蛋白质的聚乙二醇化修饰方法
阅读：583发布：2020-05-13
专利汇可以提供蛋白质的聚乙二醇化修饰方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 蛋白质 的 聚乙二醇化 修饰方法，其是以疏 水 层析色谱柱为固相反应载体的蛋白质的聚乙二醇化修饰方法：对于疏水性强的蛋白，在高盐状态下将蛋白 吸附 于疏水层析色谱柱上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白；对于疏水性弱的蛋白，在高盐状态下将聚乙二醇修饰剂吸附于疏水层析色谱柱上，以蛋白溶液为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白。采用上述方法制备获得单一较好且活性保持率高的PEG修饰蛋白，所得PEG修饰蛋白单一修饰率达到40%以上，活性保持率达到80%以上，为实现蛋白的PEG修饰提供新工艺。，下面是蛋白质的聚乙二醇化修饰方法专利的具体信息内容。
1.蛋白质的聚乙二醇化修饰方法，其特征在于，其是以疏水层析色谱柱为固相反应载体的蛋白质的聚乙二醇化修饰方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对于疏水性强的蛋白，在高盐状态下将蛋白吸附于疏水层析色谱柱上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对于疏水性弱的蛋白，在高盐状态下将聚乙二醇修饰剂吸附于疏水层析色谱柱上，以蛋白溶液为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述疏水层析色谱柱的填充物质包括HiTrap Butyl FF、HiTrap Octyl FF或HiTrap Phenyl FF。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂包括聚乙二醇-丁醛、聚乙二醇-丙醛或聚乙二醇琥珀酸酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂的分子量大小为
5kDa-40kDa。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂的分子量大小为
20kDa。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疏水性强的蛋白包括溶菌酶或α-糜蛋白酶。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述疏水性弱的蛋白包括重组酸性成纤维细胞生长因子或重组碱性成纤维细胞生长因子。
10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述高盐状态是指将蛋白或聚乙二醇修饰剂溶解于含有2-3M氯化钠的磷酸盐缓冲液中。
蛋白质的聚乙二醇化修饰方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质修饰领域，具体地说，涉及蛋白质的聚乙二醇化修饰方法。
背景技术
[0002] 随着基因工程技术的发展，蛋白质、多肽类药物的临床应用越来越受到重视。然而蛋白质、多肽类药物普遍存在诸如稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷严重制约了其应用和发展。聚乙二醇（PEG）能够使蛋白药物溶解行为改善、稳定性增强、免疫原性消除或降低、体内循环半衰期延长、药代动力学优化，因此在生物技术和生物制药开发中具有重要的应用价值和广泛的应用前景。目前，PEG已应用于多种蛋白药物的修饰，如PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素等多种蛋白质药物已陆续通过美国食品和药物管理局（FDA）批准应用于临床。
[0003] 然而，在PEG修饰过程中，非特异性修饰和多位点修饰会带来蛋白类药物均一性差，活性减弱和纯化困难等问题，构成了目前以液相条件为基础的PEG修饰的发展和应用局限。尽管对修饰条件进行优化，实际修饰反应过程中还是有许多副产物产生。此外，液相条件下的烷基化PEG修饰产物经常需要进行多步纯化步骤才能去除杂质，如还原剂、未反应的PEG以及多位点修饰产物等。因此，亟待开发一种特异性更强且具备可控性的单一位点PEG修饰方法，进而在改善药用蛋白生物功能的同时简化相应修饰蛋白的制备工艺。
[0004] 随着对PEG修饰研究的深入，近年来逐步发展起来的固相修饰技术已经显示出与液相修饰相比较为突出的优势，主要集中表现为修饰效率更高，修饰特异性更强，纯化制备工艺简单，且通过固相修饰获得的蛋白保留了更好的生物学活性，这为药物蛋白的PEG修饰提供了新思路。固相PEG修饰过程一般是先将蛋白吸附到固体基质上，然后以PEG修饰制剂作为流动相在色谱柱上循环流过，对吸附于柱上的蛋白实现PEG修饰，待修饰反应结束后，PEG化的蛋白可以采用盐溶液洗脱获得修饰混合物或者直接从未修饰蛋白及其他修饰副产物中分离纯化获得目的修饰产物。理论上讲，固相修饰方法可以降低分子间的碰撞和蛋白表面基团的自由度，从而降低PEG修饰反应过程中副产物的产生，减少后续纯化步骤。目前已知的固相修饰工艺主要集中于以离子交换层析色谱和亲和层析色谱为固相吸附材料（反应载体）。但通过大量前期研究发现，现有的离子交换或者亲和色谱固相修饰并不能适用于所有的功能蛋白，就离子交换层析色谱固相修饰技术而言，其可能的原因是由于吸附蛋白与离子固相之间的静电相互作用遮蔽了PEG修饰的位点而导致PEG修饰反应不能进行；而亲和层析色谱则要求目的蛋白能够与层析色谱柱产生特异性结合，这对蛋白与亲和色谱柱的结合力提出了较高的要求，使应用范围大大受限。
发明内容
[0005] 本发明旨在弥补现有液相和固相PEG修饰工艺的不足，提供一种以疏水层析色谱柱为反应载体的新型蛋白固相聚乙二醇修饰工艺。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种蛋白质的聚乙二醇化修饰方法，其是以疏水层析色谱柱为固相反应载体的蛋白质的聚乙二醇化修饰方法。
[0007] 对于疏水性强的蛋白（如溶菌酶、α-糜蛋白酶等），在高盐状态下将蛋白吸附于疏水层析色谱柱上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱（或低盐缓冲液洗脱）获得聚乙二醇修饰的蛋白。
[0008] 对于疏水性弱的蛋白（如重组酸性成纤维细胞生长因子rhaFGF、重组碱性成纤维细胞生长因子rhbFGF等），在高盐状态下将聚乙二醇修饰剂吸附于疏水层析色谱柱上，以蛋白溶液为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱（或低盐缓冲液洗脱）获得聚乙二醇修饰的蛋白。
[0009] 前述方法中，所述疏水层析色谱柱的填充物质包括HiTrap Butyl FF、HiTrap Octyl FF或HiTrap Phenyl FF等。本发明中采用的疏水层析色谱柱为可以市售获得的预装疏水柱（HiTrap Butyl FF、HiTrap Octyl FF和HiTrap Phenyl FF），柱体积均为1mL。
[0013] 图1为本发明实施例1中基于疏水层析色谱柱的溶菌酶固相PEG修饰产物的洗脱图谱。
[0014] 图2为本发明实施例1中对溶菌酶疏水柱固相PEG修饰产物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析的结果；其中，a为野生型溶菌酶，b为溶菌酶疏水柱固相PEG修饰产物的洗脱峰；m为标准蛋白分子量。
