聚乙二醇化C肽
阅读：170发布：2020-05-11
专利汇可以提供聚乙二醇化C肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及修饰形式的C肽及其使用方法。一方面，所述修饰形式的C肽包括包含至少一个与N端连接的PEG基团的 聚乙二醇化 C肽衍 生物 ，所述衍生物在体内表现出优良的药代动 力 学和生物学活性。，下面是聚乙二醇化C肽专利的具体信息内容。
1.一种聚乙二醇化C肽，所述C肽包含与C肽的N端共价连接的PEG部分。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化C肽，其中所述PEG部分的分子量为约10kDa至约80kDa之间。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化C肽，其中所述PEG部分的分子量为约20kDa至约60kDa之间。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化C肽，其中所述PEG部分的分子量为约30kDa至约50kDa之间。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中所述PEG部分为直链聚合物。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中所述PEG部分为支链聚合物。
7.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，R1=烷基；
n1为20-800；
连接子选自；-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、
-CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、
-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、-X-CO-X-、
-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；并且其中所述连接子与C肽的N端氨基连接。
8.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的连接子；
-X1-(CH2)m4-CO-；
-X1-CO-；
-X1-CO-(CH2)m4-CO-；
-X1-CO-X2-(CH2)m3-CO-；和
-X1-(CH2)m2-X2-CO-(CH2)m4-CO-；
其中，X1为-O-或缺失；
X2为-NH-；
m2为1-5；
m3为2；并且
m4为2-5。
9.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
10.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
11.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中n1为20-800。
12.根据权利要求5所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中n为20-800。
13.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，每个连接子独立选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、
-CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、
-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、
-CO-(CH2)m1-CO-、-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中；
每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；其中所述连接子与C肽的N端氨基连接；并且
其中R1为烷基或低级烷基，n1为20-800，并且n2为20-800。
14.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中；R1=烷基或低级烷基；
n1为20-800；
n2为20-800；
所述连接子选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、-CO-X-CO-、
-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；并且其中所述连接子与C肽的N端氨基连接。
15.根据权利要求14所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的连接子；
-X1-(CH2)m4-CO-
-X1-CO-；
-X1-CO-(CH2)m4-CO-
-X1-CO-X2-(CH2)m3-CO-；和
-X1-(CH2)m2-X2-CO-(CH2)m4-CO-；
其中，X1为-O-或缺失；
X2为-NH-；
m2为1-5；
m3为2；并且
m4为1-5。
16.根据权利要求14所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的连接子；
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-X-、
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m5-CO-、
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m5-CO-；
其中；
X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
X1为-O-或缺失；
X2为-NH-；
每个m5独立选自1-5；并且
每个n3独立选自1-400。
17.根据权利要求14所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的连接子；
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m6-CO-、
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
-X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m7-CO-；
其中，X1为-O-或缺失；
X2为-NH-；
m5为3；
m6独立为2或5；
m7为3；并且
n3为1-400。
18.一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
19.根据权利要求15所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
20.根据权利要求16所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
21.根据权利要求17所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
22.根据权利要求18所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
23.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，每个连接子独立选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、-CO-X-CO-、
-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；其中所述连接子与C肽的N端氨基连接，并且；
其中R1为烷基或低级烷基，n1为20-800，并且n2为20-800。
24.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，所述连接子选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、-CO-X-CO-、
-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；其中所述连接子与C肽的N端氨基连接，并且；
其中R1为烷基或低级烷基，n1为20-800，并且n2为20-800。
25.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，每个连接子独立选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、
-CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中；
每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；其中所述连接子与C肽的N端氨基连接，并且；
其中R1为烷基或低级烷基；n1为20-800；并且n2为20-800。
26.根据权利要求6所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有以下结构：
其中，所述连接子选自；
-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、
-CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、
-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、
-CO-(CH2)m1-CO-、-X-CO-(CH2)m1-、
-(CH2)m1-CO-X-、-X-(CH2)m1-CO-X-、
-X-CO-(CH2)m1X-、
-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
-X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
-X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
其中；
每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
每个m1独立为0-5；
每个m2独立为1-5；并且其中所述连接子与C肽的N端氨基连接。
27.根据权利要求26所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
其中R1为甲基，并且n1和n2在约400-500的范围之内，并且所述PEG部分的分子量为约40kDa。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中通过紫外圆二色性分析，所述聚乙二醇化C肽具有与未修饰C肽基本上相同的二级结构。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少10倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽保持所述未修饰C肽的至少约50%生物学活性。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽保持所述未修饰C肽的至少约75%生物学活性。
32.一种给药方案，当使用3天或更长的给药间隔时，所述给药方案将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM至约6nM之间，其包括向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽。
33.一种将有需要的患者体内的C肽水平维持在最低有效治疗水平以上的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽。
34.一种治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述糖尿病长期并发症选自视网膜病变、周围神经病变、自主神经病变和肾病。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述糖尿病长期并发症为周围神经病变。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述周围神经病变为确定的周围神经病变。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的神经传导速度相比，治疗引起神经传导速度提高至少10%。
39.一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽和胰岛素的组合。
40.一种治疗胰岛素依赖性人类患者的方法，所述方法包括步骤；
a)向所述患者施用胰岛素，其中所述患者有神经病变；
b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，经皮下向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽；
c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起的患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率，其中所述经调节的胰岛素剂量降低了低血糖的风险、发病率或严重程度，其中所述经调节的胰岛素剂量比开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量低至少10%。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中在与最近用于所述聚乙二醇化C肽相比不同的贮库部位经皮下施用所述胰岛素。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中以约3天或更长的给药间隔施用所述聚乙二醇化C肽。
43.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中以约5天或更长的给药间隔施用所述聚乙二醇化C肽。
44.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中以约7天或更长的给药间隔施用所述聚乙二醇化C肽。
45.根据权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化C肽的治疗剂量为约1mg至约4.0mg。
46.根据权利要求32-45中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化C肽的治疗剂量为约1mg。
47.根据权利要求32-45中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化C肽的治疗剂量为约3.5mg。
48.根据权利要求33-47中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇化C肽的血浆浓度保持在约0.2nM以上。
49.根据权利要求32-47中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽经皮下施用。
50.根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽，在有需要的患者中用作C肽替代疗法。
51.根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽在另外包括施用胰岛素的方案中降低胰岛素依赖性糖尿病人类患者的低血糖风险的用途，所述方案包括；
a)向所述患者施用胰岛素；
b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，施用治疗剂量的聚乙二醇化C肽；
c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起的患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述患者有至少一种糖尿病长期并发症。
53.根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽用于治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的用途。
54.根据权利要求52或53所述的用途，其中所述糖尿病长期并发症选自视网膜病变、周围神经病变、自主神经病变和肾病。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述糖尿病长期并发症为周围神经病变。
56.根据权利要求55所述的用途，其中所述周围神经病变为确定的周围神经病变。
57.根据权利要求55或56所述的用途，其中与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的神经传导速度相比，治疗引起神经传导速度提高至少10%。
58.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽和药学上可接受的载体或赋形剂。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体或赋形剂为山梨糖醇。
60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述山梨糖醇以约2%至约8%wt/wt的浓度存在。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述山梨糖醇以约4.7%的浓度存在。
62.根据权利要求58-61中任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物缓冲为约pH5.5至约pH6.5范围之内的pH。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中将所述组合物缓冲为pH约6.0。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的药物组合物，其中用浓度约5mM至约25mM的磷酸盐缓冲液来缓冲所述组合物。
65.根据权利要求64所述的药物组合物，其中用浓度约10mM的磷酸盐缓冲液来缓冲所述组合物。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物特征在于，与包含贮藏于pH7.0的0.9%盐水中的相同聚乙二醇化C肽的药物组合物相比，根据权利要求
1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽的稳定性提高，其中在40°C下孵育预定时间后测定所述稳定性。
67.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽和胰岛素。
68.一种减少胰岛素依赖性人类患者的胰岛素使用的方法，所述方法包括步骤；
a)向所述患者施用胰岛素；
b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，经皮下向所述患者施用治疗剂量的根据权利要求1-31中任一项所述的聚乙二醇化C肽；
c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起的患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率，其中所述经调节的胰岛素剂量并未诱发低血糖，其中所述经调节的胰岛素剂量比开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量低至少
10%。
聚乙二醇化C肽
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2010年5月17日提交的美国临时申请No.61/345,293和2011年3月2日提交的美国临时申请No.61/448,402的优先权的利益，其内容通过引用如同写入本文一样整体并入。
[0003] 发明背景
技术领域
[0005] C肽是胰岛素原分子中A链和B链之间的连接肽。在胰岛β细胞的内质网中裂解和加工后，生成胰岛素和C肽。C肽和胰岛素一起以等摩尔量从胰岛β细胞共同分泌进入门脉循环。除C肽对双链胰岛素结构折叠的作用外，在发现许多年之后，C肽另外的生物学活性遭到质疑。
[0006] 1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病的通常特征在于因胰岛β细胞的自身免疫性破坏而导致的胰岛素和C肽缺乏。因此患者依赖于外源胰岛素以维持生命。若干因素可能对疾病的发病机制具有重要意义，例如，遗传背景、环境因素和临时感染后的迅速自身免疫反应(Akerblom HK等：Annual Medicine 29(5)：383-385，(1997))。当前，为胰岛素依赖性糖尿病患者提供与C肽分离的外源胰岛素，因此不接受外源C肽疗法。相反，多数2型糖尿病患者最初仍产生内源性胰岛素和C肽，但是通常特征在于骨骼肌和脂肪组织抗胰岛素。
[0007] 1型糖尿病患者患有一系列糖尿病长期并发症，在许多情况下，比2型糖尿病更严重且更广泛。特别地，例如牵涉视网膜、肾和神经的微血管并发症是1型糖尿病患者发病和死亡的主要原因。
[0008] C肽缺乏可能在胰岛素依赖性糖尿病长期并发症的发展中起重要作用，对于这一概念的支持越来越多。另外，对糖尿病动物模型和1型糖尿病患者的体内以及体外研究证明，C肽具有激素活性(WahrenJ等：American Journal of Physiology 278：E759-E768，(2000)；WahrenJ等：International textbook of diabetes mellitus Ferranninni E，Zimmet P，De Fronzo RA，Keen H编，Chichester，John Wiley&Sons，(2004)，第165-182页)。因此，用作常规胰岛素疗法的补充的C肽可提供处理1型糖尿病长期并发症的有效方法。
[0009] 迄今为止，研究表明C肽的治疗活性牵涉C肽与G蛋白偶联膜受体结合、Ca2+依赖性细胞内信号途径的激活和MAP激酶系统的磷酸化、引起钠/钾ATP酶和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性增强。尽管承诺使用C肽治疗和预防胰岛素依赖性糖尿病的长期并发症，但是生物半衰期短和需要通过皮下注射或静脉内(I.V.)施用每日多次给药C肽有碍商业发展。
[0010] 本发明专注于开发保持天然C肽的生物学活性并且表现出优良的药代动力学性质的聚乙二醇化形式的C肽。这些改良的治疗形式的C肽使开发治疗糖尿病长期并发症的更有效的治疗方案成为可能，并且需要显著更低频率的施用。
[0011] 一方面，这些疗法靶向糖尿病患者，另一方面靶向胰岛素依赖性患者。一方面，胰岛素依赖性患者患有一种或多种糖尿病长期并发症。
[0012] 这些改进方法基于动物研究，令人惊讶地证明在分子N端对C肽的修饰产生保持天然分子的生物学活性，同时表现出极其优良的药代动力学特征的聚乙二醇化形式的C肽。发明概要
[0013] 在一个实施方案中，本发明包括包含与C肽的N端共价连接的PEG部分的聚乙二醇化C肽。一方面，本发明的聚乙二醇化C肽包含直链聚合物PEG聚合物。另一方面，本发明的聚乙二醇化C肽包含支链PEG聚合物。
[0014] 在这些聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，PEG部分的分子量为约10kDa至约80kDa之间。另一方面，PEG部分的分子量为约20kDa至约60kDa之间。另一方面，PEG部分的分子量为约30kDa至约50kDa之间。
[0015] 在这些直链聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽具有通式(I)：
[0016]
[0017] 其中；
[0018] R1＝烷基；
[0019] n1为20-800；
[0020] 连接子选自-X-、-CO-、-(CH2)m2-、-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、
[0021] -CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、
[0022] -X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、
[0023] -X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、-X-(CH2)m1-CO-X-、
[0024] -X-CO-(CH2)m1X-、
[0025] -X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
[0026] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
[0027] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
[0028] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
[0029] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
[0030] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
[0031] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
[0032] 其中；
[0033] 每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；\
[0034] 每个m1独立为0-5；
[0035] 每个m2独立为1-5；并且其中所述连接子与C肽的N端氨基连接。
[0036] 在这些直链聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽包含选自以下的将PEG部分连接于C肽的连接子；
[0037] -X1-(CH2)m4-CO-；
[0038] -X1-CO-；
[0039] -X1-CO-(CH2)m4-CO-；
[0040] -X1-CO-X2-(CH2)m3-CO-；和
[0041] -X1-(CH2)m2-X2-CO-(CH2)m4-CO-；
[0042] 其中；
[0043] X1为-O-或缺失；
[0044] X2为-NH-；
[0045] m2为1-5；
[0046] m3为2；并且
[0047] m4为2-5。
[0048] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0049]
[0050] 其中n1为约400至约1000。
[0051] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0052]
[0053] 其中n1为约400至约1000。
[0054] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0055]
[0056] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0057]
[0058] 其中n为约400至约1000。
[0059] 另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含通式(II)的支链PEG：
[0060]
[0061] 其中；
[0062] R1＝烷基；
[0063] n1为20-800；
[0064] n2为20-800；并且其中每个连接子独立如下定义，并且，其中连接于C肽的连接子与C肽的N端氨基连接。
[0065] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有通式(IIA)的结构：
[0066]
[0067] 其中；
[0068] R1＝烷基；
[0069] n1为20-800；
[0070] n2为20-800；
[0071] 所述连接子选自；-X-、-CO-、-(CH2)m2-、
[0072] -(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、-CO-X-CO-、-(CH2)m1-X-(CH2)m1-、
[0073] -(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、-X-CO-X-、-X-(CH2)m1-X-、-CO-(CH2)m1-CO-、[0074] -X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、-X-(CH2)m1-CO-X-、-X-CO-(CH2)m1X-、[0075] -X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
[0076] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
[0077] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
[0078] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
[0079] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
[0080] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
[0081] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
[0082] 其中；
[0083] 每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
