线性梯度，15分钟，在55℃，以0.4毫升/分钟的速率。产物与由传统
H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为98％(RP∶SP＝1∶99)。保留
时间：13.5分钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分布显示于图6A中。该化合物也通过所述
的相似的方式使用“BTC(16微摩尔)和L-2(26微摩尔)”替代“Ph3PCl2(62.5微摩尔)和
L-2(30微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的
产率为95％(RP∶SP＝1∶99)。保留时间：13.5分钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分
布显示于图6B。

[0766] 实施例80：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5tt]

[0767] 该化合物通过与“实施例78”相似的方法通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5tt的产率为98％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：12.2分钟((SP)-5tt：13.5分钟)。UPLC分布显示于
图7A中。在另外的(RP)-5tt合成中，BTC(20微摩尔)替代Ph3PCl2(62.5微摩尔)使用。
产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5tt的产率为97％(RP∶SP＝
95∶5)。保留时间：12.3分钟((SP)-5tt：13.6分钟)。UPLC分布显示于图7B中。

[0768] 实施例81：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5tt]

[0769] 该化合物通过与“实施例79”相似的方法通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5tt的产率为98％(RP∶SP＝98∶2)。保留时间：12.3分钟((SP)-5tt：13.6分钟)。UPLC分布显示于
图8中。

[0770] 实施例82：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5ct]。

[0771]

[0772] 该化合物通过与实施例78相似的方法通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧胞苷-3′-基膦
酸酯(25微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N3-苯甲酰基-5′-O-(4，
4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”获得。产物与由传统
H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5ct的产率为98％(RP∶SP＝3∶97)。保留
时间：9.7分钟((RP)-5ct：8.7分钟)。UPLC分布显示于图9A。该化合物也如所述的通过
使用“BTC(16微摩尔)和L-2(26微摩尔)”替代“Ph3PCl2(62.5微摩尔)和L-2(30微摩
尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5ct的产率为94％
(RP∶SP＝3∶97)。保留时间：9.7分钟((RP)-5ct：8.7分钟)。UPLC分布显示于图9B。

[0773] 实施例83：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-2′-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5ct]

[0774] 该化合物通过与实施例82的实验相似的方法通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”生成，图9A。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5ct的产率为98％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：8.6分钟((SP)-5ct：9.7分钟)。UPLC分布
显示于图10A。该化合物也通过与实施例82中图9B相似的方式使用“D-2(30微摩尔)”替
代“L-2(30微摩尔)”获得。(RP)-5ct的产率为87％(RP∶SP＝98∶2)。保留时间：8.6
分钟((SP)-5ct：9.8分钟)。UPLC分布显示于图10B中。

[0775] 实施例84：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5at]。

[0776]

[0777] 该化合物通过与实施例78相似的方法通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N，N-二苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺
3
苷-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰
基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”获得。
产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5at的产率为96％(RP∶SP＝
1∶99)。保留时间：14.0分钟((RP)-5at：12.6分钟)。UPLC分布显示于图11中。

[0778] 实施例85：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-2′-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5at]

[0779] 该化合物通过与实施例83相似的方法通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”生成。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5at的产率为96％(RP∶SP＝96∶4)。保留时间：12.5分钟((SP)-5at：14.1分钟)。UPLC分布显示于
图12中。

[0780] 实施例86：经由途径A固相合成成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧鸟嘌呤-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5gt]

[0781]

[0782] 该化合物通过与实施例78相似的方法通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一6
碳-7-烯O-氰基乙基-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱
3
氧鸟嘌呤-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯
甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”生
成。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5gt的产率为96％(RP∶SP
＝2∶98)。保留时间：11.5分钟((RP)-5gt：10.3分钟)。UPLC分布显示于图13中。

[0783] 实施例87：经由途径A固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-氨基2′-脱氧鸟嘌呤-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯[(RP)-5gt]

[0784] 该化合物通过与实施例86相似的方法通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”生成。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5gt的产率为96％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：10.3分钟((SP)-5gt：11.6分钟)。UPLC分布显示于
图14中。

[0785] 实施例88：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]