[0015] 图3为本发明实施例1中采用CM离子层析色谱柱对溶菌酶疏水柱固相PEG修饰产物进行分离纯化的结果。
[0016] 图4为图3中各洗脱峰的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果；其中，m为标准蛋白分子量，a为野生型溶菌酶，b为溶菌酶疏水柱PEG修饰所得产物，c、d分别对应图3中的洗脱峰1和2。
[0017] 图5为本发明实施例5中基于疏水层析色谱柱的rhaFGF固相PEG修饰产物的洗脱图谱。
[0018] 图6为图5中各洗脱峰的SDS-PAGE凝胶分析结果；其中，对照为野生rhaFGF，a、b、c分别对应图5中的洗脱峰a、b、c。
[0019] 图7为本发明实施例10中基于疏水层析色谱柱固相PEG修饰所得PEG-rhaFGF与野生rhaFGF的圆二色谱分析结果。
具体实施方式
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0021] 实施例1 基于疏水层析色谱柱的溶菌酶固相PEG修饰
[0022] 包括以下步骤：
[0023] （1）用含有2M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,2MNaCl）对HiTrap Butyl FF色谱柱（柱体积CV=1mL）进行预平衡。
[0024] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）将溶菌酶配制成浓度为1mg/mL溶菌酶溶液，取5mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Butyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无蛋白穿出。
[0025] （3）以含有30mM NaBH3CN的PB缓冲液（20mM，pH6.0,2MNaCl）配制10mL的2mg/mL聚乙二醇-丁醛(20kDa)溶液，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Butyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Butyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0026] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）继续冲洗HiTrap Butyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0027] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Butyl FF色谱柱，收集洗脱峰（图1）。对溶菌酶疏水柱固相PEG修饰产物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图2所示。
[0028] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集修饰混合物洗脱峰（图3）。对各洗脱峰进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图4所示。
[0029] （7）将除盐后的洗脱峰上样于CM-Sepharose（CV=1.0mL）阳离子交换层析柱，用含有0-2M NaCl的PB缓冲液以1mL/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中含有0.3M NaCl的PB缓冲液洗脱峰，得到PEG修饰的溶菌酶。PEG修饰率达到59%，活性保持率为80%。
[0030] 实施例2 基于疏水层析色谱柱的溶菌酶固相PEG修饰
[0031] 包括以下步骤：
[0032] （1）用含有2M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,2MNaCl）对HiTrap Phenyl FF色谱柱（柱体积CV=1mL）进行预平衡。
[0033] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）将溶菌酶配制成浓度为1mg/mL溶菌酶溶液，取5mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Phenyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0034] （3）以含有30mM NaBH3CN的PB缓冲液（20mM，pH6.0,2MNaCl）配制10mL的2mg/mL聚乙二醇-丁醛(5kDa)溶液，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Phenyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Phenyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0035] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）继续冲洗HiTrap Phenyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0036] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Phenyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0037] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集修饰混合物洗脱峰。
[0038] （7）将除盐后的洗脱峰上样于CM-Sepharose（CV=1.0mL）阳离子交换层析柱，用含有0-2M NaCl的PB缓冲液以1mL/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中含有0.3M NaCl的PB缓冲液洗脱峰，得到PEG修饰的溶菌酶。PEG修饰率达到61%，活性保持率为80%。
[0039] 实施例3 基于疏水层析色谱柱的α-糜蛋白酶固相PEG修饰
[0040] 包括以下步骤：
[0041] （1）用含有2M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,2MNaCl）对HiTrap Phenyl FF色谱柱（柱体积CV=1mL）进行预平衡。
[0042] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）将α-糜蛋白酶配制成浓度为1mg/mL蛋白溶液，取5mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Phenyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0043] （3）以含有30mM NaBH3CN的PB缓冲液（20mM，pH6.0,2MNaCl）配制10mL的2mg/mL聚乙二醇-丙醛（20kDa）溶液，将该溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Phenyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Phenyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0044] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）继续冲洗HiTrap Phenyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0045] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Phenyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0046] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集修饰混合物洗脱峰。