[0084] 每个m1独立为0-5；
[0085] 每个m2独立为1-5；并且其中所述连接子与C肽的N端氨基连接。
[0086] 在这些支链聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的将PEG部分连接于C肽的连接子：
[0087] -X1-(CH2)m4-CO-
[0088] -X1-CO-；
[0089] -X1-CO-(CH2)m4-CO-
[0090] -X1-CO-X2-(CH2)m3-CO-；和
[0091] -X1-(CH2)m2-X2-CO-(CH2)m4-CO-；
[0092] 其中；
[0093] X1为-O-或缺失；
[0094] X2为-NH-；
[0095] m2为1-5；
[0096] m3为2；并且
[0097] m4为1-5。
[0098] 在这些支链聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的将PEG部分连接于C肽的连接子：
[0099] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-X-、
[0100] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m5-CO-、
[0101] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
[0102] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m5-CO-；
[0103] 其中；
[0104] X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
[0105] X1为-O-或缺失；
[0106] X2为-NH-；
[0107] 每个m5独立选自1-5；并且
[0108] 每个n3独立选自1-400。
[0109] 在这些支链聚乙二醇化C肽的任一种的另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的将PEG部分连接于C肽的连接子：
[0110] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m6-CO-、
[0111] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
[0112] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m7-CO-；
[0113] 其中；
[0114] X1为-O-或缺失；
[0115] X2为-NH-；
[0116] m5为3；
[0117] m6独立为2或5；
[0118] m7为3；并且
[0119] n3为1-400。
[0120] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0121]
[0122] 其中；
[0123] R1＝烷基；
[0124] n1为200-800；
[0125] n2为200-800。
[0126] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0127]
[0128] 其中；
[0129] R1＝烷基；
[0130] n1为200-800；并且
[0131] n2为200-800。
[0132] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0133]
[0134] 其中；
[0135] R1＝烷基；
[0136] n1为200-800；
[0137] n2为200-800；并且
[0138] n3为1-400。
[0139] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0140]
[0141] 其中；
[0142] R1＝烷基；
[0143] n1为200-800；
[0144] n2为200-800；并且
[0145] n3为1-400。
[0146] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0147]
[0148] 其中；
[0149] R1＝烷基；
[0150] n1为200-800；
[0151] n2为200-800；并且
[0152] n3为1-400。
[0153] 另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含通式(III)的支链PEG：
[0154]
[0155] 其中；
[0156] R1＝烷基；
[0157] n1为20-800；
[0158] n2为20-800；并且
[0159] 其中每个连接子独立如下定义，并且
[0160] 其中连接于C肽的连接子与C肽的N端氨基连接。
[0161] 在式(III)的聚乙二醇化C肽的一个实施方案中，所述聚乙二醇化C肽具有结构(III A)：
[0162]
[0163] 其中；
[0164] R1＝烷基；
[0165] n1为20-800；
[0166] n2为20-800；并且
[0167] 其中所述连接子如下定义，并且与C肽的N端氨基连接。
[0168] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0169]
[0170] 其中；
[0171] R1＝烷基；
[0172] n1为200-800；并且
[0173] n2为200-800。
[0174] 另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含通式(IV)的支链PEG：
[0175]
[0176] 其中；
[0177] R1＝烷基；
[0178] n1为20-800；
[0179] n2为20-800；
[0180] 其中每个连接子独立如下定义；
[0181] 其中连接赖氨酸残基和C肽的连接子与C肽的N端氨基和
[0182] 赖氨酸残基的C端羧基连接，并且其中将赖氨酸部分连接于PEG部分的连接子通过赖氨酸分子的氨基连接。
[0183] 在另一实施方案中，本发明包括一种聚乙二醇化C肽，其中所述聚乙二醇化C肽具有结构：
[0184]
[0185] 其中；
[0186] R1＝烷基；
[0187] n1为200-800；并且
[0188] n2为200-800。
[0189] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约5倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0190] 在要求任一种的聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约6倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0191] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约7倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0192] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约8倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0193] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约10倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0194] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约15倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0195] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约20倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0196] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约25倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0197] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约50倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0198] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约75倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0199] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，当经皮下向犬施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约100倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0200] 在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，所述聚乙二醇化C肽具有与未修饰C肽等效的生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约95％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约90％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的某些方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约80％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约70％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约60％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约50％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约40％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约30％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约20％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约
10％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约5％生物学活性。
10％生物学活性。在要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的另一方面，所述聚乙二醇化C肽保持未修饰C肽的至少约5％生物学活性。
[0201] 在另一实施方案中，本发明包括一种给药方案，当使用3天或更长的给药间隔时，所述给药方案将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM至约6nM之间，其包括向所述患者施用治疗剂量的根据要求保护的任一种聚乙二醇化C肽所述的聚乙二醇化C肽。
[0202] 在另一实施方案中，本发明包括一种给药方案，当使用3天或更长的给药间隔时，所述给药方案将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.4nM至约6nM之间，其包括向所述患者施用治疗剂量的根据要求保护的任一种聚乙二醇化C肽所述的聚乙二醇化C肽。
[0203] 在另一实施方案中，本发明包括一种给药方案，当使用3天或更长的给药间隔时，所述给药方案将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.6nM至约8nM之间，其包括向所述患者施用治疗剂量的根据要求保护的任一种聚乙二醇化C肽所述的聚乙二醇化C肽。
[0204] 在另一实施方案中，本发明包括一种给药方案，当使用3天或更长的给药间隔时，所述给药方案将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.8nM至约10nM之间，其包括向所述患者施用治疗剂量的根据要求保护的任一种聚乙二醇化C肽所述的聚乙二醇化C肽。
[0205] 在另一实施方案中，本发明包括一种将有需要的患者体内的C肽水平维持在最低有效治疗水平以上的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0207] 在另一实施方案中，本发明包括一种治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0208] 在另一实施方案中，本发明包括一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的根据要求保护的任一种聚乙二醇化C肽所述的聚乙二醇化C肽和胰岛素的组合。
[0209] 在这些方法的任一种的一方面，以约3天或更长的给药间隔施用聚乙二醇化C肽。在这些方法的任一种的一方面，以约4天或更长的给药间隔施用聚乙二醇化C肽。在这些方法的任一种的一方面，以约5天或更长的给药间隔施用聚乙二醇化C肽。在这些方法的任一种的一方面，以约6天或更长的给药间隔施用聚乙二醇化C肽。在这些方法的任一种的一方面，以约7天或更长的给药间隔施用聚乙二醇化C肽。
[0210] 在某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的神经传导速度相比，治疗引起神经传导速度提高至少10％。
[0211] 在这些方法的任一种的另一方面，将聚乙二醇化C肽的血浆浓度维持在约0.1nM以上。在这些方法的任一种的另一方面，将聚乙二醇化C肽的血浆浓度维持在约0.2nM以上。在这些方法的任一种的另一方面，将聚乙二醇化C肽的血浆浓度维持在约0.3nM以上。在这些方法的任一种的另一方面，将聚乙二醇化C肽的血浆浓度维持在约0.4nM以上。
[0212] 在这些方法的任一种的另一方面，经皮下施用治疗剂量的聚乙二醇化C肽。在这些方法的任一种的另一方面，经口服施用治疗剂量的聚乙二醇化C肽。
[0213] 在另一实施方案中，本发明包括要求保护的任一种聚乙二醇化C肽在有需要的患者中作为C肽替代疗法的用途。
[0214] 在另一实施方案中，本发明包括根据权利要求保护的聚乙二醇化C肽用于治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的用途。在某些实施方案中，所述糖尿病长期并发症选自视网膜病变、周围神经病变、自主神经病变和肾病。在某些实施方案中，所述糖尿病长期并发症为周围神经病变。在某些实施方案中，所述周围神经病变为确定的周围神经病变。在某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的神经传导速度相比，治疗引起神经传导速度提高至少10％。
[0215] 在另一实施方案中，本发明包括一种包含要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂为山梨糖醇。在某些实施方案中，所述山梨糖醇以约2％至约8％wt/wt的浓度存在。在某些实施方案中，所述山梨糖醇以约4.7％的浓度存在。在某些实施方案中，将所述组合物缓冲为约pH 5.5至约pH 6.5范围之内的pH。在某些实施方案中，将所述药物组合物缓冲为pH约6.0。在某些实施方案中，用浓度约5mM至约25mM的磷酸盐缓冲液缓冲所述药物组合物。在某些实施方案中，用浓度约10mM的磷酸盐缓冲液缓冲所述药物组合物。在这些实施方案的任一个的一方面，所述组合物特征在于，与包含相同聚乙二醇化C肽和pH 7.0的0.9％盐水的药物组合物相比，要求保护的任一种聚乙二醇化C肽的稳定性提高，其中在40℃下孵育预定时间后测定所述稳定性。在不同实施方案中，预定时间为约1周、约
2周、约3周、约4周或约5周或约6周。
2周、约3周、约4周或约5周或约6周。
[0216] 在另一实施方案中，本发明包括一种包含要求保护的任一种聚乙二醇化C肽和胰岛素的药物组合物。
[0217] 某些实施方案包括公开的聚乙二醇化C肽在另外包括施用胰岛素的方案中降低胰岛素依赖性糖尿病人类患者的低血糖风险的用途，所述方案包括：a)向所述患者施用胰岛素；b)在与用于患者胰岛素施用的部位不同的部位，施用治疗剂量的聚乙二醇化C肽；c)在由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率。
[0218] 在一些实施方案中，患者有至少一种糖尿病长期并发症。
[0219] 某些实施方案包括一种治疗胰岛素依赖性人类患者的方法，所述方法包括步骤：a)向所述患者施用胰岛素，其中所述患者有神经病变；b)在与用于患者胰岛素施用的部位不同的部位，经皮下向所述患者施用治疗剂量的公开的任一种聚乙二醇化C肽；c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起的患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率，其中所述经调节的胰岛素剂量降低了低血糖的风险、发病率或严重程度，其中所述经调节的胰岛素剂量比开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量低至少10％。
[0220] 某些实施方案包括一种减少胰岛素依赖性人类患者的胰岛素使用的方法，所述方法包括步骤：a)向所述患者施用胰岛素；b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，经皮下向所述患者施用治疗剂量的公开的任一种聚乙二醇化C肽；c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起的患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率，其中所述经调节的胰岛素剂量并未诱发低血糖，其中所述经调节的胰岛素剂量比开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量低至少10％。
[0222] 参考以下列出说明性实施方案的详细描述可获得对本发明特征和优点更好的理解，其中利用了本发明的原理，并且其中附图为：
[0223] 图1示出了本发明40kDa支链聚乙二醇化C肽的反相色谱图。
[0224] 图2示出了本发明40kDa支链聚乙二醇化C肽的尺寸排阻色谱图。
[0225] 图3示出了本发明20kDa直链聚乙二醇化C肽的反相色谱图。
[0226] 图4示出了本发明20kDa直链聚乙二醇化C肽的尺寸排阻色谱图。
[0227] 图5示出了单次皮下剂量后犬体内未修饰C肽的血浆浓度-时间曲线图。图5A示出了时间标度为1天的曲线图，图5B示出了时间标度为12天的曲线图。
[0228] 图6示出了使用线性标度，在单次皮下剂量的20kD直链聚乙二醇化C肽(菱形)和40kD支链聚乙二醇化C肽(正方形)后，犬体内C肽的血浆浓度-时间曲线图。
[0229] 图7示出了使用半对数标度，在单次皮下剂量的20kD直链聚乙二醇化C肽(菱形)和40kD支链聚乙二醇化C肽(正方形)后，犬体内C肽的血浆浓度-时间曲线图。
[0230] 图8示出了在单次皮下剂量的聚乙二醇化C肽后，犬体内C肽的血浆浓度-时间曲线图。图8A示出了使用线性标度呈现的数据。图8B示出了使用半对数形式的数据。
[0231] 图9示出了在单次皮下剂量的聚乙二醇化C肽后，犬体内C肽的Cmax和AUC(0-t)。图9A示出了Cmax而图9B示出了AUC(0-t)。
[0232] 图10示出了在单剂量皮下施用聚乙二醇化C肽后，SD(SpragueDawley)大鼠体内的平均(±SD)C肽血浆浓度-时间曲线图。图A为线性标度；图B为半对数标度。
[0233] 图11示出了在单剂量皮下施用聚乙二醇化C肽后，猕猴体内的平均(±SD)C肽血浆浓度-时间曲线图。图A为线性标度；图B为半对数标度。
[0234] 图12示出了在多剂量皮下施用聚乙二醇化C肽后，SD大鼠体内的平均C肽血浆浓度-时间曲线图。图A为雄性，线性标度；图B为雌性，线性标度；图C为雄性，半对数标度；图D为雌性，半对数标度。
[0235] 图13示出了SD大鼠体内根据剂量，Cmax和AUC(0-inf)之间的关系；图A为Cmax，第一剂量；图B为AUC(0-inf)，第一剂量；图C为Cmax，最后剂量；图D为AUC(0-inf)，最后剂量。
[0236] 图14示出了多剂量皮下施用后，猕猴体内平均C肽血浆浓度-时间曲线图。图A为雄性，线性标度；图B为雌性，线性标度；图C为雄性，半对数标度；图D为雌性，半对数标度。
[0237] 图15示出了猕猴体内根据剂量，Cmax和AUC(0-inf)之间的关系；图A为Cmax，第一剂量；图B为AUC(0-inf)，第一剂量；图C为Cmax，最后剂量；图D为AUC(0-inf)，最后剂量。
[0238] 图16示出了治疗长达8周的4个大鼠治疗组的每一组的尾神经传导速度(NCV)(见实施例6)。在该图和以下3幅图中，第1组表示媒介物对照(无链脲霉素[STZ])，第2组表示STZ处理组+媒介物，第3组表示STZ+1.0mg/kg/周(1.0mg/ml)的人聚乙二醇化C肽(实施例12)，第4组表示STZ+3.0mg/kg/周(1.0mg/ml)的人聚乙二醇化C肽(实施例12)。图16中，图A示出了基线NCV测量，而图B示出了施用单独的媒介物或1.0或3.0mg/kg/周的聚乙二醇化C肽4周(从基线开始)后的尾NCV。图16，图C示出了施用单独的媒介物或1.0或3.0mg/kg/周的聚乙二醇化C肽8周(从基线开始)后的尾NCV。
[0239] 图17示出了如图16所述的4个相同动物组的每一组的趾NCV。图17中，图A示出了基线测量，而图B示出了施用单独的媒介物或1.0或3.0mg/kg/周的聚乙二醇化C肽4周(从基线开始)后的趾NCV。图17，图C示出了施用单独的媒介物或1.0或3.0mg/kg/周的聚乙二醇化C肽8周(从基线开始)后的趾NCV。
[0240] 图18示出了在整个研究持续期间，如图17所述的4个相同治疗组的趾NCV的相对变化。
[0241] 图19示出了治疗8周后，与基线测量相比，如图16和17中所述4个相同治疗组的尾和趾NCV的相对变化。
[0243] 图21示出了C肽、PEG试剂和聚乙二醇化C肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)的放大区域。
[0244] 图22示出了收集于D2O中的C肽、PEG试剂和聚乙二醇化C肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。
[0245] 图23示出了收集于D2O中的C肽、PEG试剂和聚乙二醇化C肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。
[0246] 图24示出了用胰凝乳蛋白酶孵育之后，C肽(1mg/mL)和聚乙二醇化C肽(10mg/mL)的肽图。
[0247] 图25示出了聚乙二醇化C肽(在～0.6mg/mL下)于PBS缓冲液中的归一化沉降系数分布。
[0248] 图26示出了C肽和聚乙二醇化C肽的圆二色性分析。
[0249] 图27示出了实施例12的聚乙二醇化C肽样品的尺寸排阻色谱(SEC)的结果。
[0250] 图28示出了实施例12的20kDa聚乙二醇化C肽和40kDa聚乙二醇化C肽的色谱图的重叠。
[0252] 图30示出了ERK磷酸化测定中，与天然C肽相比，聚乙二醇化C肽生物学活性的评估结果。
[0253] 发明详述
[0254] 定义：
[0255] 术语“活性”或“活化”，当连同特殊官能团使用时，指易于和另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与需要强催化剂或非常不切实际的反应条件以便反应的那些基团(即，“非反应性”或“惰性”基团)相反。如本文所使用，术语“官能团”或其任何同义词意在涵盖其保护形式以及未保护形式。
[0256] 术语“烷氧基”指-O-R基团，其中R为烷基或经取代的烷基，优选为C1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
[0257] 术语“烷基”指通常长度范围为约1-12个原子的烃。烃可为支链或直链，并且优选但未必饱和。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、2-乙基丙基等。如本文所使用的“烷基”包括环烷基以及环烯烃烷基。术语“低级烷基”指含有1-6个碳原子的烷基，并且可为直链或支链。
[0258] 如本文所使用的术语“Cmax”为监测到释放期间出现的药物最高血清或血浆浓度。
[0259] 如本文所使用的术语“Cmin”为治疗过程中释放期间出现的药物最低血清或血浆浓度。
[0260] 如本文所使用的术语“Cave”为通过用释放持续时间除以释放曲线图的曲线下面积(AUC)得到的药物平均血清或血浆浓度。
[0261] 如本文所使用的术语“Css-ave”为给药至少5个消除半衰期之后，多次给药方案期间获得的药物平均稳态浓度。应了解，甚至在已经获得药物平均稳态浓度后，药物浓度在给药间隔期间波动。
[0262] 如本文所使用的术语“tmax”指给药后观察到Cmax的时间。
[0263] 如本文所使用的术语“AUC”指通过梯形法则计算的全部样品收集间隔内血清或血浆浓度-时间曲线的“曲线下面积”。
[0264] 术语“生物利用率”指到达循环系统的药物的量，用施用药物的百分比表示。生物可利用物质的量可定义为从施用后开始到预定时间点结束期间药物释放曲线图的AUC计算值。如本领域中所理解，通过绘制在预定时间点(X轴)的受试者体内生物活性剂的血清水平(Y轴)生成释放曲线图。生物利用率通常指生物利用率％，所述生物利用率％是用静脉内施用相同等效剂量的药物后获得的药物生物利用率除以施用所述药物的缓释组合物后获得的药物(例如C肽)的生物利用率，乘以100获得的生物利用率。
[0265] 短语“保守性氨基酸取代”或“保守性突变”指一个氨基酸被另一个具有共同性质的氨基酸置换。定义单个氨基酸之间的共同性质的功能方式是分析同源生物相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz GE和RH Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag(1979))。根据此分析，一个类别的氨基酸优先相互交换，并因此大多数在其对蛋白质整体结构的影响方面相互类似时，可定义氨基酸类别(Schulz GE和RH Schirmer，Principles of ProteinStructure，Sp ringer-Verlag(1979))。
[0266] 以这种方式定义的氨基酸类别的实例包括：“带电/极性类”，由Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His组成；“芳香类或环形类”，由Pro、Phe、Tyr和Trp组成；和“脂肪类”，由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成。
[0267] 每个类别中，也可鉴定亚类，例如带电/极性氨基酸类可细分为“带正电的亚类”，由Lys、Arg和His组成；“带负电的亚类”，由Glu和Asp组成；和“极性亚类”，由Asn和Gln组成。芳香类或环形类可细分为“氮环亚类”，由Pro、His和Trp组成；和“苯基亚类”，由Phe和Tyr组成。脂肪类可细分为“大分子脂肪族非极性亚类”，由Val、Leu和Ile组成；“脂肪族弱极性亚类”，由Met、Ser、Thr和Cys组成；和“小残基亚类”，由Gly和Ala组成。
[0268] 保守性突变的实例包括上述亚类中氨基酸的氨基酸取代，例如Lys取代Arg并且反之亦然，以致可保持正电荷；Glu取代Asp并且反之亦然，以致可保持负电荷；Ser取代Thr，以致可保持游离-OH；和Gln取代Asn，以致可保持游离-NH2。“半保守性突变”包括以上所列相同类别，但是亚类不同的氨基酸的氨基酸取代。例如，Asp突变为Asn或Asn突变为Lys均牵涉类别相同，但亚类不同的氨基酸。“非保守性突变”牵涉不同类别之间的氨基酸取代，例如Lys取代Leu、Phe取代Ser。
[0269] 术语“道尔顿”、“Da”或“D”指任意质量单位，为碳-12核素质量的1/12，相当于-241.657×10 g。术语“kDa”为千道尔顿(即，1000道尔顿)。
[0270] 术语“糖尿病(diabetes)”、“糖尿病(diabetes mellitus)”或“糖尿病病状”，除非另外特别指明，涵盖所有形式的糖尿病。术语“1型糖尿病患者”或“1型糖尿病”指空腹血糖浓度高于约7.0mmoL/L且空腹C肽水平为约或低于约0.2nmoL/L的患者。术语“1.5型糖尿病患者”或“1.5型糖尿病”指空腹血糖浓度高于约7.0mmoL/L且空腹C肽水平为约或低于约0.4nmoL/L的患者。术语“2型糖尿病患者”或“2型糖尿病”通常指空腹血糖浓度高于约7.0mmoL/L且空腹C肽水平在C肽水平的正常生理范围(约0.47-2.5nmoL/L)内或更高的患者。应了解，最初诊断为2型糖尿病的患者随后可能发展胰岛素依赖性糖尿病，并且可能仍被诊断为2型患者，即使其C肽水平降至1.5型或1型糖尿病患者的水平(＜0.2nmol/L)。
[0271] 除非另有说明，术语“胰岛素依赖性患者”或“胰岛素依赖性糖尿病”涵盖需要施用胰岛素以充分维持正常葡萄糖水平的所有形式的糖尿病患者/糖尿病。
[0272] 经常通过测量空腹血糖、胰岛素或糖基化血红蛋白水平(通常称为血红蛋白A1c、Hb1c、HbA1c或A1C)诊断糖尿病。成人正常葡萄糖水平为60-126mg/dL。正常胰岛素水平为30-60pmoL/L。正常HbA1c水平通常低于6％。世界卫生组织规定糖尿病的空腹血糖浓度的诊断值为7.0mmoL/L(126mg/dL)及以上(全血6.1mmoL/L或110mg/dL)，或2-小时葡萄糖水平高于或等于11.1mmoL/L(高于或等于200mg/dL)。表明或指示糖尿病高风险的其它值包括动脉血压升高高于或等于140/90mm Hg；血浆甘油三酯升高(高于或等于1.7mmoL/L[150mg/dL])和/或HDL-胆固醇低(男性低于0.9mmoL/L[35mg/dL]；女性低于1.0mmoL/