[0786]3

[0787] 通过丁二酰连接体的N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(16.4mg；30.5微摩尔/g，0.5微摩尔)用1％TFA/DCM(3×1毫升)
处理以除去5′-O-DMTr基团，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在
真空中干燥。加入预活化的单体溶液(200微升，50微摩尔；其由8-二氮杂双环[5.4.0]
3
十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸
酯(50微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-CMP(9∶1，v/v，溶剂)、Ph3PCl2(125微摩尔，缩合试剂)和L-6(52微摩尔，氨基醇)组成)，随后加入5MCMPT/MeCN(50μL，250微摩尔)。搅拌
2分钟，除去反应溶液，并且用MeCN(3×1毫升)、DCM(3×1毫升)清洗树脂，并且在减压下
干燥(＞5分钟)。5′-O-DMTr基团和手性助剂用1％TFA的DCM(3×1毫升)处理而同时
除去，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在真空中干燥。产生的在树
脂上的中间体通过用0.2M Beaucage试剂/MeCN(200微升，40微摩尔)和BSA(25μl，100
微摩尔)的混合溶液处理20分钟硫化，然后用MeCN(3×1mL)清洗树脂。然后在室温下用
25％NH3-EtOH(2毫升，4∶1，v/v)处理树脂上的硫代磷酸酯12小时以除去核碱基的保护基团并且也从树脂上释放二聚体。树脂以通过滤除去并且用H2O清洗。滤液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫升)
反萃取。合并的水层浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，用含0-20％MeOH的0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)的线性梯度，15分钟，在55℃用0.4毫升/分钟的速率。产物与由
传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为96％(RP∶SP＝4∶96)。
保留时间：13.5分钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分布显示于图15A中。

[0788] 在可选的合成中，该化合物也用所述相似的方式通过使用“BTC(32微摩尔)”替代“Ph3PCl2(125微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为96％(RP∶SP＝5∶95)。保留时间：13.4分钟((RP)-5tt：12.3分钟)。UPLC分布显示于图15B中。

[0789] 实施例89：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5tt]

[0790] 在另一可选的合成中，[(SP)-5tt]通过与实施例88图15A中相似的方式使用3
“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)
胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)、BTC(16微摩尔)以及L-6(26微摩尔))”替代“8-二
3
氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺
嘧啶-3′-基膦酸酯(50微摩尔)、Ph3PCl2(125微摩尔)和L-6(52微摩尔)”获得。通用
的路线显示于路线19中。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的
产率为93％(RP∶SP＝6∶94)。保留时间：13.5分钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分布
显示于图16A中。该化合物以如所述相似的方式使用“0.2MDTD/MeCN(200μl，80微摩尔)”替代“0.2M Beaucage试剂/MeCN(200μL，40微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方
法合成的对照样品一致。(SP)-5tt的产率为95％(RP∶SP＝6∶94)。保留时间：13.5分
钟((RP)-5tt：12.4分钟)。UPLC分布显示于图16B中。

[0791] 路线19

[0792]

[0793] 实施例90：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5tt]

[0794] 该化合物通过与图15A实施例88的方法相似的方式使用“D-6(52微摩尔)”替代“L-6(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5tt的产率为95％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：12.3分钟((SP)-5tt：13.6分钟)。UPLC分
布显示于图17A中。

[0795] 该化合物通过与图15B实施例88的方法相似的方式使用“D-6(52微摩尔)”替代“L-6(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5tt的产率为94％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：12.3分钟(SP)-5tt：13.6分钟)。UPLC分布
显示于图17B中。

[0796] 实施例91：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5ct]

[0797]

[0798] 该化合物通过与实施例88相似的方式使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯4-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧胞苷-3′-基膦酸酯(50
3
微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲
氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方
法合成的对照样品一致。(SP)-5ct的产率为95％(RP∶SP＝4∶96)。保留时间：9.7分
钟((RP)-5ct：8.7分钟)。UPLC分布显示于图18中。

[0799] 实施例92：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-2′-脱氧胞苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5ct]

[0800] 该化合物通过与实施例91相似的方式使用“D-6(52微摩尔)”替代“L-6(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5ct的产率为96％(RP∶SP＝97∶3)。保留时间：8.6分钟((SP)-5ct：9.8分钟)。UPLC分布显示于图19
中。

[0801] 实施例93：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5at]

[0802]

[0803] 该化合物通过与实施例88相似的方式使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N，N-di苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷-3′-基膦酸
3
酯(50微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，
4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”获得。产物与由传统
H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5at的产率为95％，RP∶SP＝5∶95。保留时
间：14.0分钟((RP)-5at：12.5分钟)。UPLC分布显示于图20A中。