[0047] （7）将除盐后的洗脱峰上样于CM-Sepharose（CV=1.0mL）阳离子交换层析柱，用含有0-2M NaCl的PB缓冲液以1mL/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中各洗脱峰，得到PEG修饰的α-糜蛋白酶。PEG修饰率达到56%，活性保持率为82%。
[0048] 实施例4 基于疏水层析色谱柱的α-糜蛋白酶固相PEG修饰
[0049] 包括以下步骤：
[0050] （1）用含有2M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,2MNaCl）对HiTrap Butyl FF色谱柱（柱体积CV=1mL）进行预平衡。
[0051] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）将α-糜蛋白酶配制成浓度为1mg/mL蛋白溶液，取5mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Butyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0052] （3）以含有30mM NaBH3CN的PB缓冲液（20mM，pH6.0,2MNaCl）配制10mL的2mg/mL聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液(25kDa)，将该溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Butyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Butyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0053] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）继续冲洗HiTrap Butyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0054] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Butyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0055] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集修饰混合物洗脱峰。
[0056] （7）将除盐后的洗脱峰上样于CM-Sepharose（CV=1.0mL）阳离子交换层析柱，用含有0-2M NaCl的PB缓冲液以1mL/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集各洗脱峰，得到PEG修饰α-糜蛋白酶。PEG修饰率达到45%，活性保持率为81%。
[0057] 实施例5 基于疏水层析色谱柱的rhaFGF固相PEG修饰
[0058] 包括以下步骤：
[0059] （1）用含有3M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,3MNaCl）对HiTrap Phenyl FF色谱柱（CV=1mL）进行预平衡。
[0060] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）将聚乙二醇-丁醛（40kDa）配制成浓度为2mg/mL，取10mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Phenyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0061] （3）用含有30mM氰基硼氢化钠的上述PB缓冲液（20mM，pH6.0，3M NaCl）配制5mL的1mg/mL rhaFGF，将该蛋白溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Phenyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Phenyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0062] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）继续冲洗HiTrap Phenyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0063] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Phenyl FF色谱柱，收集洗脱峰（图5）。对各洗脱峰进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图6所示。
[0064] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集蛋白修饰峰。PEG修饰率达到42%，活性保持率为92%。
[0065] 实施例6 基于疏水层析色谱柱的rhaFGF固相PEG修饰
[0066] 包括以下步骤：
[0067] （1）用含有3M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,3MNaCl）对HiTrap Butyl FF色谱柱（CV=1mL）进行预平衡。
[0068] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）将聚乙二醇-丁醛（20kDa）配制成浓度为2mg/mL，取10mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Butyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0069] （3）用含有30mM氰基硼氢化钠的上述PB缓冲液（20mM，pH6.0，3M NaCl）配制5mL的1mg/mL rhaFGF，将该蛋白溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Butyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Butyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0070] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）继续冲洗HiTrap Butyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0071] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Butyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0072] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集蛋白修饰峰。PEG修饰率达到45%，活性保持率为92%。