2
L[39mg/dL])；中心性肥胖(BMI超过30kg/m)；微量白蛋白尿，其中尿白蛋白排泄率大于或等于20μg/min或白蛋白肌酐比值大于或等于30mg/g。
2
L[39mg/dL])；中心性肥胖(BMI超过30kg/m)；微量白蛋白尿，其中尿白蛋白排泄率大于或等于20μg/min或白蛋白肌酐比值大于或等于30mg/g。
[0273] 术语“递送剂”指在口服递送治疗剂中有效的载体化合物或载体分子，并且可与“载体”交换使用。
[0274] 术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性比较，用于鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以进行对公用数据库的检索，以(例如)鉴定其它家族成员、相关序列或同系物。可使用Altschul等：J.Mol.Biol.215：403-410，(1990)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类检索。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得空位比对以便比较，可如Altschul等：NucleicAcids Res.25(17)：3389-3402，(1997)中所述利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各个程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0275] 术语“同源的”指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来自相同动物物种超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽；见Reeck等：Cell 50：667，(1987))。正如其序列相似性所反映，无论是根据同一性百分比还是通过特定残基或基序和保守性位点的存在，此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性。在特定实施方案中，当通过已知序列比较算法，例如BLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等测定，在核酸序列的定义长度上，至少约85％，且更优选至少约90％或至少约95％的核苷酸匹配时，两个核酸序列“基本上同源”或“基本上相似”。此类序列的实例为本发明特定基因的等位或物种变异体。例如，在如对特殊系统定义的严格条件下的(例如)Southern杂交实验中，可通过杂交鉴定基本上同源的序列。
[0276] 类似地，在本发明的特殊实施方案中，当高于80％的氨基酸残基相同时，或当高于90％的氨基酸残基相似(即，功能相同)时，两个氨基酸序列“基本上同源”或“基本上相似”。优选地，通过使用(例如)GCG(Genetics Computer Group，第7版，Madison，WI)堆积程序，或使用上述任何程序和算法进行比对鉴定相似或同源多肽序列。程序可使用Smith和Waterman的局部同源算法，默认值为：空位产生罚分＝-(1+1/3k)，k为空位拓展数，平均匹配＝1，平均错配＝-0.333。
[0277] 如本文所使用，“同一性”指当比对序列以最大化序列匹配，即考虑到空位和插入时，两个或更多个序列中相应位点的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可通过已知方法容易地计算同一性，包括但不限于Computational Molecular Biology，Lesk AM编，Oxford UniversityPress，New York，(1988)；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith DW编，Academic Press，New York，(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin AM 和 Griffin HG 编，HumanaPress，New Jersey，(1994)；Sequence Analys in Molecular Biology，Heinje G，Academic Press，(1987)；和Sequence Analysis Primer，Gribskov M和Devereux J编，M Stockton Press，New York，(1991)；和Carillo H和Lipman D，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中描述的方法。将测定同一性的方法设计为给出试验序列之间的最大匹配。而且，用公开可用计算机程序整理测定同一性的方法。测定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(DevereuxJ等：Nucleic Acids Res.12(1)：387，(1984))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul SF等：J.Molec.Biol.215：403-410，(1990) 和 AltschulSF 等：Nucleic Acids Res.25：3389-3402，(1997))。BLAST X程序从NCBI和其它来源公开可用(BLAST Manual，Altschul SF 等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul SF 等，J.Mol.Biol.215：403-410，(1990))。众所周知的Smith Waterman算法(Smith TF，Waterman MS：J.Mol.Biol.147(1)：
195-197，(1981))也可用于测定序列之间的相似性。
195-197，(1981))也可用于测定序列之间的相似性。
[0278] 术语“胰岛素”包括所有形式的胰岛素，包括但不限于速效形式，例如赖脯胰岛素rDNA源：HUMALOG(1.5mL、10mL、Eli Lilly和Company，Indianapolis，IN)，来自牛和猪的胰岛素注射液(常规胰岛素)(常规ILETIN I、Eli Lilly)，人：rDNA：HUMULIN R(Eli Lilly)、诺和灵R(Novo Nordisk，New York，NY)，半合成的：人VELOSULIN(Novo Nordisk)，人rDNA，缓冲的：VELOSULIN BR，猪：常规胰岛素(Novo Nordisk)，纯化猪：猪常规ILETIN II(Eli Lilly)，常规纯化猪胰岛素(Novo Nordisk)和常规(浓缩)ILETIN II U-500(500个单位/mL，Eli Lilly)；中效形式，例如胰岛素锌悬液，牛和猪：LENTE ILETING I(Eli Lilly)，人rDNA：HUMULIN L(Eli Lilly)，诺和灵L(NovoNordisk)，纯化猪：LENTE ILETIIN II(Eli Lilly)，鱼精蛋白胰岛素锌悬液(NPH)：牛和猪：NPH ILETIN I(Eli Lilly)，人rDNA：HUMULINN(Eli Lilly)，诺和灵N(Novo Nordisk)，纯化猪：猪NPH Eetin II(EliLilly)、NPH-N(Novo Nordisk)；和长效形式，例如长效胰岛素锌悬液(ULTRALENTE，Eli Lilly)，人rDNA：HUMULIIN U(Eli Lilly)。
[0280] 如本文所使用的术语“膳食”指标准和/或混合膳食。
[0281] 除非另有说明，否则术语“平均”，在药代动力学值之前时(例如，平均tmax)，表示药代动力学值的算术平均值。
[0282] 如本文所使用的术语“平均基线水平”指用作比较基础的某些值的测量、计算或水平，这是统计上显著数量的受试者，例如在单项临床研究或一项以上的临床研究的组合的平均值。
[0283] 术语“多剂量”指患者根据该组合物的给药间隔接受至少2个剂量的药物组合物。
[0284] 在“神经病变患者”或“有神经病变”的患者的上下文中的术语“神经病变”，指患者满足圣安东尼奥会议中概述的有关糖尿病性神经病变的4项标准的至少一项(圣安东尼奥会议有关糖尿病性神经病变的报道和建议Ann.Neurol.2499-104(1988))，简言之包括1)多神经病的临床病征，2)神经功能障碍的症状，3)至少2条神经的神经传导不足，或4)定量感官不足。术语“确定的神经病变”指患者满足圣安东尼奥会议中概述的有关糖尿病性神经病变的4项标准的至少两项。术语“初期神经病变”指仅表现出神经传导不足，并未表现出其它神经病变症状的患者。
[0285] 术语“正常葡萄糖水平”可与术语“血糖量正常”和“正常”交换使用并且指空腹静脉血糖浓度低于约6.1mmoL/L(110mg/dL)。将高于正常血糖量的持续葡萄糖水平视为前糖尿病病状。
[0286] 如本文所使用，本发明上下文中的术语“患者”优选为哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛，但不限于这些实例。有利的是，可将除人以外的哺乳动物用作表示胰岛素依赖性糖尿病或糖尿病病状的动物模型的患者。患者可为雄性或雌性。患者可以是先前已经诊断或鉴定为具有胰岛素依赖性糖尿病或糖尿病病状，且任选已经进行，或正在进行糖尿病治疗性干预的患者。患者可以是患有糖尿病长期并发症的患者。优选地，患者为人。
[0287] 如本文所使用的术语“PEG”、“聚乙二醇”或“聚(乙二醇)”指任何水溶性聚(环氧乙烷)，并且包括包含结构-(CH2CH2O)n-的分子，其中n为2至约800的整数。常用PEG为封端PEG，其中PEG的一端用相对无活性的基团(例如烷氧基)封端，而另一端为可进一步修饰的羟基。常用封端基团为甲氧基而相应的封端PEG常表示为mPEG。常使用符号PEG，而不使用mPEG。本发明的特定PEG形式为支链、直链、分叉PEG等并且PEG基团通常为多分散性，具有小于约1.05的低多分散指数。本发明的PEG部分为指定分子量，通常将由一些聚乙二醇(环氧乙烷)单体组成。例如，分子量为2000Da的PEG部分通常将由43±10个单体组成，平均为43个单体左右。术语“聚乙二醇化”指PEG与另一分子(例如C肽)的共价连接。
[0288] 在C肽的替代疗法的上下文中，术语“替代剂量”指将血液中的C肽或聚乙二醇化C肽水平维持在预期范围之内，尤其是维持在最低有效治疗水平或以上的水平的C肽或聚乙二醇化C肽的剂量。在某些方面，替代剂量将给药间隔期间的平均稳态浓度C肽或聚乙二醇化C肽水平维持在约0.1nM的最低水平以上。在某些方面，替代剂量将给药间隔期间的平均稳态浓度C肽或聚乙二醇化C肽水平维持在约0.2nM的最低水平以上。在某些方面，替代剂量将给药间隔期间的平均稳态浓度C肽或聚乙二醇化C肽水平维持在约0.4nM的最低水平以上。
[0289] 关于胰岛素或聚乙二醇化C肽施用模式的术语“皮下”或“经皮下”或“S.C.”指作为大剂量注射剂施用药物，或通过植入式装置将药物施用至皮下组织中或下方，真皮和表皮正下方的皮层(统称为皮肤)。皮下施用和/或植入的优选部位包括上臂的外部区域，腰部正上方和正下方，肚脐周围除外(2英寸圆)。臀部的上部区域，臀骨正后方。大腿前部，外侧中间，大腿顶部以下4英寸至膝盖以上4英寸。
[0290] 术语“单剂量”指患者已接受单剂量的药物组合物或期间经过清除期后施用了重复单剂量。除非特别指定为“单剂量”或“稳态”，本文公开和要求保护的药代动力学参数涵盖单剂量和多剂量情况。
[0291] 术语“序列相似性”指有或没有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间同一性或符合程度(见以上Reeck等)。然而，在常用时和本申请中，术语“同源”，当用诸如“高度”等副词修饰时，可指序列相似性并且可能涉及或不涉及共同进化起源。
[0292] 用“统计上显著”指结果不可能偶然发生。可通过本领域已知的任何方法测定统计显著性。常用显著性测量方法包括p-值，p-值是如果无效假设为真，观察事件发生的频率或可能性。如果得到的p-值小于显著性水平，则拒绝无效假设。在简单情况下，显著性水平定义为p-值0.05或更小。
[0293] 如本文所定义，术语“缓释”、“延释”或“贮库制剂”指在比直接I.V.或S.C.施用单剂量药物后药物可用的周期更长的周期内，从缓释组合物或缓释装置释放药物(例如聚乙二醇化C肽)。一方面，缓释将是在至少约1-2周、约2-4周、约1-2个月、约2-3个月或约3-6个月内发生的释放。在某些方面，缓释将是在约6个月至约1年内发生的释放。如本文更全面地描述，释放的持续性和释放的水平可受缓释装置(例如，可编程泵或渗透性驱动泵)或缓释组合物的类型和所用聚乙二醇化C肽的类型(例如，单体比例、分子量、嵌段组合物和聚合物的不同组合)、多肽载量和/或产生预期效果的赋形剂的选择影响。
[0294] 根据本发明的任何方法提供各种缓释曲线图。“缓释曲线图”指在施用最初24h内体内出现低于50％在植入/插入或施用药物的其它方法过程中出现的总药物释放量的释放曲线图。在本发明的一个优选实施方案中，延释曲线图选自：a)在植入/插入或其它施用方法后48-72h之间出现的50％释放点；b)在植入/插入或其它施用方法后72-96h之间出现的50％释放点；c)在植入/插入或其它施用方法后96-110h之间出现的50％释放点；d)在植入/插入或其它施用方法后1-2周之间出现的50％释放点；e)在植入/插入或其它施用方法后2-4周之间出现的50％释放点；f)在植入/插入或其它施用方法后4-8周之间出现的50％释放点；g)在植入/插入或其它施用方法后8-16周之间出现的50％释放点；h)在植入/插入或其它施用方法后16-52周(1年)之间出现的50％释放点；和i)在植入/插入或其它施用方法后52-104周之间出现的50％释放点。
[0295] 另外，使用缓释组合物可降低药物血浆浓度的“波动程度”(“DFL”)。DFL是对药物在给药间隔期间药物血浆水平如何变化的测量(Cmax-Cmin/Cmin)。对于简单情况而言，例如I.V.施用，由消除半衰期(T1/2)和给药间隔之间的关系决定波动。如果给药间隔与半衰期相等，则谷浓度正好为峰浓度的一半，波动程度为100％。因此DFL降低的缓释组合物(对于相同给药间隔而言)表示峰和谷血浆水平之差已经减小。优选地，接受聚乙二醇化C肽的缓释组合物的患者的DFL大约是以相同给药间隔接受非延释组合物的患者的DFL的50％、40％或30％。
[0296] 术语“治疗”意在缓解、减轻、延迟、减少、逆转、改善、管理或预防患者病状的至少一种症状。术语“治疗”也可意在阻止、延迟发作(即，疾病临床表现之前的时期)，和/或降低使病状发展或恶化的风险。
[0297] 如本文所使用，术语“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是在施用之后引起预期生物反应所需的药物(例如，胰岛素或聚乙二醇化C肽)的量。
[0298] 术语“单位剂型”指适合人和动物患者并且如本领域所知单独包装的物理离散单元。为了本发明的目的，考虑到包含治疗有效量的药物的本发明剂型可能包括一个或多个单位剂量(例如，片剂、胶囊、粉剂、半固体[例如，新椭圆胶丸或膜]、供口服的液体、注射用安瓿或小瓶、加载注射器)，以达到治疗效果。为了本发明的目的，进一步考虑到，剂型的优选实施方案为皮下可注射剂型。
[0299] 术语“约”或“大约”指在由本领域的普通技术人员定义的特殊值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或测定值，即测量系统的限制。例如，“约”可指本领域每次实践中，在1个或1个以上的标准偏差内。可选地，关于组合物的“约”可指增加或减去达20％、优选达10％、更优选达5％的范围。
[0300] 如本文所使用和所附的权利要求中，除非上下文明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提到“一个分子”包括一个或多个此类分子，“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，提到“一种抗体”包括一种或多种此类不同抗体，并且提到“所述方法”包括提到本领域中普通技术人员已知，可修改或代替本文所述方法和药物组合物的等效步骤和方法。
[0301] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。在公开的某些部分中使用了表A中列出的以下缩写。
[0302]
[0303]
[0304] 虽然在本发明的实践或试验中可使用与本文所述相似或等效的任何方法、组合物、试剂、细胞，但是本文描述了优选方法和材料。
[0305] 所有公布和参考，包括但不限于本说明书中引用的专利和专利申请，通过引用整体并入本文，如同特别单独指出，如全面阐述，通过引用将每个单独的公布或参考并入本文一样。以上述公布和参考的方式，也通过引用将本申请要求优先权的任何专利申请整体并入本文。
[0306] 除非另外指出，否则本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术，所述技术在本领域普通技术人员的能力范围之内。在文献中解释了此类技术。见，例如，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual， 第 2 版， 第 1-3 篇，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；
Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols inMolecular Biology，，第9、
13 和 16 章，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree 和 A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA StructurePart A：Synthesis and Physical Analys of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Handbook of Drug Screening，由RamakrishnaSeethala、Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，N.Y.，MarcelDekker，ISBN 0-8247-0562-9)；Lab Ref：
A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，由JaneRoskams 和Linda Rodgers编，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3；Harris，JM 和 Zalipsky，S 编，Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications，ACS，Washington，1997；Veronese，F. 和J.M.Harris 编，Peptide and protein PEGylation，AdvancedDrug Delivery Reviews，
54(4)453-609(2002)；Zalipsky，S.等，“Use offunctionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification of polypeptides”Polyethylene Glycol Chemistry中：Biotechnical and BiomedicalApplications。这些通用文本的每一个均通过引用并入本文。
Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols inMolecular Biology，，第9、
13 和 16 章，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree 和 A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA StructurePart A：Synthesis and Physical Analys of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Handbook of Drug Screening，由RamakrishnaSeethala、Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，N.Y.，MarcelDekker，ISBN 0-8247-0562-9)；Lab Ref：
A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，由JaneRoskams 和Linda Rodgers编，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3；Harris，JM 和 Zalipsky，S 编，Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications，ACS，Washington，1997；Veronese，F. 和J.M.Harris 编，Peptide and protein PEGylation，AdvancedDrug Delivery Reviews，
54(4)453-609(2002)；Zalipsky，S.等，“Use offunctionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification of polypeptides”Polyethylene Glycol Chemistry中：Biotechnical and BiomedicalApplications。这些通用文本的每一个均通过引用并入本文。
[0307] 以上讨论的公布仅为其在本申请的申请日期之前的公开内容而提供。不得将本文任何条款视为承认本发明无权先于因先前发明所作的此类披露。
[0308] I.聚乙二醇(PEG)
[0309] PEG是众所周知在许多水溶剂和有机溶剂中具有良好溶解性的聚合物，表现出低毒性，无免疫原性，并且澄清、无色、无味、稳定。由于这些和其它原因，已选择PEG作为用于连接的优选聚合物，但是仅仅为了说明而采用，而不是为了限制。可用其它水溶性聚合物获得相似产物，包括但不限于：聚乙烯醇、其它聚(环氧烷烃)(例如聚(丙二醇)等)、聚(氧乙基化多元醇)(例如聚(氧乙基化丙三醇)等)、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐和聚氨基酸。本领域的技术人员将能够根据所需剂量、循环时间、抗蛋白水解性和其它因素选择所需聚合物。
[0310] 用于将此类聚合物偶联至活性部分的代表性聚合物试剂和方法描述于以下文 献 中：Harris，J.M. 和 Zalipsky，S. 编，Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications，ACS，Washington，1997；Veronese，F. 和 J.M.Harris编，Peptide and Protein PEGylation，AdvancedDrug Delivery Reviews，54(4)；453-609(2002)；Zalipsky，S.等，″Use ofFunctionalized Poly Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides″in Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and BiomedicalApplications，J.M.Harris 编，Plenus Press，New York(1992)；
Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16：157-182和Roberts等，Adv.DrugDelivery Reviews，54，459-476(2002)。
Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16：157-182和Roberts等，Adv.DrugDelivery Reviews，54，459-476(2002)。
[0311] 各种PEG衍生物可商购获得并且适合用于制备本发明的PEG偶联物。例如，NOF Corp.的 系列(www.peg-drug.com)提供了许多PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和活化PEG衍生物，例如琥珀酰亚胺酯、甲氧基-PEG胺、马来酰亚胺和羧酸，用于通过各种方法与C肽偶联，并且Nektar Therapeutics的AdvancedPEGylation还提供了不同的PEG偶联技术，以提高治疗的安全性和功效。另外用于形成本发明C肽偶联物的PEG包括可从Polypure(Norway)、QuantaBioDesign LTD(Ohio)和Sunbio，Inc(South Korea)获得的PEG。更多适合用于形成本发明偶联物的PEG试剂和偶联方法描述于Pasut.G.等，Expert Opin.Ther.Patents(2004)，14(6)859-893中。
[0312] 检索专利、公布的专利申请和相关公布也将为阅读本公开的本领域技术人员提供重要可能的PEG偶联技术和PEG衍生物。例如，其美国专利No.7,026,440、6,858,736、6,828,401、6.602,498、6,495,659、6,448,369、6,436,386、5,990,237、5,932,462、
5,900,461、5,824,784、5,739,208、5.672,662、5,650,234、5,629,384、5,252,714 和
4,904,584描述了此类技术和衍生物及其生产方法，所述专利的内容通过引用整体并入。
5,900,461、5,824,784、5,739,208、5.672,662、5,650,234、5,629,384、5,252,714 和
4,904,584描述了此类技术和衍生物及其生产方法，所述专利的内容通过引用整体并入。
[0313] 根据本发明所述的聚乙二醇化C肽具有分子量在约4,000Da-80,000Da的范围内变化的PEG部分。分子量范围通常为从约4000Da至约10,000Da、从约10,000Da至20,000Da、从约20,000Da至30,000Da、从约30,000Da至40,000Da、从约40,000Da至
50,000Da、从约50,000Da至60,000Da、从约60,000Da至70,000Da和从约70,000Da至
80,000Da。PEG部分平均分子量的非限制性实例为约10,000Da、约20,000D、约30,000Da、约40,000Da、约50,000Da、约60,000Da、约70,000Da和约80,000Da。
50,000Da、从约50,000Da至60,000Da、从约60,000Da至70,000Da和从约70,000Da至
80,000Da。PEG部分平均分子量的非限制性实例为约10,000Da、约20,000D、约30,000Da、约40,000Da、约50,000Da、约60,000Da、约70,000Da和约80,000Da。
[0314] 因为实际上所有PEG聚合物均作为不同高分子量的混合物存在，所以通常将PEG分子量(MW)报道为数量平均(Mn)、加权平均(Mw)或z-平均(Mz)分子量。加权平均很可能是三者中最有用的，因为加权平均清楚地说明了不同尺寸的链对聚合物整体行为的贡献，并且与多数目标物理性质相关最多。
[0315] 数量平均
[0316] 加权平均
[0317] Z平均
[0318] 其中“Ni”为聚合物混合物中分子量为“Mi”的分子的摩尔-分数(或数量-分数)。Mw与Mn之比称为多分散指数(PDI)，并且提供了对分布宽度的粗略指示。对于MW分布极窄的特殊聚合物而言，PDI达到1.0(下限)。
[0319] 对于指定分子量而言，本发明的PEG基团通常将由一些乙二醇(或环氧乙烷；OCH2CH2)单体组成。例如，分子量为2000Da的PEG基团通常将由43±10个单体组成，平均为43-44个单体左右。
[0320] 本发明的PEG基团通常将包含许多亚单位，例如在要求保护的任何化合物中每个n、n1或n2或n3可各自独立为约1至约1000、约1至约800、约1至约600、约1至约400、约1至约300、约1至约200。非常适合的PEG基团是其中亚单位的数量(即n1、n2和n3)独立选自：约800至约1000；约800至约950；约600至约850；约400至约650；约200至约450；约180至约350；约100至约150；约35至约55；约42至约62；约12至约25个亚单位；约1至约10个亚单位的PEG基团。在某些实施方案中，聚乙二醇化C肽的分子量将为约40kDa，并且因此支链PEG中每条PEG链的n1和n2将在约440至约550或约450至约520的范围之内。
[0321] 也可使用总分子量为前述任何值的支链型PEG聚合物(例如，由两个或更多个10,000Da至20,000Da的PEG聚合物构成的40,000Da支链PEG聚合物等)。
[0322] 本文描述的代表性支链聚合物包括具有以下通用结构的聚合物：PEG)y-[核心]-[连接子]；
[0323] 其中“[核心]”是从中延伸出2条或更多条PEG臂的中心或核心分子，变量“y”表示PEG臂的数量，而“[连接子]”表示通常将[核心]偶联至C肽的任选连接部分(如以下进一步定义)。在支链PEG的一个替代性实施方案中，至少一条聚合物臂具有适于和C肽反应的末端官能团(例如，NHS部分)。通常，本发明的支链聚合物偶联至C肽的N端氨基。