[0804] 该化合物也通过与图20A该实施例中所述方法相似的方式通过使用“BTC(32微摩尔)”替代“Ph3PCl2(125微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5at的产率为94％(RP∶SP＝5∶95)。保留时间：13.9分钟((RP)-5at：12.5分钟)。UPLC分布显示于图20B中。

[0805] 实施例94：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5at]

[0806] 该化合物通过与实施例88相似的方式通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯6-N-((二甲基氨基)亚甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧
3
腺苷-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲
酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”获
得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5at的产率为91％，RP∶SP
＝5∶95。保留时间：13.9分钟((RP)-5at：12.5分钟)。UPLC分布显示于图21中。

[0807] 实施例95：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-2′-脱氧腺苷-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5at]

[0808] 该化合物通过与图20A实施例93中方法相似的方式通过使用“D-6(52微摩尔)”替代“L-6(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5at的产率为96％产率，RP∶SP＝97∶3.保留时间：12.5分钟((SP)-5at：14.0分钟)。UPLC
分布显示于图22A中。

[0809] 该化合物通过与图20B实施例93中方法相似的方式通过使用“D-6(52微摩尔)”替代“L-6(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5at的产率为94％(RP∶SP＝95∶5)。保留时间：12.4分钟((RP)-5at：14.0分钟)。UPLC分
布显示于图22B中。

[0810] 实施例96：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(SP)-2′-脱氧鸟嘌呤-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-5gt]

[0811] 该化合物通过与实施例88相似的方式通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一6
碳-7-烯O-氰基乙基-2-N-苯氧基乙酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱
3
氧鸟嘌呤-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯
甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(50微摩尔)”获
得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-5gt的产率为95％(RP∶SP
＝6∶94)。保留时间：11.5分钟((RP)-5gt：10.3分钟)。UPLC分布显示于图23中。

[0812] 实施例97：经由途径B固相合成硫代磷酸酯二聚体，(RP)-2′-脱氧鸟嘌呤-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-5gt]

[0813] 该化合物通过与实施例96相似的方式通过使用“D-2(52微摩尔)”替代“L-2(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-5gt的产率为95％(RP∶SP＝94∶6)。保留时间：10.3分钟((SP)-5gt：11.6分钟)。UPLC分布显示于
图24。

[0814] 实施例98：经由途径B固相合成硼烷膦酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硼烷膦酸酯铵盐[(SP)-7tt]

[0815]

[0816] 通过丁二酰连接体的N3-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(16.4mg；30.5微摩尔/g，0.5微摩尔)用1％TFA/DCM(3×1毫升)
处理以除去5′-O-DMTr基团，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在
真空中干燥。加入预活化的单体溶液(200微升，50微摩尔；其由8-二氮杂双环[5.4.0]
十一碳-7-烯N3-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸
酯(50微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-CMP(9∶1，v/v，溶剂)、BTC(32微摩尔，缩合试剂)和D-6(52微摩尔，氨基醇)组成)随后加入5M CMPT/MeCN(50μL，250微摩尔)。搅拌2分
钟，除去反应溶液，并且用MeCN(3×1毫升)、DCM(3×1毫升)清洗树脂，并且在减压下干燥(＞5分钟)。5′-O-DMTr基团和手性助剂用1％TFA的DCM(3×1毫升)处理而同时除
去，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在真空中干燥。产生的在树脂
上的中间体通过用BH3·SMe2-BSA-DMAc(1毫升，1∶1∶8，v/v/v)的混合物处理15分钟
硼酸化，然后树脂用DMAc(3×1毫升)、MeCN(3×1毫升)和MeOH(3×1毫升)清洗。然后
用2M NH3/EtOH(2毫升)在室温下处理树脂上硼烷膦酸酯二聚体12小时以除去核碱基的
保护基团并且从树脂上释放二聚体。树脂通过过滤除去并且用MeOH清洗。滤液浓缩至干
燥。将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2
毫升)反萃取。合并的水层浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，用含0-15％MeCN
的0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)的线性梯度，15分钟，在60℃以0.5毫升/分钟的速率。产
物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(SP)-7tt的产率通过在260nm下的UV吸
收测量、用天然TT二聚体的摩尔消光系数近似值(16800)而确定。(SP)-7tt的产率为89％(RP∶SP＝4∶96)。保留时间：9.6分钟((RP)-7tt：9.8分钟)。UPLC分布显示于图25
中。