[0073] 实施例7 基于疏水层析色谱柱的rhbFGF固相PEG修饰
[0074] 包括以下步骤：
[0075] （1）用含有3M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,3MNaCl）对HiTrap Butyl FF色谱柱（CV=1mL）进行预平衡。
[0076] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）将聚乙二醇-丙醛（20kDa）配制成浓度为2mg/mL，取10mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Butyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0077] （3）用含有30mM氰基硼氢化钠的上述PB缓冲液（20mM，pH6.0，3M NaCl）配制5mL的1mg/mL rhbFGF，将该蛋白溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Butyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Butyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0078] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）继续冲洗HiTrap Butyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0079] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Butyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0080] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集蛋白修饰峰。PEG修饰率达到48%，活性保持率为91%。
[0081] 实施例8 基于疏水层析色谱柱的rhbFGF固相PEG修饰
[0082] 包括以下步骤：
[0083] （1）用含有3M NaCl的磷酸盐缓冲液PB（20mM，pH6.0,3MNaCl）对HiTrap Phenyl FF色谱柱（CV=1mL）进行预平衡。
[0084] （2）采用上述PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）将聚乙二醇-丙醛（25kDa）配制成浓度为2mg/mL，取10mL以流速为1mL/min上样于HiTrap Phenyl FF色谱柱，待上样完成后采用PB缓冲液（20mM,pH6.0,2M NaCl）冲洗至无穿出。
[0085] （3）用含有30mM氰基硼氢化钠的上述PB缓冲液（20mM，pH6.0，3M NaCl）配制5mL的1mg/mL rhbFGF，将该蛋白溶液作为流动相，以1mL/min的流速流过HiTrap Phenyl FF色谱柱，柱温维持在室温，同时将HiTrap Phenyl FF色谱柱用锡箔纸包裹以避光。
[0086] （4）将流动相换成PB缓冲液（20mM,pH6.0,3M NaCl）继续冲洗HiTrap Butyl FF色谱柱，以1mL/min的流速冲洗20个柱体积（CV）。
[0087] （5）用无盐PB缓冲液（20mM,pH6.0）以1mL/min的流速洗脱HiTrap Butyl FF色谱柱，收集洗脱峰。
[0088] （6）上述洗脱峰上样于Sephadex G-25（CV=100mL）层析柱，然后用PB缓冲液（20mM，pH6.0）以1mL/min的流速洗脱除盐，收集蛋白修饰峰。PEG修饰率达到51%，活性保持率为92%。
[0089] 实施例9 基于疏水层析色谱柱的PEG修饰所得PEG-rhaFGF和野生rhaFGF的活性测试
[0090] 包括以下步骤：
[0091] （1）取对数生长期NIH3T3细胞，消化离心后悬浮于1mL完全培养液（89%低糖3
DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素）中，计数调整细胞浓度为5×10 个细胞/100μL/孔接种于96孔板并置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h。
DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素）中，计数调整细胞浓度为5×10 个细胞/100μL/孔接种于96孔板并置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h。
[0092] （2）弃去96孔板中的培养液，然后用PB洗一次，拍干，加入100μL含0.4%胎牛血清的饥饿培养基，饥饿处理24h。
[0093] （3）设置4个实验组，每组设2个复孔，分别给予终浓度为50IU/mL的rhaFGF标准品，0.1nM野生rhaFGF和固相反应所得PEG-rhaFGF（实施例6）进行2倍梯度稀释（共设6个浓度，每孔加入100μL含药物的基础培养基），培养24h。
[0094] （4）96孔板每孔加20μL MTT试剂(5mg/mL)，37℃培养箱中孵育4h。然后弃去孔中液体，加100μL DMSO充分溶解混匀，在酶标仪上以630nm为参比波长，于570nm处读取吸光度值。整个实验重复4次，最后整理数据进行统计学分析。表1为基于疏水层析色谱柱固相PEG修饰所得PEG-rhaFGF（实施例6）和野生rhaFGF的活性测试结果。结果显示，疏水柱固相PEG修饰能够较好地保留rhaFGF的生物学活性，活性保持高达92%，远高于传统液相PEG修饰所得PEG-rhaFGF的活性（61%）。液相PEG修饰参考Huang ZF,Lu MF,Zhu GH,et al,Acceleration of diabetic-wound healing with PEGylated rhaFGF in healing-impaired streptozocin diabetic rats.Wound Repair and Regeneration,2011Sep-Oct,19(5):633-644。
[0095] 表1野生rhaFGF及固相PEG修饰所得PEG-rhaFGF的生物学活性比较[0096]
[0097] 实施例10 基于疏水层析色谱柱的PEG修饰所得PEG-rhaFGF和野生型rhaFGF的圆二色谱分析
[0098] 采用Jasco J715圆二色谱仪测定修饰前后蛋白的圆二色光谱，扫描范围为190-260nm（远紫外光谱区），野生型rhaFGF和PEG-rhaFGF（实施例6）蛋白浓度为0.3mg/mL。各试样均扫描6次后取平均值，最终结果用摩尔椭圆度[θ]对扫描波长作图表示。结果显示（图7），疏水柱修饰所得PEG-rhaFGF与野生rhaFGF的二级结构完全一致。
[0099] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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