[0324] 在更多实施方案中，连接子部分可表示水解稳定的，或可选地，可降解的连接子，这意味着在生理条件下可使该键合水解，例如该键合包含酯、可水解氨基甲酸酯、碳酸酯或其它此类基团。水解可降解的键合，不但在聚合物骨架中用作可降解键合，而且在本发明的某些实施方案的情况下，用于将水溶性聚合物共价连接至C肽，所述键合包括：碳酸酯；亚胺，例如由胺和醛反应产生(见，例如，Ouchi等(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)；磷酸酯，例如通过使醇与磷酸基团反应形成；腙，例如通过酰肼和醛反应形成；缩醛，例如通过醛和醇反应形成；原酸酯，例如通过甲酸酯和醇之间反应形成；酯和某些聚氨脂(氨基甲酸酯)键合。美国专利No.6,348,558、5,612,460、5,840,900、5,880,131和6,376,470中描述了用于根据本发明制备可释放C肽偶联物的说明性PEG试剂。通常，可释放连接子可与C肽中任何残基连接，并且不限于N端氨基酸。
[0325] 支链PEG，例如通常用上式(PEG)y-[核心]-[连接子]表示的PEG，可具有2条聚合物臂至约8条聚合物臂(即，“y”范围从2至约8)。优选地，此类支链PEG通常具有2至约4条聚合物臂，多臂聚合物包括具有2、3、4、5、6、7或8条PEG臂的聚合物。
[0326] 上述支链PEG中的核心分子包括之后进一步官能化的多元醇。此类多元醇包括具有1-10个碳原子和1-10个羟基的脂肪族多元醇，其包括乙二醇、烷烃二醇、烷基二醇、亚烷基烷基二醇、烷基环烷烃二醇、1，5-萘烷二醇、4，8-二(羟甲基)三环癸烷、亚环烷基二醇、二羟基烷烃、三羟基烷烃等。也可采用脂环族多元醇，其包括直链或闭环糖和糖醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓醇、阿东糖醇、卫矛醇、岩藻糖(facose)、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、塔格糖(targitose)、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。另外的脂肪族多元醇包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖的衍生物和相关立体异构体。可使用的其它核心多元醇包括冠醚、环糊精、糊精和其它碳水化合物，例如淀粉和直链淀粉。典型的多元醇包括丙三醇、季戊四醇、山梨糖醇和三羟甲基丙烷。其它适合的核心包括赖氨酸和其它聚胺，以及包含多个末端官能团的PEG部分。
[0327] 本领域中已知具有2条臂、3条臂、4条臂和8条臂的说明性多臂PEG，并且可商购获得和/或可按本领域的技术人员已知的技术制备。(通常见Pasut等，(2004)Protein，peptide and non-peptide drugPEGylation for therapeutic application Expert Opinin.Ther.Patents 14(6)859-894)。用于形成本发明C肽偶联物的另外的支链PEG包括美国专利申请公布No.20050009988、20060194940、20090234070、20070031371，美 国 专 利 No.6,664,331、6,362,254、6,437,025、6,541,543、6,664,331、6,730,334、6,774,180、6,838,528、7,030,278、7,026,440、7,053,150、7,157,546、7,223,803、
7,265,186、7,419,600、7,432,330、7,432,331、7,511,094、7,528,202、7,589,157和PCT公布No.WO2005000360、WO2005108463、WO2005107815、WO2005028539和WO200605108463中描述的支链PEG。
7,265,186、7,419,600、7,432,330、7,432,331、7,511,094、7,528,202、7,589,157和PCT公布No.WO2005000360、WO2005108463、WO2005107815、WO2005028539和WO200605108463中描述的支链PEG。
[0328] 用于本文的示例性直链或多臂PEG包括如以下进一步描述的通式(I)、(II)、(III)或(IV)的PEG：
[0329] 一方面，聚乙二醇化C肽包含通式(I)的直链PEG：
[0330]
[0331] 其中；
[0332] R1＝烷基；并且
[0333] n1为20-800；并且其中所述连接子如下定义，并且与C肽的N端氨基连接。
[0334] 另一方面，聚乙二醇化C肽包含通式(II)的支链PEG：
[0335]
[0336] 其中；
[0337] R1＝烷基；
[0338] n1为20-800；
[0339] n2为20-800；
[0340] 其中每个连接子独立如下定义；并且
[0341] 其中连接于C肽的连接子与C肽的N端氨基连接。
[0342] 在式(II)的聚乙二醇等C肽的另一实施方案中，所述聚乙二醇化C肽具有通式(II A)的结构：
[0343]
[0344] 其中；
[0345] R1＝烷基；
[0346] n1为20-800；
[0347] n2为20-800；并且
[0348] 其中所述连接子如下定义，并且与C肽的N端氨基连接。
[0349] 另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含通式(III)的支链PEG：
[0350]
[0351] 其中；
[0352] R1＝烷基；
[0353] n1为20-800；
[0354] n2为20-800；
[0355] 其中每个连接子独立如下定义，并且
[0356] 其中连接于C肽的连接子与C肽的N端氨基连接。
[0357] 在式(III)的聚乙二醇化C肽的一个实施方案中，所述聚乙二醇化C肽具有结构(III A)：
[0358]
[0359] 其中；
[0360] R1＝烷基；
[0361] n1为20-800；
[0362] n2为20-800；并且
[0363] 其中所述连接子如下定义，并且与C肽的N端氨基连接。
[0364] 另一方面，所述聚乙二醇化C肽包含通式(IV)的支链PEG：
[0365]
[0366]
[0367] 其中；
[0368] R1＝烷基；
[0369] n1为20-800；
[0370] n2为20-800；
[0371] 其中每个连接子独立如下定义；并且
[0372] 其中将赖氨酸残基连接于C肽的连接子与C肽的N端氨基和赖氨酸残基的C端羧基连接，并且其中将赖氨酸部分连接于PEG部分的连接子通过赖氨酸分子的氨基连接。
[0373] 在式(IV)的聚乙二醇化C肽的另一个实施方案中，所述聚乙二醇化C肽具有结构(IVA)：
[0374]
[0375] 其中；
[0376] R1＝烷基；
[0377] n1为20-800；
[0378] n2为20-800；并且其中所述连接子如下定义，并且与C肽的N端氨基连接。
[0379] 本领域的普通技术人员将认识到，前面描述用于形成C肽偶联物的直链和支链PEG的讨论决非详尽的，并仅为说明性，并且涵盖了所有聚合材料和具有本文所述性质的支链PEG结构。而且，在本发明基础上，本领域的普通技术人员可容易地使用常规实验，例如通过如本文所述向患者施用偶联物并定期采集血和/或尿样获得每种偶联物的清除率曲线图，测定替代性聚乙二醇化C肽的适当尺寸和最佳结构。一旦获得每种受试偶联物的一系列清除率曲线图，就可测定具有所需清除率曲线图的偶联物或偶联物的混合物。
[0380] II.连接子部分
[0381] C肽和水溶性聚合物之间的特殊键合取决于许多因素，包括所需键合稳定性、其疏水性、采用的特殊键合化学组成和对聚乙二醇化C肽的水溶性和聚集状态的影响。示例性键合水解稳定且溶于水，代表性适合连接子可包括酰胺、聚氨脂(也称为氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也称为硫化物)或脲(也称为尿素)基团。
[0382] 有许多可商购获得的适合水溶性连接子部分的实例和/或这些实例可按本领域的技术人员已知的技术制备。以下描述了某些说明性示例连接子部分。下表D1和D2中提供了相应的活化中间体。
[0383] 在通式(I)、(II)、(III)或(IV)的聚乙二醇化C肽的一个实施方案中，所述聚乙二醇化C肽包含一个或多个独立选自以下的连接子：
[0384] -X-、-CO-、-(CH2)m2-、-(CH2)m1-CO-、-CO-(CH2)m1-、-CO-X-CO-、[0385] -(CH2)m1-X-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-(CH2)m1-、-X-CO-X-、
[0386] -X-(CH2)m1-X-、
[0387] -CO-(CH2)m1-CO-、-X-CO-(CH2)m1-、-(CH2)m1-CO-X-、
[0388] -X-(CH2)m1-CO-X-、
[0389] -X-CO-(CH2)m1X-，-X-CO-(CH2)m1-CO--X-(CH2)m1-X-CO-、
[0390] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-、
[0391] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-、
[0392] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-X-、
[0393] -X-(CH2)m1-X-CO-(CH2)m2-CO-、
[0394] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-X-和
[0395] -X-(CH2)m1-CO-X-(CH2)m2-CO-；
[0396] 其中；
[0397] 每个X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
[0398] 每个m1独立为0-5；并且
[0399] 每个m2独立为1-5。
[0400] 在式(I)、(II)、(III)或(IV)的聚乙二醇化C肽的另一实施方案中，所述聚乙二醇化C肽包含一个或多个独立选自以下的连接子：
[0401] -X1-(CH2)m4-CO-；
[0402] -X1-CO-；
[0403] -X1-CO-(CH2)m4-CO-；
[0404] -X1-CO-X2-(CH2)m3-CO-；和
[0405] -X1-(CH2)m2-X2-CO-(CH2)m4-CO-；
[0406] 其中；
[0407] X1为-O-或缺失；
[0408] X2为-NH-；
[0409] m2为1-5；
[0410] m3为2；并且
[0411] m4为1-5。
[0412] 在式(II)、(III)或(IV)的聚乙二醇化C肽的另一实施方案中，所述聚乙二醇化C肽包含一个或多个独立选自以下的连接子：
[0413] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-X-、
[0414] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m5-CO-、
[0415] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
[0416] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m5-CO-；
[0417] 其中；
[0418] X独立选自-O-、-S-或-NH-或缺失；
[0419] X1为-O-或缺失；
[0420] X2为-NH-；
[0421] 每个m5独立选自1-5；并且
[0422] 每个n3独立选自1-400。
[0423] 在式(II)、(III)或(IV)的聚乙二醇化C肽的另一实施方案中，所述聚乙二醇化C肽包含一个或多个独立选自以下的连接子：
[0424] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-(CH2)m6-CO-、
[0425] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-和
[0426] -X1-CO-X2-(CH2)m5-X1-(CH2-CH2-O)n3-CO-(CH2)m7-CO-；
[0427] 其中；
[0428] X1为-O-或缺失；
[0429] X2为-NH-；
[0430] m5为3；
[0431] m6独立为2或5；
[0432] m7为3；并且
[0433] n3为1-400。
[0434] 在式(IV)的聚乙二醇化C肽的另一实施方案中，所述聚乙二醇化C肽包含选自以下的连接子：
[0435] -X-、-CO-、-(CH2)m2-和-X1-C(O)-X2-；
[0436] 其中；
[0437] X独立选自-O-或-S-或-NH-或缺失；
[0438] X1和X2独立选自-NH-或-O-或缺失；并且m2独立为1-5。
[0439] 本领域的普通技术人员将认识到，前面描述用于形成C肽偶联物的连接子部分的讨论决非详尽的，并仅为说明性，并且涵盖了所有具有本文所述性质的连接子。
[0440] 而且，在本文所述教学的基础上，本领域的普通技术人员可容易地使用常规实验测定连接子的适当尺寸和最佳结构。例如通过测试许多可商购获得的具有不同连接子部分的不同PEG衍生物并表征所得的聚乙二醇化C肽的生物学活性、溶解性和稳定性。
[0441] III.活化官能团和反应条件
[0442] 人C肽中仅天然游离氨基为N端氨基，因此可使用多种可商购获得的活化PEG和标准偶联方法容易地实现聚合PEG基团与C肽N端氨基的选择性偶联。
[0443] 一种方法是，通过活化官能团，例如琥珀酰亚胺衍生物(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS))使C肽与PEG试剂偶联。在这种方法中，使具有活性酯的PEG在室温或4℃下，在适当pH条件下于水介质中和C肽反应几小时至过夜。通常，使聚合物试剂通过本文所述的连接子与活化官能团偶联。
[0444] 通常用具有N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS基团)的PEG试剂，在室温或4℃下，在弱碱性pH条件，例如pH范围从约7.5至约8，于极性非质子溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈或其组合(有少量水以使肽溶解)中进行N端聚乙二醇化。反应时间通常在1-24h范围之内，这取决于反应的pH和温度。
[0445] 通常用具有醛基的PEG试剂，在温和条件下，在氰基硼氢化钠(10当量)存在下，在4℃，pH为约5-10下进行N端聚乙二醇化，持续约20-36h。例如，可于pH 5.0～6.0的100mM醋酸钠或100mM磷酸二氢钠缓冲液中进行N端聚乙二醇化。缓冲液可能另外含有
20mM氰基硼氢化钠。化合物与mPEG-醛的摩尔比可能为1∶5～1∶10。然后可在环境或制冷温度下搅拌聚乙二醇化过夜。
20mM氰基硼氢化钠。化合物与mPEG-醛的摩尔比可能为1∶5～1∶10。然后可在环境或制冷温度下搅拌聚乙二醇化过夜。
[0446] 通常用pH为约8-8.3的硼酸盐或磷酸盐缓冲液，在室温下用具有对硝基苯氧基羰基的PEG试剂进行N端聚乙二醇化过夜。
[0447] 对于所有偶联反应而言，可采用不同比例的聚合物试剂和C肽，例如从等摩尔比到10倍摩尔过量的聚合物试剂。通常，达2倍摩尔过量的聚合物试剂将足够。示例性活化PEG包括，例如，表D1和表D2中列出的PEG。下表中，列出了所选的聚乙二醇化试剂。明显地，其它活性基团和连接子可被采用，并且为本领域的技术人员已知。
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453] 在中和反应缓冲液后，可通过任何便利方法，例如通过用异丙醚沉降，接着进行反相HPLC或离子交换色谱法纯化聚乙二醇化C肽。
[0454] IV.治疗形式的C肽
[0455] 如本文所使用的术语“C肽”或“胰岛素原C肽”包括保持C肽活性的所有天然存在和合成形式的C肽。此类C肽包括人类肽，以及源自其它动物种和属(优选哺乳动物)的肽。优选地，“C肽”指具有氨基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(表D3中的SEQ.ID.No.1)的人类C肽。
[0456] 来自许多不同物种的C肽已经测序，并且在本领域中已知至少部分功能可交换。因此，选择来自除人以外的种或属的C肽的变异体是轻而易举的事。表D3中示出了几种此类C肽变异体(即，来自其它物种的代表性C肽)(见SEQ.ID.No.1-29)。
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463] 因此，来自人类以及其它物种的C肽(SEQ.ID No.1-29)的所有此类同系物、同源物和天然存在的异形体均包括在本发明的方法和药物组合物中，只要它们保持可检测的C肽活性。
[0464] C肽可呈其天然形式，即与可看作人C肽的功能等效变异体的不同物种在大自然中出现的不同变异体，或所述变异体可能是其功能等效的天然衍生物，所述衍生物可能在氨基酸序列上不同，例如由于截断(例如，从N或C端或二者)或其它氨基酸缺失、添加、插入、取代或翻译后修饰。还特别将天然存在的化学衍生物(包括C肽的翻译后修饰和降解产物)包括在本发明的任何方法和药物组合物中，其包括(例如)C肽的焦谷氨酰、异天冬氨酰、蛋白水解、磷酸化、糖基化、氧化、异构化和脱氨基化变异体。
[0465] 本领域中已知合成修饰蛋白质或肽序列，同时保持其有用活性，并且这可使用本领域中标准的并且在文献中广泛描述的技术来实现，例如随机或定点诱变、裂解和氨基酸连接，或通过化学合成或修饰氨基酸或多肽链实现。类似地，在本领域的技术范围之内，如果出现，使用C肽变异体处理和/或减轻免疫原性，例如通过使用自动化计算机识别程序鉴定可能的T细胞抗原决定部位，使用定向进化方法鉴定免疫原性较低的形式。
[0466] 只要保持活性，可进行此类任何修饰或其组合并且可用于本发明的任何方法和药物组合物中。已知分子的C末端对活性很重要。因此优选地，在此类C肽变异体或衍生物中应保留C肽的C末端，更优选地，C肽的C端五肽(EGSLQ)(SEQ.ID.No.31)应被保留或是足够的(见Henriksson M等：Cell Mol.Life Sci.62：1772-1778，(2005))。如上所述，可通过氨基酸取代进行氨基酸序列的修饰，例如氨基酸可被保持肽的物理化学特征的另一种氨基酸置换(例如，A可被G置换或反之亦然，V被A或L置换；E被D置换或反之亦然；和Q被N置换)。通常，取代氨基酸具有与置换氨基酸相似的性质，例如疏水性、亲水性、电负性、侧链庞大等。
[0467] 对C肽序列中部(例如，对人C肽的残基13-25)的修饰使得产生C肽的功能性衍生物或变异体。因此，可用于本发明任何方法或药物组合物的C肽可能具有与天然C肽氨基酸序列，例如表D3中所示SEQ.ID.No.1的人C肽序列或任何其它天然C肽序列基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，C肽可能具有与表D3所示SEQ.ID.No.1-29中任一个的氨基酸序列，优选与SEQ.ID.No.1的天然人序列有至少30％，优选至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，用于本发明任何方法或药物组合物的C肽与选自表D3的序列至少80％相同。另一方面，用于本发明任何方法或药物组合物的C肽与人C肽(SEQ.ID.No.1)具有至少80％同一性。虽然可如上所述改变C肽的任何氨基酸，但是优选保留人C肽(SEQ.ID.No.1)的3、11和27位或其它物种C肽的相应或等效位点的一个或多个谷氨酸。优选地，保留SEQ.ID.No.1的3、11和
27位的所有谷氨酸残基(或相应Glu残基)。可选地，优选保留人C肽的Glu27(或非人C肽的相应Glu残基)。可用于本发明任何方法或药物组合物的示例性功能等效形式的C肽包括氨基酸序列：
27位的所有谷氨酸残基(或相应Glu残基)。可选地，优选保留人C肽的Glu27(或非人C肽的相应Glu残基)。可用于本发明任何方法或药物组合物的示例性功能等效形式的C肽包括氨基酸序列：
[0468] EXEXXQXXXXELXXXXXXXXXXXXALBXXXQ(SEQ.ID.No.30)
[0469] GXEXXQXXXXELXXXXXXXXXXXXALBXXXQ(SEQ.ID.No.33)
[0470] 如本文所使用，X为任何氨基酸。N端残基可为Glu或Gly(分别对于SEQ.ID.No.30或SEQ.ID.No.33而言)。天然C肽序列的功能等效衍生物或变异体可根据本领域众所周知的技术容易地制备，并且包括具有天然C肽的功能(例如，生物学)活性的肽序列。
[0471] 天然或合成C肽序列的片段也可具有所述片段源自其中的肽的所需功能性质并且可用于本发明的任何方法或药物组合物中。因此，如本文所使用的术语“片段”包括C肽的片段，条件是所述片段保持整个分子的生物学活性或利于治疗的活性。所述片段也可包括C肽的C端片段。优选的片段包含天然C肽的残基15-31，尤其是残基20-31。还优选包含五肽EGSLQ(SEQ.ID.No.31)(天然人C肽的残基27-31)的肽。因此片段尺寸在(例如)4至30个氨基酸或5至20个残基之间变化。WO 98/13384中公开了适合的片段，其内容通过引用并入本文。
[0472] 所述片段也可包括通常具有序列EAEDLQVGQVEL(SEQ.ID.No.32)的C肽的N端片段，或其包含2个酸性氨基酸残基，能够采用所述2个酸性氨基酸残基在其α-碳之间空间间隔距离为9-14A的构象的片段。还包括具有N和/或C端扩展或侧翼序列的片段。此类扩展肽的长度可能不同，但通常长度不超过50、30、25或20个氨基酸。美国专利No.6,610,649中描述了代表性的适合片段，其特此通过引用整体并入。
[0473] 在这种情况下，应意识到扩展或侧翼序列将是并非天然存在的或天然C肽，尤其是所述片段源自其中的C肽天然的氨基酸序列。此类N和/或C端扩展或侧翼序列可包含(例如)1-10、1-6、1-5、1-4、或1-3个氨基酸。
[0474] 因此如本文所使用的术语“衍生物”指与天然序列相比具有修饰的C肽序列或其片段。此类修饰可为一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或取代。这些修饰可以是连续或非连续的。代表性变异体可包括与SEQ.ID.No.1-33的任一个相比，具有1-6个，或更优选1-4、1-3或1或2个氨基酸取代、插入和/或缺失的变异体。经取代的氨基酸可为任何氨基酸，尤其是众所周知的20种常规氨基酸之一(Ala(A)；Cys(C)；Asp(D)；Glu(E)；Phe(F)；Gly(G)；His(H)；Ile(I)；Lys(K)；Leu(L)；Met(M)；Asn(N)；Pro(P)；Gin(Q)；Arg(R)；
Ser(S)；Thr(T)；Val(V)；Trp(W)；和Tyr(Y))。任何此类C肽变异体或衍生物均可用于本发明的任何方法或药物组合物中。
Ser(S)；Thr(T)；Val(V)；Trp(W)；和Tyr(Y))。任何此类C肽变异体或衍生物均可用于本发明的任何方法或药物组合物中。
[0475] 天然L-氨基酸的异构体，例如D-氨基酸可并入以上任何形式的C肽中，并且可用于本发明的任何方法或药物组合物中。另外的变异体可能包括氨基和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。较长的肽可能包含一个或多个C肽序列(例如SEQ.ID.No.1-33的任一个)的多个拷贝。插入氨基酸序列变异体是在蛋白质的位点引入一个或多个氨基酸残基的变异体。缺失变异体特征在于，从序列中去除了一个或多个氨基酸。变异体可包括(例如)在其它物种中或由于地理差异，(例如)和它们在大自然中出现不同的等位变异体。所有此类C肽变异体、衍生物、融合蛋白或片段包括在内，可用于本文公开的任何方法权利要求或药物组合物中，并且归入术语“C肽”中。
[0476] 聚乙二醇化形式的C肽、C肽变异体、衍生物及其片段在它们具有可检测C肽活性方面功能等效。更特别的是，它们表现出天然胰岛素原C肽，尤其是人C肽的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或高于100％的活性。因此，它们能够起胰岛素原C肽的作用，即，可取代C肽本身。此类活性指天然C肽表现出的任何活性，在体内或体外试验系统中表现出的生理反应，或(例如)在酶测定中或在与试验组织、膜或金属离子的结合中由天然C肽介导的任何生物学活性或反应。因此，已知C肽引起钙流入并发起一些胞内信号级联，例如MAP激酶途径的磷酸化，其包括ERK 1和2、CREB、PKC、GSK3、PI3K、NF-κB和PPARγ的磷酸化，导致eNOS、Na+K+ATP酶和一系列转录因子的表达增强。因此可通过在向来自有关靶组织的细胞(包括内皮细胞、肾细胞、成纤维细胞和免疫细胞)添加或施用讨论的C肽(例如，片段或衍生物)后，测定这些途径的任一种的活化或上调作用进行C肽活性的测定。例如，在Ohtomo Y等(Diabetologia 39：199-205，(1996))，Kunt T等(Diabetologia 42(4)：465-471，(1999))，Shafqat J等(Cell Mol.Life Sci.59：1185-1189，(2002))，Kitamura T等(Biochem.J.355：123-129，(2001))，Hills和Brunskill(Exp Diab Res2008)中描述了此类测定法，如WO 98/13384或Ohtomo Y等(见上文)或Ohtomo Y等(Diabetologia 41：287-291，(1998))中所述。Kunt等(见上文)中还描述了使用牛主动脉细胞和报告细胞测定法基于内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性测定C肽活性。使用(例如)Rigler R等(PNASUSA 96：13318-13323，(1999))，Henriksson M等(Cell Mol.Life Sci.57：337-342，(2000))和Pramanik A等(Biochem Biophys.Res.Commun.284：94-98，(2001))所述的荧光相关光谱法，与特殊细胞的结合也可用于估计或测定C肽活性，例如与来自人肾小管细胞、皮肤成纤维细胞和隐静脉内皮细胞的结合。
[0477] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约5倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0478] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约6倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0479] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约7倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0480] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约8倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0481] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约10倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0482] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约15倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0483] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约20倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0484] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约25倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0485] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约50倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0486] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约75倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0487] 在要求保护的任何聚乙二醇化C肽的另一方面，当经皮下向哺乳动物施用时，所述聚乙二醇化C肽具有比未修饰C肽高至少约100倍的血浆或血清药代动力学AUC性质。
[0488] 一方面，所述哺乳动物为犬。一方面，所述哺乳动物为大鼠。一方面，所述哺乳动物为人。
[0489] V.C肽和聚乙二醇化C肽生成
[0490] 可使用标准固相肽合成，或通过重组技术经合成生成C肽，例如作为由人胰岛素原生成人胰岛素的副产物，或使用基因修饰宿主生成(通常见WO 1999007735；Jonasson P等，J Biotechnol.(2000)76(2-3)：215-26；Jonasson P等，Gene(1998)；210(2)：203-10；Li SX，Tian等，生物化学与生物物理学(上海)(2003)35(11)：986-92；Nilsson J等，J Biotechnol.(1996)48(3)：241-50；Huang YB等，Acta Biochim BiophysSin( 上 海 )(2006)38(8)：586-92)。
[0491] 在直接偶联至N端的替代性方法中，在肽合成期间可在C肽的所需位点并入PEG试剂或赖氨酸残基。这样，可实现一个或多个PEG的位点选择性引入。见，例如，国际专利公布No.WO 95/00162，其描述了偶联肽的位点选择性合成。
[0492] 可通过(例如)美国专利No.6,500,645中公开的众所周知用于胰岛素生物合成的技术，使编码讨论的C肽的DNA序列在适合宿主细胞中表达生成C肽。如美国专利No.6,558,924中公开，所述C肽可直接表达，或作为多聚体化构建体表达以提高产物的产率。多聚体化产物从培养基中分离后在体外裂解。