[0817] 实施例99：经由途径B固相合成硼烷膦酸酯二聚体，(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基硼烷膦酸酯铵盐[(RP)-7tt]

[0818] 该化合物通过与实施例98相似的方式通过使用“L-2(52微摩尔)”替代“D-2(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-7tt的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然TT二聚体的摩尔消光系数近似值(16800)而确定。
(RP)-7tt的产率为90％产率，RP∶SP＝95∶5。保留时间：9.8分钟((SP)-7tt：9.7分
钟).UPLC分布显示于图26中。

[0819] 实施例100：经由途径B固相合成N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯二聚体，(SP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯
[(SP)-8tt]

[0820]3

[0821] 通过丁二酰连接体的N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(16.4mg；30.5微摩尔/g，0.5微摩尔)用1％TFA/DCM(3×1毫升)
处理以除去5′-O-DMTr基团，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在
在真空中干燥。加入预活化的单体溶液(200μL，50微摩尔；其由8-二氮杂双环[5.4.0]
3
十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸
酯(50微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-CMP(9∶1，v/v，溶剂)、BTC(32微摩尔，缩合试剂)和L-6(52微摩尔，氨基醇)组成)，随后加入5MCMPT/MeCN(50μL，250微摩尔)。搅拌2分
钟，除去反应溶液，并且用MeCN(3×1毫升)、DCM(3×1毫升)清洗树脂，并且在减压下干
燥(＞5分钟)。5′-O-DMTr基团和手性助剂用1％TFA的DCM(3×1毫升)处理而同时
除去，用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗并且在真空中干燥。产生的在
树脂上的中间体通过用CCl4-Me2N(CH2)2NH2(1mL，1∶9，v/v)处理30分钟酰氨化，然后用DCM(3×1毫升)清洗树脂。然后在室温下用2M NH3/EtOH(2毫升)处理树脂上的氨基磷酸
酯二聚体12小时以除去核碱基的保护基团并且也从树脂上释放二聚体。树脂通过过滤除
去并且用MeOH清洗。滤液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫
升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫升)反萃取。合并的水层浓缩干燥。产生的粗产
物用反相UPLC 分析，用含0-20％MeOH的0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)的线性梯度，15分
钟，在55℃以0.4毫升/分钟的速率。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。
(SP)-8tt的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然的TT二聚体的摩尔消光系数近似
值(16800)而确定。(SP)-8tt的产率为90％(RP∶SP＝6∶94)。保留时间：10.3分钟
((RP)-8tt：9.6分钟)。UPLC分布显示于图27中。

[0822] 实施例101：经由途径B固相合成N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯二聚体，(RP)-胸腺嘧啶-3′-基胸腺嘧啶-5′-基N-[(2-二甲基氨基)乙基]氨基磷酸酯
[(RP)-8tt]

[0823] 该化合物通过与实施例100相似的方式通过使用“D-2(52微摩尔)”替代“L-2(52微摩尔)”获得。产物与由传统H-膦酸酯方法合成的对照样品一致。(RP)-8tt的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然TT二聚体的摩尔消光系数近似值(16800)而确定。
(RP)-8tt的产率为86％，RP∶SP＝96∶4。保留时间：9.6分钟((SP)-8tt：10.3分钟)。
UPLC分布显示于图28中。

[0824] 实施例102：经由途径A固相合成硫代磷酸酯四聚体，全-(SP)-[TPS]3T(硫代磷酸酯)

[0825] 通过丁二酰连接体的5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-负载的HCP树脂(0.5微摩尔)用于合成中。重复表3中步骤进行链延长。在链延长后，5′-O-DMTr
基团用3％DCA/DCM(3×1毫升)处理除去并且用DCM(3×1毫升)清洗。然后树脂上的
硫代磷酸酯四聚体在55℃下用25％NH3处理12小时以除去手性助剂和核碱基的保护基
团，并且也从树脂上释放四聚体。通过过滤除去树脂并且用H2O清洗。滤液浓缩至干燥。
将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫升)清洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫
升)反萃取。合并的水层浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，用含0-30％MeOH
的0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)的线性梯度，15分钟，在55℃以0.4毫升/分钟的速率。产
物与由传统氨基磷酸酯方法合成的对照样品一致。产物的产率通过在260nm下的UV吸收
测量、用天然T4四聚体的摩尔消光系数近似值(33000)而确定。平均的耦合产率为96％，光学纯度为96％(平均值：99％)。保留时间：23.0分钟；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为
-
C40H52N8O23P3S3[M-H]1201.15，实测为1200.97。UPLC分布显示于图29中。

[0826] 表3.