[0493] 可通过确定的标准方法，例如Beaucage等(1981)TetrahedronLetters 22：1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBOJournal 3：801-805描述的方法经合成制备编码C肽的多核苷酸序列。根据亚磷酰胺法，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化、复制并连接以形成合成DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的途径是通过聚合酶链式反应(PCR)。
[0494] 多核苷酸序列也可能具有混合基因组、cDNA和合成来源。例如，编码前导肽的基因组或cDNA序列可与编码A链和B链的基因组或cDNA序列连接，之后可通过根据众所周知的方法插入编码所需氨基酸序列的合成寡核苷酸进行同源重组或优选通过使用适合寡核苷酸进行PCR生成所需序列而在一个位点修饰DNA序列。
[0495] 重组法通常会利用能够在所选微生物或宿主细胞中复制并携带有编码本发明的亲本单链胰岛素的多核苷酸序列的载体。重组载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。
[0496] 载体可含有确保自我复制的任何工具。可选地，载体可能是，当引入宿主细胞内时，整合至基因组中并且和与之整合的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或两个或更多个共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA的载体或质粒，或转座子。载体可为直链或闭环质粒并且将优选含有允许载体稳定整合至宿主细胞的基因组中或允许载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。
[0497] 重组表达载体能够在酵母中复制。使载体能够在酵母中复制的序列的实例为酵母质粒2pm复制基因REP 1-3和复制起点。载体可含有一个或多个允许方便地选择转化细胞的选择标记。选择标记是一种基因，其产物为原养型到营养缺陷型生物等提供杀虫剂或病毒抗性、抗重金属性。细菌选择标记的实例为来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的标记。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)和trpC(邻氨基苯甲酸酯合成酶)。适于酵母宿主细胞的标记为ADE2、H153、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。非常适合酵母的选择标记为裂殖酵母(Schizosaccharomyces pompe)TPI基因(Russell(1985)Gene40：125-130)。
[0498] 在载体中，多核苷酸序列与适合的启动子序列可操作地连接。启动子可为在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何氨基酸序列，包括突变体、截短型和杂交启动子，并且可由与宿主细胞同源或异源的编码胞外或胞内多肽的基因获得。
[0499] 适合在细菌宿主细胞中指导转录的启动子的实例为从大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)和地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)获得的启动子。适合在丝状真菌宿主细胞中指导转录的启动子的实例为从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和黑曲霉酸稳定α-淀粉酶基因获得的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Mal、TPI、ADH或PGK启动子。编码本发明C肽的多核苷酸序列通常也将与适合的终止子可操作地连接。在酵母中，适合的终止子为TPI终止子(Alber等(1982)J.Mol.AppI.Genet.1：419-434)。
[0500] 分别用于连接编码本发明亲本单链胰岛素的多核苷酸序列、启动子和终止子并将其插入含有在所选宿主中复制所必需的信息的适合载体中的方法为本领域技术人员众所周知。应理解，可通过首先制备含有编码本发明单链胰岛素的完整DNA序列的DNA构建体，随后将该片段插入适合表达载体中，或通过依次插入编码单独元件的遗传信息的DNA片段，接着连接而构建载体。
[0501] 将包含编码本发明C肽的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞中，以便将载体保持为染色体组成部分或自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖了由于复制期间出现突变而与亲本细胞不同的任何亲本细胞后代。宿主细胞可为单细胞微生物(例如原核生物)或多细胞微生物(例如，真核生物)。有用的单细胞为细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于杆菌属(Bacillus)细胞、链霉菌属(Streptomyces)细胞或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。真核细胞可为哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。酵母生物体可为在培养时生成大量本发明单链胰岛素的任何适合酵母生物体。适合酵母生物体的实例为选自以下的菌株：酿酒酵母、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、裂殖酵母、葡萄汁酵母(Sacchoromyces uvarum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyvero-myces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia ilpolytica)、假丝酵母属(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉属(Geotrichum sp.)和发酵地霉(Geotrichumfermentans)。
[0502] 例如，可通过形成原生质体，接着以本身已知的方式转化实现酵母细胞的转化。用于培养细胞的培养基可为适合酵母生物体生长的任何传统培养基。分泌的单链胰岛素，其很大一部分将以正确加工形式存在于培养基中，可通过传统方法从培养基中回收，包括通过离心、过滤从培养基中分离酵母细胞，或用离子交换基质或反相吸附基质捕捉胰岛素前体，借助于盐(例如，硫酸铵)使上清液或滤液的蛋白质组分沉淀，接着通过多种色谱法纯化，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。
[0503] VI.使用方法
[0504] 一方面，本发明包括一种将有需要的患者体内的C肽水平维持在最低有效治疗水平以上的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0505] 另一方面，本发明包括一种治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0506] 另一方面，本发明包括一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽和胰岛素的组合。
[0507] 另一方面，本发明包括在有需要的患者中用作C肽替代疗法或剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0508] 广义地讲，糖尿病指身体不能对其自身胰岛素正确反应，不产生足够胰岛素的情形或这两种情形。削弱胰岛素生产的主要结果是葡萄糖在血液中积聚，并且C肽不足导致各种短期和长期并发症。存在3种糖尿病主要形式：
[0509] 1型：由身体不能生成胰岛素和C肽引起。据估计，5-10％经诊断患有糖尿病的美国人有1型糖尿病。目前几乎所有有1型糖尿病的人必须进行胰岛素注射。术语“1型糖尿病”代替了前面几种术语，包括儿童期发作糖尿病、青少年糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。对于1型糖尿病患者而言，C肽的基础水平通常低于约0.20nM(Ludvigsson等：New Engl.J.Med.359：1909-1920，(2008))。
[0510] 2型：由组织胰岛素抗性引起，是一种细胞不能对胰岛素正确反应的病状，有时结合有相对胰岛素不足。术语“2型糖尿病”代替了前面几种术语，包括成人型糖尿病、肥胖相关糖尿病和非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。对于处于基础状态的2型患者而言，已经报道C肽水平为约0.8nM(范围0.64-1.56nM)，并且葡萄糖刺激水平为约5.7nM(范围 3.7-7.7nM)。(Retnakaran R 等：Diabetes Obes.Metab.(2009)DOI 10.11111/j.1463-1326.2009.01129.x；Zander等：Lancet 359：824-830，(2002))。
[0511] 除1型和2型糖尿病外，人们日益认识到糖尿病子类，称为成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)或成人期迟发自身免疫性糖尿病或“缓慢发作1型”，并且有时也称为“1.5型”或“一点五型”糖尿病。在这种病症指，通常在35岁及以上时出现糖尿病发作，并且始终存在抗胰岛素生成细胞的组分的抗体，证明自身免疫活性是LADA的重要特征。发现的抗体主要是抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的抗体。一些LADA患者显示出与2型患者相似的表现型，体重指数(BMI)升高或肥胖、胰岛素抗性和血脂异常。LADA的遗传学特征与1型和2型糖尿病相似。在初次发作后前6-12个月期间，患者可能不需要施用胰岛素并且他们能够通过改变饮食和/或口服抗糖尿病药物维持相对血糖量正常。然而，最后所有患者变得依赖于胰岛素，这很可能是由于进行性自身免疫活性，导致逐渐破坏胰岛β-细胞的结果。在这个阶段，LADA患者显示出低水平的或缺乏内源性胰岛素和C肽，并且他们倾向于形成与1型糖尿病患者相似，牵涉外周神经、肾脏或眼睛的长期并发症，并因此成为C肽疗法的候选人(Palmer等：Diabetes 54(附录2)：S62-67，(2005)；Desai等：Diabetic Medcine 25(附录2)：30-34，(2008)；Fourlanos等：Diabetologia 48：2206-2212，(2005))。
[0512] 妊娠糖尿病：据说，以前从未有糖尿病但是在怀孕期间血糖(葡萄糖)水平很高的孕妇有妊娠糖尿病。妊娠糖尿病影响了全部孕妇的约4％。妊娠糖尿病可能在2型(或很少1型)糖尿病形成之前发生。
[0513] 将几种其它形式的糖尿病与这几种类型分开归类。实例包括由于胰岛素分泌的遗传缺陷引起的先天性糖尿病、囊性纤维化相关的糖尿病、由高剂量的糖皮质激素诱发的类固醇糖尿病和几种形式的单基因糖尿病。
[0514] 因此在这些方法的任一种中，术语“患者”指具有任一种糖尿病的多种症状之一的个体。在这些方法的任一种的一方面，术语“患者”指具有任一种胰岛素依赖性糖尿病的多种症状之一的个体。在这些方法的任一种的一方面，术语“患者”指具有任一种2型糖尿病的多种症状之一的个体。在这些方法的任一种的一方面，术语“患者”指具有LADA多种症状之一的个体。在这些方法的任一种的一方面，术语“患者”指具有妊娠糖尿病的多种症状之一的个体。因此在这些方法的任一种的一方面，术语“患者”指空腹C肽水平低于约0.4nM的个体。在这些方法的任一种的另一方面，术语“患者”指空腹C肽水平低于约0.2nM的个体。
[0515] 糖尿病急性并发症包括在未充分控制疾病时可能出现的低血糖、糖尿病酮酸中毒、非酮高渗性昏迷。也可出现严重的长期并发症，并且在以下更详细地讨论。
[0516] 另一方面，本发明包括一种治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0517] 另一方面，本发明包括一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗剂量的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽和胰岛素的组合。
[0518] 在这个上下文中，“结合”指：1)相同单位剂型的一部分；2)通常但非必须在同一天，单独施用，但是作为相同治疗疗程或方案的一部分。一方面，可按固定日剂量使用要求保护的任一种聚乙二醇化C肽，并根据需要服用胰岛素。
[0519] 另一方面，本发明包括用于治疗有需要的患者的一种或多种长期并发症的要求保护的任一种聚乙二醇化C肽。
[0520] 在这些方法的任一种中，术语“1型糖尿病长期并发症”或“糖尿病长期并发症”指与胰岛素依赖性糖尿病有关的血糖控制削弱且C肽不足的长期并发症。通常1型糖尿病长期并发症与1型糖尿病有关。然而术语也可指在由于丢失胰岛β细胞而形成C肽不足并因此也变得依赖于胰岛素的1.5型和2型糖尿病患者中出现的糖尿病长期并发症。广义地讲，许多此类并发症由血管的原发性损伤(血管病)而引起，导致可分组为“微血管病变”(由于对小血管的损伤)和“大血管病变”(由于对大血管的损伤)的后续问题。
[0521] 术语糖尿病长期并发症中包括特定疾病和病症，包括但不限于：视网膜病变，包括具有微动脉瘤的早期视网膜病变、增生性视网膜病变和黄斑水肿；周围神经病变，包括感觉运动多神经病、痛性神经病变、急性运动神经病变、颅部和多病灶性多神经病、胸腰部神经根神经病变、近端糖尿病性神经病变和肢端神经病变，包括嵌压性和压迫性神经病变；自主神经病变，牵涉心血管系统、胃肠道、呼吸系统、泌尿生殖系统、促汗功能和乳头功能；和肾病，包括具有微量白蛋白尿、明显蛋白尿的病症和终末期肾病。
[0522] 在糖尿病中，微循环灌流受损似乎对神经病变和视网膜病变的发病机制至关重要。这依次反映了高血糖介导的血管内皮功能混乱，导致蛋白激酶C过度活化，一氧化氮(NO)的利用率降低，过氧化物和内皮素-1(ET-1)生成增多，胰岛素功能受损，前列环素/PGE1的合成减少并且白细胞的活化和内皮细胞粘附增加。这最终是一系列灾难性的临床事件。
[0523] 因此在一些实施方案中，术语“患者”指具有糖尿病长期并发症的多种症状之一的个体。
[0524] 糖尿病性视网膜病变是系统性破坏小血管，导致微血管病的眼部表现。在视网膜病变中，视网膜中生长易碎且劣质的新血管以及黄斑水肿(斑肿胀)可导致严重的视力减退或失明。作为增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)的一部分，当新的血管在眼睛后部形成时，新的血管会流血(出血)并且使视力模糊。这影响了达80％的患糖尿病10年或以上的患者。
[0525] 糖尿病性视网膜病变的症状常常缓慢发展并且轻微，并且包括视力模糊和逐渐失明。可能引起更迅速的视力减退的黄斑水肿，有时可能无任何警示信号。然而，一般而言，有黄斑水肿的人很可能视力模糊，使其难以做像阅读或驾驶等事情。在一些情况下，在一天中视力会变得更好或更坏。
[0526] 因此在一些实施方案中，术语“患者”指具有视网膜病变的多种症状之一的个体。
[0527] 糖尿病性神经病变是与牵涉供应神经的小血管(神经滋养血管)的糖尿病性微血管损伤有关的神经性病症。相对常见的可能与糖尿病性神经病变有关的病状包括第三脑神经麻痹、单神经病变和多发性单神经病变；糖尿病性肌萎缩；痛性多神经病；自主神经病变和胸腹神经病变。
[0528] 糖尿病性神经病变影响所有外周神经：痛觉纤维、运动神经元、自主神经。因此，必然会影响所有器官和系统，因为所有器官和系统受神经支配。基于受影响的器官系统和成员，有几种不同综合征，但是这些决非独有。患者可具有感觉运动和自主神经病变或任何其它组合。症状随受影响的神经不同而改变并且可包括除所列症状以外的症状。症状通常在几年内逐渐发展。
[0529] 糖尿病性神经病的症状可包括：四肢麻木和刺痛、感觉迟钝(对身体部分的感觉减退低或丧失)、腹泻、勃起功能障碍、尿失禁(膀胱失控)、阳萎、面部、口腔和眼睑下垂、视力变化、眩晕、肌无力、吞咽困难、言语障碍、肌束震颤(肌肉收缩)、性冷淡和灼痛或触电似疼痛。
[0530] 另外，不同神经以不同方式受神经病变影响。感觉运动多神经病变，其中较长的神经纤维受影响程度比较短神经纤维高，因为神经传导速度与神经长度成比例减慢。在这种综合征中，首先在每只脚的脚趾出现感觉减退低和失去反射，然后向上延伸。通常将其描述为麻木、感觉丧失、感觉迟钝和夜间疼痛的手套-袜式分布(glove-stockingdistribution)。疼痛会感觉像灼痛、刺痛感、疼痛不止或钝痛。常见的是针刺感。本体感觉丧失，早期影响对肢体所在空间的感觉。当这些患者踩到异物(如碎片)时，或当他们因鞋不合适而起老茧时，他们感觉不到。因此，这些患者有在脚和腿上出现溃疡和感染的风险，从而可导致截肢。类似地，这些患者可发生膝盖、踝骨、或脚部多发性骨折，并且出现夏科氏关节。运动功能丧失引起背屈、脚趾挛缩、骨间肌肉功能丧失，并导致脚趾收缩(所谓的锤状趾)。这些挛缩不但在脚上出现，而且在手上出现，手上肌肉组织丧失使手显得憔悴且骨瘦如柴。肌肉功能丧失是进行性的。
[0531] 自主神经病变影响为心脏工作的自主神经系统、肠胃系统和泌尿生殖系统。糖尿病中最常认识到的自主功能障碍为直立性低血压，或在起立时昏厥。在糖尿病性自主神经病变的情况下，这是由于心脏和动脉不能适当调节心率和血管紧张度以保持血液不断充分地流入大脑。这种症状通常伴有心率丧失正常变化，看上去呼吸正常。这两种结果表明为自主神经病变。
[0532] 肠胃系统症状包括胃排空延迟、胃轻瘫、恶心、胃气胀和腹泻。因为许多糖尿病患者服用口服药物治疗其糖尿病，这些药品的吸收极受胃排空延迟影响。当已经有正常或低血糖时，在饭前服用口服糖尿病剂并且在几小时或有时几天后未被吸收时，这会导致低血糖。小肠运动缓慢可引起细菌过度生长，高血糖存在使情况变得更糟。这导致胃气胀、气多和腹泻。
[0533] 泌尿生殖系统症状包括尿频、尿急、尿失禁和尿潴留。尿潴留可导致膀胱憩室、结石、反流性肾病和频繁的尿路感染。因此在这些方法的任一种中，术语“患者”指具有自主神经病变多种症状之一的个体。
[0534] 因此在一些实施方案中，术语“患者”指具有糖尿病性神经病变多种症状之一的个体。在这些方法的任一种的另一方面，患者有“确定的周围神经病变”，其特征在于腓肠神经中的感觉神经传导速度(SCV)减小(对于匹配的正常个体而言，与身体高度修正参考价值的SD小于-1.5)。在某些实施方案中，术语“患者”指具有初期神经病变多种症状之一的个体。
[0535] 因此在某些实施方案中，本发明包括一种治疗或预防受试者或患者的高度调节感觉或运动神经传导速度降低的方法。在这种方法的一方面，运动神经传导速度为初始神经传导速度。在另一实施方案中，运动神经传导速度为峰神经传导速度。
[0536] 在某些实施方案中，受试者为糖尿病患者。在某些实施方案中，受试者具有至少一种糖尿病长期并发症。一方面，患者表现出与相似高度匹配的受试组的平均峰神经传导速度至少约有2倍标准偏差的峰神经传导速度。一方面，患者的峰神经传导速度大于约35m/s。在要求保护的任一种方法的一方面，患者的峰神经传导速度大于约40m/s。一方面，患者的峰神经传导速度大于约45m/s。一方面，患者的峰神经传导速度大于约50m/s。
[0537] 在要求保护的任一种方法的一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约1.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约2.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约2.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约3.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约
3.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约4.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约4.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约5.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约5.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约6.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约7.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约8.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约9.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约10.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约15.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约20.0m/s。
3.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约4.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约4.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约5.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约5.5m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约6.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约7.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约8.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约9.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约10.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约15.0m/s。在这些方法的另一方面，治疗引起神经传导速度提高至少约20.0m/s。
[0538] 在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少10％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少15％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少20％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少25％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少30％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少40％。在这些方法的任一种的某些实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽疗法之前的峰神经传导速度相比，治疗引起峰神经传导速度提高至少50％。
[0539] 糖尿病性肾病是由肾小球中毛细血管的血管病引起的进行性肾脏疾病。其特征在于肾病综合征和弥漫性肾小球硬化症。这是由长期糖尿病引起的，并且在许多西方国家是透析的主要原因。
[0540] 糖尿病性肾病的症状可见于慢性糖尿病患者中(发作后15年或更久)。疾病是进行性的并且在男性中更常见。在美国，糖尿病性肾病是慢性肾衰竭和终末期肾脏疾病最常见的原因。患有1型和2型糖尿病的人均有风险。如果血糖水平控制不好，风险更高。进一步地，一旦出现肾病，在血压控制不好的患者中看到进展速度最高。同样，血液中胆固醇水平高的人的风险比其他人更高。
[0541] 在糖尿病性肾病病程中最早可检测的变化是肾小球滤过屏障异常。在这个阶段，肾脏可能开始允许尿中比正常更多的血清白蛋白(蛋白尿)，并且这可通过对白蛋白进行敏感医学实验检测。这个阶段称为“微量白蛋白尿”。随着糖尿病性肾病进展，越来越多的肾小球受结节性肾小球硬化症破坏。此时，尿中排泄的白蛋白的量增加，并且可通过普通尿液分析技术检测。在这个阶段，肾活组织检查明确显示为糖尿病性肾病。
[0543] 在糖尿病性肾病的整个早期病程中，糖尿病性肾病无症状。糖尿病性肾病在晚期发展并且可能是由尿中排泄大量蛋白引起或由肾衰竭引起。症状包括水肿；肿胀，通常在早上于眼睛周围出现；随后，可导致全身肿胀，例如腿部肿胀、尿液出现泡沫或过度起泡(由蛋白尿引起)、无意识的增重(由于积液)、厌食(食欲不振)、恶心呕吐、不适(全身感到不适)、疲劳、头痛、频繁打嗝和全身搔痒。
[0544] 因此在一些实施方案中，术语“患者”指具有糖尿病性肾病多种症状之一的个体。
[0545] 糖尿病性心肌病(DCM)，损伤心脏，导致舒张期功能障碍和最终心力衰竭。除大血管疾病和在糖尿病中非常常见的加速性动脉粥样硬化外，DCM是当心室功能障碍在不存在冠状动脉粥样硬化和高血压的糖尿病患者中出现时诊断到的临床病状。DCM可功能性表征为心室扩张、心肌细胞肥大、显著的间质纤维化和在舒张期功能障碍存在下的收缩功能减退或保持。
[0546] DCM的一种特殊性是潜伏期长，期间疾病进展，但完全无症状。在多数情况下，检测到DCM伴有高血压或冠心病。最早的病征之一为轻微的左室舒张功能障碍，对左室充盈的影响很小。同样，糖尿病患者可显示出与左心室顺应或左心室肥厚或二者的组合减少有关的DCM细微病征。在颈静脉搏动中也可注意到显著的“a”波，并且在整个收缩期，心尖搏动可能过于活跃或持续。在形成收缩功能障碍、左心室扩张和有症状的心力衰竭之后，颈静脉压可升高并且心尖搏动会向左下方移动。在这些病例中收缩期二尖瓣杂音并不常见。虽然通常在无症状早期没有，但是在60％无结构性心脏病的患者中这些变化伴有多种与DCM相关的心电图变化。在进展后期，QT间期延长表明纤维化。考虑到DCM的定义不包括伴随的动脉粥样硬化或高血压，在疾病非常晚期，当肥大和纤维化变得非常明显之前，灌注或心房尿钠肽水平没有变化。
[0547] 在某些实施方案中，术语“患者”指具有糖尿病性心肌病多种症状之一的个体。
[0548] 糖尿病大血管疾病包括导致心绞痛或心肌梗塞(“心脏病发作”)的冠心病，中风(主要为缺血性)，引起间歇性跛行(与劳力有关的腿和脚痛)的周围血管疾病，以及糖尿病足和糖尿病肌坏死(“肌肉耗损”)。
[0549] 在某些实施方案中，术语“患者”指具有糖尿病大血管疾病多种症状之一的个体。
[0550] 预防低血糖的方法
[0551] 在某些实施方案中，本发明包括在另外包括施用胰岛素的方案中，公开的任一种聚乙二醇化C肽降低胰岛素依赖性糖尿病人类患者的低血糖风险的用途，所述方案包括：a)向所述患者施用胰岛素；b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，施用治疗剂量的聚乙二醇化C肽；c)在由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率。
[0552] 另一方面，本发明包括一种减少胰岛素依赖性人类患者的胰岛素使用的方法，所述方法包括步骤：a)向所述患者施用胰岛素；b)在与用于所述患者施用胰岛素的部位不同的部位，经皮下向所述患者施用治疗剂量的公开的任一种聚乙二醇化C肽；c)在监测由所述治疗剂量的聚乙二醇化C肽引起所述患者胰岛素需求改变的基础上，调节施用胰岛素的剂量数量、类型或频率，其中所述经调节的胰岛素剂量并未诱发高血糖，其中所述经调节的胰岛素剂量比开始聚乙二醇化C肽之前所述患者的胰岛素剂量低至少10％。(见例如美国专利No.7,855,177，其通过引用并入本文)。
[0553] 在这些方法的任一种中，术语“低血糖”或“低血糖事件”指使患者受到潜在危害的血糖浓度异常低的所有偶发事件。美国糖尿病协会工作组已经建议胰岛素依赖性糖尿病患者关心在血糖浓度低于70mg/dL(3.9mmoL/L)时形成低血糖的可能性。因此在要求保护的任一种方法的一方面，术语低血糖或低血糖事件指患者的血糖浓度下降至低于约70mg/dL(3.9mmoL/L)的情形。
[0554] 在糖尿病的治疗中，低血糖是严重的医学并发症，并且在大多数有1型糖尿病的人和许多有晚期2型糖尿病的人中引起复发并且有时致命。另外，低血糖危及对随后血糖浓度下降的生理和行为性防御并因此引起复发性低血糖的恶性循环。因此低血糖的预防在糖尿病的治疗，以及糖尿病长期并发症的治疗中具有重要意义。
[0555] 不幸的是，对于大多数有1型糖尿病的人而言，低血糖是不争的事实(Cryer PE等：Diabetes 57：3169-3176，(2008))。一般的患者有无数次无症状低血糖的偶发事件并且每周经历两次有症状的低血糖偶发事件，在糖尿病存在期间有数千次这种偶发事件。他或她每年经历一次或多次严重的、暂时致残的低血糖偶发事件，常常带有癫痫发作或昏迷。
[0556] 总体上，低血糖在2型糖尿病中不那么频繁；然而，低血糖的风险逐渐变得更加频繁并且在2型糖尿病病程后期受血糖控制限制。Donnelly等(Diabetes Med.22：749-755，(2005))的基于人群的预期数据表明，在用胰岛素治疗的2型糖尿病中低血糖的总发病率约为1型糖尿病的1/3。任何低血糖和严重低血糖的发病率，在1型糖尿病中分别为每100名患者有4,300和115次偶发事件，而在用胰岛素治疗的2型糖尿病中分别为每100名患者有1600和35次偶发事件。
[0557] 基于低血糖事件的严重程度为低血糖分类。例如，美国糖尿病协会工作组建议了以下糖尿病低血糖分类：1)严重低血糖(即，需要另一人协助的低血糖昏迷)；2)证明有症状的低血糖(有症状并且血糖浓度低于70mg/dL)；3)无症状的低血糖(血糖浓度低于70mg/dL，无症状)；4)可能有症状的低血糖(有归因于低血糖的症状，但未测量血糖)；和
5)相对低血糖(血糖浓度高于70mg/dL，但向该水平下降)。
5)相对低血糖(血糖浓度高于70mg/dL，但向该水平下降)。
[0558] 因此在本文公开的任一种方法的另一方面，术语“低血糖”指严重低血糖和/或低血糖昏迷。在这些方法的任一种的另一方面，术语“低血糖”指有症状的低血糖。在这些方法的任一种的另一方面，术语“低血糖”指可能有症状的低血糖。在这些方法的任一种的另一方面，术语“低血糖”指无症状的低血糖。在这些方法的任一种的另一方面，术语“低血糖”指相对低血糖。
[0559] 胰岛素类型和施用形式
[0560] 全世界已经开发有180多种单独胰岛素制剂可用，以提供不同时间长短的活性(活性曲线图)。这些制剂的大约25％为可溶性胰岛素(未修饰形式)；约35％为长效或中效基础胰岛素(与NPH[中性鱼精蛋白锌胰岛素]胰岛素或慢胰岛素[胰岛素锌悬液]混合，或修饰为等电点升高[甘精胰岛素]或酰化[地特胰岛素]的形式；相对于可溶性胰岛素，这些形式的溶解性降低、皮下吸收慢并且作用持续时间长)；约2％为速效胰岛素(例如，通过氨基酸变化工程化并且自我交联(self-association)减少而皮下吸收增强的胰岛素)；并且约38％为预混胰岛素(例如，短效、中效和长效胰岛素的混合物；这些制剂有利于减少每日注射次数)。
[0561] 在美国可商购获得的短效胰岛素制剂包括普通胰岛素和速效胰岛素。普通胰岛素起效时间为30-60min，效应峰值时间为1.5-2h，并且活性持续时间为5-12h。速效胰岛素，例如门冬胰岛素(Novo Rapid)，赖脯胰岛素(Humalog)和赖谷胰岛素(Apidra)起效时间为10-30min，效应峰值时间为30min左右，并且活性持续时间为3-5h。
[0562] 中效胰岛素，例如NPH和慢胰岛素，起效时间为1-2h，效应峰值时间4-8h，并且活性持续时间为10-20h。
[0563] 长效胰岛素，例如特慢胰岛素，起效时间为2-4h，效应峰值时间8-20h，并且活性持续时间为16-24h。长效胰岛素的其它实例包括甘精胰岛素和地特胰岛素。甘精胰岛素起效时间为1-2h，并且作用持续时间为24h，但无峰值效应。
[0564] 在许多情况下，使用胰岛素管理糖尿病的方案结合了长效和短效胰岛素。例如，来自Aventis Pharmaceuticals Inc.的Lantus是一种重组人胰岛素类似物，是一种长效肠胃外降血糖剂，其作用持续时间更长(长达24h)与其吸收速率更慢直接相关。经皮下施用Lantus每天一次，优选在临睡前施用，并且据说Lantus提供持续水平的胰岛素，与正常胰腺提供的缓慢、稳定(基础)的胰岛素分泌相似。此类长效胰岛素的活性引起在24h内浓度/时间曲线相对恒定，无明显峰值，从而允许将其作为患者的基础胰岛素每天施用一次。施用时，此类长效胰岛素依靠其化学组成，而非依靠除胰岛素以外的添加物起长效效应。
[0565] 最近，已开发了用于持续输注胰岛素的自动化无线控制系统，例如销售商标为TMOMNIPOD 的系统，胰岛素管理系统(InsuletCorporation，Bedford，MA)。这些系统在离散型两部制系统(discreettwo-part system)中以血糖监测技术提供持续的皮下胰岛素递送。这种系统消除了对每天注射胰岛素的需要，并且不需要通过管路连接的传统胰岛素泵。
[0566] OMNIPODTM是和输液装置一样穿戴在皮肤上的一种小型轻量级设备。OMNIPODTM根据从个人糖尿病管理器(PDM)无线传输的预编程序指令递送胰岛素。PDM是用于为TMOMNIPOD 胰岛素管理系统编制定制胰岛素递送指令，监测系统的操作并使用销售商标TM
为FREESTYLE 的血糖试纸检查血糖水平的无线手持设备。没有连接设备与PDM的管路。
TM
OMNIPOD 胰岛素管理系统穿戴在衣服下面，并且PDM可单独于背包、公文包或钱包中携带。
TM
与当前可用的胰岛素泵相似，OMNIPOD 胰岛素管理系统特征是，完全可编程的持续皮下胰岛素递送，有多种基础速率和大剂量(bolus)选择、建议大剂量计算、安全检查和警报特征。
为FREESTYLE 的血糖试纸检查血糖水平的无线手持设备。没有连接设备与PDM的管路。
TM
OMNIPOD 胰岛素管理系统穿戴在衣服下面，并且PDM可单独于背包、公文包或钱包中携带。
TM
与当前可用的胰岛素泵相似，OMNIPOD 胰岛素管理系统特征是，完全可编程的持续皮下胰岛素递送，有多种基础速率和大剂量(bolus)选择、建议大剂量计算、安全检查和警报特征。
[0567] 胰岛素治疗糖尿病患者的目的通常是施用足够的胰岛素，以致患者一整天的血糖水平将在生理范围之内并且碳水化合物代谢正常。因为糖尿病患者个体的胰腺未分泌一整天足够的胰岛素，所以为了通过胰岛素疗法有效控制糖尿病，必须施用称为基础胰岛素的长效胰岛素治疗，以提供控制血糖浓度和在食物未消化时保持细胞有能量供应所需的胰岛素的缓慢稳定释放。基础胰岛素是在两餐之间和夜间抑制葡萄糖生成所必需的，并且优选模拟24h内患者的正常胰腺基础胰岛素分泌。因此，糖尿病患者可每天经皮下施用单剂量的长效胰岛素，作用持续约24h。
[0568] 此外，为了通过胰岛素疗法处理餐后血糖水平升高而有效控制糖尿病，还必须施用大剂量速效治疗。通常经皮下施用的大剂量胰岛素在施用后大约1h使血浆胰岛素水平升高，从而限制餐后高血糖。因此，在一天中患者的血糖水平倾向于升得太高时，例如用餐时，可经皮下施用作用持续时间为(例如)5-6h的额外量的普通胰岛素。作为与大剂量胰岛素结合施用基础胰岛素的替代方案，可施用重复常规较低剂量的大剂量胰岛素代替长效基础胰岛素，并且可根据需要在餐后施用大剂量胰岛素。
[0569] 目前，推荐在用餐前30-45min服用普通皮下注射胰岛素。因此，糖尿病患者和其它胰岛素使用者必须参与精心计划他们的膳食和他们相对于其膳食的胰岛素施用。不幸的是，在胰岛素施用和进餐之间可能发生的介入事件可能影响预期的血糖偏移。
[0570] 此外，如果施用的胰岛素在太长时间内提供治疗效果，例如在由于进餐而出现的葡萄糖水平升高已经降低后，也有低血糖的可能。如实施例中所概述，在已经用C肽治疗的患者中由于对胰岛素的需求减少，这种低血糖风险增加。
[0571] 因此，在本文公开的任一种方法的一方面，本发明包括一种通过在开始聚乙二醇化C肽疗法后减少约5％至约50％向患者施用的胰岛素的平均日剂量而减少患者形成低血糖的风险的方法。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约45％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约40％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约35％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约30％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约25％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约20％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约15％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约5％至约10％。
[0572] 另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约2％至约10％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约2％至约15％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约2％至约20％。
[0573] 另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约50％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约45％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约40％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约35％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约30％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约25％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少约10％至约20％。另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的胰岛素剂量减少至少10％。
[0574] 在这些方法的任一种的一方面，按以上所列任一规定范围选择性减少施用的短效胰岛素剂量。在这些方法的任一种的一方面，按任一规定范围选择性减少施用的中效胰岛素剂量。在这些方法的任一种的一方面，按以上所列任一规定范围选择性减少施用的长效胰岛素剂量。
[0575] 在这些方法的任一种的一方面，按以上所列任一规定范围独立减少施用的中效和长效胰岛素剂量，然而短效胰岛素的剂量基本上保持不变。
[0576] 在这些方法的一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的短效胰岛素剂量减少约5至约50％。在另一实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的短效胰岛素剂量减少约5％至约35％。在另一实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的短效胰岛素剂量减少约10％至约20％。在这些方法的一方面，减少在餐前施用的短效胰岛素剂量。在这些方法的另一方面，减少在早上或夜间施用的短效胰岛素剂量。在这些方法的任一种的另一方面，减少施用的短效胰岛素剂量，然而向患者施用的长效和/或中效胰岛素的剂量基本上不变。
[0577] 在本文公开的任一种方法的另一方面，本发明包括一种通过在开始聚乙二醇化C肽疗法后减少约5％至约35％向患者施用的中效胰岛素的平均日剂量而减少患者形成低血糖的风险的方法。在这些方法的另一方面，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的中效胰岛素剂量减少约5％至约50％。在另一实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，中效胰岛素施用剂量减少约5％至约35％。在另一实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的中效胰岛素剂量减少约10％至约20％。在这些方法的另一方面，减少在早上或夜间施用的中效胰岛素剂量。在这些方法的任一种的另一方面，减少施用的中效胰岛素剂量，然而向患者施用的短效胰岛素剂量基本上不变。
[0578] 在本文公开的任一种方法的另一方面，本发明包括一种通过在开始聚乙二醇化C肽疗法后减少约5％至约50％向患者施用的长效胰岛素的平均日剂量而减少患者形成低血糖的风险的方法。在一个实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的长效胰岛素剂量减少约5％至约35％。在另一实施方案中，与开始聚乙二醇化C肽治疗之前患者的胰岛素剂量相比，施用的长效胰岛素剂量减少约10％至约20％。在这些方法的另一方面，减少在早上或夜间施用的长效胰岛素剂量。在这些方法的任一种的另一方面，减少施用的长效胰岛素剂量，然而向患者施用的短效胰岛素剂量基本上不变。
[0579] 在某些优选的实施方案中，与治疗之前的基线水平相比，在用聚乙二醇化C肽治疗后，患者实现更高的胰岛素利用率和胰岛素敏感性，同时经历更低的形成低血糖的风险。优选地，通过HOMA(稳态模式评估法)中统计上显著的降低测量更高的胰岛素利用率和胰岛素敏感性(Turner等：Metabolism 28(11)：1086-1096，(1979))。
[0580] 通常不向最近用于胰岛素施用的相同部位经皮下施用聚乙二醇化C肽，即聚乙二醇化C肽和胰岛素将注射至不同部位。特别地，一方面，聚乙二醇化C肽施用部位通常距离最近用于胰岛素施用的部位至少约10cm。另一方面，聚乙二醇化C肽施用部位通常距离最近用于胰岛素施用的部位至少约15cm。另一方面，聚乙二醇化C肽施用部位通常距离最近用于胰岛素施用的部位至少约20cm。
[0581] 不同部位的实例包括但不限于向左右手臂注射，或向左右大腿注射，或向左侧臀部，或右侧臀部注射，或向腹部相对侧注射。不同部位的其它明显变型包括在手臂和大腿注射，或在手臂和臀部注射，或向手臂和腹部注射等。
[0582] 而且，根据提供了关于如何选择不同胰岛素注射部位的内容的现有技术教学和有关胰岛素施用的大量教科书，本领域的普通技术人员(即医师)或糖尿病患者将认识并理解如何向不同部位的其它组合注射聚乙二醇化C肽和胰岛素。见例如，以下代表性教科书(Learning tolive well with diabetes，Cheryl Weiler编(1991)DCI Publishing，Minneapolis，MN；American Diabetes Association Complete Guide toDiabetes，ISBN0-945448-64-3(1996))。
[0583] 在要求保护的任一种方法的一方面，向距离最近用于胰岛素施用的部位大约15-20cm的腹部相对侧施用聚乙二醇化C肽。
[0584] VII.药物组合物
[0585] 一方面，本发明包括一种包含聚乙二醇化C肽和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
[0586] 对于本领域的技术人员而言，适于递送聚乙二醇化C肽的药物组合物及其制备方法显而易见并且可包含任何已知载体、稀释剂或赋形剂。例如，在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版(MackPublishing Company，1995)中可找到此类组合物及其制备方法。
[0587] 一方面，药物组合物可呈药物活性成分的无菌水溶液和/或悬浮液形式、气雾剂、软膏等。最优选为水溶液的制剂。此类制剂通常含有聚乙二醇化C肽本身、水和一种或多种用作稳定剂的缓冲液(例如，含磷酸盐的缓冲液)和任选一种或多种防腐剂。此类制剂含有(例如)约1-200mg、约3-100mg、约3-80mg、约3-60mg、约3-40mg、约3-30mg、约0.3-3.3mg、约1-3.3mg、约1-2mg、约1-3.3mg、约2-3.3mg或本文提到的范围的任一值，例如约200mg、约150mg、约120mg、约100mg、约80mg、约60mg、约50mg、约40mg、约30mg、约20mg或10mg或约8mg或约6mg或约5mg或约4mg或约3mg或约2mg或约1mg或约0.5mg的聚乙二醇化C肽并且构成本发明的又一方面。
[0588] 药物组合物可包括聚乙二醇化C肽的药学上可接受的盐。关于适合的盐的评论，见Stahl和Wermuth的Handbook of PharmaceuticalSalts：Properties，Selection，and Use(Wiley-VCH，2002)。适合的碱式盐由形成无毒盐的碱形成。代表性实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。也可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。在一个实施方案中，可将聚乙二醇化C肽制备为具有药学上可接受的带正电的离子的凝胶。
[0589] 一方面，带正电的离子可为一价金属离子。一方面，金属离子选自钠和钾。
[0590] 一方面，带正电的离子可为二价金属离子。一方面，金属离子选自钙、镁和锌。
[0591] 可在一天中的任何时间施用聚乙二醇化C肽。对于人而言，所用剂量范围为聚乙二醇化C肽约0.1-200mg/周，例如约0.1-0.3mg/周、约0.3-1.5mg/周、约1-3.5mg/周、约1.5-2.25mg/周、约2.25-3.0mg/周、约3.0-6.0mg/周、约6.0-10mg/周、约10-20mg/周、约20-40mg/周、约40-60mg/周、约60-80mg/周、约80-100mg/周、约100-120mg/周、约120-140mg/周、约140-160mg/周、约160-180mg/周和约180-约200mg/周。
[0592] 优选地，所用聚乙二醇化C肽的周总剂量为约1mg至约3.5mg、约1mg至约20mg、约20mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约150mg或约150mg至约200mg。
[0593] 聚乙二醇化C肽的周总剂量为约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5mg、约5.5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约12mg、约15mg、约18mg、约21mg、约24mg、约27mg、约30mg、约33mg、约36mg、约
39mg、约42mg、约45mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约
120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg或约200mg。(应认识到，以上提到的聚乙二醇化C肽的质量取决于递送系统的生物利用率并且基于分子质量为大约40,000Da的聚乙二醇化C肽的使用。)
39mg、约42mg、约45mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约
120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg或约200mg。(应认识到，以上提到的聚乙二醇化C肽的质量取决于递送系统的生物利用率并且基于分子质量为大约40,000Da的聚乙二醇化C肽的使用。)
[0594] 在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽的治疗剂量包括范围为约1mg至约45mg的周剂量。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽的治疗剂量包括范围为约3mg至约15mg的周剂量。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽的治疗剂量包括范围为约30mg至约60mg的周剂量。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，聚乙二醇化C肽的治疗剂量包括范围为约
60mg至约120mg的周剂量。
60mg至约120mg的周剂量。
[0595] 在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，治疗剂量的聚乙二醇化C肽将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度(Css-ave)维持在约0.2nM和约6nM之间。
[0596] 在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用3天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM和约6nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用4天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM和约6nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用5天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM和约6nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用至少一周的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.2nM和约6nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种中，通过每天皮下注射施用治疗剂量。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，通过缓释制剂或装置施用治疗剂量。
[0597] 在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用3天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.4nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用4天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.4nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用5天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.4nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用7天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.4nM和约8nM之间。
[0598] 在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用3天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.6nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用4天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.6nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用5天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.6nM和约8nM之间。在这些方法和药物组合物的任一种的另一方面，当使用7天或更长的给药间隔时，为患者提供治疗剂量的聚乙二醇化C肽，以便将患者血浆中聚乙二醇化C肽的平均稳态浓度维持在约0.6nM和约8nM之间。
[0599] 剂量可能或可能不呈溶液。如果剂量呈溶液施用，应认识到剂量的体积可变化，但是通常为20μL-2mL。优选地，用于S.C.施用的剂量指定体积为2000μL、1500μL、1200μL、1000μL、900μL、800μL、700μμL、600μμL、500μμL、400μμL、300μμL、
200μμL、100μμL、50μμL或20μL。
200μμL、100μμL、50μμL或20μL。
[0600] 呈溶液的聚乙二醇化C肽剂量也可包含防腐剂和/或缓冲液。例如，可使用防腐剂间甲酚或苯酚。防腐剂的典型浓度包括0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL。因此，防腐剂的浓度范围可包括0.2-10mg/mL，优选0.5-6mg/mL或0.5-5mg/mL。
可用缓冲液的实例包括组氨酸(pH 6.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6-7.5)或碳酸氢钠缓冲液(pH
7-7.5)。应认识到，聚乙二醇化C肽剂量可包含天然或完整C肽、C肽的片段、衍生物或其它功能等效变异体的一种或多种。
可用缓冲液的实例包括组氨酸(pH 6.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6-7.5)或碳酸氢钠缓冲液(pH
7-7.5)。应认识到，聚乙二醇化C肽剂量可包含天然或完整C肽、C肽的片段、衍生物或其它功能等效变异体的一种或多种。
[0601] VIII.施用方法
[0602] 一剂聚乙二醇化C肽可包含全长人C肽(SEQ.ID.No.1)和C端C肽片段EGSLQ(SEQ.ID.No.31)和/或C肽同系物或C肽衍生物。进一步地，需要时，剂量可仅含有C肽片段，例如EGSLQ。因此，术语“C肽”可涵盖单个C肽实体或不同“C肽”的混合物。可通过医学领域中已知的任何适合方法施用聚乙二醇化C肽，包括口服、肠胃外、局部或皮下施用、吸入或植入持续递送装置或组合物。一方面，施用是通过皮下施用。
[0603] 适合口服施用的本发明药物组合物可(例如)包含呈无菌纯化原料粉末形式的聚乙二醇化C肽，所述聚乙二醇化C肽优选用一种或多种包装物(envelope)(肠溶胶囊)覆盖防止药物在胃部降解并从而使得这些物质从齿龈处或于小肠内吸收。组合物中活性成分的总量可在重量的99.99％至0.01％之间变化。
[0604] 对于口服施用，包含聚乙二醇化C肽的药物组合物可呈溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂等形式。含有诸如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙的各种赋形剂的片剂可随同诸如淀粉和优选马铃薯或木薯淀粉和某些复合硅酸盐的各种崩解剂一起，和诸如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶的粘合剂一起使用。此外，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石的润滑剂常常对于压片用途非常有用。也可采用相似类型的固体组合物作为软和硬明胶填充胶囊的填料；在这一点上，优选材料还包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。当口服施用需要水悬浮液和/或酏剂时，本发明的化合物可与各种甜味剂、芳香剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂，以及诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种相似组合的赋形剂结合。
[0605] 待用于本发明中，适于肠胃外施用的药物组合物通常为药物活性成分的无菌水溶液和/或悬浮液，优选使其与接受者的血液等渗。此类组合物通常包含赋形剂、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3-9)，例如氯化钠、甘油、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇等。
[0606] 对于一些应用而言，用于肠胃外施用的药物组合物可适当配制呈无菌非水溶液或干燥形式以连同适合媒介物，例如无菌无热源水一起使用。使用本领域技术人员众所周知的标准制药技术，可容易地实现在无菌条件下，例如通过冻干法制备肠胃外制剂。
[0607] 用于本发明的包含聚乙二醇化C肽的药物组合物也可在局部、在真皮(内)或经皮施用至皮肤或黏膜。用于局部施用的药物组合物可配制为速释型和/或调释型。调释制剂包括延释型、缓释型、脉冲释放型、控释型、靶向释放型和程序性释放型。用于该用途的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗液、溶液、乳膏、软膏、撒布剂、敷料、泡沫、薄膜、皮肤贴剂、干胶片(wafer)、植入物、海绵、纤维、绷带和微乳剂。也可使用脂质体。典型载体包括醇、水、矿物油、液体凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可并入渗透促进剂-见，例如，Finnin和Morgan：J.Pharm.Sci.88(10)：955-958，(1999)。局部施用的其它方式包括通过电穿孔、TM TM离子电渗疗法、超声透入疗法、超声波导入术和微针或无针(例如，POWDERJECT 、BOJECT )注射。
[0608] 用于肠胃外施用的聚乙二醇化C肽的药物组合物可直接施用至血流、肌肉或内脏中。适合肠胃外施用的方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内和皮下。适合肠胃外施用的装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
[0609] 通常不向最近用于胰岛素施用的相同部位皮下施用聚乙二醇化C肽。在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，向最近用于胰岛素施用的腹部相对侧施用聚乙二醇化C肽。在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，向上臂施用聚乙二醇化C肽。在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，向腹部施用聚乙二醇化C肽。在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，向臀部上部区域施用聚乙二醇化C肽。在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，向大腿的前部施用聚乙二醇化C肽。
[0610] 用于肠胃外施用的制剂可配制成速释型和/或缓释型。缓释组合物包括延释型、调释型、脉冲释放型、控释型、靶向释放型和程序性释放型。因此可将聚乙二醇化C肽配制成悬浮液或固体、半固体或触变性液体，以便作为提供缓释的植入贮库施用。此类制剂的实例包括但不限于药物涂层支架和半固体和悬浮液，其包含载药(DL-乳酸-乙醇酸)共聚物(PGLA)、(DL-丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)或聚(丙交酯)(PLA)薄片状泡囊或微粒、水凝胶(Hoffman AS：Ann.N.Y.Acad.Sci.944：62-73(2001))，聚氨基酸纳米颗粒系统(例如Flamel TechnologiesInc.开发的Medusa系统)、非水凝胶系统(例如Atrix，Inc.开发的Atrigel和Durect Corporation开发的SABER(蔗糖乙酸异丁酯延释))和基于脂质的系统(例如，SkyePharma开发的DepoFoam)。