[0827]*

[0828] “预活化的(RP)-或(SP)-单体溶液”的制备3

[0829] 8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)通过与干燥吡啶和干燥的甲苯反复的共
蒸发干燥，然后溶解于干燥的MeCN-CMP(9∶1，v/v)中。向溶液中加入Ph3PCl2(62.5微摩尔)，并且搅拌10分钟。然后将L-2(30微摩尔；D-2用于“SP”溶液)加入并且搅拌另外的
10分钟以产生预活化的单体溶液。

[0830] 实施例103：经由途径A固相合成硫代磷酸酯四聚体，(SP，RP，SP)-[TPS]3T(硫代磷酸酯)

[0831] 该化合物通过与实施例102中与全-(SP)-[TPS]3T相似的方式获得。产物的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然T4四聚体的摩尔消光系数近似值(33000)而
确定。产物与由传统氨基磷酸酯方法合成的对照样品一致。平均的耦合产率为96％，光
学纯度为94％(平均值：98％)。保留时间：22.3分钟；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为
-
C40H52N8O23P3S3[M-H] 1201.15，实测为1200.97。UPLC分布显示于图30中。

[0832] 实施例104：经由途径A固相合成硫代磷酸酯四聚体，(RP，SP，RP)-[TPS]3T(硫代磷酸酯)

[0833] 该化合物通过与实施例102中与全-(SP)-[TPS]3T相似的方式获得。产物的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然T4四聚体的摩尔消光系数近似值(33000)而
确定。产物与由传统氨基磷酸酯方法合成的对照样品一致。平均的耦合产率为97％，
光学纯度为96％(平均值：99％).保留时间：21.7分钟；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为
-
C40H52N8O23P3S3[M-H]1201.15，实测为1200.96。UPLC分布显示于图31中。

[0834] 实施例105：经由途径A固相合成硫代磷酸酯四聚体，全-(RP)-[TPS]3T(硫代磷酸酯)

[0835] 该化合物通过与全-(SP)-[TPS]3T相似的方式获得。产物的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然T4四聚体的摩尔消光系数近似值(33000)而确定。产物与由传统氨基磷酸酯方法合成的对照样品一致。平均的耦合产率为95％，光学纯度为92％(平均值：
-
97％)。保留时间：19.1分钟；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为C40H52N8O23P3S3[M-H]1201.15，实测1200.92。UPLC分布显示于图32中。

[0836] 实施例106：经由途径A固相合成RNA硫代磷酸酯四聚体，(SP)-氨基2′-O-甲基尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-9uMu]

[0837]3

[0838] 通过丁二酰连接体的2′-O-乙酰基-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)尿苷-负载的CPG树脂(21.4毫克；23.4微摩尔/克，0.5微摩尔)用3％DCA/
DCM(3×1毫升)处理，然后用DCM(3×1毫升)和干燥的MeCN(3×1毫升)清洗。在树脂在
减压下干燥后(＞5分钟)，加入预活化的单体溶液(250μL，25微摩尔；其由8-二氮杂双
3
环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-O-甲
基尿苷-3′-基膦酸酯(25微摩尔，H-膦酸酯单酯)、MeCN-吡啶(9∶1，v/v，溶剂)、
Ph3PCl2(62.5微摩尔，缩合试剂)和L-2(30微摩尔，氨基醇)组成)。搅拌5分钟，除去反应溶液，并且用MeCN(3×1毫升)清洗，在减压下干燥(＞5分钟)。产生的中间体通过用0.3M DTD/MeCN(500微升，150微摩尔)处理5分钟硫化，然后用MeCN(3×1毫升)和DCM(3×1毫
升)清洗。5′-O-DMTr基团通过用3％DCA/DCM(3×1毫升)处理除去，并且用DCM(3×1
毫升)清洗。然后树脂上的硫代磷酸酯二聚体用25％NH3(1毫升)在55℃下处理12小时
以除去手性助剂和核碱基的保护基团并且也从树脂上释放二聚体。树脂通过过滤除去并
且用H2O清洗。滤液浓缩至干燥。将残留物溶解于H2O(2毫升)中，用Et2O(3×2毫升)清
洗，并且合并的清洗液用H2O(2毫升)反萃取。合并的水层浓缩干燥。产生的粗产物用反相UPLC 分析，用含0-20％MeOH的0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)的线性梯度，15分钟，在55℃
以0.4毫升/分钟的速率。(SP)-9uMu的产率为95％(RP∶SP＝2∶98)。保留时间：10.2
-
分钟((RP)-9uMu：9.3分钟)；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为C19H24N4O13PS[M-H]579.08，实测
578.92。UPLC分布显示于图33中。