[0611] 本领域中已知能够在更长时间段内递送所需剂量的聚乙二醇化C肽的缓释装置。例如，美国专利No.5,034,229、5,557,318、5,110,596、5,728,396、5,985,305、6,113,938、
6,156,331、6,375,978和6,395,292教导了能够在更长时间段内(即，范围从一周以上至一年或更久的时间段)以所需速率递送活性剂制剂，例如溶液或悬浮液的渗透性驱动装TM
置。其它示例性缓释装置包括提供可从(例如)OmniPod 胰岛素管理系统获得的恒定流量、可调流量或可编程流量的有益试剂制剂的调节器式泵(Insulet Corporation，Codman of Raynham，MA，Medtronic ofMinneapolis，MN，Intarcia Therapeutics of Hayward，CA和TricumedMedinzintechnik GmbH of Germany)。美国专利No.6,283,949、5,976,109、
5,836,935和5，511,355中描述了装置的更多实例。
6,156,331、6,375,978和6,395,292教导了能够在更长时间段内(即，范围从一周以上至一年或更久的时间段)以所需速率递送活性剂制剂，例如溶液或悬浮液的渗透性驱动装TM
置。其它示例性缓释装置包括提供可从(例如)OmniPod 胰岛素管理系统获得的恒定流量、可调流量或可编程流量的有益试剂制剂的调节器式泵(Insulet Corporation，Codman of Raynham，MA，Medtronic ofMinneapolis，MN，Intarcia Therapeutics of Hayward，CA和TricumedMedinzintechnik GmbH of Germany)。美国专利No.6,283,949、5,976,109、
5,836,935和5，511,355中描述了装置的更多实例。
[0612] 因为可将植入式递送系统设计用于在更长时间段内递送治疗水平的所需活性剂，所以植入式递送系统可有利地提供长期治疗剂量的所需活性剂，而不需要经常就医或反复自我药疗。因此，植入式递送装置可通过更强的给药控制起作用，以提供更高的患者依从性、更少对施用部位的刺激、更少对医护人员的职业危害、更小的废物危害和更高的治疗效果。
[0613] 在其它挑战中，当试图在更长的时间段内从植入递送装置递送生物分子材料时，必须解决两个问题。第一，必须将生物分子材料包含于在装置作用期间的高温(即，37℃及以上)下基本上维持所述材料的稳定性的制剂中。第二，必须以允许在更长时间段内将生物分子材料从植入装置递送至所需作用环境的方式配制生物分子材料。该第二项挑战已经证实将生物分子材料放入在更长时间段内以低流速(即，≤100μL/天)从装置中递送的可流动组合物中尤其困难。
[0614] 肽类药物(例如C肽)可通过若干不同机制的一种或多种降解，包括脱酰胺作用、氧化、水解和外消旋作用。明显的是，水是许多有关降解途径的反应物。而且，水用作增塑剂并促进生物分子材料解折叠和不可逆性聚集。为解决生物分子材料的含水制剂产生的稳定性问题，已使用已知颗粒形成工艺，例如通过已知的冻干法、喷雾干燥或脱水技术产生了生物分子材料的干粉制剂。虽然已经证实生物分子材料的干粉制剂提供了适合的稳定性特征，但是期望提供不但在更长时间段内稳定，而且可流动并容易地从植入式递送装置递送的制剂。
[0615] 因此在要求保护的方法和药物组合物的任一种的一方面，在非水药物制剂中提供聚乙二醇化C肽，并且从植入式缓释装置中递送，其中聚乙二醇化C肽在37℃下稳定至少2个月。
[0617] WO98/27962公开了一种含有聚合物、可溶解聚合物并从而形成粘胶的溶剂、有益试剂和在粘胶中呈分散液滴相形式的乳化剂的可注射贮库凝胶组合物。
[0618] WO04089335公开了使用产生可混溶于水的媒介物的聚合物和溶剂组合形成的非水媒介物。如本文所使用，术语“可混溶于水”指在代表所选作用环境的温度范围下，媒介物可按所有比例与水混合，而不引起聚合物与溶剂相位分离，以致形成高粘性聚合物相。为了本发明的目的，“高粘性聚合物相”指含有表现出的粘性比媒介物与水混合之前媒介物的粘性更高的组成的聚合物。
[0619] 因此在要求保护的任一种方法的另一方面，在缓释装置中提供聚乙二醇化C肽，所述缓释装置包含：具有至少一个药物递送口的储存器和稳定的非水药物制剂。在这些方法和药物组合物的一方面，制剂包含：至少一种聚乙二醇化C肽；和包含至少一种聚合物和至少一种溶剂的非水单相媒介物，所述媒介物可混溶于水，其中所述药物不溶于一种或多种媒介物组分并且聚乙二醇化C肽制剂在37℃下稳定至少2个月。一方面，溶剂选自四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、苯甲醇、四甘醇、n-甲基吡咯烷酮、甘油缩甲醛、丙二醇及其组合。
[0620] 特别的是，如果将制剂保持在37℃下2个月之后，不超过约35％的聚乙二醇化C肽经化学途径降解，例如通过氧化、脱酰胺作用和水解，则认为非水制剂化学稳定，并且如果在相同条件下，制剂中所含C肽不超过约15％通过聚集降解，则认为制剂物理稳定。根据本发明，如果于37℃下2个月之后，至少约65％的聚乙二醇化C肽保持物理和化学稳定，则药物制剂稳定。
[0621] 聚乙二醇化C肽可经鼻内施用或通过使用或不使用适合推进剂(例如，1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷)，从干粉吸入器中吸入，通常呈干粉形式(单独地，作为混合物，例如与乳糖的干混剂，或作为混合组分颗粒，例如与磷脂(例如卵磷脂)混合)，如同来自高压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选使用电流体动力产生细雾的雾化器)或喷洒器的气雾剂喷雾或如同滴鼻剂施用。对于鼻内使用，粉剂可包含生物粘合剂，例如壳聚糖或环糊精。这些高压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器装有本发明化合物的溶液或悬浮液，包含(例如)乙醇、含水乙醇或用于分散、溶解或延长释放活性成分的适合替代性试剂、作为溶剂的推进剂和任选表面活性剂，例如失水山梨糖醇三甘油酯、油酸或低聚乳酸。
[0622] 用于干粉或悬浮制剂之前，将药品微粉化为适于通过吸入递送的尺寸(通常小于5μm)。这可通过任何适当方法实现，例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、形成纳米颗粒的超临界流体加工、高压均质法或喷雾干燥法。
[0623] 对于C肽使其进入肺部，优选进入下呼吸道或肺泡中的能力而言，通过吸入装置递送的制剂中本发明的聚乙二醇化C肽的粒度很重要。优选地，将本发明的聚乙二醇化C肽配制成以便递送的至少约10％聚乙二醇化C肽沉积于肺部，优选约10％至约20％，或更多。已知用约2pm至约3pm的粒度获得了用口呼吸的人类肺部沉积的最高效率。当粒度大于约5pm时，肺部沉积明显减少。粒度低于约1pm引起肺部沉积减少，并且变得难以递送质量足够的颗粒以达到治疗效果。因此，通过吸入递送的聚乙二醇化C肽颗粒的粒度优选为小于约10pm，更优选在约1pm至约5pm的范围之内。选择聚乙二醇化C肽的制剂以在所选吸入装置中产生所需粒度。
[0624] 有利的是，对于作为干粉施用，将本发明的聚乙二醇化C肽制备为粒度小于约10pm，优选约1至约5pm的微粒形式。优选粒度对于向患者肺泡递送有效。优选地，干粉主要由产生的颗粒构成，以致大部分颗粒的尺寸在所需范围内。有利的是，至少约50％的干粉由直径小于约10pm的颗粒制成。可通过喷雾干燥、研磨或临界点冷凝含有本发明聚乙二醇化C肽和其它所需成分的溶液获得此类制剂。本领域中已知也适于产生用于本发明的颗粒的其它方法。
[0625] 在容器中颗粒通常与干粉制剂分开，然后通过载体气流运输到肺部。通常，在当前的干粉吸入器中，使固体破裂的力仅通过患者吸入提供。在另一类吸入器中，通过患者吸入产生的气流来激活使颗粒解聚集的叶片式马达。
[0626] 用于吸入器或吹入器中的胶囊(例如，由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)、泡罩和药盒可制备为装有本发明化合物、适合粉体基料(例如乳糖或淀粉)和改性剂(例如1-亮氨酸、甘露糖醇或硬脂酸镁)的混合粉末。乳糖可无水或呈一水合物形式，优选后者。其它适合赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。
[0627] 用于使用电流体动力学产生细雾的雾化器中的适合溶液制剂每次驱动可含有100μg-200mg的聚乙二醇化C肽并且驱动体积可在1μL至100μL之间变化。典型制剂可包含聚乙二醇化C肽丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可用于代替丙二醇的替代性溶剂包括丙三醇和聚乙二醇。可向本发明用于吸入/鼻内施用的那些制剂中添加适合香料(例如甲醇和左薄荷脑)或甜味剂(例如糖精或糖精钠)。可使用(例如)PGLA将用于吸入/鼻内施用的制剂配制为速释型和/或调释型。调释制剂包括延释型、缓释型、脉冲释放型、控释型、靶向释放型和程序性释放型。
[0628] 在干粉吸入剂和气雾剂的情况下，依靠递送计量的量的阀门测定剂量单位。通常安排根据本发明的单位以施用含有1mg-200mg聚乙二醇化C肽的计量剂量或“吹气”。日总剂量通常在1mg-200mg的范围内，在一整天内可呈单剂量施用，或更通常，作为分次剂量施用。
[0629] 可商购获得的适于本发明实践的吸入装置的实例的销售商标为TM TM
TURBHALER (Astra)、 SPIROS 吸 入
TM
器(Dura)，Inhale Therapeutics在市场出售的装置的商标为AERX (Aradigm)，和雾化器(Mallinckrodt)、 雾化器(Marquest Medical
Products)、 计量剂量吸入器(Glaxo)和 粉剂吸入器
(Fisons)等。
TURBHALER (Astra)、 SPIROS 吸 入
TM
器(Dura)，Inhale Therapeutics在市场出售的装置的商标为AERX (Aradigm)，和雾化器(Mallinckrodt)、 雾化器(Marquest Medical
Products)、 计量剂量吸入器(Glaxo)和 粉剂吸入器
(Fisons)等。
[0630] 还考虑将试剂盒用于本发明。典型试剂盒将包含用于在药学上可接受的制剂中包含聚乙二醇化C肽的聚乙二醇化C肽制剂的容器(优选为小瓶)和说明书和/或产品插页或标签。一方面，说明书包括向胰岛素依赖性患者施用所述聚乙二醇化C肽以降低低血糖风险、发病率或严重程度的给药方案。一方面，试剂盒包括当开始聚乙二醇化C肽疗法时减少胰岛素施用约5％至约35％的说明书。另一方面，说明书包括对患者开始聚乙二醇化C肽疗法时密切监测其血糖水平的指导。另一方面，说明书包括对患者开始聚乙二醇化C肽疗法时避免使患者倾向于低血糖的情形或情况的指导。实施例
[0631] 缩写。以下缩写已用于说明书和实施例中：ACN＝乙腈；Bzl＝Bn＝苄基；DIEA＝N，N-二异丙基乙胺；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺；tBu＝叔丁基；TSTU＝O-(N-琥珀酰亚胺)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯；THF＝四氢呋喃；EtOAc＝乙酸乙酯；DIPEA＝DIEA＝二异丙基乙胺；HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑；NMP＝N-甲基吡咯烷-2-酮；TEA＝三乙胺；SA＝芥子酸；Su＝1-琥珀酰亚胺基＝2，5-二氧代-吡咯烷-1-基；TFA＝三氟乙酸；DCM＝二氯甲烷；DMSO＝二甲亚砜；RT＝室温；一般程序：以下实施例和一般程序是指本说明书中鉴定的中间化合物和最终产物。可选地，本文公开的其它反应或其它常规反应将适用于本发明相应化合物的制备。在所有制备方法中，所有原料已知或可容易地由已知原料制备。所有温度按摄氏度(℃)提出并且除非另外指出，当提到产率时所有份数和百分比均按重量计(即，w/w)，并且当提到溶剂和洗脱剂时所有份数按体积计(即，v/v)。
[0632] 实施例1：支链聚乙二醇化C肽的制备
[0633]
[0634] 其中R1＝甲基，并且n1和n2为约450至约520。
[0635] 将 一 (1)g 人 C 肽 (SEQ.ID.No.1)(0.33mM) 溶 于 25mL DMF/ 水 (20mL/5mL)中。用N-甲基吗啉(NMM)将pH调解至7.8。然后添加近似分子量为40,000Da的SUNBRIGHT GL2-400GS2(NOF Corporation)的溶液(1.85g活化PEG(0.04mM)于DMF/水/ACN(25mL/5mL/10mL)中)并且在室温下搅拌反应过夜。
[0636] 用纯化水将溶液稀释至700mL。DMF浓度为6％v/v。用醋酸将pH调节至4-4.5并过滤。使用YMC-ODS柱(2.5×30cm)，使用0.5％醋酸(流动相A)/100mM醋酸钠(流动相B)/ACN(流动相C)梯度进行HPLC来纯化溶液。通过用3个柱体积的90％A/10％C保持柱平衡完成分离。装载聚乙二醇化C肽，并且用90％B/10％C(3个柱体积)冲洗，接着用1个柱体积的90％A/10％C等度冲洗。通过用多元线性梯度来实现洗脱，从90％A/10％C开始，经2个柱体积至70％A/30％C，接着是由70％A/30％C并经5个柱体积上升至50％A/50％C组成的线性梯度。
[0638] 通过反相和尺寸排阻HPC分析纯化后收集的级分。使用WatersUPLCBEH C1817μM柱，使用ACN和0.1％TFA流动相，使用24％-40％ACN的二元线性梯度进行反相HPLC
3min，接着用40％-90％ACN进行1min，流速为0.25mL/min，柱温为40℃，并且样品浓度为
5mg/mL。图1中呈现了代表性色谱图。
3min，接着用40％-90％ACN进行1min，流速为0.25mL/min，柱温为40℃，并且样品浓度为
5mg/mL。图1中呈现了代表性色谱图。
[0639] 使用Superdex 75，10/300GL柱，使用pH 7.4含有2.7mM KCl和0.137M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液的流动相，以0.5mL/min的流速进行等度洗脱进行尺寸排阻色谱法。图
2中呈现了代表性色谱图。
2中呈现了代表性色谱图。
[0640] 实施例2：其它支链聚乙二醇化C肽的制备
[0641] 使用如实施例1所述的相似反应条件，并使用以下试剂代替SUNBRIGHT GL2-400GS2，可容易地制备以下分子量为10kDa-80kDa的聚乙二醇化C肽。
[0642] 使用SUNBRIGHT GL2-400TS获得：
[0643]
[0644] 其中R1＝甲基。
[0645] 使用SUNBRIGHT GL3-400TS100U获得：
[0646]
[0647] 其中R1＝甲基。
[0648] 使用SUNBRIGHT GL3-400GS100U获得：
[0649]
[0650] 其中R1＝甲基。
[0651] 使用SUNBRIGHT GL3-400HS100U获得：
[0652]
[0653] 其中R1＝甲基。
[0654] 使用SUNBRIGHT LY-400NS获得：
[0655]
[0656] 其中R1＝甲基。
[0657] 使用活性中间体
[0658]
[0659] 获得：
[0660]
[0661] 其中R1＝甲基。
[0662] 实施例3：直链聚乙二醇化C肽的制备
[0663] 使用如实施例1所述的相似反应条件，并使用以下试剂代替SUNBRIGHT GL2-400GS2，可容易地制备以下分子量为5kDa-80kDa的聚乙二醇化C肽。
[0664] SUNBRIGHT ME-200GS
[0665]
[0666] 通过反相和尺寸排阻HPC分析纯化后收集的级分。使用WatersUPLCBEH C1817μM柱，使用ACN和0.1％TFA流动相，使用24％-40％ACN的二元线性梯度进行反相HPLC
3min，接着用40％-90％ACN进行1min，流速为0.25mL/min，柱温为40℃，并且样品浓度为
5mg/mL。图3中呈现了代表性色谱图。
3min，接着用40％-90％ACN进行1min，流速为0.25mL/min，柱温为40℃，并且样品浓度为
5mg/mL。图3中呈现了代表性色谱图。
[0667] 使用Superdex 75，10/300GL柱，使用pH 7.4含有2.7mM KCl和0.137M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液流动相，以0.5mL/min的流速进行等度洗脱进行尺寸排阻色谱法。图4中呈现了代表性色谱图。
[0668] 实施例4：其它直链聚乙二醇化C肽的制备
[0669] 使用如实施例1所述的相似反应条件，并使用以下试剂代替SUNBRIGHT GL2-400GS2，可容易地制备以下分子量为5kDa-80kDa的直链聚乙二醇化C肽。
[0670] 使用SUNBRIGHT ME-200CS获得：
[0671]
[0672] 使用SUNBRIGHT ME-200HS获得：
[0673]
[0674] 使用SUNBRIGHT ME-200TS获得：
[0675]
[0676] 使用SUNBIO P1PAL-30获得：
[0677]
[0678] 使用SUNBIO P1APAL-30获得：
[0679]
[0680] 使用SUNBIO P1TPAL-5获得：
[0681]
[0682] 使用SUNBIO P1BAL-30获得：
[0683]
[0684] 使用SUNBIO P1ABAL-30获得：
[0685]
[0686] 使用SUNBIO P1TBAL-5获得：
[0687]
[0688] 实施例5：犬药代动力学特征的测量
[0689] 进行药代动力学(PK)研究以测定比格犬体内未修饰C肽的C肽PK曲线图。
[0690] 方法：2只雄性犬和1只雌性犬经皮下接受配制于磷酸盐缓冲盐水中的未修饰合成人C肽(0.5mg/kg；0.025mL/kg)(20mg/mL)。在14天内的预定时间点通过静脉穿刺使犬流血并且收集血样。离心血液(3,000rpm，10min)后获得血浆样品并且在分析之前于-80℃下贮藏。由具有良好实验室规范(GLP)能力的CRO(MicroConstants，Inc.；SanDiego，CA)进行生物分析工作。基于用于人C肽测定的商品化试剂盒(Mercodia；目录号10-1136-01)，使用生产商说明书，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测量C肽的血浆水平。将结果表示为C肽浓度。对于PK分析，将低于定量水平(BQL)处理为0并且将标定时间点用于所有计算。通过不依赖标准模型的方法，在每种动物的单独血浆浓度-时间数据基础上，使用WinNonlin Professional 5.2.1(PharsightCorp.，Mountain View，CA)的模型200测定PK参数。
[0691] 结果：在研究持续期间所有动物均存活。在没有临床异常的基础上，每次处理耐受良好。以下表E1中呈现了犬在经皮下给药未修饰C肽后C肽最高浓度(Cmax)和曲线下面积(AUC(0-t))值的平均值±标准偏差(SD)。图5A和图5B中分别呈现了给药后1天和12天按线性标度计算的相应平均±SD C肽血浆浓度-时间曲线图。单剂量施用未修饰C肽在犬体内引起迅速峰值积累，然后C肽从循环中迅速消失。使用未修饰C肽引起在半天之内低于定量水平(BQL)的C肽循环水平。
[0692]
[0693] 使用两种分子量不同的代表性聚乙二醇化C肽(20kDa直链PEG(实施例3)和40kDa支链PEG(实施例1))对犬进行第二PK研究以测定C肽PK曲线图。将结果与未修饰C肽的结果进行比较。
[0694] 方法：3只雄性犬经皮下接受配制于磷酸盐缓冲盐水中的20kDa聚乙二醇化合成人C肽(0.5mg/kg当量的C肽；0.09mL/kg)(50.8mg/mL聚乙二醇化C肽)并且3只雄性犬经皮下接受配制于磷酸盐缓冲盐水中的40kDa聚乙二醇化合成人C肽(0.5mg/kg当量的C肽；0.012mL/kg)(82.5mg/mL聚乙二醇化C肽)。在21天内的预定时间点通过静脉穿刺使犬流血并且收集血样。离心血液(3,000rpm，10min)后获得血浆样品并且在分析之前于-80℃下贮藏。由具有GLP能力的CRO(MicroConstants，Inc.；San Diego，CA)进行生物分析工作。
基于用于人C肽测定的商品化试剂盒(Mercodia；目录号10-1136-01)，使用聚乙二醇化C肽质量控制标准，通过ELISA技术测量C肽的血浆水平。将结果表示为C肽浓度。对于PK分析，将BQL处理为0并且将标定时间点用于所有计算。通过不依赖标准模型的方法，在每种动物的单独血浆浓度-时间数据基础上，使用WinNonlin Professional5.2.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)的模型200测定PK参数。
基于用于人C肽测定的商品化试剂盒(Mercodia；目录号10-1136-01)，使用聚乙二醇化C肽质量控制标准，通过ELISA技术测量C肽的血浆水平。将结果表示为C肽浓度。对于PK分析，将BQL处理为0并且将标定时间点用于所有计算。通过不依赖标准模型的方法，在每种动物的单独血浆浓度-时间数据基础上，使用WinNonlin Professional5.2.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)的模型200测定PK参数。
[0695] 结果：在研究持续期间所有动物均存活。在没有临床异常的基础上，每次处理耐受良好。通过与未修饰C肽比较，使用聚乙二醇化C肽延长犬的C肽暴露，给药后用20kDa直链聚乙二醇化C肽延长为至少4天，并且给药后用40kDa支链聚乙二醇化C肽延长为至少15天。
[0696] 以下表E2中呈现了犬在经皮下给药20kDa聚乙二醇化C肽和40kDa聚乙二醇化C肽后C肽Cmax、AUC(0-t)和半衰期(T1/2)的平均值±SD。图6和图7中分别呈现了按线性和半对数标度计算的相应平均±SD C肽血浆浓度-时间曲线图。
[0697]
[0698]
[0699] 令人惊讶的是，经皮下给药40kDa聚乙二醇化C肽后的Cmax和AUC(0-t)值分别比20kDa聚乙二醇化C肽的相应值高2.26和6.67倍。因此，与20kDa聚乙二醇化C肽相比，或与未修饰C肽相比，40kDa支链聚乙二醇化C肽提供显著改善的PK性质。通过用较低剂量配制于磷酸盐缓冲盐水中的40kDa支链聚乙二醇化C肽(0.006、0.025和0.1mg/kg，通过单剂量皮下注射聚乙二醇化合成人C肽(40kDa PEG；实施例1，通过SUNBRIGHT GL2-400GS2制得))对犬进行第三PK研究。
[0700] 方法：在14天内测量C肽的血浆水平。非临床CRO(Bio-Quant，Inc.；San Diego，CA)进行研究的动物部分。9只雄性犬和雌性犬在剂量施用当天(第0天)分别重7-12kg和6-8kg。研究期间饲喂动物并且在第0、1和2天测定摄食量。还在第7和14天测定体重。在第0天前2天剃干净每只动物背部的注射区域。有3组犬(n＝2只雄性和1只雌性/组)：
[0701] 第1组通过25G针的2mg/mL聚乙二醇化C肽接受剂量为0.05mL/kg(含有0.005mg/kg当量的C肽)的单次皮下注射。
[0702] 第2组通过25G针的2mg/mL聚乙二醇化C肽接受剂量为0.0125mL/kg(含有0.00125mg/kg当量的C肽)的单次皮下注射。
[0703] 第3组通过25G针的0.4mg/mL聚乙二醇化C肽接受剂量为0.015mL/kg(含有0.0003mg/kg当量的C肽)的单次皮下注射。
[0704] 在第0天(给药前30min、1h、3h和6h)和第1、2、3、4、7、10和14天通过静脉穿刺使犬流血并且收集血样。离心血液(3,000rpm，10min)后获得血浆样品并且在分析之前于-80℃下贮藏。由具有GLP能力的CRO(MicroConstants，Inc.；San Diego，CA)进行生物分析工作。基于用于人C肽测定的商品化试剂盒(Mercodia；目录号10-1136-01)，使用聚乙二醇化C肽质量控制标准，通过ELISA技术测量C肽的血浆水平。将结果表示为C肽浓度。对于PK分析，将BQL处理为0并且将标定时间点用于所有计算。通过不依赖标准模型的方法，在每种动物的单独血浆浓度-时间数据基础上，使用WinNonlin Professional5.2.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)的模型200测定PK参数。
[0705] 结果：在研究持续期间所有动物均存活。在没有临床异常的基础上，每次处理耐受良好。表E3中呈现了犬在单次皮下剂量的聚乙二醇化C肽后C肽Cmax、AUC(0-t)和T1/2值的平均值±SD。图8A和图8B中分别呈现了按线性和半对数标度计算的C肽血浆浓度-时间曲线图的相应平均值±SD。图9A和图9B中分别呈现了C肽Cmax和AUC(0-t)的平均值±SD。
[0706]
[0707] 总之，在对犬施用逐步上升的单次皮下剂量的40kDa聚乙二醇化C肽后，C肽的暴露显著增加。对犬的第二和第三PK研究的结果确认，与20kDa直链聚乙二醇化C肽相比，或与未修饰C肽(对犬的第一PK研究)相比，40kDa支链聚乙二醇化C肽提供显著改善的PK性质。此外，40kDa支链聚乙二醇化C肽证明在试验剂量下无明显不良副作用。
[0708] 实施例7：单剂量皮下施用后SD大鼠体内的药代动力学参数
[0709] 在单剂量皮下施用0.0413、0.167和0.664mg/kg后评估SD大鼠(2只/性别/组)体内40kDa聚乙二醇化C肽的PK(实施例12)。在施用之前和施用后14天收集血样。使用以上所述用于犬研究的ELISA方法分析血样的聚乙二醇化C肽。使用“非房室”法估计单独的PK参数。图10中说明了单剂量皮下施用后的平均(±SD)血浆浓度-时间曲线图，表E4中总结了相应的PK参数。
[0710]
[0711]
[0712] 实施例8：单剂量皮下施用后猕猴体内的药代动力学参数
[0713] 在单剂量皮下施用0.0827mg/kg后评估猕猴(2只/性别)体内40kDa聚乙二醇化C肽的PK(实施例12)。在施用之前和施用后14天收集血样。施用以上所述用于犬研究的ELISA方法分析血浆样品的CBX129801。使用“非房室”法估计单独的PK参数。图11中说明了单剂量皮下施用后的平均(±SD)血浆浓度-时间曲线图，表E5中总结了相应的PK参数。
[0714]
[0715] 结果表明，峰浓度在2天内出现；T1/2为～5.4天。因为猴未禁食并且由于检测抗体与猴C肽交叉反应，40kDa聚乙二醇化C肽(实施例12)的结果包括内源C肽水平。因此在测量的聚乙二醇化C肽水平更低的后来时间点(即，第0和14天)，内源猴C肽的作用会可混淆结果。由于第14天时间点从分析中去除，T1/2为3.7天。在对这些单剂量PK研究的总结中，在皮下施用后，聚乙二醇化C肽血浆峰值浓度通常在1-5天内出现。AUC和Cmax随剂量增加而增加并且通常与剂量成比例。
[0716] 实施例9：用未修饰C肽进行重复剂量药代动力学研究
[0717] 在用非聚乙二醇化C肽对大鼠进行长达4周和对猕猴进行长达13周的5项GLP毒理学研究中，通过植入渗透泵经皮下持续输注C肽。在整个研究期间定期测量C肽的血浆浓度并且如表E6所示，已经对每项研究测定了暴露持续期间的稳态浓度(Css)。
[0718]
[0719] 总之，在这些毒理学研究的整个给药持续期间存在持续C肽水平。
[0720] 实施例10：重复剂量药代动力学研究
[0721] 在对大鼠和猴多剂量施用之后评估了40kDa聚乙二醇化C肽(实施例12)的PK。以下总结了这些研究。
[0722] 重复剂量皮下施用(每周一次)28天后SD大鼠的药代动力学
[0723] 方法：多剂量皮下施用2.74、8.22和27.4mg/kg/周，5个剂量之后，评估了SD大鼠(3只/性别/组/时间点)体内40kDa聚乙二醇化C肽(实施例12)的PK。第一剂量前和7天后收集血样。第4剂量2天后收集槽血样(trough blood sample)。在最后剂量(第5剂量)之后，收集28天血样。如前所述，使用ELISA法分析血浆样品的聚乙二醇化C肽。按性别使用“非房室”法和每次剂量的平均浓度-时间曲线图估计PK参数。
[0724] 结果：图12中说明了按性别，多剂量皮下施用后的平均(±SD)血浆浓度-时间曲线图，表E7中总结了相应的PK参数。剂量和主要之间的关系
[0725]
[0726]
[0727] 总之，这些结果表明在第14天至第21天达到稳态。暴露随剂量增加而增加，峰血浆浓度在第1天和第3天之间出现。在与第一剂量后相似的稳态下对AUC评估的范围内(AUC稳态与第一剂量比例大范围为0.7-1.5)，第一剂量和最后剂量之后的AUC和Cmax似乎与剂量呈比例。在3次剂量期间和第一和最后剂量之后，T1/2似乎相似(～1.5天)。雌性的全身性暴露比雄性高～2倍。停止给药后的28天恢复期内，所有剂量下的可检药物水平持续大约2周，除一只雄性(2.74mg/kg/周)和一只雌性(8.22mg/kg/周)外，在恢复期结束时无可检药物。由于最初对抗药抗体(ADA)测定的技术困难，结果不可用于抗聚乙二醇化C肽抗体。暴露高，通常为结果与剂量成比例并且第一和最后剂量之间清除率与聚乙二醇化C肽一致，支持了任何抗体形成不大可能在显著程度上影响暴露的命题。
[0728] 重复剂量皮下施用(每周一次)28天后猕猴的药代动力学
[0729] 方法：多剂量皮下施用1.33、4.0和13.3mg/kg/周，5个剂量之后，评估了猕猴(5只/性别/组)体内40kDa聚乙二醇化C肽(实施例12)的PK。第一剂量前和7天后收集血样。第4剂量2天后收集槽血样。在最后剂量(第5剂量)之后，收集28天血样。如前所述，使用ELISA法分析血浆样品的聚乙二醇化C肽。使用“非房室”法估计PK参数。
[0730] 结果：图14中说明了按性别，多剂量皮下施用后的平均血浆浓度-时间曲线图，表E8中总结了相应的PK参数。图15示出了剂量和主要暴露参数(AUC和Cmax)之间的关系。
[0731]
[0732]