[0839] 实施例107：经由途径A固相合成RNA硫代磷酸酯四聚体，(RP)-2′-O-甲基尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-9uMu]

[0840] 该化合物通过与实施例106相似的方式通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”获得。(RP)-9uMu的产率为94％(RP∶SP＝95∶5)。保留时间：9.3分钟-
((SP)-9uMu：10.3分钟)；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为C19H24N4O13PS[M-H]579.08，实测
578.97。UPLC分布显示于图34中。

[0841] 实施例108：经由途径A固相合成RNA硫代磷酸酯四聚体，(SP)-2′-脱氧-2′-氟尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-10uFu]

[0842]

[0843] 该化合物通过与实施例106相似的方式通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一3
碳-7-烯N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-2′-氟尿
3
苷-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰
基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-O-甲基尿苷-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”
获得。(SP)-10uFu的产率为93％(RP∶SP＝1∶99)。保留时间：10.6分钟((RP)-10uFu：
-
8.5分钟)；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为C18H21FN4O12PS[M-H]567.06，实测566.96。UPLC分布显示于图35中。

[0844] 实施例109：经由途径A固相合成RNA硫代磷酸酯四聚体，(RP)-2′-脱氧-2′-氟尿苷-3′-基尿苷-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-10uFu]

[0845] 该化合物通过与实施例108相似的方式通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”获得。(RP)-10uFu的产率为92％，RP∶SP＝96∶4。保留时间：8.4分钟-
((SP)-10uFu：10.7分钟)；MS(MALDI TOF-MS)m/z计算为C18H21FN4O12PS[M-H]567.06，实测
566.97。UPLC分布显示于图36中。

[0846] 实施例110：经由途径A溶液法合成非天然核碱基(SP)-1-(3-硝基吡咯-1-基)-2-脱氧呋喃核糖-3-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(SP)-11nt]

[0847]

[0848] 该化合物通过与实施例78相似的方式通过使用“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-(3-硝基吡咯-1-基)-2-脱氧呋喃核
3
糖-3-基膦酸酯(25微摩尔)”替代“8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯N-苯甲酰
基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸腺嘧啶-3′-基膦酸酯(25微摩尔)”获得。产物的产率通过在260nm下的UV吸收测量用天然CT聚体的摩尔消光系数近似值(15200)而确
定。(SP)-11nt的产率为98％。保留时间：16.3分钟.(RP)-11nt无法拆分；MS(MALDITOF-MS)-
m/z计算为C19H24N4O11PS[M-H]547.09，实测547.02。UPLC分布显示于图37中。

[0849] 实施例111：经由途径A溶液法合成非天然核碱基(RP)-1-(3-硝基吡咯-1-基)-2-脱氧呋喃核糖-3-基胸腺嘧啶-5′-基硫代磷酸酯铵盐[(RP)-11nt]

[0850] 该化合物通过与实施例110相似的方式通过使用“D-2(30微摩尔)”替代“L-2(30微摩尔)”获得。产物的产率通过在260nm下的UV吸收测量、用天然CT二聚体的摩尔消光系数近似值(15200)而确定。(RP)-11nt的产率为97％。保留时间：16.1分钟。(SP)-11nt-
无法拆分；MS(MALDITOF-MS)m/z计算为C19H24N4O11PS[M-H]547.09，实测547.01。UPLC分布显示于图38中。

[0851] 当本发明的优选实施方式显示和描述于本文中时，对于本领域的技术人员明白的是所述实施方式仅以举例的方式提供。对本领域技术人员而言，许多改变、修改和替换不会偏离本发明。可以理解的是，本文所述发明的实施方式的不同替代方式可用于实施本发明。以下权利要求书在此意在限定本发明的范围，以及在本发明范围内的方法和结构及其等同物均在此范围内。

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