[0733] 总之，这些结果表明大约在第14天达到稳态。暴露随剂量增加而增加，峰血浆浓度在第1天和第2天之间出现。在稳态下对AUCtau评估的比第一剂量后的观测值高大约30％-90％的范围内，第一剂量和最后剂量之后的AUC和Cmax似乎与剂量呈比例。在3次剂量期间和第一和最后剂量之后，T1/2似乎相似(～3天)。雌性的全身性暴露与对雄性观测到的相似。停止给药后，在两种恢复剂量(4.0和13.3mg/kg/周)下可检药物水平持续；然而，聚乙二醇化C肽的血浆浓度随时间显著降低并且对于所有剂量而言，在恢复期结束时明显更低(大约为定量下限的2-3倍)。在恢复期结束时，在较低的两种剂量下ADA反应适度而在高剂量下反应强烈；然而，因为在整个给药期和给药完成后存在显著药物水平，所以抗体的存在并不有意义地影响猴子对聚乙二醇化C肽的暴露。
[0734] 实施例11：对STZ诱导的糖尿病大鼠的神经传导速度(NCV)影响
[0735] 为评估聚乙二醇化C肽对糖尿病大鼠神经传导速度的影响，向STZ诱导的糖尿病大鼠施用40kDa支链PEG(实施例12)8周。也将结果与未修饰人C肽结果作比较。如实施例1所述，与相同40kDa支链PEG偶联的聚乙二醇化大鼠C肽和未修饰大鼠C肽。
[0736] 规程和方法：按50mg/kg的剂量，通过注射1ml的50mg/mL STZ标准溶液静脉施用链脲霉素(STZ)。SD雄性大鼠从Harlan获得。大鼠的平均体重为400g左右，饲喂标准饮食(TD2014)并单独喂养在具有玉米穗草垫的8英寸深的标准实底塑料中。在研究持续期间以正常的12h明、12h暗循环并且在72±8°F的平均温度和30％-70％相对湿度下喂养动物。根据表E9中所列的剂量和制剂，为动物给药8周。
[0737]
[0738]
[0739] 基于最近的体重计算每种药物需要向每只动物施用的剂量。使用无菌磷酸盐缓冲盐水作为媒介物。
[0740] 预处理期研究进行：开始处理之前，观察动物以鉴定任何异常、疼痛或痛苦的迹象和记录的任何发现，当观察到时与临床兽医讨论。STZ处理前(第1天)测定体重，在第7和11天随机测定处理组并且此后每周一次。STZ前(第1天)测定食物重量，在第7和11天随机测定处理组并且此后每周一次。基于C肽(＜0.4nM)、全血葡萄糖值(400-600mg/dL)和体重值随机化动物的处理期。(见表E5)使用B.R.A.T.(区组随机化配置工具)实现随机化。在第10天和第39天经手术植入皮下泵植入物(2ML4型Alzet泵)。
[0741] 处理期研究进行：在第3天、第7天、第11天通过尾取血随机收集血液，并且此后每周一次以测量葡萄糖和/或C肽。STZ注射之前使动物禁食6h，每次葡萄糖估计前禁食3h而在研究其余时间饲喂无限制。(见表E10)
[0742]
[0743]
[0744]
[0746] 用位于尾的发线(hair line)以下10mm(在视觉上测定)的有源记录电极和远60-70mm的刺激阴极记录尾神经动作电位。通过用初始去极化电流的绝对发作潜伏期除以刺激阴极和有源电极之间的距离计算速率。
[0747] 用位于后爪内肌中的有源电极和邻近踝关节、外踝后面的刺激阴极记录胫骨运动传导。
[0748] 动物的准备：所有记录期间，用异氟烷麻醉动物并以卧姿放置。电生理学记录过程中检测呼吸和温度。
[0749] 电极：为每种用药方式定制有源电极、参比电极和接地电极的放置并且在每个受试者中相对于骨骼标志定位。在1,000Hz下阻抗为大约50千欧姆的铂针电极(Grass-Telefactor，Co.)用作所有PNS记录的有源和参比导线。
[0750] 温度控制：在整个记录期间将直肠温度维持在35.5和38.0℃之间。
[0751] 数据处理：使用单位增益前置放大器使神经电信号阻抗匹配，使用多极滤波器适当使其带通，并进一步使用0.5-50K的增益系数差异性放大。为每种用药方式调节滤波器设置。调节共模抑制电平和增益系数以为每一记录系列最小化60Hz干扰并优化信噪比。将扩大信号时间锁定以引起刺激，多路复用于所选信道并且以比取样的最高频率高5倍的速率数字化。扫描数据的伪迹(使用预定抑制电平-数字化窗口的80％)并且对适于研究下用药方式的时期数字化平均。为每次测量调节每个平均数中包括的扫频数以优化信噪比并促进发作潜伏期和峰值振幅测量的准确评估。
[0752] 数据评分：信号优化之后为所有电生理学数据评分。测量从刺激伪迹到去极化开始的发作潜伏期为近0.01ms；测量从去极化基线到峰值的幅度，对于感觉反应而言为近0.01μV，而对于运动反应而言为近0.01mV。所有测量均用跟随数字化痕迹的内部计算机光标进行。数字存储所有波形并且可用于进一步的离线分析。
[0753] 校准：在电生理学记录的每一天现场校准放大器和滤波器。
[0754] 终末期研究进行：通过吸入CO2麻醉动物，接着在特定时间点进行心脏穿刺。
[0755] 结果：神经传导速度(NCV)的基线测量
[0756] 在对第2-4组的每只大鼠施用STZ和确认高血糖存在后8-9天进行第一次NCV评估(见上表E4)。此时，在施用任何媒介物或聚乙二醇化人C肽之前(即，基线)，有STZ诱导的外周多神经病变的明确显著证据。在基线评估时，与年龄匹配的对照组相的发现相比，每个STZ处理组中最高尾NCV稍微降低10m/s以上(大约18％)(图16A)。此时，最高趾NCV降低3-4m/s(图17A)并且胫骨远端潜伏期延长(与速度减慢一致)相同值的大约10％。
[0757] 第4周神经传导速度(NCV)的测量
[0758] 图16B和17B说明了按1.0或3.0mg/kg/周施用单独的媒介物或聚乙二醇化人C肽4周后(从基线开始)4个组中每一个的尾和趾NCV。这4周期间，第2组的1只大鼠、第3组的5只大鼠和第4组的1只大鼠死亡。图16A和17A中的基线值省略了来自这些缺失大鼠的数据以保持对相同亚类受试者的比较。
[0759] 在检查的4周内，对于尾和趾神经而言，对照组的NCV保持相对恒定(图18)。然而，不出所料，在仅STZ组中尾和趾神经的NCV持续降低。对于纯感觉远端趾神经而言，在最初4周处理期内再减缓大约3m/s(10％)(图18)。NCV持续减缓和由于STZ诱导的胰腺β细胞破坏引起对远端神经的渐进性损伤一致，导致高血糖和内源C肽不足，这将最终导致跨膜电流改变，结节处的微环境变化，轴突萎缩并最终导致沃勒变性。
[0760] 在第4周对所有组评估时，胫骨运动反应的绝对潜伏期稍微更长，这反映了动物持续生长，然而在研究最初4周过程中组间与这次测量有很小或无差异(数据未示出)。
[0761] 在从基线开始的4周期间，对于用聚乙二醇化人C肽共同处理的每个组中的幸存者而言，NCV降低至比在仅STZ组中的发现更低的速率(图18)。然而在第4周时，影响较小。
[0762] 第8周神经传导速度(NCV)的测量
[0763] 图16C和17C说明了第8周时4个组中每一个的尾和趾NCV。在研究期间，对照组中混合尾神经的NCV从基线值升高大约4m/s(7％)(图19)。这种变化与有良好文档记录的出生后髓鞘和轴突横截面直径持续增大一致。在基线评估后第4周和第8周之间任何组中再无动物死亡。
[0764] 从基线开始，在8周内对照组趾神经的NCV变化相对很小(图18和19)。相反，仅STZ组(第2组)的NCV在这期间持续下降。这种进行性退化和由高血糖和缺乏内源C肽生成诱导的持续损伤一致。到第8周，仅STZ组的趾NCV从基线降低＞4m/s(14％)并且从在年龄匹配的对照组的值降低20％以上。相反，在用聚乙二醇化人C肽共同处理的组中，在8周研究期内趾神经NCV稳定(第3组)或实际上提高(第4组)(图18)。
[0765] 表E11和E12概述了趾和尾NCV分别从基线到第8周评估时的变化百分比。
[0766]
[0767]
[0768]
[0769] 结论：与年龄匹配的对照组(第1组)相比，在用STZ处理的组(第2-4组)中，趾和尾NCV显著减缓。这些影响在基线、施用STZ 8-9天后，但是在联合施用聚乙二醇化C肽之前是显著的。
[0770] 对于8周研究期内，仅用STZ处理的组的趾神经而言，用文件证明NCV的逐渐减缓。按1.0或3.0mg/kg/周联合施用聚乙二醇化C肽预防了这种持续退化。在用3.0mg/kg/周的聚乙二醇化C肽共同处理的组中，在STZ诱导的神经病变之后的8周内，趾神经NCV稍有提高。
[0771] 来自该研究的结果明确表明，在检查期内用聚乙二醇化C肽共同处理对由STZ单独诱导的神经病变提供了神经保护作用。对于纯感觉趾神经而言，这种作用尤其明显。部分由于早期受试者的损失，该研究仅提供了对与剂量有关的聚乙二醇化C肽利益差异的初步了解，但是在趾数据中表明支持稍微更有利于高剂量组。
[0772] 尾神经数据证明在第2-4组中在基线时表现的STZ处理的显著负面影响。没有8周研究期间尾NCV减缓的进一步证据。然而，用聚乙二醇化C肽共同处理的两个组的速度提高近似于对照组的倾向(表E12)。第3和4组的提高比在仅STZ组中观察到的提高更高。和第4周的情况相同，组间胫骨运动反应几乎无变化(数据未示出)。
[0773] 这些结果证明，当肽聚乙二醇化时保持了天然C肽的生物学活性，这延长了C肽的循环半衰期并从而减小了替代给药的频率。在第3周给药2天后，在低剂量和高剂量聚乙二醇化人C肽和聚乙二醇化大鼠C肽组中评估的平均最高血浆浓度分别为约129nM、431nM和12nM(数据未示出)。在低剂量和高剂量聚乙二醇化人C肽和聚乙二醇化大鼠C肽组中，研究结束时的平均最低血浆浓度分别为约22nM、94nM和2nM。结论是，聚乙二醇化人C肽保持了未修饰C肽的有利生物学性质，并且对糖尿病长期并发症的治疗和预防均有效。特别的是，当前实验确定，人聚乙二醇化C肽对糖尿病相关神经病变的治疗有效。
[0774] 实施例12：聚乙二醇化C肽的GMP批量制备
[0775] 概述
[0776] 人C肽(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)(SEQ.ID.No.1)
[0777]
[0778] 聚乙二醇化：通过在N-甲基吗啉的存在下使人C肽的N端(钠盐)与大约40kDa的支链NHS酯PEG衍生物(SUNBRIGHT GL2-400GS2(NOF Corporation)偶联一步性进行人聚乙二醇化C肽的合成。
[0779] 首先将SUNBRIGHT GL2-400GS2(115g)溶于600mL的(50/50)乙腈/水溶液中。搅拌所得溶液并注入在175mL乙腈/水溶液中含有人C肽(7.9g)的另一溶液，接着添加1.2mL的N-甲基吗啉(NMM)。间隔～1h重复添加NMM几次，每次添加之前通过HPLC监测反应进度。重复该过程8-10次，然后搅拌反应过夜约8-12h。一旦通过HPLC分析验证反应完全，就将所得反应混合物进行纯化步骤。通常在该过程期间，制备若干小批量，然后如下所述合并进行纯化。
[0780] 通过制备反相色谱法进行粗聚乙二醇化C肽的纯化
[0781] 用6体积的0.1％TFA/水稀释粗聚乙二醇化C肽溶液。将pH调节至pH≤3并使用反相硅胶(Diasogel C-18，15μm，300Angstrom)通过制备HPLC纯化。通过将乙腈梯度应用于稀TFA水溶液中使吸附的聚乙二醇化C肽从柱上洗脱(缓冲液A为0.1％TFA，缓冲液B为100％ACN：5min内为0-25％B，然后在100min内为25％-50％B，然后保持直至产物洗脱)。通过230nm的UV监测洗脱液。合并纯度≥90、NSI＞6.0％的成分。可回收纯度＞70％的成分。
[0782] 通过制备反相色谱法进行聚乙二醇化C肽的脱盐和纯化
[0783] 通过使用反相硅胶进行制备HPLC为从前一步骤获得的合并纯成分脱盐并纯化。用稀TFA水溶液冲洗柱，接着用稀醋酸铵水溶液冲洗。然后通过将乙腈梯度应用于稀AcOH水溶液中使聚乙二醇化C肽从柱上洗脱(缓冲液A为2％醋酸，缓冲液B为100％ACN：5min内为0-25％B，然后在75min内为25％-50％B，然后保持直至产物洗脱)。通过230nm的UV监测洗脱液。合并并冻干由色谱法获得的纯成分(纯度≥95％，NSI≥3.0％)。可回收纯度＞80％的成分进行进一步纯化。
[0784] 通过制备HPLC进行聚乙二醇化C肽的离子交换纯化
[0785] 将来自上一步骤的粗冻干聚乙二醇化人C肽(～180g)溶于5％乙腈/水中并加至离子交换柱(DEAE52纤维素)上。然后用～50L水冲洗柱并用具有～40L氯化钠(1M)/醋酸铵(1M)水溶液的柱洗脱产物。通过230nm的UV监测洗脱液。合并由色谱法获得的纯成分(纯度≥92％；无单个杂质(NSI)＞4％)并进行脱盐/纯化。可回收纯度＞80％的成分。
[0786] 通过制备反相色谱法进行CBX129801的脱盐和纯化
[0787] 用等体积的水稀释来自离子交换色谱法步骤的纯成分并加至制备HPLC柱(硅胶)上。然后用2％稀醋酸(1BV)冲洗柱并且用乙腈在稀醋酸中的溶液洗脱产物(缓冲液A为2％醋酸，缓冲液B为100％ACN：5min内为0-25％B，然后在50min内为25％-50％B，然后保持直至产物洗脱)。通过230nm的UV监测洗脱液。合并并冻干由色谱法获得的纯成分(纯度≥95％；NSI＞3.0％)。可回收纯度＞80％的成分。
[0788] 冻干聚乙二醇化C肽
[0789] 按在2％醋酸水溶液中约15-20g/L的浓度使来自前述纯化的产物复溶并冻干以产生作为其游离酸的纯聚乙二醇化C肽药物。
[0790] 实施例13：聚乙二醇化C肽的生物物理特征
[0791] 除非特别注明，通过用紫外光检测进行RP-HPLC测定，如以上实施例12中所述制备的一批纯度为99.5％的聚乙二醇化C肽用于以下所述的分析研究中。表E13中列出了进行的结构研究。所有分析确认了原料药的化学结构。
[0792]
[0793]
[0794] 除上述结构解析试验外，对以上实施例12中所述的聚乙二醇化C肽进行了另外的特征研究，并且这些另外的研究列于表E14中。
[0795] 通过MS测量的分子量：使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)验证原料药的分子量。样品产生了阳离子MALDI-TOF质谱，观察到主要的单电荷准分子离子簇集中在约m/z45743。
[0796] 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)：用配备有安装在ATR组件上的TGS检测器和单反ZnSe晶体的Jasco 4200FT-IR分光计收集C肽、PEG试剂和聚乙二醇化C肽的FT-IR光谱。用聚四氟乙烯棒将固体样品压在Zn Se晶体上。从光谱中减去残留水分峰值。结果示于图
20和图21中(放大区域)。聚乙二醇化C肽的光谱与PEG试剂的光谱非常相似。鉴于肽与PEG的质量比，这并不令人惊讶。
20和图21中(放大区域)。聚乙二醇化C肽的光谱与PEG试剂的光谱非常相似。鉴于肽与PEG的质量比，这并不令人惊讶。
[0797] 然而，如图21所示的酰胺I区稍有差异。特别地，聚乙二醇化C肽的酰胺I谱带-1 -1在1627和1653cm 处显示出两个峰，而游离C肽的光谱仅在1634cm 处表现出一个酰胺I-1 -1
宽谱带峰。1630cm 附近的酰胺I谱带一般与β-折叠结构或β-转角相关，而1650cm 附-1
近的酰胺I谱带一般归因于α-螺旋、不规则或无规卷曲结构。1653cm 处吸光度的出现与聚乙二醇化C肽的结构比C肽更随机一致。
宽谱带峰。1630cm 附近的酰胺I谱带一般与β-折叠结构或β-转角相关，而1650cm 附-1
近的酰胺I谱带一般归因于α-螺旋、不规则或无规卷曲结构。1653cm 处吸光度的出现与聚乙二醇化C肽的结构比C肽更随机一致。
[0798] 为调查酰胺I区中的差异是否是由于酰胺基和溶剂水之间氢键的差异，于D2O中收集FT-IR光谱，如图22和图23中所示。对于D2O光谱的收集，以6μm间隔将于D2O溶液中的样品置于两个CaF2窗口之间。-1
[0799] 聚乙二醇化C肽于D2O中的FT-IR光谱显示出最低酰胺II谱带强度(在1566cm-1处)，这表明所有酰胺基均经历了H-D交换。H-D交换后，酰胺II谱带从1566cm 位移至-1
1465cm (变为酰胺II’谱带)。对于游离C肽而言，在D2O中的较高(～25mg/mL)和较低浓度(～12.5mg/mL)下均存在剩余酰胺II强度，这表明一些酰胺基未交换。未交换的酰胺基很可能受β-转角内的分子内氢键或在高浓度肽寡聚体(聚集物)之间形成的分子间氢键保护。对于D2O中的聚乙二醇化C肽而言，由于C肽与40kDa PEG的质量比低，所以有效C肽浓度更低。
1465cm (变为酰胺II’谱带)。对于游离C肽而言，在D2O中的较高(～25mg/mL)和较低浓度(～12.5mg/mL)下均存在剩余酰胺II强度，这表明一些酰胺基未交换。未交换的酰胺基很可能受β-转角内的分子内氢键或在高浓度肽寡聚体(聚集物)之间形成的分子间氢键保护。对于D2O中的聚乙二醇化C肽而言，由于C肽与40kDa PEG的质量比低，所以有效C肽浓度更低。
[0800] 然而，正如从第二衍生物FT-IR光谱(图23所示)可见，高浓度C肽样品(～25mg/-1 -1mL)的酰胺I′谱带在1639cm 处显示出主峰，在1645cm 处显示出肩峰，然而低浓度样品-1 -1
(～12.5mg/mL)在1639cm 和1645cm 处均显示主峰。这表明酰胺I′区的差异可能与浓-1
度有关。与聚乙二醇化C肽的光谱相比，游离C肽的光谱在1635-1640cm 附近显示出更高强度，表明游离C肽中有更多β-转角结构。应当指出的是，对于更稀的C肽样品而言，信噪比差，排除了对较低浓度的评估。
(～12.5mg/mL)在1639cm 和1645cm 处均显示主峰。这表明酰胺I′区的差异可能与浓-1
度有关。与聚乙二醇化C肽的光谱相比，游离C肽的光谱在1635-1640cm 附近显示出更高强度，表明游离C肽中有更多β-转角结构。应当指出的是，对于更稀的C肽样品而言，信噪比差，排除了对较低浓度的评估。
[0801] 通过氨基酸分析测定的单独氨基酸的同一性和比例：为确保组成型氨基酸的同一性和正确比例，对实施例12中制备的聚乙二醇化C肽进行氨基酸分析。这种方法包括于强酸中使肽水解，在离子交换柱上分离氨基酸，最后在茚三酮衍生化后检测洗脱液。研究结果示于表E14中。来自氨基酸分析的结果确认聚乙二醇化C肽中氨基酸的同一性和理论相对出现率在实验误差范围内。
[0802]
[0803]
[0804] 通过GC测定的单独氨基酸的同一性和手性：进行实施例12的手性氨基酸分析以调查组成型氨基酸残基的手性同一性。使肽在氘化溶剂(DCl/D2O)中水解，衍生化为N(O，S)-氟乙酰氨基酸酯，并用GC-MS分析以测定每种氨基酸对映异构体。使用涂有Chirasil-Val的去活化玻璃毛细管进行GC。载气为氢气。结果示于表E15中。获得的值确认了对组成实施例12的聚乙二醇化C肽结构的氨基酸预期的手性。
[0805]
[0806] 通过MS/MS测定氨基酸的序列：鉴于PEG的大尺寸和多分散性，在最后中间阶段通过MS/MS进行测序。通过使用CID(碰撞诱导解离)进行MS/MS来研究实施例12的聚乙二醇化C肽的氨基酸序列，在CID技术中故意使完整样品分子成为碎片，其目的是由过程中生成的子离子光谱来获得结构信息。
[0807] MS/MS光谱中观察到的碎片离子的类型取决于许多因素，包括一级序列、内能的量、如何引入能量、电荷状态等。由Roepstorff和Fohlman[Biomedical Spectrometry，1984，11(11)：601]首先提出被接受的碎片离子命名法，随后由Johnson等[Annals of Chemistry，1987，59(21)：2621-2625]修改。
[0808] 如果片段携带至少一个电荷则仅检测片段。如果该电荷保持在N端片段上，则离子分为a、b或c。如果电荷保持在C端，则离子类型为x、y或z。下标表示片段中残基的数量。
[0809] 除携带电荷的质子外，c离子和y离子从前体肽吸引另外的质子。因此，可能为6个单电荷序列离子。注意，这些结构包括携带单个电荷的质子。在电喷雾离子化中，肽通常携带两个或更多个电荷，以致碎片离子可能携带一个以上的质子。
[0810] 使用Croker等[Jurnal of Biomolecular Techniques，2000，volume1]，issue 3，135-141]开发的计算机程序计算所需的多电荷b和y离子和碎片离子。结果示于表E16和E17中。通过MS/MS和MS/MS/MS进行的片段化和序列分析确认了实施例12最终中间体的聚乙二醇化C肽的建议一级序列。
[0811]
[0812]
[0813]
[0814]
[0815] 肽图：肽图是通过用蛋白水解酶消化蛋白质生成的片段化图。肽片段图是特殊蛋白质的特征并且可用于鉴定结构。先前开发了绘制C肽图的方法并通过质谱法鉴定了4个片段。所述4个片段含有如图24底图所示的氨基酸25-31(标记为片段A)、13-24(标记为片段B)、1-12(标记为片段C)和1-24(标记为片段D)。
[0816] 进行横向比较，其中将C肽(1mg/mL)和聚乙二醇化C肽(10mg/mL)溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中。向每1mL的样品，添加40μL的0.25mg/mL胰凝乳蛋白酶并且在37℃下孵育样品4h。通过添加甲酸停止消化，并且通过RP-HPLC分析样品。结果示于图24中。
[0817] 正如对聚乙二醇化C肽所预期，因为PEG部分在N端连接，所以未观察到片段C(1-12)和D(1-24)。对于实施例12的聚乙二醇化C肽而言，观察到片段25-31和13-24。为调查14min时的峰值是否是未消化的聚乙二醇化C肽，在27h内进行消化的时间进程研究。未获得与将要完成的消化一致的另外的片段。另外，通过用扩展梯度进行RP-HPLC分析未消化聚乙二醇化C肽和消化聚乙二醇化C肽的50/50混合物以确定是否可实现任何分离；然而，仅观察到单峰。因此结论是，在14min处的峰含有聚乙二醇化1-12和1-24片段并且可能含有实施例12的一些完整聚乙二醇化C肽。因为分子的色谱行为受较大的PEG部分支配，所以不能解析这些片段并不出人意料。
[0818] 无反离子：通过离子色谱法(IC)测量铵含量，通过HPLC测量醋酸含量，并通过ICP/MS测量钠含量以确保在脱盐过程之后剩余很少反离子或无反离子。
[0819] 测定铵含量为0.035％w/w，并且发现钠含量为0.02％w/w，低于质量标准限度。
[0820] 虽然原料药中反离子的水平很低，但是当按摩尔计算时，可能表明铵(摩尔比为0.9)和/或钠(摩尔比为0.4)与最终原料药的一些关联。
[0821] 通过分析超速离心法测定的沉降速度：为评估聚乙二醇化C肽中任何聚集物的同质性和分布，用分析超速离心机测量沉降速度。使用这种技术，可在其不同沉降系数的基础上检测聚集物。沉降速度是基于简单物理原理的绝对法。其校准基于长度和时间的基本单位，不需要标准分子作为参考。沉降系数取决于分子形状以及分子量，因此甚至当单体沉降系数已知时也不可能预测寡聚体的沉降系数。
[0822] 图25中示出了PBS缓冲液中批号1008-134的聚乙二醇化C肽(～0.6mg/mL)的归一化沉降系数分布。0.802S处的主峰值为98.1％，表明样品同质。先前测定了C肽(未聚乙二醇化)的沉降系数在～0.4-0.5S的范围内。在该范围内未检测到信号，表明无游离C肽。另外，沉降系数与40kDa支链PEG(0.82S)一致。
[0823] C肽和聚乙二醇化C肽的圆二色性分析：对C肽和聚乙二醇化C肽进行远近紫外圆二色性(CD)分析。将样品溶于含有4.7％山梨糖醇、pH 6.0的20mM磷酸盐缓冲液中，对于C肽而言为1mg/mL而对于聚乙二醇化C肽而言为～10.4mg/mL(相当于0.69mg/mL的C肽)。使用肽浓度(1或0.69mg/mL)、平均残基重量(97.4)和吸收池的光程长(对于吸光度测量而言为1cm或对于CD而言为0.02cm)将减去溶剂的光谱转化为平均残基椭圆率。用Jasco J-715分光偏振计进行测量。
[0824] 如图26所示，对于两个样品而言，近紫外区内C肽(上线)和聚乙二醇化C肽(下线)的平均残基椭圆率基本为0，正如没有芳族基和二硫键一样(示于图26的上图中)。
[0825] C肽和聚乙二醇化C肽的远紫外CD光谱显示，二级结构很大程度上无序。对于α-螺旋而言典型的是在220和208nm下没有两个最小值并且对于反向平行β-折叠而言典型的是在217nm下没有波谷。
[0826] CD分析显示了修正浓度时C肽和聚乙二醇化C肽几乎相同的光谱形状(图26的下图)(注意，因为未对水或盐/溶剂修正样品重量，所以浓度估计存在一些误差)。因此，可以推断聚乙二醇化并未改变肽的二级结构。
[0827] 尺寸排阻色谱法(SEC)：如图27所示，通过尺寸排阻色谱法分析实施例12的聚乙二醇化C肽样品(100μg于20mM磷酸盐缓冲液中，4.7％山梨糖醇，pH 6.0)。
[0828] 作为SEC方法条件的一部分，单独合成20kDa聚乙二醇化肽并通过SEC分析以证实所述方法能够根据尺寸区别相关化合物。图28中示出了20kDa聚乙二醇化C肽和实施例12的聚乙二醇化C肽(在相同缓冲系统中，两种样品的载量为100μg)的色谱图的重叠。如图28中可见，较低分子量的峰值从SEC柱中稍后洗脱。主峰之前无峰值表明，在实施例
12的聚乙二醇化C肽中不存在可观水平的较高分子量种类。类似地，主峰之后无峰值表明，无可观水平的较低分子量种类。
12的聚乙二醇化C肽中不存在可观水平的较高分子量种类。类似地，主峰之后无峰值表明，无可观水平的较低分子量种类。
[0829] SDS-PAGE：使用4-12％Tris-甘氨酸凝胶进行凝胶电泳。如图29中所展示，将分子量标准物(见蓝色+2，来自Invitrogen的预染标准物)涂在泳道2和10上。将范围从2μg至10μg的不同量的聚乙二醇化C肽涂在泳道4、6和8中的凝胶上。通过考马斯亮蓝染色使64-98kDa之间的单强度带显现。已知PEG的水力半径大于根据蛋白质标记的分子量预测的尺寸。因此，这个结果并不出人意料。SDS-PAGE结果还显示不存在其它较高分子量杂质。
[0830] 活性分析：将聚乙二醇化C肽样品与真正未标记的C肽作比较以确认聚乙二醇化产物保持了未标记肽的活性。
[0831] 方法：按20,000个细胞/孔的密度将人肾(HK2)细胞接种于(无涂层)96孔(bl/cl)板上并孵育48h。在实验当天，冲洗HK2细胞并于DMEM+0.5％BSA中饥饿1h。用1nM(最终浓度)处理细胞5min，重复10次。加入等体积的C肽PEG GMP(批号1-FIN-0988)、C肽PEGTox(1007-119)、C肽PEG Tox(1008-090)、未修饰C肽(209400-3)和C肽PEG参照(1008-134)。在1000rpm下将板旋转5min。总处理时间为7-10min。处理后立即用2％(最终)多聚甲醛固定细胞并用冰冷甲醇使细胞渗透。然后用抗pERK抗体处理细胞并使用IF+酪胺扩增，按照标准方法加工板。
[0832] 结果：图30中所示结果证明，聚乙二醇化C肽保持了未聚乙二醇化产物的活性，并且在若干不同批次的C肽间这种活性一致。
[0833] 实施例14：药物开发
[0834] 因为聚乙二醇化C肽(实施例1)配制为水溶液，可影响制剂性能的关键物理化学性质是药物的溶解性、pH、离子强度和张度。所有这些因素可影响聚乙二醇化C肽的PEG部分的溶解性并且在此已做评估。
[0835] 在20mg/mL时，药物远远低于在制剂缓冲液中的溶解极限(高达100mg/mL)。已经选择了与药物相容的赋形剂以优化如下所述产品的稳定性。药品中所用的赋形剂为磷酸钠(一元和二元)、山梨糖醇、氢氧化钠和注射用蒸馏水。所有赋形剂均法定并且满足USP中提出的标准。该实施例中描述了赋形剂及其含量的选择。
[0836] 缓冲液选择：由于常用于药物制剂中并且在生理pH下具有良好缓冲能力，所以选择磷酸盐缓冲液进行初步评估。通过将～1mg/mL的聚乙二醇化C肽(实施例12)溶于不同pH(6.0、6.5、7.0和7.5)的10mM磷酸钠缓冲液中进行pH筛选研究。将样品在40℃下贮藏9天，然后通过RP-HPLC分析。所有样品显著降解(～40％或以上)，与肽-PEG偶联物的PEG组分降解一致。另外，所有制剂的pH向下移动0.7-1.0个pH单位，表明缓冲能力不足。然而，在较低pH下随着稳定性升高可观察到明显趋势。即，从pH 6.0开始的制剂分别优选为6.5、7.0和7.5以上。因此选择6.0为目标pH。
[0837] 张度剂：进行第二制剂研究以选择张度剂(盐水或山梨糖醇)。选择盐水(0.9％)或山梨糖醇(4.7％)的浓度以使得药品溶液等渗。将聚乙二醇化C肽(实施例1)(1mg/mL)溶于20mM具有盐水(0.9％)或山梨糖醇(4.7％)的磷酸钠缓冲液中。pH调节至6.0。将样品在5℃和40℃下贮藏。通过添加张度剂大大提高了这些制剂的稳定性(数据未示出)。在40℃下4周后，两种张度剂给出等效结果，面积-％纯度下降～2-3％。在40℃下12周后，与显示面积-％纯度下降～72％(与PEG降解相对应)的含有盐水的制剂相比，含有山梨糖醇的制剂显然更好，面积-％纯度下降7％。在5℃下，12周后在两种制剂中观察到很少甚至没有降解。根据加速稳定性结果，选择山梨糖醇作为张度剂。
[0838] 离子强度：进行第三制剂研究以评估离子强度对制剂稳定性的影响。于10、20和50mM含有4.7％山梨糖醇的磷酸盐缓冲液中制备～20mg/mL的聚乙二醇化C肽(实施例12)溶液并调节为pH 6.0。将样品在5℃和40℃下贮藏。表E18中总结了结果。
[0839]
[0840] 在5℃下，3个月后所有制剂看起来相似。pH含量或面积-％纯度无可观变化。在40℃下，所有制剂的pH、纯度和含量降低。对于10mM磷酸盐浓度获得最佳结果，表明高离子强度可能对稳定性产生负面影响。因此，选择10mM磷酸盐作为缓冲液浓度。
[0841] 从前面的描述中，本领域的技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且在不背离本发明精神和范围的前提下，可对本发明做各种变化和修改以使其适应于各种用途和条件。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 聚乙二醇化的AβFAB | 2020-05-11 | 745 |
| 聚乙二醇化的AβFAB | 2020-05-11 | 320 |
| 聚乙二醇化C肽 | 2020-05-11 | 170 |
| 一种纯化聚合物聚乙二醇的区熔方法 | 2020-05-12 | 590 |
| 支化的紧凑型聚乙二醇衍生物 | 2020-05-13 | 947 |
| 蛋白质的聚乙二醇化修饰方法 | 2020-05-13 | 583 |
| 聚乙二醇化的T1249多肽 | 2020-05-11 | 902 |
| 聚乙二醇化的AβFAB | 2020-05-11 | 307 |
| 硫代双酚抗氧化剂/聚乙二醇共混物 | 2020-05-13 | 200 |
| 一种碳化硅、聚乙二醇专用过滤结构 | 2020-05-12 | 87 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
聚乙二醇化热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